CN108893472B - 一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用 - Google Patents

一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108893472B
CN108893472B CN201810775922.8A CN201810775922A CN108893472B CN 108893472 B CN108893472 B CN 108893472B CN 201810775922 A CN201810775922 A CN 201810775922A CN 108893472 B CN108893472 B CN 108893472B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
dsrna
tet2
groton bug
nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810775922.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108893472A (zh
Inventor
任充华
李胜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meizhou Huasheng Guangmei Biotechnology Co., Ltd
Original Assignee
South China Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Normal University filed Critical South China Normal University
Priority to CN201810775922.8A priority Critical patent/CN108893472B/zh
Publication of CN108893472A publication Critical patent/CN108893472A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108893472B publication Critical patent/CN108893472B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用，靶向德国小蠊Tet2基因的dsRNA，为由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列和与SEQ ID No.7所示的核苷酸反向互补的核苷酸组成的双链RNA。本发明通过RNAi干扰技术，通过合成dsRNA来靶向DNA去甲基化相关基因Tet2来影响蟑螂的卵巢发育，在阻断或破坏卵巢发育及卵鞘形成的基础上达到蟑螂防治的目的。

Description

一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用。
背景技术
蟑螂原产于非洲，生活场地较潮湿、温暖、黑暗；体型较小，喜欢躲藏在隐蔽的缝隙中；活动时间集中在夜晚，因此人类较难消灭其种群。
德国小蠊为较为常见的一种蟑螂，为杂食性昆虫，能进食酸甜苦辣咸的食物、昆虫尸体等，比较喜欢吃甜食。食物和水分对德国小蠊的生存至关重要，王学军等人的研究表明德国小蠊的耐饥饿能力较强，在饥饿状态下，德国小蠊群体中会出现互相残食的情况。水对德国小蠊的生存比食物更为重要，如果有食物和水，成虫能存活约3-4个月；若有食物没有水，德国小蠊存活约10天；若没有食物有水，德国小蠊存活约48天，因此该物种生存能力极强，极难防治。
德国小蠊不仅分布最广泛，也是最难治理的世界性家居卫生害虫。德国小蠊体积虽小，但是它们的杀伤力极强，它们咬坏衣服、污染食物，传播疾病，它们是多种细菌携带者；德国小蠊能分泌一些怪味物质，在种群密度较高时，这些分泌物会使它们的生活场所弥漫一种特殊的臭味，同时，这些分泌物可以使食物变味、变质，对人类的生活和农业生产带来一定的危害。
从上世纪40年代开始，化学农药和有机杀虫剂在害虫防治实践中表现出高效的杀虫效果，为害虫防治带来了革命性改变。但随着其长期大量使用，土壤退化、农药残留、水源和环境污染、生物链中断、生态失衡等一系列负面问题日益凸显。因此，开发环境友好、高效、低毒的蟑螂防治方法是攸关国家经济发展、社会进步和食品安全所亟需解决的关键问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何开发环境友好、高效、低毒的蟑螂防治方法。
本发明的技术方案为：德国小蠊Tet2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
靶向沉默德国小蠊Tet2基因的dsRNA，由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列和与SEQID No.7所示的核苷酸反向互补的核苷酸组成的双链RNA。
上述所述的dsRNA的制备方法，将SEQ ID No.4所示的DNA片段克隆到pTOPO载体，命名为pTOPO-Tet2，然后以pTOPO-Tet2为模板，设计两端含有T7启动子的引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，进行PCR扩增，PCR产物用T7RiboMAX Express RNAi System转录合成得到dsRNA。
编码上述所述的dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
