CN103103191A - 用于防治昆虫和蜘蛛类动物的RNAi - Google Patents

Abstract

本发明描述了新的不基于化合物的防治昆虫和/或蜘蛛类动物的方法。本发明人已首次鉴定了新的RNAi靶标，其能够有效地防治昆虫和/或蜘蛛类有害生物群体。由此，本发明提供有关新靶标的核苷酸和氨基酸序列。本发明还提供包含用于在昆虫中介导RNAi的双链RNA区的RNA构建体、DNA构建体、表达载体、宿主细胞和组合物，其利用RNAi来防治昆虫和/蜘蛛类动物。最后，本发明还提供所述的构建体、载体、宿主细胞和组合物在防治昆虫和/或蜘蛛类动物群体中的用途以及适用于基于RNAi来防治昆虫和/或蜘蛛类有害生物的方法的试剂盒。

Description

用于防治昆虫和蜘蛛类动物的RNAi

本申请是德福根有限公司于2006年5月31日提交的发明名称为“用于防治昆虫和蜘蛛类动物的RNAi”的中国专利申请号200680024099.2的分案申请，原申请是国际申请号PCT/IB2006/129204于2007年12月29日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及昆虫物种中双链RNA(dsRNA)介导基因沉默的领域。更具体地，本发明涉及遗传构建体，其被设计用来表达对应于本文首次鉴定的新靶标的dsRNA。这些构建体在dsRNA介导的有害昆虫防治中，尤其是在防治居室昆虫或者蜘蛛类动物例如蟑螂中，是非常有用的。

背景技术

有害生物防治，特别是昆虫和/或蜘蛛类动物的防治，尤其是涉及公众健康和卫生(例如城市保护)的居室昆虫、外寄生物和昆虫(比如蟑螂、跳蚤、蚂蚁、白蚁、蠼螋(earwigs)、蚊、蝇和家蟋蟀)的防治是重要的领域。在诸如家庭、办公室、餐馆、医院或者仓库的一些地点昆虫的存在无疑造成困扰，因为公众的观念认为昆虫比如蟑螂或者蝇生存的地方是肮脏的和不卫生的。

这些昆虫不但造成困扰，而且还污染食物和餐具、破坏织物和纸制品并且给它们所接触的表面带来污迹和令人讨厌的气味。此外，这些昆虫作为细菌携带者可以引起健康风险。例如蟑螂可以传播引起食物中毒的细菌(沙门氏菌属(Salmonella spp.)和志贺氏菌属(Shigella spp.))。德国蟑螂被认为能够传播引起疾病的生物体比如葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、肝炎病毒和大肠杆菌类细菌。它们还涉及伤寒和痢疾的传播。一些人，尤其是具有哮喘的人，对这些蟑螂产生的过敏原是敏感的。

有多种已开发且市售的化学杀虫剂和捕获装置用于对抗居室有害生物。然而，随着这些手段功效的增加，健康风险通常也随之增加。杀虫剂可能污染食物，这在诸如厨房、餐馆或者食物贮藏间的一些地方中几乎是不可避免的，并且混入杀虫剂可能引起人的健康风险。

已有解决所述污染问题的方案是应用较少毒性的杀虫剂。然而，当应用较少毒性的杀虫剂时，昆虫随时间变得有抗性的可能性增加。杀虫剂通过结合某种昆虫蛋白质(比如例如乙酰胆碱受体)起作用，并通过使所述蛋白质失活或者过度活化来引起有害生物物种死亡。已开发的杀虫剂在一定浓度下是安全的，但是当所述杀虫剂以较高剂量或者持续长时间地掺入时，能够并确实影响人的健康。与农用化学品相反，家用杀虫剂被施用于贮藏食物或者准备食物的一些地方，于是食物污染以及与人的接触是不能避免的。

一种替代化学杀虫剂的方法是利用生物试剂。在过去的几年中，依靠RNA干扰或者“RNAi”下调多细胞生物体内的基因(也被称为“基因沉默”)已经成为非常完善的技术。

通常，RNAi包括使生物体与双链RNA片段或者“dsRNA”(通常作为两条退火的互补单链RNA或者作为发夹构建体)相接触，所述双链RNA片段或者“dsRNA”包含对应于待下调基因(“靶基因”)之(至少一部分)核苷酸序列的核苷酸序列。具体可参见国际申请WO 99/32619(Carnegie Institute of Washington)、国际申请WO 99/53050(CSIRO)、国际申请WO 00/010846(Devgen)和Fire et al.，Nature，Vol.391，pp.806-811，February 1998。

在线虫类中，可以通过用dsRNA片段本身或者作为替代，用含有dsRNA片段的或者经线虫摄食后能够表达dsRNA片段的细菌菌株喂食线虫来实施RNAi。对于这种所谓的“经摄食的RNAi”，具体可参见申请人的国际申请WO 00/01846以及上述引用的WO 99/32619，其中应用了线虫秀丽隐杆线虫(C.elegans)。

在本领域中已经描述了许多dsRNA构建体。从DNA构建体产生典型的dsRNA，其包含两个会聚的启动子(convergent promoter)，位于需要下调之靶序列的互补序列的旁侧(见例如WO00/01846(Devgen))。随着dsRNA介导的基因沉默技术的发展，设计了新的构建体以改进用于各种目的的dsRNA。

为了更有效地产生dsRNA，开发了茎-环-茎结构或者“发夹”。例如，如在文件WO 99/53050(CSIRO)中描述的，此发夹允许从一种单一RNA转录物形成dsRNA。所述RNA转录物包括互补序列的正义和反义型式，其由非互补环结构分开，这允许RNA转录物折叠回来并碱基配对构成dsRNA的茎部分。

发现dsRNA基因沉默在许多不同的领域有应用，比如例如dsRNA介导的基因沉默在临床(WO2004/001013)和植物中的应用。在植物中，也设计了用于基因沉默的dsRNA构建体以切割并加工成为短干扰RNA(siRNA)。

也已经计划将RNAi作为保护植物抵抗植物寄生线虫的手段，即通过在植物中(例如，在完整植株中，或者在植物部分组织或细胞中)表达一种或多种核苷酸序列，所述核苷酸序列形成对应于植物寄生线虫中靶基因的dsRNA片段，所述靶基因是线虫生长、繁殖和/或生存所必需的。可参见本申请人的国际申请WO 00/01846，美国专利6,506,559(基于WO 99/32619)，以及国际申请WO 01/96584、WO 01/37654和WO03/052110对这些技术的说明。

Elbashir et al.(Nature，411，494-498，2001)已证明在哺乳动物细胞中应用长度为21个核苷酸的dsRNA片段(也被称为小干扰RNA或者siRNA)实现有效的RNAi介导的基因沉默。

WO 03/004644概括地描述了向节肢动物递送dsRNA，并且其通过参考并入本文。WO 03/004644详述了应用RNAi下调黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的报告基因GUS(Clontech)和下调棉铃虫(H.armigera)的vATPase基因。

WO 01/34815描述了产生dsRNA的杆状病毒表达载体以及这些载体在有害生物防治中的应用。

尽管在植物、线虫和哺乳动物细胞的领域中，RNAi技术被一般性了解已经有数年，但迄今为止对在昆虫和/或蜘蛛类动物中应用RNAi下调基因表达却没有多少了解。此外，对应用RNAi防治有害生物物种比如涉及公众健康和卫生的居室昆虫、外寄生物和昆虫和/或蜘蛛类动物也缺乏了解。

对于dsRNA介导的有害生物防治来说，合适的和有效的构建体应至少满足以下一些要求：

(1)所述dsRNA必须被有害生物体摄取

(2)所述dsRNA在有害生物体中必须具有良好的稳定性

(3)所述dsRNA必须在有害生物体中有效地控制其生存力、生长和/或发育和/或

(4)所述dsRNA必须保证最大的安全性以及最小的环境影响。

在此本发明的目的是提供满足上述要求的dsRNA构建体。

发明内容

本发明描述了新的不基于化合物的防治昆虫和/或蜘蛛类动物的方法。活性成分是核酸，双链RNA(dsRNA)，其可被用作杀昆虫的和杀蜘蛛的制剂(例如在诱饵或者凝胶应用中)。dsRNA序列匹配昆虫必需基因(essential gene)的一部分并通过RNA干扰(RNAi)引起昆虫靶基因的下调。作为mRNA下调的结果，dsRNA阻止相应昆虫蛋白质的表达并由此引起昆虫和/或蜘蛛类动物的死亡、生长停滞或者不育。

靶标

本发明人已首次鉴定了新的RNAi靶标，其能够有效地防治昆虫或者蜘蛛类有害生物群体。

为避免疑义，在本文中将靶标定义为基因，它的蛋白质产物是昆虫和/或蜘蛛类动物维持其正常生理和生物化学功能所必需的。对所述靶基因表达的抑制限制了昆虫和/或蜘蛛类动物进食、生长或者存活的能力。可用于本发明实践的昆虫和/或蜘蛛类动物基因的实例包括必需基因，涉及诸如发育、代谢或者神经传导过程的基因，以及其产物是现有杀昆虫剂和/或杀蜘蛛剂靶标的基因。在本发明的一个优选实施方案中，靶标是细胞功能必需途径的一部分，所述细胞功能比如转录、翻译、细胞骨架、细胞周期、代谢(合成代谢或者分解代谢)、胞吞作用、细胞内和细胞间转运、钙结合、核输入和输出、核酸结合、信号肽酶-蛋白质结合、蛋白酶体、囊泡转运、神经传导、水分平衡、离子平衡、剪接、有丝分裂、减数分裂、染色体组构、稳定性或者完整性、微RNA、siRNA、翻译后蛋白质修饰、电子传递、凋亡、膜完整性和细胞粘附。

本发明鉴定的新的靶基因包括：

A)结构蛋白质，例如原肌球蛋白1(GenBank AF260897)(SEQ IDNO 41和42)、肌动蛋白5C(GenBank AY004248)(SEQ ID NO 57和58)和在相同的或者不同的昆虫和/或蜘蛛类动物物种中具有相同生物学功能的同源或者异源蛋白质；

B)代谢酶，例如HMG辅酶A合酶(GenBank X73679)(SEQ IDNO 49和50)和在相同的或者不同的昆虫和/或蜘蛛类动物物种中具有相同生物学功能的同源或者异源蛋白质；

C)涉及离子/pH体内稳态的酶，比如V-ATPase和在相同的或者不同的昆虫和/或蜘蛛类动物物种中具有相同生物学功能的同源或者异源蛋白质；

D)涉及转录/翻译机制的酶，比如例如

●核糖体蛋白质S4同源物(SEQ ID NO 1和2)

●核糖体蛋白质S9同源物(SEQ ID NO 11和12)

●核糖体蛋白质L9同源物(SEQ ID NO 21和22)

●核糖体蛋白质L19同源物(SEQ ID NO 31和32)

因此，本发明的第一方面提供核酸分子，其包含SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181中任一的核苷酸序列，或者来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的直系同源(orthologous)核苷酸序列，其中所述直系同源核苷酸序列与SEQ IDNO 1、11、21和31中任一种所示的核苷酸序列具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、更优选至少约95％、甚至更优选至少约96％、97％、98％、最优选至少99％序列一致性。优选的直系同源序列包含，或者如果按照本发明方法使用时将包括，来自居室昆虫、外寄生物以及涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物的序列，例如蝇、叶螨(spider mites)、蓟马(thrips)、壁虱、家禽红螨(red poultry mite)、蚂蚁、蟑螂、白蚁、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣鱼(silverfish)、书虱、甲虫(beetles)、蠼螋、蚊和跳蚤，但不限于此。更优选的直系同源序列来自蟑螂(蜚蠊目(Blattodea))，比如但不限于小蠊属(Blatella spp.)(例如，德国小蠊(Blatella germanica)(德国蟑螂))、大蠊属(Periplanetaspp.)(例如，美洲大蠊(Periplaneta americana)(美洲蟑螂)和澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae)(澳洲蟑螂))、蜚蠊属(Blatta spp.)(例如东方蜚蠊(Blatta orientalis)(东方蟑螂Oriental cockroach))和蠊属(Supella spp.)(例如褐带蠊(Supella longipalpa)(褐带蟑螂(brown-banded cockroach))；蚂蚁(蚁总科(Formicoidea))，比如但不限于火蚁属(Solenopsis spp.)(例如入侵红火蚁(Solenopsis invicta)(红火蚁))、小家蚁属(Monomorium spp.)(例如法老小家蚁(Monomorium pharaonis)(法老蚁(Pharaoh Ant))、弓背蚁属(Camponotus spp.)(例如弓背蚁属(Camponotus spp)(木匠蚁(Carpenter Ants))、毛蚁属(lasius spp.)(例如黑毛蚁(lasius niger)(小黑蚁(Small Black Ant)))、铺道蚁属(Tetramorium spp.)(例如铺道蚁(Tetramorium caespitum)(铺道蚁(Pavement Ant)))、红蚁属(Myrmica spp.)(例如小红蚁(Myrmica rubra)(红蚁(Red Ant)))、蚁属(Formica spp.)(木蚁(wood ants))、举腹蚁属(Crematogaster spp.)(例如举腹蚁(Crematogaster lineolata)(举腹蚁(Acrobat Ant)))、虹臭蚁属(Iridomyrmex spp.)(例如伊蚁(Iridomyrmex humilis)(阿根廷蚁(Argentine Ant)))、大头蚁属(Pheidole spp.)(大头蚁(Big HeadedAnts))和蚁蜂属(Dasymutilla spp.)(例如蚁蜂(Dasymutilla occidentalis)(蚁蜂(Velvet Ant)))；白蚁类(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白蚁科(Termitidae))比如但不限于暗白蚁属(Amitermes spp.)(例如佛罗里达暗白蚁(Amitermes floridensis)(佛罗里达暗翅土白蚁(Florida dark-winged subterranean termite)))、散白蚁属(Reticulitermes spp.)(例如黄肢散白蚁(Reticulitermes flavipes)(东方土白蚁(the eastern subterranean termite))、西方土白蚁(Reticulitermes hesperus)(西方土白蚁(Western SubterraneanTermite)))、家白蚁属(Coptotermes spp.)(例如家白蚁(Coptotermesformosanus)(台湾土白蚁(Formosan Subterranean Termite)))、楹白蚁属(Incisitermes spp.)(例如小楹白蚁(Incisitermes minor)(西方干木白蚁(Western Drywood Termite)))和新白蚁属(Neotermes spp.)(例如Neotermes connexus(森林白蚁(Forest Tree Termite)))。

本发明的另一方面提供核酸分子，其包含以下任一所示的核苷酸序列、或者基本由其组成或由其所组成：SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200。

SEQ ID NO 4、6、7、16、27、26、27、36和37中的所有序列均代表特异性引物的核苷酸序列，其被用于以选择性和特异性方式鉴定本发明的新序列。

新鉴定的基因代表德国小蠊(Blatella germanica)转录/翻译机制的成分。通过RNAi抑制这些基因的表达或者通过RNAi抑制这些新鉴定的靶基因的表达，可以防治重要的有害生物。

可预测的并且本领域技术人员应理解的是，这些新的靶基因的直系同源物也代表在防治其它昆虫和/或蜘蛛类动物物种中供下调的另外靶标。因此，本发明的新核酸分子的直系同源物也涵盖在本发明范围内。

如果蛋白质或者核苷酸序列显示出“显著”水平的序列相似性或者一致性，那么它们可能是同源的。真正同源的序列是通过从共同祖先基因的趋异化而相关的。序列同源物可以是以下两种类型：(i)当同源物存在于不同的物种，它们被称为直系同源物。例如，小鼠和人中的α-珠蛋白基因是直系同源物。(ii)旁系同源物(paralogue)是单一物种内的同源基因。例如，在小鼠中α-和β-珠蛋白基因是旁系同源物基因。在本文中，“直系同源物”是指上述两种类型的同源物。

在一个实施方案中，所述直系同源物将与SEQ ID NO 1、11、21、31、41、49或57中任一序列所示的核苷酸序列具有至少约40％、50％或者60％的核苷酸一致性。优选地，所述直系同源物将与SEQ ID NO1、11、21、31、41、49或57中任一序列所示的核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％，更优选至少约95％甚至更优选至少约96％、97％、98％或者99％的序列一致性。

根据另一实施方案，本发明包括作为一种基因之昆虫或者蜘蛛类动物直系同源物的靶基因，所述一种基因包含以下任一所示的核苷酸序列、或者基本由其组成或由其所组成：SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200。作为实例，直系同源物可以包括SEQ ID NO 71-200中任何序列表示的核苷酸序列，或者其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的片段。在表4和5中给出了昆虫或者蜘蛛类直系同源基因或者包含本发明序列之一的至少17个核苷酸之片段的序列的非限制性列表。表4和5的序列构成本发明的一部分。因此，直系同源物包括表4和5列举的任意序列、或者基本由其组成或由其所组成。

根据另一方面，本发明由此包括本文描述的用于防治昆虫和/或蜘蛛类动物侵染或者感染的任意方法，其包括使昆虫和/或蜘蛛类动物与双链RNA接触，其中所述双链RNA包括退火的互补链，其中一条链具有与靶基因核苷酸序列至少一部分互补的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO71-200所示任意序列的至少17、18、19、20或者21个核苷酸的片段，由此所述双链RNA被昆虫和/或蜘蛛类动物摄取并由此防治昆虫和/或蜘蛛类动物的生长，杀伤或者防止其侵染或者感染。所述昆虫和/或蜘蛛类动物可以包括本文描述的任何靶生物体/物种、或者基本由其组成或由其所组成。

本发明所包括的相关核酸分子还可以根据与包含SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181中任一所示核苷酸序列的核酸分子的杂交进行定义。优选地，杂交条件是中等严谨的杂交条件，甚至更优选高严谨的杂交条件。中等和高严谨的这些条件对于本领域技术人员是非常熟悉的。例如，在42℃包含50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS的溶液中孵育杂交反应，或者在65℃包含5×SSC和1％SDS的溶液中孵育，并在65℃用0.2×SSC和0.1％SDS清洗，代表适合的高严谨条件。

本发明还提供这些新靶基因的蛋白质产物和其直系同源物。

由此，本发明的第二方面提供包含SEQ ID NO 2、12、22或者32中任一序列所示氨基酸序列的蛋白质或者其直系同源蛋白质，其具有来自其它昆虫和/或蜘蛛类动物物种的保守氨基酸序列。

如上所述，还预测，所述新靶基因的直系同源物将代表在防治其它昆虫和/或蜘蛛类动物物种中可供下调的其它靶标。因此，本发明的新蛋白质分子的直系同源物也涵盖在本发明范围内。

在一个实施方案中，所述直系同源物将与SEQ ID NO 2、12、22或者32任一序列所示的氨基酸序列具有至少约40％氨基酸序列一致性。优选地，所述直系同源物将与SEQ ID NO 2、12、22或者32任一序列所示的氨基酸序列具有至少约40％、50％、60％、65％、70％、80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约96％、97％、98％或者95％氨基酸序列一致性。

在另一实施方案中，本发明还提供编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含SEQ ID NO 2、12、22或者32任一序列所示的氨基酸序列。本发明此方面包括的核酸分子还包括因编码相同蛋白质分子而在功能上等价的核酸分子。因此，由于遗传密码简并性而可能产生的所有核酸分子落入本发明此方面的范围。

