KR20010043627A

KR20010043627A - 재조합 바큐로바이러스에 기초한 살충제

Info

Publication number: KR20010043627A
Application number: KR1020007012790A
Authority: KR
Inventors: 린에이 브레넌; 피터엠 디억스; 아서 맥킨토시
Original assignee: 아메리칸 사이아나미드 캄파니; 마가렛 에이. 코너; 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 에즈 리프리젠티드 바이 더 시크리터리 오브 에그리컬쳐
Priority date: 1998-05-08
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2001-05-25
Also published as: JP2002514435A; HUP0101684A2; IL139401A0; CN1310767A; AU3885699A; CA2331853A1; ID28101A; NZ507918A; TR200003245T2; ZA200006301B; WO1999058705A1; SK16852000A3; EP1076717A1; AU753930B2; PL345242A1; HUP0101684A3; BR9910515A

Abstract

본 발명은 살충제로써 사용될 수 있는 분리된 재조합 플루텔라 실로스텔라 (Plutella xylostella)의 바큐로바이러스(baculovirus)를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 의한 재조합 바큐로바이러스는 이의 게놈에 살충효과가 있는 독소를 만드는 유전자를 포함한다. 또한, 본 발명은 재조합 Plutella xylostella의 바큐로바이러스를 포함하는 살충제의 조성물과 제형, 및 곤충 해충을 죽이고 병충해에 의한 농작물의 피해를 줄이는 방법을 제공한다.

Description

재조합 바큐로바이러스에 기초한 살충제{Recombinant Baculovirus-Based Insecticides}

관련출원에 대한 상호참조(cross-reference to related application)

본 출원은 본 명세서에 참조문헌으로 제시되었으며, 1998년 5월 8일 출원된 가출원 제 60/084,705호에 근거한 35 U.S.C. 119에 의거하여 우선권을 주장한다.

바큐로바이러스는 생물학적 살충제로서 유용한 곤충 바이러스이다. 400개 이상의 바큐로바이러스 분리주들에 대해 상세하게 서술되어 있다. 바큐로바이러스과의 표준 바이러스인 오토그라파 캘리포니카 뉴클레어 폴리헤드로시스 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)는 통상 자주개자리 자벌레(alfalfa looper)로 알려져 있는 나비목 밤나방(lepidopteran noctuid)인 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica)로부터 최초로 분리되었다. 이 바이러스는 나비목 곤충목 내의 12개 과와 30개 이상의 종을 감염시킨다(참조: Granados et al., The Biology of Baculoviruses, I, 99(1986)). AcMNPV가 이 목에 속하지 않는 종을 감염시키는가에 대해서는 알려져 있지 않다.

AcMNPV로 예시되는 것처럼 바큐로바이러스의 생활사는 두 단계로 이루어진다. 생활사의 각 단계는 특정형태의 바이러스들로 대표된다: 오클루젼 바디 (occlusion body, OB)와, 오클루젼 바디가 없는 봉오리 비리온(budded virion, BV).

자연적으로 발생하는 곤충감염형에서, 다수의 비리온은 오클루젼 바디 혹은 폴리헤드랄 인클루젼 바디(polyhedral inclusion body, PIB)로 불려지기도 하는 반 결정형 단백질 매체(paracrystalline protein matrix)에 묻혀있는 형태로 발견된다. 단백질 성분의 바이러스 오클루젼은 폴리헤드라(polyhedra)로 불려진다. 분자량 29 kD의 폴리헤드린(polyhedrin) 단백질은 바이러스 오클루젼의 바이러스 자체 내에 암호화된 주요 구조단백질이다(참조: 미합중국 특허 제 4,745,051호).

바이러스 오클루젼은 감수성 있는 곤충 종들 간의 (곤충에서 곤충으로의) 수평전염 수단을 제공하는 자연적인 바큐로바이러스 생활사의 중요한 부분이다.

이 같은 환경에서 감수성이 있는 곤충은(일반적으로 유충 단계에서) 식물과 같은 오염된 음식원으로부터 바이러스 오클루젼들을 섭취한다. 결정형 오클루젼은 감수성 있는 곤충들의 장에서 해리하여 감염성 바이러스 입자들을 방출한다. 이 오클루젼에서 유도된 바이러스(occlusion derived virus, ODV)들은 중장(midgut) 조직의 세포 속에서 복제한다.

바이러스 입자들은 세포내 이입작용(endocytosis)이나 융합에 의해 세포에 들어가며, 바이러스 DNA는 핵공이나 핵 속에서 탈피되는 것으로 여겨진다. 바이러스 DNA 복제는 6시간 내에 검출된다. 감염 후 10시간에서 12시간째에, 세포표면으로부터 봉오리 비리온(BV)의 출아(budding)에 의해 2차 감염이 곤충의 다른 조직들로 퍼지게 된다. 바이러스의 BV형태는 세포배양에서 감염을 전달하는 원인이 될 뿐만 아니라, 감염된 곤충 개체 안에서 바이러스의 세포간 확산의 원인이 된다.

감염 주기 말(감염 12시간 후)에, 폴리헤드린 단백질을 감염세포 내에서 검출할 수 있다. 18시간에서 24시간이 지나서야 폴리헤드린 단백질은 감염된 세포핵 내에서 조립되고, 바이러스 입자들은 단백질 성분의 오클루젼 내에 파묻히게 된다. 바이러스 오클루젼들은 세포를 용해시키면서 4일에서 5일에 걸쳐 다량으로 축척된다. 이 폴리헤드라들은 유충 감염을 전파하는 데에는 능동적인 역할을 하지 않는다. 혈관 림프내의 BV들이 증식하고 확산하여 결국에는 유충을 죽게 한다.

감염된 유충들이 죽을 때, 수백만의 폴리헤드라가 부패조직 내에 남아 있는 동안 BV들은 분해된다. 다른 유충들이, 예를 들어 오염된 식물이나 다른 영양원들을 섭취함으로써 폴리헤드라에 노출될 때, 주기는 반복된다.

요약하면, 이 바이러스의 오클루젼 형태는 바이러스의 환경을 안정시킬 뿐 아니라, 장을 통한 곤충의 초기 감염의 원인이 된다. ODV들은 주사로 투여했을 때에는 본질적으로 감염성이 없으나, 입으로 섭취했을 때에는 감염성이 상당히 높다. 이 바이러스의 오클루젼이 없는 형태(BV)는 2차 감염과 세포간 감염의 원인이다. BV들은 배양 중인 세포들 혹은 내부 곤충 조직으로의 주입에 대해서는 감염성이 상당히 높지만, 섭취시에는 감염성이 없다.

농업에서 바큐로바이러스 살충제를 광범위하게 사용하는데 있어서 주된 장애는 곤충의 초기 감염에서 죽음에 이를 때까지의 시간적인 지체이다. 이 시간간격은 수일에서 수주에 이를 수 있다. 이 기간동안, 곤충은 계속해서 먹이를 먹으면서 식물에 더 많은 피해를 입히게 된다. 이 시간 지체를 단축시키기 위해, 독소, 신경성펩티드, 호르몬, 또는 효소와 같은, 곤충생리를 조절하는 물질 혹은 그것을 수정한 물질을 발현하는 재조합 바큐로바이러스들이 작제되었다(참조: Tomalski, M.D. et al., Nature, 352:82-85 (1991); Federici,, In Vitro, 28:50A (1992); Martens et al., App. ＆ Envir. Microbiology, 56:2764-2770 (1990); Menn et al., Agric. Food Chem.,37:271-278 (1989); Eldridge et al., Insect Biochem.,21:341-351 (1992); Hammock et al., Nature, 344:458-461 (1990)).

바큐로바이러스 살충제를 사용하는데 있어서 두 번째 주된 장애는 이 바이러스들의 제한적인 숙주 범위이다. 바큐로바이러스들의 제한적인 숙주 범위는, 비표적 생물체에는 안전한 반면, 들판에 존재하는 다양한 나비목 해충들을 바큐로바이러스가 방제할 수 없다는 것을 의미하기도 한다. 방제될 필요가 있는 나비목 곤충들 중에 특정 살충용 바큐로바이러스에 의한 감염에 비수용적이거나 반수용적인 곤충들이 포함될 때, 이 점이 특히 들어맞는다. 감염에 대해 비수용적인 곤충은 분량에 관계없이 전혀 감염될 수 없는 곤충이고, 감염에 대해 준수용적인 곤충은, 감수성이 있는 곤충들 즉 수용적인 숙주들을 감염시키는데 필요한 양보다 최소한 10¹배에서 더 일반적으로는 10²배 이상에 노출될 때에만 감염이 되는 곤충이다. 본 발명 이전에는 다이아몬드백 나방(diamondback moth), Plutella xylostella을 수용적인 숙주로 사용하는 뉴클레오폴리헤드로바이러스(nucleopolyhedrovirus) 속의 바큐로바이러스는 확인된 바 없었다. 이 곤충은 많은 채소농작물에 있어서 증대한 해충이며 화학적 살충제, 생물학적 살충제 양 쪽 모두에 대해 내성을 키워왔다.

따라서, (i) 개선된 효능과 감염에서 사멸까지의 단축된 시간간격을 제시하고 (ii) 예를 들어 Plutella xylostella를 포함해서 광범위하게 나비목 해충들을 방제할 수 있도록 개선된 숙주 범위를 제시하는, 생물학적 살충제들에 대한 기술이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 다른 야생형(wild-type) 또는 재조합 바큐로바이러스에 비해 Plutella xylostella 곤충들에 대한 보다 뛰어난 살충작용을 가지는 재조합 Plutella xylostella 바큐로바이러스(PxNPV)를 제공한다.

본 발명에 의한 재조합 PxNPV는 야생형 PxNPV에 비해 하나 혹은 그 이상의 유전적인 변형을 포함하는 PxNPV이다. 유전적 변형은 하나 혹은 그 이상의 제한효소 절단 부위의 도입이나 결실을 포함한다; 하나 이상의 바이러스 코딩 유전자들의 변형, 결실, 또는 중복; 그리고 이종단백질들, 즉 비바이러스 단백질이나 혹은 이종 바이러스 단백질들을 암호화한 하나 혹은 그 이상의 유전자들의 도입들로, 여기에 한정되지는 않는다.

바람직하게는, 재조합 PxNPV은 그들의 게놈 내에, 예를 들어 살충 독소, 펩티드 호르몬, 효소, 또는 수용체와 같은, 곤충을 조절하는 물질을 코딩하는 핵산서열을 병합했는데, 곤충을 조절하는 물질은 표적 곤충에서 전사를 활성화하는 프로모터와 작동 가능하게 연결되었다. 가장 바람직하게는, 곤충을 조절하는 물질은 살충 독소이다. PxNPV의 유전체적 배경과 관련해서 살충 독소를 코딩하는 재조합 바큐로바이러스는 상당히 향상된 살충혜택을 제공한 것으로 여겨진다.

살충 독소들에 대한 예는 수없이 많아서, AaIT, AaHIT1, AaHIT2, LqhIT2, LqqIT1, LqqIT2, BjIT1, BjIT2, LqhP35, Lqha IT, SmpIT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-아가톡신(μ-agatoxin), 킹콩 톡신(King Kong toxin), Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, ω-아트라코톡신(ω-atracotoxin), α-코노톡신(α-conotoxin), μ-코노톡신(μ-conotoxin), 클로로톡신(chlorotoxin) 및 ω-코노톡신(ω-conotoxin)이 이에 포함된다. 어떤 실시태양에 의하면 자연적인 분비 시그널 펩티드, 즉 독소와 결합된 시그널 펩티드가 사용된다; 다른 실시태양에 의하면 이종신호펩티드가 감염된 곤충 세포들로부터 독소의 분비를 촉진시키는데 사용된다. 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 pBMHPC-12 시그널 서열, 만두카 섹스타 (Manduca sexta)의 아포리포포린(apolipophorin) 시그널 서열, Manduca sexta의 아디포키네틱 호르몬 시그널(adipokinetic hormone signal), Bombyx mori의 코리온 (chorion) 시그널 서열, 초파리(Drosophila melanogaster)의 큐티클 시그널 서열, Drosophila melanogaster의 에스터라제-6(esterase-6) 시그,널 서열, 및 Bombyx mori의 성-특이적 시그널 서열 등에서 유래한 것들은 수없이 많은 유용한 이종신호펩티드의 예에 속한다.