上述所述的DNA分子的制备方法，基于SEQ ID No.1所示的德国小蠊Tet2基因核苷酸序列，设计含有T7启动子的引物对SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，进行PCR扩增得到。
含有上述所述的DNA分子的重组载体或重组菌。
上述所述的dsRNA或上述所述的DNA分子或上述所述的重组载体或重组菌在德国小蠊防治上的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过RNAi干扰技术，通过合成dsRNA来靶向DNA去甲基化相关基因Tet2来影响蟑螂的卵巢发育，在阻断或破坏卵巢发育及卵鞘形成的基础上达到蟑螂防治的目的。
附图说明
图1为Tet2基因干扰效果验证；
图2为Tet2基因干扰对卵鞘产生的影响；
图3为Tet2基因干扰对卵巢重量的影响；
图4为Tet2基因干扰对卵巢长度的影响；
图5为Tet2基因干扰促使卵巢细胞凋亡。
具体实施方式
实施例1 dsRNA的合成
使用TRIzol(Life technologies)方法提取雌性德国小蠊脂肪体部位的总RNA，然后使用oligodT引物进行反转录(PrimeScript II reverse transcriptase(Takara Bio,Shiga,Japan))合成第一条cDNA链。
根据已有的德国小蠊基因组信息，通过与其他物种进行比对找到德国小蠊Tet2基因的完整序列，如SEQ ID No.1所示。
利用dsRNA设计网站E-RNAi(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/)，将整个靶向的德国小蠊Tet2基因开放阅读框序列复制粘贴到网站中，通过设计参数筛选得到最佳的dsRNA靶向序列。然后设计引物:Tet2F:CAGCGTGGATTGTGGTAG(SEQ ID No.2)和Tet2 R:AATGGTCGTCCTGGTTTG(SEQ ID No.3)。以cDNA为模板扩增得到含有靶向序列的DNA片段，并将其克隆改到pTOPO载体(Aidlab，China)中，测序验证序列是否存在碱基突变，挑选没有任何突变的克隆用于后续实验，载体命名为pTOPO-Tet2。dsRNA靶向的DNA序列如SEQ ID No.4所示。
采用PCR在靶向序列两侧引入T7启动子，具体方法为用设计两端含有T7启动子的引物，Tet2 T7F:TAATACGACTCACTATAGGCAGCGTGGATTGTGGTAGTG(SEQ ID No.5)和Tet2 T7R：TAATACGACTCACTATAGGAATGGTCGTCCTGGTTTGAA(SEQ ID No.6)。以pTOPO-Tet2载体为模板进行扩增，得到两端含有T7启动子的PCR产物，然后利用T7RiboMAX Express RNAi System(Promega Corporation)来合成正向和反向RNA，在T7 RNA聚合酶和DNaseI依次处理后将两条正反向的RNA混合并70℃处理10min，然后逐渐降温到室温使其退火变成dsRNA，序列为由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列和与SEQ ID No.7所示的核苷酸反向互补的核苷酸组成的双链RNA。
实施例2 dsRNA的德国小蠊活体注射实验
挑选刚羽化变为成虫的雌性德国小蠊并将其与雄性成虫混养，在其羽化后的第二天将其低温麻醉后放在显微镜解剖台上，然后使用显微注射方法将靶向Tet2基因的dsRNA按照不同的剂量注射到德国小蠊的腹部。然后每隔两天重复一次，总共注射三次，注射后持续观察dsRNA处理对雌性德国小蠊产卵的影响，在使蛋白表达量降低的情况下研究Tet2基因对德国小蠊繁殖产卵的影响。
(一)dsRNA对Tet2基因干扰效果验证
在注射两次dsRNA后的48h将德国小蠊麻醉并进行解剖，将脂肪体解剖出来并提取RNA，使用RN28-EASYspin Plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒对脂肪体进行处理，按照试剂盒说明书进行操作。利用Nanodrop One对RNA浓度进行测定，然后量取2ug RNA进行反转录得到cDNA。利用premier 5引物设计软件设计qPCR引物，通过对定量结果进行分析，检测靶基因干扰效果，结果见图1。可以发现dsRNA处理可以显著干扰靶基因Tet2的表达。
(二)德国小蠊繁殖性能观察与统计
与对照组(注射无法靶向德国小蠊任何內源基因的dsGFP)进行比较，观察不同处理组雌性德国小蠊的繁殖性能，并进行统计。实验结果发现，注射对照组的德国小蠊可以正常产卵(图2)并孵化得到正常的德国小蠊自子代；Tet2基因干扰组的德国小蠊完全没有卵鞘产生，进而亦可以达到完全阻止德国小蠊繁殖的目的。
(三)解剖观察干扰Tet2基因对德国小蠊卵巢发育的影响
对实验处理组及对照组进行解剖分析，发现dsRNA注射会对德国小蠊卵巢发育产生影响，卵巢的重量(图3)、长度(图4)及表型都发生明显改变，重量减轻、长度缩短且表型出现坏死现象。通过细胞凋亡检测剂TUNEL对卵巢进行染色鉴定，发现Tet2基因干扰组的卵巢出现凋亡及坏死现象，从而找到了影响卵巢发育及卵巢成熟的原因(图5)。
序列表
<110> 请修改成申请人名称 华南师范大学
<120> 一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7155
<212> DNA
<213> 德国小蠊(Blattella germanica)
<400> 1
atgcctttct acggagccaa cacgggccct ctgccccctc aaccgggggg tatggtggat 60
cccgctggtg gctttgcgcc tcccctcagg gatcgcttcc ccaattcggt gtggcatcct 120
gcatcgggaa ctgaccccaa cgctgttggg tcttggactc cccaaggtca gttcatgcaa 180