靶生物体/物种

本发明使用的“靶物种”可以是代表有害生物的任何昆虫或者蜘蛛类动物物种。该术语还表示在任何发育阶段的所述昆虫或者蜘蛛类动物。因为昆虫具有不生长的外骨骼，所以它们不能以恒定速率生长，而是通过周期性脱落它们的外骨骼分阶段性生长。这些阶段被称为脱皮或者蜕皮。在蜕皮之间的阶段被称为“龄(instars)”，并且根据本发明可以靶向该阶段。同样地，按照本发明也可以靶向昆虫卵或者活体幼虫(liveyoung)。按照本发明可以通过RNAi靶向发育周期中的所有阶段(包括有翅昆虫的变态阶段)。因此，发育的各个阶段比如幼虫、蛹、若虫等阶段都可以被靶向。

靶物种可以是任何昆虫或者蜘蛛类动物，意指属于动物界的，更具体属于节肢动物门和昆虫纲或者蛛形纲的任何生物体或者物种。本发明的方法可适用于对经由RNA干扰的基因沉默敏感的和能够从周围环境内化双链RNA的所有昆虫和蜘蛛类动物。

在本发明一个实施方案中，所述昆虫或者蜘蛛类动物可以属于以下目：蜱螨亚纲(Acari)、蛛形纲(Arachnida)、虱目(Anoplura)、蜚蠊目(Blattodea)、鞘翅目(Coleoptera)、弹尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)、纺足目(Embioptera)、蜉蝣目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)、异翅亚目(Heteroptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、

毛目(Phithiraptera)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨尾目(Thysanura)、胸喙亚目(Sternorrhyncha)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)、缺翅目(Zoraptera)和衣鱼目(Zygentoma)。

在本发明优选的但非限制性的实施方案中，所述昆虫或者蜘蛛类动物选自以下组：

(1)蜱螨亚纲：螨类(mites)包括蜱亚目(Ixodida)(壁虱(ticks))

(2)蛛形纲：蜘蛛目(Araneae)(蜘蛛)和盲蛛目(Opiliones)(盲蜘蛛)，实例包括：美国毒蛛(Latrodectus mactans)(黑寡妇)和隐遁斜蛛(Loxosceles recluse)(棕色隐遁蜘蛛(Brown RecluseSpider))

(3)虱目：虱(lice)，比如人体虱(Pediculus humanus)(人体虱(humanbody louse))

(4)蜚蠊目(Blattodea)：蟑螂包括德国蟑螂(德国小蠊)，大蠊属蟑螂，其包括美洲蟑螂(美洲大蠊(Periplaneta americana))和澳洲蟑螂(澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae))，蜚蠊属蟑螂，其包括东方蟑螂(东方蜚蠊(Blatta orientalis))和蠊属蟑螂，其包括褐带蟑螂(褐带蠊(Supella longipalpa))。最优选的靶标是德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))。

(5)鞘翅目：甲虫，实例包括：粉蠹科(the family of Powderpost beetle)(长蠹总科(family of Bostrichoidea))；大小蠹属(Dendroctonusspp.)(黑松节油大小蠹(Black Turpentine Beetle)，华山松大小蠹(Southern Pine Beetle)，IPS切梢小蠹(IPS Engraver Beetle))；地毯甲虫(Carpet Beetles)(圆皮蠹属(Anthrenus spp.)、毛皮蠹属(Attagenus spp.))；老房蛀虫(Old House Borer)(天牛科(family of Cerambycidae)：北美家天牛(Hylotrupes bajulus))；家具窃蠹(Anobium punctatum)；拟谷盗属(Tribolium spp.)(粉甲虫(flour beetle))；谷斑皮蠹(Trogoderma granarium)(谷斑皮蠹(Khapra Beetle))；锯谷盗(Oryzaephilus sarinamensis)(锯谷盗(Toothed Grain Beetle))等(书蠹(Bookworm))

(6)革翅目：蠼螋科(family of earwigs)

(7)双翅目：蚊(mosquitoes)(蚊科(Culicidae))和蝇(flies)(短角亚目(Brachycera))，实例为：按蚊亚科(Anophelinae)比如按蚊属(Anopheles spp.)和库蚊亚科(Culicinae)比如Aedesfulvus；虻科(Tabanidae)比如Tabanus punctifer(马蝇(HorseFly))、刺舌蝇(Glossina morsitans morsitans)(舌蝇(tsetse fly))、污水蝇(drain flies)(毛蠓科(Psychodidae))和有瓣蝇类(Calyptratae)比如舍蝇(Musca domestica)(家蝇(House fly))，肉蝇(flesh flies)(麻蝇科(family of Sarcophagidae))等。

(8)异翅亚目：臭虫类(bugs)，比如温带臭虫(Cimex lectularius)(臭虫(bed bug))

(9)膜翅目(Hymenoptera)：黄蜂(wasps)(细腰亚目(Apocrita))，包括蚂蚁(ants)(蚁总科(Formicoidea))，蜜蜂(bees)(蜜蜂总科(Apoidea))：入侵红火蚁(红火蚁(Red Fire Ant))、小家蚁(Monomorium pharaonis)(小黄家蚁(Pharaoh Ant))、弓背蚁属(Camponotus spp)(木匠蚁(Carpenter Ants))、黑毛蚁(lasiusniger)(小黑蚂蚁(Small Black Ant))、铺道蚁(tetramoriumcaespitum)(铺道蚁(Pavement Ant))、小红蚁(Myrmica rubra)(红蚁(Red Ant))、蚁属(Formica spp.)(木蚁(wood ants))、举腹蚁(Crematogaster lineolata)(举腹蚁)、伊蚁(Iridomyrmexhumilis)(阿根廷蚁(Argentine Ant))、大头蚁属(Pheidole spp.)(大头蚁)、蚁蜂(Dasymutilla occidentalis)(蚁蜂)等。

(10)等翅目：白蚁，实例包括：佛罗里达暗白蚁(Amitermesfloridensis)(佛罗里达暗翅土白蚁)，东方土白蚁(黄肢散白蚁(Reticulitermes flavipes))，the R.hesperus(西方土白蚁(WesternSubterranean Termite))，家白蚁(Coptotermes formosanus)(台湾土白蚁)，小楹白蚁(Incisitermes minor)(西方干木白蚁)，Neotermes connexus(森林白蚁)和白蚁科

(11)鳞翅目：蛾(moths)，实例包括：谷蛾科(Tineidae)和织蛾科(Oecophoridae)比如衣蛾(Tineola bisselliella)(普通衣蛾(Common Clothes Moth))，和螟蛾科(Pyralidae)比如紫斑谷螟(Pyralis farinalis)(膳食飞蛾(Meal Moth))等

(12)啮虫目：书虱(啮虫(Psocids))

(13)隐翅目：跳蚤，比如致痒蚤(Pulex irritans)

(14)胸喙亚目：蚜虫(aphids)(蚜科(Aphididae))

(15)衣鱼目：衣鱼(silverfish)，实例为：小灶衣鱼(Thermobiadomestica)和西洋衣鱼(Lepisma sacch arina)

优选的靶昆虫或者蜘蛛类动物包括居室昆虫、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物，作为举例但非限制的蝇，叶螨、蓟马、壁虱，家禽红螨、蚂蚁、蟑螂、白蚁、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣鱼、书虱、甲虫、蠼螋、蚊和跳蚤。更优选的靶标是蟑螂(蜚蠊目)比如但不限于小蠊属(Blatella spp.)(例如德国小蠊(Blatella germanica)(德国蟑螂))、大蠊属(Periplaneta spp.)(例如美洲大蠊(Periplanetaamericana)(美洲蟑螂)和澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae)(澳洲蟑螂))、蜚蠊属(Blatta spp.)(例如东方蜚蠊(Blatta orientalis)(东方蟑螂))和蠊属(Supella spp.)(例如褐带蠊(Supella longipalpa)(褐带蟑螂)；蚂蚁(蚁总科(Formicoidea))，比如但不限于火蚁属(Solenopsisspp.)(例如入侵红火蚁(Solenopsis invicta)(红火蚁))、小家蚁属(Monomorium spp.)(例如法老小家蚁(Monomorium pharaonis)(法老蚁(Pharaoh Ant))、弓背蚁属(Camponotus spp.)(例如弓背蚁属(Camponotus spp)(木匠蚁(Carpenter Ants))、毛蚁属(lasius spp.)(例如黑毛蚁(lasius niger)(小黑蚁(Small Black Ant)))、铺道蚁属(Tetramorium spp.)(例如铺道蚁(Tetramorium caespitum)(铺道蚁(Pavement Ant)))、红蚁属(Myrmica spp.)(例如小红蚁(Myrmicarubra)(红蚁(Red Ant)))、蚁属(Formica spp.)(木蚁(wood ants))、举腹蚁属(Crematogaster spp.)(例如Crematogaster lineolata(AcrobatAnt))、虹臭蚁属(Iridomyrmex spp.)(例如伊蚁(Iridomyrmex humilis)(阿根廷蚁(Argentine Ant)))、大头蚁属(Pheidole spp.)(大头蚁(BigHeaded Ants))和Dasymutilla spp.(例如Dasymutilla occidentalis(VelvetAnt))；白蚁类(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白蚁科(Termitidae))比如但不限于暗白蚁属(Amitermes spp.)(例如佛罗里达暗白蚁(Amitermes floridensis)(佛罗里达暗翅土白蚁(Florida dark-wingedsubterranean termite)))、散白蚁属(Reticulitermes spp.)(例如黄肢散白蚁(Reticulitermes flavipes)(东方土白蚁(the eastern subterraneantermite))、Reticulitermes hesperus(西方土白蚁(Western SubterraneanTermite)))、家白蚁属(Coptotermes spp.)(例如家白蚁(Coptotermesformosanus)(台湾土白蚁(Formosan Subterranean Termite)))、楹白蚁属(Incisitermes spp.)(例如小楹白蚁(Incisitermes minor)(西方干木白蚁(Western Drywood Termite)))和新白蚁属(Neotermes spp.)(例如Neotermes connexus(森林白蚁(Forest Tree Termite)))。更优选的靶标是蟑螂。最优选的靶标是德国蟑螂(德国小蠊(Blatellagermanica))。

RNA构建体

“互补的”意思是，RNA链代表指定序列的RNA等价物(如果所述序列是DNA序列)或者DNA序列互补序列的RNA等价物。

本发明涉及供RNAi介导下调基因表达的另外靶标。对于本文鉴定的所有靶标，在本发明的另一方面中提供RNA构建体，其包括双链RNA区，其中至少一条链包含与以下任一核苷酸序列之一部分相互补的核苷酸序列：(i)由SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181任一序列确定的靶核酸分子；或者(ii)包含SEQ ID NO 41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200任一序列所示核苷酸序列的核酸分子，或者其来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的直系同源核苷酸序列。如上所述，所述直系同源物可以与SEQ ID NO 1、4、6、7、11、16、17、21、26、27、31、36、37、41、43、44、49、51、52和57任一序列所示的核苷酸序列具有至少约50％核苷酸序列一致性。优选地，所述直系同源物将与SEQ ID NO 1、4、6、7、11、16、17、21、26、27、31、36、37、41、43、44、49、51、52和57任一序列所示的核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％，更优选至少约95％、甚至更优选至少约96％、97％、98％或者99％序列一致性。

如前述，本文在德国小蠊中鉴定的靶标的直系同源物被认为在其它昆虫和/或蜘蛛类动物物种中也是可行的靶标，所述的昆虫和/或蜘蛛类动物物种包括居室昆虫和/或蜘蛛类动物、外寄生物以及涉及公众健康和卫生的昆虫，例如苍蝇、叶螨、蓟马、壁虱、家禽红螨、蚂蚁、蟑螂、白蚁、蟋蟀(包括家蟋蟀)、蠹虫、书虱、甲虫、蠼螋、蚊和跳蚤，但不限于此。

最优选的靶标源于蟑螂，例如小蠊属的蟑螂，包括德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))，大蠊属的蟑螂，包括美洲蟑螂(美洲大蠊(Periplaneta americana))和澳洲蟑螂(澳洲大蠊(Periplanetaaustraliasiae))，蜚蠊属(Blatta)的蟑螂，包括东方蟑螂(东方蜚蠊(Blattaorientalis))和蠊属(Supella)的蟑螂，包括褐带蟑螂(褐带蠊(Supellalongipalpa))。最优选的靶标是德国蟑螂(德国小蠊(Blatellagermanica))，其中新的靶标已被鉴定。

之前已有报导，约21bp的短干扰RNA(siRNA)的形成对于有效的基因沉默是理想的。然而，在本申请人的应用中已表明，为了被某些有害生物体有效地摄取，dsRNA的最小长度优选为至少约80-100bp。有迹象表明，在无脊椎动物中，比如自由运动的线虫秀丽隐杆线虫(C.elegans)或者植物寄生线虫南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，这些较长片段在基因沉默中更加有效，这可能是由于这些长的dsRNA被无脊椎动物更有效地摄取。

最近还有证据表明，与常规的21聚体siRNA相比，由平头27聚体或者短发夹(sh)RNA(其具有29bp的茎和2-nt 3’突出端)组成的合成RNA双链体是RNA干扰更加有效的诱导物(见，Williams，NatureBiotechnology Vol 23，2，Feb 2005，181 and Kim et al，NatureBiotechnology Vol 23，2，Feb 2005，222-229and Siolas et al，NatureBiotechnology Vol 23，2，Feb 2005，227-231，它们以整体通过参考并入本文)。因此，基于以上鉴定的靶标以及平头27聚体或者具有29-bp茎和2-nt 3’突出端的短发夹(sh)RNA的分子也包括在本发明范围内。

因此，在一个实施方案中，所述RNA构建体具有双链RNA区，其长度为至少约17bp，优选至少约21bp，更优选约20-1500bp，甚至更优选约80-1000bp，最优选约17-27bp或者约80-250bp；比如约17bp、18bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp或者1500bp的双链RNA区。

双链RNA长度的上限可以取决于i)dsRNA被昆虫和/或蜘蛛类动物所摄取的要求和ii)dsRNA在相关细胞中被加工成指导RNAi的片段的要求。所选的长度还可受到RNA合成方法以及递送RNA至细胞的方式的影响。优选地，在本发明方法中待应用的双链RNA将小于10,000bp长，更优选小于或等于1000bp，更优选小于或等于500bp，更优选小于或等于300bp，更优选小于或等于100bp。

用单个RNA构建体靶向多个靶基因可以增加在有害生物防治方面的功效。如此，有害生物不太可能存活和获得抗性，因为将有多种双链RNA介导RNA干扰，其可能所有的同时作用或者可能以级联方式作用。

本发明的方法包括同时地或者依次向同一昆虫和/或蜘蛛类动物提供两种或多种不同的双链RNA或者RNA构建体，从而实现对多个靶基因的下调或者抑制或者实现对单靶基因的更有效抑制。

根据另一个实施方案，本发明的RNA构建体包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与本文描述的任何核苷酸序列之一部分相互补的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的互补序列包含与以下序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、85％、90％，更优选至少约95％和甚至更优选至少约96％、97％、98％或者99％序列一致性：(i)SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181中任意序列所示的核酸分子的部分核苷酸序列，或者(ii)如下的核酸分子，其包含SEQ ID NO 41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列，或者其来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的直系同源核苷酸序列，其中序列一致性百分率是在相同长度上计算的。

“在相同的长度上”意指当计算序列之间一致性百分率时，所述计算是在两个序列中对应的核苷酸区段上进行的。

或者，提供一种双链RNA来下调多种靶基因，所述双链RNA起到抗多种靶序列的作用。或者，存在超过一拷贝的对应于靶基因的双链RNA片段可以更有效地抑制单个靶标。因此，在本发明一个实施方案中，所述双链RNA构建体包含多个dsRNA区，各个dsRNA区的至少一条链包含与昆虫和/或蜘蛛类动物靶基因的靶核苷酸序列至少一部分相互补的核苷酸序列。根据本发明，RNA构建体中的dsRNA区可以互补于相同的或者不同的靶基因和/或所述dsRNA区可以互补于来自相同或者不同昆虫和/或蜘蛛类动物物种的靶基因。

因此，本发明提供根据本发明的分离的双链RNA或者RNA构建体，其包含至少两个双链RNA区，其中每个区的至少一条链包含以下核苷酸序列、或者基本由其组成或由其所组成：与SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一核苷酸序列的一部分互补的核苷酸序列，或者与来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的直系同源核苷酸序列的一部分互补的核苷酸序列，其中所述直系同源核苷酸序列至少与SEQ ID NO 1、11、21和31任一核苷酸序列的相关部分或者包括SEQ ID NO 41、43、44、49、51、52和57任一序列所示核苷酸序列的核酸分子的相关部分具有至少70％、80％、85％、87.5％、90％、95％或者至少99％序列一致性。优选地，所述双链RNA或者RNA构建体包含独立地选自下述一个或者至少两个核苷酸序列、或者基本由或者由独立地选自下述的一个或至少两个核苷酸序列组成：SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200的任意序列，优选SEQ ID NO 65-70的任意序列。

因此，在本发明一个实施方案中，RNA构建体包括多个dsRNA区，每个dsRNA区的至少一条链包含与来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的靶基因核苷酸序列一部分相互补的核苷酸序列。根据本发明，RNA构建体中的dsRNA区可以与相同或者不同靶基因相互补；dsRNA区可以与来自相同或者不同昆虫物种的靶标相互补。

dsRNA可以按照如下进行组合：

a)当对靶向单靶基因的多个dsRNA区进行组合时，它们可以在RNA构建体中以原始顺序(即以各片段在靶基因中呈现的顺序)组合，

b)或者，可以忽略各片段的原始顺序，从而将它们打乱并随机地或者有意地以任意顺序组合成RNA构建体，

c)或者，一个单片段可以在RNA构建体中被重复几次，例如1-10次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10次，或者

d)可以以正义或者反义取向组合dsRNA区(靶向单一的或者不同的靶基因)。

此外，待组合的靶基因可以选自以下一个或多个基因类别(包括其适当的所有可能组合)：

e)“必需”基因或者“致病性”基因，包括对于一种或多种靶昆虫和/或蜘蛛类动物是必需的并且当被沉默时造成致死或者严重(例如运动、摄食、麻痹、饮用、生育、繁殖、生长)表型的基因。选择强致死靶基因导致有力的RNAi效果。在本发明的RNA构建体中，可以组合靶向相同或不同(非常有效)致死基因的多个dsRNA区以进一步增加RNAi在昆虫和/或蜘蛛类动物防治中的效能、功效或者速率。

f)“弱”基因，包括在本文描述的在一种细胞途径中具有特别感兴趣功能的靶基因，而当其被独自沉默时导致弱表型效果。在本发明的RNA构建体中，可以组合靶向单一或者不同弱基因的多个dsRNA区以获得更强的RNAi效果。

g)“昆虫和/或蜘蛛类动物特异性”基因，包括如通过生物信息学同源性检索(例如BLAST检索)所测定的，在非有害生物体中没有实质同源对应物的基因和基因部分。对昆虫和/或蜘蛛类动物特异性靶基因或其部分的选择导致物种特异性的RNAi效果，而在非靶生物体中没有作用或者没有实质性(不利)作用。

h)“保守基因”，包括在靶生物体和一种或多种非靶生物体之间保守(在氨基酸水平上)的基因。为降低对非靶物种的可能影响，分析这样的有效但保守的基因，并选择来自这些保守基因可变区的靶序列以用做RNA构建体中dsRNA区的靶标。在此，在核酸序列水平上评价保守性。因此，这样的可变区，包括保守靶基因在核酸序列水平上最不保守的部分。

i)“保守途径”基因，包括参与相同生物学途径或者细胞过程的基因，或者包括在不同的昆虫和/或蜘蛛类动物物种中具有相同功能性的基因，由此而导致特异的和有力的RNAi作用和更有效的害虫防治；

j)或者，本发明的RNA构建体靶向来自不同生物途径的多种基因，由此而导致广泛的细胞RNAi效果和更有效的昆虫和/或蜘蛛类动物的防治。

优选地，所有双链RNA区包含至少一条与以下任一核苷酸序列一部分相互补的链：SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200。然而，如果一个双链RNA区包括至少一条与以下任一核苷酸序列一部分相互补的链：SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200，那么其它双链RNA区可以包括至少一条与来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种任意靶基因(包括已知的靶基因)一部分相互补的链。本发明还提供本文描述的任何RNA构建体，其还包含至少一个其它的功能性序列和任选的接头。在一个实施方案中，通过一个或多个接头连接多个dsRNA区。在另一实施方案中，接头存在于RNA构建体中的一个位点，该位点将dsRNA区与感兴趣的另一区分开。本发明提供对于dsRNA构建体的不同接头类型。