본 발명은 생체 외에서 DNA 절편의 연결에 의한 재조합 PxNPV 유전체 합성을 수월하게 하도록 고안된 직접 연결 벡터(direct ligation vector)들도 포함한다. 이와 같은 접합의 결과로서, DNA를 적절한 숙주세포 속으로 삽입함으로써 재조합 PxNPV가 만들어지게 된다.

다른 면에서, 본 발명은 살충 독소를 암호화하는 발현 카셋트들을 제공한다. 발현 카셋트들은 바람직하게는 초파리(Drosophila melanogaster)의 hsp 70 프로모터로부터 유래한 프로모터 서열을 포함하는데, 이것은 독소를 암호화한 핵산서열과 연결되어 있다. 본 발명의 발현카셋트들은, 플라스미드 벡터들에 병합될 수 있는데, 이를 모듈 발현벡터(modular expression vector)라 칭한다.

또 다른 면에서, 본 발명은, 예를 들어 아래 도 10과 11에서 볼 수 있는 것처럼, 살충 독소를 암호화하는 코돈-최적화(codon-optimised)된 유전자들을 제공한다. 코돈-최적화된 유전자들은, 독소를 암호화하는 원 서열에 존재하는 특정 유전자 코돈들이 곤충 세포의 단백질 합성기구에 의해 보다 더 효율적으로 이용되는 선택적인 유전자 부호들로 치환된 것이다.

또 다른 면에서, 본 발명은, 상술한 바와 같이 적어도 하나의 재조합 PxNPV를 포함하는 조성물과 제형, 및 농학적으로 허용되는 담체를 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 PxNPV를 담고있는 살충 조성물 혹은 제형의 살충 효과량을 원하는 위치에 투여하는 단계를 포함한 해충을 죽이고 곤충의 출몰을 줄이는 방법들을 제공한다.

본 발명은 생물학적 살충제(biological insecticide)의 용도를 가진, 개량된 플루텔라 실로스테라(Plutella xylostella) 바큐로바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 살충 독소를 암호화하는 유전인자를 유전공학적으로 삽입하여 만들어진 재조합 바큐로바이러스를 제공한다.

도 1은 바이러스의 엑디스테로이드 글루코실 트렌스퍼라제(ecdysteroid glucosyl transferase, egt) 유전자를 결실시킨 재조합 PxNPV들의 생산을 위해 pmd 205.1, pmd 216.1, 및 pmd 220.2 벡터들을 구성하는데 사용되는 절차를 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 2는 LAB 50.2 벡터를 구성하는데 사용되는 절차를 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 3은 pMEV 모듈 발현벡터들의 구조에 대한 도식적 그림이다.

도 4는 상이한 프로모터들을 지니고 있는 pMEV를 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 5는 모듈 발현벡터 속으로 DNA 서열을 클로닝하는 것을 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 6은 pMEV5 내의 초파리 hsp 70의 프로모터 모듈(promoter module)과, 서열을 분리하는데 사용된 증폭 프라이머들을 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 7은 pMEV6 내의 초파리 hsp 70 프로모터 모듈과, 서열을 분리하는데 사용된 증폭 프라이머들을 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 8은 AaIT를 암호화하는 코돈-최적화된 DNA서열과, 이 서열을 합성하는데 사용되었던 올리고핵산과 증폭 프라이머들을 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 9는 pMEV/ADK 모듈 발현 벡터들의 구조를 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 10은 LqhIT2 독소를 암호화하는 코돈-최적화된 DNA서열과, 이 서열을 합성하는데 사용되었던 올리고핵산과 증폭 프라이머들을 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 11은 ω-ACTX-HV1 독소를 암호화하는 코돈-최적화된 DNA서열과, 이 서열을 합성하는데 사용되었던 올리고핵산과 증폭 프라이머들을 도식적으로 나타낸 그림이다.

본 발명의 실행시, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 단백질 생화학, 그리고 곤충 바이러스학의 관련 종사자들에게 잘 알려져 있는 많은 기술들이 사용될 수 있다(참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis, 1984,(M.I.Gait. ed.); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1997 (John Wiley ＆ Sons); the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Protein Purification: Principles and Practice, 2판 (Springer-Verlag, N.Y.); Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, 1987; 및 O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, 1994, Oxford Univ. Press, N.Y.).

본 발명은 생물학적 살충제로서 분리, 정제된 재조합 Plutella xylostella 바큐로바이러스(PxNPV)를 제공한다. 여기서 사용되는 PxNPV는 뉴클레오폴리헤드로 바이러스(nucleopolyhedrovirus, NPV)속의 바큐로바이러스 분리주를 가리키는데, 이것의 야생형은 감염된 Plutella xylystella 유충으로부터 분리되었으며 알려진 다른 바큐로바이러스들과는 유전적으로 구별되고 다른 바큐로바이러스들에 비해 Plutella xylostella 유충에 대한 더 높은 감염성을 보인다. 본 발명에 의한 재조합 PxNPV의 유전체 서열들은, 이종성 염기서열(heterologous sequence)을 제외했을 경우, ATCC VR-2607로 등록된 PxNPV의 유전체 서열들과 적어도 90% 가량의 서열 동일성과 바람직하게는 적어도 95% 가량의 서열 동일성을 보인다. 본 발명에 포함되어 있는 PxNPV들은 또한 다음에 의해서 확인될 수 있다:

(i) Plutella xylostella 유충에 대한 감염성 측정. 본 발명의 PxNPV들은 ATCC VR-2465로 등록된 AcMNPV의 V8 주에 의해 나타나는 것보다 적어도 대략 10²배의 Plutella xylostella 유충에 대한 감염성을 나타낸다.

(ii) HindIII, XhoI, 및/또는 PstI에 의한 바이러스 유전체 DNA의 잘림과, PxNPV에서 유래한 유전체 DNA, 그리고 non-PxNPV 바큐로바이러스에서 유래한 유전체 DNA의 분해로 생성되는 제한효소 분해절편(restriction fragment)들의 양상의 비교. 유전체 변형의 결과로 생성되는 절편들을 제외할 경우, 본 발명의 PxNPV들은 PxNPV가 갖는 제한효소 분해절편의 특징, 다시 말해 PxNPV에는 존재하고 다른 종류의 바큐로바이러스 DNA에는 존재하지 않는 특징을 보인다.

본 발명인들은 본 발명의 재조합 PxNPV들이 야생형 PxNPV 및/또는 다른 바큐로바이러스 종들에서 유래한 재조합 NPV들에 비해 Plutella xylostella 유충에 대한 우월한 살충작용을 보인다는 것을 발견하였다. 본 발명에 의거한 재조합 PxNPV들은 야생형 PxNPV들에 비해 하나 혹은 그 이상의 유전적 변형이 도입된 PxNPV들이다. "유전적 변형(genetic alteration)"은, 하나 혹은 그 이상의 제한효소 절단부위들의 도입, 하나 혹은 그 이상의 제한효소 절단부위들의 결실, 하나 혹은 그 이상의 바이러스성 유전자의 변형이나 결실, 혹은 중복, 그리고 이종단백질 다시 말해 비바이러스성 단백질이나 이종바이러스성 단백질들을 암호화하는 하나 혹은 그 이상의 유전자들의 도입을 포함한, PxNPV 유전체 서열상의 모든 변화를 가리키나, 여기에 한정되지 않는다. 예를 들어, 유전체가 야생형 PxNPV에는 존재하지 않는 제한효소 절단부위들을 포함한다거나 또는 역으로, 야생형 PxNPV에는 존재하는 제한효소 절단부위가 하나 이상 결여되어 있는, 변경된 PxNPV들을 본 발명은 망라하고 있다. "제한효소 절단부위(restriction site)"라는 용어는 제한효소가 인지하는 인식부위인 핵산서열을 가리킨다. 전형적으로, 하나 혹은 그 이상의 제한효소 절단부위의 삽입 및/또는 결실은, 야생형 PxNPV에 존재하지 않는, 다시 말해 PxNPV 유전체 속으로 이종 유전자의 병합을 위해 적어도 하나의 특이한 제한효소 절단부위를 포함하는 클로닝 부위를 만들기 위해 시행된다. 바람직하게는, 재조합 PxNPV들은 예를 들어 살충 독소나 호르몬, 효소, 또는 수용체와 같은 곤충 조절물질을 암호화한 여러 가지 유전자들을 포함하여 적어도 하나의 이종 유전자를 자기의 유전체 안에 포함하고 있다.

가장 바람직하게는, 재조합 PxNPV들은 살충 독소를 암호화하는 이종 유전자를 포함한다. 적합한 살충 독소들은 아래 표에서 열거한 것들을 포함하나 여기에 한정되지 않는다:

독소 참조문헌

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Chem. 262:1194-1198, 1987

독소를 암호화한 염기서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는데, 다시 말해 프로모터서열이 독소 암호화서열의 상단에 위치해 있어서 독소의 발현이 프로모터의 지배를 받는다. 이 프로모터는, 예를 들어 DA26, 35K, 6.9K, 및 폴리 헤드린(polh) 프로모터들과 같은, 바큐로바이러스에서 유래한 프로모터일 수 있다(참조: O'Reilly et al., J. Gen. Virol. 71:1029 (1990); Friesen et al., J. Virol. 61:2264, 1987; Wilson et al., J. Virol. 61:661-666, 1987; Hooft van Iddekinger et al., J. Virol. 131:561, 1983; Miller, ed., The Baculoviruses, Plenum Press, New York,(1997)). 선택적으로, 곤충에서 유래한 hsp70 프로모터 또는 액틴(actin) 프로모터와 같은 숙주세포의 프로모터가 사용될 수 있다. 표적 곤충 세포들에서 전사를 촉진하는 그 어떤 자연적 또는 인공적 프로모터도 사용될 수 있다.

더 나아가, 독소를 암호화하는 DNA 서열은, 기원세포 내에서 독소의 분비를 조정하는 시그널 펩티드를 암호화하는, 자연상태의 상단서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 독소의 암호화 서열은 이종 시그널 서열들을 암호화하는 상단 DNA 서열과 틀을 맞추어 융합될 수 있고, Bombyx mori의 pBMHPC-12 시그널 서열, Manduca sexta의 아디포키네틱 호르몬 시그널 서열, Manduca sexta의 아포리포포린 시그널 서열, Bombyx mori의 코리온 시그널 서열, Drosophila melanogaster의 큐티클 시그널 서열, Drosophila melanogaster의 에스터라제-6 시그널 서열, 및 Bombyx mori의 성-특이적 시그널 서열 등, 모두 미합중국 특허 제 5,547,871호에 기술되어 있는 이종 시그널 서열들이 그 예이다.

본 발명의 실시태양에 의하면, 본 발명의 재조합 PxNPV는 유전체 속에 야생형이나 변종의 유년기 호르몬을 암호화한 유전자를 포함하는데, 이 유전자의 발현은 섭식단계(feeding stage)와 번데기화(pupation) 과정을 비가역적으로 종결시켜 표적곤충을 죽이는 결과를 낳을 수 있다(참조: WO 94/03588).