cagattcccc cccaattgga agatttgcga taccatcatc atcctcaata ccctagctca 240
gcatcatacc accaacctgc tgccacaggc tatcagcaac agactgcttt cctaaatgca 300
gaacctcaga ctacagcatc attccaacaa cagcctcaac agcaacaaca acaacagcaa 360
cctcagcaac agcaatacca aaatcccagt ggaatgccag gcaatcgtcc accatcctca 420
cccgcccagc agccattgac tcctcgaggc ggaagcggta attactccca agttcacaca 480
ccgcagccat cgccaatcgg ctctgcaaat ggacttcaag ggagccatgg gacagtgaat 540
atgaacaaca gcaatgtgaa cgggttaacg aatagtcaca acggcacatc aactgcggtt 600
gtcaatggag tgaacggagg tgctgtgcac agaacgagtg gtatgaatgg tcagtatgtg 660
gacacttcac cgagtggaca gtatcctgac cagagagagt atgtgaatgg cgggaatgcg 720
tataatccat cgcaggatgt gacgatggct ccgccgcctt caacaacacc tacgagtcga 780
agcagttccg tgcatatgga aacaaacaat gacgggtcga ctatcccgaa tgtagtgctt 840
aataatggga caaagacttc aacgtcggcc tacaacaatc ccaatcccac catcacaagc 900
actgccaacc caaattcgac cggtcaccca aacgccttgc ctgggtacct accccacccc 960
caaatacaac atcaacaaca tcagcaacag agtttacaca actctagtag gtatccaggc 1020
caagataaca acatggggga atcaatgccg gctccgtgga gtgtgccggt gagtagtagt 1080
gatggtagaa tggtgtggac ggaagaaaac aagagtgaaa caacttccaa cgtttatcga 1140
gaagatgaca gagcagctgc acaaaatgga gtgccaaatg agagttatga acgggtcaat 1200
ctaaatagcc gtttgaagac gatgattctg aacaaacaac aacaacaaca aatgaatcat 1260
caaatgcagc aatacaatca gcaaattgta ttccttaatt tctcaggtca tcatggaaca 1320
tcacagtcag acgcagctca tcagctcatg agtccaaatg atcaacaacg atcgatatct 1380
gtgtcgcaag cacagcagta catgtcgtcg tcttccagta tgatgtctca agcgtctgat 1440
agaacgttgt gtagtaatca gggcatggac agaatgatcg tggcagatag caatttgttg 1500
gggaataggc aacccacaaa catggacagg aagctagata accaatcatc ctcggaggtt 1560
aattttttag cccaaggcca ccatcctcgg aatcaatcgt cgataatgac gtctgagggt 1620
ggtggcttcc cgtgggactg gaatagttca accgccaatg atatcatgga tggaaacagc 1680
atatcggcca tggaaaactt catcaagtat gcagctagcg aagatcgagg tggcatttta 1740
gacaaatctc tagacatggc cacttccaac accactgtaa agcaattttt acctaacaat 1800
acctgctcac cagcaaactt ccagaaaacc aacaggcagg gtggtacaaa tgcaaattgg 1860
cactccccta tgctacctca agatcaggta tctttgtcct ccaataacaa ttacaaagaa 1920
caagtttcta tatcttctaa taataattat aaggagcaga tatctatgtc tgccaacaat 1980
tccttcaaag agcagatgtt caagtgcaca gccccttcca gtaataactt caaatgtaga 2040
agagaatgtc cgacagaagt ggatgataag tcatttcaga aaaggatggg catcggacca 2100
gcagcaagaa atgaatttcc aaacagtgcg tatggttcta tgagaccgac catggatggg 2160
gaagagaaga gaacacaggg aatgaccact acaccaggat ataacaacta tcaacaagat 2220
ttcaatccga atgtcaccca gataaaaaac gaaggacgaa aggtagctcc gacaaatatg 2280
gcaaataatt atttcaatca accgggattt gatcccggct ccaataccat gaagactgaa 2340
