CN103409430B

CN103409430B - 小菜蛾泛素基因ubl40及在治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性中的应用

Info

Publication number: CN103409430B
Application number: CN201310362127.3A
Authority: CN
Inventors: 程罗根; 李风良; 张宏; 程晨
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2013-08-19
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2033-08-19
Also published as: CN103409430A

Abstract

本发明属于害虫抗药性机理与防治领域，具体涉及小菜蛾泛素基因UBL40及一种治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性的方法。小菜蛾泛素基因UBL40，其序列如SEQ ID NO.1所示；可用于治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性。其治理方法是：合成所述小菜蛾泛素基因UBL40的dsRNA，核酸酶消化以去除DNA和ssRNA，纯化dsRNA，将UBL40的dsRNA喷洒到田间小菜蛾的幼虫和饲料上，通过渗透和取食，dsRNA进入小菜蛾细胞，沉默UBL40基因；48小时后施溴氰菊酯类杀虫剂。可明显提高防效。

Description

小菜蛾泛素基因UBL40及在治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性中的应用

技术领域

本发明属于害虫抗药性机理与防治领域，具体涉及小菜蛾泛素基因UBL40及一种治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性的方法。

背景技术

昆虫对杀虫剂的抗药性是由人类活动引起的最广泛的遗传变异之一，研究抗药性相关基因将有助于阐明抗药性的分子基础,发现治理抗性的靶标和有效措施。小菜蛾对目前常用杀虫剂均产生了不同程度的抗药性，虽然已报道了小菜蛾对菊酯类、有机磷类、沙蚕毒素类等药剂的抗性遗传方式及其相关基因，但是有关这些基因与抗药性关系的分析主要是在基因表达水平的差异比较，没有进行相关基因的敲除和增强表达之后对杀虫剂抗性水平影响的活体研究，缺乏直接的实验证据，因此难以进行开发和应用。

小菜蛾是一种世界性的蔬菜害虫，年发生世代多，繁殖系数高，世代重叠现象严重，长期以来，人们主要是依赖大量使用各种杀虫剂来克服和防治小菜蛾的危害，由此造成大量的农药污染与残留，破坏了生态平衡与生态安全，危害公众的身体健康。另外，长期大量使用农药，也不可避免地使其对各种杀虫剂都产生了不同程度的抗药性。

拟除虫菊酯因其对人类低毒、杀虫效果快等特性而被广泛用于农业害虫和卫生害虫杀虫剂，从而导致了全球性的抗药性，与其它类型的杀虫剂之间存在着程度不同的交互抗性。因此，研究拟除虫菊酯的抗性发生机制和防治方法，在理论和实践上均具有重要意义。

溴氰菊酯是人工合成拟除虫菊酯杀虫剂中杀虫毒力最大的一个品种，性质稳定，杀虫谱广，生物活性高，在世界范围内被广泛应用。小菜蛾对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性发展速度较快，水平较高。由于害虫的抗药性是在药剂的长期胁迫下产生的一种遗传变异，因此筛选抗性相关基因是治理抗性的关键。

本发明的目的主要解决如下技术问题：（1）克隆抗性相关基因并实现在体外的高效表达；（2）活体沉默该基因并检测对药剂敏感水平的影响；（3）不同程度地增强该基因的表达，检测抗性水平的变化；（4）为该基因的开发应用提供实验数据和技术手段。

发明内容

本发明的目的是提供小菜蛾对溴氰菊酯的抗性相关基因及其应用。

本发明根据GenBank中已有的泛素基因序列，设计简并引物克隆出小菜蛾的泛素基因家族成员UBL40、UBS27a、polyubiquitin的开放阅读框序列，经过实验证明UBL40是小菜蛾对溴氰菊酯的抗性相关基因。

本发明所述的小菜蛾泛素基因UBL40，其序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的小菜蛾泛素基因UBL40能用于治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性。

本发明还公开了一种治理小菜蛾溴氰菊酯抗性的方法，其步骤是：

（1）用下述引物，按照MEGAscriptRNAi Kit说明书进行操作，合成UBL40的dsRNA：上游引物：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGAAAATGTCAAAGCC-3’（SEQ ID NO.3）；下游引物：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGGGAGGTTGTTGGTGTG-3’（SEQ ID NO.4）；

（2）核酸酶消化以去除DNA和ssRNA。

①冰上加样消化液如下

20ul步骤3）中的转录反应液

21ul Nuclease-free water

5ul 10×digestion buffer

2ulDNase I

2ulRNase

②置于37°C孵育1h;