재조합 PxNPV는 하나 혹은 그 이상의 바이러스 고유기능들을 변경시키는 방법으로 야생형이나 기존 재조합 PxNPV 주를 유전적으로 변경시킴으로써 만들어질 수도 있다. 예를 들어, 바이러스 폴리헤드린 단백질이나 엑디스테로이드 글루코실트랜스퍼라제(EGT), 또는 p10 단백질을 암호화하는 바이러스 유전자들 같은 하나 혹은 그 이상의 바이러스 유전자들이 변형, 결실, 또는 중복될 수 있다. 더 나아가, 예를 들어 미합중국 특허 제 5,662,897호에 기술되어 있는 바와 같이 훨씬 더 빠른 치사 표현형(killing phenotype)을 유발하는 결정인자를 갖고 있는 AcMNPV V8주의 영역과 같이 다른 바큐로바이러스들에서 유래하는 바이러스 염기서열도 삽입될 수 있다.

본 발명에 의한 여기에 한정되지 않은 재조합 PxNPV의 예로는 ATCC 기탁번호 VR-2607, VR-2608, VR-2609를 갖는 것들이 포함되어 있다.

본 발명은 재조합 PxNPV의 제조를 위한 방법과 조성물을 제공한다. 본 기술과 관련하여 기술된 모든 방법이 재조합 PxNPV를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 적절한 숙주세포에 두 종류의 PxNPV 주의 동시 트랜스펙션은 하나의 재조합 PxNPV를 형성할 수 있는 관련 염기서열 간에 생체내 상동 재조합을 초래할 수 있다. 비숫한 식으로, 정제된 PxNPV 바이러스 유전체 DNA와 PxNPV 서열을 갖는 두번째 핵산으로 동시에 트랜스펙션된 세포에서 생체내 상동 재조합이 일어날 수 있다. 선택적으로 재조합 PxNPV는 사전에 생체외에서 변형된 분리된 바이러스 유전체 DNA를 세포에 도입하여 생산될 수 있다.

본 발명의 실시태양에 의하면, 재조합 PxNPV는 직접 연결 벡터들과 모듈 발현 벡터들을 이용하여 제조된다. 재조합 PxNPV를 제조하기 위해 이용되는 구상요소와 방법은 아래에서 기술된다.

PxNPV-유래 직접 연결 벡터

직접 연결 바이러스 벡터(direct ligation virus vector)들은 생체외에서 DNA 결합에 의한 재조합 PxNPV 유전체를 제조하기 위해 사용되는 정제된 PxNPV 바이러스 유전체 DNA들을 포함한다. 직접 연결 벡터들은 적절한 숙주세포에 도입되었을 때 재조합 PxNPV 비리온의 생산을 관리한다. 본 발명의 실시태양에 의하면, PxNPV 직접 연결 벡터들은 야생형 PxNPV에 존재하지 않는 적어도 하나의 암호화 부위가 결합되도록 변형된 PxNPV 유전체 DNA를 포함한다. 암호화 부위는 야생형 PxNPV 유전체에 존재하지 않거나 필수적인 PxNPV 바이러스 기능을 암호화하거나 조절하는 핵산에서 발견되지 않는 제한효소 절단부위를 하나 이상 포함한다. 후자의 경우에 본 발명의 직접 연결 벡터는 코딩밖에 존재하는 제한효소 절단부위를 제거하여 암호화 부위는 적어도 하나의 유일한 제한효소 절단부위를 포함하도록 만들어 졌다. 암호화 부위가 지정하는 한 개 이상의 제한효소에 의한 직접 연결 벡터의 분해는 필수적인 바이러스 기능을 방해하지 않으면서 통상 한번의 결합과정으로 이종 핵산 조각이 도입될 수 있는 DNA 조제물을 만든다. 직접 연결 벡터에 이종 핵산 결합으로 만들어지는 DNA 조제물은 재조합 PxNPV의 번식을 위해 적절한 숙주세포에 도입될 수 있다. 직접 연결 벡터는 재조합 바이러스들을 형성하기 위한 생체내 재조합 단계에 대한 의존도를 제거하여 재조합 PxNPV들의 합성을 단순화 한다(참조: WO 94/28114).

PxN PV 직접 연결 벡터의 클로닝 부위는 (i) PxNPV를 전혀 자르지 않거나 (ii) 필수적인 PxNPV 바이러스 기능을 암호화하거나 조절하는 핵산 내에는 존재하지 않는 소수의 자리들을 인식하는 하나 이상의 제한효소를 선정하여 고안된다. 그와 같은 선정은 (i) 컴퓨터로 PxNPV DNA 서열을 탐색하거나 (ii) 효소에 의한 PxNPV DNA 분해를 시행하고 분해산물의 존재여부를 확인함으로써 시행된다. 그 효소가 소수의 자리를 인식하는 경우에 이 자리들은 전통적인 방법(예를 들어, 제한효소에 의한 분해후 블런트 말단으로 만들고 재결합시키는 방법)으로 제거되어 그 자리들은 소실되었으나 바이러스 증식과 감염력은 유지된 PxNPV DNA가 만들어진다.

하나 이상의 제한효소 절단부위를 선정한 후, 클로닝부위는 생체내 상동 재조합이나 생체외 접합 등을 포함한 적절한 방법들로 PxNPV DNA(야생형 또는 상기한 바와 같이 하나 혹은 그 이상의 제한효소 절단부위를 비활성화함으로써 변형된 형)에 도입된다. 바람직하게는 클로닝부위는 적어도 (i) 삽입되는 핵산의 방향성 클로닝 및/또는 (ii) 독립적인 다수 핵산 삽입이 가능하도록 중복되지 않는 제한효소 절단부위를 포함한다.

PxNPV로부터 직접 연결 벡터를 형성하기 위해 폴리헤드린, EGT 또는 p10 단백질을 암호화하는 바이러스 유전자의 비활성화를 초래하는 다른 종류의 변경도 도입될 수 있다. 본 발명의 실시태양에 의하면 클로닝 부위가 그와 같은 비활성화를 초래하는 자리에 도입되기도 한다.

모듈 발현 벡터(Modular Expression Vector)와 발현 카셋트(Expression Cassette)

본 발명에서 사용된 모듈 발현 벡터는 상기한 바와 같이, 이것으로부터 잘려나와 PxNPV 직접 연결 벡터에 결합될 수 있는 발현 카셋트를 포함하는 플라스미드 벡터들이다. 전형적으로 발현 카셋트는 5'-to-3' 방향으로 다음을 가진다: 전사 개시 부위(transcription start site)를 포함하는 5' 비해독 영역(untranslated region, UTR)에 결합된 하나의 프로모터 서열; 이종 유전자의 삽입을 가능케 하는 한 개 이상의 제한효소 절단부위(이 서열은 "삽입자리(insertion site)"라고 지칭된다.); 및 적어도 하나의 3' 말단 mRNA 가공과 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 자리를 갖는 3' UTR 서열. 발현 카셋트는 어느 한쪽에 PxNPV 직접 연결 벡터에 적합한 적절한 제한효소 절단부위 (restriction site)들이 근처에 위치한다.

모듈 발현 벡터에서 사용하기 적합한 프로모터는 바큐로바이러스의 프로모터와 숙주세포의 프로모터이다. 적합한 바큐로바이러스 프로모터로는 DA26, 35K, 6.9K 및 폴리헤드린(polh) 프로모터들이다. 적합한 숙주세포 프로모터는 바람직하게는 곤충 종에서 유래한 hsp70 프로모터와 액틴 프로모터가 있다. 프로모터 서열에서 "유래한(derived from)" 서열들은 자연상태의 프로모터의 결실, 삽입, 치환, 중복 등의 변형들을 포함한다. 유일한 필요조건은 최종의 프로모터가 표적곤충세포에서 효과적으로 기능을 수행하여 결합되어 있는 이종 유전자의 발현을 조절하는 것이다.

발현 카셋트들은 분비를 조절하는 이종 단백질의 시그널 서열을 암호화하는 서열들을 또한 포함할 수 있다. 그 시그널 서열은 이종 단백질과 관련된 것일 수도 있고, 또는 다른 단백질에서 유래한 것일 수도 있다. 적절한 시그널 서열은 Bombyx mori의 pBMHPC-12 시그널 서열, Manduca sexta의 호르몬 시그널 서열, 아포리포포린 시그널서열, Bombyx mori의 코리온 시그널 서열, Drosophila melanogaster의 큐티클 시그널 서열, Drosophila melanogaster의 에스터라제-6 시그널 서열, 및 Bombyx mori의 성-특이적 시그널 서열에서 유래한 것들을 포함한다. 시그널 펩티드를 암호화하는 핵산서열은 5' UTR과 성숙한 이종 단백질의 첫머리 사이에 삽입된다. 시그널 펩티드 암호화 서열의 3' 말단부위와 성숙된 이종 단백질의 시작부위 사이의 연결점에서, 시그널 서열과 이종 서열간의 해독 틀이 일치하는(in frame) 방식으로 융합 단백질이 만들어질 수 있게 이종 서열을 삽입하도록 고안한다. 알려진 시그널 서열에서 "유래한(derived from)" 서열들은 시그널 서열 내부의 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 등의 변형을 포함한다. 유일한 필요조건은 결과적으로 만들어진 서열이 표적 곤충세포에서 효과적으로 기능을 수행하여 곤충세포로부터 이종 서열의 분비를 유도하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 이종 서열은 곤충조절물질, 즉 살충독소, 호르몬, 효소와 수용체 등을 암호화하는 서열을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 적합한 살충독소는 AaIT, AaHIT1, AaHIT2, LqhIT2, LqqIT1, LqqIT2, BjIT1, BjIT2, LqhP35, LqhαIT, SmpIT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-아가톡신, 킹콩톡신, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, ω-아트라코톡신 α-코노톡신, μ-코노톡신, 클로로톡신, 및 ω-코노톡신을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

곤충조절물질 및/또는 시그널 서열을 암호화하는 핵산 서열은 그 펩티드를 암호화하는 자연상태의 핵산 서열과 동일할 수도 있다. 선택적으로, 바이러스 벡터(또는 밀접한 관련된 주들) 및/또는 본 발명의 살충 바이러스 표적 곤충에서 알려진 유전자에 대한 최적의 유전자 부호 사용(optimal codon usage)을 고려하여 변경될 수도 있다. 유전자 코돈의 최적화 서열 즉, 특정 아미노산을 암호화하는 핵산서열이 변경되어도 그 위치가 암호화하는 아미노산의 변화가 없는 서열을 고안할 수 있는데, 예를 들면 바이러스 및/또는 표적 곤충에서 알려진 유전자와 본 발명에서 사용되는 시그널 서열, 그리고 곤충조절물질을 암호화하는 핵산 서열에서 유전자 부호 사용을 비교하는 방법이다. 바람직하게는 시그널 서열, 곤충조절물질을 암호화하는 서열에서 유전자 부호 사용은 바이러스 벡터 또는 표적 곤충의 유전자 코돈 사용을 반영한다. 유전자 부호와 최적화된 독소서열들의 예를 도 10, 11에서 볼 수 있다.

재조합 PxNPV의 생산

재조합 PxNPV는 (i) PxNPV DNA와 이종염기서열을 적절한 숙주세포에 동시에 트랜스펙션하고 생체내에서 상동 재조합을 하게하거나 (ii) 직접적 접합 벡터에 이종서열을 생체외에서 결합시키고 적절한 숙주세포에 그 제조물을 도입시켜 바이러스 번식을 하게 하는 방법으로 생산될 수 있다. 적절한 숙주세포라 함은 바큐로바이러스 증식을 도와주는 모든 세포들을 말하고, 이에는 Sf9 세포, Sf21 세포, 및 High Fire^TM세포(Invitrogen, Carlsbad, CA)등이 포함된다. 본 발명에서 분리된 바이러스는 조직 배양에서 플라크 분리에 의하여 클로닝된 것이거나 단 하나의 바이러스 유전자형(single viral genotype)에서 만들어진 것이다.