aacaggaaac ctgttccgaa caatacgaat gcttctgcag gtttccattg ccaaatatac 2400
gataatgtag ggcctagaaa tgaagtcagg gttaccatcg ggaataacac ctacccatgc 2460
cagaacagca ctagtaataa caacaatggt aacaacaata acaataataa tgttagaatc 2520
agtaataata atagtaataa caacaataat gacagcaatg ttgataataa gaatagtaat 2580
tctagtgggt gtagtgaaga aaggactagt acgccaacag aaaaagtggc agaatccgca 2640
aaagtgaaaa cagaatgtcc atcatatttg tttgccgggg acggaggtcc aacgccattg 2700
gagaaaataa agggctcgtg gtgctgtcgt caaggaggga ccgaaactcc aacccctgaa 2760
catctgcgtg acggctgttg tcaagggttc cagacagcag acgaacagga tacaaaggag 2820
ccgtggtccc cacagcagcc cgagtctaat cctggggact cgtcccccaa tacgcccaag 2880
gggtatggag ggatgtctgc caaggagttc caagaccact tggaaaggct gaagaataat 2940
gtgagggccg aggttccaga ctgcaattgt tttccaccag ataaatgtcc tccagaacca 3000
ggttcctatt atactcacct gggagcagca gcgagtcttg cagaacttag gaaggacatg 3060
gaaaagagaa caggattaaa aggaaaggca gtgcgcatag agaaagtaat gtacactgga 3120
aaagagggca aaacaaccca gggttgccct cttgctaagt ggataatccg gagatcaaac 3180
ttggaagaga agattctggc aatcgttaaa catcgtcagg gtcacaagtg tccgacagcg 3240
tggattgtgg tagtgatggt ggcatgggaa ggcgttcctt cacatgaagc agaccgcgtc 3300
tacaacctgc tcactcataa actgaatcgc tatggtcttc caacaactcg ccgctgtgcc 3360
accaacgagc ccagaacttg cgcttgtcag ggactggacc ccgatacctg cggggccagt 3420
ttctctttcg ggtgctcatg gtccatgtac tacaacggct gcaagtatgc tcgctccaag 3480
actgtacgca agtttcgact ttctgtacgg tctgaggaac aggaagtaga agaacgaatg 3540
catgtattgg caactctttt gtcacctttg taccagtcct tagcaccgga tgcttttaag 3600
aaccaaaccc aatttgagag ggaagcttca gaatgccggt tgggtttcaa accaggacga 3660
ccattctcag gagtgacggc ttgcattgat ttctgtgcgc attcccatcg agacctgcac 3720
aacatgaaca acggttgcac cgtggtggtg agtttaacaa agcaccgcac acttgctaag 3780
ccagatgacg agcagcttca tgtattgcca ctgtacgtaa tggatgatac ggatgaattt 3840
gggagcaagg agggacagga tgccaaggtg aaaagcggag ctgtggaaac cttgactaag 3900
tttccatgtg aagtgcgtgt ccgagcagta cctttgcagc catgtcggcg tcatggtaag 3960
aaacgcaaag aagacgaacc cgatgcagta attggaagga aagatcctgc cacattacac 4020
cgaaatcctt gctcaatggg gccaacaaca atggcaggaa tggaccatcg gggcacgcct 4080
atgtccctcg atatggcctc catgctggaa ggtatggagg tagcacagct ccaaagttca 4140
caggtagttt catccacagt acttgatagt ccagtgtcaa tgtatcaagg ctggggatac 4200
caccattctc agagtgcaga atctcgtgga tcagacgtgt atggttctcc tggaagcagt 4260
ggaacttctc cggcttgggg tcaccaccgc agccaaactc atgcctggat ggcagccgaa 4320
gcacagagga agcagaactg gctcaattcg gccgctacag ccgtgagtgg aaatttagct 4380
tctgggaact taaatggttg ggggccatct gattatggtg catttggtgg tggaactgca 4440
ggcctgtctg cctctgcaag cgatcgagaa ggaaaggttg atcctgatag cacgaccaac 4500