（3）纯化dsRNA。

①组装反应液

50ul步骤4)中的反应液

50ul 10×binding buffer

150ul Nuclease-free water

250ul 100%ethanol

②轻轻吹打混合反应液，转移到制备管中并置于收集管中，最大速度离心2min，弃滤液；

③吸取500ul wash solution于制备管，最大转速2min，弃滤液；

④重复步骤③一次；

⑤空管离心30sec以去除多余的液体；

⑥将制备管放入新的收集管中，加入50ul预先加热至95°C的Elution Solution，最大速度离心2min，弃滤液；

⑦重复步骤⑥；

⑧分光光度计测定产物的A260以检测dsRNA的浓度

（4）将UBL40的dsRNA喷洒到田间小菜蛾的卵、幼虫和饲料上，通过渗透和取食，dsRNA进入小菜蛾细胞，沉默UBL40基因，降低小菜蛾对溴氰菊酯的耐受水平。

（5）干扰48小时后施药，可明显提高防效。

经研究表明：（1）UBL40RNAi后幼虫的抗药性水平明显下降。（2）在一系列的溴氰菊酯浓度梯度刺激下，UBL40转染组细胞的存活率相对于对照组细胞有明显升高。

UBL40基因是我们从小菜蛾的细胞中克隆的新基因，编码泛素核糖体融合蛋白，该蛋白具有C4型锌指结构域，具有锌指结构的蛋白大多是基因表达调控有关的功能蛋白，而且泛素－蛋白酶体是细胞内的重要解毒与防御体系。我们通过个体和细胞水平分别证明该基因与溴氰菊酯的抗性密切相关，因此本发明对进一步阐明溴氰菊酯的抗性机理以及在抗性的防治应用中均具有重要的意义。

附图说明

图1小菜蛾UBL40的核酸和推导出的蛋白序列推导出的蛋白质序列用单字母表示并位于核酸之下，核定位序列见图中阴影部分，起始密码子和终止密码子如划线部分，组成锌指结构的4个半胱氨酸残基用方框框出.。

图2小菜蛾溴氰菊酯抗性品系和敏感品系UBL40的mRNA表达水平DS-strain:溴氰菊酯敏感品系，DR-strain:溴氰菊酯抗性品系，*代表p<0.05。

图3暴露于不同浓度溴氰菊酯的对照组和UBL40转染组Kc细胞的存活率检测。细胞转染后72h用CCK-8试剂盒检测细胞存活率.*代表p<0.05。

具体实施方式

实施例一

1、小菜蛾的泛素基因克隆

（1）实验材料

小菜蛾源自贵州省贵阳市花溪区中曹乡的甘蓝地，室内繁殖一代后测四龄幼虫的LD₅₀值，与武汉市蔬菜研究所的小菜蛾敏感品系四龄幼虫LD₅₀值比较，发现小菜蛾田间种群为敏感种群。将其作为敏感品系同步隔离培养。小菜蛾溴氰菊酯抗性品系由点滴法处理小菜蛾四龄幼虫敏感品系经多代繁育选育而成。

（2）幼虫RNA提取

随机取抗性和敏感小菜蛾10只，按照RNeasy Mini Kit说明书操作，提取总RNA。

（3）RT-PCR法扩增泛素基因

按照Primerscript^TM RT reagents kit(TaKaRa,Japan)试剂盒操作说明进行cDNA第一链的合成，根据GenBank中已有的泛素基因序列，设计简并引物：

上游引物：ATGCAGATCTTYGTGAARACC（SEQ ID NO.5）

下游引物：YTAYTTSAVCTTCTTCTTCTTGGG（SEQ ID NO.6）

克隆泛素基因家族成员的开放阅读框序列。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

泛素基因家族成员包括U1、U2、U3和U4(polyubiquitin)。本研究采用RT-PCR法扩增了小菜蛾泛素基因的cDNA序列，经GenBank序列比对证实，U1和U2的编码区序列完全相同，编码的蛋白为一个泛素蛋白的C末端连接52个氨基酸组成的核糖体蛋白（大亚基L40），U1和U2只有内含子长度的差别，故统称为UBL40。小菜蛾泛素基因家族的另外2个成员是UBS27a和polyubiquitin。

2、小菜蛾UBL40的开放阅读框

UBL40的开放阅读框387bp,（SEQ ID NO.1）；编码128个氨基酸残基（SEQ ID NO.2）；第1至228个碱基编码泛素蛋白（76个氨基酸），第229到387个碱基编码核糖体蛋白L40（52个氨基酸）（附图1）。