“条件性自切割接头”是能够在特定条件下被加工的RNA序列。适合的条件性自切割接头的一个实例是在低pH条件下自切割的RNA序列。Jayasena和Gold(Proc Natl Acad Sci USA.1997Sep 30；94(20)：10612-7)描述过这种RNA序列的合适实例，该文献通过参考并入本文。

适合的条件性自切割接头的另一实例是在高pH条件下自切割的RNA序列。Borda et al.(Nucleic Acids Res.2003May 15；31(10)：2595-600)描述过这种RNA序列的合适实例，该文献通过参考并入本文。该序列源于锤头核酶HH16的催化核心。

在本发明的一个方面中，在有害生物体中，可以应用接头分开较小的dsRNA区。有益的是，在该情形中，在特定的情况下接头序列可以促进长的dsRNA分成较小的dsRNA区，由此导致在这些情况下释放各个dsRNA区并通过这些较小的dsRNA区产生更有效的基因沉默。

在本发明的另一方面中，接头被定位于RNA构建体中的某一位点，其将dsRNA区与感兴趣的另一序列分开，其优选向RNA构建体提供一些其它功能。可以并入RNA构建体的(感兴趣的)其它功能性序列的非限制性实例有例如(i)促进大规模产生dsRNA构建体的其它序列；(ii)增加/降低dsRNA稳定性的其它序列；(iii)结合组合物中的蛋白质或者其它分子以促进被有害生物物种摄取的其它序列；(iv)作为适配子(aptamer)并结合有害生物物种消化道中受体或者分子以促进被所述有害生物物种摄取、内吞和/或转胞吞(transcytosis)的其它序列；(v)催化dsRNA区加工的其它序列。

根据一个具体实施方案，有害生物物种具有肠(gut)系统，比如例如昆虫和/或蜘蛛类动物，并且接头在昆虫和/或蜘蛛类动物的肠中是自切割的。肠中的pH可在极酸性到极碱性的范围内变化。

或者，接头在内体中是自切割的。这在本发明的构建体由有害生物生物体通过内吞或者转胞吞摄取，并由此在有害生物物种的内体中被区室化时可以是有益的。内体可具有低pH环境，由此导致接头切割。

当本发明dsRNA构建体被用于通过细胞壁中的转运蛋白从一个细胞转移至另一细胞时，例如当穿越昆虫和/或蜘蛛类有害生物体的细胞壁时，上述在疏水条件中自切割的接头尤其可用于这样的RNA构建体中。

内含子也可被用作接头。本文使用的“内含子”可以是信使RNA的任何非编码RNA序列。对于本发明构建体尤其适合的内含子序列(1)是富含U的(35-45％)；(2)具有平均100bp长度(在约50至500bp之间变化)，其碱基对可以是随机选择的或者可以基于已知的内含子序列；(3)5’端起点具有-AG:GT-或者-CG:GT-和/或(4)在它们的3’端具有-AG:GC-或者-AG:AA-。

约1个碱基对至约10,000个碱基对的非互补RNA序列也可被用作接头。

如上所述，本发明的dsRNA区可以只对应靶基因的一部分，只要其互补性能够实现RNAi，从而有效地防治昆虫和/或蜘蛛类动物即可。知道相关靶基因的全长序列对于本发明来说不是必需的，只要所用的包含dsRNA区的构建体能够下调靶基因即可。

例如，可以应用基于来自昆虫和/或蜘蛛类动物的部分基因序列(比如EST)的dsRNA片段，只要所述部分序列是SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71to 79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-47、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200所述序列之一的直系同源物即可。根据所用dsRNA片段的长度确定序列同源性或者互补性的程度。

此外，在本发明中还可以应用在一个或多个核苷酸位置上不同于(例如通过缺失、插入或者取代)包含SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中所述序列的核酸分子的dsRNA片段，只要所得的dsRNA片段仍能下调靶基因即可。

优选地，RNA构建体中的dsRNA片段与包含如SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列、或者来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的直系同源核苷酸序列的任一靶核酸分子的核苷酸序列之相应部分具有互补性，或者同源性水平为至少约70％核苷酸序列一致性，优选至少约80％序列一致性，甚至更优选至少约85％或者87.5％序列一致性，仍更优选约90％序列一致性，仍更优选至少约95％序列一致性，最优选至少约96％、97％、98％或者99％序列一致性。

确定序列一致性的方法在本领域中是常规方法，包括应用Blast软件和GAP分析(GCG程序)的方法。dsRNA的至少一条链与靶基因的高水平序列一致性(互补性)对于介导有效的RNAi以及由此的有害生物防治是必需的。

然而，相对于哺乳动物的直系同源物序列，本发明的dsRNA区选择性的针对有害生物靶序列是同样有益的。在必需防治有害生物的环境中，比如厨房，其是存放食物的地方并且在其中人和其它哺乳动物可以接触到被设计用来防治有害生物的组合物，这在本发明中是尤其有意义的。相对于化学试剂，选择性生物试剂是优选的，因为所述化学试剂对于有害生物物种和哺乳动物可能具有同样的毒性。

此外，对于生物学试剂比如本发明的RNA构建体来说，其优点包括所述分子将随着时间发生生物降解并且因此对人类使用者而言其比化学试剂(比如已知的杀虫剂)将具有更少环境和健康风险。

因此，根据一个优选的实施方案，RNA构建体中的双链RNA的至少一条链包含与SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示核酸分子的核苷酸序列一部分相互补的或者与来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的直系同源核苷酸序列一部分相互补的核苷酸序列，并且其与来自哺乳动物物种的相应(直系同源)核苷酸序列具有小于约5％、小于约10％、小于约12.5％、小于约15％、小于约20％、小于约30％、小于约40％的序列一致性。在一个实施方案中，在21个连续核苷酸上与哺乳动物序列没有序列一致性。在另一实施方案中，在24个连续核苷酸上与来自哺乳动物物种的相应核苷酸序列具有小于约10％或者小于约12.5％序列一致性。优选地，所述哺乳动物物种是人。

在一个实施方案中，RNA构建体中的双链RNA的至少一条链包含互补于SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示核酸分子的核苷酸序列或者来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种直系同源的核苷酸序列一部分的核苷酸序列，其包含任何下述核酸分子中至少17个核苷酸，优选至少18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、24个核苷酸、27个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、150个核苷酸、200个核苷酸、250个核苷酸、300个核苷酸、350个核苷酸、400个核苷酸、450个核苷酸、500个核苷酸、550个核苷酸、600个核苷酸、650个核苷酸、700个核苷酸、900个核苷酸、1000个核苷酸、1100个核苷酸、1200个核苷酸或者1300个核苷酸，所述核酸分子含有SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一所示的核苷酸序列或者其互补序列。

本发明还提供这样的RNA构建体，其还包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含任何下述核酸分子的至少约17个核苷酸、优选至少约18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸、25个核苷酸、27个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、150个核苷酸、200个核苷酸、250个核苷酸、300个核苷酸、350个核苷酸、400个核苷酸、450个核苷酸、500个核苷酸、550个核苷酸、600个核苷酸、650个核苷酸、700个核苷酸、900个核苷酸、1000个核苷酸、1100个核苷酸、1200个核苷酸或者约1300个核苷酸，所述核酸分子包含SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任意序列所示的核苷酸序列或者其互补序列。

DNA、表达构建体和宿主细胞

在另一方面中，本发明还提供DNA构建体，其包含本发明新靶标的核苷酸序列，代表性序列如SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200。

本发明还涉及DNA构建体，其包含编码本发明RNA构建体的区域。

再一方面中，本发明还提供表达构建体，其包括本发明的任意DNA构建体。

表达构建体是这样的，其能够在合适的条件下提供(通过转录)包含上面提及的dsRNA区的RNA构建体。

用于表达dsRNA的遗传构建体在本领域中是众所周知的：可参考例如在WO 99/32619；WO 00/01846和WO 01/88121(Devgen)；WO00/44914和WO 01/70949以及上面已提及的现有技术中描述的构建体。如在其中所提及的，这样的构建体可以是DNA或者RNA(并优选为DNA)并且可以是适合的表达载体(比如适于在细菌中转化和表达的表达载体)或者另外的表达系统的形式。例如，构建体可以存在于(例如通过转化)用于在细菌中生产或者用于转化昆虫和/或蜘蛛类动物的适合的细菌或者病毒系统中，并且含有遗传构建体的这些和其它宿主细胞构成本发明另一方面。

本发明的表达构建体除包含编码dsRNA片段自身的序列以外，通常还将包含合适的调节元件(比如启动子、终止子和增强子)和这些遗传构建体本身已知的其它元件；并且可以例如表达dsRNA区为两个分开的互补RNA链，它们杂交形成预期的dsRNA区，或者可以以包含两个互补链的单RNA形式表达dsRNA区，所述的两个互补链自我杂交形成“茎-环”或者“发夹”结构，该结构含有预期的dsRNA区。所有这样的构建体可以适合在本发明中应用，这并不作为对所用构建体类型的特别限制，只要所述构建体适于表达能在昆虫和/和蜘蛛类有害生物中介导有效RNAi的dsRNA即可。

还可以以本身已知的方式构建所述构建体自身，有关其的参考文献还可以参见上述的现有技术参考文献，以及标准手册比如Sambrook etal，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和F.Ausubel et al，eds.，“Current protocols in molecular biology”，Green Publishing and WileyInterscience，New York(1987)。

dsRNA区优选在细菌宿主中在组成型或者诱导型启动子(例如，通过特定化合物诱导的、通过对细菌的破坏等诱导的启动子)控制下表达。组成型和诱导型启动子可以是非特异性的或者特异性的(例如，针对细菌生命周期的特定部分)。

在细菌宿主细胞被用作生物杀虫剂之前，可能需要被灭活。这可以通过本领域已知的任何技术来实施，比如例如通过加热或者通过苯酚或者甲醛处理。或者，可以利用灭活病毒，比如经适当改良的杆状病毒，从而向昆虫和/或蜘蛛类有害生物递送本发明的dsRNA区。

所述表达构建体还可以包含对于核酸序列或者遗传构建体而言所有本身已知的其它元件，比如启动子或者其它控制元件、终止子、翻译或者转录增强子、整合因子、信号序列、选择标记等，优选适于在细菌细胞中应用。编码构建体的这些其它元件的序列还可以分离自合适的生物学来源，或者通过合成提供。

合适启动子的一些具体的但非限制性的实例包括但不限于来自RNA PolI、RNA PolII、RNA PolIII、T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶或者SP6RNA聚合酶的启动子，并且所述启动子和其它调节元件还参见上面引用的现有技术，比如例如WO 00/01846。本发明还提供能指导单链RNA表达的细菌启动子，所述单链RNA一经表达就可以形成含环的发夹二级结构并利用其双链RNA区。

用于将构建体引入细菌或者病毒宿主的转化技术的具体的但非限制的实例包括转化、电穿孔、转染等。

本发明由此提供表达构建体，其包含：(a)编码如本文所述RNA构建体的核酸；(b)能够驱动(a)所述核酸表达的一个或多个调控序列；和任选的(c)转录终止序列。

可以将表达构建体插入质粒或者载体，所述质粒或载体可以是市售的。根据本发明的一个实施方案，表达构建体是细菌表达载体，其适于转化入细菌并且适于在转化的细菌细胞中维持和表达本发明的RNA构建体。有关质粒和载体参见在本申请人的WO 01/01846中的有关描述，其以整体通过参考并入本文。可以应用能够感染昆虫物种的病毒细胞(比如在WO 01/34815中描述的病毒，其以整体通过参考并入本文)作为替代。

本文所用的术语“调控序列”应在广泛的范畴内理解，其是指能够驱动和/或调节与其连接和/或可操作性连接的序列表达的调节核酸序列。根据本发明的一个实施方案，调控序列在细菌或者病毒中是可操作的；优选地，所述调控序列是源于细菌序列。术语“调控序列”包括启动子或者能够活化或者增强核酸分子在细胞、组织或者器官中表达的序列。

任选地，在表达构建体中还可以掺入一个或多个转录终止序列。术语“转录终止序列”包括在转录单位末端的调控序列，其发出对初始转录物3’端进行加工和多聚腺苷酸化以及终止转录的信号。在表达构建体中可以掺入另外的调节元件，比如转录或者翻译增强子。

本发明的表达构建体还可以包含对于在特定细胞类型中维持和/或复制必需的复制起点。

一个实施例是，当表达构建体必须作为细胞中附加体遗传元件(例如，质粒或者粘粒分子)在细菌细胞中维持时。优选的复制起点包括但不限于f1起点和colE1起点。

表达构建体可以任选地包含选择标记基因。如本文使用的，术语“选择标记基因”包括任何基因，其赋予细胞一定表型，该表型在所述细胞中表达以促进对用本发明表达构建体转染或者转化的细胞的鉴定和/或选择。合适的选择标记的实例包括抗氨苄青霉素(Amp^r)、四环素(tetracydine)(Tc^r)、卡那霉素(Kan^r)、膦丝菌素(phosphinothricin)和氯霉素(CAT)的抗性基因。其它适合的标记基因提供代谢性状，例如manA。还可以应用可视标记基因以及包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。

因此，如上所述，本发明提供宿主细胞，其包含本发明的RNA构建体和/或DNA构建体和/或表达构建体。优选地，宿主细胞是细菌细胞，但可以是例如病毒。可以利用特异性感染昆虫和/或蜘蛛类动物的病毒(比如杆状病毒)。这确保对于哺乳动物，尤其是人的安全性，因为所述病毒将不会感染哺乳动物，因此不需要的RNAi作用将不会发生。

在可能与人或者其它哺乳动物接触的环境中(比如上述的厨房)使用时，在应用所述细菌细胞或者病毒作为递送剂用于介导昆虫有害生物中的RNAi之前，应优选是灭活的。通过许多手段可以实现灭活，比如例如通过加热处理、苯酚或者甲醛处理。

本发明还提供产生本发明RNA构建体的方法。该方法包括以下步骤：

在允许所述DNA构建体转录以产生所述RNA构建体的条件下

a.将本发明的DNA构建体或者本发明的表达构建体与无细胞组分接触；或者

b.向细胞施用本发明的DNA构建体或者本发明的表达构建体。

由此，本发明提供体外方法，其中提供用于转录的必需组分。这些组分对于本领域技术人员是非常熟悉的并且许多体外表达试剂盒可从市场上获得。

或者，可以在宿主细胞中驱动所述表达。优选地，所述细胞是细菌细胞，但可以是例如病毒。

此外，在本发明的另一方面，本发明的宿主细胞可以被用作产生本发明dsRNA分子和RNA构建体的来源。例如，可以在合适条件下(例如在37℃或这42℃)培养包含本发明表达构建体(如以上所述)的细菌宿主细胞，从而产生有效量的本发明RNA构建体。大规模的细菌发酵和收集方法在本领域中是众所周知的并且可以被商业化利用。在许多合适的介质中可以实施细菌培养，比如例如LB肉汤，任选地补充合适的抗生素，比如氨苄青霉素、羧苄青霉素或者氯霉素，其中利用抗生素抗性宿主菌株。

生成的细菌培养物由此大量产生本发明的RNA构建体。所述细菌自身可以被配制为如本文所述的合适杀虫组合物，或者可以被用作本发明RNA构建体的直接(食物)来源，用以被靶昆虫或者蜘蛛类动物摄取(例如摄食)。

相似地，在一个实施方案中，如上所述，通过使细菌破裂或者灭活细菌，所述细菌可以被用作dsRNA的来源。例如，可以应用任何合适的手段破裂或者裂解细胞，比如例如通过渗透压冲击(osmoticshock)，并且在本发明的组合物中利用细菌的裂解物或者其它合适的细胞组分或者提取物。

在一个实施方案中，可以适当地纯化细菌提取物或者裂解物以留下含有基本上纯的RNA构建体的提取物。优选地，从含最终dsRNA的提取物中去除基本所有的细菌组分，随后可以将所述最终dsRNA配制成本发明的任一组合物。适合的纯化步骤在本领域中是众所周知的并且可以包括，作为举例但非限制性的，适合的过滤步骤，例如根据电荷或者分子量的分离。还可以应用适合的杂交反应来纯化感兴趣的dsRNA分子。

通过标准技术可以将RNA构建体纯化至基本纯，所述标准技术包括选择性沉淀、柱色谱、免疫纯化方法及其它技术(见，例如，Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(1982)；Ausubel et al.，见上述；和Sambrook et al.，见上述)。

RNA和DNA构建体(包括双链RNA分子)将通常掺入天然碱基。然而，本发明的范围包括变体。因此，“RNA”和“DNA”的范围涵盖合成的类似物，包括公知的糖基修饰的碱基，其能够碱基配对和介导RNAi或者能够分别被转录从而以天然核酸类似物的形式产生RNA。例如，本发明涵盖掺入非天然的、经化学修饰的或者衍生的碱基的核酸类似物或者具有修饰主链的核酸类似物。这同样地适用于可以被掺入本发明构建体的接头。具体地，术语“双链RNA”或者“dsRNA”将被解释为涵盖了包含非天然碱基的dsRNA。包含非天然碱基或者具有化学修饰主链的双链RNA可以提供有关增加或者降低dsRNA构建体稳定性的额外优点。

杀虫组合物

仍在另一方面中，本发明涉及杀虫组合物，其包括本发明的RNA构建体和/或本发明的DNA构建体和/或本发明的表达构建体和/或本发明的宿主细胞以及合适的载体、赋形剂或者稀释剂。

根据一个最优选的实施方案，所述组合物为适合于昆虫和/或蜘蛛类动物摄食的形式。

所述组合物可以是适合向昆虫和/或蜘蛛类动物施用的任何物理形式。所述组合物可以是例如固体形式(比如粉末、颗粒或者诱饵)、液体形式(比如喷雾)或者凝胶形式。

所述组合物可以包含另外一些组分，其用来在长时间保存所述组合物的期间稳定dsRNA和/或控制dsRNA降解。

所述组合物还可包含另外一些组分，其增强或者促进肠(intestianl)细胞或者肠(gut)细胞对dsRNA的摄取。这些可以包括例如常规促进细胞摄入RNA的化学剂，例如lipofectamine等。