caggcgaaca ctgcaaacct gggaggaagt tcaagtctga atccccggca gtcgcccgta 4560
aatacaagtt caaatggact ttgcaataac ttcagtatga atagtccggc cacctcgggc 4620
ttgccccaga tcaatgggca gataagtcca atttcatcat caatgcagaa tcaagcttcc 4680
actccttcta gtccgtttgt gttccagcag cagacatccc cctggcaggc gagtcagcag 4740
cagcaaaata gttctaatga cttgttttcg gaaagtggac actcccaatc gtctattgcg 4800
aggggggaga cgacgagttg gcagtcgggc tcggacagat cttcgggtct gcaaaatgcg 4860
ataacccctg accggtccaa gccgtcgccg cctagcgctg ctagctccaa caagctgcgg 4920
agtccacttt caggaggaaa cgattccggg actgctactg ggcaaatgga aaggtctcct 4980
ttcccttctc atctccctcc ttctccattc tcgtcacctc aacctcagca gacggcaagt 5040
agtccacaac aatcttccat ctgcaacagt tccttgccac ctccatcgcc ttctaaccct 5100
tccaacagtt cttccacaaa tcctatgtca cagcagactt tgcctctttc agttcaacaa 5160
tcgcagcaac aacaagcaca actgcctcaa cagcttcctg ttccaggaga cattggcctc 5220
acacagcctc atacaccaca ggaggtcagc tcgcggacgg tgaaaacccc cgaacgctca 5280
gtgtccgtac ctcttccgct cactccgacg gaacattctg cttcctcttc gtgttcgggt 5340
tctagtcgag gaggttgggt gaccccagat agacctcagt ctacctggga ctataatcct 5400
ctgacgcctg cacctcctca agccagttct cccacacagg cctctccatt tcgtatccca 5460
aaaggacggc ctccatcaag aacttcaaca ttgcattcaa acaataatag caatagtagc 5520
aatgcatcgc ccatttccac gaatgatctg ggaactacta atacatcccc tactactgct 5580
gcccaagcca tgaactatgc ctcagcatct caaacttatt gcaaaggttt tctgaagcct 5640
tttcctcctg gtgaaaattc ttcctctaaa ccctcagcat tggagaatca ccatcaaaac 5700
aacactatag gaaacattca aggtaacaat agcaatatga aaggtgcgtc tttgcattgg 5760
acaccagaaa atagtcctgc aatttccgaa caaggtgcaa agtctcataa ctcaacccct 5820
ttcaatccca atggcaattt gcaggactcg actccttctt ggtttcctgg tgattctaac 5880
gagggtagaa cggcgaacgg taacaaagca aatggaaatc attcagctaa gtccaacatg 5940
tttttgaata actcgagtgg ttcggaagca gatgatggtg catgtggtgt gatgatgtcg 6000
gatatggcgt ctcagccagg caagggtgca tgtaatacca ttaagcagga aaatttgtca 6060
tcttcgtggt cttctgctga tgaggctaaa caacttagtg actaccatgc aacgatgatg 6120
tcctataatt cgacaactgg gagcggaagt acaaatacga gcaatccttt tgtatcttcc 6180
ctcaacagtt gttcttccag ctatggttat tgcagctcct ctaacagccc gtttgtatcc 6240
ggtagctatt ccatgttccc tgaaggtaag tcttacccaa gtggcgcatg gaacgaagct 6300
acaggttaca tggattcccg ttccggatca gcaccgcata tgaaccatca tatgaatgta 6360
aattatccgt atcagtccat ggagtttaat tcccagttct atccaggtca gactgcgaaa 6420
catgaagcgg ctagatcggc gtgttaccat tcgtccccct atggatatca aggcatgggc 6480
agtatgagtc agttccatcc ccaataccct ggtccaacat cgcagtatcc aggacagttc 6540
catcctcacc gttgggaccc gcacagatgg gatttgtatg gtcctcctcc tttctttcct 6600
gtagtcccgg aaccccccag atcagagcct attggtgaag tgactgacta cattgataac 6660
