BRPI0613235A2 - rnai para o controle de insetos e aracnÍdeos - Google Patents

Abstract

RNAI PARA O CONTROLE DE INSETOS E ARACNÍDEOS, descreve uma nova abordagem sem base em composto para o controle de insetos e/ou de aracnídeos. Os presentes inventores identificaram, pela primeira vez, novos alvos para o RNAI que podem efetivamente controlar as populações de infestações de insetos e/ou de aracnídeos. Assim, a invenção proporciona seqüências de nucleotídeos e aminoácidos para os novos alvos. Também são fornecidas construções de RNA, incluindo regiões de RNA de dupla cepa para a mediação do RNAi em insetos, construções de DNA, vetores de expressão, células hospedeiras e composições para o controle de insetos e/ou de aracnídeos usando RNAi. Finalmente, a invenção também proporciona o uso de construções, vetores, células hospedeiras e composições no controle de populações de isentos e/ou de aracnídeos, e Kits adequados para uso em um método baseado em RNAi para o controle de infestações de insetos e/ou de aracnídeos.

Description

RNAI PARA O CONTROLE DE INSETOS E ARACNÍDEOS.

Campo da invenção.

A presente invenção se refere ao campo do silenciamento de genes

mediados por RNA de dupla fita (dsRNA) em espécies de insetos. Mais

particularmente, a presente invenção se refere a construções genéticas

projetadas para a expressão do dsRNA correspondentes aos novos alvos

identificados pela primeira vez na presente. Essas construções são

particularmente úteis para o controle de infestações de insetos mediado por

dsRNA, especialmente o controle de insetos domésticos ou aracnídeos, por exemplo, baratas.

Histórico da invenção.

O controle de infestações e particularmente o controle de insetos

e/ou de aracnídeos, especialmente o controle de insetos domésticos, de

ectoparasitas e de insetos relevantes para a saúde e a higiene públicas (ex.,

proteção urbana), como baratas, pulgas, formigas, cupins, centopéias,

mosquitos, moscas e grilos domésticos é um campo importante. A presença

de insetos em locais como o lar, escritórios, restaurantes, hospitais ou

armazéns causa, sem dúvidas, problemas porque existe uma percepção

pública comum que os insetos como baratas ou moscas vivem em locais sujos e não bem mantidos.

Esses insetos não somente causam problemas, como também contaminam os alimentos e os utensílios de mesa, destroem tecidos e produtos de papel, manchando e proporcionando odores desagradáveis às superfícies com as quais têm contato. Além disso, esses insetos podem induzir riscos à saúde como portadores de bactérias. Por exemplo, as baratas podem transmitir bactérias que envenenam os alimentos (Salmonella spp. e Shigella spp.). Acredita-se que as baratas alemãs sejam capazes de transmitir organismos causadores de doenças, como o Staphylococcus spp., Streptoeoeeus spp., o vírus da hepatite e bactérias coliformes. Também estão implicadas na difusão do tifo e da disenteria. Algumas pessoas, especialmente as que sofrem de <653

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asma, são sensíveis aos alérgenos produzidos por essas baratas.

Existem vários inseticidas químicos e dispositivos para a captura, desenvolvidos e disponíveis no comércio para o combate às pragas domésticas. Entretanto, a maior eficácia desses meios está normalmente ligada a um maior risco à saúde. Os inseticidas podem contaminar os alimentos, o que se torna quase inevitável em locais como cozinhas, restaurantes ou depósitos de alimentos, e a incorporação pode provocar riscos de saúde aos humanos.

A solução para este problema de contaminação foi usar menos inseticidas tóxicos. Entretanto, ao aplicar inseticidas menos tóxicos, existe uma maior probabilidade de o inseto se tornar resistente com o tempo.

Os inseticidas atuam pela ligação a determinadas proteínas do inseto, como a um receptor acetilcolina, por exemplo, e provoca a morte da espécie de praga pela desativação ou pela super-ativação da proteína. Os inseticidas foram desenvolvidos para serem seguros em determinadas concentrações, mas podem, e têm impacto, sobre a saúde humana quando incorporados em maiores dosagens ou por longos períodos. Ao contrário dos agroquímicos, os inseticidas domésticos são aplicados em locais onde é guardada ou preparada a comida, e a contaminação dos alimentos e o contato '20 com as pessoas não podem ser evitados.

Uma alternativa aos pesticidas químicos é a utilização de agentes biológicos. Nos últimos anos, a regulação para baixo dos genes (também denominada de "silenciamento de genes") em organismos multicelulares por meio da interferência de RNA ou "RNAi", tornou-se uma técnica bem 2 5 estabelecida.

Em geral, o RNAi compreende o contato do organismo com um fragmento de RNA de dupla fita ou "dsRNA" (em geral como duas fitas simples complementares aneladas de RNA ou como uma construção em hairpin) que compreende uma seqüência de nucleotídeos que corresponde à (ou pelo menos a uma parte) da seqüência de nucleotídeos do gene a ser 3/81

regulado para baixo (o "gene alvo"). Entre outros, é feita referência ao pedido internacional WO 99/32619 (Carnegie Institute of Washington), ao pedido internacional WO 99/53050 (CSIRO), ao pedido internacional WO 00/01846 (Devgen) e a Fire et al., Nature, Vol. 391, pp.806-811, February 1998.

Nos nematódeos, o RNAi pode ser feito pela alimentação do nematódeo com o fragmento dsRNA como tal, ou de maneira alternativa com uma cepa bacteriana que contenha o fragmento dsRNA ou que, após a ingestão pelo nematódeo seja capaz de expressar o fragmento dsRNA. Para esta denominada "RNAi por alimentação", é feita referência, entre outras, ao pedido internacional WO 00/01846 pelo solicitante, e à WO 99/32619 supracitada, em que é usado o nematódeo C. elegans.

Muitas construções dsRNA foram descritas na técnica. Um dsRNA clássico é produzido a partir de uma construção DNA que compreende dois promotores convergentes flanqueando a seqüência complementar à seqüência alvo que deve ser regulada para baixo (ver, por exemplo, W000/01846 (Devgen)). Como a tecnologia de silenciamento de genes mediados por dsRNA avançou, foram projetadas novas construções para melhorar o dsRNA com vários objetivos.

Para produzir o dsRNA de forma mais eficiente, foi desenvolvida uma estrutura tipo "stem-loop-stem" ou "hairpin". Como descrito no, por exemplo, documento WO 99/53050

(CSIRO), este hairpin permite a formação do dsRNA a partir de uma simples transcrição de RNA. A transcrição de RNA compreende a versão no sentido e no anti-sentido da seqüência complementar, separada por uma estrutura não complementar em Ioop que permite que a transcrição de RNA dobre de volta para um par de base na porção de haste do dsRNA.

O silenciamento de genes dsRNA encontra aplicação em muitas áreas diferentes, como por exemplo o silenciamento de genes mediados por dsRNA em aplicações clínicas (W02004/001013) e em plantas. Em plantas, as construções dsRNA úteis para o silenciamento de genes também foram projetadas para serem clivadas e processadas em pequenos RNAs de interferência (siRNAs).

O RNAi também foi proposto como meio de proteção às plantas contra os nematódeos parasíticos das plantas, isto é, pela expressão na planta (ex., em toda a planta, ou em uma parte, um tecido ou uma célula da planta) uma ou mais seqüências de nucleotídeos que formam um fragmento dsRNA que corresponde a um gene alvo no nematódeo parasítico da planta essencial para o seu crescimento, reprodução e/ou sobrevivência. Pode ser feita referência ao pedido internacional WO 00/01846 do presente solicitante, Patente norte-americana 6,506,559 (baseada no WO 99/32619), e aos pedidos internacionais WO 01/96584, WO 01/37654 e WO 03/052110 para uma descrição dessas técnicas.

Elbashir et al. (Nature, 411, 494-498, 2001) demonstraram o efetivo silenciamento de genes mediado por RNAi em células de mamíferos usando fragmentos dsRNA de 21 nucleotídeos de comprimento (também denominados pequenos RNAs ou siRNAs de interferência).

O WO 03/004644 descreve a administração de dsRNA a artrópodes em termos gerais, estando incorporado ao presente por referência. O WO 03/004644 detalha a regulação para baixo do gene repórter GUS (Clonetech) usando RNAi na Drosophila melanogaster e a regulação para baixo do gene vATPase na H. armigera.

O WO 01/34815 menciona os vetores de expressão do baculovirus que produzem dsRNA e o uso desses vetores para o controle de pragas.

Apesar de a técnica do RNAi ser geralmente conhecida na técnica de células de plantas, de nematódeos e de mamíferos por alguns anos, até o presente muito pouco é conhecido sobre o uso do RNAi para regular para baixo a expressão do gene em insetos e/ou aracnídeos. Além disso, pouco é conhecido sobre a aplicação do RNAi para o controle de espécies de pragas como insetos domésticos, ectoparasitas e insetos e/ou aracnídeos relevantes para a saúde e higiene públicas. As construções adequadas e eficientes para o controle de infestações mediada por dsRNA, devem concordar com pelo menos alguns dos seguintes requisitos:

(1)O dsRNA deve ser absorvido pelos organismos da infestação;

(2) O dsRNA deve ter uma boa estabilidade nos organismos da infestação;

(3) O dsRNA deve ser efetivo nos organismos da infestação de maneira a controlar sua viabilidade, crescimento e/ou desenvolvimento; e/ou

(4) O dsRNA deve garantir a máxima segurança e o mínimo impacto ambiental.

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E agora o objetivo da presente invenção prover construções dsRNA que estejam em conformidade com os requisitos acima.

Descrição da invenção

A presente invenção descreve uma nova abordagem sem base em composto para o controle de insetos e/ou de aracnídeos. O princípio ativo é um ácido nucléico, um RNA de dupla fita (dsRNA), que pode ser usado como uma formulação inseticida ou aracnicida (por exemplo, em aplicações de iscas ou de gel). A seqüência do dsRNA combina com uma parte essencial de um gene do inseto e provoca a regulação para baixo do alvo inseto pela interferência RNA (RNAi). Como resultado da regulação para baixo do mRNA, o dsRNA evita a expressão da correspondente proteína do inseto, provocando assim a morte, a parada do crescimento ou a esterilidade do inseto e/ou do aracnídeo.

Alvos

Os presentes inventores identificaram pela primeira vez novos alvos para o RNAi, que podem controlar efetivamente as populações de insetos ou de aracnídeos.

Para evitar a dúvida, um alvo é definido na presente como um gene cujo produto de proteína é necessário para que o inseto e/ou o aracnídeo mantenha suas funções fisiológicas e bioquímicas normais. A inibição da expressão do gene alvo limita a capacidade do inseto e/ou do aracnídeo para alimentar-se, crescer ou sobreviver. Os exemplos de genes de insetos e/ou de aracnídeos que podem ser empregados na prática da invenção incluem genes essenciais, genes envolvidos em processos como desenvolvimento, metabolismo ou neurotransmissão e genes cujos produtos sejam alvos de inseticidas e/ou aracnicidas existentes. Em uma configuração preferida da invenção, o alvo faz parte das vias necessárias para a função celular, como a transcrição, a translação, o citoesqueleto, o ciclo celular, o metabolismo (anabolismo ou catabolismo), endocitose, transporte intraceluar e intercelular, ligação de cálcio, importação e exportação de núcleo, ligação com ácido nucléico, peptidase do sinal-ligação protéica, a proteassoma o transporte vesicular, neurotransmissão, balanço de água, balanço iônico, divisão, mitose, meiose, organização cromossômica, estabilidade ou integridade, micro RNAs, siRNAs, modificações da proteína pós-translacional, transporte de elétrons, apoptose, integridade de membrana e adesão celular.

Os novos genes alvo identificados na presente invenção compreendem:

A) proteínas estruturais, por exemplo, a tropomiosina 1 (GenBank AF260897) (SEQ ID Ν25 41 e 42), actina 5C (GenBank AY004248) (SEQ ID N- 57 e 58), e proteínas homólogas e heterólogas com a mesma função biológica na mesma ou em outras espécies de insetos e/ou aracnídeos;

B) enzimas metabólicas, por exemplo, a HMG Coenzima A sintase (GenBank X73679) (SEQ ID N2 49 e 50), e proteínas homólogas e heterólogas com a mesma função biológica na mesma ou em outras espécies de insetos e/ou aracnídeos;

C) enzimas envolvidas na homeostase de íons/ pH, como a V- ATPase. e proteínas homólogas e heterólogas com a mesma função biológica na mesma ou em outras espécies de insetos e/ou aracnídeos;

D) enzimas envolvidas no maquinário transcripcional/translacional, como por exemplo:

Homólogo S4 da proteína ribossômica (SEQ ID N- 1 e 2); Homólogo S9 da proteína ribossômica (SEQ ID N- 11 e 12); Homólogo L9 da proteína ribossômica (SEQ ID N- 21 e 22); e Homólogo L19 da proteína ribossômica (SEQ ID N- 31 e 32). Assim, de acordo com um primeiro aspecto, é provida uma molécula de ácido nucléico que compreende a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em quaisquer das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180 e 181, ou uma seqüência de nucleotídeos ortóloga de uma espécie de inseto e/ou aracnídeo, caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeos ortóloga tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos75%, 80%, 85%, 90%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos de quaisquer das SEQ ID Nss 1, 11, 21 e 31. As seqüências ortólogas preferidas compreendem, ou, caso usadas de acordo com os métodos da invenção incluem, seqüências de insetos domésticos, ectoparasitas e insetos e/ou aracnídeos relevantes para a saúde e higiene públicas como, por exemplo e sem limitações, moscas, ácaros de aranhas, tripses, carrapatos, ácaros vermelhos das aves, formigas, baratas, cupins, grilos incluindo grilos domésticos, traças de livros, piolhos de livros, besouros, centopéias, mosquitos e pulgas. As seqüências ortólogas mais preferidas são as de baratas (Blattodea), como sem limitações, a Blatella spp. (ex., Blatella germanica (barata alemã)), Periplaneta spp. (ex., Periplaneta americana (Barata americana) e Periplaneta australiasiae (Barata australiana)), Blatta spp. (ex., Blatta orientalis (Barata oriental)) e Supella spp. (ex., Supella Iongipalpa (barata de estrias marrons); formigas (Formicoidea), como sem limitações a Solenopsis spp. (ex. Solenopsis invicta (Formiga do Fogo)), Monomorium spp. (ex., Monomorium pharaonis 6S°í

(Formiga Faraó)), Camponotus spp. (ex., Camponotus spp (Formigas carpinteiras)), lasius spp. (ex., Iasius niger (Pequena formiga negra)), Tetramorium spp. (ex., Tetramorium caespitum (Formiga do solo)), Myrmica spp. (ex., Myrmiea rubra (Formiga Vermelha)), Formiea spp (Formiga da madeira), 'Crematogaster spp. (ex., Crematogaster lineolata (Formiga Acrobata)), Iridomyrmex spp. (ex., Iridomyrmex humilis (Formiga Argentina)), Pheidole spp. (Formigas de Cabeças Grandes), e Dasymutilla spp. (ex., Dasymutilla oceidentalis (Formiga Veludo)); cupins (Isoptera e/ou Termitidae) como sem limitações a Amitermes spp. (ex., Amitermes floridensis (Ácaro subterrâneo de asas negras da Flórida)), Reticulitermes spp. (ex., Reticulitermes flavipes (ácaro subterrâneo do Iestey), Reticulitermes hesperus (Ácaro Subterrâneo do Oeste)), Coptotermes spp. (ex., Coptotermes formosanus (Ácaro Subterrâneo de Formosa)), Ineisitermes spp. (ex., Incisitermes minor (Ácaro Ocidental da Madeira Seca)) e Neotermes spp. (ex., Neotermes connexus (Ácaro de Árvores das Florestas)).

De acordo com um outro aspecto, é provida uma molécula de ácido nucléico compreendendo e consistindo essencialmente de, ou consistindo da seqüência de nucleotídeos indicada em uma das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179 e 188 a 200.

As SEQ ID N— 4, 6, 7, 16, 27, 26, 27, 36 e 37 representam as seqüências de nucleotídeos de prímeros específicos que foram utilizados para identificar as novas seqüências da invenção de maneira seletiva e específica. Os novos genes identificados representam componentes do

maquinário transcrípcional/translacional da Blatella germanica. Pela inibição da expressão desses genes ou pela inibição da expressão dos novos genes alvos identificados, pelo RNAi, uma importante infestação pode ser controlada.

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E previsto, e seria compreendido pelos técnicos no assunto, que também os ortólogos desses novos genes alvos representam outros alvos para a regulação para baixo η controle de outra espécie de inseto e/ou aracnídeo. Assim, são também contemplados os ortólogos das novas moléculas de ácido nucléico da presente invenção.

As seqüências protéicas ou de nucleotídeos são provavelmente homólogas se demonstrarem um nível "significativo" de similaridade seqüencial ou de identidade. As seqüências verdadeiramente homólogas estão relacionadas pela divergência de um gene ancestral comum. Homólogos seqüenciais podem ser de dois tipos: (i) onde existirem homólogos em diferentes espécies, são conhecidos como ortólogos, por exemplo, os genes a- globina no camundongo e nos humanos são ortólogos, (ii) os parálogos são genes homólogos dentro de uma única espécie, ex., os genes α e β globina no camundongo, são parálogos. Como "ortólogos" são denominados no presente ambos os tipos de homólogos acima mencionados.

Em uma configuração, o ortólogo compartilhará pelo menos cerca de 40%, 50% ou 60 % da identidade da seqüência de nucleotideo.com a seqüência de nucleotídeos indicada em uma das SEQ ID N- 1, 11, 21, 31, 41, 49 ou 57. De preferência, o ortólogo compartilhará pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade seqüencial da seqüência de nucleotídeos indicada em uma das SEQ IDN- 1, 11, 21, 31, 41, 49 ou 57.

De acordo com uma outra configuração, a invenção engloba genes alvos que são ortólogos de insetos ou de Aracnidase de um gene que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de uma seqüência de nucleotídeos como representada em quaisquer das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63; 64, 151 a 179, e 188 a 200. Como exemplo, os ortólogos podem compreender uma seqüência de nucleotídeos como representada em quaisquer das SEQ ID N- 71 a 200, ou um fragmento de pelo menos 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27 de seus nucleotídeos. É fornecida uma lista não limitativa de genes ortólogos de insetos ou aracnídeos ou seqüências compreendendo pelo menos um fragmento de 17 nucleotídeos de uma das seqüências da invenção nas Tabelas 4 e 5. As seqüências apresentadas nas Tabelas 4 e 5 pretendem fazer parte da presente invenção. Assim, os ortólogos compreendem, consistem essencialmente ou consistem de quaisquer das seqüências mencionadas nas Tabelas 4 e 5.

De acordo com um outro aspecto, a invenção engloba assim quaisquer dos métodos ora descritos para o controle de infestações ou infecção de insetos e/ou aracnídeos, compreendendo fazer o contato dos insetos e/ou aracnídeos com um RNA de dupla fita, caracterizado pelo fato de que o RNA de dupla fita compreende fitas complementares aneladas, uma das quais tem uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a pelo menos parte da seqüência de nucleotídeos de um gene alvo que compreende um fragmento de pelo menos 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos de quaisquer das seqüências representadas nas SEQID N- 71 a 200, em que o RNA de dupla fita é absorvido pelo inseto e/ou aracnídeo, controlando assim o crescimento, matando ou evitando a infestação ou a infecção pelo inseto e/ou aracnídeo. O referido inseto e/ou aracnídeo pode compreender, consistir essencialmente ou consistir de quaisquer organismos/espécies alvos ora descritos.

As moléculas de ácidos nucléicos relacionadas englobadas pela invenção também podem ser definidas em termos de hibridização com uma molécula de ácido nucléico que compreende a seqüência de nucleotídeos de quaisquer das SEQ ID N25 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180 e 181. De preferência, as condições de hibridização são moderadas condições de hibridização de estringência e ainda mais, de preferência, grandes condições de hibridização de estringência. Tais condições de moderada e alta estringência seriam imediatamente familiares para os técnicos no assunto. Por exemplo, uma reação de hibridização incubada a 42°C em uma solução compreendendo 50% de formamida, 5xSSC, e 1% SDS ou a 65°C em uma solução compreendendo 5xSSC e 1% SDS5 com uma adaptação em 0.2xSSC e 0,1% SDS a 65°C representam condições adequadas de alta estringência.

A invenção também provê os produtos protéicos desses novos genes alvos, e de seus ortólogos.

Assim, de acordo com um segundo aspecto, é provida uma proteína que compreende a seqüência aminoácida indicada em uma das SEQ ID Nq5 2, 12, 22 ou 32 ou uma proteína ortóloga tendo uma seqüência aminoácida conservada de uma outra espécie de inseto e/ou aracnídeo.

Como acima mencionado, é previsto também que ortólogos dos novos genes alvos representarão outros alvos para a regulação para baixo para o controle de outra espécie de inseto e/ou aracnídeo. Portanto, são também contemplados os ortólogos das novas moléculas protéicas da presente invenção.

Em uma configuração, o ortólogo compartilhará pelo menos cerca de 40% da identidade da seqüência aminoácida com a seqüência aminoácida indicada em uma das SEQ ID N- 2, 12, 22 ou 32. De preferência, o ortólogo compartilhará pelo menos cerca de 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 80%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 95% amino da identidade da seqüência aminoácida com a seqüência aminoácida indicada em uma das SEQ ID N- 2, 12, 22 ou 32.

Em uma outra configuração, a invenção também provê um ácido nucléico que codifica uma proteína que compreende uma seqüência aminoácida indicada em uma das SEQ ID N- 2, 12, 22 ou 32. As moléculas de ácidos nucléicos englobadas por este aspecto da invenção também incluem aquelas que são funcionalmente equivalentes pelo que codificam a mesma molécula de proteína. Assim, todas as moléculas de ácidos nucléicos que são M&KiateBj&ÍHaMtfe* vc ϊ&«τ tí-aK.í-tmw-Urâr Λ?*-,*»? S^--SrC. y-á ft. OSjFJ^V — "V ' ' £ 1^4** P-C.È-T 12/81 ^

possíveis devido à degenerescência do código genético devem se situar dentro do escopo deste aspecto da invenção.

Organismos/espécies alvos

As "espécies alvo" como usadas na presente invenção, podem ser uma espécie de inseto ou de aracnídeo que representa uma praga. O termo também se refere a um inseto ou a um aracnídeo em qualquer estágio de seu desenvolvimento. Como os insetos possuem um exoesqueleto não vivente, não podem crescer em uma taxa uniforme, crescendo, entretanto em estágios mudando periodicamente seus exoesqueletos. Esse processo é denominado de muda ou ecdise. Os estágios entre mudas são denominados como "instars", e este estágio pode ser visado de acordo com a invenção. Também, os ovos de insetos ou os insetos jovens também podem ser visados de acordo com a presente invenção. Todos os estágios no ciclo do desenvolvimento, que incluem a metamorfose nos pterigotos, podem ser visados pelo RNAi de acordo com a presente invenção. Assim, os estágios individuais como as larvas, pupas, ninfas, etc. do desenvolvimento podem ser visados.

As espécies alvo podem ser qualquer inseto ou aracnídeo, significando qualquer organismo ou espécie que pertence ao Reino dos Animais, mais especificamente à Phylum Arthropoda, e à Classe Insecta ou à ^O Classe Aracnidas. Os métodos da invenção se aplicam a todos os insetos e aracnídeos susceptíveis ao silenciamento de genes pela interferência do RNA que são capazes de internalizar o RNA de dupla fita de seu ambiente circundante.

Em uma configuração da invenção, o inseto ou o aracnídeo pode pertencer às seguintes ordens: Acari, Aracnida, Anoplura, Blattodea, Coleoptera, Collembola, Dermaptera, Dictioptera, Diplura, Diptera, Embioptera, Efemeroptera, Griloblatodea, Hemiptera, Heteroptera, Homoptera, Himenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Mecoptera, Neuroptera, Odonata, Orthoptera, Phasmida, Phithiraptera, Plecoptera, Protura, Psocoptera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Sternorrhyncha, •—•«-!«•λ»»*'.!» sua.. «j^r' :::.-·.., 13/81

Strepsiptera, Thysanoptera, Trichoptera, Zoraptera e Zygentoma.