전형적으로 모듈 발현 벡터는 적절한 프로모터 서열이 이종 단백질을 암호화한 서열에 결합되어 있는 발현 카셋트를 포함하도록 구성되고, 이종 단백질은 프로모터의 조절 하에 놓이게 된다. 발현 카셋트는 모듈 발현 벡터로부터 잘려나와 생체외에서 DNA 결합에 의해 PxNPV 직접 연결 벡터에 삽입된다. 접합 반응 혼합물은 적절한 숙주세포에 트랜스펙션된다. 재조합 PxNPV는 증식배지에서 회수되고, LC₅₀과 LT₅₀은 섭취물 도포 분석방법, 섭취물 함유 분석방법, 잎잠금법 등의 전통적인 방법으로 특성이 규명된다.

LC₅₀은 시험기간 내에 감염된 유충의 50%가 죽는 바이러스 농도이다. LT₅₀은 특정 용량의 바이러스에 노출되어 감염된 이후 유충의 50%가 죽을 때까지 소요된 시간이다.

바람직하게는, 아래의 실시예 6에서 서술된 표준 섭취물 도포 분석방법을 이용하여 측정했을 때, 본 발명에 따른 PxNPV들은 Plutella xylostella 유충에서 1 x 10⁵OBs/16cm²이하를 나타낸다. 다른 바큐로바이러스 분리주는 Plutella xylostella 유충에서 높은 LC₅₀들을 보이는데, 다른 곤충 종에 대한 이들의 감염력과 비교하면 훨씬 저 효율적인 것이다.

살충제의 조성물(composition)과 제형(formulation)

본 발명은 하나 혹은 그 이상의 재조합 PxNPV 바이러스를 포함하는 살충제의 조성물과 제형을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 PxNPV는 야생형 PxNPV나 다른 재조합 형태의 바큐로바이러스보다 더 효과적으로 Plutella xylostells 유충을 죽인다(참조: 실시예 11).

본 발명에 따른 살충제의 조성물은 적어도 하나의 재조합 PxNPV를 포함한다. 살충제의 제형은 살충에 효과적인 양과 농학적으로 허용된 담체 속에 적어도 하나의 재조합 PxNPV를 포함한다. 살충 효과가 있는 양은 주어진 장소에 또는 농작물에 만연한 곤충 해충의 양이나 수로서, 곤충 해충에 의한 피해, 또는 다른 적절한 척도로써 명백한 해충 감염을 눈에 탐지할 수 있을 정도로 줄어들게 만드는 양이다. 제형은 젖을 수 있는 분말 형태일 수 있고, 분산 입자 제제, 입자, 현탁액, 유상액, 연무질 용액, 미끼, 및 다른 통상적인 살충제 제조물의 형일 수 있다. 적절한 담체는 물, 알콜, 탄화수소 또는 다른 형태의 유기용매, 또는 무기물, 동물, 또는 식물성 기름, 또는 활석, 진흙, 규산염, 또는 규조토 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 습윤제, 코팅제, 자외선 차단제, 분산제, 그리고 접착제 등이 포함될 수도 있다. 곤충을 유혹하거나 섭취의 행위를 증진시킬 수 있는 설탕과 같은 영양제가 포함될 수 도 있다. 젖을 수 있는 분말 형태나 다른 건조된 제조물이 굳는 것을 최소화하기 위해 유동성을 주는 제재 등이, 예를 들어 진흙이 포함된 유동성 제재, 포함될 수도 있다. 본 조성물은 코팅된 입자나 미세 캡슐에 싸인 물질로서 만들어질 수 있다. 조성방법은 절대 식물에 독성이 있어서는 안되며, 그 속에 포함된 재조합 PxNPV의 보전에 해가 되어서도 안되며, 어떤 구성요소가 현저하게 바이러스 기능이나 곤충의 섭취를 방해해서도 안 된다(참조: 유럽 특허 출원 제 0697 170 A1호; PCT 출원 제 WA 92/19102호; 및 미합중국 특허 제 4,948,586호).

또한, 본 발명의 살충제 제형은 하나 혹은 그 이상의 화학적 살충제 및/또는 하나 혹은 그 이상의 PxNPV가 아닌 생물학적 조절제를 포함할 수도 있다. 화학적 살충제는 피레트로이드(pyrethroid), 피라졸린(pyrazoline), 유기인산 (organophosphates), 카르바네이트(carbanate), 포르마딘(formadine), 및 피롤 (pyrrole) 등과 같은 당 업계에서 널리 알려진 것들을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다(참조: PCT 출원 제 96/03048호, 제 96/01055호, 및 제 95/95471호). 생물학적 조절제는 예를 들어, PxNPV가 아닌 바큐로바이러스(원형이나 재조합된); 바실러스 서린지엔시스(Bacillus thuringiensis); 노제마 폴리보라(Nosema polyvora); 엠 그랜디스(M. grandis); 브라콘 멜리터(Bracon mellitor); 곤충에 해를 주는 곰팡이; 및 선충류를 포함한다.

본 발명은 또한 곤충 해충을 죽이는 방법을 제공한다. 이것은 본 발명의 제형이나 조성물의 살충 효과적인 양으로 곤충을 접촉시키는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 살충 효과적인 양의 조성물이나 제형을 원하는 위치에 주입하여 예를 들어 농작물의 병충해를 감소시키는 방법을 제공한다. 살충 제형은 통상적인 기술로서, 예를 들어 농작물에 분무나 가루살포와 같은, 주입할 수 있다. 전형적으로, 제형은 약 2.4 x 10⁸과 약 2.4 x 10¹²OBs/헥타르 사이의 양으로 주입한다(OB는 오클루젼 바디이다). 효과적인 양은 예를 들어, 표적 곤충, 사용되는 재조합 PxNPV, 및 처리하는 농작물에 따라 다르다. 살충 효과량을 포함하는 1회 투여량은 당 업계에 일반적인 기술을 가진 사람들이 사용하는 통상적인 방법으로 결정될 수 있다.

다음 실시예들은 본 발명을 한정함이 없이 예시로 보여주는 것이다.

실시예 1: Egt-결손된 베타-갈락토시다제를 포함하는 재조합 PxNPV의 제조

하기 실험은 바이러스의 엑디스테로이드 글루코실 트랜스퍼라제(egt) 유전자를 결실시키고, 대장균(E.coli)의 베타-갈락토시다제(β-gal) 표지유전자를 대체시킨 재조합 PxNPV를 만들기 위해 수행되었다.

유전자 재조합을 위한 바이러스 클론 원종(stock)을 생성하기 위하여, 곤충에서 몇 세대 지난 야생형 PxNPV 원종을 플라크 순수분리 하였다(참조: O'Reilly et al. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, New York, NY, 1994). PxNPV-3로 명명된 본 원종의 상태(integrating)는 PxNPV의 부모세대 원종의 제한효소 패턴과 비교함으로써 확인되었다. 다양한 곤충종을 대상으로 생물학적 정량분석을 한 결과, 이것의 독성이 클론하지 않은 원종과 일치하는 것도 또한 확인하였다.

도 1은 베타-갈락토시다제 유전자를 주입함으로써 PxNPV의 egt 유전자를 파괴하는데 사용하기 위한 이동 벡터(transfer vector)를 제조하는 과정을 보여주고 있다. AcNPV와 PxNPV의 제한효소 패턴의 유사성은, 미합중국 특허 제 5,662,897호에서 개시된 AcNPV의 V8 종에 기초한 이동 벡터 사용을 가능케 한 DNA 수준에서 상동성을 보여주었다. pmd 216.1로 명명된 β-gal 카셋트를 포함하는 벡터는 하기와 같이 제조되었다. Drosophila melanogaster hsp 70 프로모터의 조절 하에 있는 β-gal 유전자를 포함한 Bam H1-Xba I 절편은 pAcDz1(참조: Zuidema et al., J. Gen Vir ol. 71:2201, 1990)에서 분리되었다. 이 절편은 다시 pBluescript^TMSK⁺(Stratagene, La Jolla, CA)의 폴리링커에 있는 BamHI와 XbaI 위치에 서브클론되었다. egt 유전자와 그 주위를 포함하는 AcNPV의 V8vEGTDEL종의 Pst "G" 절편은(참조: 미합중국 특허 제 5,662,897호) pUC9의 PstI 위치에 서브클론하였다. 이렇게 이루어진 플라스미드를 pmd 205.1이라 명명하였다.

마지막 이동 벡터는 (i) 카프 인테스틴 포스파타제(calf intestine phosphatase)로 탈인산화시킨 후, BamHI 과 PstI으로 자른 pBluescript^TMSK⁺; (ii) pmd 205.1의 BglII에서 Pvu II 사이의 0.975 kb 절편; (iii) pmd 216.1의 Sma I에서 Xba I 사이의 3.86kb β-gal 절편; 및 (iv) pmd 205.1의 Xba I에서 Pst I 사이의 1.6 kb 절편간의 4개 절편 접합을 수행하여 만들어졌다. 이렇게 만들어진 이동벡터를 pmd 220.2라 명명하였고, 이 벡터는 egt 결실 부위에 클론된 hsp 70에 의해 발현되는 β-gal 표지 유전자를 포함하고 있다.

egt 결손 β-gal 표지 PxNPV는 Sf-9 세포주에 동시 트랜스펙션된 pmd 220.2와 PxNPV-3 DNA 사이의 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 만들어졌다. 1μg의 pmd 220.2 DNA와 250ng의 PxNPV-3 DNA를 최종 200μl TNM-FH(JRH Biosciences, Lenexa KS)속에서 25μg의 리포펙틴(Lipofectin, Gibco BRL, Gaithersburg MD)과 함께 혼합하였다. 상온에서 15분간 방치한 후, 혼합물을 TNM-FH 완전 배지(TNM-FH, 10% 태아송아지 혈청, 1% pluronic F68(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD))로 최종 2.0ml이 되게 하였다. 혼합물은 표준 6-웰 조직배양접시에 배양된 2.75 x 10⁵Sf-9 세포에 넣어주었다. 24시간 후 세포를 새로운 배지로 갈아주고 발아해 나오는 바이러스를 96시간 추가배양 후 수확하였다. 재조합 바이러스는 오클루젼 바디를 가지고 β-gal유전자를 발현하고 있었다. 재조합체(occ⁺/파란 플라크)는 100μg/ml의 5 브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드(5 bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, X-gal)의 존재하에 세 번의 플라크 순수분리를 통하여 동정하였다. 결과적인 바이러스를 T96-19.1.1.1로 명명하였다.

실시예 2: Egt-결손 직접 접합 PxNPV 바이러스 벡터의 제조

하기 실험은 PxNPV로부터 유래한 직접 연결 벡터의 제조를 위해 수행하였다(참조: 국제특허출원 제 US 94/06079호). 이 벡터는 PxNPV 유전체의 egt 위치에 삽입된 폴리링커("Bsu-Sse 링커"로 명명, 아래 참조)를 포함하고 있다.