gaggagtgct tcaaggattc ccagatgggt ggcgttgcaa ttgccctagg tcatggctcg 6720
gtattatttg aatgcgccaa acatgaattg cattcgacaa ctgcattgcg ccgtccaaat 6780
agactgcacc ccactcgaat aagtctagtg ttttatcagc atcgcaatct taacagagcg 6840
aaacacggtt gggatgaatg ggaggagaag atgagactgc gcaagctcgg aatcacaacc 6900
tccacttcga gcactgcaaa ctcaagttct aatggtgcca acaatacctc gaacaactcg 6960
ggaaacggga acaataacac cgcttcggtg accgagcttc ttcatcttct tcccccgacc 7020
gatcgaccgc cgacgtacac gtcgcagttc ctgatgagaa cccccacctt taccaccaca 7080
acatggacta cgctttttcc aatgcatcct tgcatggtga caggaccgta tcaagaaggc 7140
ggggccgttg gatag 7155
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcgtggat tgtggtag 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatggtcgtc ctggtttg 18
<210> 4
<211> 430
<212> DNA
<213> 德国小蠊(Blattella germanica)
<400> 4
cagcgtggat tgtggtagtg atggtggcat gggaaggcgt tccttcacat gaagcagacc 60
gcgtctacaa cctgctcact cataaactga atcgctatgg tcttccaaca actcgccgct 120
gtgccaccaa cgagcccaga acttgcgctt gtcagggact ggaccccgat acctgcgggg 180
ccagtttctc tttcgggtgc tcatggtcca tgtactacaa cggctgcaag tatgctcgct 240
ccaagactgt acgcaagttt cgactttctg tacggtctga ggaacaggaa gtagaagaac 300
gaatgcatgt attggcaact cttttgtcac ctttgtacca gtccttagca ccggatgctt 360
ttaagaacca aacccaattt gagagggaag cttcagaatg ccggttgggt ttcaaaccag 420
gacgaccatt 430
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatacgact cactataggc agcgtggatt gtggtagtg 39
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactatagga atggtcgtcc tggtttgaa 39
<210> 7
<211> 430
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagcguggau ugugguagug augguggcau gggaaggcgu uccuucacau gaagcagacc 60
gcgucuacaa ccugcucacu cauaaacuga aucgcuaugg ucuuccaaca acucgccgcu 120
gugccaccaa cgagcccaga acuugcgcuu gucagggacu ggaccccgau accugcgggg 180
ccaguuucuc uuucgggugc ucauggucca uguacuacaa cggcugcaag uaugcucgcu 240
ccaagacugu acgcaaguuu cgacuuucug uacggucuga ggaacaggaa guagaagaac 300
gaaugcaugu auuggcaacu cuuuugucac cuuuguacca guccuuagca ccggaugcuu 360
uuaagaacca aacccaauuu gagagggaag cuucagaaug ccgguugggu uucaaaccag 420
gacgaccauu 430

Claims (8)

1.德国小蠊Tet2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.靶向沉默德国小蠊Tet2基因的dsRNA，由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列和与SEQ IDNo.7所示的核苷酸反向互补的核苷酸组成的双链RNA。
3.权利要求2所述的dsRNA的制备方法，其特征在于，将SEQ ID No.4所示的DNA片段克隆到pTOPO载体，命名为pTOPO-Tet2，然后以pTOPO-Tet2为模板，设计两端含有T7启动子的引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，进行PCR扩增，PCR产物用T7RiboMAX Express RNAiSystem转录合成得到dsRNA。
4.编码权利要求2所述的dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