Nas configurações preferidas, sem limitações, da invenção, o inseto ou aracnídeo é escolhido no grupo que consiste de:

1) Ácaros: ácaros, incluindo Ixodida (carrapatos);

2) Aracnidas: Araneae (aranhas) e Opiliones (aranha caseira), os exemplos incluem: Latrodectus maetans (viúva negra) e Loxosceles reeluse (Aranha Marrom);

3) Anoplura: parasita, como a Pedieulus humanus (parasita do corpo humano);

4) Blattodea: baratas incluindo a barata alemã (Blatella germanica), do gênero Periplaneta, incluindo a barata americana (Periplaneta americana) e a barata australiana (Periplaneta australiasiae), do gênero Blatta, incluindo a barata oriental (Blatta orientalis) e do gênero Supella, incluindo barata de estrias marrons (Supella longipalpa). O alvo mais preferido é a barata alemã (Blatella germanica);

5) Coleoptera: besouros, os exemplos incluem: a família do Caruncho (família das Bostrichoidea); Dendroctonus spp. (Besouro Negro, Besouro do Pinho, IPS Besouro Gravador); Besouros do Tapete (Anthrenus spp, Attagenus spp); Caruncho da madeira (família do Cerambycidae: Hylotrupes bajulus); Anobium punctatum; Tribolium spp (coleópteros); Trogoderma granarium (Besouro do arroz); Oryzaephilus sarinamensis (Besouro dos Grãos) etc. (larvas de livros)

6) Dermaptera: família das centopéias;

7) Diptera: mosquitos (Culicidae) e moscas (Brachycera), os exemplos são: Anophelinae como o Anopheles spp. e Culicinae como o Aedes fulvus; Tabanidae como o Tabanus punctifer (Mosca dos Cavalos), Glossina morsitans morsitans (mosca tsé-tsé), moscas de esgotos (Psychodidae) e Calyptratae como a Musca domestica (Mosca doméstica), moscas da carne (família das Sarcophagidae) etc.;

8) Heteroptera: percevejos, como o Cimex lectularius (percevejo de cama);

9) Hymenoptera: vespas (Apocrita), incluindo formigas (Formicoidea), abelhas (Apoidea): Solenopsis invicta (Formiga do Fogo), Monomorium pharaonis (Formiga Faraó), Camponotus spp (Formigas carpinteiras), lasius niger (Pequena formiga negra), tetramorium caespitum (Formiga do solo), Myrmica rubra (Formiga Vermelha), Formica spp (Formiga da madeira), Crematogaster lineolata (Formiga Acrobata), Iridomyrmex humilis (Formiga Argentina), Pheidole spp. (Formigas de Cabeças Grandes, Dasymutilla occidentalis (Formiga Veludo) etc.;

10) Isoptera: cupins, os exemplos incluem: Amitermes floridensis

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(Acaro subterrâneo de asas negras da Flórida), ácaro subterrâneo do leste (Reticulitermes flavipes), o R. hesperus

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(Acaro Subterrâneo do Oeste), Coptotermes formosanus

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(Acaro Subterrâneo de Formosa), Incisitermes minor (Acaro Ocidental da Madeira Seca), Neotermes connexus (Ácaro de

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Arvores das Florestas) e Termitidae;

11) Lepidoptera: Traças, os exemplos incluem: Tineidae & Oecophoridae como a Tineola bisselliella (Traça comum de roupas), e Pyralidae como a Pyralis farinalis (Traça de Alimentos) etc;

12) Psocoptera: piolhos de livros (Psocids);

13) Siphonaptera: pulgas como a Pulex irritans;

14) Sternorrhyncha: afídeos (Aphididae); e

15) Zygentoma: traças de livros, os exemplos são: Thermobia domestica e Lepisma saccharina Os insetos ou aracnídeos alvo preferidos incluem insetos domésticos, ectoparasitas e insetos e/ou aracnídeos relevantes para a saúde e higiene públicas como, por exemplo, e sem limitações, moscas, ácaros de aranhas, tripses, carrapatos, ácaros vermelhos das aves, formigas, baratas, cupins, grilos incluindo grilos domésticos, traças de livros, piolhos de livros, besouros, centopéias, mosquitos e pulgas. Os alvos mais preferidos são as baratas (Blattodea) como, sem limitações, a Blatella spp. (ex., Blatella germanica (barata alemã)), Periplaneta spp. (ex., Periplaneta americana (Barata americana) e Periplaneta australiasiae (Barata australiana)), Blatta spp. (ex., Blatta orientalis (Barata oriental)) e Supella spp. (ex., Supella longipalpa (barata de estrias marrons); formigas (Formicoidea), como, sem limitações, a Solenopsis spp. (ex., Solenopsis invicta (Formiga do Fogo)), Monomorium spp. (ex., Monomorium pharaonis (Formiga Faraó)), Camponotus' spp. (ex., Camponotus spp (Formigas carpinteiras)), lasius spp. (ex., lasius niger (Pequena formiga negra)), Tetramorium spp. (ex., Tetramorium caespitum (Formiga do solo)), Myrmica spp. (ex.,Myrmica rubra (Formiga Vermelha)), Formica spp (Formiga da madeira), Crematogaster spp. (ex., Grematogaster lineolata (Formiga Acrobata)), Iridomyrmex spp. (ex., Iridomyrmex humílis (Formiga Argentina)), Pheidole spp. (Formigas de Cabeças Grandes), e Dasymutilla spp. (ex., Dasymutilla occidentalis (Formiga Veludo)); cupins (Isoptera e/ou Termitidae) como, sem limitações, a Amitermes spp. (ex., Amitermes floridensis (Ácaro subterrâneo de asas negras da Flórida)), Reticulitermes spp. (ex., Reticulitermes flavipes (ácaro subterrâneo do Iestq),Reticulitermes hesperus (Ácaro Subterrâneo do Oeste)), Coptotermes spp. (ex., Coptotermes

r s

formosanus (Acaro Subterrâneo de Formosa)), Incisitermes spp. (ex., Incisitermes minor (Acaro Ocidental da Madeira Seca)), Neotermes spp.

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(ex., Neotermes connexus (Acaro de Arvores das Florestas)). Os alvos mais preferidos são as baratas. Um alvo mais preferido é a barata alemã CBlatella germanica). J 16/81

Construções de RNA

"Complementar" significa que a fita de RNA representa o equivalente RNA à seqüência especificada, se essa seqüência for uma seqüência de DNA ou do equivalente RNA do complemento da seqüência do DNA.

A presente invenção se refere a outros alvos para a regulação para baixo mediada por RNAi da expressão do gene. Para todos os alvos ora identificados, é provido um outro aspecto da invenção, uma construção RNA compreendendo uma região de RNA de dupla fita, pelo menos uma fita iI 0 compreendendo uma seqüência de nucleotídeos complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos de qualquer uma das (i) moléculas alvo de ácido nucléico definidas em uma das SEQ ID N25 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180 e 181; ou (ii) as moléculas de ácido nucléico que compreendem a seqüência de nucleotídeos indicada em uma das SEQ ID Nqs 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147; 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200, ou uma das seqüência de nucleotídeos ortóloga de uma espécie de inseto e/ou aracnídeo. Como acima descrito, o ortólogo pode compartilhar pelo menos cerca de 50% da seqüência da identidade de nucleotídeos com a ύο seqüência de nucleotídeos indicada em uma das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 11, 16, 17, 21, 26, 27, 31, 36, 37, 41, 43, 44, 49, 51, 52 e 57. De preferência, o ortólogo compartilhará pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, mais de preferência pelo menos cerca de 95% e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade da seqüência com a seqüência de nucleotídeos indicada em uma das SEQ ID Nas 1, 4, 6, 7, 11, 16, 17, 21, 26, 27, 31, 36, 37, 41, 43, 44, 49, 51, 52 e 57.

Como acima mencionado, os ortólogos dos alvos ora identificados na Blatella germanica são considerados como alvos viáveis em outras espécies de inseto e/ou aracnídeo, incluindo insetos e/ou aracnídeos domésticos, ectoparasitas e insetos relevantes para a saúde e higiene públicas como, por exemplo e sem limitação, moscas, ácaros de aranhas, tripses, carrapatos, ácaros vermelhos das aves, formigas, baratas, cupins, grilos incluindo grilos domésticos, traças de livros, piolhos de livros, besouros, centopéias, mosquitos e pulgas.

Os alvos mais preferidos provêm de baratas, por exemplo baratas do gênero Blatella, incluindo a barata alemã (,Blatella germanica), do gênero Periplaneta, incluindo Barata americana (.Periplaneta americana) e a barata australiana (Periplaneta australiasiae), do gênero Blatta, incluindo a barata oriental (Blatta orientalis) e do gênero Supella, incluindo barata de estrias marrons (Supella longipalpa). O alvo mais preferido é a barata alemã (Blatella germanica), onde foram identificados os novos alvos.

Foi comunicado anteriormente ser desejável a formação de RNAs de curta interferência (siRNAs) com cerca de 21 bp para um efetivo silenciamento de genes. Entretanto, nos pedidos do solicitante foi demonstrado que o comprimento mínimo do dsRNA é, de preferência, pelo menos cerca de 80-100 bp para que seja absorvido de maneira eficiente por determinados organismos de infestações. Existem indicações de que nos invertebrados, como um nematódeo C. elegans ou no nematódeo parasítico de plantas Meloidogyne incógnita esses maiores fragmentos são mais efetivos para o silenciamento de genes, possivelmente devido a uma captação mais eficiente desses longos dsRNA pelos invertebrados.

Foi recentemente sugerido que os dúplex sintéticos de RNA consistindo de RNAs 27-mer curto ou rombo do hairpin (sh) com hastes 29 bp e 2-nt 3' projeções são indutores mais potentes de interferência de RNA que os siRNAs 21-mer convencionais (ver Williams, Nature Biotechnology Vol 23, 2, Feb 2005, 181 e Kim et al, Nature Biotechnology Vol 23, 2, Feb 2005, 222-229 e Siolas et al, Nature Biotechnology Vol 23, 2, Feb 2005, 227-231 cujas referências estão ora incorporadas na totalidade). Assim, as moléculas baseadas nos alvos acima identificados e sendo tanto de RNAs 27-mer curto ou rombo do hairpin (sh) com hastes 29-bp e projeções 2-nt 3' estão também incluídos no escopo da invenção.

Portanto, em uma configuração, a construção de RNA tem uma região de RNA de dupla fita, mais comprida do que pelo menos cerca de 17 bp, preferivelmente pelo menos que cerca de 21 bp, mais de preferência entre cerca de 20-1500 bp, ainda mais de preferência entre cerca de 80 - 1000 bp e mais de preferência entre cerca de 17-27 bp ou entre cerca de 80-250 bp; como regiões RNA de dupla fita cerca de 17 bp, 18 bp, 20 bp, 21 bp, 22 bp, 23 bp, 24 bp, 25 bp; 26 bp, 27 bp, 50 bp, 80 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 250 bp, 300 bp, 350 bp, 400 bp,-450 bp, 500 bp, 550 bp, 600 bp, 650 bp, 700 bp, 900 bp, 100 bp, 1100 bp, 1200 bp, 1300 bp, 1400 bp ou 1500 bp.

O limite superior de comprimento do RNA de dupla fita pode ser dependente i) da exigência que o dsRNA seja absorvido pelo inseto e/ou aracnídeo e ii) da exigência de que o dsRNA seja processado na célula relevante em fragmentos que direcionem o RNAi. O comprimento escolhido também pode ser influenciado pelo método de síntese do RNA e pelo modo de administração do RNA para a célula. De preferência, o RNA de dupla fita a ser usado nos métodos da invenção terá comprimento menor que 10,000 bp, mais de preferência 1000 bp ou menos, mais de preferência 500 bp ou menos, mais de preferência 300 bp ou menos, mais de preferência 100 bp ou menos.

A eficácia, em termos de controle de pragas, pode ser aumentada visando múltiplos genes alvos com uma única construção de RNA. Assim, a praga tem menor probabilidade de sobrevivência e de adquirir resistência, porque existirão múltiplos RNAs de dupla fita mediando a interferência do RNA, possivelmente ao mesmo tempo ou possivelmente em cascata.

Os métodos da invenção incluem a provisão simultânea ou seqüencial de dois ou mais diferentes RNAs de dupla fita ou de construções RNA para o mesmo inseto e/ou aracnídeo, de maneira a obter a regulação para baixo ou a inibição de múltiplos genes alvo ou obter uma inibição mais potente de um único gene alvo.

De acordo com uma outra configuração, a construção de RNA de acordo com a invenção compreende pelo menos uma região de RNA de dupla fita, pelo menos uma que compreende uma seqüência de nucleotídeos complementar à uma porção de quaisquer das seqüências de nucleotídeos ora descritas, caracterizado pelo fato de que a complementaridade da referida seqüência de nucleotídeo compreende pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade da seqüência (i) da porção da seqüência de nucleotídeos das moléculas do ácido nucléico como estabelecida em qualquer das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180 e 181 ou (ii) as moléculas do ácido nucléico que compreendem a seqüência de nucleotídeos indicada em uma das SEQ ID Nas 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200, ou uma sua seqüência de nucleotídeos ortóloga de uma espécie de inseto e/ou aracnídeo, caracterizada pelo fato de que a porcentagem da identidade seqüencial é calculada no mesmo comprimento.

- "No mesmo comprimento" significa que quando a identidade % é calculada entre seqüências, isto é feito no stretch correspondente de nucleotídeos em ambas as seqüências.

De maneira alternativa; múltiplos genes alvos são regulados para baixo pela provisão de um RNA de dupla fita que atua contra múltiplas seqüências alvo. De maneira alternativa, um único alvo pode ser inibido com maior eficiência pela presença de mais de uma cópia do fragmento de RNA de dupla fita que corresponde ao gene alvo. Assim, em uma configuração da invenção, a construção do RNA de dupla fita compreende múltiplas regiões dsRNA, pelo menos uma fita de cada região dsRNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeos complementar a pelo menos parte de uma seqüência de nucleotídeos alvo de um inseto e/ou aracnídeo gene alvo. De acordo com a invenção, as regiões dsRNA na construção RNA podem ser £7/

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complementares ao mesmo ou a diferentes genes alvos e/ou as regiões dsRNA podem ser complementares aos genes alvos da mesma espécie ou de diferentes espécies de inseto e/ou aracnídeo.

Assim, a invenção provê um RNA isolado de dupla fita ou uma construção RNA da invenção que compreende pelo menos duas regiões de RNA de dupla fita, pelo menos uma fita de cada que compreende, consiste essencialmente ou consiste de uma seqüência de nucleotídeos complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos de quaisquer das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200, ou uma seqüência de nucleotídeos ortóloga de uma espécie de inseto e/ou aracnídeo, caracterizada pelo fato de que a seqüência de nucleotídeos ortóloga tem pelo menos 70%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 95% ou pelo menos 99% da identidade da seqüência com pelo menos a porção relevante da seqüência de nucleotídeo de quaisquer das SEQ ID N- 1, 11, 21 e 31 ou as moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos indicada em uma das SEQ ID N2s 41, 43, 44, 49, 51, 52 e 57. De preferência, o referido RNA „ de dupla fita ou a construção RNA compreende, consiste essencialmente ou 2 o consiste de uma ou pelo menos duas seqüências de nucleotídeos escolhidas de maneira independente de quaisquer das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200, De preferência, 2 5 qualquer SEQ ID N- 65 a 70.

Assim, em uma configuração da invenção, a construção RNA compreende múltiplas regiões dsRNA, pelo menos uma fita de cada região dsRNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos de um gene alvo da espécie de inseto e/ou aracnídeo. De acordo com a invenção, as regiões dsRNA na construção RNA podem ser complementares ao mesmo ou a diferentes genes alvos; as regiões dsRNA podem ser complementares aos alvos da mesma ou de diferentes espécies de insetos.

As regiões dsRNA podem ser combinadas como a seguir:

a) Quando múltiplas regiões dsRNA objetivando um único gene alvo são combinadas, podem ser combinadas na ordem original (isto é, na ordem em que os fragmentos aparecem no gene alvo) na construção RNA5

b) de maneira alternativa, a ordem original dos fragmentos pode ser ignorada, de maneira que sejam misturados e combinados randomicamente ou deliberadamente em qualquer ordem na construção RNA5

c) de maneira alternativa, um único fragmento pode ser repetido várias vezes, por exemplo, de 1 a 10 vezes, ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes na construção RNA, ou

d) as regiões dsRNA (objetivando um ou diferentes genes alvos) podem ser combinadas na orientação do sentido ou do anti- sentido.

Além disso, o(s) gene(s) alvo(s) a se combinar(em) pode(m) ser escolhido(s) de uma ou mais das seguintes categorias de genes (incluindo todas as suas possíveis combinações, como adequado):

e) genes "essenciais" ou "genes patogênicos" incluem genes vitais para um ou mais insetos e/ou aracnídeos alvos e resultam em um fenótipo letal ou severo (ex., movimento, alimentação, paralisia, bebida, fertilidade, reprodução, crescimento) quando silenciados. A escolha de um potente gene alvo letal resulta em um potente efeito RNAi. Nas construções RNA da invenção, múltiplas regiões dsRNA objetivando os mesmos ou diferentes (muito efetivos) genes letais podem ser combinados para um maior aumento da potência, da eficácia ou da velocidade do efeito RNAi no controle do inseto e/ou do aracnídeo.

f) genes "fracos" incluem genes alvos com uma função particularmente interessante em uma das vias celulares ora descritas, mas que resultam em um fraco efeito fenotípico quando silenciados independentemente. Nas construções RNA da invenção, múltiplas regiões dsRNA objetivando um único ou diferentes gene(s) fraco(s) podem ser combinadas para obter um maior efeito RNAi.

g) genes "específicos de inseto e/ou aracnídeo" incluem genes e porções de genes que não possuem contraparte substancialmente homóloga nos organismos de não infestação como pode ser determinado por buscas bioinformáticas de homologia, por exemplo por buscas BLAST. A escolha de um gene alvo de inseto e/ou aracnídeo específico ou de uma sua porção resulta em um efeito RNAi específico da espécie, sem efeito ou sem efeito substancial (adverso) nos organismos não alvo.

h) "genes conservados" incluem genes que são conservados (no nível aminoácido) entre o organismo alvo e o(s) organismo(s) não alvo. Para reduzir os possíveis efeitos sobre espécies não alvo, são analisados esses genes efetivos, mas conservados, e as seqüências alvo de regiões variáveis desses genes conservados são escolhidas para serem objetivadas pelas regiões dsRNA na construção RNA. Aqui, a conservação é avaliada no nível da seqüência do ácido nucléico. Essas regiões variáveis incluem assim as seções menos conservadas, no nível da seqüência do ácido nucléico, do(s) gene(s) alvo conservado(s).

i) genes "via conservada" incluem os genes que estão envolvidos na mesma via biológica ou processo celular ou que incluem genes que possuem a mesma funcionalidade em diferentes espécies de inseto e/ou aracnídeo, resultando em um específico e potente efeito RNAi e em um controle de infestação mais eficiente;

j) de maneira alternativa, as construções RNA de acordo com a presente invenção visam múltiplos genes de diferentes vias biológicas, resultando em um maior efeito, celular RNAi e em um controle mais eficiente do inseto e/ou aracnídeo.

De preferência, todas as regiões de RNA de dupla fita compreendem pelo menos uma fita complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos de quaisquer das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31,36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200. Entretanto, desde que uma das regiões RNA de dupla fita compreenda pelo menos uma fita complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos de quaisquer das SEQ ID N25 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200, as outras regiões de RNA de dupla fita podem compreender pelo menos uma fita complementar a uma porção de qualquer gene alvo da espécie de inseto e/ou aracnídeo (incluindo conhecidos genes alvos).

A invenção também provê quaisquer das construções RNA descritas na presente, compreendendo ainda pelo menos uma outra seqüência adicional e opcionalmente um linker. Em uma configuração, as múltiplas regiões dsRNA estão ligadas por um ou mais linkers. Em outra configuração, o linker está presente em um sítio na construção RNA, separando as regiões dsRNA de uma outra região de interesse. São providos diferentes tipos de linker para as construções dsRNA pela presente invenção.

"Linkers condicionalmente auto clivantes" são seqüências de RNA capazes de serem processadas sob determinadas condições. Um exemplo de --•-jCL^Í-iaLS^'^···^ -t^"'- · * .· * \ W 'I0I--------------- --------------- 5fè

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linkers condicionalmente auto clivantes adequados são as seqüências de RNA que são auto clivantes em condições de baixo pH. Exemplos adequados dessas seqüências de RNA são descritos por Jayasena and Gold (Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Sep 30; 94(20): 10612-7), cujo documento está incorporado à presente por referência.

Um outro exemplo de linkers condicionalmente auto clivantes adequados são as seqüências de RNA auto clivantes em altas condições de pH. Exemplos adequados dessas seqüências de RNA são descritos por Borda et al. (Nucleic Acids Res. 2003 May 15;31(10):2595-600), cujo documento JlO está incorporado à presente por referência. Esta seqüência se origina do núcleo catalítico da ribozima em cabeça de martelo HHl6.

Em um aspecto da invenção, os linkers podem ser usados para desligar menores regiões dsRNA no organismo de infestação. Vantajosamente, nesta situação a seqüência do linker pode promover a divisão de um longo dsRNA nas menores regiões dsRNA em determinadas circunstâncias, resultando na liberação de regiões separadas de dsRNA nessas circunstâncias e conduzindo a um silenciamento de genes mais eficiente por essas menores regiões dsRNA.

Em um outro aspecto da invenção, o linker se localiza em um sítio na construção RNA, separando as regiões dsRNA de outra seqüência de interesse que, de preferência provê uma outra função para a construção RNA. São exemplos não limitativos de outras seqüências funcionais (de interesse) que podem ser incorporadas à construção RNA, por exemplo, (i) outras seqüências para facilitar a produção em grande escala da construção dsRNA; (ii) outras seqüências para aumentar/reduzir a estabilidade do dsRNA; (iii) outras seqüências para ligar às proteínas ou a outras moléculas em uma composição para facilitar a captação pela espécie de praga; (iv) outras seqüências que são aptâmeros e que se ligam a receptores ou a moléculas no intestino da espécie da praga para facilitar a captação, endocitose e/ou transcitose pela espécie de praga; (v) outras seqüências para catalisar o 5VQ

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processamento das regiões dsRNA .

De acordo com uma particular configuração, a espécie de praga tem um sistema intestinal, como por exemplo, insetos e/ou aracnídeos, e o linker é auto clivante no intestino do inseto e/ou aracnídeo. O pH no intestino é variável, variando entre extremamente ácido até extremamente básico.

De maneira alternativa, os linkers são auto clivantes nos endossomos. Isto pode ser vantajoso quando as construções da presente invenção são absorvidas pelos organismos das pragas por endocitose ou transcitose e são, portanto compartimentalizados nos endossomos da espécie da praga. Os endossomos podem ter baixo ambiente de pH, levando à clivagem do linker.

Os linkers supramencionados que são auto clivantes em condições hidrofóbicas são particularmente úteis nas construções dsRNA da presente invenção quando usados para serem transferidos de uma célula para outra pelo trânsito em uma parede celular, por exemplo ao cruzar a parede celular de um organismo de praga de inseto e/ou aracnídeo.

Um intron também pode ser usado como linker. Um "intron" como usado na presente pode ser qualquer seqüência não codificada RNA de um RNA mensageiro. Determinadas seqüências adequadas de introns para as ■20 construções da presente invenção (1) são U-rich (35-45%); (2) ter um comprimento médio de 100 bp (variando entre cerca de 50 e cerca de 500 bp) cujos pares base podem ser escolhidos randomicamente ou podem ser basear em seqüências intron conhecidas; (3) iniciar na extremidade 5' com -AG:GT- ou -CG:GT- e/ou (4) ter em suas extremidades 3' -AG:GC- ou -AG:AA. Também pode ser usada como linker uma seqüência RNA não

complementar, variando entre cerca de 1 par base a cerca de 10,000 pares base.

Como acima descrito, as regiões dsRNA da invenção podem corresponder a somente uma porção do gene alvo, desde que a complementaridade seja tal que o RNAi possa ocorrer para controlar efetivamente a praga de inseto e/ou aracnídeo. Não é essencial para a invenção que todo o comprimento da seqüência do gene alvo pertinente seja conhecida, enquanto a região dsRNA contendo a construção usada seja capaz de regular para baixo o gene alvo.

Por exemplo, é possível usar um fragmento dsRNA com base em

uma seqüência parcial de genes (como um EST) do inseto e/ou aracnídeo, enquanto a referida seqüência parcial for ortóloga de uma das seqüências descritas como SEQ ID Nes 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 1IO 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200. O grau de homologia seqüencial ou complementaridade é determinado no comprimento do fragmento dsRNA usado.

Além disso, é também possível usar na invenção fragmentos dsRNA que diferem das moléculas de ácido nucléico compreendendo as seqüências descritas em SEQ ID N2s 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179 e 188 a 200 em uma ou mais posições do 0 nucleotídeo (ex., por um cancelamento, inserção ou substituição), enquanto o fragmento dsRNA resultante é ainda capaz de regular para baixo o gene alvo.

De preferência, o fragmento dsRNA η construção RNA tem uma complementaridade, ou nível de homologia compreendendo pelo menos cerca de 70% da identidade seqüencial do nucleotídeo, preferivelmente pelo menos cerca de 80% da identidade seqüencial, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% ou 87.5% da identidade seqüencial, ainda mais de preferência cerca de 90% da identidade seqüencial, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% da identidade seqüencial e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade seqüencial com a porção relevante da seqüência de nucleotídeos de qualquer

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26/81 das moléculas alvo de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos indicada em uma das SEQ ID Ν— 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200, ou uma seqüência de nucleotídeos ortóloga de uma espécie de inseto e/ou aracnídeo.

Os métodos para a determinação da identidade seqüencial são rotineiros na técnica e incluem o uso do software Blast e da análise GAP (programa GCG). São necessários altos níveis de identidade seqüencial JPlO (complementaridade) de pelo menos uma fita do dsRNA com o gene alvo para mediar o RNAi efetivo, e assim controlar a praga.

Entretanto, é também vantajoso que as regiões dsRNA da invenção sejam seletivas com relação à seqüência alvo da praga versus às seqüências dos ortólogos mamíferos. Isto é especialmente relevante na presente invenção, onde a praga deve ser controlada em um ambiente, como em uma cozinha, onde existem alimentos e onde as pessoas e outros mamíferos podem estar expostos a composições projetadas para o controle de pragas. E preferível um agente biológico seletivo a um agente químico, que possa ser igualmente tóxico para um mamífero como para uma espécie de praga, o Além disso, para um agente biológico como as construções RNA da

presente invenção, existe a vantagem de as moléculas biodegradarem com o tempo e assim induzirem menos riscos ambientais e para a saúde das pessoas do que um agente químico (como os inseticidas conhecidos).

Assim, de acordo com uma configuração preferida, a pelo menos uma fita do RNA de dupla fita na construção RNA que compreende a seqüência de nucleotídeos complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucléico indicada em uma das SEQ IDNss 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200, ou uma seqüência de nucleotídeos ortóloga de uma espécie de inseto e/ou aracnídeo tem menos que cerca de 5%, menos que cerca de 10%, menos que cerca de 12.5 %, menos que cerca de 15%, menos que cerca de 20%, menos que cerca de 30%, menos que cerca de 40% da identidade seqüencial da correspondente seqüência (ortóloga) de nucleotídeos de uma espécie mamífera. Em uma configuração, não existe identidade seqüencial com seqüências de mamíferos em 21 nucleotídeos contíguos. Em outra configuração, há menos que cerca de 10% ou menos que cerca de 12.5 % da identidade seqüencial em 24 nucleotídeos contíguos da correspondente seqüência de nucleotídeos de uma espécie mamífera. De preferência, a espécie mamífera é a humana.

Em uma configuração, a pelo menos uma fita (do RNA de dupla fita na construção RNA que compreende uma seqüência de nucleotídeos complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucléico indicada em uma das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29,30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200 ou uma seqüência de nucleotídeos ortóloga de uma espécie de inseto e/ou aracnídeo) compreende pelo menos 17 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 18 nucleotídeos, 19 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 21 nucleotídeos, 24 nucleotídeos, 27 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 40 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 60 nucleotídeos, 70 nucleotídeos, 80 nucleotídeos, 90 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 150 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 250 nucleotídeos, 300 nucleotídeos, 350 nucleotídeos, 400 nucleotídeos, 450 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 550 nucleotídeos, 600 nucleotídeos, 650 nucleotídeos, 700 nucleotídeos, 900 nucleotídeos, 1000 nucleotídeos, 1100 nucleotídeos, 1200 nucleotídeos ou 1300 nucleotídeos de qualquer das moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos estabelecida em quaisquer das SEQID N251, 4, 6, 7, 9,10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200, ou seus complementos.

r

E também fornecida uma construção RNA que compreende pelo menos uma região de RNA de dupla fita, pelo menos uma fita das quais compreende pelo menos cerca de 17 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos cerca de 18 nucleotídeos, 19 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 21 nucleotídeos, 23 nucleotídeos, 24 nucleotídeos, 25 nucleotídeos, 27 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 40 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 60 nucleotídeos, 70 nucleotídeos, 80 nucleotídeos, 90 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 150 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 250 nucleotídeos, 300 nucleotídeos, 350 nucleotídeos, 400 nucleotídeos, 450 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 550 nucleotídeos, 600 nucleotídeos, 650 nucleotídeos, 700 nucleotídeos, 900 nucleotídeos, 1000 nucleotídeos, 1100 nucleotídeos, 1200 nucleotídeos ou cerca de 1300 nucleotídeos de quaisquer das moléculas de ácido nucléico que compreende a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em quaisquer das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200, ou seu complemento. DNA e construções de expressão e células hospedeiras Em um outro aspecto, a invenção também provê uma construção DNA que compreende a seqüência de nucleotídeos dos novos objetivos da invenção, representados nas SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200.