Bsu-Sse 링커를 만들기 위해 다음의 염기서열을 가진 두 올리고핵산이 합성되었다:

5'-CCTCAGGGCAGCTTAAGGCAGCGGACCGGCAGCCTGCAGG-3'

(올리고 32),

5'-CCTGCAGGCTGCCGGTCCGCTGCCTTAAGCTGCCCTGAGG-3'

(올리고 33)

어닐링(annealing)이 되면, 이 두 올리고머는 Bsu 36I 및 Sse 8387I를 포함한 재조합 바이러스 제조에 유용한 몇 개의 제한효소 절단부위를 암호화하게된다. 각 올리고머를 10mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 7.5), 100mM 염화나트륨과 1mM EDTA를 포함하는 어닐링 완충액으로 30pmol/μl의 농도로 희석하였다. 혼합액을 95℃에서 10분간 가열하고 여러 시간에 걸쳐 상온으로 천천히 냉각하였다.

어닐링된 올리고핵산을 pmd 205.1 이동 벡터에 다음과 같이 삽입하였다. pmd 205.1 벡터를 egt 결손의 상위에 위치한 단일부위의 Spe I으로 잘랐다(도 2). 잘라진 플라스미드 말단은 4종류 뉴클레오타이드 존재하에 DNA 중합효소 I의 클레노우 조각(Klenow fragment)을 사용하여 끝을 메꾸었다. 다음 100ng의 선형 플라스미드를 15pmol의 이중나선 링커와 최종 10μl의 용액에서 T4 리가아제로서 연결하였다. 접합 반응이 완성된 후, T4 리가아제를 열로서 불활성화하고 혼합액을 폴리뉴클레오타이드 키나아제(polynucleotide kinase)로 처리하였다. 8.8 kb DNA를 1% 저용융점 분리 등급의 아가로즈 젤(BioRad, Richmond VA)에 전기영동한 후 순수분리하였다. 8.8 kb 의 선형 DNA를 가진 젤 조각을 65℃에서 녹이고, DNA를 다시 원형으로 만들기 위해 약 1/10의 젤 조각을 사용하여 젤-내 접합을 한 후, E. coli DH5α세포에 형질전환하였다.

결과적인 플라스미드는 중합효소 연쇄반응(PCR)으로써 egt 유전자에 상대적인 Bse-Sse 링커의 방향성을 결정하고 스크린하였다. 올리고 32와 33은 egt 유전자 결손부위의 5' 특수한 염기서열인 올리고머 EGT 1(5'-GCGGCCAATATATTGGCCGTGTTT-3')과 각각 짝을 이루었다. LAB 50.2에 있는 Bse-Sse 링커의 방향성을 도 2에서 보여주고 있다.

egt-결손 직접 연결 PxNPV 벡터는 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 1μg LAB 50.2와 250 ng T96-19.1.1.1 바이러스 DNA를 사용하여, 배양된 Sf9 세포에 동시 트랜스펙션된 LAB 50.2와 T96-19.1.1.1 PxNPV 바이러스 DNA 사이의 상동재결합으로 제조되었다. 이 경우, 재조합 바이러스는 오클루젼 바디를 가지며 β-gal 유전자를 발현하지 않았다. 재조합 바이러스(occ⁺/흰색)는 100μg/m X-gal의 존재하에 세 번의 플라크 순수분리를 통하여 동정하였다. 결과적인 바이러스를 T97-8.1.1.1로 명명하였다(ATCC 기탁번호 제 VR-2608호).

실시예 3: 재조합 PxNPV의 생산에 유용한 모듈 발현 벡터의 제조

A. pMEV 1-4

외부유전자를 바큐로바이러스의 프로모터 조절 하에 발현하기 위해 벡터 pMEV1, pMEV2, pMEV3, 및 pMEV4를 고안하고, 제조하고 사용하는 것은 국제특허출원 제 US 94/06079호에서 개시되었다. 이 벡터들은 도 3에서 보여주는 것과 같은 일반적인 구조를 가지고 있다. 각 벡터는 pBluescript SK+(Stratagene, La Jolla CA)의 pBluescript 폴리링커에 있는 Sst I과 Xho I 사이의 부위를 다음과 같은 요소들로 조성된 발현 카셋트로 대치하여 이루어졌다: (i) 제한효소 Sst I, Sse 8387 I 및 Stu I 절단부위를 가지는 짧은 합성 링커 DNA; (ii) 원하는 AcMNPV 바이러스 유전자의 프로모터와 완전한 5' 비해독부위(UTR)를 포함하는 프로모터 모듈; (iii) 원하는 단백질의 해독부위를 삽입하는데 용이한 폴리 링커 모듈; (iv) AcMNPV 6.9K(염기성 단백질) 유전자의 완전한 3' 비해독부위로 이루어진 3' UTR 모듈; (v) 제한효소 Stu I, Bsu 36 I 및 Xho I 절단부위를 가진 짧은 합성 링커 DNA.

도 4에서 보여주는 바와 같이, 벡터 pMEV1에서 pMEV4에 있는 프로모터 모듈은 바이러스 생활사의 다른 단계에서 발현되는 유전자들로부터 유래한 것이다. pMEV1의 DA26 유전자 프로모터 모듈과 pMEV4에 있는 35K 유전자 프로모터 모듈은 바이러스 생활사에서 초기에 발현되는 유전자에서 유래하였다; 즉, DNA 합성이 시작되기 전, pMEV2의 6.9 K 유전자 프로모터 모듈은, DNA 합성이 시작된 이후에 발현되는, "후기(late)" 구조 유전자에서 유래하였고 pMEV3에 있는 폴리헤드린(polh)유전자 프로모터는 바이러스 오클루젼 바디의 주된 구성성분을 만드는 "말기(very late)" 유전자로부터 유래하였다.

폴리링커 모듈은 단백질 해독부위를 복잡한 링커 시퀀스를 도입하지 않고 프로모터의 5' UTR 근처에 위치할 수 있도록 고안되었다. 도 5에서 보여주듯이, 폴리링커는 Esp3 I 제한효소 절단부위를 가지고 있어서 벡터를 Esp3 I로 처리하면 프로모터 모듈의 상위가닥에 있는 -4와 -5 사이와 하위가닥의 폴리링커와 프로모터 접촉지점을 자르게 된다. Esp3 I으로 잘린 DNA를 4종의 표준적 2'-디옥시핵산 삼인산 (2'-deoxynucleoside triphosphate, dNTPs)의 존재 하에 DNA 중합효소로 처리하면 정확히 프로모터 모듈의 3' 말단부위가 블런트(blunt)로 잘라진 선형의 벡터를 만들게 된다. 이렇게 만들어진 단편은 원하는 단백질 코딩부위의 ATG 시작 코돈으로 시작되는 5' 블런트-말단(blunt-end) 조각과 연결될 수 있다. 단백질 코딩조각의 방향성 클로닝을 용이하게 하기 위하여, 단편의 3' 말단에 폴리링커 모듈에 있는 제한효소 절단부위(도 5에서 BamH I으로 도해됨)를 가지도록 제작되었고, 단백질 코딩 단편과 벡터는 접합하기 전 이 효소로 잘라주었다.

이들 벡터의 주된 특징은 발현카셋트의 양쪽에 Sse 8387 I와 Bsu36 I 제한효소 절단부위를 가지는 것이다. 이것은 모듈로 발현되는 벡터로부터 삽입된 염기서열을 떼어내어 본 발명의 직접 접합 PxNPV 벡터에 접합되도록 하여준다(상단 실시예 2 참조).

B. pMEV5와 pMEV6

두 벡터는, pMEV5와 pMEV6, D. melanogaster의 hsp70(주된 열충격) 유전자 프로모터를 가지도록 제작되었다. pMEV5는 D. melanogaster hsp70 프로모터/5' UTR (도 4에서 hsp70Bam로 표시)의 724 염기쌍 조각을 가지고 있으며 이는 hsp70 유전자의 전사 시작점을 기준으로 -493에서 +231 위치에 걸쳐있는 부위이다. pMEV6는 -244에서 +231 사이를 걸치는 475 염기쌍의 동일한 프로모터/5'-UTR(도 PD2에서 hsp70Xba로 표시)를 가지고 있다.

pMEV5와 pMEV6를 제작하기 위한 프로모터 모듈은 phcHSP70PL(참조: Morris et al., J. Virol. 66:7397 (1992))를 주형으로 사용하여 PCR 증폭함으로써 합성되었다. 본 반응의 올리고핵산 프라이머들과 증폭된 생성물의 염기서열은 도 6과 7에서 보여주었다(pMEV5와 pMEV6 각각에 대해). 각 프라이머는 두 부분으로 된 구조를 가지고 있다. 5' 부분은 phcHSP70PL 주형과 염기서열 상동이 없으며 최종 PCR 생성물의 말단에 특정 제한효소부위를 삽입하기 위하여 사용되었다. 이들은 PCR 생성물 5' 말단에 Sst I, Sse8387 I 및 Stu I과 PCR 생성물 3' 말단에 Esp3 I와 Xba I을 포함한다(참조: 도 6, 7). 각 프라이머의 3' 부위는 phcHSP70PL 주형과 동일 염기서열을 가지고 있고 각 모듈에 있는 특정 hsp70 염기서열의 한쪽 경계면을 결정하고 있다.

PCR 반응전, 200pmol의 프라이머와 10 ml 의 70mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 7.5), 10mM 염화마그네슘, 5mM DTT, 1mM ATP 및 10 units T4 폴리핵산 키나아제 (New England Biolabs, Beverly MA)를 포함하는 반응액에 30분간 37℃에서 반응함으로써 (-)가닥 프라이머(HSP70Esp) 5' 말단을 인산화하였다. PCR 반응은 독립적인 MicroAmp 튜브(Perkin Elmer, Norwalk CT)에서 다음과 같은 과정으로 수행하였다. 각 프라이머 50pmol을 0.25 - 1.0ng의 phcHSP70PL DNA와 200μM dNTPs, 1X 클론된 Pfu 중합효소 완충액(Stratagene, La Jolla CA)과 5 유니트의 Pfu DNA 중합효소 (Stratagene, La Jolla CA)가 들어있는 최종50μl 반응용액과 혼합하였다. 샘플들은 퍼킨-엘머 모델 9600 열순환기(Perkin Elmer, Norwalk CT)에서 94℃에서 1분간(변성단계), 50℃에서 1.5분간(어닐링단계), 3분간 72℃(신장단계)의 2 사이클을 돌리고 뒤이어 1분 94℃, 1.5분 55℃, 3분 72℃의 사이클을 28회 하였다. 마지막 사이클에, 신장단계는 7분간 추가하였고 반응물을 4℃로 냉각하였다. 증폭된 생성물을 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1)로 한번 추출하고, 0.3M 아세트산 나트륨 (sodium acetate)로 조정한 후 에탄올로 침전시켰다.

적절한 반응 완충액에 녹인 후, DNA를 Pst I(Sse8387 I 부위를 자르는)으로 자르고 hsp70 프로모터 모듈을 가지는 것으로 예상되는 절편을 1.2% 저용융점 분석등급의 아가로즈 젤(BioRad, Richmond, CA)에 전기 영동 함으로써 순수정제하였다. pMEV5과 pMEV6를 만드는 기본 벡터는 pMEV1를 EcoR I으로 자르고 그 말단을 모든 4종의 dNTPs의 존재하에 DNA 중합효소 1의 클레노우 조각으로 채움으로써 제작되었다. 이 벡터를 Sse8387 I로써 이차 절단하고 말단을 카프 인테스틴 알칼라인 포스파타제(calf intestine alkaline phosphatase)로써 탈인산화한 다음, pBluescript와 3'UTR과 폴리링커 모듈을 가지는 큰 단편(3.1 kb)을 저 용융점 아가로즈 젤에서 순수분리하여 각각 순수분리된 hsp70 프로모터 모듈과 접합하여 pMEV5와 pMEV6를 만들었다.