5.权利要求4所述的DNA分子的制备方法，其特征在于，基于SEQ ID No.1所示的德国小蠊Tet2基因核苷酸序列，设计含有T7启动子的引物对SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，进行PCR扩增得到。
6.含有权利要求4所述的DNA分子的重组载体或重组菌。
7.权利要求2所述的dsRNA在德国小蠊防治上的应用。
8.权利要求4所述的DNA分子或权利要求6所述的重组载体或重组菌在德国小蠊防治上的应用。
CN201810775922.8A 2018-07-16 2018-07-16 一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用 Active CN108893472B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810775922.8A CN108893472B (zh) 2018-07-16 2018-07-16 一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810775922.8A CN108893472B (zh) 2018-07-16 2018-07-16 一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108893472A CN108893472A (zh) 2018-11-27
CN108893472B true CN108893472B (zh) 2019-07-12

Family

ID=64349380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810775922.8A Active CN108893472B (zh) 2018-07-16 2018-07-16 一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108893472B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110551720B (zh) * 2019-08-13 2020-11-10 梅州市华师昆虫发育生物学与应用技术重点实验室广梅园研发中心 基于美洲大蠊Dsx基因设计的dsRNA、其制备方法、编码基因及应用
CN110862990B (zh) * 2019-10-15 2020-09-01 华南师范大学 与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因、该基因的dsRNA及其制备方法与应用
CN110699359B (zh) * 2019-10-15 2020-11-10 梅州市华师昆虫发育生物学与应用技术重点实验室广梅园研发中心 与德国小蠊表皮发育相关的Grh基因、该基因的dsRNA及其制备方法与应用
CN110679606B (zh) * 2019-11-14 2020-11-10 海南大学 dsRNA及其在防治埃及伊蚊中的应用
CN112458087B (zh) * 2020-11-06 2021-06-08 华南师范大学 基于美洲大蠊HDAC1基因设计的dsRNA、其制备方法、编码基因及其应用
CN114957426B (zh) * 2022-06-02 2023-05-16 华南师范大学 Sp6rars及其在防治蜚蠊目昆虫中的应用
CN116790679B (zh) * 2023-05-30 2024-03-12 华南师范大学 德国小蠊Dnmt1基因在肢体再生及害虫防治中的应用
CN118086313A (zh) * 2024-04-29 2024-05-28 华南师范大学 离子型受体基因ir720在控制德国小蠊求偶行为中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102251040A (zh) * 2011-07-19 2011-11-23 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 德国小蠊kdr突变等位基因检测试剂盒及其专用引物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102251040A (zh) * 2011-07-19 2011-11-23 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 德国小蠊kdr突变等位基因检测试剂盒及其专用引物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DNA羟甲基化酶TET2突变对其功能的影响;王申森 等;《生命的化学》;20170430;第37卷(第2期);第23-28页
德国小蠊Akirin基因的克隆及表达分析;陈静 等;《基因组学与应用生物学》;20180531;第37卷(第5期);第1907-1914页

Also Published As

Publication number Publication date
CN108893472A (zh) 2018-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108893472B (zh) 一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用
Hosokawa et al. Wolbachia as a bacteriocyte-associated nutritional mutualist
Garbutt et al. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica
Chu et al. Differential effects of RNAi treatments on field populations of the western corn rootworm