A invenção também se refere a uma construção DNA que compreende uma região codificando uma construção RNA da invenção.

A invenção também provê, em ainda um outro aspecto, uma ápi

construção de expressão que compreende quaisquer das construções DNA da invenção.

A construção de expressão é tal que é capaz, em condições adequadas, de prover (por transcrição) uma construção RNA que compreende uma região dsRNA como acima mencionada.

As construções genéticas para a expressão do dsRNA são bem conhecidas na técnica: é feita referência, por exemplo às construções descritas na WO 99/32619; na WO 00/01846 e na WO 01/88121 (todas Devgen); WO 00/44914 e WO 01/70949, assim como na técnica anterior já mencionada acima. Como aí mencionado, essas construções podem ser DNA ou RNA (sendo de preferência, DNA) e podem estar sob a forma de um adequado vetor de expressão (como um vetor de expressão adequado para a transformação de e para a expressão em bactérias) ou outro sistema de expressão. Por exemplo, a construção pode estar presente em (por exemplo, por transformação) em um sistema bacteriano ou viral adequado para a produção em bactérias ou for para a transformação de insetos e/ou aracnídeos, e estas e outras células hospedeiras que contêm as construções genéticas formam um outro aspecto da invenção.

Uma construção de expressão de acordo com a invenção contém normalmente - além da(s) seqüência(s) que codificam o próprio fragmento dsRNA - adequados elementos reguladores (como promotores, terminadores e ampliadores) e outros elementos dessas construções genéticas conhecidas de per si; e podem, por exemplo expressar as regiões dsRNA como duas fitas RNA complementares separadas que hibridizam para formar a desejada região dsRNA ou podem exprimir a região dsRNA sob a forma de um RNA simples contendo as duas fitas complementares, que se auto-hibridizam para formar uma estrutura "stem-loop" ou "hairpin" que contém a desejada região dsRNA. Todas essas construções podem ser adequadamente usadas na presente invenção, que não está particularmente limitada ao tipo de construção usada, enquanto a referida construção for adequada para a -ο. 31/81

expressão de um dsRNA que possa mediar o RNAi efetivo em uma infestação de inseto e/ou aracnídeo.

As próprias construções também podem ser feitas de maneira conhecida por si, para a qual é feita novamente referência às menções acima da técnica anterior, assim como a manuais padrões como o Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

As regiões dsRNA podem ser expressas de preferência em um

hospedeiro bacteriano sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor indutivo (ex., um promotor que é induzido por um composto específico, por danos às bactérias, etc.). O promotor constitutivo ou indutivo pode ser não específico ou específico (por exemplo, para uma parte especificado ciclo de vida das bactérias).

A célula hospedeira bacteriana pode precisar ser inativada antes de ser utilizada como pesticida biológico. Isto pode ser feito por qualquer técnica conhecida, como por aquecimento ou por tratamento com fenol ou formaldeído, por exemplo. De maneira alternativa, um vírus inativado, como "έ O um baculovírus adequadamente modificado, pode ser utilizado para atingir as regiões dsRNA da invenção da praga de inseto e/ou aracnídeo.

A construção da expressão pode ainda conter todos os demais elementos conhecidos por si das seqüências de ácidos nucléicos ou de construções genéticas, como promotores ou outros elementos de controle, terminadores, ampliadores de translação ou de transcrição, fatores de integração, seqüências de sinais, marcadores de seleção, etc. que são, de preferência, adequados para o uso em uma célula bacteriana. As seqüências que codificam esses outros elementos da construção podem novamente ser isoladas de uma fonte biológica adequada ou providas de forma sintética. Alguns exemplos específicos, não limitativos, de promotores 6Ρ3 in-

adequados incluem, sem limitações, promotores de um RNA Poli, um RNA POI, um RNA Pollll, T7 RNA polimerase, T3 RNA polimerase ou SP6 RNA polimerase, e também os promotores e outros elementos reguladores mencionados na técnica anterior supracitada, como na WO 00/01846, por exemplo. A invenção ainda provê promotores bacterianos que podem dirigir a expressão de um RNA de fita simples, que pode com a expressão formar uma estrutura secundária hairpin contendo um Ioop e utilizar uma região de RNA de dupla fita.

Exemplos específicos, não limitativos, de técnicas de transformação para a introdução de construções nos hospedeiros bacterianos ou virais incluem a transformação, eletroporação, transfecção, etc.

A invenção provê assim uma construção de expressão que compreende: (a) um ácido nucléico que codifica uma construção RNA como ora descrita; (b) uma ou mais seqüências de controle capazes de dirigir a expressão do ácido nucléico de (a); e, opcionalmente, (c) uma seqüência de terminação de transcrição.

As construções de expressão podem ser inseridas em um plasmídeo ou em um vetor, que podem estar comercialmente disponíveis. De acordo com uma configuração da presente invenção, a construção de expressão é um vetor de expressão bacteriano, adequado para a transformação em bactérias e adequado para a manutenção e a expressão de uma construção RNA de acordo com a presente invenção em uma célula bacteriana transformada. É feita no presente referência aos plasmídeos e vetores descritos na WO 01/01846 pelo solicitante, referência que é incorporada à presente em sua totalidade. Uma alternativa é usar uma célula viral que possa infectar uma espécie de inseto, tais como os vírus descritos na WO 01/34815, cuja referência é incorporada à presente em sua totalidade.

O termo "seqüência de controle" como ora usada deve ser compreendida em um contexto amplo e se refere às seqüências reguladoras de ácido nucléico capazes de direcionar e/ou regular a expressão das seqüências

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às quais estão ligadas e/ou operacionalmente conectadas. De acordo com uma configuração da presente invenção, a seqüência de controle é operável em uma bactéria ou vírus; de preferência, a seqüência de controle é uma derivada de uma seqüência bacteriana. O termo "seqüência de controle" inclui um promotor ou uma seqüência capaz de ativar ou ampliar a expressão de uma molécula de ácido nucléico em uma célula, tecido ou órgão.

De forma opcional, uma ou mais seqüências de terminação de transcrição também podem ser incorporadas na construção de expressão. O termo " seqüência de terminação de transcrição " inclui uma seqüência de ?10 controle no final de uma unidade transcripcional, que sinaliza o processamento 3' e a poliadenilação de uma transcrição primária e uma terminação de transcrição. Outros elementos reguladores, como os ampliadores transcripcionais ou translacionais podem ser incorporados à construção de expressão. As construções de expressões da invenção podem ainda incluir uma

origem de replicação que é necessária para a manutenção e/ou a replicação em um tipo específico de célula.

Um exemplo é quando é necessário que uma construção de expressão seja mantida em uma célula bacteriana como elemento genético y20 epissomal (ex., molécula plasmídea ou cosmídea) em uma célula. As origens preferidas da replicação incluem, sem limitações, fl-ori e colEl ori.

A construção de expressão pode compreender opcionalmente um gene marcador selecionável. Como ora usado, o termo "gene marcador selecionável" inclui qualquer gene que confira um fenótipo em uma célula em que é expresso para facilitar a identificação e/ou a seleção de células que são transfectadas ou transformadas, com uma construção de expressão da invenção. Os exemplos de marcadores selecionáveis adequados incluem os genes de resistência contra o gene da ampicilina (Amp), da tetracidina (Tcr), da canamicina (Kan), da fosfinotricina e do cloranfenicol (CAT). Outros genes marcadores adequados provêem um trato metabólico, por exemplo manA. Também podem ser usados genes marcadores visuais que incluem, por exemplo, a betaglucuronidase (GUS), a luciferase e a Proteína Fluorescente Verde (GFP).

Assim, como acima descrito, a invenção provê uma célula hospedeira que compreende uma construção RNA e/ou uma construção DNA e/ou uma construção de expressão da invenção. De preferência, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, mas pode ser, por exemplo, um vírus. Pode ser utilizado um vírus como o baculovírus, que infecta especificamente insetos e/ou aracnídeos. Isto garante a segurança para os mamíferos, especialmente os humanos, já que o vírus não infecta os mamíferos e, portanto sem a ocorrência de efeito RNAi indesejado.

A célula bacteriana ou viral, de preferência deve ser inativada antes do uso como agente de administração para a mediação do RNAi a uma praga de insetos quando o agente for usado em um ambiente onde é provável o contato com humanos ou com outros mamíferos (como em uma cozinha, como discutido acima). A inativação pode ser conseguida por quaisquer meios, como pelo tratamento térmico, por fenol ou formaldeído, por exemplo.

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E também fornecido um método para a geração das construções RNA da invenção.Este método compreende as etapas de

a. fazer contato de uma construção DNA da invenção ou de uma construção de expressão da invenção com componentes sem células ou

b. administrar uma construção DNA da invenção ou uma construção de expressão da invenção com uma célula,

em condições que permitam a transcrição da referida construção DNA para produzir a referida construção RNA.

Assim, é provido um método in vitro, caracterizado pelo fato de que são providos os componentes necessários para a transcrição. Esses componentes seriam imediatamente familiares para os peritos na técnica, estando vários kits de expressão in vitro disponíveis no comércio.

De maneira alternativa, a expressão pode ser conduzida em uma célula hospedeira. De preferência, a célula é uma célula bacteriana, mas pode ser um vírus por exemplo.

Além disso, em um outro aspecto da invenção, as células hospedeiras da invenção podem ser usadas como uma fonte para a produção das moléculas de dsRNA e das construções RNA da invenção. Por exemplo, as células hospedeiras bacterianas que contêm a construção de expressão da invenção (como descritas anteriormente) podem crescer em cultura sob determinadas condições (por exemplo, a 37° ou 42°C), para produzirem as construções RNA da invenção em quantidades efetivas. A fermentação bacteriana em grande escala e os processos de colheita são bem conhecidos na técnica e são usados comercialmente. A cultura bacteriana pode ser feita em um meio adequado como, por exemplo em caldo LB, suplementado opcionalmente com os antibióticos adequados, como ampicilina, carbenicilina ou cloranfenicol, onde uma cepa resistente ao hospedeiro estiver sendo utilizada.

Assim, as culturas bacterianas resultantes produzem as construções RNA da invenção em grandes quantidades. As próprias bactérias podem ser formuladas em uma composição pesticida adequada como aqui descrita, ou podem ser usadas como fonte direta (alimentar) das construções RNA para a captação, por exemplo, pela ingestão por um inseto ou aracnídeo alvo.

Similarmente, em uma configuração, as bactérias podem ser usadas como uma fonte de dsRNA, pelo desligamento ou pela inativação das bactérias, como discutido acima. Por exemplo, as células podem ser rompidas ou Usadas usando qualquer meio adequado como, por exemplo, por choque osmótico, e o lisado ou outra fração celular adequada ou extrato das bactérias utilizadas nas composições da invenção.

Em uma configuração, o extrato bacteriano ou lisado pode ser adequadamente purificado para deixar uma construção RNA substancialmente pura contendo o extrato. De preferência, substancialmente todos os componentes bacterianos são removidos dos extratos finais contendo dsRNA, 5Ρ7

.....

que podem subseqüentemente ser formulados em qualquer uma das composições da invenção. As etapas adequadas de purificação são bem conhecidas na técnica e podem incluir, como exemplo e sem limitações, etapas adequadas de filtração, por exemplo, a separação baseada na carga ou no peso molecular. Podem também ser empregadas adequadas reações de hibridização para purificar as moléculas dsRNA de interesse.

As construções RNA podem ser purificadas até uma pureza substancial com técnicas padrão, incluindo a precipitação seletiva, a cromatografia de coluna, métodos de imunopurificação e outros (ver, ex., Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (1982);; Ausubel et al., supra; and Sambrook et al., supra).

As construções RNA e DNA, incluindo as moléculas RNA de dupla fita, incorporarão tipicamente as bases naturais. Entretanto, as variantes estão incluídas no escopo da invenção. Assim, o escopo de "RNA" e "DNA" inclui análogos sintéticos, incluindo bem conhecidas bases modificadas do açúcar, que são capazes de base pareamento e mediar o RNAi ou de serem transcritas para produzirem o RNA respectivamente de maneira análoga aos ácidos nucléicos naturais. Por exemplo, são visados os análogos de ácido nucléico que incorporam bases modificadas ou derivadas não naturais quimicamente modificadas, ou análogos de ácido nucléico tendo um backbone modificado. Isto se aplica igualmente aos linkers que podem ser incorporados nas construções da invenção. Em particular, o termo " RNA de dupla fita" ou "dsRNA" deve ser interpretado como incluindo o dsRNA que contém bases não naturais. O RNA de dupla fita que compreende bases não naturais ou que compreende um backbone quimicamente modificado pode proporcionar outras vantagens referentes ao aumento ou à redução da estabilidade da construção dsRNA.

Composições pesticidas

Ainda em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição pesticida que compreende uma construção RNA da invenção e/ou uma construção DNA da invenção e/ou a construção de expressão da invenção e/ou a célula hospedeira da invenção, juntamente com um portador, excipiente ou diluente adequado.

De acordo com a configuração mais preferida, a composição está sob uma forma adequada para a ingestão por um inseto e/ou aracnídeo.

A composição pode ter qualquer forma física adequada para a aplicação a insetos e/ou aracnídeos. A composição pode ser em forma sólida (como um pó, grânulo ou isca), forma líquida (como um spray) ou sob a forma de gel, por exemplo.

A composição pode ainda conter componentes que servem para estabilizar o dsRNA e/ou evitar a degradação do dsRNA durante a armazenagem prolongada da composição.

A composição pode ainda conter componentes que aumentam ou que promovem a captação do dsRNA pelo trato ou pelas células intestinais. Pode incluir, por exemplo, agentes químicos que geralmente promovem a captação do RNA nas células, por ex., a lipofectamina, etc.

E contemplado que a "composição" da invenção pode ser fornecida sob a forma de um "kit de peças" que compreende o RNA de dupla fita em um recipiente e um adequado diluente ou portador para a entidade que contém o RNA (como uma construção RNA, construção DNA, construção de expressão ou célula hospedeira) em um recipiente separado. A invenção também se refere ao fornecimento do RNA de dupla fita individualmente, sem quaisquer componentes. Nessas configurações, o dsRNA pode ser fornecido sob forma concentrada, como em uma solução aquosa concentrada. Pode também ser fornecido sob a forma congelada ou sob a forma desidratada a frio ou liofilizada. Esta última pode ser mais estável para uma armazenagem de longo prazo e pode ser descongelada e/ou reconstituída com um diluente adequado imediatamente antes do uso.

Em uma configuração específica, a composição pode ser um revestimento, pasta ou pó que pode ser aplicado a um substrato, para proteger o referido substrato da infestação por insetos e/ou aracnídeos. Nesta configuração, a composição pode ser usada para proteger qualquer substrato ou material que seja susceptível a infestações ou por danos provocados por um inseto e/ou aracnídeo, por exemplo, alimentos e outros materiais perecíveis, e substratos como a madeira. A espécie preferida de inseto e/ou aracnídeo alvo para esta configuração inclui, sem limitações, as pragas da invenção anteriormente definidas (ver "Organismos/espécies alvos"), isto é, insetos caseiros e/ou aracnídeos, ectoparasitas e insetos relevantes para a saúde e higiene públicas como, por exemplo e sem limitações, moscas, ácaros de aranhas, tripses, carrapatos, ácaros vermelhos das aves, formigas, baratas, cupins, grilos incluindo grilos domésticos, traças de livros, piolhos de livros, besouros, centopéias, mosquitos e pulgas. As espécies alvo mais preferidas são baratas, por exemplo, baratas do gênero Blatella, incluindo Barata alemã (Blatella germanica), do gênero Periplaneta, incluindo Barata americana (Periplaneta americana) e Barata australiana (Periplaneta australiasiae), do gênero Blatta, incluindo Barata oriental (Blatta orientalis) e do gênero Supella, incluindo barata de estrias marrons (Supella longipalpa). O alvo mais preferido é a Barata alemã (Blatella germanica).

Nesta configuração, a composição compreenderá pelo menos uma entidade contendo RNA de dupla fita (ex., uma construção RNA como acima descrita), caracterizada pelo fato de que a região do RNA de dupla fita compreende fitas complementares aneladas, pelo menos uma das quais tendo uma seqüência de nucleotídeos que corresponde a uma seqüência de nucleotídeos alvo de um gene alvo de um inseto e/ou aracnídeo a ser controlado e pelo menos um portador,diluente ou excipiente adequado para o uso a que se destina.

A natureza dos excipientes e a forma física da composição podem variar dependendo da natureza do substrato que se deseja tratar. Por exemplo, a composição pode ser um líquido que é espalhado ou nebulizado sobre ou impresso no material ou substrato a ser tratado, ou um revestimento ou pó que seja aplicado ao material ou substrato a ser tratado. Assim, em uma configuração, a composição está sob a forma de um revestimento sobre uma superfície adequada que adere ao inseto, sendo eventualmente ingerida pelo inseto e/ou aracnídeo que entrar em contato com o revestimento.

Em uma configuração, a composição está sob a forma de uma isca. A isca é projetada para enganar o inseto e/ou aracnídeo que entrar em contato com a composição. Após o contato, a composição é internalizada pelo inseto e/ou aracnídeo, por ingestão, por exemplo, e media o RNAi, matando o inseto e/ou aracnídeo. A referida isca pode compreender uma substância alimentar, como um alimento protéico, por exemplo, peixe. Também pode ser usado o ácido bórico como isca. A isca pode depender da espécie à que se destina. Por exemplo, a Blatella germanica comerá quase todos os alimentos que estiverem disponíveis. Também pode ser usado um atrativo. O atrativo pode ser um feromônio, como um feromônio macho ou fêmea, por exemplo. Como exemplo, os feromônios mencionados no livro "Insect Pheremones and their use in Pest Management" (Howse et al, Chapman and Hall, 1998) podem ser usados na invenção. Os atrativos agem para enganar os insetos e/ou aracnídeos até a isca, e podem ser visados para um inseto e/ou aracnídeo em particular ou podem atrair toda uma gama de insetos. A isca pode ser sob qualquer forma adequada, como sob a forma sólida, pastosa, em grânulos ou em pó.

A isca também pode ser transportada pelo inseto e/ou aracnídeo para a sua colônia. A isca pode então atuar como fonte alimentar para os demais membros da colônia, proporcionando assim um controle efetivo de um grande número de insetos e/ou aracnídeos e de potencialmente toda uma colônia de insetos e/ou aracnídeos. Esta é uma vantagem associada ao uso do RNA de dupla fita da invenção, Como a ação retardada dos efeitos mediados por RNAi sobre as pragas permite que a isca seja carregada para a colônia, proporciona assim impacto máximo em termos de exposição dos insetos e/ou aracnídeos. Além disso, as composições que entram em contato com os insetos e/ou aracnídeos podem permanecer na cutícula do inseto e/ou aracnídeo. Na desinfestação, seja de individual ou uma auto-desinfestação de insetos e/ou aracnídeos ou uma inter-desinfestação de insetos e/ou aracnídeos, as composições podem ser ingeridas e assim mediarem seus efeitos no inseto e/ou aracnídeo. Isto exige que as composições sejam suficientemente estáveis, de maneira que o dsRNA permanece intacto e capaz de mediar o RNAi, mesmo quando exposto a condições ambientais externas por algum tempo, que pode ser, por exemplo, um período de dias.

As iscas podem ser providas em um adequado "alojamento" ou "armadilha". Esses alojamentos e armadilhas estão disponíveis no comércio e existem armadilhas que podem ser adaptadas para incluírem as composições da invenção Qualquer alojamento ou armadilha que possa atrair um inseto e/ou aracnídeo para seu interior está incluído no escopo da invenção. O alojamento ou armadilha pode ter o formato, por exemplo, de uma caixa e pode ser provido em condição pré-formada ou pode ser feito, por exemplo, de papelão dobrável. Os materiais adequados para um alojamento ou armadilha incluem plásticos e papelão, especialmente o papelão corrugado. As dimensões adequadas para um tal alojamento ou armadilha são, por exemplo, 7-15 cm de largura, 15-20 cm de comprimento e 1-5 cm de altura. As superfícies internas das armadilhas podem ser revestidas com uma substância pegajosa de maneira a restringir o movimento do inseto e/ou aracnídeo quando estiver dentro da armadilha. O alojamento ou armadilha pode conter uma calha adequada no interior que possa manter a isco posicionada. A armadilha é distinta de um alojamento porque o inseto não pode sair imediatamente da armadilha após sua entrada, considerando que o alojamento atua como um "posto de alimentação", que dá ao inseto e/ou aracnídeo o ambiente adequado em que podem se alimentar e sentirem-se a salvo dos predadores.

Também, em um outro aspecto da invenção, é provido um alojamento ou armadilha para insetos e/ou aracnídeos que contém uma composição da invenção, que pode incorporar quaisquer das características da composição ora descrita.

Em uma configuração alternativa, a composição pode ser fornecida sob a forma de spray. Assim, o usuário pode nebulizar sobre a praga diretamente com a composição. A composição é então internalizada pelo inseto e/ou aracnídeo, de onde pode mediar a interferência RNA, controlando assim o inseto e/ou aracnídeo. O spray é, de preferência, um spray pressurizado/aerossolizado ou um spray de bomba. As partículas podem ter o tamanho adequado, de maneira a aderirem ao inseto e/ou aracnídeo, por exemplo, nos exoesqueletos dos.insetos e/ou dos aracnídeos e podem daí serem absorvidas. O tamanho das partículas pode ser medido por meios conhecidos, como pelo uso de um Mastersizer, disponível comercialmente.

Em ainda uma outra configuração, o portador é um pó ou uma partícula eletrostaticamente carregada que adere à cutícula do inseto e/ou do aracnídeo. Os pós e partículas adequados que são capazes de aderir a um inseto e/ou aracnídeo administrando assim as construções RNA da invenção, estão descritos na WO 94/00980 e na WO 97/33472, ambas incorporadas à presente por referência.

De maneira alternativa, o portador pode compreender partículas magnéticas que aderem à cutícula do inseto. As partículas magnéticas adequadas que são capazes de aderir a um inseto e/ou aracnídeo, administrando assim as construções RNA da invenção, estão descritas em detalhes na WO 00/01236, incorporada à presente por referência.

Em ainda uma outra configuração, que é preferida, o portador da composição compreende partículas metálicas que são inicialmente desmagnetizadas, mas que são capazes de se tornarem polarizadas magneticamente quando submetidas ao campo elétrico provido pelo corpo do inseto e/ou aracnídeo. Este modo de ação está descrito em detalhes na WO 2004/049807 e incorporada à presente por referência. Essas composições que entram em contato com os insetos e/ou aracnídeos podem permanecer na cutícula do inseto e/ou aracnídeo. Na desinfestação, seja de individual ou uma auto-desinfestação de insetos e/ou aracnídeos ou uma inter-desinfestação de insetos e/ou aracnídeos, as composições podem ser ingeridas e assim mediarem seus efeitos no inseto e/ou aracnídeo. Isto exige que a composição seja suficientemente estável de maneira que o dsRNA permaneça intacto e capaz de mediar o RNAi mesmo quando exposto a condições ambientais externas por um tempo, que pode ser, por exemplo, um período de dias.

De preferência, a composição incorpora um portador que aumenta a captação do RNA de dupla fita dentro do inseto e/ou aracnídeo (ver "organismos/espécies alvo" acima) que, de preferência é um inseto e/ou aracnídeo e de preferência uma espécie de barata. Esse portador pode ser um portador lipídico, de preferência compreendendo uma ou mais, emulsões de óleo em água, micelas, colesterol, lipopoliaminas e lipossomos. Outros agentes que promovem a captação das construções da invenção são bem conhecidos na técnica e incluem policações, dextrans e lipídeos (tris) catiônicos, como CS096, CS102 etc. Os lipossomos comercialmente disponíveis incluem LIPOFECTIN® e CELLFECTIN® etc. Alguns portadores adequados estão listados sob o título de "Agente promotor de transfecção" na WO 03/004644 e todos os exemplos providos estão incorporados à presente por referência.

Em uma outra configuração preferida, o portador é um agente condensador de ácido nucléico. De preferência, o agente condensador de ácido nucléico compreende espermidina ou sulfato de protamina ou um seu derivado.

As composições da invenção podem ser combinadas com outros princípios ativos, incluindo um outro pesticida. Assim, a composição pode ser provida como um "kit de peças" compreendendo a composição contendo o RNA de dupla fita em um recipiente e um ou mais pesticidas adequados, que podem ser pesticidas químicos ou biológicos, em um recipiente em separado. De maneira alternativa, as composições podem ser providas como misturas que sejam estáveis e que possam ser usadas em conjunto entre si.

Os princípios ativos adequados que podem atuar de forma complementar com as moléculas do RNA de dupla fita da presente invenção incluem, sem limitações, os seguintes: Cloropirifos, Aletrin, Resmetrina, Tetrabromoetil, Acido carboxílico dimetil ciclopropano (que estão geralmente incluídos em composições líquidas); e Hidrametilnona, Avermectin, Cloropirifos, Sulfuramida, Hidroprene, Fipronil (receptor GABA), Isopropilfenil metil carbamato, Indoxacarb (PARR), Noviflumuron (inibidor da síntese de quitina), Imiprothrin (PARA), Abamectin (canal de cloreto com porta de glutamato), Imidacloprid (receptor de acetilcolina) (que estão geralmente incluídos em composições de iscas).

Em uma configuração preferida, o princípio ativo é conhecido como sendo um inseticida ou um aracnicida preferido em termos de saúde e considerações ambientais, como por exemplo, Hidrametilnona e Avermectin.

De acordo com uma outra configuração, o dsRNA é expresso em uma célula hospedeira adequada como uma célula bacteriana ou fungica, sendo a célula administrada ou comida pela espécie de praga. De acordo com uma outra configuração, o dsRNA é isolado ou purificado da célula que é, de preferência uma célula bacteriana ou fungica que expressa o dsRNA, e o dsRNA é provido em um pesticida ou em uma formulação de pesticida à espécie de praga. As células hospedeiras, como células hospedeiras bacterianas ou fungicas podem ser projetadas para produzirem qualquer construção dsRNA ou RNA da invenção. Essas células hospedeiras, que são, de preferência células bacterianas, podem ser ingeridas ou de outra forma internalizadas pela espécie de praga. Quando ingeridas, o dsRNA pode iniciar uma resposta, conduzindo à degradação do mRNA alvo e enfraquecendo ou matando a praga.

Portanto, em uma configuração mais específica, o referido RNA de dupla fita ou a construção RNA é expressa por uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro procariótico, como uma bactéria, ou eucariótico como um levedo. Essas células ou organismos podem ser fornecidos em qualquer formulação adequada para facilitar a captação pelo inseto e/ou aracnídeo.