C. pMEV5/ADK-AaIT pMEV6/ADK-AaIT

상기한 pMEV5와 pMEV6 벡터는 안독튜오누스 오스트랄리스(Andoctuonus australis, Hector)(참조: Zlotkin et al.,Biochimie 53:1073 (1971))에서 발현되는 곤충-특이적 독소인 AaIT를 만드는 유전자를 삽입하기 위해 좀더 설계되었다. AaIT를 곤충의 유충의 체강에 주입하면, 이것은 전압에 민감한 나트륨 체널에 선택적으로 결합하고 일시적인 수축성 마비상태를 일으킨다. AaIT-생성 바큐로바이러스를 곤충유충에 감염시키는 독소의 만성적 주입은 지속적인 마비상태를 만들고 궁극적으로 죽음과 연관된다(참조: Stewart et al., Nature 352:85 (1991); Maeda et al., Virol. 184:777(1991); McCutchen et al., Biotechnol. 9:848 (1991)). 미합중국 특허 제 5,547,871호에는 AaIT독소분비가 Manduca sexta의 아디포키네틱 호르몬 (adipokinetic hormone, ADK) 유전자로부터의 시그널 펩티드에 의해 조절되는 코돈-최적화된 ADK-AaIT 유전자 염기 서열이 게시되어 있다. ADK-AaIT 암호화 부위의 pMEV1-pMEV4 벡터로의 삽입은(플라스미드 pMEV1/ADK-AaIT에서 pMEV4/ADK-AaIT를 만들기 위해) 국제특허출원 제 US 94/06079호에서 개시되었다.

ADK-AaIT를 가지는 pMEV5와 pMEV6 유도체를 제조하기 위하여, ADK-AaIT 유전자 염기 서열을 가지는 절편을 pMEV3/ADK-AaIT를 주형으로 PCR로 증폭하여 합성하였다. PD30으로 명명된 (+)가닥 프라이머는 ADK 시그널 펩티드의 ATG 개시 코돈에서 시작한다. 69K3UT로 명명된 (-)가닥 프라이머는 폴리링커의 아래쪽 위치에서 DNA 합성을 시작할 수 있도록 선택하였다; 즉, pMEV3/ADK-AaIT의 3' UTR내에. 프라이머 염기서열과 증폭된 DNA 절편은 도 8에서 제시되었다.

증폭에 앞서, (+)가닥 프라이머, PD30, 5' 말단은 HSP70Esp에서 상기한 바와 같이 인산화되었다. PCR반응은 역시 상기한 바와 같이 기본적으로 수행하였으나, 증폭은 1분간 94℃, 1.5분간 52℃, 3분간 72℃의 사이클을 25회 반복하였다. 합성후, DNA를 폴리링커 모듈을 자르는 BamH I으로 자르고 ADK-AaIT 암호화 부위를 포함하는 274 염기쌍의 5'-블런트(blunt)/BamH I 절편을 pMEV5와 pMEV6로 삽입하였다. 결과적인 플라스미드, pMEV5/ADK-AaIT와 pMEV6/ADK-AaIT의 구조는 제한효소분석과 부분적 DNA 염기 서열분석으로 확인하였다.

D. ADK 시그널 펩티드 모듈을 가진 MEVS 벡터

하기 실험은 어떤 삽입된 염기 서열을 직접 분비되게 하는데 사용될 수 있는 ADK 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA를 가지는 일련의 모듈 발현 벡터를 제조하기 위하여 수행하였다. pMEV1/ADK에서 pMEV6/ADK로 명명된 일련의 벡터가 57 염기쌍의 코돈-적정화된 ADK 시그널 펩티드 염기 서열(도 8에서 1-57번 위치)이 프로모터와 폴리링커 모듈사이에 위치하도록 제조되었다. 이들 벡터의 발현 카셋트는 도 9에서 보여주는 바와 같은 일반적인 구조를 가지고 있다.

pMEVx/ADK 벡터 시리즈를 제조하기 위해, 프로모터 모듈과 연결된 ADK 시그널 펩티드를 포함하는 DNA 절편은 PCR에 의해 pMEVx/ADK-AaIT 벡터의 상응하는 부위로부터 만들어졌다. 이 반응에 사용되는 (+)가닥 프라이머는 5' 말단의 프로모터 모듈에서 DNA 합성이 시작하도록 프라임하는 프로모터 특정 올리고핵산이며, 증폭된 단편의 5' 말단에 Sst I, Sse8387 I 및 Stu I의 제한효소절단부위를 가지게 한다. 각 반응에 사용되는 주형과 (+) 가닥 프라이머는 아래 도표에 열거하였다:

ADKRev(5'-CGGATCTAGACACGTCTCGGGCCTCAGCGATAATCACGAAGGC-3')로 명명된, 각 반응의 (-)가닥 프라이머는 ADK 시그널 펩티드의 3' 말단으로부터 합성이 개시되도록 하고 증폭된 3' 말단에 Esp3 I와 Xba I 제한효소 절단부위를 가지게 한다. PCR 반응은 pMEV5-6 제조에서 상기한 것과 동일하게 수행하였으나, 증폭은 1분간 94℃, 1.5분간 52℃, 3분간 72℃에서 25 사이클을 수행하였다. 합성된 모든 DNA는 pMEV5/ADK-AaIT를 제외하고 모두 프로모터 상위의 Sse8387 I부위를 자르는 Pst I과 ADK 시그널 펩티드의 하위를 자르는 Xba I으로 잘랐고, 프로모터 모듈과 시그널 펩티드를 포함하는 절편은 pMEVx 벡터 중의 하나에, 예를들어 pMEV1, 있는 Pst I (Sse8387 I)과 Xba I 사이에 삽입하였다.

pMEV5에 있는 hsp70Bam 프로모터 모듈이 내부에 Xba I 사이트를 가지고 있기 때문에, hsp70Bam/ADK 모듈은 반드시 pMEVx 골격에 두 조각으로 삽입되게 된다. 그러므로, pMEV5/ADK-AaIT 주형으로부터 합성된 DNA의 한 부분은 Pst I와 Xho I으로 자르고 두 번째 부분은 Xho I과 Xba I으로 자른다. hsp70Bam/ADK 모듈의 5' 부분인 Pst I/Xho I 절편은 hsp70Bam/ADK 모듈의 3' 부분인 Xho I/Xba I 절편과 조합되고 pMEV1으로부터 제조된 Pst I/Xba I 벡터 절편과 연결되었다.

결과물인 pMEVx/ADK 벡터는 상응하는 pMEVx 벡터와 구조적으로 동일하지만, 57 염기쌍의 ADK 시그널 펩티드가 프로모터와 폴리링커 모듈사이에 삽입된 것이다.

실시예 4: 살충 독소를 암호화하는 모듈 발현 벡터의 제조

하기 실험은 본 발명에 따라 재조합된 PxNPVs에 삽입하기 적합한 살충효과가 있는 독소를 암호화하는 모듈 발현 벡터를 생산하기 위해 수행하였다.

A. Txp-I

스트로 이치 진드기(straw itch mite) 독소인 Txp-I는 포악한 스트로 이치 진드기 피에모테스 트리티시(Pyemotes tritici, 참조: Tomalski et al., Toxicon 27:1151 (1989))의 독액에서 분리한 마비형 신경독소이다. tox34 유전자는 291 아미노산을 가진 전구체 단백질을 암호화한다(참조: Tomalski et al., Nature 352:82 (1991)).

재조합된 PxNPV에 존재하는 tox34 유전자의 효능을 실험하기 위하여, 세포로부터 독소를 분비하게 하는 아미노말단의 시그널 서열이 다른 세 종류의 다른 Txp-I 조합체를 제조하였다. 하나는 원래의 tox34 아미노말단을 유지하고 있다; 다른 하나는 tox34의 전구단백질의 40개의 아미노 말단 대신 ADK의 시그널 펩티드를 가지고 있다; 다른 하나는 tox34 전구단백질의 아미노말단의 26개 대신 ADK 시그널 펩티드를 가지고 있다.

tox34 유전자의 세 개의 다른 단편들을 1-291 (tox34로 명명), 27-291 (tox34L) 및 40-291(tox34S)으로 PCR로 합성하고 상기 기술한 하나 혹은 그 이상의 모듈 발현 벡터에 클론하기 위하여 개조하였다. 증폭반응에 사용한 주형은 플라스미드 pHSP70tox34 (참조: Lu et al., Biological control7:320(1996))이다. 각 증폭에 사용한 (+) 가닥 프라이머는 다음 도표에서 보는 바와 같다:

TOX34CT2 라고 명명한 (-) 가닥 프라이머는,

5'-GTACCCCCGGGATCCAATTTAACACAGTCTTGAATCACTT-3', tox34 코딩부위의 3' 말단에서 합성을 프라임하고 증폭된 단편의 3' 말단에 BamH I과 Xma I(Sma I)제한효소 절단부위를 만든다. 증폭에 앞서, 각 (+)가닥 프라이머의 5' 말단은 실시예 3에서 HSP70Esp의 프라이머에 대해 기술한 바와 같은 과정을 사용하여 인산화 하였다. PCR 반응은 실시예 3에서 기술한 바와 같이 수행하였으나, 증폭 사이클링은 1분간 94℃, 1.5분간 45℃, 3분간 72℃로 2 사이클을 하고 이어서 1분 94℃, 1.5분 55℃, 및 3분 72℃로 28 사이클을 하였다.

합성 후, DNA를 Xma I로 자르고 5'-블런트/3- Xma I tox34 암호화 부위 단편 (tox34, tox34L 및 tox34S로 명명)을 순수 분리하여 실시예 3에서 기술한바와 같이 제조된 MEVS 벡터에 클론하였으나, 폴리링커는 BamH I 대신 Xma I(Sma I 부위를 자른다)으로 잘랐다.

다음 도표에는 각 TxP-I을 발현하는 MEVS 벡터를 제조하는데 사용한 구성 요소를 종합하였다.

B. LqHIT2

많은 부티내(Buthinae) 전갈 독액은 흥분성 독소, 예를 들어 AaIT, 뿐만이 아니라 곤충에 특이한 독소를 포함하는데, 이것은 느리고 점진적인 근육 이완 마비를 가져오게 한다(참조: Zlotkin et al., Biochemistry 30:4814 (1991)). 이 그룹에 속하는 것 중 가장 잘 연구가 되어있는 것은 LqHIT2라는 독소로써 이것은 라이우러스 퀸케스티아투스헤브리아우스(Leiurus quinquestriatus hebreaeus)라는 전갈에서 분리된 것이다. LqHIT2의 cDNA 클론은 21개 아미노산의 시그널 펩티드와 번역 후 제거되는 세 개의 C-말단 아미노산 (Gly-Lys-Lys)을 가지고 있음이 밝혀졌다(참조: Zlotkin et al., Arch. Insect Biochem. Physiol. 22:55 (1993)).

LqHIT2가 PxNPV의 살충 활성을 증가시킬 수 있는지를 탐색하기 위하여, 완전한 LqHIT2 독소를 암호화하는 DNA를 만들고 네 개의 다른 pMEVx/ADK 발현 벡터에 클론하였다: pMEV1/ADK, pMEV2/ADK, pMEV5/ADK, 및 pMEV6/ADK. 도 10에서 보여주는 독소의 암호화 부위 염기서열은 61개의 코돈에서 27개가 원상의 cDNA와 다르다; 이러한 변화는 합성된 LqHIT2의 암호화 부위에서 코돈 사용이 AcMNPV 게놈에서 전반적인 코돈 사용을 반영하도록 도입되었다(참조: Ayres et al (1994)).