本发明预期，可以提供本发明的“组合物”作为“套装试剂盒”，其包括在一个容器中的双链RNA和在另外容器中的适用于含RNA的实体(比如RNA构建体、DNA构建体、表达构建体或者宿主细胞)的稀释剂或者载体。本发明还涉及提供单独的双链RNA，而没有其它任何组分。在这些实施方案中，可以以浓缩形式(比如浓缩水溶液)提供dsRNA。它甚至可以以冷冻形式或者冻干(freezed-dried)或者冻干(lyophilised)形式提供。对于长期保存来说，后者可更加稳定并且可以在应用之前即刻解冻和/或用适合的稀释剂重构。

在一个具体实施方案中，所述组合物可以是能够施用于基质从而保护所述基质免受昆虫和/或蜘蛛类动物感染的涂料、糊剂或者粉剂。在此实施方案中，可以应用所述组合物保护易受昆虫和/或蜘蛛类动物感染或者造成损害的任何基质或者物质，例如食物和其它易腐物质以及基质比如木材。对于此实施方案优选的靶昆虫和/或蜘蛛类动物物种包括但不限于本文较早前定义的本发明有害生物(见“靶生物体/物种”)，即居室昆虫和/或蜘蛛类动物、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫，比如作为举例但非限制的蝇、叶螨、蓟马、壁虱，家禽红螨、蚂蚁、蟑螂、白蚁、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣鱼、书虱、甲虫、蠼螋、蚊和跳蚤。最优选的靶物种是蟑螂，例如小蠊属蟑螂，包括德国蟑螂(德国小蠊)，大蠊属蟑螂，包括美洲蟑螂(美洲大蠊)和澳洲蟑螂(澳洲大蠊)，蜚蠊属蟑螂，包括东方蟑螂(东方蜚蠊)和蠊属蟑螂，包括褐带蟑螂(褐带蠊)。最优选的靶标是德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))。

在此实施方案中，所述组合物将包括含有至少一种双链RNA的实体(例如上述的RNA构建体)，其中双链RNA区包括退火的互补链，其至少一条链具有对应于待防治昆虫和/或蜘蛛类动物靶基因的靶核苷酸序列的核苷酸序列，以及适于预期应用的至少一种载体、稀释剂或者赋形剂。

赋形剂的特性和组合物的物质形式可根据预期处置基质的特性而改变。例如，所述组合物可以是刷或者喷于或者印于待处置物质或者基质的液体，或者施用于待处置物质或者基质的涂料或者粉剂。因此，在一个实施方案中，所述组合物是附着于适合表面上的涂料形式，并且最终由与所述涂料接触的昆虫和/或蜘蛛类动物所摄取。

在一个实施方案中，所述组合物是诱饵形式。设计用该诱饵引诱昆虫和/或蜘蛛类动物与所述组合物接触。一旦与其发生接触，所述组合物接着被昆虫和/或蜘蛛类动物通过例如摄食而内化并介导RNAi，由此杀伤昆虫和/或蜘蛛类动物。所述诱饵可以包含食物，比如基于蛋白质的食物，例如鱼饲料。还可以应用硼酸作为诱饵。所述的诱饵可以取决于靶向的物种。例如，德国小蠊将食用它们可获得的几乎任何食物。还可以应用引诱剂。引诱剂可以是信息素，比如例如雄性或者雌性信息素。作为实例，所述信息素参见“Insect Pheremones and their use in PestManagement”(Howse et al，Chapman and Hall，1998)，并且可在本发明中应用。所述引诱剂的作用在于引诱昆虫和/或蜘蛛类动物至诱饵，并且可以靶向于特定的昆虫和/或蜘蛛类动物或者可以吸引整个范围的昆虫。所述诱饵可以是任何合适的形式，比如固体、糊剂、颗粒或者粉剂形式。

还可以通过昆虫和/或蜘蛛类动物将诱饵运回群体。随后所述诱饵可以作为群体其它成员的食物来源，由此提供对大量昆虫和/或蜘蛛类动物以及潜在的对整个昆虫和/或蜘蛛类有害生物群体的有效防治。这是与应用本发明双链RNA有关的一个优点，因为RNAi介导效应对有害生物的延迟作用允许将诱饵运回群体，因此在使其接触到昆虫和/或蜘蛛类动物方面发挥最大作用。

此外，与昆虫和/或蜘蛛类动物接触的组合物可以保留在昆虫和/或蜘蛛类动物的表皮上。当昆虫和/或蜘蛛类动物自我清洁或者昆虫和/或蜘蛛类动物相互清洁时，所述组合物可以被摄取并且因此能够在昆虫和/或蜘蛛类动物中介导它们的效应。这要求所述组合物充分稳定，以使得dsRNA保持完整并能够介导RNAi，即使在它们被长时间(例如可以是几天的时间)暴露于外部环境条件时。

可以在适合的“室(housing)”或者“诱捕器”中提供所述诱饵。这样的室和诱捕器可从商业获得并且可以改造现有诱捕器以包含本发明的组合物。任何可吸引昆虫和/或蜘蛛类动物进入的室或诱捕器包括在本发明的范围内。室或诱捕器可以是例如盒形，并且可以在预成形条件下提供或者可形成例如可折叠的纸板。适合用于室或诱捕器的材料包括塑料和纸板，尤其是波纹状的纸板。对于所述室或诱捕器而言适合的尺度为例如7-15cm宽，15-20cm长和1-5cm高。诱捕器的内表面可以排布有粘性物质，从而一旦昆虫和/或蜘蛛类动物进入诱捕器内就限制其移动。室或诱捕器可以包含适合的内槽，其能够将诱饵保持在适当的位置。诱捕器与室是有区别的，因为昆虫进入后不能容易地离开诱捕器，而室担当“饲喂站”，其提供给昆虫和/或蜘蛛类动物一个较佳的环境，在其中它们能够进食并且感觉免受捕食者之患。

因此，在本发明的另一方面中提供针对昆虫和/或蜘蛛类动物的包含本发明组合物的室或诱捕器，其可以并入本文所述组合物的任何特性。

在另一可替代实施方案中，可以以喷雾剂形式提供所述组合物。因此，人使用者可以用所述组合物直接向有害生物喷洒。随后所述组合物被昆虫和/或蜘蛛类动物内化，并于此它可以介导RNA干扰，由此防治昆虫和/或蜘蛛类动物。所述喷雾剂优选是加压的/气溶胶化的喷雾剂或者泵式喷雾剂。颗粒可以为合适的大小，以使得它们附着于昆虫和/或蜘蛛类动物，例如附着于昆虫和/或蜘蛛类动物的外骨骼，并且可以于此被吸收。可以应用已知工具测量颗粒大小，比如应用激光粒度仪(Mastersizer)，其是可从商业获得的装置。

仍在另一实施方案中，所述载体是带静电的粉末或者颗粒，其附着于昆虫和/或蜘蛛类动物的表皮。能附着于昆虫和/或蜘蛛类动物并由此递送本发明RNA构建体的适合的粉末和颗粒在WO 94/00980和WO97/33472中有详细的描述，这两篇文献通过参考并入本文。

或者，所述载体可以包括附着于昆虫表皮的磁性颗粒。能附着于昆虫和/或蜘蛛类动物并由此递送本发明RNA构建体的适合的磁性颗粒在WO 00/01236中有详细描述，其通过参考并入本文。

仍在另一优选实施方案中，所述的组合物的载体包括金属颗粒，其初始时是未磁化的，但是当其被置于由昆虫和/或蜘蛛类动物体提供的电场中时，其能变成磁极化。该作用方式在WO 2004/049807中有详细描述并且其通过参考并入本文。

这些与昆虫和/或蜘蛛类动物接触的组合物可保留在昆虫和或蜘蛛类动物的表皮上。当昆虫和/或蜘蛛类动物个体自身清洁或者昆虫和/或蜘蛛类动物互相清洁时，所述组合物可以被摄入并能因此介导它们在昆虫和/或蜘蛛类动物中的效应。这要求所述组合物充分稳定，以使得dsRNA保持完整并能够介导RNAi，即使在它们被长时间(例如可以是几天的时间)暴露于外部环境条件时。

优选地，所述组合物掺入载体，该载体增加昆虫和/或蜘蛛类有害生物(见上述“靶生物体/物种”)对双链RNA的摄入，所述有害生物优选昆虫和/或蜘蛛类动物并优选蟑螂物种。这样的载体可以是基于脂质的载体，优选包括水包油乳剂、胶束、胆固醇、脂多胺和脂质体的一种或多种。其它促进本发明构建体摄入的试剂对本领域技术人员是熟知的并且包括聚阳离子、葡聚糖和(tris)阳离子脂质，比如CS096、CS102等。可从商业获得的脂质体包括

和等。在WO 03/004644的“Transfection promoting agent”标题下列举了许多合适的载体并且所提供的各个实例通过参考并入本文。

在另一优选实施方案中，所述载体是核酸凝聚剂。优选地，核酸凝聚剂包括亚精胺或者硫酸鱼精蛋白或者其衍生物。

本发明的组合物可以与另外的活性成分组合在一起，包括另外的杀虫剂。因此，可以提供本发明的“组合物”作为“套装试剂盒”，其包括在一个容器中的含有双链RNA的组合物和在另外容器中的一种或多种合适的杀虫剂，其可以是化学杀虫剂或者生物杀虫剂。或者，可以提供所述组合物作为混合物，其是稳定的并且相互之间将联合应用。

可以以补充方式与本发明双链RNA分子一起作用的合适的活性成分包括但不限于以下各项：毒死蜱(Chlorpyrifos)、丙烯菊酯(Allethrin)、苄呋菊酯(Resmethrin)、四溴乙基(Tetrabromoethyl)、二羟甲基-环丙烷羧酸(Dimethol-cyclopropane carboxylic acid)(其通常包含在液体组合物中)；和氟蚁腙(Hydramethylnon)、齐螨素(Avermectin)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氟虫胺(Sulfuramid)、烯虫炔酯(Hydroprene)、氟虫腈(Fipronil)(GABA受体)、异丙基苯基氨基甲酸甲酯(Isopropylphenyl methyl carbamate)、茚虫威(Indoxacarb)(PARA)、多氟脲(Noviflumuron)(几丁质合成抑制剂)、炔咪菊酯(Imiprothrin)(PARA)、阿维菌素(Abamectin)(谷氨酸门控氯离子通道)、吡虫啉(Imidacloprid)(乙酰胆碱受体)(其通常包含在诱饵组合物中)。

在一个优选实施方案中，就健康和环境的考虑而言，已知所述活性成分是优选的杀昆虫剂和/或杀蜘蛛剂，比如例如氟蚁腙和齐螨素。

根据另一实施方案，dsRNA在适合的宿主细胞(比如细菌细胞或者真菌细胞)中进行表达并且所述细胞被有害生物物种所摄取或者摄食。根据另一实施方案，从细胞中分离或者纯化dsRNA，所述细胞优选表达dsRNA的细菌或者真菌细胞，并且提供所述dsRNA作为针对有害生物物种的杀虫剂或者杀虫制剂。可以将宿主细胞(比如细菌和真菌宿主细胞)工程化以产生任何本发明的dsRNA或者RNA构建体。这些宿主细胞(优选细菌细胞)可以被有害生物物种摄食或者以其它方式内化。当dsRNA被摄取时，dsRNA可以启动RNAi反应，导致靶mRNA降解并弱化或者杀伤有害生物。

因此，在一个更具体的实施方案中，由原核(比如细菌)或者真核(比如酵母)宿主细胞或者宿主生物表达所述双链RNA或者RNA构建体。可以在任何合适的制剂中提供这些细胞或者生物以促进昆虫和/或蜘蛛类动物的摄取。

本发明的用途和方法

仍在另一方面中，本发明涉及本发明RNA构建体和/或本发明DNA构建体和/或本发明表达构建体和/或本发明组合物和/或本发明的室或诱捕器通过RNA干扰用于防治昆虫和/或蜘蛛类动物的用途。可以将该用途应用于许多处于任何发育阶段的昆虫和/或蜘蛛类动物，其具有针对本文鉴定的新靶标的直系同源靶基因，所述昆虫和/或蜘蛛类动物包括居室昆虫和/或蜘蛛类动物、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物比如，作为举例但非限制的蝇、叶螨、蓟马、壁虱，家禽红螨、蚂蚁、蟑螂、白蚁、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣鱼、书虱、甲虫、蠼螋、蚊和跳蚤。最优选的靶物种是蟑螂，例如小蠊属蟑螂，包括德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))，大蠊属蟑螂，包括美洲蟑螂(美洲大蠊(Periplaneta americana))和澳洲蟑螂(澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae))，蜚蠊属(Blatta)蟑螂，包括东方蟑螂(东方蜚蠊(Blatta orientalis))和蠊属(Supella)蟑螂，包括褐带蟑螂(褐带蠊(Supella longipalpa))。最优选的靶标是德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))。

优选地，通过RNAi对抗有害生物，并从而杀伤、麻痹有害生物、延迟其生长、抑制其摄食和/或阻止其繁殖。

在一个补充方面中，本发明还提供防治昆虫和/或蜘蛛类动物(有害生物)的方法，其包括向昆虫和/或蜘蛛类动物施用包含如上定义dsRNA区的RNA构建体和/或本发明的DNA构建体和/或如上定义的表达构建体和/或如上定义的宿主细胞和/或如上定义的组合物和/或如上定义的室或诱捕器，其中所述双链RNA能通过RNA干扰来下调至少一种昆虫基因的表达。

所述施用可以包括例如给昆虫和/或蜘蛛类动物喂食所述dsRNA(其以如上描述和定义的各种形式呈现)或者可以包括让昆虫和/或蜘蛛类动物与所述dsRNA接触。适合直接接触的手段包括如上定义和描述的有关本发明组合物的诱饵、粘性带、磁性和带电粉末以及颗粒、喷雾、凝胶、软膏、表面处理等。在本发明范围内包括任何施用手段，如果它导致有效的针对靶基因表达的双链RNA介导的干扰并由此防治昆虫和/或蜘蛛类动物即可。

提供含有针对多靶标的多个双链RNA区的构建体是有益的，因为这增加了昆虫和/或蜘蛛类动物防治的功效并且还降低了昆虫和/或蜘蛛类动物获得抗性的可能性。

因此，在所述方法的一个实施方案中，向有害生物提供/施用多种如上定义的RNA构建体和/或如上定义的DNA构建体和/或如上定义的表达构建体和/或如上定义的宿主细胞和/或如上定义的组合物和/或如上定义的室或诱捕器，从而介导多个不同的RNAi事件。

可以同时靶向多种靶标的全部，或者可以依次进行靶向。因此，在一个实施方案中，依次提供/施用所述的多种RNA构建体和/或DNA构建体和/或表达构建体和/或宿主细胞和/或组合物和/或室或诱捕器，从而降低昆虫和/或蜘蛛类动物获得抗性的可能性。

可以将本发明的方法应用于处于任何发育阶段的许多昆虫和/或蜘蛛类动物，其具有针对本文鉴定的新靶标的直系同源靶基因。靶昆虫包括居室昆虫和/或蜘蛛类动物、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物比如，作为举例的但非限制的蝇、叶螨、蓟马、壁虱，家禽红螨、蚂蚁、蟑螂、白蚁、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣鱼、书虱、甲虫、蠼螋、蚊和跳蚤。最优选的靶物种是蟑螂，例如小蠊属蟑螂，包括德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))，大蠊属蟑螂，包括美洲蟑螂(美洲大蠊(Periplaneta americana))和澳洲蟑螂(澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae))，蜚蠊属(Blatta)蟑螂，包括东方蟑螂(东方蜚蠊(Blatta orientalis))和蠊属(Supella)蟑螂，包括褐带蟑螂(褐带蠊(Supella longipalpa))。最优选的靶标是德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))。

优选地，通过RNAi对抗昆虫和/或蜘蛛类有害生物，并从而杀伤、麻痹有害生物、延迟其生长、抑制其摄食和/或阻止其繁殖。

在一个实施方案中，所述宿主细胞可以是细菌细胞，其已被改造以产生本发明的RNA构建体。

仍在另一方面中，本发明提供防治蟑螂有害生物的方法，其包括向蟑螂提供/施用RNA构建体，其包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与编码蟑螂核糖体蛋白质的核苷酸序列一部分互补的核苷酸序列。蟑螂核糖体蛋白质代表RNAi的一种新靶标，其可介导对蟑螂侵染的有效防治。

优选地，所述的至少一种双链RNA区的至少一条链包含以下任意核酸分子的至少约17、18、19、20、21个核苷酸，优选至少约23个核苷酸、24个核苷酸、27个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、150个核苷酸、200个核苷酸、250个核苷酸、300个核苷酸、350个核苷酸、400个核苷酸、450个核苷酸、500个核苷酸、550个核苷酸、600个核苷酸、650个核苷酸、700个核苷酸、900个核苷酸、1000个核苷酸、1100个核苷酸、1200个核苷酸或者约1300个核苷酸，所述核酸分子包含如SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181任意序列所示的核苷酸序列或者其互补序列。

甚至在另一方面中，本发明提供防治蟑螂有害生物的方法，其包括向蟑螂提供/施用RNA构建体，其包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与编码原肌球蛋白、HMG辅酶A合成酶基因或者肌动蛋白5C基因的核苷酸序列一部分互补的核苷酸序列。蟑螂原肌球蛋白、HMG辅酶A合成酶和肌动蛋白5C蛋白质代表RNAi的新靶标，其可以介导对蟑螂侵染的有效防治。

优选地，所述的至少一种双链区的至少一条链包含以下任意核酸分子的至少约17个核苷酸，优选至少约18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸、27个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、150个核苷酸、200个核苷酸、250个核苷酸、300个核苷酸、350个核苷酸、400个核苷酸、450个核苷酸、500个核苷酸、550个核苷酸、600个核苷酸、650个核苷酸、700个核苷酸、900个核苷酸、1000个核苷酸、1100个核苷酸、1200个核苷酸或者约1300个核苷酸，所述核酸分子包含如SEQ ID NO 41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200任意序列所示的核苷酸序列或者其互补序列。