Usos e Métodos da invenção

Em ainda um outro aspecto, a invenção se refere ao uso de uma construção RNA da invenção e/ou uma construção DNA da invenção e/ou uma construção de expressão da invenção e/ou uma composição da invenção e/ou alojamento ou armadilha da invenção para controlar um inseto e/ou aracnídeo pela interferência do RNA. O uso pode se aplicar a vários insetos e/ou aracnídeos em todos os estágios do desenvolvimento, possuindo genes alvos ortólogos com os novos alvos ora identificados, incluindo insetos domésticos e/ou aracnídeos, ectoparasitas e insetos e/ou aracnídeos relevantes para a saúde e higiene públicas como, por exemplo, e sem limitação, moscas, ácaros de aranhas, tripses,carrapatos, ácaros vermelhos das aves, formigas, baratas, cupins, grilos incluindo grilos domésticos, traças de livros, piolhos de livros, besouros, centopéias, mosquitos e pulgas. As espécies alvo mais preferidas são as baratas, por exemplo, baratas do gênero Blatella, incluindo a barata alemã (Blatella germânico), do gênero Periplaneta, incluindo a barata americana (Periplaneta americana) e a barata australiana (Periplaneta australiasiae), do gênero Blatta, incluindo a barata oriental (Blatta orientalis) e do gênero -Supella, incluindo a barata de estrias marrons (Supella longipalpa). O alvo mais preferido é a Barata alemã (Blatella germanica).

De preferência, a praga é combatida por meio do RNAi, que é consequentemente morta, paralisada, retardada no crescimento, inibida na alimentação e/ou obstada em sua reprodução.

Em um aspecto complementar, a invenção também provê um método para o controle de insetos e/ou aracnídeos (pragas) que compreende a administração a um inseto e/ou aracnídeo de uma construção RNA que compreende uma região dsRNA como acima definida e/ou uma construção DNA da invenção e/ou uma construção de expressão como definida acima e/ou células hospedeiras como definidas acima e/ou uma composição como definida acima e/ou alojamento ou armadilha como definida acima, caracterizada pelo fato de que o RNA de dupla fita é capaz de regular para baixo a expressão de pelo menos um gene de inseto pela interferência do RNA.

A administração pode envolver, por exemplo, a alimentação do inseto e/ou aracnídeo ou pode envolver o contato do inseto e/ou aracnídeo com o dsRNA (em suas várias formas de apresentação como ,descrito e definido acima). Os meios adequados de contato direto incluem iscas, fitas aderentes, pós e partículas carregadas elétrica ou magneticamente, sprays, géis, ungüentos, tratamentos de superfície, etc. como definidos e descritos acima com respeito às composições da invenção. Todos os meios de administração estão incluídos no escopo da presente invenção, desde que conduzam a uma efetiva interferência do RNA de dupla fita da expressão do gene alvo, controlando assim o inseto e/ou aracnídeo.

Pode ser vantajoso prover uma região de RNA de dupla fita contendo construções direcionadas contra múltiplos alvos, já que isto aumenta a eficácia do controle do inseto e/ou aracnídeo como também reduz a possibilidade de o inseto e/ou aracnídeo adquirir resistência.

Assim, em uma configuração do método, múltiplas construções RNA como acima definidas e/ou construções DNA como acima definidas e/ou construções de expressões como acima definidas e/ou células hospedeiras como acima definidas e/ou composições como acima definidas e/ou alojamento ou armadilha como acima definidos são providos/administrados à praga para mediar múltiplos eventos RNAi separados.

Os alvos múltiplos podem ser visados ao mesmo tempo, ou podem ser visados de forma seqüencial. Assim, em uma configuração, as múltiplas construções RNA e/ou construções DNA e/ou construções de expressões e/ou 3η7 φ-

células hospedeiras e/ou composições e/ou alojamentos ou armadilhas são providos/administrados seqüencialmente para reduzir a probabilidade de o inseto e/ou aracnídeo adquirir resistência.

Os métodos da invenção podem ser aplicar a vários insetos e/ou aracnídeos em todos os estágios de desenvolvimento, possuindo genes alvos ortólogos com os novos alvos ora identificados. Os insetos alvo incluem insetos domésticos e/ou aracnídeos, ectoparasitas e insetos e/ou aracnídeos relevantes para a saúde e higiene públicas como, por exemplo, e sem limitações, moscas, ácaros de aranhas, tripses, carrapatos, ácaros vermelhos das aves, formigas, baratas, cupins, grilos incluindo grilos domésticos, traças de livros, piolhos de livros, besouros, centopéias, mosquitos e pulgas. As espécies alvo mais preferidas são as baratas, por exemplo baratas do gênero Blatella, incluindo a barata alemã (Blate//a germanica), do gênero Periplaneta, incluindo a barata americana (Periplaneta americana) e a barata australiana (Periplaneta australiasiae), do gênero Blatta, incluindo a barata oriental (Blatta orientalis) e do gênero Supella, incluindo barata de estrias marrons (Supella longipalpa). O alvo mais preferido é a barata alemã (Blatella germanica).

x De preferência, a praga do inseto e/ou aracnídeo é combatida por

^O meio do RNAi, sendo consequentemente morta, paralisada, retardada no crescimento, inibida na alimentação e/ou comprometida em sua reprodução.

A célula hospedeira pode ser, em uma configuração, uma célula bacteriana que foi projetada para produzir as construções RNA da invenção.

Em ainda um outro aspecto, a invenção provê um método para o controle da infestação de baratas, compreendendo prover/administrar à barata uma construção RNA que compreende pelo menos uma região de RNA de dupla fita, onde pelo menos uma fita compreende uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína ribossomal da barata. As proteínas ribossomais da barata representam um novo alvo para o RNAi, que pode mediar o controle

efetivo de uma infestação de baratas.

De preferência, pelo menos uma fita de pelo menos uma região RNA de dupla fita compreende pelo menos cerca de 17, 18, 19, 20, 21 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos cerca de 23 nucleotídeos, 24 ι nucleotídeos, 27 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 40 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 60 nucleotídeos, 70 nucleotídeos, 80 nucleotídeos, 90 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 150 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 250 nucleotídeos, 300 nucleotídeos, 350 nucleotídeos, 400 nucleotídeos, 450 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 550 nucleotídeos, 600 nucleotídeos, 650 nucleotídeos, 700 nucleotídeos, 900 nucleotídeos, 1000 nucleotídeos, 1100 nucleotídeos, 1200 nucleotídeos ou cerca de 1300 nucleotídeos de qualquer das moléculas de ácido nucléico que compreendem a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em quaisquer das SEQ ID Ν— 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180 e 181, ou seu complemento.

Em ainda um outro aspecto, a invenção provê um método para o controle de infestações de baratas que compreende prover/administrar à barata uma construção RNA que compreende pelo menos uma região de RNA de dupla fita, pelo menos uma fita das quais compreende uma seqüência de *20 nucleotídeos complementar à uma porção da seqüência de nucleotídeos que codifica uma tropomiosina, um gene da HMG Coenzima A sintase ou um gene Actin 5C. As proteínas da tropomiosina da barata, da HMG Coenzima A sintase e da Actin 5C representam um novo alvo para o RNAi, que pode mediar o controle efetivo de uma infestação de baratas. De preferência, pelo menos uma fita de pelo menos uma região

RNA de dupla fita compreende pelo menos cerca de 17 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos cerca de 18 nucleotídeos, 19 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 21 nucleotídeos, 23 nucleotídeos, 24 nucleotídeos, 27 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 40 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 60 nucleotídeos, 70 nucleotídeos, 80 nucleotídeos, 90 nucleotídeos, 100 48/81

nucleotídeos, 150 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 250 nucleotídeos, 300 nucleotídeos, 350 nucleotídeos, 400 nucleotídeos, 450 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 550 nucleotídeos, 600 nucleotídeos, 650 nucleotídeos, 700 nucleotídeos, 900 nucleotídeos, 1000 nucleotídeos, 1100 nucleotídeos, 1200 nucleotídeos ou cerca de 1300 nucleotídeos de qualquer das moléculas de ácido nucléico que compreendem a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em quaisquer das SEQ ID N2s 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179, e 188 a 200, ou seu complemento.

Os métodos da invenção podem ser aplicar a vários insetos e/ou aracnídeos em todos os estágios de desenvolvimento, possuindo genes alvos ortólogos com os novos alvos ora identificados. Os insetos alvo incluem insetos domésticos, ectoparasitas e insetos e/ou aracnídeos relevantes para a saúde e higiene públicas como, por exemplo, e sem limitações, moscas, ácaros de aranhas, tripses, carrapatos, ácaros vermelhos das aves, formigas, baratas, cupins, grilos incluindo grilos domésticos, traças de livros, piolhos de livros, besouros, centopéias, mosquitos e pulgas. As espécies alvo mais preferidas são as baratas (Blattodea) como, sem limitações, a Blatella spp. (ex., Blatella germanica y20 (barata alemã)), Periplaneta spp. (ex., Periplaneta americana (Barata americana) e Periplaneta australiasiae (Barata australiana)), Blatta spp. (ex., Blatta orientalis (Barata oriental)) e Supella spp. (ex., Supella longipalpa (barata de estrias marrons); formigas (Formicoidea) como, sem limitações, a Solenopsis spp. (ex., Solenopsis invicta (Formiga do Fogo)), Monomorium spp. (ex., Monomorium pharaonis (Formiga Faraó)), Camponotus spp. (ex., Camponotus spp (Formigas carpinteiras)), lasius spp. (ex., lasius niger (Pequena formiga negra)), Tetramorium spp. (ex., Tetramorium caespitum (Formiga do solo)), Myrmica spp. (ex., Myrmica rubra (Formiga Vermelha)), Formica spp (Formiga da madeira), Crematogaster spp. (ex., Crematogaster lineolata (Formiga Acrobata)), GX>

Iridomyrmex spp. (ex., Iridomyrmex humilis (Formiga Argentina)), Pheidole spp. (Formigas de Cabeças Grandes), e Dasymutilla spp. (ex., Dasymutilla occidentalis (Formiga Veludo)); cupins (Isoptera e/ou Termitidae) como, sem limitações, a Amitermes spp. (ex., Amitermes ι floridensis (Ácaro subterrâneo de asas negras da Flórida)), Reticulitermes spp. (ex., Reticulitermes flavipes (ácaro subterrâneo do Iestey),

r

Reticuliterm.es hesperus (Acaro Subterrâneo do Oeste)), Coptotermes spp.

r

(ex., Coptotermes formosanus (Acaro Subterrâneo de Formosa)),

/

Incisitermes spp. (ex., Incisitermes minor (Acaro Ocidental da Madeira

Ff

rIO Seca)) and Neotermes spp. (ex., Neotermes connexus (Acaro de Arvores das Florestas)), baratas, por exemplo, baratas do gênero Blatella, incluindo a barata alemã {Blatella germanica), do gênero Periplaneta, incluindo a barata americana (Periplaneta americana) e a barata australiana (Periplaneta austraiiasiae), do gênero Blatta, incluindo a barata oriental (Blatta orientalis) e do gênero Supella, incluindo a barata de estrias marrons (Supella longipalpa). Os alvos mais preferidos são as baratas. O alvo mais preferido é a barata alemã {Blatella germanica).

De preferência, a praga de insetos e/ou aracnídeos é combatida pelo RNAi, que é consequentemente morta, paralisada, retardada no *20 crescimento, inibida na alimentação e/ou comprometida em sua reprodução.

Kits da invenção

A invenção também provê kits para uso nos métodos da invenção. Esses kits podem incorporar as construções RNA e/ou as construções DNA e/ou as construções das expressões e/ou células hospedeiras e/ou composições e/ou alojamentos ou armadilhas da invenção, todas fornecendo regiões dsRNA para efetuar o RNAi contra genes alvos específicos.

De preferência, os kits também incluem as instruções de uso dos componentes do kit. Os RNAs de dupla fita encontrados nos kits da CbJ

50/81

invenção, ou produzidos pelos kits da invenção são capazes de regular para baixo a expressão de pelo menos um gene do inseto (praga) pela interferência do RNA.

De preferência, para prover um controle de pragas mais efetivo (como descrito acima), o kit compreende múltiplos componentes, cada um dos quais media o RNAi em um diferente gene alvo ou espécie de inseto e/ou aracnídeo. Assim, o kit pode compreender múltiplas construções RNA e/ou DNA e/ou as construções das expressões e/ou composições, caracterizado pelo fato de que cada RNA de dupla fita é capaz de regular ^lO para baixo a expressão de pelo menos um gene do inseto e/ou aracnídeo (praga) pela interferência do RNA.

De preferência, os componentes do kit são aplicados em seqüência para mediar o controle efetivo da praga. Entretanto, alguns ou todos os componentes podem ser administrados simultaneamente se necessário para produzir o máximo impacto.

O kit pode também compreender pesticidas conhecidos, que podem ser fornecidos em conjunto ou separadamente dos componentes que fazem parte da invenção.

Os princípios ativos adequados que podem atuar de forma *20 complementar com as moléculas do RNA de dupla fita da presente invenção incluem, sem limitações, os seguintes: Cloropirifos, Aletrin, Resmetrina, Tetrabromoetil, Ácido carboxílico dimetil ciclopropano (que estão geralmente incluídos em composições líquidas); e Hidrametilnona, Avermectin, Cloropirifos, Sulfuramida, Hidroprene, Fipronil (receptor GABA), Isopropilfenil metil carbamato, Indoxacarb (PARR), Noviflumuron (inibidor da síntese de quitina), Imiprothrin (PARA), Abamectin (canal de cloreto com porta de glutamato), Imidacloprid (receptor de acetilcolina) (que estão geralmente incluídos em composições de iscas).

Em uma configuração preferida, o princípio ativo é conhecido como sendo um inseticida ou um inseticida e/ou aracnicida "preferido" em termos de saúde e considerações ambientais, como por exemplo, Hidrametilnona e avermectin.

Os kits podem assim também ser direcionados contra múltiplas espécies ao mesmo tempo, de maneira a dar uma opção de controle da praga em ampla escala. As moléculas de RNA de dupla fita podem ser incluídas nos kits (como parte das construções adequadas, etc.) para mediarem o RNAi de alvos múltiplos, incluindo ortólogos inter-espécies dos mesmos alvos, por exemplo.

Os kits podem incluir tampões e embalagens necessários, etc. para garantir a estabilidade e a armazenagem de seus componentes.

Vantagens técnicas da invenção

Existem várias vantagens importantes associadas à presente invenção com relação ao uso dos inseticidas químicos convencionais.

(1) O dsRNA que media o RNAi deve combinar com o alvo em um alto grau da identidade seqüencial de nucleotídeos, para regular efetivamente para baixo a expressão e assim controlar a praga. Assim, pode ser obtida especificidade projetando as moléculas de RNA de dupla fita em que uma fita tem alta homologia com a seqüência alvo, mas cuja fita tem somente baixa homologia com a seqüência ortóloga nas espécies mamíferas, como na humana. Esta especificidade é maior do que a que pode ser obtida com pesticidas químicos convencionais.

(2) Foi identificado um novo conjunto de alvos que pode ser usado no controle das pragas. Como esses alvos não foram anteriormente identificados, não deve haver resistência adquirida nas espécies de pragas.

(3) O RNA de dupla fita usado no RNAi contra os novos alvos é um produto biodegradável quando comparado com os conhecidos pesticidas sintetizados quimicamente, como o DMSO etc. A natureza biodegradável das construções torna-as mais adaptáveis ao ambiente.

(4) O RNAi não necessariamente provê um efeito imediato em termos de matar a praga; ao invés disso, os efeitos são mediados efetivamente, mas é necessário tempo para que o RNA de dupla fita se associe a seu alvo. O efeito RNAi pode resultar na morte da praga posteriormente e não diretamente no contato, como o Noviflumuron (que é um inibidor da síntese da quitina da Dow AgroSciences). Assim, o uso do RNAi pode permitir uma controle mais fácil das grandes infestações de pragas como de insetos e/ou aracnídeos, por haver uma menor probabilidade de ser propagado um efeito de choque entre as pragas onde possam encontrar um grande número de insetos e/ou aracnídeos mortos nas vizinhanças do inseticida e/ou aracnicida.

(5) O uso de alvos múltiplos ao mesmo tempo pode prover um controle mais eficaz das populações de pragas e reduzir a possibilidade de aquisição de resistência. Os alvos podem ser comuns para algumas espécies de pragas, proporcionando um tratamento em grande escala.

(6) Em contraste com os pesticidas convencionais, não seria necessária nenhuma assistência profissional para tratar as áreas relevantes, devido à natureza mais segura das construções DNA e RNA, das composições e das células hospedeiras da invenção.

(7) Seria necessária uma mínima interrupção das atividades das pessoas, já que a região de RNA de dupla fita contendo as construções é projetada de maneira a não ter efeitos adversos ou somente efeitos menores sobre a expressão dos genes gene fora da população da praga alvo.

A invenção será melhor compreendida com referência à seguinte seção experimental:

Descrição das Tabelas e Figuras

Tabela 1 Exemplos de novos genes alvos de insetos identificados.

A função genética indicada se baseia no ortólogo FlyBase;

Tabela 2 fragmentos dsRNA complementares às seqüências alvo Blatella germânica; 9$; 1

53/81

Tabela 3 Efeito dos tratamentos dsRNA no número de baratas que atingem com sucesso o estágio adulto, como porcentagem dos insetos vivos (média ± erros padrão, η =4); Tabela 4 Seqüências selecionadas* de genes alvos. Fragmentos de pelo menos 17 bp das seqüências* estão presentes nas

seqüências ortólogas especificadas nas espécies de insetos (representadas pelo número GI); Tabela 5 Seqüências selecionadas * de genes alvos. Fragmentos de pelo menos 17 bp das seqüências * estão presentes nas

seqüências ortólogas especificadas nas espécies de

aracnídeos (representadas pelo número GI);

Figura 1 Mortalidade da B. germanica com uma dieta de grânulos artificiais. A concentração de dsRNA nos grânulos foi de 1% ρ/ρ. A concentração de imidacloprida foi de 1% p/p;

Figura 2 Mortalidade da B. germanica com uma dieta de grânulos

artificiais. A concentração de dsRNA (BgOOl, tendo a seqüência como representada na SEQ ID N2 9, e BgOOl concatâmero 2, tendo a seqüência como representada na SEQ ID Nq 68) nos grânulos foi de 1% p/p. Neste

experimento, foi testado o hexaflumuron (1% p/p) como

controle positivo e solvente como controle negativo;

Figura 3 Estabilidade do Bg032 dsRNA em meio LB (LB) e Rnase isenta de água (MQ) em temperatura ambiente por um período de oito meses;

2 5 Figura 4 Efeito na mortalidade das baratas após a aplicação de

dsRNA (BgOOl) às ninfas de primeiro instar por uma semana - neste experimento, foram testados vários dsRNA e solventes como controles negativos - a concentração de dsRNA nos grânulos foi de 1% p/p; e

3 0 Figura 5 Seqüências da invenção. GoS 54/81

TABELA 1 ID alvo Identificadoi Dm SEÇ <■ ID N2 NA SEC ID N0 AA ) Função (baseada no FIyBase): http:/lflybase.orgI BgOOl CGl 1276 1 2 Proteína ribossomal S4 (RpS4), constituinte estrutural do ribossomo envolvido na biosíntese protéica que é uma componente da subunidade ribossomal cistosólica pequena. Bg003 CG3395 11 12 Proteína ribossomal S9 (RpS9), constituinte estrutural do ribossomo envolvido na biosíntese protéica que é uma componente da)' subunidade ribossomal cistosólica pequena. Bg004 CG6141 21 23 Proteína ribossomal L9,constituinte estrutural do ribossomo envolvido na biosíntese protéica que está localizada no ribossomo. Bg005 CG2746 31 32 Proteína ribossomalL 19,constituinte estrutural do ribossomo envolvido na biosíntese protéica que está localizada no ribossomo. Bg031 CG4898 41 42 Tropomiosina 1 (AF260897), membro da família das tropomiosinas que são proteínas intimamente relacionadas com múltiplas funções, incluindo a regulação da interação actina-miosina, o transporte do mRNA, e o suporte mecânico da membrana citoplásmica) Bg032 CGl 6796 49 50 A HMG Coenzima A sintase (X73679) catalisa uma etapa comprometida nas vias para a Drodução do isoprenoide, colesterol, e da detona corporal Bg033 CG4027 57 58 1 C C \ actina 5C (AY004248) é o principal gene na Drosophila melonogaster que codifica a actina ntoesquelética presente em todos os tipos de células em todos os estágios de crescimento is-esest^xÊrn&tÍSS&me&mte^iím&gg GoQ

55/81

TABELA 2 Gene tamanho do fragmento dsRNA íbp) freefrag tamanho freefrag (posição no dsRNA) BgOOl BgOOl BgOOl BgOOl 594 (SEQ ID N2 9) 594 (SEQ ID N2 9) 594 (SEQ ID Nfi 9) 594 (SEQ ID Ns 9) bestl_human_24_3 best2_human_24_3 best3_human_24_3 bestl human 21 0 69 (19-87) 69(445-513) 62 (206-267) 573 (1-573) Bg003 Bg003 Bg003 Bg003 433 (SEQ ID N2 19) 433 (SEQ ID N2 19) 433 (SEQ ID Ns 19) 433 (SEQ ID N2 19) bestl_human_24_3 best2_human_24_3 best3_human_24_3 bestl human 21 0 133 (141-273) 72 (68-139) 65 (1-65) 412(1-412) Bg004 Bg004 Bg004 Bg004 449 (SEQ ID N2 29) 449 (SEQ ID N2 29) 449 (SEQ ID N2 29) 449 (SEQ ID N2 29) bestl_human_24_3 best2_human_24_3 best3_human_24_3 bestl human 21 0 78 (276-353) 61 (200-260) 53 (91-143) 428 (1-428) Bg005 Bg005 Bg005 Bg005 404 (SEQ ID N2 39) 404 (SEQ ID N2 39) 404 (SEQ ID N2 39) 404 (SEQ ID N2 39) bestl_human_24_3 best2_human_24_3 best3_human_24_3 bestl human 21 0 115 (40-154) 45 (191-235) 42 (237-278) 383 (1-383) Bg031 Bg031 Bg031 Bg031 Bg031 849 (SEQ ID N2 47) 849 (SEQ ID N2 47) 849 (SEQ ID N2 47) 849 (SEQ ID NO 47) 849 (SEQ ID N2 47) bestl_human_24_3 best2_human_24_3 best3_human_24_3 bestl_human_21_0 best2 human 21 0 70 (756-825) 56 (546-601) 54 (280-333) 821 (8-828) 6(1-6) Bg032 Bg032 Bg032 Bg032 1300 (SEQ ID N2 55) 1300 (SEQ ID N2 55) 1300 (SEQ ID N2 55) 1300 (SEQ ID Ns 55) bestl_human_24_3 best2_human_24_3 best3_human_24_3 bestl human 21 0 126(1138-1263) 114(731-844) 99 (259-357) 1279(1-1279) Bg033 Bg033 Bg033 Bg033 Bg033 Bg033 446 (SEQ ID N2 63) 446 (SEQ ID N2 63) 446 (SEQ ID N2 63) 446 (SEQ ID N2 63) 446 (SEQ ID N2 63) 446 (SEQ ID N2 63) bestl_human_24_3 best2_human_24_3 best3_human_24_3 bestl_human_21 _0 best2_human_21_0 best3 human 21 0 4 (362-365) 4 (367-370) 3 (115-117) 108 (88-195) 102 (244-345) 62(350-411)

TARFJ.A Ά Dia BgOOl BgOOl concatâmero 2 Controle positivo Controle negativo 38 0,0(±0,0) 0,0(±0,0) 0,0(±0,0) 2,5 (±2,5) 41 0,0(±0,0) 0,0(±0,0) 0,0(±0,0) 9,6 (±6,7) 45 0,0(±0,0) 0,0(±0,0) 0,0(±0,0) 64,1 (±14,0) 48 33,3(±23,6) 0,0(±0,0) 0,0(+0,0) 77,1 (±10,4) 52 41,7(±25,0) 0,0(±0,0) 0,0(±0,0) 100,0 (±0,0) 56/81

GcF}

Φ-

TABELA 4 Alvo ID SEQ ID N2 Exemplo número e espécies GI Seqüência* BgOOl 71 2871551 (Drosophilamelanogaster) aaggcatggatgttggacaagct BgOOl 72 48927129 (Hydropsyche sp.) gcatggatgttggacaagctcgg BgOOl 73 60293875 (Homalodisca coagulata); 71547743 (Oncometopianigricans) attaaggttgatggaaaagtcagaac BgOOl 74 56153292 (Rhynchosciara americana) cccaactatccagctggttttatggatgttgt BgOOl 75 90820001 (Graphocephala atropunctata) gctggttttatggatgttgttacaattgaaaa BgOOl 76 25956479 (Biphyllus lunatus) attgaaaaaactggagaatttttccg BgOOl 77 15353483 (Apis mellifera) ggtaatctctgtatgattactgg BgOOl 78 92041090 (Drosophila willistoni) cgtcatcctggttcctttgacattgt BgOOl 79 62083410 (Lysiphlebus testaceipes) ttaaagattcacaaggacacac Bg003 80 76169686 (Diploptera punctata) aaaatccgtaaagctgccagagaact Bg003 81 62083482 (Lysiphlebus testaceipes) cgtaaagctgccagagaacttct Bg003 82 2459311 (Antheraea yamamai) aggttgtttgaaggcaatgctctt Bg003 83 22040140 (Ctenocephalides felis) cgtattggagtgttggatgaa Bg003 84 83664146 (Myzus persicae) ccgtatgaagcttgattacgt Bg003 85 55909980 (Locusta migratória; 76169686 (Diploptera punctata); 15358510 (Apis mellifera); 67890783 (Drosophila pseudoobscura) ttgggtttgaagattgaagatttcttgga Bg003 86 62240069 (Diabrotica virgifera) aagattgaagatttcttggaa Bg003 87 57963755 (Heliconius melpomene); 83663084 (Myzus persicae) aggaacaaacgtgaagtgtggcg Bg004 88 70909652 (Cincindela litorea) tgctctcatattgagaacatg Bg004 89 83660638 (Myzus persicae) aagggtttcctgtacaaaatg Bg004 90 83931139 (Lutzomyia longipalpis) gccgtgtatgcccatttccccat Bg004 91 67895088 (Drosophila pseudoobscura); 92218607 (Drosophila willistoni) tatgcccatttccccattaactgcgt Bg004 92 92960248 (Drosophila ananassae); 15455304 (Drosophila melanogaster); 38047668 (Drosophilayakuba) cgtaacttcttgggcgagaagt Bg004 93 56199511 (Culicoides sonorensis); 67876239 (Drosophila pseudoobscura) aaatggtttggaacaaagaaggag Bg005 94 92931824 (Drosophila virilis) gatcccaatgaaataaacgaaat 57/81