LqHIT2 암호화 부위를 포함하는 DNA 절편의 조합은 여러 단계에 거쳐 만들어졌다. 첫째, LqHIT2의 암호화 부위와 작은 양의 3' 측면 링커 DNA의 양쪽 가닥을 각각 인식하는 4개의 올리고핵산이 합성되었다(도 10). 사용전, 올리고핵산 LqHIT2F2 ((+) 가닥의 3' 부위를 포함하는)과 LqHIT2R3 ((-) 가닥의 3' 부위를 포함하는)의 5' 말단을 실시예 3에서 기술한 바와 같은 방법으로 인산화하였다. 40pmol의 각 올리고핵산을 10μl의 50mM 염화나트륨에서 95℃에서 짧게 가열한 뒤 혼합액을 60℃로 천천히 식히면서 어닐링하였다. 혼합액 총 부피를 40 μl로 조절하고 두 개의 반쪽 LqHIT2 암호화 영역(LqHIT2F21:LqHIT2R3 및 LqHIT2F2:LqHIT2R4)을 접합하였다. 각 올리고핵산의 합성 시 불완전 합성 생성물의 존재로, 초기 접합은 절편의 길이가 200-1000 염기쌍이 되는 다양한 혼성물을 만들었다. 이 혼성물로부터 O.5μl의 접합 반응액을 주형의 출처로 사용하고 올리고핵산 LqHIT2 PCRF(5 말단을 인산화한)과 LqHIT2 PCRR(도 10)을 프라이머로 사용하여 PCR로서 원하는 생성물을 얻었다. 증폭은 실시예 3에서와 같이 1분간 94℃, 1.5분간 55℃, 3분간 72℃에서 25 사이클을 수행하였다. 합성 후, DNA는 종결코돈 근접부위에 있는 링커 부위를 자르는 BamH I으로 자르고, 190 염기쌍의 5'-블런트/3'-BamH I 단편을 젤 전기영동으로 순수분리하고, 실시예 3과 도 5에서 약술한 바와 같이 pMEV1/ADK, pMEV2/ADK, pMEV5/ADK, 및 pMEV6/ADK와 같은 MEVS 벡터에 클론하였다. LqHIT2의 암호화 부위 염기서열은 DNA 서열 결정으로 확인하였다.

B. ω-ACTX-HV1

ω-아트라코톡신(ω-atracotoxin)은 호주 깔대기 망사 거미(Australian tunnel web spider)로부터 분리된 살충성 펩티드 독소에 속한다. 이 그룹에서 가장 잘 연구되어있는 것은 ω-아트라코톡신-HV1(ω-ACTX-HV1)으로, 블루마운틴 깔대기 망사 거미인 하드로니세 버수타(Hadronyche versuta)의 독액으로부터 분리한 37개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 독소(참조: 국제특허출원 제 AU93/00039호)이다. ω-ACTX-HV1는 곤충의 볼테지-게이트 칼슘 채널을 저해하고 헬리코버파 아미제라 (Helicoverpa armigera) 유충에게 치명적이나 갓 태어난 쥐에게는 무해하다.

ω-ACTX-HV1의 아미노산 배열순서에 기초하여, ω-ACTX-HV1의 암호화 부위 두 가닥과 짧은 3' 근접 링커 DNA를 대표하는 두 개의 올리고핵산이 고안되었다. ω-ACTX-HV1의 암호화 부위에 있는 코돈 사용은 전반적인 AcMNPV의 코돈 사용을 반영하도록 고안되었다(참조: Ayres et al (1994)). 이러한 올리고핵산의 염기서열은 도 11에서 보여주고 있다. ACTXHVIF와 ACTXHVIR의 올리고핵산 길이로 인하여, 불완전한 합성물이 생겼을 가능성이 많았다. 그래서, MEVS에 클론한 적절한 ω-ACTX-HV1의 코딩 절편을 합성하는데 위 LqIT2에서 기술한 바와 같은 방법을 사용하였다. 이 경우, 원하는 완전한 길이의 ω-ACTX-HV1를 PCR로 증폭하기 위하여 0.1pmol의 각 올리고핵산을 섞어서 PVR 주형으로 사용하였다. 반응의 프라이머는 ACTXPCRF(위에서 기술한 바와같이 5' 말단이 인산화되었다)와 ACTXPCRR이다. PCR 반응은 위에서 기술한 바와 같이 수행하였으나, 1분간 94℃, 1.5분 55℃, 3분 72℃에서 15 사이클로서 증폭하였다. 증폭 후, DNA는 종료 코돈에 가까이 있는 링커 부위를 자르는 BamH I으로 자르고, 원하는 118 염기쌍의 5'-블런트/3'-BamH I 단편을 젤 전기영동으로 분리하여 pMEV1/ADK, pMEV2/ADK, pMEV5/ADK, 및 pMEV6/ADK와 같은 MEVS 벡터에 클론하였다. 각 벡터에 ω-ACTX-HV1의 암호화 부위 염기 서열은 DNA 서열 결정으로 확인하였다.

실시예 5: 재조합 PxNPV 제조

하기 실험은 살충 독소를 암호화하는 재조합 PxNPV를 제조하기 위하여 수행하였다.

바이러스 DNA는 오클루젼 바디(참조: O'Reilly et al. 1994)로부터 만들었다. 순수정제된 DNA는 μg DNA당 5유니트의 Bse 361와 Sse8387 I를 사용하여 잘랐다. 잘라진 조각에서 바이러스 게놈 DNA를 분리하는데 크기배제 크로마토그라피 또는 수크로즈 농도차 분리를 사용하였다. 결과적으로 얻어진 선형 바이러스 DNA를 에탄올에 침전시키고 0.2 - 1μg/μl의 농도로 10mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 8.0/ 1 mM EDTA) 용액에 녹였다.

0.5μg의 선형 DNA는 적절한 MEV 벡터로부터 나온 15ng의 Bse 36I/Sse 8387I단편과 5μl 반응액으로 15℃에서 하룻밤 접합하였다. 이 혼합액은 실시예 1에서 기술한 바와 같이 Sf-9 세포를 트랜스펙션하는데 사용되었다. 세포는 트랜스펙션 24시간 후 새로운 배지로 갈아주었다. 추가로 72 시간을 배양후, 세포 상층액을 수확하였고, 희석하고, 플라크 분리를 위하여 Sf-9 세포에 재트랜스펙션하였다. 임의의 플라크를 골라내어 0.5ml의 TNM-FH 완전배지에 6 x 10⁴세포/well/48웰 플레이트 들어있는 Sf-9세포에 감염시켰다. 재조합체는 주입된 유전자에 특이적 프라이머를 사용하여 확인하였다. 양성반응이 나온 웰에서 나온 바이러스는 두 번의 추가 플라크 순수분리를 거쳐 순수분리 하였다.

다음 도표는 제조된 다양한 재조합 PxNPV에 관한 정보를 제공하고 있다.

실시예 6: 살충성 단백질을 발현하는 재조합 PxNPV의 효율

하기 실험은 본 발명에 따라 재조합된 PxNPV의 살충효능을 알아보기 위하여 수행하였다.

2차 탈피단계에 있는 Plutella xylostella(2-3일된, 0.15-0.3mg) 유충을 사용하여 테스트 곤충집단의 50%의 사망률(i.e., LC₅₀)을 얻기 위해 필요한 주입양을 결정하기 위하여 표준 섭취물 도포 분석실험을 수행하였다. 바이러스 원종(stock)을 0.01% 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)에 연속적으로 희석하고 이 바이러스 현탁액의 50μl를 아마씨 오일-접합된 스톤빌 다이어트(Southland Products Incorporated, Lake Village, AK)를 포함하는 15mm 둥근 판의 표면에 발랐다. 개개의 유충을 각 둥근판에 놓고 테스트 기간동안 감염된 식사를 시켰다. 테스트 기간 첫 3일 간은 하루에 두 번씩 그리고 그 후 6일 내지 7일 후 번데기가 되기 시작할 때까지는 적어도 하루에 한번 씩 죽은 유충의 수를 기록하였다(참조: Finney, 1952). 평균 사망 기간(LT₅₀)은 단일섭취에서 사망에 대한 시간의 프로빗 (Probit) 분석으로 결정하였다.

결과를 하기 도표에서 보여주었다. 비교를 위하여, 모든 오클루젼 바디(OB) 농도는 OBs/16cm²로서 표시하였다.

프로빗값은 32 유충/섭취 처리의 4개의 반복실험에서 얻어졌다.

*ND 관찰하지않았음

이러한 결과는 (i) PxNPV 게놈의 독소 유전자의 추가가 Plutella xylostella 유충을 죽이는 속도를 증가시켰을 뿐 아니라 유효한 LC₅₀을 확연히 낮추었고; (ii) 재조합 PxNPV는 유사한 재조합 바이러스 AcNPV와 비교하여 확연히 낮추어진 LC₅₀으로 훨씬 빠른 속도로 죽이는 것을 보여주었다.

다음 도표는 두번째 곤충에 특이한 톡신, tox34,를 발현하는 재조합 PxNPV를 분석한 데이터이다.

이러한 데이터는 재조합 PxNPV의 증가된 효율이 AaIT-발현 제조체에 한정되지 않는다는 것을 보여준다. tox34를 발현하는 PxNPV는 AaIT-발현 재조합체 만큼 이나 낮은 LT₅₀와 LC₅₀를 보여주고 있다. 어떤 경우에는(예를들어, PxEGTDEL/hsp70Xba tox34) 재조합 PxNPV에서 발현되는 tox34가 AaIT-발현 재조합체에 비해 LT₅₀가 더욱 낮은 결과를 가져오기도 하였다.

위에서 지적한 모든 특허, 특허출원, 논문, 출판물, 및 테스트 방법은 참조문헌으로 삽입하였다.

상기 상세한 설명에 의해 본 발명의 많은 변화형을 당 업계의 통상적인 전문가들이 제안할 것이다. 이러한 명확한 변화형들은 본 발명의 가장 크게 의도된 목적 안에 속한다.

Claims

야생형 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큐로바이러스(PxNPV)에 대하여 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 유전적 변형을 갖는 분리된 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큐로바이러스(PxNPV):

(a) 제한효소 절단부위의 도입 또는 결실;

(b) 바이러스에 의해 암호화되는 유전자의 변형, 결실 또는 중복;

(c) 이종 단백질을 암호하는 유전자의 도입; 및,

(d) 전기의 조합.
제 1항에 있어서,

전기 바큐로바이러스 게놈 안에, 곤충 세포에서 전사를 활성화시킬 수 있는 프로모터와 작동가능하게 연결된(operably linked) 곤충을 변형시키는 물질을 암호화하는 핵산을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 2항에 있어서,

전기 곤충을 변형시키는 물질은 살충 독소인 것을 특징으로 하는 재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 3항에 있어서,

전기 독소는 AaIT, AaHIT1, AaHIT2, LqhIT2, LqqIT1, LqqIT2, BjIT1, BjIT2, LqhP35, LqhαIT, SmpIT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12,μ-아가톡신(μ-agatoxin), 킹콩 톡신(King Kong toxin), Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, ω-아트라코톡신(ω-atracotoxin), α-코노톡신(α-conotoxin), μ-코노톡신(conotoxin), 클로로톡신(chlorotoxin) 및 ω-코노톡신(ω-conotoxin)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 4항에 있어서,

전기 독소는 AaIT, TxP-1, LquIT2, 및 ω- 아트라코톡신으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 4항에 있어서,

이종의 시그널 펩티드를 추가로 포함하고, 전기 시그널 펩티드를 암호화하는 서열은 전기 독소를 암호화하는 서열의 프레임에 맞춰 융합된 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 6항에 있어서,