可以将本发明的方法应用于处于任何发育阶段的许多昆虫和/或蜘蛛类动物，其具有本文鉴定的新靶标的直系同源靶基因。靶昆虫包括居室昆虫、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物比如作为举例但非限制的蝇、叶螨、蓟马、壁虱，家禽红螨、蚂蚁、蟑螂、白蚁、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣鱼，书虱、甲虫、蠼螋、蚊和跳蚤。更优选的靶物种是蟑螂(蜚蠊目(Blattodea))比如但不限于小蠊属(Blatellaspp.)(例如德国小蠊(德国蟑螂))、大蠊属(Periplaneta spp.)(例如美洲大蠊(美洲蟑螂)和澳洲大蠊(澳洲蟑螂))、蜚蠊属(Blatta spp.)(例如东方蜚蠊(东方蟑螂))和蠊属(Supella spp.)(例如褐带蠊(褐带蟑螂))；蚂蚁(蚁总科(Formicoidea))，比如但不限于火蚁属(Solenopsis spp.)(例如入侵红火蚁(Solenopsis invicta)(红火蚁))、小家蚁属(Monomorium spp.)(例如法老小家蚁(Monomoriumpharaonis)(法老蚁(Pharaoh Ant))、弓背蚁属(Camponotus spp.)(例如弓背蚁属(Camponotus spp)(木匠蚁(Carpenter Ants))、毛蚁属(lasius spp.)(例如黑毛蚁(lasius niger)(小黑蚁(Small Black Ant)))、铺道蚁属(Tetramorium spp.)(例如铺道蚁(Tetramorium caespitum)(铺道蚁(Pavement Ant)))、红蚁属(Myrmica spp.)(例如小红蚁(Myrmica rubra)(红蚁(Red Ant)))、蚁属(Formica spp.)(木蚁(woodants))、举腹蚁属(Crematogaster spp.)(例如Crematogaster lineolata(Acrobat Ant))、虹臭蚁属(Iridomyrmex spp.)(例如伊蚁(Iridomyrmexhumilis)(阿根廷蚁(Argentine Ant)))、大头蚁属(Pheidole spp.)(大头蚁(Big Headed Ants))和Dasymutilla spp.(例如Dasymutillaoccidentalis(Velvet Ant))；白蚁类(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白蚁科(Termitidae))比如但不限于暗白蚁属(Amitermes spp.)(例如佛罗里达暗白蚁(Amitermes floridensis)(佛罗里达暗翅土白蚁(Florida dark-winged subterranean termite)))、散白蚁属(Reticulitermes spp.)(例如黄肢散白蚁(Reticulitermes flavipes)(东方散白蚁(the eastern subterranean termite))、Reticulitermes hesperus(西方散白蚁(Western Subterranean Termite)))、乳白蚁属(Coptotermes spp.)(例如乳白蚁(Coptotermes formosanus)(台湾乳白蚁(Formosan Subterranean Termite)))、楹白蚁属(Incisitermes spp.)(例如小楹白蚁(Incisitermes minor)(西方干木白蚁(Western DrywoodTermite)))和新白蚁属(Neotermes spp.)(例如Neotermes connexus(森林白蚁(Forest Tree Termite)))，蟑螂，例如小蠊属蟑螂，包括德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))，大蠊属蟑螂，包括美洲蟑螂(美洲大蠊(Periplaneta americana))和澳洲蟑螂(澳洲大蠊(Periplanetaaustraliasiae))，蜚蠊属(Blatta)蟑螂，包括东方蟑螂(东方蜚蠊(Blattaorientalis))和蠊属(Supella)蟑螂，包括褐带蟑螂(褐带蠊(Supellalongipalpa))。更优选的靶标是蟑螂。最优选的靶标是德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))。

优选地，通过RNAi对抗昆虫和/或蜘蛛类有害生物，并从而杀伤、麻痹有害生物、延迟其生长、抑制其摄食和/或阻止其繁殖。

本发明的试剂盒

本发明还提供在本发明方法中使用的试剂盒。这些试剂盒可以掺入本发明的RNA构建体和/或DNA构建体和/或表达构建体和/或宿主细胞和/或组合物和/或室或诱捕器，它们都递送dsRNA区从而实现针对特异性靶基因的RNAi。

优选地，所述试剂盒还将包括应用试剂盒组件的使用说明。在本发明试剂盒中提供的或者由本发明试剂盒组分产生的双链RNA能够通过RNA干扰下调至少一种昆虫(有害生物)基因的表达。

优选地，为了提供更有效的有害生物防治(如以上所述)，所述试剂盒包含多种组分，其每个组分介导针对不同靶基因或者昆虫和/或蜘蛛类动物物种的RNAi。因此，所述试剂盒可以包括多种RNA构建体和/或DNA构建体和/或表达构建体和/或组合物，其中每个双链RNA能够通过RNA干扰下调至少一种昆虫和/或蜘蛛类动物(有害生物)基因的表达。

优选地，依次施用试剂盒的组分以介导有效的有害生物防治。然而，如果需要最大效应的话，可以同时施用一些或者所有的组分。

所述试剂盒可以额外包含已知的杀虫剂，其可以与组成本发明一部分的组分一起或者分开地提供。

可以以补充方式与本发明双链RNA分子一起作用的合适的活性成分包括但不限于以下各项：毒死蜱(Chlorpyrifos)、丙烯菊酯(Allethrin)、苄呋菊酯(Resmethrin)、四溴乙基(Tetrabromoethyl)、二羟甲基-环丙烷羧酸(Dimethol-cyclopropane carboxylic acid)(其通常包含在液体组合物中)；和氟蚁腙(Hydramethylnon)、齐螨素(Avermectin)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氟虫胺(Sulfuramid)、烯虫炔酯(Hydroprene)、氟虫腈(Fipronil)(GABA受体)、异丙基苯基氨基甲酸甲酯(Isopropylphenyl methyl carbamate)、茚虫威(Indoxacarb)(PARA)、多氟脲(Noviflumuron)(几丁质合成抑制剂)、炔咪菊酯(Imiprothrin)(PARA)、阿维菌素(Abamectin)(谷氨酸门控氯离子通道)、吡虫啉(Imidacloprid)(乙酰胆碱受体)(其通常包含在诱饵组合物中)。

在一个优选实施方案中，已知活性成分是就健康和环境考虑而言“优选的”杀昆虫剂和/或杀蜘蛛剂，比如例如氟蚁腙和齐螨素。

因此，本发明的试剂盒还可以同时定向针对多个物种，从而提供对更广范围有害生物防治的选择。多种双链RNA分子可以被包含在试剂盒中(作为适合的构建体的一部分等)以介导多靶标的RNAi，所述靶标包括例如相同靶标的种间直系同源物。

所述试剂盒可以包括适合的缓冲液和包装等以确保其中组分的稳定性和保存。

本发明的技术优点

相对于常规化学杀虫剂的应用，本发明有许多显著的优点。

(1)介导RNAi的dsRNA必须以高度的核苷酸序列一致性与靶标匹配，从而有效地下调表达并由此防治有害生物。因此，通过设计双链RNA分子可以实现特异性，其中一条链与靶序列具有高同源性，但是该链针对哺乳动物物种(比如人)的直系同源序列只具有低同源性。这种特异性要高于常规化学杀虫剂所能达到的特异性。

(2)已鉴定了一组新的靶标，其能够在有害生物防治中应用。因为先前这些靶标没有被鉴定过，所以在有害生物物种中应不会获得抗性。

(3)与已知的化学合成杀虫剂(例如DMSO等)相比，在RNAi中应用的针对所述新靶标的双链RNA是生物可降解产物。所述构建体的生物可降解特性使得它们更加无害于环境。

(4)RNAi不是一定立即提供有关杀伤有害生物的效应，其所提供的有效介导的效应需要时间让双链RNA与它的靶标结合。RNAi效应可以导致在稍后时间杀伤有害生物并且不直接依赖于接触，比如多氟脲(Noviflumuron)(其是一种几丁质合成抑制剂，来自DowAgroSciences)。因此，应用RNAi可以允许更容易地防治有害生物(比如昆虫和/或蜘蛛类动物)的大规模侵染，因为几乎不会发生在有害生物中传播的冲击效应(shock effect)，这种效应是在当它们在杀昆虫剂和/或杀蜘蛛剂附近可能遭遇到大量死的有害生物时发生的。

(5)同时应用多种靶标可以提供对有害生物群体更有效的防治并且降低获得抗性的可能性。所述靶标可以是大量有害生物物种共有的，从而提供广泛的处置。

(6)与常规杀虫剂相反，由于本发明的DNA和RNA构建体、组合物和宿主细胞较为安全的特性，所以在为了处置相关区域时，并不需要专业的协助。

(7)对人活性的最小破坏是必需的，因为对含双链RNA区的构建体的设计使得它们对靶有害生物群体以外的基因表达没有副作用或者只有轻微的影响。

根据以下实验部分将对本发明有更进一步的了解。

图表说明

表1：新鉴定的昆虫靶基因的实例。根据FlyBase直系同源物确定基因功能。

表2：与德国小蠊(Blatella germanica)靶序列互补的dsRNA片段。

表3：dsRNA处置对成功蜕皮至成虫期的蟑螂数量的影响，以活昆虫的百分率表示(平均值±标准误差，n＝4)。

表4：靶基因的选择序列＊。所述序列＊的至少17bp片段存在于昆虫物种的特定直系同源序列中(由GI值表示)。

表5：靶基因的选择序列＊。所述序列＊的至少17bp片段存在于蜘蛛类动物物种的特定直系同源序列中(由GI值表示)。

图1：德国小蠊(B.germanica)对于人工颗粒食物的死亡率。颗粒中dsRNA的浓度为1％w/w。吡虫啉(imidacloprid)的浓度为1％w/w。

图2：德国小蠊(B.germanica)对于人工颗粒食物的死亡率。颗粒中dsRNA(Bg001，具有如SEQ ID NO 9所示的序列，和Bg001多联体2，具有如SEQ ID NO 68所示的序列)的浓度为1％w/w。在此实验中，检验氟铃脲(hexaflumuron)(1％w/w)作为阳性对照和溶剂作为阴性对照。

图3：在室温下和八个月期间，Bg032dsRNA在LB培养基(LB)和无核糖核酸酶水(MQ)中的稳定性。

图4：在一周内向一龄若虫施用dsRNA(Bg001)对蟑螂死亡率的影响。在此实验中，检验各种dsRNA和溶剂作为阴性对照。dsRNA在颗粒中的浓度为1％w/w。

图5：本发明的序列

表1

表2

表3

实施例

实施例1：通过家族PCR克隆德国小蠊(Blattella germanica)的Bg001、Bg003、Bg004和Bg005的部分序列

按照使用说明应用TRIzol Reagent(目录号15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从德国小蠊(Blattellagermanica)(来源：Central Science Laboratory，York)分离高质量、完整的RNA。按照使用说明通过Dnase处理去除RNA制备物中存在的基因组DNA。按照使用说明应用可商业获得的试剂盒(SuperScript^TMIII反转录酶，目录号18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)生成cDNA。

为分离包含一部分Bg001、Bg003、Bg004和Bg005基因的cDNA序列，按照使用说明应用Amplitaq Gold(目录号N8080240；AppliedBiosystems)来实施应用简并引物的一系列PCR反应。

对于Bg001，在两个独立PCR反应中依照以下条件应用简并引物oGBKA002和oGBKA020(分别如本文SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示)：95℃10分钟，接着为95℃30秒、57℃1分钟和72℃1分钟的40个循环，接着为72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物，纯化(QIAquick Gel Extraction Kit；目录号28706，Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO载体(目录号K4575-40，Invitrogen)并测序。对两种PCR产物进行测序产生的共有序列如本文SEQ ID NO 1所示并且被称为Bg001基因的部分序列。相应的部分氨基酸序列如本文SEQ ID NO 2所示。

对于Bg003，在两个独立PCR反应中依照以下条件应用简并引物oGBKC001和oGBKC010(分别如本文SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14所示)：95℃10分钟，接着为95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的40个循环，接着为72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物，纯化(QIAquick Gel Extraction Kit；目录号28706，Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO载体(目录号K4575-40，Invitrogen)并测序。对两种PCR产物进行测序产生的共有序列如本文SEQ ID NO 11所示并且被称为Bg003基因的部分序列。相应的部分氨基酸序列如本文SEQ ID NO 12所示。

对于Bg004，在两个独立PCR反应中依照以下条件应用简并引物oGBKD001和oGBKD006(分别如本文SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24所示)：95℃10分钟，接着为95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分钟的40个循环，接着为72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物，纯化(QIAquick Gel Extraction Kit；目录号28706，Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO载体(目录号K4575-40，Invitrogen)并测序。对两种PCR产物进行测序产生的共有序列如本文SEQ ID NO 21所示并且被称为Bg004基因的部分序列。相应的部分氨基酸序列如本文SEQ ID NO 22所示。

对于Bg005，在两个独立PCR反应中依照以下条件应用简并引物oGBKE002和oGBKE009(分别如本文SEQ ID NO 33和SEQ ID NO 34所示)：95℃10分钟，接着为95℃30秒、52℃1分钟和72℃1分钟的40个循环，接着为72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物，纯化(QIAquick Gel Extraction Kit；目录号28706，Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO载体(目录号K4575-40，Invitrogen)并测序。对两种PCR产物进行测序产生的共有序列如本文SEQ ID NO 31所示并且被称为Bg005基因的部分序列。相应的部分氨基酸序列如本文SEQ ID NO 32所示。

实施例2：通过EST序列克隆德国小蠊(Blattella germanica)的Bg031、Bg032和Bg033基因的部分序列

按照使用说明应用TRIzol Reagent(目录号15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从德国小蠊(Blattellagermanica)(来源：Central Science Laboratory，York)分离高质量、完整的RNA。按照使用说明通过DNAse处理去除RNA制备物中存在的基因组DNA。按照使用说明应用可商业获得的试剂盒(SuperScript^TMIII反转录酶，目录号18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)生成cDNA。

为鉴定来自Bg031、Bg032和Bg033基因的部分cDNA序列，在公用数据库Genbank中，针对每个基因确定一个EST，登记号分别为源于公用数据库Genbank的AF260897、X73679和AY004248。

为分离包含一部分Bg031、Bg032和Bg033基因的cDNA序列，按照使用说明应用Perfectshot^TM ExTaq(目录号RR005A，TAKARABIO INC.)来实施应用基于EST的特异性引物的一系列PCR反应。

对于Bg031，在两个独立PCR反应中依照以下条件应用特异性引物oGBLA001和oGBLA002(分别如本文SEQ ID NO 43和SEQ ID NO44所示)：95℃10分钟，接着为95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的40个循环，接着为72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物，纯化(QIAquick Gel Extraction Kit；目录号28706，Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO载体(目录号K4575-40，Invitrogen)并测序。对两种PCR产物进行测序产生的共有序列如本文SEQ ID NO 41所示并且被称为Bg031基因的部分序列。相应的部分氨基酸序列如本文SEQ ID NO42所示。

对于Bg032，在两个独立PCR反应中依照以下条件应用特异性引物oGBLB003和oGBLB004(分别如本文SEQ ID NO 51和SEQ ID NO52所示)：95℃10分钟，接着为95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的40个循环，接着为72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物，纯化(QIAquick Gel Extraction Kit；目录号28706，Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO载体(目录号K4575-40，Invitrogen)并测序。对两种PCR产物进行测序产生的共有序列如本文SEQ ID NO 49所示并且被称为Bg032基因的部分序列。相应的部分氨基酸序列如本文SEQ ID NO50所示。

对于Bg033，在两个独立PCR反应中依照以下条件应用特异性引物oGBLC001和oGBLC004(分别如本文SEQ ID NO 59和SEQ ID NO60所示)：95℃10分钟，接着为95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的40个循环，接着为72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物，纯化(QIAquick Gel Extraction Kit；目录号28706，Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO载体(目录号K4575-40，Invitrogen)并测序。对两种PCR产物进行测序产生的共有序列如本文SEQ ID NO 57所示并且被称为Bg033基因的部分序列。相应的部分氨基酸序列如本文SEQ ID NO58所示。

实施例3：德国小蠊(Blattella germanica)的Bg001、Bg003、Bg004、Bg005、Bg031、Bg032和Bg033基因的dsRNA产物

应用可商业获得的试剂盒T7RiboMAX^TMExpress RNAi System(目录号P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。首先在两个独立的PCR反应中生成两种分开的单一5’T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含关于T7启动子的不同方向的靶序列。

对于Bg001，在PCR反应中依照以下条件应用特异性T7FW引物oGBLD001和特异性RV引物oGBLD010(分别如本文SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示)生成正义T7模板：95℃4分钟，接着为95℃30秒、51℃30秒和72℃1分钟的35个循环，接着为72℃10分钟。在PCR反应中依照上述的相同条件应用特异性FW引物oGBLD009和特异性T7RV引物oGBLD002(分别如本文SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8所示)生成反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物并通过NaClO₄沉淀进行纯化。按照使用说明，混合生成的T7FW和RV模板以进行转录，并且将生成的RNA链进行退火，Dnase和Rnase处理以及通过醋酸钠纯化。所得dsRNA的正义链如本文SEQ ID NO 9所示。

对于Bg003，在PCR反应中依照以下条件应用特异性T7FW引物oGBLD003和特异性RV引物oGBLD012(分别如本文SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16所示)生成正义T7模板：95℃4分钟，接着为95℃30秒、51℃30秒和72℃1分钟的35个循环，接着为72℃10分钟。在PCR反应中依照上述的相同条件应用特异性FW引物oGBLD011和特异性T7RV引物oGBLD004(分别如本文SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 18所示)生成反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物并通过NaClO₄沉淀进行纯化。按照使用说明，混合生成的T7FW和RV模板以进行转录，并且将生成的RNA链进行退火，Dnase和Rnase处理以及通过醋酸钠纯化。所得dsRNA的正义链如本文SEQ ID NO 19所示。

对于Bg004，在PCR反应中依照以下条件应用特异性T7FW引物oGBLD005和特异性RV引物oGBLD014(分别如本文SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26所示)生成正义T7模板：95℃4分钟，接着为95℃30秒、51℃30秒和72℃1分钟的35个循环，接着为72℃10分钟。在PCR反应中依照上述的相同条件应用特异性FW引物oGBLD013和特异性T7RV引物oGBLD006(分别如本文SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28所示)生成反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物并通过NaClO₄沉淀来纯化。按照使用说明，混合生成的T7FW和RV模板以进行转录，并且将生成的RNA链进行退火，Dnase和Rnase处理以及通过醋酸钠纯化。所得dsRNA的正义链如本文SEQ ID NO 29所示。

对于Bg005，在PCR反应中依照以下条件应用特异性T7FW引物oGBLD007和特异性RV引物oGBLD016(分别如本文SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36所示)生成正义T7模板：95℃4分钟，接着为95℃30秒、51℃30秒和72℃1分钟的35个循环，接着为72℃10分钟。在PCR反应中依照上述的相同条件应用特异性FW引物oGBLD015和特异性T7RV引物oGBLD008(分别如本文SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所示)生成反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物并通过NaClO₄沉淀来纯化。按照使用说明，混合生成的T7FW和RV模板以进行转录，并且将生成的RNA链进行退火，Dnase和Rnase处理以及通过醋酸钠纯化。所得dsRNA的正义链如本文SEQ ID NO 39所示。

对于Bg031，在PCR反应中依照以下条件应用特异性T7FW引物oGBLA007和特异性RV引物oGBLA002(分别如本文SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 44所示)生成正义T7模板：95℃4分钟，接着为95℃30秒、51℃30秒和72℃1分钟的35个循环，接着为72℃10分钟。在PCR反应中依照上述的相同条件应用特异性FW引物oGBLA001和特异性T7RV引物oGBLA008(分别如本文SEQ ID NO 43和SEQ ID NO 46所示)生成反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物并通过NaClO₄沉淀来纯化。按照使用说明，混合生成的T7FW和RV模板以进行转录，并且将生成的RNA链进行退火，Dnase和Rnase处理以及通过醋酸钠纯化。所得dsRNA的正义链如本文SEQ ID NO 47所示。

对于Bg032，在PCR反应中依照以下条件应用特异性T7FW引物oGBLB007和特异性RV引物oGBLB004(分别如本文SEQ ID NO 53和SEQ ID NO 52所示)生成正义T7模板：95℃4分钟，接着为95℃30秒、51℃30秒和72℃1分钟的35个循环，接着为72℃10分钟。在PCR反应中依照上述的相同条件应用特异性FW引物oGBLB003和特异性T7RV引物oGBLB008(分别如本文SEQ ID NO 51和SEQ ID NO 54所示)生成反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物并通过NaClO₄沉淀来纯化。按照使用说明，混合生成的T7FW和RV模板以进行转录，并且将生成的RNA链进行退火，Dnase和Rnase处理以及通过醋酸钠纯化。所得dsRNA的正义链如本文SEQ ID NO 55所示。