Gfc φ-

Bg005 95 55883492 (Locusta migratória) aatgaaataaacgaaattgcaaatac Bg005 96 60296437 (Homalodisca coagulata) ggttttggcaaaaggaagggtac Bg005 97 78231035 (Heliconius erato/himera mixed EST library) gcaaatgcccgtatgccacagaa Bg005 98 76553206 (Spodoptera frugiperda); 33491424 (Trichoplusia ni) aatgcccgtatgccacagaagg Bg005 99 55900360 (Locusta migratória) aagaagtacagggaagcaaagaa Bg005 100 57963592 (Heliconius melpomene) aagaagatcgacagacatctata Bg005 101 92948400 (Drosophila ananassae); 2871894 (Drosophila melanogaster); 68267374 (Drosophila simulans); 33354497 (Drosophila yakuba); 83935652 (Lutzomyia longipalpis); 18866169 (Anopheles gambiae); 60307025 (Sphaerius sp.); 25958948 (Curculio glandium); 90812513 (Nasonia giraulti) caagggtaacgtgttcaagaacaagcg Bg005 102 18909153 (Anopheles gambiae); 60311920 (Euclidia glyphica); 25957531 (Cincindela campestris); 18948649 (Anopheles gambiae); 38048300 (Drosophila yakuba); 58385089 (Anopheles gambiae str. PEST); 27556513 (Anopheles gambiae); 70909752 (Cincidela campestris); 56462221 (Lonomia oblíqua); 92931824 (Drosophila virilis) aagggtaacgtgttcaagaacaagcgtgtcct Bg005 103 25957246 (Carabus granulatus); 90135865 (Bicyclus anynana) gtgttcaagaacaagcgtgtcctgatggagt Bg005 104 71538996 (Diaphorina citri); 90812513 (Nasonia giraulti); 60311920 (Euclidia glyphica) tgatggagttcatccacaagaagaaggctg Bg005 105 15511486 (Drosophila melanogaster) catccacaagaagaaggctgagaag BgOOS 106 60311920 (Euclidia glyphica) acaagaagaaggctgagaaggc Bg005 107 82572137 (Acyrthosiphon pisum); 73616334 (Aphis gossypii); 37804858 (Rhopalosiphum padi); 31365253 (Toxoptera citricida); 84647391 (Myzus persicae) accaattccagacaaaatattcgtaa Bg005 108 55908261 (Locusta migratória); 10764114 (Manduca sexta); 90135865 (Bicyclus anynana); 91845469 (Bombyx mori) gaagaaggctgagaaggccaggaca " ' ~ ' ......"----------"-daa^"-o*^-*·^.^**»^^·*^^ : CoJCfj

58/81

84252313 (Aedes aegypti); 78052352 (Heliconius erato); 50818693 (Heliconius melpomene); 92942003 (Drosophila ananassae) 92466045 (Drosophila erecta); 92998051 (Drosophila grimshawi); 3627588 (Drosophila melanogaster); 92985296 (Drosophila mojavensis); 92921049 (Drosophila virilis); 92230306 (Drosophila willistoni); 92983068 (Drosophila mojavenis); 60294371 (Homalodisca coagulata); 73614014 (Aphis gossypii); 90819969 (Graphocephala atropunctata); 55886387 (Locusta migratória); 85854848 (Aedes aegypti); 19310970 (Periplaneta fuliginosa); 20387026 (Lepisma saccharina); 27621313 (Anopheles gambiae); 91838618 (Bombyx mori); 20387028 (Lepisma saccharina); Bg031 109 4378572 (Periplaneta americana); atggatgccatcaagaagaagatgcaggcgatgaag 71050465 (Oncometopia nigricans); ctggagaaggacaacgcg 18916954 (Anopheles gambiae); 29557544 (Bombyx mori); 55911583 (Locusta migratória); 90978993 (Aedes aegypti); 56462261 (Lonomia oblíqua); 85850284 (Aedes aegypti); 78230930 (Heliconius erato/himera mixed EST libraiy); 55895968 (Locusta migratória); 29557242 (Bombyx mori); 18926345 (Anopheles gambiae); 37663025 (Bombyx mori); 18940590 (Anopheles gambiae); 81521031 (Lutzomyia longipalpis); 55804534 (Acyrthosiphon pisum); 18898107 (Anopheles gambiae); 29557268 (Bombyx mori); 84647487 (Myzus persicae); 37664569 (Bombyx mori); 81521022 (Lutzomyia longipalpis); 70978108 (Aedes aegypti) Bg031 110 4378572 (Periplaneta americana); 19310970 (Periplaneta fuliginosa) gggccgagaaggctgaggaggaggc Bg031 111 4378572 (Periplaneta americana); 19310970 (Periplaneta fuliginosa) tccctgcagaagaagatccagcagattgagaatgatc t Bg031 112 50557705 (Homalodisca coagulata); 71050465 (Oncometopia nigricans) tgatgcaagtcaacgccaagct Bg031 113 78056651 (Heliconius erato); 50818693 (Heliconius melpomene) atgcaagtcaacgccaagctgga Bg031 114 4378572 (Periplaneta americana); 19310970 (Periplaneta fuliginosa) gtcaacgccaagctggacgagaaggacaaggccct Bg031 115 71050465 (Oncometopia nigricans) gagaaggacaaggccctgcagaa Bg031 116 55907164 (Locusta migratória); 55917622 (Locusta migratória) aaccgccgaatccaactgctggagga Bg031 117 86462380 (Acyrthosiphon pisum); 73618346 (Alphis gossypii); 53883526 (Plutella xylostella); 25958075 (Plastystomos albinus); 85854848 (Aedes aegypti); 40384866 (Nilaparvata lugens); 56085268 (Bombyx mori); 78050451 (Heliconius erato); 71535946 (Diaphorina citri); 20387028 (Lepisma saccharina); 4378572 (Periplaneta americana); 19310970 (Periplaneta fuliginosa); 66500379 (Apis mellifera); 45753874 (Apis mellifera); 66522385 (Apis mellifera) gcgatgaagctggagaaggacaacgcgatggatcg cgc Bg031 118 34788042 (Callosobruchus maculatus) tctgaggaacgtttggccacagc Bg031 119 20387028 (Lepisma saccharina) tggcagatgaagagcgtatgga Bg031 120 90972767 (Aedes aegypti); 56150925 (Rhynchosciara americana); 85854848 (Aedes aegypti) gatgaagagcgtatggatgct Bg031 121 60296314 (Homalodisca coagulata); 71050465 (Oncometopianigricans) gctttggagaaccagctgaagga Bg031 122 85850407 (Aedes aegypti) gagaaccagctgaaggaagcc Bg031 123 29555905 (Bombyx mori) cagctgaaggaagccaggttc Bg031 124 85847532 (Aedes aegypti); 77850398 (Aedes aegypti); 3627588 (Drosophila melanogaster); 56150925 (Rhynchosciara americana); 77792932 (Aedes aegypti) ttcatggctgaggaagctgacaagaaata Bg031 125 78540242 (Glossina morsitans); gctgacaagaaatatgatgaggt Qi 60/81

6901854 (Bombyx mori)

Bg031

126 40384866 (Nilaparvata lugens)

gacaagaaatatgatgaggtcgc

Bg031

127 84647487 (Myzus persicae)

atggttgaggccgacttggaaagagcaga

Bg031

128 51979105 (Myzus persicae)

gccgacttggaaagagcagaaga

Bg031

129 55886192 (Locusta migratória)

cgacttggaaagagcagaagagcgtgc

Bg031

130 92957972 (Drosophila ananassae)

ccaagattgtggagcttgagga

Bg031

131 60312749 (Gryllus bimaculatus)

aagattgtggagcttgaggaaga

Bg031

132 70978108 (Aedes aegypti)

Bg031

133 67842690 (Drosophila pseudoobscura)

Bg031

134 92939324 (Drosophila virilis)

Bg031

135 53883608 (Plutella xylostella)

Bg031

Bg031

Bg031

4378572 (Periplaneta americana); 19310970 (Periplaneta fuliginosa); 33354924 (Drosophila yakuba); 136 I 25957752 (Cicindela campestris); 60312749 (Gryllus bimaculatus); 55907164 (Locusta migratória); 75726914 (Tribolium castaneum)

137 19310970 (Periplaneta fiiliginosa)

55923520 (Locusta migratória); 138 I 20387028 (Lepisma saccharina); 55922834 (Locusta migratória)

Bg031

Bg031

139 25958290 (Platystomos albinus)

Bg031

Bg031

45757348 (Apis mellifera); 77783094 (Aedes aegypti); 25956952 (Biphyllus lunatus); 25957752 (Cicindela campestris); 30972767 (Aedes aegypti); 75722624 (Tribolium castaneum); 47519043 (Acyrthosiphon pisum); 140 I 73612504 (Aphis gossypii); 83664605 (Myzus persicae); 9055470 (Pyrocoelia rufa); 30030953 (Toxoptera citricida); 77758700 (Aedes aegypti); 33365552 (Glossina morsitans); 56154884 (Rhynchosciara americana); 78540242 (Glossina morsitans)_

141

52630932 (Toxoptera citricida); 71047185 (Oncometopia n4igricans)

tggatcgcgcccttctctgcgaacagcaggccg attgtggagcttgaggaagaactgcgcgt ctgcgcgttgtcggcaacaac_

cgcgttgtcggcaacaacctgaagtcccttgaggt

gttgtcggcaacaacctgaagtcccttgaggtgtctga agagaaggccaacctgcgtga

taccaggctaaaggaggctga

accaggctaaaggaggctgaagc

gctaaaggaggctgaagctcg

92943056 (Drosophila ananassae); 142 I 92460361 (Drosophila erecta);

49400641 (Drosophila melanogaster)

ctaaaggaggctgaagctcgtgctgagtt

gctcgtgctgagttcgctgaa 61/81

Bg031 143 19310970 (Periplaneta fuliginosa); 60311491 (Euclidia glyphica); 60312896 (Gryllus bimaculatus); 25958290 (Platystomos albinus); 60311415 (Euclidia glyphica); 55886380 (Locusta migratória); 60312749 (Gryllus bimaculatus) tgcagaaggaggttgacaggcttgaggatgaattggt acacgagaaggagaagtacaagt Bg031 144 55895696 (Logusta migratória) ttggtacacgagaaggagaagtacaagtacat Bg031 145 60311892 (Euclidia glyphica); 55900730 (Locusta migratória); 60311708 (Euclidia glyphica) gagaaggagaagtacaagtacatttgtgacgatcttg atatgactttcaccga Bg031 146 77732463 (Aedes aegypti); 4378572 (Periplaneta americana); 19310970 (Periplaneta fuliginosa) aacagcaggcccgcgacgccaac Bg031 147 19310970 (Periplaneta fuliginosa); 60311610 (Euclidia glyphica); 60313268 (Gryllus bimaculatus) catttgtgacgatcttgatatgactttcaccgaacttatt gg Bg032 148 76169650 (Diploptera punctata) cggacagggaggacatcaactc Bg032 149 18888282 (Anopheles gambiae) tggacaagtcgaagagcgtcaag Bg032 150 91094918 (Tribolium castaneum) ctgctccaagatccagaaaca Bg033 151 30310034 (Scarabaeus laticollis); 83933868 (Lutzomyia longipalpis); 90137292 (Spodoptera frugiperda); 82610902 (Tineola bisselliella); 5853355 (Lymantria dispar); 50818292 (Heliconius melpomene); 22474252 (Helicoverpa armigera); 58371832 (Lonomia oblíqua); 3719570 (Manduca sexta); 25959205 (Meladema coriacea); 53883538 (Plutella xylostella); 34787974 (Callosobruchus maculatus); 16901146 (Ctenocphalides felis); 60309684 (Scarabaeus laticollis); 78050191 (Heliconius erato); 57963831 (Heliconius melpomene); 60305522 (Mycetophagus quadripustulatus); 60295481 (Homalodisca coagulata); 71539924 (Oncometopia nigricans); 29556355 (Bombyx mori); 14010638 (Heliothis virescens); 5853355 (Lymantria dispar); 293219 (Manduca sexta); gaggcccagagcaagagaggtatcctcactctgaag taccccat Glò

40218737 (Spodoptera exígua); 67838313 (Drosophila pseudoobscura) Bg033 152 83662157 (Myzus persicae) gctccagaggaacacccaatcct Bg033 153 71543527 (Oncometopia nigricans); 60295481 (Homalodisca coagulata); 71048162 (Oncometopia nigricans) atcctgctgactgaggctcccct Bg033 154 49206619 (Drosophila melanogaster); 22474062 (Helicoverpa armigera); 29535046 (Bombyx mori); 60295481 (Homalodisca coagulata); 60336301 (Homalodisca coagulata); 62387502 (Reticulitermes flavipes); 60311490 (Euclidia glyphica); 91082248 (Tribolium castaneum); 67838313 (Drosophila pseudoobscura); 24251124 (Culicoidessp.); 60304993 (Dascillus cervinus); 25956497 (Biphyllus lunatus); 62239347 (Diabrotica virgifera); 55783599 (Apriona germari); 50818328 (Heliconius melpomene); 75723625 (Tribolium castaneum); 60305522 (Mycetophagus quadripustulatus); 49395567 (Drosophila melanogaster); 67838495 (Drosophila pseudoobscura); 50818292 (Heliconius melpomene) aaggccaacagggagaagatgactcaaatcatgtttg agaccttcaa Bg033 155 25959205 (Meladema coriacea); 18923947 (Anopheles gambiae); 3477239 (Drosophila melanogaster); 29556355 (Bombyx mori); 56772582 (Drosophila virilis); 34788040 (Callosobruchus maculutus); 60315015 (Tricholepisma aurea); 49395567 (Drosophila melanogaster); 60314849 (Tricholepisma aurea); 60314729 (Tricholepisma aurea); 34787974 (Callosobruchus maculatus); 60315012 (Tricholepisma aurea); 50560908 (Homalodisca coagulata); 62387502 (Reticulitermes flavipes); 60305522 (Mycetophagus quadripustulatus); 62387510 (Reticulitermes flavipes); 60295481 (Homalodiscacoagulata) caaatcatgtttgagaccttcaacacccc 63/81

O

Bg033 156 71547931 (Oncometopia nigricans); 60311490 (Euclidia glyphica); 75723625 (Tribolium castaneum); 49394847 (Drosophila melanogaster); 61949513 (Triboliumcastaneum) tcatgtttgagaccttcaacacccccgccatgtatgt Bg033 157 37951847 (Ips pini); 60299272 (Diaphorina citri); 73615611 (Alphis gossypii); 84648237 (Myzus persicae); 86461101 (Acyrthosiphon pisum); 52630958 (Toxoptera citricida); 34788040 (Callosobruchus maculatus); 60315015 (Tricholepisma aurea) accttcaacacccccgccatgtatgttgccatccaggc Bg033 158 37804525 (Rhopalosiphum padi); 86307561 (Culex pipiens); 62238804 (Diabrotica virgifera); 40310862 (Timarcha balearica); 49005801 (Drosophila melanogaster); 83933868 (Lutzomyia longipalpis) cccgccatgtatgttgccatccaggccgt Bg033 159 67782282 (Aedes aegypti); 48718502 (Anopheles funestas); 18933335 (Anopheles gambiae); 58385473 (Anopheles gambiae str. PEST); 66509773 (Apis mellifera); 45331062 (Megachile rotundata); 18923947 (Anopheles gambiae); 60312762 (Gryllus bimaculatus); 90137292 (Spodopterafrugiperda) gccatccaggccgtgctgtccct Bg033 160 60312762 (Gryllus bimaculatus) tacgcttccggccgtaccactggtattgtg Bg033 161 30031443 (Toxopteracitricida) gcttccggccgtaccactggtat Bg033 162 34788040 (Callosobruchus maculatus); 19613046 (Anopheles gambiae); 92043996 (Drosophila willistoni); 58375293 (Anopheles gambiae str. PEST) cgtaccactggtattgtgctggactctggtga Bg033 163 18938956 (Anopheles gambiae); 92926094 (Drosophila virilis) ggtattgtgctggactctggtgacgg Bg033 164 92473382 (Drosophila erecta); 78050191 (Heliconius erato); 78230609 (Helioconius erato/himera mixed EST library) ggtgacggcgtctcccacaccgt Bg033 165 29556355 (Bombyx mori); 55923288 (Locusta migratória) gtctcccacaccgtacccatctatgaaggtta Bg033 166 60304032 (Eucinetus sp.); tcccacaccgtacccatctatgaaggttacgc 64/81

37951847 (Ips pini); 60310034 (Scarabaeus laticollis); 55913655 (Locustamigratoria) Bg033 167 60311532 (Euclidia glyphica); 60311490 (Euclidia glyphica); 62387510 (Reticulitermes flavipes); 60309684 (Scarabaeus laticollis) tgaagtaccccattgaacatggaatcatcaccaactg gga Bg033 168 92948842 (Drosophila ananassae); 62387555 (Reticulitermes flavipes); 3113938 (Drosophila melanogaster); 68267390 (Drosophila simulans); 12802910 (Coptotermes acinaciformis); 55917578 (Locusta migratória); 78050191 (Heliconiuserato) tgccccatgccatcctgcgtctggactt Bg033 169 78231052 (Heliconius erato/himera mixed EST library); 29551161 (Bombyx mori); 55888553 (Locusta migratória); 33528426 (Trichoplusia ni); 22474252 (Helicoverpa armigera); 55896579 (Locusta migratória) gccatcctgcgtctggacttggccggccgt Bg033 170 55924447 (Locusta migratória); 57963831 (Heliconius melpomene); 293219 (Manduca sexta); 60314729 (Tricholepisma aurea); 50818292 (Heliconius melpomene) cgtctggacttggccggccgtgacttgac Bg033 171 55901019 (Locusta migratória); 67877117 (Drosophila pseudoobscura); 42765807 (Armigeres subalbatus); 92044691 (Drosophila willistoni); 91718815 (Liriomyza huidobrensis); 67838313 (Drosophila pseudoobscura) cgtgacttgactgactacctgatgaagatcct Bg033 172 13761518 (Drosophila melanogaster); 18938956 (Anopheles gambiae); 18923947 (Anopheles gambiae); 18933335 (Anopheles gambiae); 18928068 (Anopheles gambiae); 77731484 (Aedes aegypti); 21260592 (Culex pipiens); 20146853 (Simulium vittatum); 51978737 (Bacillus cereus) gactacctgatgaagatcctgaccgagcgtggctac Bg033 173 12802910 (Coptotermes acinaciformis) atgaagatcctgaccgagcgtggctacagcttcac Bg033 174 84648237 (Myzus persicae); ggaatcatcaccaactgggatgacatgga 86461101 (Acyrthosiphon pisum); 73618206 (Aphis gossypii); 55913634 (Locusta migratória); 37804558 (Rhopalosiphum padi); 52630958 (Toxoptera citricida); 37593622 (Pediculus humanus); 49395567 (Drosophila melanogaster); 37951847 (Ips pini) Bg033 175 55888553 (Locusta migratória); 53883538 (Plutella xylostella); 29535046 (Bombyx mori); 2700128 (Drosophila melanogaster); 50560971 (Homalodisca coagulata); 55901019 (Locusta migratória); 29551161 (Bombyx mori); 55901019 (Locusta migratória); 22474062 (Helicoverpa armigera); 50560971 (Homalodisca coagulata); 55888553 (Logusta migratória); 53883538 (Plutella xylostella); 29556355 (Bombyx mori); 55901019 (Locusta migratória); 55901019 (Locusta Migratória) atcatcaccaactgggatgacatggagaagatctggc a Bg033 176 677900 (Aedes aegypti); 42764600 (Armigeres subalbatus); 51978737 (Bacillus cereus); 86465013 (Bombyx mori); 90811718 (Culex pipiens); 92460622 (Drosophila erecta); 67838495 (Drosophila pseudoobscura); 92926494 (Drosophila virilis); 83934452 (Lutzomya longipalpis); 90814004 (Nasonia vitripennis); 71547039 (Oncometopia nigricans); 60315012 (Tricholepisma aurea); 71048162 (Oncometopia nigricans); 82610902 (Tineola bisselliella); 60310034 (Scarabaeus laticollis); 5853355 (Lymantria dispar); 60309684 (Scarabaeus laticollis); 49005801 (Drosophila melanogaster); 60314849 (Tricholepisma aurea); 60312762 (Gryllus bimaculatus); gacatggagaagatctggcatcacaccttctacaa C'7

60314729 (Tricholepisma aurea); 60311532 (Euclidia glyphica); 3338522 (Drosophila melanogaster); 55886573 (Locusta migratória); 34579881 (Aedes aegypti); 25959205 (Meladema coriacea); 57963831 (Heliconius melpomene); 58371832 (Lonomia oblíqua); 78230609 (Heliconius erato/himera mixed EST library) Bg033 177 25957102 (Carabus granulatus); 18939947 (Anopheles gambiae); 56152104 (Rhynchosciara americana); 60315012 (Tricholepisma aurea); 60310833 (Agriotes lineatus); 60297606 (Diaprepes abbreviatus); 25958625 (Curculio glandium); 34787974 (Callosobruchus maculatus) atggagaagatctggcatcacaccttctacaatgaa Bg033 178 25956583 (Biphyllus lunatus); 37951847 (Ips pini); 40544541 (Tribolium castaneum); 56772582 (Drosophila virilis); 34788040 (Callosbruchus maculatus); 25956497 (Biphyllus lunatus) aagatctggcatcacaccttctacaatgaactccg Bg033 179 16901057 (Ctenocephalides felis); 56772662 (Drosophila virilis); 60310833 (Agriotes lineatus); 57963831 (Heliconius melpomene); 60297606 (Diaprepes abbreviatus); 60314729 (Tricholepisma aurea); 60311490 (Euclidia glyphica); 87266181 (Choristoneura fiimiferana); 62239347 (Diabrotica virgifera); 60315015 (Tricholepisma aurea); 677900 (Aedes aegypti); 51978737 (Bacillus cereus); 5853355 (Lymantria dispar); 55783599 (Apriona germari); 83934452 (Lutzomyia longipalpis); 19848020 (Chelonus inanitus); 82610902 (Tineola bisselliella); 42765392 (Armigeres subalbatus); 82611040 (Troxsp.) atctggcatcacaccttctacaatgaactccgagt 67/81 Φ-

TABELA 5 Alvo ID SEQID N2 Exemplo número e espécies GI Seqüência* Bg005 180 82835847 (Boophilus microplus); 63511642 (Ixodes scapularis) aacgtgttcaagaacaagcgtgtcct Bg005 181 82835847 (Boophilus microplus) catccacaagaagaaggctgagaaggccagg Bg031 182 21642857 (Amblyomma variegatum); 4325305 (Boophilus microplus); 49549243 (Rhipicephalus appendiculatus) gccatcaagaagaagatgcaggcgatgaagctggagaagga Bg031 183 22758956 (Haemaphysalis longicornis) cctgcagaagaagatccagcagat Bg031 184 83308264 (Dermanyssus gallinae); 22758956 (Haemaphysalis longicornis) aagatgcaggcgatgaagctggagaaggacaa Bg031 185 21642857 (Amblyomma variegatum); 29779612 (Ornithodoros porcinus) gagaaggacaaggccctgcag Bg031 186 10707547 (Amblyomma americanum); 21642025 (Amblyomma variegatum); 49535169 (Rhipicephalus appendiculatus) gttgtcggcaacaacctgaagtccct Bg031 187 29779612 (Ornithodoros porcinus) aaggaggctgaagctcgtgctga Bg033 188 28627064 (Mesobuthus gibbosus) gaggcccagagcaagagaggtatcctc Bg033 189 68767268 (Acanthoscurria gomesiana) cagagcaagagaggtatcctcac Bg033 190 18143239 (Araneus ventricosus) gcccagagcaagagaggtatcctcactctgaagt Bg033 191 32423713 (Haemaphysalis lingicornis) aaggccaacagggagaagatgac Bg033 192 45269080 (Ornithodoros moubata) gagaagatgactcaaatcatgtt Bg033 193 32423713 (Haemaphysalis longicornis) ggtatcctcactctgaagtaccccattga Bg033 194 68764791 (Acanthoscurriagomesiana) atcatgtttgagaccttcaac Bg033 195 10708501 (Amblyomma americanum); 60730229 (Ixodes ricinus); 63510574 (Ixodes scapularis); 49538235 (Rhipicephalus appendiculatus); 77539276 (Ornithodoros moubata); 29779134 (Ornithodoros porcinus) gagaccttcaacacccccgccatgta Bg033 196 10708501 (Amblyomma americanum) gccatccaggccgtgctgtccct Bg033 197 77539276 (Ornithodoros moubata); 29779134 (Ornithodoros porcinus); 68764791 (Acanthoscurriagomesiana) gtctcccacaccgtacccatctatgaaggttacgc Bg033 198 68767268 (Acanthoscurria gomesiana); 77539276 (Ornithodoros moubata); 29779134 (Ornithodoros porcinus); 45269080 (Ornithodoros moubata); 68758323 (Acanthoscurria gomesiana) tcaccaactgggatgacatggagaagatctggcatcacac Bg033 199 68764791 (Acanthoscurriagomesiana) gacatggagaagatctggcatcacaccttctacaa Bg033 200 18143239 (Araneus ventricosus); 28627064 (Mesobuthus gibbosus) atggagaagatctggcatcacaccttctacaatgaactccg Gf)

EXEMPLOS Exemplo 1

Clonagem de uma seqüência parcial dos genes da Blattella germanica BgOOl, Bg003, Bg004 e Bg005 por PCR família.

Foi isolado RNA de alta qualidade e intacto da Blattella

germanica (origem: Central Science Laboratory, York) usando Reagente TRIzol (Cat. N°. 15596-026/15596-018, Invitrogen, Rockville, Maryland, USA) seguindo as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na preparação RNA foi removido por tratamento DNase como indicado pelo fabricante.O cDNA foi gerado usando um kit disponível no comércio (SuperScript™ III Reverse Transcriptase, Cat N0 18080044, Invitrogen, Rockville,- Maryland, USA) seguindo as instruções do fabricante.

Para isolar as seqüências de cDNA compreendendo uma porção dos genes BgOO 1, Bg003, Bg004 e Bg005, foi feita uma série de reações PCR com primers degenerados usando Amplitaq Gold (Cat. N°. N8080240; Applied Biosystems) seguindo as instruções do fabricante.

Para BgOO 1, os primers degenerados oGBKA002 e oGBKA020 (representados aqui como SEQ ID Na 3 e SEQ ID N2 4 respectivamente) foram usados em duas reações PCR independentes nas seguintes condições: 10 minutos a 95 °C, seguidos por 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 57 0C e 1 minuto a 72 °C, seguido por 7 minutos a 72 °C. Os produtos PCR resultantes foram analisados em gel agarose, purificados (QlAquick Gel Extraction Kit; Cat. N0 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4-TOPO (Cat. N°. K4575-40, Invitrogen) e seqüenciados. A seqüência de consenso resultante do sequenciamento de ambos os produtos PCR está aqui representada por SEQ ID Na 1 e é mencionada como a seqüência parcial do gene BgOO 1. A seqüência aminoácida parcial correspondente está aqui representada como SEQ ID N2 2.