전기 시그널 펩티드는 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 pBMHPC-12 시그널 서열; 만두카 섹스타(Manduca sexta)의 아디포키네틱 호르몬 시그널(adipokinetic hormone signal); 만두카 섹스타(Manduca sexta)의 아포리포포린(apolipophorin) 시그널 서열; 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 코리온(chorion) 시그널 서열; 초파리(Drosophila melanogaster)의 큐티클 시그널 서열; 초파리(Drosophila melanogaster)의 에스터라제-6(esterase-6) 시그널 서열; 및, 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 성-특이적인 시그널 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 2항에 있어서,

전기 프로모터는 hsp70 프로모터인 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 8항에 있어서,

전기 프로모터는 hsp70 Bam 및 hsp70 Xba로 구성되는 그룹으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 3항에 있어서,

전기 프로모터는 DA26, 35K, 6.9K, 폴리헤드린(polyhedrin), hsp70 및 액틴 프로모터로 구성되는 그룹으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 3항에 있어서,

전기 게놈은 바이러스의 egt 유전자를 불활성화시키기 위해서 추가로 변형되는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 3항에 있어서,

곤충 세포에서 전사를 활성화시킬 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된 (operably linked), 유충 호르몬 에스터라제(JHE)를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 5항에 있어서,

전기 프로모터는 hsp70 프로모터인 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
초파리 hsp70 프로모터에 작동가능하게 연결된, TxP-1를 암호화하는 서열을 게놈에 포함하는 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큐로바이러스 (PxNPV).
초파리 hsp70 프로모터에 작동 가능하게 연결된, AaIT를 암호화하는 서열을 게놈에 포함하는 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큐로바이러스 (PxNPV).
제 1항에 있어서,

전기 유전적 변형은 야생형 PxNPV에는 존재하지 않는 클로닝 부위를 형성하는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 16항에 있어서,

곤충 세포에서 전사를 활성화시킬 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 (operably linked), 곤충을 변형시키는 물질을 암호화하는 핵산 서열이 전기 클로닝 부위에 삽입되는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 17항에 있어서,

전기 곤충을 변형시키는 물질은 살충 독소인 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 18항에 있어서,

전기 독소는 AaIT, AaHIT1, AaHIT2, LqhIT2, LqqIT1, LqqIT2, BjIT1, BjIT2, LqhαIT, LqhP35, SmpIT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-아가톡신 (μ-agatoxin), 킹콩 톡신(King Kong toxin), Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, ω-아트라코톡신(ω-atracotoxin), α-코노톡신(α-conotoxin), μ-코노톡신(μ-conotoxin), 클로로톡신(chlorotoxin) 및 ω-코노톡신(ω-conotoxin)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 19항에 있어서,

전기 프로모터는 DA26, 35K, 6.9K, 폴리헤드린(polyhedrin), hsp70 및 액틴 프로모터로 구성되는 그룹으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 20항에 있어서,

전기 게놈은 바이러스의 egt유전자를 불활성화시키기 위해서 추가로 변형되는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
제 21항에 있어서,

곤충 세포에서 전사를 활성화시킬 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 유충 호르몬 에스터라제(JHE)를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

재조합 바큐로바이러스(PxNPV).
ATCC VR-2607, ATCC VR-2608, 및 ATCC VR-2609로 구성되는 그룹으로부터 선택 되는 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큘로바이러스(PxNPV).
제 1항에서 정의된 재조합 바큘로바이러스로부터 분리된 게놈 DNA를 포함하는 직접연결 벡터(direct ligation vector).
제 24항에 있어서,

전기 DNA는 곤충 세포에서 전사를 활성화시킬 수 있는 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 곤충을 변형시키는 물질을 암호화하는 DNA를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

직접연결 벡터(direct ligation vector).
제 25항에 있어서,

전기 곤충을 변형시키는 물질은 AaIT, AaHIT1, AaHIT2, LqhIT2, LqqIT1, LqqIT2, LqhP35,BjIT1, BjIT2, LqhαIT, SmpIT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-아가톡신(μ-agatoxin), 킹콩 톡신(King Kong toxin), Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, ω-아트라코톡신(ω-atracotoxin), α-코노톡신(α-conotoxin), μ-코노톡신(μ-conotoxin), 클로로톡신(chlorotoxin) 및 ω-코노톡신(ω-conotoxin)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 독소를 포함하는 것을 특징으로 하는

직접연결 벡터(direct ligation vector).
제 26항에 있어서,

이종의 시그널 펩티드를 추가로 포함하고, 전기 시그널 펩티드를 암호화하는 서열은 전기 독소를 암호화하는 서열의 프레임에 맞게 융합되는 것을 특징으로 하는

직접연결 벡터(direct ligation vector).
제 27항에 있어서,

전기 시그널 펩티드는 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 pBMHPC-12 시그널 서열; 만두카 섹스타(Manduca sexta)의 아디포키네틱 호르몬 시그널(adipokinetic hormone signal); 만두카 섹스타(Manduca sexta)의 아포리포포린(apolipophorin) 시그널 서열; 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 코리온(chorion) 시그널 서열; 초파리(Drosophila melanogaster)의 큐티클 시그널 서열; 초파리(Drosophila melanogaster)의 에스터라제-6(esterase-6) 시그널 서열; 및, 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 성-특이적인 시그널 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 직접연결 벡터(direct ligation vector).
제 25항에 있어서,

전기 게놈은 바이러스의 egt 유전자를 불활성화시키기 위해서 추가로 변형되는 것을 특징으로 하는

직접연결 벡터(direct ligation vector).
제 25항에 있어서,

곤충 세포에서 전사를 활성화시킬 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 (operably linked) 유충 호르몬 에스터라제(JHE)를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

직접연결 벡터(direct ligation vector).
제 16항에서 정의된 재조합 바큘로바이러스로부터 분리된 게놈 DNA를 포함하는 직접연결 벡터(direct ligation vector).
제 19항에서 정의된 재조합 바큘로바이러스로부터 분리된 게놈 DNA를 포함하는 직접연결 벡터(direct ligation vector).
제 23항에서 정의된 재조합 바큘로바이러스로부터 분리된 게놈 DNA를 포함하는 직접 연결 벡터(direct ligation vector).
야생형 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큘로바이러스(PxNPV)에 대하여 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 유전적 변형을 갖는 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큘로바이러스(PxNPV) 및 농학적으로 허용되는 담체를 포함하는 살충제 조성물:

(a) 제한 효소 절단 부위의 도입 또는 결실;

(b) 바이러스에 의해 암호화되는 유전자의 변형, 결실 또는 중복;

(c) 이종 단백질을 암호하는 유전자의 도입; 및,

(d) 전기의 조합.
제 34항에 있어서,

전기 바큘로바이러스 게놈 안에, 곤충 세포에서 전사를 활성화시킬 수 있는 프로모터와 작동가능하게 연결된(operably linked), 곤충을 변형시키는 물질을 암호화하는 핵산을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는

살충제 조성물.
제 35항에 있어서,

전기 곤충을 변형시키는 물질은 AaIT, AaHIT1, AaHIT2, LqhIT2, LqqIT1, LqqIT2, LqhP35, BjIT1, BjIT2, LqhαIT, SmpIT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-아가톡신(μ-agatoxin), 킹콩 톡신(King Kong toxin), Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, ω-아트라코톡신(ω-atracotoxin), α-코노톡신(α-conotoxin), μ-코노톡신(μ-conotoxin), 클로로톡신(chlorotoxin) 및 ω-코노톡신(ω-conotoxin)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 살충 독소인 것을 특징으로 하는

살충제 조성물.
제 36항에 있어서,

전기 재조합 바큘로바이러스는 이종의 시그널 펩티드를 추가로 포함하고, 전기 시그널 펩티드를 암호화하는 서열은 전기 독소를 암호화하는 서열의 프레임에 맞게 융합되는 것을 특징으로 하는

살충제 조성물.
제 37항에 있어서,

전기 시그널 펩티드는 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 pBMHPC-12 시그널 서열; 만두카 섹스타(Manduca sexta)의 아디포키네틱 호르몬 시그널(adipokinetic hormone signal); 만두카 섹스타(Manduca sexta)의 아포리포포린(apolipophorin) 시그널 서열; 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 코리온(chorion) 시그널 서열; 초파리(Drosophila melanogaster)의 큐티클 시그널 서열; 초파리(Drosophila melanogaster)의 에스터라제-6(esterase-6) 시그널 서열; 및, 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 성-특이적인 시그널 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

살충제 조성물.
제 36항에 있어서,

전기 게놈은 바이러스의 egt 유전자를 변형시키기 위해서 추가로 변형되는 것을 특징으로 하는 살충제 조성물.
제 36항에 있어서,

전기 유전적 변형은 야생형 PxNPV에는 존재하지 않는 클로닝 부위를 형성하는 것을 특징으로 하는

살충제 조성물.
제 40항에 있어서,

전기 바큘로바이러스는 곤충 세포에서 전사를 활성화시킬 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된(operably linked), 곤충을 변형시키는 물질을 암호화하는 핵산 서열을 전기 클로닝 부위에 포함하고 있는 것을 특징으로 하는

살충제 조성물.
제 41항에 있어서,

전기 곤충을 변형시키는 물질은 살충 독소인 것을 특징으로 하는

살충제 조성물.
제 42항에 있어서,

전기 독소는 AaIT, AaHIT1, AaHIT2, LqhIT2, LqqIT1, LqqIT2, BjIT1, BjIT2, LqhαIT, LqhP35, SmpIT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-아가톡신 (μ-agatoxin), 킹콩 톡신(King Kong toxin), Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, ω-아트라코톡신(ω-atracotoxin), α-코노톡신(α-conotoxin), μ-코노톡신(μ- conotoxin), 클로로톡신(chlorotoxin) 및 ω-코노톡신(ω-conotoxin)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

살충제 조성물.
제 2항에서 정의된 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큘로바이러스 및 농학적으로 허용되는 담체를 포함하는 살충제 조성물.
제 4항에서 정의된 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큘로바이러스 및 농학적으로 허용되는 담체를 포함하는 살충제 조성물.
제 7항에서 정의된 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큘로바이러스 및 농학적으로 허용되는 담체를 포함하는 살충제 조성물.
제 14항에서 정의된 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큘로바이러스 및 농학적으로 허용되는 담체를 포함하는 살충제 조성물.
제 15항에서 정의된 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큘로바이러스 및 농학적으로 허용되는 담체를 포함하는 살충제 조성물.
제 20항에서 정의된 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큘로바이러스 및 농학적으로 허용되는 담체를 포함하는 살충제 조성물.
제 23항에서 정의된 재조합 플루텔라 실로스텔라(Plutella xylostella) 바큘로바이러스 및 농학적으로 허용되는 담체를 포함하는 살충제 조성물.
제 44항에서 정의된 살충제 조성물을 살충에 효과적인 양으로 병충에 접촉시키는 것을 포함하는 곤충을 죽이는 방법.
제 45항에서 정의된 살충제 조성물을 살충에 효과적인 양으로 병충에 접촉시키는 것을 포함하는 곤충을 죽이는 방법.
제 46항에서 정의된 살충제 조성물을 살충에 효과적인 양으로 병충에 접촉시키는 것을 포함하는 곤충을 죽이는 방법.
제 47항에서 정의된 살충제 조성물을 살충에 효과적인 양으로 병충에 접촉시키는 것을 포함하는 곤충을 죽이는 방법.
제 48항에서 정의된 살충제 조성물을 살충에 효과적인 양으로 병충에 접촉시키는 것을 포함하는 곤충을 죽이는 방법.
제 49항에서 정의된 살충제 조성물을 살충에 효과적인 양으로 병충에 접촉시키는 것을 포함하는 곤충을 죽이는 방법.
제 50항에서 정의된 살충제 조성물을 살충에 효과적인 양으로 병충에 접촉시키는 것을 포함하는 곤충을 죽이는 방법.