对于Bg033，在PCR反应中依照以下条件应用特异性T7FW引物oGBLC007和特异性RV引物oGBLC004(分别如本文SEQ ID NO 61和SEQ ID NO 60所示)生成正义T7模板：95℃4分钟，接着为95℃30秒、51℃30秒和72℃1分钟的35个循环，接着为72℃10分钟。在PCR反应中依照上述的相同条件应用特异性FW引物oGBLC001和特异性T7RV引物oGBLC008(分别如本文SEQ ID NO 59和SEQ ID NO 62所示)生成反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所获得的PCR产物并通过NaClO₄沉淀来纯化。按照使用说明，混合生成的T7FW和RV模板以进行转录，并且将生成的RNA链进行退火，Dnase和Rnase处理以及通过醋酸钠纯化。所得dsRNA的正义链如本文SEQ ID NO 63所示。

实施例4：筛选具有抵抗德国蟑螂(德国小蠊(Blattella germanica))活性的dsRNA靶标的实验室试验

制备溶于蒸馏水的1-10μg/μldsRNA的储备溶液。将各个dsRNA溶液稀释至适合的浓度并与细磨的实验室食物(大鼠和小鼠标准食物，B&K Universal Ltd，Hull，UK)混合，所述实验室食物之前经过加热处理，从而使所有的酶失活。将所述混合物或者制剂制成同样重量(0.3g)的小颗粒以达到0.1％-2％w/w dsRNA的终浓度并在室温下干燥过夜。

在具有塑料盖的容器(29±2℃，最小相对湿度40％，12∶12的有光照∶无光照光周期)中各放置10只新孵化的德国蟑螂(B.germanica)的若虫。在动物接触到所述颗粒之前，被停食24小时。一周两次评价蟑螂的存活、濒死或者死亡，直至成虫期。所述颗粒一周一次用新制备的颗粒替换。将含dsRNA的颗粒、制剂与阴性对照(溶剂)和阳性对照(1或2％吡虫啉(imidacloprid)，通常被用于可商业获得的蟑螂诱饵)进行比较。如图1所示，在用Bg001、Bg003和Bg005处理的第一次施用后24天内或者在用Bg004处理起的29天内，至少80％的蟑螂死亡。

实施例5：检验不同片段的功效

鉴定德国小蠊(Blattella germanica)Bg001、Bg003、Bg004、Bg005、Bg031、Bg032和Bg033基因的与人基本没有同源性的片段

分析Bg001、Bg003、Bg004、Bg005、Bg031、Bg032和Bg033基因的部分序列(在本文中分别如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 11、SEQID NO 21、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 49和SEQ IDNO 57所示)，以找到与非靶生物基本没有同源性的片段。尤其是，因为dsRNA在生物中将被切成siRNA分子，扫描所述序列的与非靶物种具有同源性的siRNA序列。这样的siRNA会在非靶生物中引起副作用，因此优选应当避免将该dsRNA片段掺入终产物。当例如存在于诱饵并通过蟑螂进食从该诱饵摄取时，所选的片段适合通过RNA干扰对蟑螂进行防治。对于此分析，非靶生物是人(Homo sapiens)。鉴定21个连续核苷酸(best1_human_21_0)或者24个连续核苷酸的允许3个错配(best1/2/3_human_24_3)的片段，其不在非靶生物中存在，在本文中被称为“自由片段(freefrags)”。应用第一选择标准鉴定的无非靶生物序列的Bg001、Bg003、Bg004、Bg005、Bg031、Bg032和Bg033的最长序列在SEQ ID NO中给出并被称为“自由片段”。这些Bg001、Bg003、Bg004、Bg005、Bg031、Bg032和Bg033的自由片段在本文中分别如SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 40、SEQID NO 48、SEQ ID NO 56和SEQ ID NO 64所示。其它适于在本发明中应用的自由片段序列的一些实例的序列和长度在表2中显示。从该表中可以很容易地推导出正确的序列。在该表中描述的所有自由片段属于本发明的序列的组。

本领域的技术人员应当承认，在本文描述的德国小蠊序列中、以及在本发明其它有害生物序列中的相应基因和蛋白质直系同源物的序列中可以鉴定更多这样的各种长度的自由片段，因此本发明扩展至另外这些可鉴定的自由片段。

实施例6：选择最佳片段；检验多联体的功效

设计针对各个靶基因的多联体。多联体是50-100bp双链片段的合成串联重复。在本实施例中，通过在蛋白质家族中以及在核苷酸水平上的具有同源性的区域中、在包含最佳预测siRNA的区域中以及在GC含量为40-60％(如果可能优选约50％GC含量)的区域中选择最可能片段来设计多联体。

对于Bg001，设计了两种多联体，由50bp片段的5次重复组成，即由SEQ ID NO 65和66所示，产生Bg001多联体1和Bg001多联体2，在本文中被分别显示为SEQ ID NO 67和SEQ ID NO 68，并且设计一种多联体，其由100bp重复序列的3次重复组成，由SEQ ID NO 69所示，产生Bg001多联体3，在本文中被显示为SEQ ID NO 70。添加Xbal和Smal旁侧位点用于载体中的克隆以产生dsRNA。在蟑螂实验室试验中检验这些包含多联体的dsRNA构建体。

在如图2所示的另一实验中，与负对照(溶剂)相比，当用Bg001和Bg001多联体2处理时，死亡率要明显更高。

除了死亡率之外，处理对发育显示出明显的影响。例如，在48天时，在用Bg001处理过的存活蟑螂中，只有33.3％的蟑螂蜕皮至成虫期，而在用Bg001多联体2处理过的蟑螂中，没有蟑螂蜕皮至成虫期，如表3所示。

实施例7：检验不同的制剂

RNA干扰(RNAi)是在许多不同物种中以序列特异性方式抑制靶基因表达的一种潜在的非常有效的手段。然而，对于有价值且有效的RNAi而言，特异性地沉默任何指定靶基因是必需的，其中没有非特异性的敲低(knockdown)和毒性副作用。由于不能有效地递送这些化合物至它们在细胞内的作用位点，从而阻碍了dsRNA的应用。对dsRNA进行化学修饰以增加相互作用的强度和稳定性并且不损失特异性的进展正在进行中。在本研究中，对几种用于递送dsRNA至德国小蠊中靶基因的设计进行了评估。

通过促进内吞作用来增加dsRNA的胞内摄取或者通过应用递送剂(比如脂质和脂质体)来增加dsRNA在生物环境中的稳定性可以改善RNAi诱导效应。siRNA具有阴离子磷酸二酯主链，并为此原因研究阳离子脂质体/脂质介导的siRNA递送(siFection)。从许多可商业获得的产品中选择这些基于阳离子脂质体/脂质的系统，包括lipofectamine和1，2-二油酰基-3-三甲基-铵基-丙烷(DOTAP)-胆固醇，并在蟑螂实验室试验中检验dsRNA制剂。待研究的参数包括混合的脂质：dsRNA比率、阳离子脂质体/脂质-dsRNA复合物形成的程度、颗粒大小、递送方式和剂量效应作用。

实施例8：检验dsRNA稳定性

将dsRNA应用于基因沉默将取决于在分子生物稳定性、特异性和递送方面的改进。

在pH 7和pH 9的TRIZMA缓冲液中和用于模拟一些靶物种肠中pH的pH 11的CAPS缓冲液中检验所生成dsRNA的稳定性。孵育dsRNA几天，并在不同的时间间隔在20％聚丙烯酰胺凝胶上分析等分试样。基于凝胶结果可以观察到pH对dsRNA的稳定性没有影响。

在8个月的期间，在室温条件下，在无RNase水中和在LB培养基中检验作为时间函数的所生成dsRNA的稳定性。每周一次和/或每月一次采集等分试样，并且在20％聚丙烯酰胺凝胶上分析之前保存在-20℃中。如图3所示，在聚丙烯酰胺凝胶上可观察到dsRNA没有明显的降解。

实施例9：检验单剂dsRNA在德国蟑螂(德国小蠊(Blattella germanica))的早期若虫阶段中对死亡率影响的实验室试验

制备溶于蒸馏水的10μg/μl dsRNA的储备溶液，并与细磨的实验室食物(大鼠和小鼠标准食物，B&K Universal Ltd，Hull，UK)混合，所述实验室食物之前经过加热处理，从而使所有的酶失活。将所述混合物或者制剂制成同样重量(0.3g)的小颗粒以达到1％w/w dsRNA的终浓度并在室温下干燥过夜。

在具有塑料盖的容器(29±2℃，最小相对湿度40％，12∶12的有光照∶无光照光周期)中各放置10只新孵化的德国蟑螂(德国小蠊)的若虫。在动物接触到所述颗粒之前，被停食24小时。一周后，该初始剂用未经处理的颗粒替换。一周两次评价蟑螂的存活、濒死或者死亡，直至成虫期。如图4所示，与两种负对照(溶剂和混杂的dsRNA)相比，包含Bg001dsRNA的颗粒显示出明显更高的死亡率。

以下内容对应于原申请权利要求书：

1.核酸分子，其包含如SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181中任一序列所示的核苷酸序列或者来自昆虫或蜘蛛类动物物种的直系同源核苷酸序列，其中所述直系同源核苷酸序列与SEQ ID NO 1、11、21和31任一序列的核苷酸序列具有至少70％序列一致性。

2.RNA构建体，其包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与以下任一核酸分子的一部分核苷酸序列互补的核苷酸序列：(i)项1中定义的核酸分子或者(ii)核酸分子，其包含如SEQ ID NO 41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的直系同源核苷酸序列。

3.项2的RNA构建体，其中所述至少一个双链RNA区具有至少17bp长。

4.根据项2或3的RNA构建体，其中所述核苷酸序列的互补性包含与(i)或(ii)具有至少70％的核苷酸序列一致性，其中序列一致性百分率是在相同长度上计算的，(i)项1或者项2中定义的核酸分子的一部分核苷酸序列，(ii)核酸分子，所述核酸分子包含如SEQ ID NO 41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示核苷酸序列或者其来自昆虫或者蜘蛛类动物物种的直系同源核苷酸序列。

5.根据项2-4任一项的RNA构建体，其中所述的至少一条链与来自哺乳动物物种的相应核苷酸序列在24个连续核苷酸上具有小于12.5％的序列一致性，所述的至少一条链包含与(i)或(ii)互补的核苷酸序列，(i)项1或者项2中定义的核酸分子的一部分核苷酸序列或者(ii)核酸分子，其包含如SEQ ID NO 41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其来自昆虫或蜘蛛类动物物种的直系同源核苷酸序列。

6.根据项2-5任一项的RNA构建体，其包含独立地选自下述任意序列的至少两个核苷酸序列：SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200，例如SEQ ID NO 65-70的任意序列。

7.DNA构建体，(i)包含项1的核苷酸序列或者(ii)包含编码项2-6中任一项之RNA构建体的区域。

8.表达构建体，其包含项7的DNA构建体。

9.根据项8的表达构建体，其还包含能驱动项7中所定义核酸之表达的一个或多个调控序列；和任选地转录终止序列。

10.宿主细胞，其包含如项2-6中任一项的RNA构建体、项7或8的DNA构建体和/或项9的表达构建体。

11.杀虫组合物，其包含如项2-6中任一项定义的RNA构建体和/或如项7或8中定义的DNA构建体和/或如项9中定义的表达构建体和/或如项10中定义的宿主细胞以及适合的载体。

12.根据项10的组合物，其中所述载体包括带静电的粉末或颗粒和/或磁性颗粒，优选金属颗粒，其初始时是未磁化的，但是当其被置于由昆虫和/或蜘蛛类动物体所提供的电场中时能被磁性极化，所述粉末或颗粒附着于昆虫或蜘蛛类动物的表皮并且可被昆虫或蜘蛛类动物摄入。

13.用于昆虫和/或蜘蛛类动物的室或诱捕器，其包含如项11或12中定义的组合物。

14.如项2-6中任一项定义的RNA构建体和/或如项7或8中定义的DNA构建体和/或如项9中定义的表达构建体和/或如项10中定义的宿主细胞和/或如项11或12中定义的组合物和/或如项13中定义的室或诱捕器通过RNA干扰防治昆虫和/或蜘蛛类动物的用途。

15.防治昆虫和/或蜘蛛类动物的方法，其包括向昆虫和/或蜘蛛类动物施用如项2-6中任一项定义的RNA构建体和/或如项7或8中定义的DNA构建体和/或如项9中定义的表达构建体和/或如项10中定义的宿主细胞和/或如项11或12中定义的组合物和/或如项13中定义的室或诱捕器，其中所述双链RNA能通过RNA干扰下调至少一种昆虫和/或蜘蛛类动物基因的表达。

16.项15的方法，其中多种如项2-6中任一项定义的RNA构建体和/或如项7或8中定义的DNA构建体和/或如项9中定义的表达构建体和/或如项10中定义的宿主细胞和/或如项11或12中定义的组合物和/或如项13中定义的室或诱捕器被施用给所述昆虫和/或蜘蛛类动物。

17.项16的方法，其中所述的多种如项2-6中任一项定义的RNA构建体和/或如项7或8中定义的DNA构建体和/或如项9中定义的表达构建体和/或如项10中定义的宿主细胞和/或如项11或12中定义的组合物和/或如项13中定义的室或诱捕器被依次施用，以降低昆虫和/或蜘蛛类动物获得抗性的可能性。

18.根据项14的用途或者根据项15-17中任一项的方法，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物包括居室昆虫、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物，优选蝇、叶螨、蓟马、壁虱、家禽红螨、蚂蚁、蟑螂、白蚁、蟋蟀包括家蟋蟀、衣鱼、书虱、甲虫、蠼螋、蚊和跳蚤。

19.根据项18的用途或者方法，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物包括蟑螂(蜚蠊目(Blattodea))比如但不限于小蠊属(Blatella spp.)(例如德国小蠊(Blatella germanica)(德国蟑螂))、大蠊属(Periplaneta spp.)(例如美洲大蠊(美洲蟑螂)和澳洲大蠊(澳洲蟑螂))、蜚蠊属(Blattaspp.)(例如东方蜚蠊(东方蟑螂))和蠊属(Supella spp.)(例如褐带蠊(褐带蟑螂))；蚂蚁(蚁总科(Formicoidea))，比如但不限于火蚁属(Solenopsis spp.)(例如入侵红火蚁(Solenopsis invicta)(红火蚁))、小家蚁属(Monomorium spp.)(例如法老小家蚁(Monomoriumpharaonis)(法老蚁(Pharaoh Ant))、弓背蚁属(Camponotus spp.)(例如弓背蚁属(Camponotus spp)(木匠蚁(Carpenter Ants))、毛蚁属(lasius spp.)(例如黑毛蚁(lasius niger)(小黑蚁(Small Black Ant)))、铺道蚁属(Tetramorium spp.)(例如铺道蚁(Tetramorium caespitum)(铺道蚁(Pavement Ant)))、红蚁属(Myrmica spp.)(例如小红蚁(Myrmica rubra)(红蚁(Red Ant)))、蚁属(Formica spp.)(木蚁(woodants))、举腹蚁属(Crematogaster spp.)(例如Crematogaster lineolata(Acrobat Ant))、虹臭蚁属(Iridomyrmex spp.)(例如伊蚁(Iridomyrmexhumilis)(阿根廷蚁(Argentine Ant)))、大头蚁属(Pheidole spp.)(大头蚁(Big Headed Ants))和Dasymutilla spp.(例如Dasymutillaoccidentalis(Velvet Ant))；白蚁类(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白蚁科(Termitidae))比如但不限于暗白蚁属(Amitermes spp.)(例如佛罗里达暗白蚁(Amitermes floridensis)(佛罗里达暗翅土白蚁(Florida dark-winged subterranean termite)))、散白蚁属(Reticulitermes spp.)(例如黄肢散白蚁(Reticulitermes flavipes)(东方土白蚁(the eastern subterranean termite))、Reticulitermes hesperus(西方土白蚁(Western Subterranean Termite)))、家白蚁属(Coptotermes spp.)(例如家白蚁(Coptotermes formosanus)(台湾土白蚁(Formosan Subterranean Termite)))、楹白蚁属(Incisitermes spp.)(例如小楹白蚁(Incisitermes minor)(西方干木白蚁(Western DrywoodTermite)))和新白蚁属(Neotermes spp.)(例如Neotermes connexus(森林白蚁(Forest Tree Termite)))，并且最优选德国蟑螂(德国小蠊)。

20.用于项15-19中任一项方法的试剂盒，其包含如项2-6中任一项定义的RNA构建体和/或如项7或8中定义的DNA构建体和/或如项9中定义的表达构建体和/或如项10中定义的宿主细胞和/或如项11或12中定义的组合物和/或如项13中定义的室或诱捕器以及使用说明，其中所述双链RNA能够通过RNA干扰下调至少一种有害生物基因的表达。

21.项20的试剂盒，其包含多种如项2-6中任一项定义的RNA构建体和/或如项7或8中定义的DNA构建体和/或如项9中定义的表达构建体和/或如项10中定义的宿主细胞和/或如项11或12中定义的组合物和/或如项13中定义的室或诱捕器，其中每种双链RNA能够通过RNA干扰下调至少一种有害生物基因的表达。

22.项20的试剂盒，其中所述的多种如项2-6中任一项定义的RNA构建体和/或如项7或8中定义的DNA构建体和/或如项9中定义的表达构建体和/或如项10中定义的宿主细胞和/或如项11或12中定义的组合物和/或如项13中定义的室或诱捕器被依次应用，以降低有害生物获得抗性的可能性。

23.防治蟑螂有害生物的方法，其包括向蟑螂提供RNA构建体，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与编码蟑螂核糖体蛋白质的一部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。

24.根据项23的方法，其中所述的至少一个双链RNA区的至少一条链包含下述任一核酸分子的至少17、18、19、20、21个或者更多个核苷酸，所述核酸分子包含如SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其互补序列。

25.项2-6中任一项的RNA构建体，其包含至少一个另外的dsRNA区，其至少一条链包含与来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的另外基因的一部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。

26.项2-6或者25中任一项的RNA构建体，其还包含至少一个另外的功能性序列和任选地接头。

27.根据项26的RNA构建体，其中所述另外的功能性序列选自包括以下序列的组：(i)促进大规模生产所述RNA构建体的序列；(ii)实现增加或者降低dsRNA稳定性的序列；(iii)允许结合蛋白质或者其它分子以促进昆虫和/或蜘蛛类动物摄取所述RNA构建体的序列；(iv)作为适配子结合昆虫肠道中受体或分子以促进昆虫和/或蜘蛛类动物摄取、内吞和/或转胞吞的序列。

28.根据项26或27的RNA构建体，其中所述接头是条件性自切割RNA序列，优选pH敏感性接头或者疏水敏感性接头。

29.根据项26或27的RNA构建体，其中所述接头是内含子。

30.根据项23-27中任一项的RNA构建体，其中所述核苷酸序列的互补性包含与(i)或(ii)具有至少70％的核苷酸序列一致性，其中序列一致性百分率是在相同长度上计算的，(i)项1或者项2中定义的核酸分子的一部分核苷酸序列，(ii)核酸分子，其包含如SEQ ID NO 41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的直系同源核苷酸序列。