Para Bg003, os primers degenerados oGBKOOOl e oGBKCOlO (representados aqui como SEQ ID N2: 13 e SEQ ID N2: 14 respectivamente) foram usados em duas reações PCR independentes nas seguintes condições: 10 minutos a 95 0C, seguidos por 40 ciclos de 30 segundos a 95 0C5 1 minuto a 55 0C e 1 minuto a 72 °C, seguido por 7 minutos a 72 0C. Os produtos PCR resultantes foram analisados em gel agarose, purificados (QlAquick Gel Extraction Kit; Cat. N0 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4-TOPO (Cat. N°. K4575-40, Invitrogen) e seqüenciados. A seqüência de consenso resultante do sequenciamento de ambos os produtos PCR está aqui representada por SEQ ID N2 11 e é mencionada como a seqüência parcial do gene Bg003. A seqüência aminoácida parcial correspondente está aqui representada como SEQ ID N2 12.

Para Bg004, os primers degenerados oGBKDOOl e 0GBKDOO6 (representados aqui como SEQ ID N2 23 e SEQ ID N2 24, respectivamente) foram usados em duas reações PCR independentes nas seguintes condições: minutos a 95 °C, seguidos por 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50 0C e 1 minuto a 72 °C, seguido por 7 minutos a 72 °C. Os produtos PCR resultantes foram analisados em gel agarose, purificados (QlAquick Gel Extraction Kit; Cat. N0 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4-TOPO (Cat. N°. K4575-40, Invitrogen) e seqüenciados. A seqüência de consenso resultante do sequenciamento de ambos os produtos PCR está aqui representada por SEQ ID N2 21 e é mencionada como a seqüência parcial do gene Bg004. A seqüência aminoácida parcial correspondente está aqui representada como SEQ ID N2 22.

Para Bg005, os primers degenerados oGBKE002 e oGBKE009 (representados aqui como SEQ ID N2 33 e SEQ ID N2 34, respectivamente) foram usados em duas reações PCR independentes nas seguintes condições: minutos a 95 0C, seguidos por 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 52 0C e 1 minuto a 72 °C, seguido po7 minutos a 72 °C. Os produtos PCR resultantes foram analisados em gel agarose, purificados (QlAquick Gel Extraction Kit; Cat. N0 28706, Qiagen), clonados no vetor QU

pCR4-TOPO (Cat. N°. K4575-40, Invitrogen) e seqüenciados. A seqüência de consenso resultante do sequenciamento de ambos os produtos PCR está aqui representada por SEQ ID Nfi 31 e é mencionada como a seqüência parcial do gene Bg005. A seqüência aminoácida parcial correspondente está aqui representada como SEQ ID N2 32. Exemplo 2

Clonagem de uma seqüência parcial dos genes da Blattella germanica Bg031, Bg032 e Bg033 pela seqüência EST.

Foi isolado RNA de alta qualidade e intacto da Blattella germanica (origem: Central Science Laboratory, York) usando Reagente TRlzol (Cat. N°. 15596-026/1596-018, Invitrogen, Rockville, Maryland, USA) seguindo as instruções do fabricante. O DNA genômico presente na preparação RNA foi removido por tratamento DNase como indicado pelo fabricante.O cDNA foi gerado usando um kit disponível no comércio (SuperScript™ IU Reverse Transcriptase, Cat N0 18080044, Invitrogen, Rockville, Maryland, USA) seguindo as instruções do fabricante.

Para identificar uma seqüência parcial cDNA dos genes Bg031, Bg032 e Bg033, foi encontrado um EST por gene na base de dados pública Genbank de acordo com os números de acesso AF260897, X73679 e AY004248, respectivamente, originários da base pública de dados Genbank.

Para isolar as seqüências cDNA compreendendo uma parte dos genes Bg031, Bg032 e Bg033, foi feita uma série de reações PCR com primers específicos em base EST usando Perfectshot™ ExTaq (Cat N0 RR005A, TAKARA BIO INC.) como indicado pelo fabricante.

Para Bg031, foram usados os primers específicos oGBLAOOl e OGBLA002 (ora representados como SEQ ID N2 43 e SEQ ID N2 44, respectivamente) em duas reações independentes PCR nas seguintes condições: 10 minutos a 95 0C, seguidos por 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 0C e 1 minuto a 72 °C, seguido por 7 minutos a 72 °C: 71/81

Os produtos PCR resultantes foram analisados em gel agarose, purificados (QlAquick Gel Extraction Kit; Cat. N0 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4-TOPO (Cat. N°. K4575-40, Invitrogen) e seqüenciados. A seqüência de consenso resultante do sequenciamento de ambos os produtos PCR está aqui representada por SEQ ID Ns 41 e é mencionada como a seqüência parcial do gene Bg031. A seqüência aminoácida parcial correspondente está aqui representada como SEQ ID N2 42.

Para Bg032, foram usados os primers específicos oGBLB003 e oGBLB004 (ora representados como SEQ ID N2: 51 e SEQ ID N2: 52, 0 respectivamente) em duas reações independentes PCR nas seguintes condições: 10 minutos a 95 0C, seguidos por 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 0C e 1 minuto a 72 °C, seguido por 7 minutos a 72 0C: Os produtos PCR resultantes foram analisados em gel agarose, purificados (Q1 Aquick Gel Extraction Kit; Cat. N0 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4-TOPO (Cat. N°. K4575-40, Invitrogen) e seqüenciados. A seqüência de consenso resultante do sequenciamento de ambos os produtos PCR está aqui representada por SEQ ID N2 49 e é mencionada como a seqüência parcial do gene Bg032. A seqüência aminoácida parcial correspondente está aqui representada como SEQ ID N2 50.

ê.3

^èo Para Bg033, foram usados os primers específicos oGBLOOOl e

oGBL0004 (ora representados como SEQ ID N2 59 e SEQ ID N2 60 respectivamente) em duas reações independentes PCR nas seguintes condições: 10 minutos a 95 0C, seguidos por 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 0C e 1 minuto a 72 °C, seguido por 7 minutos a 72 °C. Os produtos PCR resultantes foram analisados em gel agarose, purificados (QlAquick Gel Extraction Kit; Cat. N0 28706, Qiagen), clonados no vetor pCR4-TOPO (Cat. N°. K4575-40, Invitrogen) e seqüenciados. A seqüência de consenso resultante do sequenciamento de ambos os produtos PCR está aqui representada por SEQ ID N2 57 e é mencionada como a seqüência parcial do gene Bg033 gene. A seqüência aminoácida parcial

Ge>L· <$&ò

correspondente está aqui representada como SEQ ID N2 58. Exemplo 3

Produção de dsRNA dos genes da Blattella germanica BgOOl, Bg003, Bg004, Bg005, Bg031, Bg032 e Bg033.

j O dsRNA foi sintetizado em quantidades de miligramas usando o

kit disponível comercialmente T7 RiboMAX™ Express RNAi System (Cat. N°. P1700, Promega). Os primeiros dois gabaritos promotores de polimerase 5' T7 RNA simples separados foram gerados em duas reações PCR separadas, cada reação contendo a seqüência alvo em uma orientação diferente relativa 0 ao promotor T7.

Para BgOO 1, o gabarito T7 de sentido foi gerado usando o primer específico T7 FW oGBLDOOl e o primer específico RV oGBLDOlO (ora representados como SEQ ID Ne 5 e SEQ ID Ns 6, respectivamente) em uma reação PCR nas seguintes condições: 4 minutos a 95°C, seguidos por 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 51°C e 1 minuto a 72°C, seguido por 10 minutos a 72°C. O gabarito Tl anti-sentido foi gerado usando o primer FW específico oGBLD009 e o primer específico T7 RV oGBLD002 (ora representados como SEQ ID N- 7 e SEQ ID N- 8, respectivamente) em uma reação PCR com as mesmas condições acima descritas. Os produtos r20 PCR resultantes foram analisados em gel agarose e purificados por precipitação de NaCIO^ Os gabaritos T7 FW e RV gerados foram misturados para serem transcritos, sendo aneladas as fitas RNA resultantes, tratados com Dnase e Rnase e purificados com acetato de sódio, segundo as instruções do fabricante. A fita sentido do dsRNA resultante está aqui representada por SEQID Na 9.

Para Bg003 o gabarito T7 de sentido foi gerado usando o primer específico T7 FW oGBLD003 e o primer específico RV oGBLD012 (ora representados como SEQ ID N2 15 e SEQ ID N2 16, respectivamente) em uma reação PCR nas seguintes condições: 4 minutos a 95°C, seguidos por 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 51°C e 1 minuto a 72°C, Ψ-

seguido por 10 minutos a 72°C. O gabarito T7 anti-sentido foi gerado usando o primer FW específico oGBLD009 e o primer específico FW oGBLDOl 1 e o primer específico T7 RV oGBLD004 (ora representados como SEQ ID N2: 17 e SEQ ID N2: 18, respectivamente) em uma reação PCR com as mesmas condições acima descritas. Os produtos PCR resultantes foram analisados em gel agarose e purificados por precipitação de NaCIO4. Os gabaritos T7 FW e RV gerados foram misturados para serem transcritos, sendo aneladas as fitas RNA resultantes, tratados com Dnase e Rnase e purificados com acetato de sódio, segundo as instruções do fabricante. A fita sentido do dsRNA O resultante está aqui representada por SEQID Ns 19.

Para Bg004, o gabarito T7 de sentido foi gerado usando o primer específico T7 FW oGBLD005 e o primer específico RV oGBLD014 (ora representados como SEQ ID N2 25 e SEQ ID N2 26, respectivamente) em uma reação PCR nas seguintes condições: 4 minutos a 95°C, seguidos por 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 51°C e 1 minuto a 72°C, seguido por 10 minutos a 72°C. O gabarito T7 anti-sentido foi gerado usando o primer FW específico oGBLD013 e o primer específico T7 RV 0GBLDOO6 (ora representados como SEQ ID N2: 27 e SEQ ID N2: 28 respectivamente) em uma reação PCR com as mesmas condições acima descritas. Os produtos iSo PCR resultantes foram analisados em gel agarose e purificados por precipitação de NaCIO4. Os gabaritos T7 FW e RV gerados foram misturados para serem transcritos, sendo aneladas as fitas RNA resultantes, tratados com Dnase e Rnase e purificados com acetato de sódio, segundo as instruções do fabricante. A fita sentido do dsRNA resultante está aqui representada por SEQID N2 29.

Para Bg005, o gabarito T7 de sentido foi gerado usando o primer específico T7 FW oGBLD007 e o primer específico RV 0GBLDOI6 (ora representados como SEQ ID N2 35 e SEQID N2 36 respectivamente) em uma reação PCR com as seguintes condições: 4 minutos a 95 °C, seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 51 0C e 1 minuto a 72 °C, Q>£ Φ

seguido por 10 minutos a 72 °C. O gabarito T7 anti-sentido foi gerado usando o primer FW específico oGBLD015 e o primer T7 RV específico 0GBLDOO8 (ora representados como SEQ ID Na: 37 e SEQ ID N2: 38 respectivamente) em uma reação PCR com as mesmas condições acima descritas. Os produtos PCR resultantes foram analisados em gel agarose e purificados por precipitação de NaCIO4. Os gabaritos T7 FW e RV gerados foram misturados para serem transcritos, sendo aneladas as fitas RNA resultantes, tratados com Dnase e Rnase e purificados com acetato de sódio, segundo as instruções do fabricante. A fita sentido do dsRNA resultante está aqui representada por ^LO SEQID N2 39.

Para Bg031, o gabarito T7 de sentido foi gerado usando o primer específico T7 FW oGBLA007 e o primer específico RV oGBLA002 (ora representados como SEQ ID N2 45 e SEQ ID N2 44 respectivamente) em uma reação PCR com as seguintes condições: 4 minutos a 95 0C, seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 95 0C, 30 segundos a 51 0C e 1 minuto a 72 °C, seguido por 10 minutos a 72 0C. O gabarito T7 anti-sentido foi gerado usando o primer FW específico oGBLAOOl e o primer T7 RV específico 0GBLAOO8 (ora representados como SEQ ID N2 43 e SEQ ID N2 46 respectivamente) em uma reação PCR com as mesmas condições acima descritas. Os produtos w20 PCR resultantes foram analisados em gel agarose e purificados por precipitação de NaCIO4. Os gabaritos T7 FW e RV gerados foram misturados para serem transcritos, sendo aneladas as fitas RNA resultantes, tratados com Dnase e Rnase e purificados com acetato de sódio, segundo as instruções do fabricante. A fita sentido do dsRNA resultante está aqui representada por SEQID N2 47.

For Bg032, o gabarito T7 de sentido foi gerado usando o primer específico T7 FW oGBLB007 e o primer específico RV oGBLB004 (ora representados como SEQID N2 53 e SEQID N2 52 respectivamente) em uma reação PCR com as seguintes condições: 4 minutos a 95 0C seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 95 0C, 30 segundos a 51 0C e 1 minuto a 72 °C, 75/81 ^

seguido por 10 minutos a 72 °C. O gabarito T7 anti-sentido foi gerado usando o primer FW específico oGBLB003 e o primer T7 RV específico 0GBLBOO8 (ora representados como SEQ ID Nfl 51 e SEQ ID Na 54 respectivamente) em uma reação PCR com as mesmas condições acima descritas. Os produtos PCR resultantes foram analisados em gel agarose e purificados por precipitação de NaCIO4. Os gabaritos T7 FW e RV gerados foram misturados para serem transcritos, sendo aneladas as fitas RNA resultantes, tratados com Dnase e Rnase e purificados com acetato de sódio, segundo as instruções do fabricante. A fita sentido do dsRNA resultante está aqui representada por SEQ ID N2 55.

Para Bg033, o gabarito T7 de sentido foi gerado usando o primer específico T7 FW oGBL0007 e o primer específico RV oGBL0004 (ora representados como SEQ ID N2 61 e SEQ ID N2 60 respectivamente) em uma reação PCR com as seguintes condições: 4 minutos a 95 °C, seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 95 0C, 30 segundos a 51 0C e 1 minuto a 72 0C seguido por 10 minutos a 72 0C. O gabarito T7 anti-sentido foi gerado usando o primer FW específico oGBLCOOl e o primer T7 RV específicooGBL0008 (ora representados como SEQ ID N2 59 e SEQ ID N2 62 respectivamente) em uma reação PCR com as mesmas condições acima descritas. Os produtos PCR resultantes foram analisados em gel agarose e purificados por precipitação de NaCIO4. Os gabaritos T7 FW e RV gerados foram misturados para serem transcritos, e as fitas RNA resultantes foram aneladas, tratadas com Dnase e Rnase, e purificadas com acetato de sódio, seguindo as instruções do fabricante. A fita sentido do dsRNA resultante está aqui 2 5 representada por SEQID N2 63.

Exemplo 4

Experimentos laboratoriais para triar alvos dsRNA para

atividade contra a Barata alemã, Blattella germânica.

Foram preparadas soluções estoque de 1-10μ^ρ1 dsRNA em água destilada. Cada solução dsRNA foi diluída até a concentração adequada e

misturada com dieta laboratorial finamente moída (Dieta padrão para ratos e camundongos, B&K Universal Ltd, Hull, UK), que foi previamente tratada termicamente de maneira a inativar todas as enzimas. A mistura ou formulação foi formada em pequenos grânulos de igual peso (0,3g) para se obter uma concentração final de 0,1% a 2% p/p de dsRNA e seca por uma noite em temperatura ambiente.

Ninfas recém-nascidas da Barata alemã, B. germanica foram confinadas por 10 em recipientes plásticos com tampas (29+2°C, mínimo de 40% de umidade relativa, com um fotoperíodo de 12 horas de iluminação e 12 horas de escuridão). Os animais não receberam alimentação 24 horas antes da exposição aos grânulos. As baratas foram avaliadas como vivas, moribundas ou mortas duas vezes por semana até a idade adulta. Os grânulos foram substituídos por grânulos recém-preparados uma vez a cada semana. Os grânulos, as formulações contendo dsRNA foram comparados com um controle negativo (solvente) e com um controle positivo (imidacloprida 1% ou 2%, comumente usada nas iscas para baratas disponíveis no comércio). Como mostrado na Figura 1, pelo menos 80% das baratas morreram em 24 dias após a primeira administração quando tratadas com BgOO 1, Bg003 e Bg005, ou em 29 dias quando tratadas com Bg004, respectivamente. Exemplo 5

Teste de eficiência com diferentes fragmentos. Identificação de um fragmento de genes da Blattella germanica BgOOlf Bg003, Bg004, Bg005, Bg031, Bg032 e Bg033 sem homologia substancial com humanos.

As seqüências parciais dos genes BgOO 1, Bg003, Bg004,

Bg005, Bg031, Bg032 e Bg033, ora representadas respectivamente como SEQ ID N2 1, SEQ ID N2 11, SEQ ID Na.21, SEQ ID Nfi 31, SEQ ID Ns 41, SEQ ID Nfi 49 e SEQ ID Na 57, foram analisadas para encontrar fragmentos sem homologia substancial com os organismos não alvo. Em particular, como o dsRNA será introduzido no organismo em moléculas <3^

siRNA, as seqüências foram verificadas com relação às seqüências siRNA que pudessem ter homologia com as espécies não alvo. Essas siRNA poderiam provocar efeitos adversos no organismo não alvo e devem, portanto de preferência ser evitadas no fragmento dsRNA a ser incorporado aos produtos finais. Os fragmentos selecionados são adequados para o controle de baratas pela interferência RNA quando, por exemplo estiverem presentes na isca e forem ingeridos por uma barata que dela se alimentar. Para esta análise, o organismo não alvo foi o humano (Homo sapiens). Foram identificados fragmentos de 21 nucleotídeos contíguos (bestl_human_21_0), ou 24 nucleotídeos contíguos que permitem três não combinações (bestl/2/3_human_24_3), que não ocorrem no organismo não alvo, sendo denominados no presente de "freefrags." A maior seqüência de BgOOl, Bg003, Bg004, Bg005, Bg031, Bg032 e Bg033 isenta das seqüências do organismo não alvo e que usa o primeiro critério de seleção foi fornecida na SEQ ID N- e denominada no presente como "freefrag". Essas freefrags BgOO 1, BgQ03, Bg004, Bg005, Bg031, Bg032 e Bg033, estão aqui representadas como SEQ ID Nfi 10, SEQ ID Na 20, SEQ ID N2 30, SEQ ID Na 40, SEQ ID Na 48, SEQ ID Na 56 e SEQ ID Na 64, respectivamente. O comprimento e a seqüência de alguns exemplos de outras seqüências freefrag adequadas para uso na presente invenção estão representadas na Tabela 2. A seqüência exata pode ser facilmente deduzida da tabela. Todas as seqüências freefrag descritas na tabela pertencem ao grupo de seqüências da invenção.

Um técnico no assunto reconhecerá que muitos mais desses

freefrags, de vários comprimentos, podem ser identificados nas seqüências da Blatella germanica ora apresentadas, assim como nas seqüências que são ortólogas dos genes e proteínas correspondentes nas outras seqüências de pragas de acordo com a invenção, e assim, a presente invenção é ampliada até esses outros freefrags identificáveis. G^Pi 78/81 P

Exemplo 6

Escolhendo o fragmento ideal; testando a eficácia dos concatâmeros.

Os concatâmeros foram projetados para cada gene alvo. Os concatâmeros são repetições sintéticas em tandem de 50 to 100 bp dsfragmentos. No presente exemplo, os concatâmeros foram projetados selecionando os melhores fragmentos possíveis em regiões com homologia na família protéica, assim como no nível nucleotídeo, em regiões que contenham os melhores siRNAs previstos e nas regiões com .0 teor GC entre 40 e 60%, de preferência cerca de um teor GC de 50%, se possível.

Para BgOO 1, foram projetados dois concatâmeros que consistem de uma repetição de cinco vezes de um fragmento 50 bp, isto é, representado pelas SEQ ID Nfi 65 e 66, resultando no concatâmero BgOOl 1 e no concatâmero BgOOl 2, ora representados respectivamente como SEQ ID Ns 67 e SEQ ID Na 68, sendo projetado um concatâmero que consiste de uma repetição de três vezes de uma repetição 100 bp, isto é, representado pela SEQ ID Na 69, resultando no concatâmero BgOOl 3, ora representado como SEQ ID Na 70. Os sítios de flanqueamento Xbal e Smal foram adicionados para a clonagem em um vetor para produzir dsRNA. Essas construções dsRNA compreendendo os concatâmeros foram testadas nos experimentos de laboratório com baratas.

Em um outro experimento mostrado na Figura 2, a mortalidade foi significativamente maior quando tratadas com o concatâmero BgOOl e BgOOl 2 comparado com o controle negativo (solvente).

Além da mortalidade, o tratamento mostrou um efeito significativo no desenvolvimento. Por exemplo, no dia 48, entre as baratas sobreviventes tratadas com BgOO 1, somente 33,3 % prosseguiram para o estágio adulto, considerando que nenhuma das baratas tratadas com o concatâmero BgOOl 2 alcançou neste tempo, como mostrado na Tabela 3. 79/81

Exemplo 7

Testando diferentes formulações.

A interferência RNA (RNAi) é uma ferramenta potencialmente muito poderosa para inibir a expressão de genes alvos de maneira seqüencial específica em muitas espécies diferentes. Entretanto, para o RNAi ser valioso e efetivo, o silenciamento específico de qualquer gene alvo dado é essencial, destituído de knockdown não específico e de efeitos colaterais tóxicos. As aplicações do dsRNA foram prejudicadas pela incapacidade de administrar efetivamente esses compostos a seus locais de ação dentro das células. O progresso da modificação h 0 química do dsRNA para aperfeiçoar a potência e a estabilidade de interação, sem a perda da especificidade, está em curso. Neste estudo, é feita uma avaliação de uns poucos conceitos para a administração de dsRNA a genes alvos na B. germanica.

Os efeitos induzidos pelo RNAi podem ser aperfeiçoados, aumentando a captação intracelular do dsRNA, facilitando a endocitose ou aumentando a estabilidade do dsRNA no ambiente biológico, usando agentes de administração como lipídeos e lipossomos. Os siRNAs possuem backbones fosfodiéster aniônicos e, por essa razão, é investigada a administração siRNA catiônica mediada por lipossomo/lipídeo (siFection). Estes sistemas catiônicos 2 O baseados em lipossomo/lipídeo são selecionados a partir de alguns produtos comercialmente disponíveis, incluindo a lipofectamina e o l,2-dioleoil-3- propanoato de trimetilamônio (DOTAP)-colesterol, e testar as formulações dsRNA nos experimentos laboratoriais com baratas. Os parâmetros a serem investigados incluem a taxa lipídeo:dsRNA da mistura, o alcance da formação de complexo catiônico lipossomo/lipídeo-dsRNA, o tamanho da partícula, o modo de administração e o efeito dose-resposta.

Exemplo 8

Testando a estabilidade do dsRNA.

A aplicação do dsRNA no silenciamento de genes será dependente dos aperfeiçoamentos na bioestabilidade, especificidade e administração molecular.

A estabilidade dos dsRNAs gerados foi testada em tampão TRIZMA com pH 7 e pH 9 e em tampão CAPS com pH 11 para imitar o pH no intestino de algumas das espécies alvo. O dsRNA foi incubado por vários dias e foram analisadas alíquotas em géis poliacrilamida a 20% em diferentes intervalos de tempo. Não puderam ser observadas influências do pH na estabilidade do dsRNA com base nos resultados do gel.

Foi testada a estabilidade dos dsRNAs gerados como função do tempo em água isenta de RNAse e em meio LB em temperatura ambiente por um período de oito meses. Foram tomadas alíquotas semanalmente e/ou mensalmente e armazenadas a -20°C antes da análise em géis poliacrilamida a 20%. Não foram observadas degradações significativas do dsRNA em um gel poliacrilamida como mostrado na Figura in Figure 3;

Exemplo 9

Experimento laboratorial para testar uma dose única de

dsRNA sobre a mortalidade no estágio precoce de ninfa da

Barata alemã, Blattella germanica.

Foi preparada uma solução estoque de ^g/pl de dsRNA em água destilada e misturada com dieta de laboratório finamente moída (Dieta padrão de ratos e camundongos, B&K Universal Ltd, Hull, UK), que foi previamente tratada termicamente para inativar quaisquer enzimas. A mistura ou formulação foi formada em pequenos grânulos de pesos iguais (0,3g) para ser obtida uma concentração final de 1% p/p de dsRNA e seca por uma noite em temperatura ambiente.