CN104610440B (zh) ABC转运蛋白基因ABCH1及其特异性dsRNA在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的应用
Das De et al. Interorgan molecular communication strategies of “Local” and “Systemic” innate immune responses in mosquito Anopheles stephensi
CN106102456B (zh) 昆虫的生物防治
Wang et al. The Masc gene product controls masculinization in the black cutworm, Agrotis ipsilon
Fontanilla Achatina (Lissachatina) fulica Bowdich: its molecular phylogeny, genetic variation in global populations, and its possible role in the spread of the rat lungworm Angiostrongylus cantonensis (Chen)
CN108823212B (zh) 美洲大蠊断肢再生相关Wingless信号通路基因及其dsRNA的应用
Sun et al. Detoxification of plant defensive glucosinolates by an herbivorous caterpillar is beneficial to its endoparasitic wasp
Jan et al. Isolation and functional identification of three cuticle protein genes during metamorphosis of the beet armyworm, Spodoptera exigua
Wu et al. RNA interference of odorant receptor CquiOR114/117 affects blood-feeding behavior in Culex quinquefasciatus
US20220346380A1 (en) RNAi Insecticide Materials and Methods
Li et al. Identification and functional analysis of a TEP gene from a crustacean reveals its transcriptional regulation mediated by NF-κB and JNK pathways and its broad protective roles against multiple pathogens
CN109679954A (zh) 基于CRISPR/Cas9的小菜蛾APN3a基因的敲除和应用
Barman et al. Transcription dynamics of heat-shock proteins (Hsps) and endosymbiont titres in response to thermal stress in whitefly, Bemisia tabaci (Asia-I)
CN112695033A (zh) 基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的siRNA及其制备方法与应用
Eychenne et al. Mutagenesis of both prophenoloxidases in the fall armyworm induces major defects in metamorphosis
CN109680010A (zh) 基于CRISPR/Cas9的小菜蛾ABCC3基因的敲除和应用
CN112695045B (zh) 一种鳞翅目昆虫Hpx12基因及应用
CN103103191A (zh) 用于防治昆虫和蜘蛛类动物的RNAi
CN111034736A (zh) 一种杀虫组合物及其应用
Patnaik et al. Silencing of apolipophorin‐III causes abnormal adult morphological phenotype and susceptibility to L isteria monocytogenes infection in T enebrio molitor
CN116790679B (zh) 德国小蠊Dnmt1基因在肢体再生及害虫防治中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20191212

Address after: Building 9, Guangmei Green Innovation Center, No.1, Gaoxin 2nd Road, high tech Zone, Meizhou City, Guangdong Province

Patentee after: Meizhou Huasheng Guangmei Biotechnology Co., Ltd

Address before: 510631 School of life science, South China Normal University, 55 West Zhongshan Road, Guangzhou, Guangdong, Tianhe District

Patentee before: South China Normal University