3、小菜蛾UBL40的功能研究

（1）实时荧光定量PCR

结果显示UBL40在小菜蛾抗性品系中的mRNA表达水平显著高于敏感品系

（附图2）；

（2）UBL40的RNAi

设计引物并合成UBL40的一段保守序列，上下游引物的5’端分别加上一段T7启动子（下划线部分）。

上游引物：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGAAAATGTCAAAGCC-3’；（SEQ ID NO.3）

下游引物：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGGGAGGTTGTTGGTGTG-3’（SEQ ID NO.4）

按照MEGAscriptRNAi Kit说明书进行操作，合成UBL40的dsRNA。

选择同一批龄期相同、发育良好的抗性品系小菜蛾，用微量操纵仪（WPI,USA）

于小菜蛾四龄幼虫的前胸背面注射UBL40dsRNA。处理组注射160ngdsRNA,对照组注射相同体积的es(elution solution，试剂盒中提供)，幼虫注射后大量出血者弃之不用。放入28°C培养箱中培养，每天光照16小时。相对湿度为70%～80%。

将溴氰菊酯用丙酮作溶剂配制成母液，然后按照等差或等比再稀释成5个浓度梯度备用，分别为2500ppm,5000ppm,10000ppm,20000ppm，设丙酮稀释液做对照。对干扰组和对照组幼虫进行毒力测定。用毛细微量进样器将不同浓度的药剂点在幼虫的前胸背板上，每个药剂浓度点30只幼虫，每头点药0.5ul，然后放入培养皿中，每个培养皿放10只幼虫，培养皿中的幼虫以甘蓝叶喂食。48小时后统计不同浓度组的幼虫死亡数，触动虫体不活动者认为其死亡。采用SPSS软件进行毒力回归分析。通过数据分析获得半量致死浓度LC₅₀值，95%置信区间（95%CI），毒力回归方程等。结果发现，UBL40基因被沉默后，小菜蛾的抗性水平明显下降；

表1.注射UBL40dsRNA和elution solution后小菜蛾抗性品系四龄幼虫对溴氰菊酯毒力的变化

将甘蓝叶片用清水浸泡冲洗晾干之后，喷洒UBL40dsRNA，放入培养皿喂食按照上述方法点滴溴氰菊酯的小菜蛾，结果表明采用饲喂法，同样能有效地沉默UBL40基因，使小菜蛾的抗性水平明显下降（表2）。

表2.饲喂UBL40dsRNA和elution solution后小菜蛾抗性品系四龄幼虫对溴氰菊酯毒力的变化

（3）UBL40的dsRNA的转染

将处于对数生长期的Kc细胞计数后按5×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，于细胞培养箱28°C培养24小时，按照X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent操作说明书，待细胞融合率达80%时，用此转染试剂转染，共设3组：转染pIB/V5-His组、转染pIB/UBL40组和未转染组。转染后48小时，将细胞传代后用含稻瘟菌素（blasticidin，20ug/ml）的培养基选择培养，建立稳定转染细胞系；

（4）细胞毒性检测

①将Kc细胞制成单细胞悬液，以1×10⁴个细胞/100ul/孔接种于96孔板中，28°C于无CO²细胞培养箱中培养24小时；

②28°C培养24小时后分别加入5ul不同浓度的溴氰菊酯（0ug/ml,10^0.5ug/ml,10^1.0ug/ml,10^1.5ug/ml,10^2.0ug/ml,10^2.5ug/ml），配制溴氰菊酯时以DMSO（二甲基亚砜）做溶剂。每个药物浓度组设3个复孔，空白对照组亦设3个复孔（只加100ul培养基）；

③加药后48小时后，每孔加入10ul CCK-8试剂（Dojindo,Japan），28°C孵育4小时后在酶标仪上检测各孔的光吸收值，选择波长450nm；

④与对照组相比，计算细胞相对存活率

细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100

A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0加药)：具有细胞核CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

与对照组相比，计算细胞相对存活率（附图3）。结果发现在一系列溴氰菊酯浓度下，转染组的细胞存活率均高于对照组细胞。

Claims

1.一种利用小菜蛾泛素基因UBL40治理小菜蛾溴氰菊酯抗性的方法，其步骤是：

(1)用序列为SEQ ID NO.3和4的引物，按照MEGAscriptRNAi Kit说明书进行操作，合成序列如SEQ ID NO.1所示的小菜蛾泛素基因UBL40的dsRNA，

(2)核酸酶消化以去除DNA和ssRNA，

(3)纯化dsRNA，

(4)将UBL40的dsRNA喷洒到田间小菜蛾的卵、幼虫和饲料上，通过渗透和取食，dsRNA进入小菜蛾细胞，沉默UBL40基因；

(5)48小时后施溴氰菊酯类杀虫剂。