As ninfas recém-nascidas da Barata alemã, B. germanica foram confinadas por 10 em recipientes plásticos com tampas (29+2°C, mínimo de 40% de umidade relativa, com um fotoperíodo de 12 horas de iluminação e 12 horas de escuridão). Os animais não receberam alimentação 24 horas antes da exposição aos grânulos. Após uma semana, esta dose inicial foi substituída por grânulos não tratados. As baratas foram avaliadas como vivas, moribundas ou mortas duas vezes por semana até a idade adulta. O dsRNA BgOOlcontendo os grânulos mostrou mortalidade significativamente maior quando comparado aos dois controles negativos (solvente e dsRNA variado) como mostrado na Figura 4. CC3 1/46

<110> Devgen NV

<120> RNAi para o controle de insetos e aracnídeos <130> P79369WOOO <160> 200

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1 <211> 624 <212> DNA

<213> Blattella germânica

<400> 1 taaggcatgg atgttggaca agctcggtgg agtgtatgct ccaagaccaa gcacaggacc 60 tcacaagtta cgagagagtc tgccccttgt aatatttcttc gtaataggc tgaaatatgc 120 attaaccaac tgtgaggtta agaaaattgt tatgcagcgcc ttattaagg ttgatggaaa 180 agtcagaaca gaccccaact atccagctgg ttttatggat gttgttacaa ttgaaaaaac 240 tggagaattt ttccgtctga tttatgacgt gaaaggacgt ttcaccattc acagaataac 300 tgctgaagaa gccaagtata aactgtgcaa ggtaaagaga gtgcagactg ggcccaaggg 360 tattccattc ttggtgaccc atgatggtag aactcttaga tatcctgatc ctgtcatcaa 420 agttaatgat acagttcaac ttgacatcgc tacttccaag attatggata gcatcaaatt 480 tgataatggt aatctctgta tgattactgg aggccgtaac ttgggtcgtg ttggaactg 540 tagttaatcga gaacgtcatc ctggttcctt tgacattgtg catgttaaag attcacaagg 600 acacacattt gctaccagat tgaa 624

<210> 2 <211> 208 <212> PRT

<213> Blattella germânica <400> 2

Lys Ala Trp Met Leu Asp Lys Leu Gly Gly Val Tyr Ala Pro Arg Pro 10 15

Ser Thr Gly Pro His Lys Leu Arg Glu Ser Leu Pro Leu Val Ile Phe 25 30

Leu Arg Asn Arg Leu Lys Tyr Ala Leu Thr Asn Cys Glu Val Lys Lys 40 45

Ile Val Met Gln Arg Leu Ile Lys 50 55

Val Asp Gly Lys Val Arg Thr Asp 60 <&■ ιΡ» + <c ^,feS&ê^^áS-tf*^^^ «Ηώ.-* as?!* -FiW Jlr ^ ás. ^sai- i^- .Jr κ. . ^/iy ,a? «ki^l,__- n.^v.. CCM

2/46

Pro Asn Tyi—Pro—Ala Gly—Phe Met Asp Val—Val THr—Ile------GliT Eys Thr

65 70 75 80

Gly Glu Phe Phe Arg Leu Ile Tyr Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

85 90 95

His Arg Ile Thr Ala Glu Glu Ala Lys Tyr Lys Leu Cys Lys Val Lys 100 105 110

Arg Val Gln Thr Gly Pro Lys Gly Ile Pro Phe Leu Val Thr His Asp

115 120 125

Gly Arg Thr Leu Arg Tyr Pro Asp Pro Val Ile Lys Val Asn Asp Thr 130 135 140

Val Gln Leu Asp Ile Ala Thr Ser Lys Ile Met Asp Ser Ile Lys Phe 145 150 155 160

Asp Asn Gly Asn Leu Cys Met Ile Thr Gly Gly Arg Asn Leu Gly Arg

165 170 175

Val Gly Thr Val Val Asn Arg Glu Arg His Pro Gly Ser Phe Asp Ile 180 185 190

Val His Val Lys Asp Ser Gln Gly His Thr Phe Ala Thr Arg Leu Asn 195 200 205

<210> 3 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Degenerar primer <400>3

catttgaagc gtttwrmygc ycc 23

<210> 4 <211> 27 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer específico

<400>4

gtgcccttgc caatgatgaa cacgttg

27 *......... ......"" 5^"' V -....................-I~.~JL.-i.----«StSSi. ^^'''VtwSfc® 3/46 ^

<210> 5_____________________________________________

<211> 45 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer T7 específico <400>5

cgctaatacg actcactata ggggagtgta tgctccaaga ccaag 45

<210> 6 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<223> Primer específico

<400> 6

caatctggta gcaaatgtgt gtcc 24

<210> 7 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer específico <400>7

ggagtgtatg ctccaagacc aag 23

<210>8 <211> 46 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer T7 sintético

<400> 8

cgctaatacg actcactata ggcaatctgg tagcaaatgt gtgtcc 46

<210> 9 <211> 594 <212> RNA

<213> Blattella germanica

Co C (o

4/46

<4nn> o ggaguguaug cuccaagacc aagcacagga ccucacaagu uacgagagag ucugccccuu guaauauuuc uucguaauag gcugaaauau gcauuaacca acugugaggu uaagaaaauu guuaugcagc gccuuauuaa gguugaugga aaagucagaa cagaccccaa cuauccagcu gguuuuaugg auguuguuac aauugaaaaa acuggagaau uuuuccgucu gauuuaugac gugaaaggac guuucaccau ucacagaaua acugcugaag aagccaagua uaaacugugc aagguaaaga gagugcagac ugggcccaag gguauuccau ucuuggugac ccaugauggu agaacucuua gauauccuga uccugucauc aaaguuaaug auacaguuea acuugacauc gcuacuucca agauuaugga uageaucaaa uuugauaaug guaaucucug uaugauuacu ggaggccgua acuugggucg uguuggaacu guaguuaauc gagaacguca uccugguucc uuugacauug ugcauguuaa agauucacaa ggacacacau uugcuaccag auug

60 120 180 240 300 360 420 480 540 594

<210> 10 <211> 573 <212> RNA

<213> Blattella germanica

<400> 10 ggaguguaug cuccaagacc aagcacagga ccucacaagu uacgagagag ucugccccuu guaauauuuc uucguaauag gcugaaauau gcauuaacca acugugaggu uaagaaaauu guuaugcagc gccuuauuaa gguugaugga aaagucagaa cagaccccaa cuauccagcu gguuuuaugg auguuguuac aauugaaaaa acuggagaau uuuuccgucu gauuuaugac gugaaaggac guuucaccau ucacagaaua acugcugaag aagccaagua uaaacugugc aagguaaaga gagugcagac ugggcccaag gguauuccau ucuuggugac ccaugauggu agaacucuua gauauccuga uccugucauc aaaguuaaug auacaguuca acuugacauc gcuacuucca agauuaugga uagcaucaaa uuugauaaug guaaucucug uaugauuacu ggaggccgua acuugggucg uguuggaacu guaguuaauc gagaacguca uccugguucc uuugacauug ugcauguuaa agauucacaa gga

60 120 180 240 300 360 420 480 540 573

<210> 11 <211> 436 <212> DNA

<213> Blattella germânica

<400> 11 tcccaggcga ccttatgaaa aggcacgtct tgatcaggag ttgaaaatca taggagaata tggtcttagg aacaaacgtg aagtgtggcg agtcaagtat accttggcaa aaatccgtaa agctgccaga gaacttctga ctttggaaga gaaagatcag cgcaggttgt ttgaaggcaa tgctcttctt cgtcggttgg tgcgtattgg agtgttggat gaaaceegta tgaagcttga ttacgtcttg ggtttgaag attgaagattt cttggaacga cgtctccaaa cacaagtttt caagttgggg cttgcaaaat caatccatca tgctcgtgtg ctgatccgte aaagacatat cagggttcgt aagcaggtcg tgaatattcc aagcttcatt gtgagaettg attcccagaa gcatattgac ttetcg

60 120 180 240 300 360 420 436

<210> 12 <211> 145 <212> PRT

<213> Blattella germânica GG7

5/46

<4θ0> 12

Pro Arg Arg Pro Tyr Glu Lys Ala Arg Leu Asp Gln Glu Leu Lys Ile 10 15

Ile Gly Glu Tyr Gly Leu Arg Asn Lys Arg Glu Val Trp Arg Val Lys 25 30

Tyr Thr Leu Ala Lys Ile Arg Lys Ala Ala Arg Glu Leu Leu Thr Leu 40 45

Glu Glu Lys Asp Gln Arg Arg Leu Phe Glu Gly Asn Ala Leu Leu Arg 50 55 60

Arg Leu Val Arg Ile Gly Val Leu Asp Glu Thr Arg Met Lys Leu Asp 65 70 75 80

Tyr Val Leu Gly Leu Lys Ile Glu Asp Phe Leu GIu Arg Arg Leu Gln

85 90 95

Thr Gln Val Phe Lys Leu Gly Leu Ala Lys Ser Ile His His Ala Arg 100 105 110

Val Leu Ile Arg Gln Arg His Ile Arg Val Arg Lys Gln Val Val Asn 115 120 125

Ile Pro Ser Phe Ile Val Arg Leu Asp Ser Gln Lys His Ile Asp Phe 130 135 140

<210> 13 <211> 26 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<221> Degenerar primer <222> (18)..(18) <223> η = a, c, g ou t

<400> 13

tcggtcttct cgaagacnta ygtkac 26

<210> 14 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência artificial 6/46

<220>

<223> primer degenerativo <400> 14

ccgccgaagg gmgayttbag 20

<210> 15 <211> 43 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer T7 específico <400> 15

cgctaatacg actcactata ggcaggcgac cttatgaaaa ggc 43

<210> 16 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer específico <400> 16

cgagaagtca atatgcttct ggg 23

<210> 17 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer específico <400> 17

caggcgacct tatgaaaagg c 21

<210> 18 <211> 45 <212> DNA

<213> Seqüência artificial 7/46 Φ <220>----------------------------------------------

<223> primer T7 específico

<400> 18

cgctaatacg actcactata ggcgagaagt caatatgctt ctggg

<210> 19 <211> 433 <212> RNA

<213> Blattella germanica

<400> 19 60 120 180 240 300 360 420 433 caggcgaccu uaugaaaagg cacgucuuga ucaggaguug aaaaucauag gagaauaugg ucuuaggaac aaacgugaag uguggcgagu caaguauacc uuggcaaaaa uccguaaagc ugccagagaa cuucugacuu uggaagagaa agaucagcgc agguuguuug aaggcaaugc ucuucuucgu cgguuggugc guauuggagu guuggaugaa acccguauga agcuugauua CgUCUUgggU uugaagauug aagauuucuu ggaacgacgu cuccaaacac aaguuuucaa guuggggcuu gcaaaaucaa uccaucaugc ucgugugcug auccgucaaa gacauaucag gguucguaag caggucguga auauuccaag cuucauugug agacuugauu cccagaagca auuugacuuc ucg

<210> 20 <211> 412 <212> RNA

<213> Blattella germanica

<400> 20 60 120 180 240 300 360 412 caggcgaccu uaugaaaagg cacgucuuga ucaggaguug aaaaucauag gagaauaugg ucuuaggaac aaacgugaag uguggcgagu caaguauacc uuggcaaaaa uccguaaagc ugccagagaa cuucugacuu uggaagagaa agaucagcgc agguuguuug aaggcaaugc ucuucuucgu cgguuggugc guauuggagu guuggaugaa acccguauga agcuugauua CgUCUUgggU uugaagauug aagauuucuu ggaacgacgu cuccaaacac aaguuuucaa guuggggcuu gcaaaaucaa uccaucaugc ucgugugcug auccgucaaa gacauaucag gguucguaag caggucguga auauuccaag cuucauugug agacuugauu CC

<210> 21 <211> 418 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 10

tgtgaaagga

cttggttcat

agccgtgcgc

cctgtacaaa

caattccgtt

ggctccgggag

ccacgaggca

ccaaggctcc

accgtctgct

atgcgcgccg

attgaagtgc

tgaccgtca

ccttgaagcgcg

tgaaggtgga

ctcatattga

tgtatgccca

gtaacttctt

ccaattctcc

gtttcaag

aaaatggttt

gaacatgatt

tttccccatt

gggcgagaag

aaagcagaaa

catcttgctt

ggaacaaaga

aaaggagtca

aactgcgtaa

ttcatccgca

gacgagctc

tagatatcca

aggagttggc

caaagggttt

ccacagaaaa

gagtgaagat

attctggaggg

60 120 180 240 300 360 GVo 8/46 ^

caacgacatc------gaggatgtat — cgagatcagc-------cgcactcatc caacaatcga cgactgtgaa 420-------------------

gaacaaggac atccggaaat tccttgac 448

<210> 22 <211> 149 <212> PRT

<213> Blattella germânica <400> 22

Val Lys Gly Pro Arg Gly Thr Leu Lys Arg Gly Phe Lys His Leu Ala 10 15

Leu Asp Ile His Leu Val His Pro Arg Leu Leu Lys Val Glu Lys Trp 25 30

Phe Gly Thr Lys Lys Glu Leu Ala Ala Val Arg Thr Val Cys Ser His 40 45

Ile Glu Asn Met Ile Lys Gly Val Thr Lys Gly Phe Leu Tyr Lys Met 50 55 60

Arg Ala Val Tyr Ala His Phe Pro Ile Asn Cys Val Thr Thr Glu Asn 65 70 75 80

Asn Ser Val Ile Glu Val Arg Asn Phe Leu Gly GIu Lys Phe Ile Arg

85 90 95

Arg Val Lys Met Ala Pro Gly Val Thr Val Thr Asn Ser Pro Lys Gln 100 105 110

Lys Asp Glu Leu Ile Leu Glu Gly Asn Asp Ile Glu Asp Val Ser Arg 115 120 125

Ser Ala Ala Leu Ile Gln Gln Ser Thr Thr Val Lys Asn Lys Asp Ile 130 135 140

Arg Lys Phe Leu Asp 145

<210> 23 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer degenerativo adiante <220>

<221>misc feature Gvá

*<222> (12)..(13) _________________________

<223> η = a, c, g, ou t

<400> 23

gtgaaggccc gnntggtgac

<210> 24 <211> 26 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer degenerativo reverso <400> 24

gtcgtcttct cdgahacrta vagacc

<210> 25 <211> 43 <212> DNA <213>

<220> Seqüência artificial <223> primer T7 adiante

<400> 25

cgctaatacg actcactata gggtgaaagg accacgaggc acc

<210> 26 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer específico reverso <400> 26

ccgtcaagga atttccggat g

<210> 27 <211>21 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer específico adiante

<400> 27

gtgaaaggac cacgaggcac c

21 ggcttgatcc — caatgaaata— Q^^fTQQ off fr aittgauattg —caaataccaa ttccagacaa aatattcgta 60 aactgattaa agatggtctt atcatcaaga agcccgtagc tgtacactca agggcccgtg 120 ttcgcaagaa caccgaagca agaagaaaag gacgtcactg cggtttggc aaaaggaagg 180 gtacggcaaa tgcccgtatg ccacagaagg tcttgtggat taatcgcatg cgtgttctga 240 gaaggcttct caagaagtac agggaagcaa agaagatcga cagacatcta taccaccagc 300 tgtacatgaa ggccaagggt aacgtgttca agaacaagcg tgtcctgatg gagttcatcc 360 acaagaagaa ggctgagaag gccaggacaa agatgcttaa cgac 404

<210> 32 <211> 134 <212> PRT

<213> Blattella germanica

<400> 32 Leu Asp Pro Asn Glu Ile Asn Glu Ile Ala Asn Thr Asn Ser Arg Gln 1 5 10 15 Asn Ile Arg Lys Leu Ile Lys Asp Gly Leu Ile Ile Lys Lys Pro Val 20 25 30 Ala Val His Ser Arg Ala Arg Val Arg Lys Asn Thr Glu Ala Arg Arg 35 40 45 Lys Gly Arg His Cys Gly Phe Gly Lys Arg Lys Gly Thr Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Met Pro Gln Lys Val Leu Trp Ile Asn Arg Met Arg Val Leu Arg 65 70 75 80 Arg Leu Leu Lys Lys Tyr Arg Glu Ala Lys Lys Ile Asp Arg His Leu 85 90 95 Tyr His Gln Leu Tyr Met Lys Ala Lys Gly Asn Val Phe Lys Asn Lys 100 105 110 Arg Val Leu Met Glu Phe Ile His Lys Lys Lys Ala Glu Lys Ala Arg 115 120 125 Thr Lys Met Leu Asn Asp 130

<210> 33 <211> 26 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer degenerativo adiante <400> 33

tgcgatgcgg caaraaraag gtbtgg 26

<210> 34 <211> 19 <212> DNA

<213> Seqüência artificial aKSWMKaSàsaiísass^^ J^tJtgx jyff^Tfo f^, jgs . ^ «iSsceasáSseitiisa:

10/46

<210> 28

<211> 43 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer T7 específico reverso <400> 28

cgctaatacg actcactata ggccgtcaag gaatttccgg atg

<210> 29 <211> 449 <212> RNA

<213> Blattella germanica

43

<400> 29 gugaaaggac cacgaggcac cuugaagcgc gguuucaagc aucuugcuuu agauauccac 60 uugguucauc caaggcuccu gaagguggaa aaaugguuug gaacaaagaa ggaguuggca 120 gccgugcgca ccgucugcuc ucauauugag aacaugauua aaggagucac aaaggguuuc 180 cuguacaaaa ugcgcgccgu guaugcccau uuccccauua acugcguaac cacagaaaac 240 aauuccguua uugaagugcg uaacuucuug ggcgagaagu ucauccgcag agugaagaug 300 gcuccgggag ugaccgucac caauucucca aagcagaaag acgagcucau ucuggagggc 360 aacgacaucg aggauguauc gagaucagcc gcacucaucc aacaaucgac gacugugaag 420 aacaaggaca uccggaaauu ccuugacgg 449

<210 30 <211> 428 <212> RNA

<213> Blattella germanica

<400> 30 gugaaaggac cacgaggcac cuugaagcgc gguuucaagc aucuugcuuu agauauccac 60 uugguucauc caaggcuccu gaagguggaa aaaugguuug gaacaaagaa ggaguuggca 120 gccgugcgca ccgucugcuc ucauauugag aacaugauua aaggagucac aaaggguuuc 180 cuguacaaaa ugcgcgccgu guaugcccau uuccccauua acugcguaac cacagaaaac 240 aauuccguua uugaagugcg uaacuucuug ggcgagaagu ucauccgcag agugaagaug 300 gcuccgggag ugaccgucac caauucucca aagcagaaag acgagcucau ucuggagggc 360 aacgacaucg aggauguauc gagaucagcc gcacucaucc aacaaucgac gacugugaag 420 aacaagga 428

<210> 31 <211> 404 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 31 <220>

<223> primer degenerativo reverso <400> 34

gtcggcgagc ytcrgcytg

<210> 35 <211> 46 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer T7 específico adiante <400> 35

cgctaatacg actcactata ggggcttgat cccaatgaaa taaacg

<210> 36 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer específico reverso <400> 36

gtcgttaagc atctttgtcc tggc

<210> 37 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer específico adiante <400> 37

ggcttgatcc caatgaaata aacg <210> 38 <211> 46 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer T7 específico reverso <400> 38

cgctaatacg actcactata gggtcgttaa gcatctttgt cctggc 13/46 <z>

<210> 39 <211> 404 <212> RNA

<213> BIattella germanica

<400> 39

ggcuugaucc

aacugauuaa

uucgcaagaa

guacggcaaa

gaaggcuucu

uguacaugaa

acaagaagaa

caaugaaaua agauggucuu caccgaagca ugcccguaug eaagaaguae ggeeaagggu ggeugagaag

aaegaaauug aueaueaaga agaagaaaag ccacagaagg agggaagcaa aacguguuca gccaggacaa

caaauaccaa

agcccguagc

gacgucacug

ucuuguggau

agaagaucga

agaacaagcg

agaugcuuaa

uuccagacaa

uguacacuca

cgguuuuggc

uaaucgcaug

cagacaucua

uguccugaug

egae

aauauucgua

agggcccgug

aaaaggaagg

cguguucuga

uaccaccagc

gaguucaucc

60 120 180 240 300 360 404

<210> 40 <211> 383 <212> RNA

<213> Blattella germanica

<400> 40

ggcuugaucc caaugaaaua aaegaaauug caaauaccaa uuccagacaa aauauucgua 60 aacugauuaa agauggucuu aueaueaaga agcccguagc uguacacuca agggcccgug 120 uucgcaagaa caccgaagca agaagaaaag gacgucacug cgguuuuggc aaaaggaagg 180 guacggcaaa ugcccguaug ccacagaagg ucuuguggau uaaucgcaug cguguucuga 240 gaaggcuucu eaagaaguae agggaagcaa agaagaucga cagacaucua uaccaccagc 300 uguacaugaa ggeeaagggu aacguguuca agaacaagcg uguccugaug gaguucaucc 360 acaagaagaa ggeugagaag gcc 383

<210> 41 <211> 849 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 41 atggatgcca tcaagaa gaagatgcaggcg cgcgcccttc tctgcgaaca gcaggcccgc gaggaggccc gatccctgca gaagaagatc atggagcagt tgatgcaagt caacgccaag gctgagagtg aggtcgctgc cctcaaccgc aggtctgagg aacgtttggc cacagccacc gatgagtcag agcgagctcg taagattctt atggatgctt tggagaacca gctgaaggaa aaatatgatg aggtcgeacg taagttggct gagcgtgccg agactggtga atccaagatt ggcaacaacc tgaagtccct gaggtgtct tacaagcaac agattaagac tctgaatacc ttcgctgaaa gatccgtgca gaattgcag gtacacgaga aggagaagta caagtacatt cttattggc

atgaagctgg agaaggacaa cgcgatggat 60 gacgccaaca tccgggccga gaaggctgag 120 cagcagattg agaatgatct tgatcagacc 180 ctggacgaga aggacaaggc cctgcagaat 240 cgaatccaac tgctggagga ggatcttgag 300 egccaagttgg ctgaggcttc ccaggctgcc 360 gaatccaaag gcctggcaga tgaagagcgt 420 gccaggttca tggctgagga agctgacaag 480 atggttgagg ccgacttgga aagagcagaa 540 gtggagcttg aggaagaact gcgcgttgtc 600 gaagagaagg ccaacctgcg tgaggaagag 660 aggctaaagg aggctgaagc tcgtgctgag 720 aaggaggttga caggcttg aggatgaattg 780 tgtgacgatc ttgatatgac tttcaccgaa 840 849 14/46

<210> 42 <211> 283 <212> PRT

<213> Blattella germanica <400> 42

Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Ala Met Lys Leu Glu Lys Asp 1 5 10 15

Asn Ala Met Asp Arg Ala Leu Leu Cys GIu Gln Gln Ala Arg Asp Ala 25 30

Asn Ile Arg Ala Glu Lys Ala Glu Glu Glu Ala Arg Ser Leu Gln Lys 40 45

Lys Ile Gln Gln Ile Glu Asn Asp Leu Asp Gln Thr Met Glu Gln Leu 50 55 60

Met Gln Val Asn Ala Lys Leu Asp Glu Lys Asp Lys Ala Leu Gln Asn 65 70 75 80

Ala Glu Ser Glu Val Ala Ala Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Leu Glu

85 90 95

Glu Asp Leu Glu Arg Ser Glu Glu Arg Leu Ala Thr Ala Thr Ala Lys 100 105 100

Leu Ala Glu Ala Ser Gln Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Ala Arg Lys Π5 120 125

Ile Leu Glu Ser Lys Gly Leu Ala Asp Glu Glu Arg Met Asp Ala Leu 130 135 140

Glu Asn Gln Leu Lys Glu Ala Arg Phe Met Ala Glu Glu Ala Asp Lys 145 150 155 160

Lys Tyr Asp Glu Val Ala Arg Lys Leu Ala Met Val Glu Ala Asp Leu

165 170 175

Glu Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Thr Gly Glu Ser Lys Ile Val Glu 180 185 190

Leu Glu Glu Glu Leu Arg Val Val Gly Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu 195 200 205

Val Ser Glu Glu Lys Ala Asn Leu Arg Glu Glu Glu Tyr Lys Gln Gln 210 215 220 (377

Ile_____Lys Thr____Leu Asn Thr Arg Leu Lys Glu Ala Glu Ala Arg____Ala Glu

225 230 235 240

Phe Ala Glu Arg Ser Val Gln Lys Leu Gln Lys Glu Val Asp Arg Leu

245 250 255

Glu Asp Glu Leu Val His Glu Lys Glu Lys Tyr Lys Tyr Ile Cys Asp 260 265 270

Asp Leu Asp Met Thr Phe Thr GIu Leu Ile Gly 275 280

<210> 43 <211> 27 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer específico adiante <400> 43

atggatgcca tcaagaagaa gatgcag 27

<210> 44 <211> 30 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer específico reverso <400> 44

gccaataagt tcggtgaaag tcatatcaag 30

<210> 45 <211>46 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer T7 específico adiante <400> 45

cgctaatacg actcactata ggatggatgc catcaagaag aagatg 45

<210> 46 <211> 46 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer T7 específico reverso <400> 46

cgctaatacg actcactata gggccaataa gttcggtgaa agtcat 46

<210> 47 <211> 849 <212> RNA

<213> Blattella germanica

<400> 47

auggaugcca ucaagaagaa gaugcaggcg augaagcugg agaaggacaa cgcgauggau 60 cgcgcccuuc ucugcgaaca gcaggcccgc gacgccaaca uccgggccga gaaggcugag 120 gaggaggcce gaucccugca gaagaagauc cagcagauug agaaugaucu ugaucagacc 180 auggagcagu ugaugcaagu caacgccaag cuggaegaga aggacaaggc ccugcagaau 240 gcugagagug aggucgcugc ccucaaccgc cgaauccaac ugcuggagga ggaucuugag 300 aggucugagg aacguuuggc cacagccacc gccaaguugg cugaggcuuc ccaggcugcc 360 gaugagucag agcgagcucg uaagauucuu gaauccaaag gccuggcaga ugaagagcgu 420 auggaugcuu uggagaaeea gcugaaggaa gccagguuca uggcugagga agcugacaag 480 aaauaugaug aggucgcacg uaaguuggcu augguugagg ccgaeuugga aagagcagaa 540 gagcgugccg agacugguga auccaagauu guggagcuug aggaagaacu gcgcguuguc 600 ggcaacaacc ugaagucccu ugaggugucu gaagagaagg ccaaccugcg ugaggaagag 660 uacaagcaac agauuaagac ucugaauacc aggcuaaagg aggcugaagc ucgugcugag 720 uucgcugaaa gauccgugca gaaauugcag aaggagguug acaggcuuga ggaugaauug 780 guacacgaga aggagaagua caaguacauu ugugacgauc uugauaugac uuucaccgaa 840 cuuauuggc 849

<210> 48 <211> 821 <212> RNA

<213> Blattella germanica

<400> 48

ccaucaagaa gaagaugcag gcgaugaagc uggagaagga caacgcgaug gaucgcgccc 60 uucucugcga acagcaggc cgcgacgcca acauccgggc cgagaaggcu gaggaggagg 120 cccgaucccu gcagaagaag auccagcaga uugagaauga ucuugaucag accauggagc 180 aguugaugca agucaacgcc aagcuggacg agaaggacaa ggcccugcag aaugcugaga 240 gugaggucgc ugcccucaac cgccgaaucc aacugcugga ggaggaucuu gagaggucug 300 aggaacguuu ggccacagcc accgccaagu uggcugaggc uucccaggcu gccgaugagu 60 cagagcgagc ucguaagauu cuugaaucca aaggccuggc agaugaagag cguauggaug 420 cuuuggagaa ccagcugaag gaagccaggu ucauggcuga ggaagcugac aagaaauaug 480 augaggucgc acguaaguug gcuaugguug aggccgacuu ggaaagagca gaagagcgug 540 ccgagacugg ugaauccaag auuguggagc uugaggaaga acugcgcguu gucggcaaca 600 accugaaguc ccuugaggug ucugaagaga aggccaaccu gcgugaggaa gaguacaagc 660 aacagauuaa gacucugaau accaggcuaa aggaggcuga agcucgugcu gaguucgcug 720 aaagauccgu gcagaaauug cagaaggagg uugacaggcu ugaggaugaa uugguacacg 780 agaaggagaa guacaaguac auuugugacg aucuugauau g 821 G^1