31.根据项25-30中任一项的RNA构建体，其中所述的至少一条链与来自哺乳动物物种的相应核苷酸序列在24个连续核苷酸上具有小于12.5％的序列一致性，所述的至少一条链包含与(i)或(ii)互补的核苷酸序列，(i)项1或者项2中定义的核酸分子的一部分核苷酸序列或者(ii)核酸分子，其包含如SEQ ID NO 41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的直系同源核苷酸序列。

32.根据项3-6或者25-28任一项的RNA构建体，其中所述的至少一条链包含下述任一核酸分子的至少17、18、19、20、21个或者更多个核苷酸，所述核酸分子包含如SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其互补序列。

33.根据项31或者32的RNA构建体，其中所述哺乳动物物种是人。

34.包含至少一个双链RNA区的RNA构建体，其至少一条链包含下述任一核酸分子的至少17、18、19、20、21个或者更多个核苷酸，所述核酸分子包含如SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其互补序列。

35.DNA构建体，其包含编码项25-34中任一项之RNA构建体的区域。

36.表达构建体，其包含项35的DNA构建体。

37.宿主细胞，其包含项25-34中任一项的RNA构建体、项35的DNA构建体或者项36的表达构建体。

38.如项10或37定义的宿主细胞，其是细菌细胞。

39.如项38定义的宿主细胞，其是灭活的细菌细胞。

40.用于产生项2-6或25-34中任一项之RNA构建体的方法，其包括在允许所述DNA构建体转录以产生所述RNA构建体的条件下实施以下步骤：

a.将项7或35的DNA构建体或者项8、9或36的表达构建体与无细胞组分接触；或者

b.向细胞施用项7或35的DNA构建体或者项8、9或36的表达构建体。

41.项40的方法，其中所述细胞是细菌细胞。

42.杀虫组合物，其包含如项25-34中任一项定义的RNA构建体和/或如项35中定义的DNA构建体和/或如项36中定义的表达构建体和/或如项37-39中任一项定义的宿主细胞以及适合的载体。

43.根据项10、11或43中任一项的组合物，其为适于昆虫和/或蜘蛛类动物摄入的形式。

44.根据项42或43的组合物，其是固体形式，比如颗粒或粉末、液体形式或凝胶形式。

45.根据项42-44中任一项的组合物，其为诱饵的形式。

46.根据项45的组合物，其中所述诱饵还包含至少一种食物，比如基于蛋白质的食物或者硼酸和/或引诱剂，比如信息素。

47.根据项42-46中任一项的组合物，其中所述组合物被存放在昆虫和/或蜘蛛类动物为了摄取该组合物能够进入的室或诱捕器中。

48.根据项42-46中任一项的组合物，其是喷雾剂的形式，优选加压的/气溶胶化的喷雾剂或者泵式喷雾剂。

49.根据项42-46中任一项的组合物，其是在适合表面上的涂料形式，当昆虫和/或蜘蛛类动物与所述涂料接触时，所述涂料就附着于昆虫和/或蜘蛛类动物

50.根据项42-46中任一项的组合物，其中所述载体包括带静电的粉末或颗粒和/或磁性颗粒，优选金属颗粒，其初始时是未磁化的，但是当其被置于由昆虫和/或蜘蛛类动物体提供的电场中时能被磁性极化，其附着于昆虫或者蜘蛛类动物的表皮。

51.根据项42-50中任一项的组合物，其中所述载体提高有害生物对所述双链RNA的摄取。

52.项51的组合物，其中所述载体是基于脂质的载体，优选包括一种或者多种的水包油乳剂、胆固醇、胶束、脂多胺和脂质体。

53.项51的组合物，其中所述载体包含核酸凝聚剂，优选亚精胺或者硫酸鱼精蛋白。

54.项11、12或者42-53中任一项的组合物，其与另外的杀虫剂相组合。

55.用于昆虫和/或蜘蛛类动物的室或诱捕器，其包含如项42-46或者54中任一项定义的组合物。

56.如项25-34中任一项定义的RNA构建体和/或如项35中定义的DNA构建体和/或如项36中定义的表达构建体和/或如项37-39中任一项定义的宿主细胞和/或如项42-54中任一项定义的组合物和/或如项55中定义的室或诱捕器通过RNA干扰防治昆虫和/或蜘蛛类动物的用途。

57.根据项56的用途，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物包括居室昆虫、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物，优选蝇、叶螨、蓟马、壁虱、家禽红螨、蚂蚁、蟑螂、白蚁、蟋蟀包括家蟋蟀、衣鱼、书虱、甲虫、蠼螋、蚊和跳蚤。

58.根据项57的用途，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物包括蟑螂(蜚蠊目(Blattodea))比如但不限于小蠊属(Blattella spp.)(例如，德国小蠊(Blatella germanica)(德国蟑螂))、大蠊属(Periplaneta spp.)(例如美洲大蠊(Periplaneta americana)(美洲蟑螂)和澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae)(澳洲蟑螂))、蜚蠊属(Blatta spp.)(例如东方蜚蠊(Blatta orientalis)(东方蟑螂))和蠊属(Supella spp.)(例如褐带蠊(Supella longipalpa)(褐带蟑螂)；蚂蚁(蚁总科(Formicoidea))，比如但不限于火蚁属(Solenopsis spp.)(例如入侵红火蚁(Solenopsis invicta)(红火蚁))、小家蚁属(Monomorium spp.)(例如法老小家蚁(Monomorium pharaonis)(法老蚁(Pharaoh Ant))、弓背蚁属(Camponotus spp.)(例如弓背蚁属(Camponotus spp)(木匠蚁(Carpenter Ants))、毛蚁属(lasius spp.)(例如黑毛蚁(lasius niger)(小黑蚁(Small Black Ant)))、铺道蚁属(Tetramorium spp.)(例如铺道蚁(Tetramorium caespitum)(铺道蚁(Pavement Ant)))、红蚁属(Myrmica spp.)(例如小红蚁(Myrmica rubra)(红蚁(Red Ant)))、蚁属(Formica spp.)(木蚁(wood ants))、举腹蚁属(Crematogaster spp.)(例如Crematogaster lineolata(Acrobat Ant))、虹臭蚁属(Iridomyrmexspp.)(例如伊蚁(Iridomyrmex humilis)(阿根廷蚁(Argentine Ant)))、大头蚁属(Pheidole spp.)(大头蚁(Big Headed Ants))和Dasymutillaspp.(例如Dasymutilla occidentalis(Velvet Ant))；白蚁类(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白蚁科(Termitidae))比如但不限于暗白蚁属(Amitermes spp.)(例如佛罗里达暗白蚁(Amitermes floridensis)(佛罗里达暗翅土白蚁(Florida dark-winged subterranean termite)))、散白蚁属(Reticulitermes spp.)(例如黄肢散白蚁(Reticulitermes flavipes)(东方土白蚁(the eastern subterranean termite))、Reticulitermeshesperus(西方土白蚁(Western Subterranean Termite)))、家白蚁属(Coptotermes spp.)(例如家白蚁(Coptotermes formosanus)(台湾土白蚁(Formosan Subterranean Termite)))、楹白蚁属(Incisitermes spp.)(例如小楹白蚁(Incisitermes minor)(西方干木白蚁(Western DrywoodTermite)))和新白蚁属(Neotermes spp.)(例如Neotermes connexus(森林白蚁(Forest Tree Termite)))，并且最优选德国蟑螂(德国小蠊)。

59.根据项14、18或56-58中任一项的用途，其中使所述昆虫和/或蜘蛛类动物生长延迟、麻痹、使其不育或者被杀伤。

60.防治昆虫和/或蜘蛛类动物的方法，其包括向昆虫和/或蜘蛛类动物施用如项25-34中任一项定义的RNA构建体和/或如项35中定义的DNA构建体和/或如项36中定义的表达构建体和/或如项37-39中任一项定义的宿主细胞和/或如项42-54中任一项定义的组合物和/或如项13中定义的室或诱捕器，其中所述双链RNA能通过RNA干扰下调至少一种昆虫和/或蜘蛛类动物基因的表达。

61.项60的方法，其中施用多种如项25-34中任一项定义的RNA构建体和/或如项35中定义的DNA构建体和/或如项36中定义的表达构建体和/或如项37-39中任一项定义的宿主细胞和/或如项42-54中任一项定义的组合物和/或如项13中定义的室或诱捕器。

62.项61的方法，其中所述的多种如项25-34中定义的RNA构建体和/或如项35中定义的DNA构建体和/或如项36中定义的表达构建体和/或如项37-39中任一项定义的宿主细胞和/或如项42-54中任一项定义的组合物和/或如项13中定义的室或诱捕器被依次施用，以降低有害生物获得抗性的可能性。

63.根据项60-62中任一项的方法，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物包含居室昆虫、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物，优选蝇、叶螨、蓟马、壁虱、家禽红螨、蚂蚁、蟑螂、白蚁、蟋蟀包括家蟋蟀、衣鱼、书虱、甲虫、蠼螋、蚊和跳虱。

64.根据项60-63中任一项的方法，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物包括蟑螂(蜚蠊目(Blattodea))比如但不限于小蠊属(Blattella spp.)(例如，德国小蠊(Blatella germanica)(德国蟑螂))、大蠊属(Periplanetaspp.)(例如美洲大蠊(Periplaneta americana)(美洲蟑螂)和澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae)(澳洲蟑螂))、蜚蠊属(Blatta spp.)(例如东方蜚蠊(Blatta orientalis)(东方蟑螂))和蠊属(Supella spp.)(例如褐带蠊(Supella longipalpa)(褐带蟑螂)；蚂蚁(蚁总科(Formicoidea))比如但不限于火蚁属(Solenopsis spp.)(例如入侵红火蚁(Solenopsis invicta)(红火蚁))、小家蚁属(Monomorium spp.)(例如法老小家蚁(Monomorium pharaonis)(法老蚁(Pharaoh Ant))、弓背蚁属(Camponotus spp.)(例如弓背蚁属(Camponotus spp)(木匠蚁(Carpenter Ants))、毛蚁属(lasius spp.)(例如黑毛蚁(lasius niger)(小黑蚁(Small Black Ant)))、铺道蚁属(Tetramorium spp.)(例如铺道蚁(Tetramorium caespitum)(铺道蚁(Pavement Ant)))、红蚁属(Myrmica spp.)(例如小红蚁(Myrmica rubra)(红蚁(Red Ant)))、蚁属(Formica spp.)(木蚁(wood ants))、举腹蚁属(Crematogaster spp.)(例如Crematogaster lineolata(Acrobat Ant))、虹臭蚁属(Iridomyrmexspp.)(例如伊蚁(Iridomyrmex humilis)(阿根廷蚁(Argentine Ant)))、大头蚁属(Pheidole spp.)(大头蚁(Big Headed Ants))和Dasymutillaspp.(例如Dasymutilla occidentalis(Velvet Ant))；白蚁类(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白蚁科(Termitidae))比如但不限于暗白蚁属(Amitermes spp.)(例如佛罗里达暗白蚁(Amitermes floridensis)(佛罗里达暗翅土白蚁(Florida dark-winged subterranean termite)))、散白蚁属(Reticulitermes spp.)(例如黄肢散白蚁(Reticulitermes flavipes)(东方土白蚁(the eastern subterranean termite))、Reticulitermeshesperus(西方土白蚁(Western Subterranean Termite)))、家白蚁属(Coptotermes spp.)(例如家白蚁(Coptotermes formosanus)(台湾土白蚁(Formosan Subterranean Termite)))、楹白蚁属(Incisitermes spp.)(例如小楹白蚁(Incisitermes minor)(西方干木白蚁(Western DrywoodTermite)))和新白蚁属(Neotermes spp.)(例如Neotermes connexus(森林白蚁(Forest Tree Termite)))。

65.根据项15-16或6-62中任一项的方法，其中使所述昆虫和/或蜘蛛类动物生长延迟、麻痹、使其不育或者被杀伤。

66.用于项60-65中任一项所述方法的试剂盒，其包含如项25-34中定义的RNA构建体和/或如项35中定义的DNA构建体和/或如项36中定义的表达构建体和/或如项37-39中任一项定义的宿主细胞和/或如项42-54中任一项定义的组合物和/或如项13中定义的室或诱捕器以及施用说明，其中所述双链RNA能通过RNA干扰下调至少一种有害生物基因的表达。

67.项64的试剂盒，其包含多种如项25-34中定义的RNA构建体和/或如项35中定义的DNA构建体和/或如项36中定义的表达构建体和/或如项37-39中任一项定义的宿主细胞和/或如项42-54中任一项定义的组合物，其中每种双链RNA能通过RNA干扰下调至少一种有害生物基因的表达。

68.项67的试剂盒，其中所述的多种如项25-34中定义的RNA构建体和/或如项35中定义的DNA构建体和/或如项36中定义的表达构建体和/或如项37-39中任一项定义的宿主细胞和/或如项42-54中任一项定义的组合物被顺序地应用，以降低有害生物获得抗性的可能性。

69.防治蟑螂有害生物的方法，其包括向蟑螂施用RNA构建体，其包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与编码原肌球蛋白、HMG辅酶A合成酶基因或肌动蛋白5C基因的一部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。

70.根据项69的方法，其中所述的至少一个双链区的至少一条链包含下述任一核酸分子的至少17、18、19、20、21个或者更多个核苷酸，所述核酸分子包含如SEQ ID NO 1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其互补序列。

71.根据项23、24、69或者70中任一项的方法，其中所述蟑螂有害生物选自属于包含以下属的组的物种：小蠊属(Blatella)、大蠊属(Periplaneta)、蜚蠊属(Blatta)和蠊属(Supella)。

72.根据项23、24或69-71中任一项的方法，其中所述蟑螂有害生物选自以下组，所述的组包含德国蟑螂(德国小蠊(BlatellaGermanica))、美洲蟑螂(美洲大蠊(Periplaneta americana))、澳洲蟑螂(澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae))、东方蟑螂(东方蜚蠊(Blattaorientalis))和褐带蟑螂(褐带蠊(Supella longipalpa))。

73.蛋白质，其包含如SEQ ID NO 2、12、22或32任一序列所示的氨基酸序列或者直系同源蛋白质，所述直系同源蛋白质具有来自另外昆虫和/或蜘蛛类动物物种的保守氨基酸序列。

74.项73的蛋白质，其中所述直系同源物与如SEQ ID NO 2、12、22或32任一序列所示的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列一致性。

75.用于产生项2-6或25-34中任一项之RNA构建体的方法，其包括在允许所述RNA构建体表达的条件下培养如项10或37-39中任一项定义的宿主细胞。

76.项75的方法，其还包括纯化所述RNA构建体。

Claims (86)

1.核酸分子，其由如SEQ ID NO 11、16、17、19、20、80至87、21、26、27、29、30、88至93、31、36、37、39、40、94至108、180、181、1、4、6、7、9、10、65至70和71至79中任一序列所示的核苷酸序列组成。

2.RNA构建体，其包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与以下任一种核酸分子互补的核苷酸序列：(i)权利要求1中定义的核酸分子，和(ii)由如SEQ ID NO 41、43、44、47、48、109至147、182至187、49、51、52、55、56、148至150、57、63、64、151至179和188至200中任一序列所示的核苷酸序列组成的核酸分子。

3.权利要求2的RNA构建体，其中所述至少一个双链RNA区具有至少17bp长。

4.根据权利要求2或3的RNA构建体，其中所述的至少一条链与来自哺乳动物物种的相应核苷酸序列在24个连续核苷酸上具有使用Blast软件和GAP分析而确定的小于12.5％的序列一致性，所述的至少一条链包含与权利要求1中定义的核酸分子互补的核苷酸序列。

5.根据权利要求2或3的RNA构建体，其包含独立地选自下述任意序列的至少两个核苷酸序列的RNA等价物：SEQ ID NO 11、16、17、19、20、80至87、21、26、27、29、30、88至93、31、36、37、39、40、94至108、180、181、41、43、44、47、48、109至147、182至187、49、51、52、55、56、148至150、57、63、64、151至179、188至200、1、4、6、7、9、10、65至70和71至79。

6.权利要求2或3的RNA构建体，其包含至少一个另外的dsRNA区，其至少一条链包含与来自昆虫和/或蜘蛛类动物物种的另外基因互补的核苷酸序列。

7.权利要求2或3的RNA构建体，其还包含至少一个另外的功能性序列和任选地接头。

8.根据权利要求7的RNA构建体，其中所述另外的功能性序列选自包括以下序列的组：(i)促进大规模生产所述RNA构建体的序列；(ii)实现增加或者降低dsRNA稳定性的序列；(iii)允许结合蛋白质或者其它分子以促进昆虫和/或蜘蛛类动物摄取所述RNA构建体的序列；(iv)作为适配子结合昆虫肠道中受体或分子以促进昆虫和/或蜘蛛类动物摄取、内吞和/或转胞吞的序列。

9.根据权利要求7的RNA构建体，其中所述接头是条件性自切割RNA序列。

10.根据权利要求7的RNA构建体，其中所述接头是pH敏感性接头或者疏水敏感性接头。

11.根据权利要求8的RNA构建体，其中所述接头是内含子。

12.根据权利要求6的RNA构建体，其中所述的至少一条链与来自哺乳动物物种的相应核苷酸序列在24个连续核苷酸上具有使用Blast软件和GAP分析而确定的小于12.5％的序列一致性，所述的至少一条链包含与权利要求1中定义的核酸分子互补的核苷酸序列。

13.根据权利要求2或3的RNA构建体，其中所述的至少一条链包含下述任一核酸分子，所述核酸分子由如SEQ ID NO 11、16、17、19、20、80至87、21、26、27、29、30、88至93、31、36、37、39、40、94至108、180、181、41、43、44、47、48、109至147、182至187、49、51、52、55、56、148至150、57、63、64、151至179、188至200、1、4、6、7、9、10、65至70和71至79中任一序列所示的核苷酸序列的RNA等价物或者其互补序列组成。

14.根据权利要求12的RNA构建体，其中所述哺乳动物物种是人。

15.DNA构建体，(i)包含权利要求1的核苷酸序列的DNA等价物，或者(ii)包含编码权利要求2-5中任一项之RNA构建体的区域。

16.表达构建体，其包含权利要求15的DNA构建体。

17.根据权利要求16的表达构建体，其还包含能驱动权利要求15中所定义核苷酸序列之表达的一个或多个调控序列；和任选地转录终止序列。

18.宿主细胞，其包含如权利要求2-5中任一项的RNA构建体、权利要求15的DNA构建体和/或权利要求16或17的表达构建体。

19.杀虫组合物，其包含如权利要求2-5中任一项定义的RNA构建体和/或如权利要求15中定义的DNA构建体和/或如权利要求16或17中定义的表达构建体和/或如权利要求18中定义的宿主细胞以及适合的载体。

20.根据权利要求19的组合物，其中所述载体是带静电的粉末或颗粒和/或磁性颗粒和/或金属颗粒，其中所述金属颗粒初始时是未磁化的，但是当其被置于由昆虫或蜘蛛类动物体所提供的电场中时能被磁性极化，所述粉末或颗粒附着于昆虫或蜘蛛类动物的表皮并且可被昆虫或蜘蛛类动物摄入。

21.用于昆虫和/或蜘蛛类动物的室或诱捕器，其包含如权利要求19或20中定义的组合物。

22.如权利要求2-5中任一项定义的RNA构建体和/或如权利要求15中定义的DNA构建体和/或如权利要求16或17中定义的表达构建体和/或如权利要求18中定义的宿主细胞和/或如权利要求19或20中定义的组合物和/或如权利要求21中定义的室或诱捕器通过RNA干扰防治昆虫和/或蜘蛛类动物的用途。

23.根据权利要求22的用途，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物是居室昆虫、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物。

24.根据权利要求22的用途，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物是蟑螂。

25.根据权利要求23的用途，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物选自小蠊属(Blatella spp.)、大蠊属(Periplaneta spp.)、蜚蠊属(Blatta spp.)、蠊属(Supella spp.)、火蚁属(Solenopsis spp.)、小家蚁属(Monomoriumspp.)、弓背蚁属(Camponotus spp.)、毛蚁属(lasius spp.)、铺道蚁属(Tetramorium spp.)、红蚁属(Myrmica spp.)、蚁属(Formica spp.)、举腹蚁属(Crematogaster spp.)、虹臭蚁属(Iridomyrmex spp.)、大头蚁属(Pheidole spp.)、Dasymutilla spp.、暗白蚁属(Amitermes spp.)、散白蚁属(Reticulitermes spp.)、家白蚁属(Coptotermes spp.)、楹白蚁属(Incisitermes spp.)和新白蚁属(Neotermes spp.)。

26.根据权利要求25的用途，其中所述昆虫是德国小蠊(Blatellagermanica)、美洲大蠊(Periplaneta Americana)、澳洲大蠊(Periplanetaaustraliasiae)、东方蜚蠊(Blatta orientalis)或褐带蠊(Supellalongipalpa)。

27.防治昆虫和/或蜘蛛类动物的方法，其包括向昆虫和/或蜘蛛类动物施用：

(i)如权利要求2-5中任一项定义的包含至少一个双链RNA区的RNA构建体，和/或

(ii)如权利要求15中定义的包含编码RNA构建体的区域的DNA构建体，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iii)如权利要求16或17中定义的包含DNA构建体的表达构建体，所述DNA构建体包含编码RNA构建体的区域，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iv)如权利要求18中定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体和/或(iii)的所述表达构建体的宿主细胞，和/或

(v)如权利要求19或20中定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体、(iii)的所述表达构建体和/或(iv)的所述宿主细胞的组合物，和/或

(vi)如权利要求21中定义的含有(v)的所述组合物的室或诱捕器，其中所述双链RNA能通过RNA干扰下调至少一种昆虫和/或蜘蛛类动物基因的表达。

28.权利要求27的方法，其中多种如权利要求2-5中任一项定义的RNA构建体和/或如权利要求15中定义的DNA构建体和/或如权利要求16或17中定义的表达构建体和/或如权利要求18中定义的宿主细胞和/或如权利要求19或20中定义的组合物和/或如权利要求21中定义的室或诱捕器被施用给所述昆虫和/或蜘蛛类动物。

29.权利要求28的方法，其中所述的多种如权利要求2-5中任一项定义的RNA构建体和/或如权利要求15中定义的DNA构建体和/或如权利要求16或17中定义的表达构建体和/或如权利要求18中定义的宿主细胞和/或如权利要求19或20中定义的组合物和/或如权利要求21中定义的室或诱捕器被依次施用，以降低昆虫和/或蜘蛛类动物获得抗性的可能性。

30.根据权利要求27-29中任一项的方法，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物是居室昆虫、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物。

31.根据权利要求27至29中任一项的方法，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物是蟑螂。

32.根据权利要求30的方法，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物选自小蠊属(Blatella spp.)、大蠊属(Periplaneta spp.)、蜚蠊属(Blatta spp.)、蠊属(Supella spp.)、火蚁属(Solenopsis spp.)、小家蚁属(Monomoriumspp.)、弓背蚁属(Camponotus spp.)、毛蚁属(lasius spp.)、铺道蚁属(Tetramorium spp.)、红蚁属(Myrmica spp.)、蚁属(Formica spp.)、举腹蚁属(Crematogaster spp.)、虹臭蚁属(Iridomyrmex spp.)、大头蚁属(Pheidole spp.)、Dasymutilla spp.、暗白蚁属(Amitermes spp.)、散白蚁属(Reticulitermes spp.)、家白蚁属(Coptotermes spp.)、楹白蚁属(Incisitermes spp.)和新白蚁属(Neotermes spp.)。

33.根据权利要求32的方法，其中所述昆虫是德国小蠊(Blatellagermanica)、美洲大蠊(Periplaneta Americana)、澳洲大蠊(Periplanetaaustraliasiae)、东方蜚蠊(Blatta orientalis)或褐带蠊(Supellalongipalpa)。

34.用于权利要求27-33中任一项方法的试剂盒，其包含

(i)如权利要求2-5中任一项定义的包含至少一个双链RNA区的RNA构建体，和/或

(ii)如权利要求15中定义的包含编码RNA构建体的区域的DNA构建体，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iii)如权利要求16或17中定义的包含DNA构建体的表达构建体，所述DNA构建体包含编码RNA构建体的区域，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iv)如权利要求18中定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体和/或(iii)的所述表达构建体的宿主细胞，和/或

(v)如权利要求19或20中定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体、(iii)的所述表达构建体和/或(iv)的所述宿主细胞的组合物，和/或

(vi)如权利要求21中定义的含有(v)的所述组合物的室或诱捕器，以及使用说明，其中所述双链RNA能够通过RNA干扰下调至少一种有害生物基因的表达。

35.权利要求34的试剂盒，其包含

(i)多种如权利要求2-5中任一项定义的包含至少一个双链RNA区的RNA构建体，和/或

(ii)如权利要求15中定义的包含编码RNA构建体的区域的DNA构建体，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iii)如权利要求16或17中定义的包含DNA构建体的表达构建体，所述DNA构建体包含编码RNA构建体的区域，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iv)如权利要求18中定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体和/或(iii)的所述表达构建体的宿主细胞，和/或

(v)如权利要求19或20中定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体、(iii)的所述表达构建体和/或(iv)的所述宿主细胞的组合物，和/或

(vi)如权利要求21中定义的含有(v)的所述组合物的室或诱捕器，其中每种双链RNA能够通过RNA干扰下调至少一种有害生物基因的表达。

36.权利要求35的试剂盒，其中所述的多种如权利要求2-5中任一项定义的RNA构建体和/或如权利要求15中定义的DNA构建体和/或如权利要求16或17中定义的表达构建体和/或如权利要求18中定义的宿主细胞和/或如权利要求19或20中定义的组合物和/或如权利要求21中定义的室或诱捕器被依次应用，以降低有害生物获得抗性的可能性。

37.防治蟑螂有害生物的方法，其包括向蟑螂提供RNA构建体，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与编码蟑螂核糖体蛋白质、原肌球蛋白、HMG辅酶A合酶或肌动蛋白5C的一部分核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述的至少一个双链RNA区的至少一条链包含下述任一核酸分子，所述核酸分子由如SEQ ID NO11、16、17、19、20、80至87、21、26、27、29、30、88至93、31、36、37、39、40、94至108、180、181、41、43、44、47、48、109至147、182至187、49、51、52、55、56、148至150、57、63、64、151至179、188至200、1、4、6、7、9、10、65至70和71至79中任一序列所示的核苷酸序列的RNA等价物或者其互补序列组成。

38.根据权利要求37的方法，其中所述蟑螂有害生物选自以下属的物种：小蠊属(Blatella)、大蠊属(Periplaneta)、蜚蠊属(Blatta)和蠊属(Supella)。

39.根据权利要求37的方法，其中所述蟑螂有害生物选自德国小蠊(Blatella Germanica)、美洲大蠊(Periplaneta americana)、澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae)、东方蜚蠊(Blatta orientalis)和褐带蠊(Supella longipalpa)。

40.包含至少一个双链RNA区的RNA构建体，其至少一条链包含下述任一核酸分子，所述核酸分子由如SEQ ID NO 11、16、17、19、20、80至87、21、26、27、29、30、88至93、31、36、37、39、40、94至108、180、181、41、43、44、47、48、109至147、182至187、49、51、52、55、56、148至150、57、63、64、151至179、188至200、1、4、6、7、9、10、65至70和71至79中任一序列所示的核苷酸序列的RNA等价物或者其互补序列组成。

41.DNA构建体，其包含编码权利要求6-14和40中任一项之RNA构建体的区域。

42.表达构建体，其包含权利要求41的DNA构建体。

43.宿主细胞，其包含权利要求6-14和40中任一项的RNA构建体、权利要求41的DNA构建体或者权利要求42的表达构建体。

44.如权利要求18或43定义的宿主细胞，其是细菌细胞。

45.如权利要求44定义的宿主细胞，其是灭活的细菌细胞。

46.用于产生权利要求2-14和40中任一项之RNA构建体的方法，其包括在允许所述DNA构建体或所述表达构建体转录以产生所述RNA构建体的条件下实施以下步骤：

a.将权利要求15或41的DNA构建体或者权利要求16、17或42的表达构建体与无细胞组分接触；或者

b.向细胞施用权利要求15或41的DNA构建体或者权利要求16、17或42的表达构建体。

47.权利要求46的方法，其中所述细胞是细菌细胞。

48.杀虫组合物，其包含如权利要求6-14和40中任一项定义的RNA构建体和/或如权利要求41中定义的DNA构建体和/或如权利要求42中定义的表达构建体和/或如权利要求43-45中任一项定义的宿主细胞以及适合的载体。

49.根据权利要求19、20或48中任一项的组合物，其为适于昆虫和/或蜘蛛类动物摄入的形式。

50.根据权利要求19、20或48的组合物，其是固体形式、液体形式或凝胶形式。

51.根据权利要求19、20或48的组合物，其是颗粒或粉末形式。

52.根据权利要求19、20或48中任一项的组合物，其为诱饵的形式。

53.根据权利要求52的组合物，其中所述诱饵还包含至少一种食物或者硼酸或引诱剂和/或信息素。

54.根据权利要求52的组合物，其中所述诱饵还包含至少一种基于蛋白质的食物。

55.根据权利要求19、20或48中任一项的组合物，其中所述组合物被存放在昆虫和/或蜘蛛类动物为了摄取该组合物能够进入的室或诱捕器中。

56.根据权利要求19、20或48中任一项的组合物，其是喷雾剂的形式。

57.根据权利要求19、20或48中任一项的组合物，其是加压的/气溶胶化的喷雾剂或者泵式喷雾剂的形式。

58.根据权利要求19、20或48中任一项的组合物，其是在适合表面上的涂料形式，当昆虫和/或蜘蛛类动物与所述涂料接触时，所述涂料就附着于昆虫和/或蜘蛛类动物。

59.根据权利要求19、20或48中任一项的组合物，其中所述载体是带静电的粉末或颗粒和/或磁性颗粒和/或金属颗粒，其中所述金属颗粒初始时是未磁化的，但是当其被置于由昆虫和/或蜘蛛类动物体提供的电场中时能被磁性极化，其附着于昆虫和/或蜘蛛类动物的表皮。

60.根据权利要求19、20或48中任一项的组合物，其中所述载体提高有害生物对双链RNA的摄取。

61.权利要求60的组合物，其中所述载体是基于脂质的载体，包括一种或者多种的水包油乳剂、胆固醇、胶束、脂多胺和脂质体。

62.权利要求60的组合物，其中所述载体是核酸凝聚剂。

63.根据权利要求60的组合物，其中所述载体是亚精胺或者硫酸鱼精蛋白。

64.权利要求19、20或者48中任一项的组合物，其与另外的杀虫剂相组合。

65.权利要求64的组合物，其中所述另外的杀虫剂选自毒死蜱、丙烯菊酯、苄呋菊酯、四溴乙基、二羟甲基-环丙烷羧酸、氟蚁腙、齐螨素、毒死蜱、氟虫胺、烯虫炔酯、氟虫腈、异丙基苯基氨基甲酸甲酯、茚虫威、多氟脲、炔咪菊酯(PARA)、阿维菌素和吡虫啉。

66.用于昆虫和/或蜘蛛类动物的室或诱捕器，其包含如权利要求48-54或者59-65中任一项定义的组合物。

67.如权利要求6-14和40中任一项定义的RNA构建体和/或如权利要求41中定义的DNA构建体和/或如权利要求42中定义的表达构建体和/或如权利要求43-45中任一项定义的宿主细胞和/或如权利要求48-65中任一项定义的组合物和/或如权利要求66中定义的室或诱捕器通过RNA干扰防治昆虫和/或蜘蛛类动物的用途。

68.根据权利要求67的用途，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物是居室昆虫、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物。

69.根据权利要求67的用途，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物是蟑螂。

70.根据权利要求68的用途，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物选自小蠊属(Blattella spp.)、大蠊属(Periplaneta spp.)、蜚蠊属(Blatta spp.)、蠊属(Supella spp.)、火蚁属(Solenopsis spp.)、小家蚁属(Monomoriumspp.)、弓背蚁属(Camponotus spp.)、毛蚁属(lasius spp.)、铺道蚁属(Tetramorium spp.)、红蚁属(Myrmica spp.)、蚁属(Formica spp.)、举腹蚁属(Crematogaster spp.)、虹臭蚁属(Iridomyrmex spp.)、大头蚁属(Pheidole spp.)、Dasymutilla spp.、暗白蚁属(Amitermes spp.)、散白蚁属(Reticulitermes spp.)、家白蚁属(Coptotermes spp.)、楹白蚁属(Incisitermes spp.)和新白蚁属(Neotermes spp.)。

71.根据权利要求68的用途，其中昆虫和/或蜘蛛类动物是蚂蚁。

72.根据权利要求70的用途，其中所述昆虫是德国小蠊(Blatellagermanica)、美洲大蠊(Periplaneta Americana)、澳洲大蠊(Periplanetaaustraliasiae)、东方蜚蠊(Blatta orientalis)或褐带蠊(Supellalongipalpa)。

73.根据权利要求22、30或67-72中任一项的用途，其中使所述昆虫和/或蜘蛛类动物生长延迟、麻痹、使其不育或者被杀伤。

74.防治昆虫和/或蜘蛛类动物的方法，其包括向昆虫和/或蜘蛛类动物施用：

(i)如权利要求6-14和40中任一项定义的包含至少一个双链RNA区的RNA构建体，和/或

(ii)如权利要求41中定义的包含编码RNA构建体的区域的DNA构建体，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iii)如权利要求42中定义的包含DNA构建体的表达构建体，所述DNA构建体包含编码RNA构建体的区域，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iv)如权利要求43-45中任一项定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体和/或(iii)的所述表达构建体的宿主细胞，和/或

(v)如权利要求48-65中任一项定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体、(iii)的所述表达构建体和/或(iv)的所述宿主细胞的组合物，和/或

(vi)如权利要求21或66中定义的含有(v)的所述组合物的室或诱捕器，其中所述双链RNA能通过RNA干扰下调至少一种昆虫和/或蜘蛛类动物基因的表达。

75.权利要求74的方法，其中施用多种如权利要求6-14和40中任一项定义的RNA构建体和/或如权利要求41中定义的DNA构建体和/或如权利要求42中定义的表达构建体和/或如权利要求43-45中任一项定义的宿主细胞和/或如权利要求48-65中任一项定义的组合物和/或如权利要求21或66中定义的室或诱捕器。

76.权利要求75的方法，其中所述的多种如权利要求6-14和40中任一项定义的RNA构建体和/或如权利要求41中定义的DNA构建体和/或如权利要求42中定义的表达构建体和/或如权利要求43-45中任一项定义的宿主细胞和/或如权利要求48-65中任一项定义的组合物和/或如权利要求21或66中定义的室或诱捕器被依次施用，以降低有害生物获得抗性的可能性。

77.根据权利要求74-76中任一项的方法，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物是居室昆虫、外寄生物和涉及公众健康和卫生的昆虫和/或蜘蛛类动物。

78.根据权利要求74-76中任一项的方法，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物是蟑螂。

79.根据权利要求74-76任一项的方法，其中所述昆虫和/或蜘蛛类动物选自小蠊属(Blattella spp.)、大蠊属(Periplaneta spp.)、蜚蠊属(Blatta spp.)、蠊属(Supella spp.)、火蚁属(Solenopsis spp.)、小家蚁属(Monomorium spp.)、弓背蚁属(Camponotus spp.)、毛蚁属(lasiusspp.)、铺道蚁属(Tetramorium spp.)、红蚁属(Myrmica spp.)、蚁属(Formica spp.)、举腹蚁属(Crematogaster spp.)、虹臭蚁属(Iridomyrmex spp.)、大头蚁属(Pheidole spp.)、Dasymutilla spp.、暗白蚁属(Amitermes spp.)、散白蚁属(Reticulitermes spp.)、家白蚁属(Coptotermes spp.)、楹白蚁属(Incisitermes spp.)和新白蚁属(Neotermes spp.)。

80.根据权利要求74-76中任一项的方法，其中所述昆虫是德国小蠊(Blatella germanica)、美洲大蠊(Periplaneta Americana)、澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae)、东方蜚蠊(Blatta orientalis)或褐带蠊(Supella longipalpa)。

81.根据权利要求27-29或74-76中任一项的方法，其中使所述昆虫和/或蜘蛛类动物生长延迟、麻痹、使其不育或者被杀伤。

82.用于权利要求74-81中任一项所述方法的试剂盒，其包含

(i)如权利要求6-14和40中任一项定义的包含至少一个双链RNA区的RNA构建体，和/或

(ii)如权利要求41中定义的包含编码RNA构建体的区域的DNA构建体，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iii)如权利要求42中定义的包含DNA构建体的表达构建体，所述DNA构建体包含编码RNA构建体的区域，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iv)如权利要求43-45中任一项定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体和/或(iii)的所述表达构建体的宿主细胞，和/或

(v)如权利要求48-65中任一项定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体、(iii)的所述表达构建体和/或(iv)的所述宿主细胞的组合物，和/或

(vi)如权利要求21或66中定义的含有(v)的所述组合物的室或诱捕器，以及使用说明，其中所述双链RNA能通过RNA干扰下调至少一种有害生物基因的表达。

83.权利要求82的试剂盒，其包含

(i)多种如权利要求6-14和40中任一项定义的包含至少一个双链RNA区的RNA构建体，和/或

(ii)如权利要求41中定义的包含编码RNA构建体的区域的DNA构建体，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iii)如权利要求42中定义的包含DNA构建体的表达构建体，所述DNA构建体包含编码RNA构建体的区域，所述RNA构建体包含至少一个双链RNA区，和/或

(iv)如权利要求43-45中任一项定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体和/或(iii)的所述表达构建体的宿主细胞，和/或

(v)如权利要求48-65中任一项定义的包含(i)的所述RNA构建体、(ii)的所述DNA构建体、(iii)的所述表达构建体和/或(iv)的所述宿主细胞的组合物，和/或

(vi)如权利要求21或66中定义的含有(v)的所述组合物的室或诱捕器，其中每种双链RNA能通过RNA干扰下调至少一种有害生物基因的表达。

84.权利要求82的试剂盒，其中所述的多种如权利要求6-14和40中任一项定义的RNA构建体和/或如权利要求41中定义的DNA构建体和/或如权利要求42中定义的表达构建体和/或如权利要求43-45中任一项定义的宿主细胞和/或如权利要求48-65中任一项定义的组合物和/或如权利要求21或66中定义的室或诱捕器被顺序地应用，以降低有害生物获得抗性的可能性。

85.用于产生权利要求2-14和40中任一项之RNA构建体的方法，其包括在允许所述RNA构建体表达的条件下培养如权利要求18或43-45中任一项定义的宿主细胞。

86.权利要求85的方法，其还包括纯化所述RNA构建体。

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