17/46 CL·,

<210> 49 <211> 1300 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 49

gctctggagc tcatattccc ttcgcagtat gtggatcagg tggacctcga ggtctacgac 60 aatgtttctg caggaaagta cacggtgggg ttgggacagg ctcgcatggg gttctgcacg 120 gacagggagg acatcaactc tctgtgtctc accgtcgtca gtcgactgat ggaacgatgg 180 agcatccct actcgcaaat tgggcgcctg gaagtaggca ccgagaccct tctggacaag 240 tcgaagagcg tcaagactgt cctgatgcaa ctcttcaagg acaacacgga catcgagggc 300 gtggataccg tgaacgcctg ttacgggggc acctcggctc tcttcaatgc gatttcgtgg 360 gtggagtcca gctcctggga tggcaggtat gctcttgtgg tcgctgggga cattgctgt 420 gtatgctaaag gcagtgcgag gcccaccggt ggagcagggg ctgtggccat gctagtgggc 480 gccaatgct cccctagtgtt cgacagagga gttcgttcat cacacatgca acatgcttat 540 gacttctaca aaccggatct gtcctcgctg taccccaccg tggatggcaa gctgtcaatt 600 caatgctatc ttagtgcctt agatcattgt tatcaactgt actgctccaa gatccagaaa 660 caacttggag agaagttcga tattgagcgg ctggatgcag ttctcttcca cgcgccttat 720 tgtaagttgg tgcagaagtc tcttgctcgc ctcgtcttga acgactttgtg cgggcatca 780 gaggaggagc ggacgactaa atactccagt ctggaagcac taaaaggcgt gaagctagaa 840 gatacgtact tcgaccgaga agttgagaaa gcagtcatga catacagcaa gaacatgttt 900 gaagagaaaa caaagccctc gctgttgctc gccaaccaag tcggeaacat gtacactcct 960 tcgctttacg gaggttggt ctctctattg gtcagcaaga gcgcccagga gttggcaggg 1020 aagcgcgtgg ccttgtttc ttacggctcc ggactggcct cttccatgtt ctctctaagaa 1080 tatcatcgg acgccagcg cgaaatcttctc tgcaacgcc tcgtccgaa tctetcgcac 1140 atcaagccgc agctggatct gcgccacaag gtgtcaccag aggagtttgc acaaacgatg 1200 gagacgaggg aacacaacca ccacaaagct ccatacaccc agagggctc gatcgacgtc 1260 ttgtttccag gaacttggta tctggagagc gtggacagcc 1300

<210> 50 <211> 433 <212> PRT

<213> Blattella germanica <400> 50

Ala Leu Glu Leu Ile Phe Pro Ser Gln Tyr Val Asp Gln Val Asp Leu I0 I5

Glu Val Tyr Asp Asn Val Ser Ala Gly Lys Tyr Thr Val Gly Leu Gly

25 30

Gln Ala Arg Met Gly Phe Cys Thr Asp Arg Glu Asp Ile Asn Ser Leu

40 45

Cys Leu Thr Val Val Ser Arg Leu Met Glu Arg Trp Ser Ile Pro Tyr 50 55 60

Ser Gln Ile Gly Arg Leu Glu Val Gly Thr Glu Thr Leu Leu Asp Lys 65

70

-75

80

Ser Lys Ser Val Lys Thr Val Leu Met Gln Leu Phe Lys Asp Asn Thr

85 90 95

Asp Ile Glu Gly Val Asp Thr Val Asn Ala Cys Tyr Gly Gly Thr Ser 100 105 110

Ala Leu Phe Asn Ala Ile Ser Trp Val Glu Ser Ser Ser Trp Asp Gly Π5 120 125

Arg Tyr Ala Leu Val Val Ala Gly Asp Ile Ala Val Tyr Ala Lys Gly 130 135 140

Ser Ala Arg Pro Thr Gly Gly Ala Gly Ala Val Ala Met Leu Val Gly 145 150 155 160

Ala Asn Ala Pro Leu Val Phe Asp Arg Gly Val Arg Ser Ser His Met

165 170 175

Gln His Ala Tyr Asp Phe Tyr Lys Pro Asp Leu Ser Ser Leu Tyr Pro 180 185 190

Thr Val Asp Gly Lys Leu Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Ser Ala Leu Asp 195 200 205

His Cys Tyr Gln Leu Tyr Cys Ser Lys Ile Gln Lys Gln Leu Gly Glu 210 215 220

Lys Phe Asp Ile Glu Arg Leu Asp Ala Val Leu Phe His Ala Pro Tyr 225 230 235 240

Cys Lys Leu Val Gln Lys Ser Leu Ala Arg Leu Val Leu Asn Asp Phe

245 250 255

Val Arg Ala Ser Glu Glu Glu Arg Thr Thr Lys Tyr Ser Ser Leu Glu 260 265 270

Ala Leu Lys Gly Val Lys Leu Glu Asp Thr Tyr Phe Asp Arg Glu Val 275 280 285

Glu Lys Ala Val Met Thr Tyr Ser Lys Asn Met Phe Glu Glu Lys Thr 290 295 300

Lys Pro Ser Leu Leu Leu Ala Asn Gln Val Gly Asn Met Tyr Thr Pro

305 310 315 320

Ser Leu Tyr Gly Gly Leu Val Ser Leu Leu Val Ser Lys Ser Ala Gln

325 330 335 J^^j^iè^^.·^75ΦΚΦ.g^-^f r"?Sw^j.-..^ 19/46

Glu Leu Ala Gly Lys Arg Val Ala Leu Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Leu

34O 345 350

Ala Ser Ser Met Phe Ser Leu Arg Ile Ser Ser Asp Ala Ser Ala Glu

355 360 365

Ser Pro Leu Gln Arg Leu Val Ser Asn Leu Ser His Ile Lys Pro Gln

370 375 380

Leu Asp Leu Arg His Lys Val Ser Pro Glu Glu Phe Ala Gln Thr Met

385 390 395 400

Glu Thr Arg Glu His Asn His His Lys Ala Pro Tyr Thr Pro Glu Gly

405 410 415

Ser Ile Asp Val Leu Phe Pro Gly Thr Trp Tyr Leu Glu Ser Val Asp

420 425 430

Ser

<210> 51 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer específico adiante <400> 51

gctctggagc tcatattccc ttcgc

<210> 52 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer específico reverso <400> 52

ggctgtccac gctctccaga tacc

<210> 53 <211> 45 <212> DNA

<213> Seqüência artificial 20/46 ^ _______<220>_____________________________________________________________________________________________ ________________________________________________ ______________________________________________________________

<223> primer T7 específico adiante

<400> 53

cgctaatacg actcactata gggctctgga gctcatattc ccttc 45

<210> 54 <211> 41 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> primer T7 específico reverso <400> 54

cgctaatacg actcactata ggggctgtcc acgctctcca g 41

<210> 55 <211> 1300 <212>RNA

<213> Blattella germanica

<400> 55 gcucuggagc ucauauuccc uucgcaguau guggaucagg uggaccucga ggucuacgac 60 aauguuucug caggaaagua cacggugggg uugggacagg cucgcauggg guucugcacg 120 gacagggagg acaucaacuc ucugugucuc accgucguca gucgacugau ggaacgaugg 180 agcauccccu acucgcaaau ugggcgccug gaaguaggca ccgagacccu ucuggacaag 240 ucgaagagcg ucaagacugu ccugaugcaa cucuucaagg acaacacgga caucgagggc 300 guggauaccg ugaacgccug uuacgggggc accucggcuc ucuucaaugc gauuucgugg 360 guggagucca gcuccuggga uggcagguau gcucuugugg ucgcugggga cauugcugug 420 uaugcuaaag gcagugcgag gcccaccggu ggagcagggg cuguggccau gcuagugggc 480 gccaaugcuc cccuaguguu cgacagagga guucguucau cacacaugca acaugcuuau 540 gacuucuaca aaccggaucu guccucgcug uaccccaccg uggauggcaa gcugucaauu 600 caaugcuauc uuagugccuu agaucauugu uaucaacugu acugcuccaa gauccagaaa 660 caacuuggag agaaguucga uauugagcgg cuggaugcag uucucuucca cgcgccuuau 720 uguaaguugg ugcagaaguc ucuugcucgc cucgucuuga acgacuuugu gcgggcauca 780 gaggaggagc ggacgacuaa auacuccagu cuggaagcac uaaaaggcgu gaagcuagaa 840 gauacguacu ucgaccgaga aguugagaaa gcagucauga cauacagcaa gaacauguuu 900 gaagagaaaa caaagcccuc gcuguugcuc gccaaccaag ucggcaacau guacacuccu 960 ucgcuuuacg gagguuuggu cucucuauug gucagcaaga gcgcccagga guuggcaggg 1020 aagcgcgugg ccuuguuuuc uuacggcucc ggacuggccu cuuccauguu cucucuaaga 1080 auaucaucgg acgccagcgc gaaaucuucu cugcaacgcc ucgucucgaa ucucucgcac 1140 aucaagccgc agcuggaucu gcgccacaag gugucaccag aggaguuugc acaaacgaug 1200 gagacgaggg aacacaacca ccacaaagcu ccauacaccc cagagggcuc gaucgacguc 1260 uuguuuccag gaacuuggua ucuggagagc guggacagcc 1300

<210> 56 <211> 1279 <212> RNA Q?3 21/46 _

<213> Blattella germanica

<400> 56

gcucuggagc ucauauuccc uucgcaguau guggaucagg uggaccucga ggucuacgac 60 aauguuucug caggaaagua cacggugggg uugggacagg cucgcauggg guucugcacg 120 gacagggagg acaucaacuc ucugugucuc accgucguca gucgacugau ggaacgaugg 180 agcauccccu acucgcaaau ugggcgccug gaaguaggca ccgagacccu ucuggacaag 240 ucgaagagcg ucaagacugu ccugaugcaa cucuucaagg acaacacgga caucgagggc 300 guggauaccg ugaacgccug uuacgggggc accucggcuc ucuucaaugc gauuucgugg 360 guggagucca gcuccuggga uggcagguau gcucuugugg ucgcugggga cauugcugug 420 uaugcuaaag gcagugcgag gcccaccggu ggagcagggg cuguggccau gcuagugggc 480 gccaaugcuc cccuaguguu cgacagagga guucguucau cacacaugca acaugcuuau 540 gacuucuaca aaccggaucu guccucgcug uaccccaccg uggauggcaa gcugucaauu 600 caaugcuauc uuagugccuu agaucauugu uaucaacugu acugcuccaa gauccagaaa 660 caacuuggag agaaguucga uauugagcgg cuggaugcag uucucuucca cgcgccuuau 720 uguaaguugg ugcagaaguc ucuugcucgc cucgucuuga acgacuuugu gcgggcauca 780 gaggaggagc ggacgacuaa auacuccagu cuggaagcac uaaaaggcgu gaagcuagaa 840 gauacguacu ucgaccgaga aguugagaaa gcagucauga cauacagcaa gaacauguuu 900 gaagagaaaa caaagcccuc gcuguugcuc gccaaccaag ucggcaacau guacacuccu 960 ucgcuuuacg gagguuuggu cucucuauug gucagcaaga gcgcccagga guuggcaggg 1020 aagcgcgugg ccuuguuuuc uuacggcucc ggacuggccu cuuccauguu cucucuaaga 1080 auaucaucgg acgccagcgc gaaaucuucu cugcaacgcc ucgucucgaa ucucucgcac 1140 aucaagccgc agcuggaucu gcgccacaag gugucaccag aggaguuugc acaaacgaug 1200 gagacgaggg aacacaacca ccacaaagcu ccauacaccc cagagggcuc gaucgacguc 1260 uuguuuccag gaacuuggu 1279

<210> 57 <211> 451 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 57

gaggcccaga gcaagagagg tatcctcact ctgaagtacc ccattgaaca tggaatcatc 60 accaactggg atgacatgga gaagatctgg catcacacct tctacaatga actccgagtg 120 gctccagagg aacacccaat cctgctgact gaggctcccc tgaacccaaa ggccaacagg 180 gagaagatga ctcaaatcat gtttgagacc ttcaacaccc ccgccatgta tgttgccatc 240 caggccgtgc tgtccctcta cgcttccggc cgtaccactg gtattgtgct ggactctggt 300 gacggcgtct cccacaccgt acccatctat gaaggttacg cattgcccca tgccatcctg 360 cgtctggact tggccggccg tgacttgact gactacctga tgaagatcct gaccgagcgt 420 ggctacagct tcacaactac agcagagcga g 451

<210> 58 <211> 150 <212> PRT

<213> Blattella germanica Gp^

-ρ

<400> 58

Glu Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu 10 15

His Gly Ile Ile Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His 25 30

Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Ile Leu 40 45

Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr 50 55 60

Gln Ile Met Phe Glu Thr Phe Asn Thr Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile 65 70 75 80

Gln Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val

85 90 95

Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Ser His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly 100 105 110

Tyr Ala Leu Pro His Ala Ile Leu Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp 115 120 125

Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe 130 135 140

Thr Thr Thr Ala Glu Arg 145 150

<210> 59 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer degenerativo adiante <400> 59

gaggcccaga gcaagagagg tatcc 25

<210> 60 <211> 26 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>___________________________________________________________________________________

<223> primer degenerativo reverso

<400> 60

ctcgctctgc tgtagttgtg aagctg

<210> 61 <211> 42 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer T7 específico adiante <400> 61

cgctaatacg actcactata gggaggccca gagcaagaga gg

<210> 62 <211> 48 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> primer T7 específico reverso <400> 62

cgctaatacg actcactata ggtctgctgt agttgtgaag ctgtagcc

<210> 63 <211> 446 <212> RNA

<213> Blattella germanica

<400> 63

gaggcccaga gcaagagagg uauccucacu cugaaguacc ccauugaaca uggaaucauc 60 accaacuggg augacaugga gaagaucugg caucacaccu ucuacaauga acuccgagug 120 gcuccagagg aacacccaau ccugcugacu gaggcucccc ugaacccaaa ggcaaacagg 180 gagaagauga cucaaaucau guuugagacc uucaacaccc ccgccaugua uguugccauc 240 caggccgugc ugucccucua cgcuuccggc cguaccacug guauugugcu ggacucuggu 300 gacggcgucu cccacaccgu acccaucuau gaagguuacg cauugcccca ugccauccug 360 cgucuggacu UggCCggCCg ugacuugacu gacuaccuga ugaagauccu gaccgagcgu 420 ggcuacagcu ucacaacuac agcaga 446

<210> 64 <211> 108 <212> RNA

<213> Blattella germanica GZG

24/46 ^

<400> 64______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________

uggcaucaca ccuucuacaa ugaacuccga guggcuccag aggaacacc aauccugcug 60 acugaggcuc cccugaaccc aaaggccaac agggagaaga ugacucaa 108

<210> 65 <211> 50 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Fragmento sintético <400> 65

tatgctccaa gaccaagcac aggacctcac aagttacgag agagtctgcc 50

<210> 66 <211> 50 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Fragmento sintético <400> 66

cttgggtcgt gttggaactg tagttaatcg agaacgtcat cctggttcct 50

<210> 67 <211> 250 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Concatômero

<400> 67

tatgctccaa

gaccaagcac

aggacctcac

aagttacgag

agagtctgcc

gaccaagcac aggacctcac aagttacgag agagtctgcc

<210> 68 <211> 250 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

aggacctcac aagttacgag agagtctgcc tatgctccaa

aagttacgag agagtctgcc tatgctccaa gaccaagcac

agagtctgcc tatgctccaa gaccaagcac aggacctcac

tatgctccaa gaccaagcac aggacctcac aatgttacgag

60 120 180 240 250

<220>

<223> Concatômero <400> 68

cttgggtcgt

gttggaactg

tagttaatcg

agaacgtcat

cctggttcct

gttggaactg tagttaatcg agaacgtcat cctggttcct

<210> 69 <211> 100 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

tagttaatcg agaacgtcat cctggttcct cttgggtcgt

agaacgtcat cctggttcct cttgggtcgt gttggaactg

cctggttcct cttgggtcgt gttggaactg tagttaatcg

cttgggtcgt gttggaactg tagttaatcg agaacgtcat

60 120 180 240 250

<220>

<223> Fragmento sintético <400> 69

gctgaaatat gcattaacca actgtgaggt taagaaaatt gttatgcagc gccttattaa 60

ggttgatgga aaagtcagaa cagaccccaa ctatccagct 100

<210> 70 <211> 300 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Concatômero

<400> 70 gctgaaatat gcattaacca actgtgaggt ggttgatgga aaagtcagaa cagaccccaa actgtgaggt taagaaaatt gttatgcagc cagaccccaa ctatccagct gctgaaatat gttatgcagc gccttattaa ggttgatgga <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Blattella germanica <400> 71 aaggcatgga tgttggacaa gct <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Blattella germanica <400> 72 gcatggatgt tggacaagct cgg

taagaaaatt gttatgcagc gccttattaa 60 ctatccagct gctgaaatat gcattaacca 120 gccttattaa ggttgatgga aaagtcagaa 180 gcattaacca actgtgaggt taagaaaatt 240 aaagtcagaa cagaccccaa ctatccagct 300

23 <3RP

26/46

Φ

<210> 73 <211> 26 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 73

attaaggttg atggaaaagt cagaac 26

<210> 74 <211> 32 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 75 <211> 32 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 75

gctggtttta tggatgttgt tacaattgaa aa 32

<210> 76 <211> 26 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 77 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 77

ggtaatctct gtatgattac tgg 23

<210> 78 <211> 26 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 74

cccaactatc cagctggttt tatggatgtt gt

32

<400> 76

attgaaaaa ctggagaatt tttccg

26

<400> 78

cgtcatcctg gttcctttga cattgt

26 <210> 79___________________ _ _________________ ___________________________

<211> 22 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 79

ttaaagattc acaaggacac ac 22

<210> 80 <211> 26 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 81 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 81

cgtaaagctg ccagagaact tct 23

<210> 82 <211> 24 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 83 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 83

cgtattggag tgttggatga a 21

<210> 84 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 80

aaaatccgta aagctgccag agaact

26

<400> 84

aggttgtttg aaggcaatgc tctt

24

<400> 84

ccgtatgaag cttgattacg t

21

<210> 85 <211> 29______________________________________________ <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 85

ttgggtttga agattgaaga tttcttgga

<210> 86 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 86

aagattgaag atttcttgga a

<210> 87 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 87

agaacaaac gtgaagtgtg gcg

<210> 88 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 88

tgctctcata ttgagaacat g

<210> 89 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 89

aagggtttcc tgtacaaaat g

<210> 90 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 90

gccgtgtatg cccatttccc cat

(^fD

28/46

29

21

23

21

21

23

<210> 91 <211> 26 <212> DNA_______________________________________________

<213> Blattella germanica

<400> 91

tatgcccatt tcccatta ctgcgt

<210> 92 <211> 22 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 92

cgtaacttct tgggcgagaa gt

<210> 93 <211> 24 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 93

aaatggtttg gaacaaagaa ggag

<210> 94 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 94

gatcccaatg aaataaacga aat

<210> 95 <211> 26 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 95

aatgaaataa acgaaattgc aaatac

<210> 96 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 96

ggtttggca aaaggaaggg tac

<210> 97 <211> 23 <212> DNA <213> Blattella germanica_______________________

<400> 97

gcaaatgccc gtatgccaca gaa

<210> 98 <211> 22 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 98

aatgcccgta tgccacagaa gg

<210> 99 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 99

aagaagtcaca gggaagcaaa gaa

<210> 100 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 100

aagaagatcg acagacatct ata

<210> 101 <211> 27 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 101

caaagggtaac gtgttcaaga acaagcg

<210> 102 <211> 32 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 102

aagggtcaacg tgttcaagaa caagcgtgtc ct

<210> 103 <211> 31 <212> DNA

<213> Blattella germanica

23

22

23

23

27 <400> 103 gtgttcaaga acaagcgtgt cctgatggag t

<210> 104 <211> 30 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 104

tgatggagtt catccacaag aagaaggctg

<210> 105 <211> 25 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 105

catccacaag aagaaggctg agaag

<210> 106 <211> 22 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 106

acaagaagaa ggctgagaag gc

<210> 107 <211> 26 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 107

accaattcca gacaaaatat tcgtaa

<210> 108 <211> 25 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 108

gaagaaggct gagaaggcca ggaca

<210> 109 <211> 54 <212> DNA

<213> Blattella germanica

©93

31/46 ^

31

30

25

22

26

25 32/46

<400> 109

atggatgcca tcaagaagaa gatgcaggcg atgaagctgg agaaggacaa cgcg

54

<210> 110 <211> 25 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 110

gggccgagaa ggctgaggagg gagc 25

<210> 111 <211> 38 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 112 <211> 22 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 112

tgatgcaagt caacgccaag Ct 22

<210> 113 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 114 <211> 35 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 114

gtcaacgcca agctggacga gaaggacaag gccct 35

<210> 115 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 111

tccctgcaga agaagatcca gcagattgag attgatct

38

<400> 113

atgcaagtca acgccaagct gga

23

<400> 115 _____________gagaaggaca aggccctgca gaa_________

<210>116 <211> 26 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 116

aaccgccgaa tccaactgct ggagga

<210> 117 <211> 38 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 117

gcgatgaagc tggagaagga caacgcgatg gatcgcgc

<210> 118 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 118

tctgaggaac gtttggccac age

<210> 119 <211> 22 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 119

tggcagatga agagcgtatg ga

<210> 120 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 120

gatgaagagc gtatggatgc t

<210> 121 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 121

gctttggaga accagctgaa gga G9G

<210> 122 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 122

gagaaccagc tgaaggaagc c 21

<210> 123 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 124 <211> 29 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 124

ttcatggctg aggaagctga caagaaata 29

<210> 125 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 126 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 126

gacaagaaat atgatgaggt cgc 23

<210> 127 <211> 29 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 123

cagctgaagg aagccaggtt c

21

<400> 125

gctgacaaga aatatgatga ggt

23

<400> 127

atggttgagg ccgacttgga aagagcaga

29 GaT 35/46 ^

<210> 128___________________________ ____________

<211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 128

gccgacttgg aaagagcaga aga

<210> 129 <211>27 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 129

cgacttggaa agagcagaag agcgtgc

<210> 130 <211> 22 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 130

ccaagattgt ggagcttgag ga

<210> 131 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 131

aagattgtgg agcttgagga aga

<210> 132 <211> 34 <212> DNA

<213> BIattella germanica <400> 132

tggatcgcgc ccttctctgc gaacagcagg cccg

<210> 133 <211> 29 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 133

attgtggagc ttgaggaaga actgcgcgt

<210> 134 <211> 21__________________

<212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 134

ctgcgcgttg tcggcaacaa c

<210> 135 <211> 35 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 135

cgcgttgtcg gcaacaacct gaagtccctt gaggt

<210> 136 <211> 59 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 136

gttgtcggca acaacctgaa gtcccttgag gtgtctgaag agaaggccaa cctgcgta

<210> 137 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 137

taccaggcta aaggaggctg a

W <210> 138 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 138

accaggctaa aggaggctga age

<210> 139 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 139

gctaaaggag gctgaagctc g

Ψ

21

35

59

21

23

<210> 1140 <211> 29 *

37/46

<212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 140

ctaaaggagg ctgaagctcg tgctgagtt

29

<210> 141 <211> 32 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 141

aaggaggctg aagctcgtgc tgagttcgct ga 32

<210> 142 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 143 <211> 60 <212> DNA

<213> BIattella germanica <400> 143

tgcagaagga ggttgacagg cttgaggatg aattggtaca cgagaaggag aagtacaagt 21

<210> 144 <211> 32 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 145 <211> 53 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 145

gagaaggaga agtacaagta catttgtgac gatcttgata tgactttcac cga 53

<400> 142

gctcgtgctg agttcgctga a

21

<400> 144

ttggtacacg agaaggagaa gtacaagtac at

32

<210> 146 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella genrianica

<400> 146

aacagcaggc ccgcgacgcc aac

23

<210> 147 <211> 42 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 147

catttgtgac gatccttgata tgactttcac cgaacttatt gg 42

<210> 148 <211> 22 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 149 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 149

tggacaagtc gaagagcgtc aag 23

<210> 150 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 151 <211> 44 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 151

gaggcccaga gcaagagagg tatcctcact ctgaagtacc ccat 44

<210> 152 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 148

cggacaggga ggacatcaac tc

22

<400> 150

ctgctccaag atccagaaac a

21 ^^'Sa^kiAjSwil^a^h^T^···».·'^». r^fâÂTÍ^P^-^fnrtff f ti !,,lFiinnmtiff- «.iyf&fr;^

39/46

Yof

<400> 152

gctccagagg aacacccaat cct

<210> 153 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 153

atcctgctga ctgaggctcc cct

<210> 154 <211> 47 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 154

aaggccaaca gggagaagat gactcaaatc atgtttgaga ccttcaa

<210> 155 <211> 29 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 155

caaatcatgt ttgagacctt caacacccc

<210> 156 <211> 37 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 156

tcatgtttga gaccttcaac accccgcca tgtatgt

<210> 157 <211> 38 <212> DNA

<213> Blattella germanica

23

23

47

29

37

<400> 157

accttcaaca ccccgccat gtatgttgcc atccaggc

<210> 158 <211> 29 <212> DNA

<213> Blattella germanica Vão

40/46 ^

<400> 158

cccgccatgt atgttgccat ccaggccgt 29

<210> 159 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 159

gccatccagg ccgtgctgtc cct 23

<210> 160 <211> 30 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 160

tacgcttccg gccgtaccac tggtattgtg 30

<210> 161 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 161

gcttccggcc gtaccactgg tat 23

<210>162 <211> 32 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 162

ggtaccactg gtattgtgct ggactctggt ga

<210> 163 <211> 26 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 163

ggtattgtgc tggactctgg tgacgg

<210> 164 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 164 V03

ggtgacggcg tctcccacac cgt ___________________________________________________________________________23

<210> 165 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 165

ggtgacggcg tctcccacac cgt 23

<210> 166 <211> 32 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 166

tcccacaccg tacccatcta tgaaggttac gc 32

<210> 167 <211> 40 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 167

tgaagtaccc cattgaacat ggaatcatca ccaactggga

<210> 168 <211> 28 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 168

tgccccatgc catcctgcgt ctggactt

<210> 169 <211> 30 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 169

gccatcctgc gtctggactt ggccggccgt

<210> 170 <211> 29 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 170

cgtctggact tggccggccg tgacttgac Υοψ

<210> 171 <211> 32 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 171

cgtgacttga ctgactacct gatgaagatc ct32

<210> 172 <211> 36 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 172

<210> 173 <211> 35 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 173

atgaagatcc tgaccgagcg tggctacagc ttcac 35

<210> 174 <211> 29 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 174

ggaatcatca ccaactggga tgacatgga 29

<210> 175 <211> 38 <212> DNA

<213> Blattella germanica

gactacctga tgaagatcct gaccgagcgt ggctac

36

<400> 175

atcatcacca actgggatga catggagaag atctggca

38

<210> 176 <211> 35 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 176

gacatggaga agatctggca tcacaccttc tacaa

35 43/46

<210> 177 ______________________

<211> 36 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 177

atggagaaga tctggcatca caccttctac aatgaa

<210> 178 <211> 35 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 178

aagatctggc atcacacctt ctacaatgaa ctccg

<210> 179 <211> 35 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 179

atctggcatc acaccttcta caatgaactc cgagt

<210> 180 <211> 26 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 180

aacgtgttca agaacaagcg tgtcct

<210> 181 <211> 31 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 181

catccacaag aagaaggctg agaaggccag g

<210> 182 <211> 41 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 182

gccatcaaga agaagatgca ggcgatgaag ctggagaagg a

<210> 183 » 44/46

jT

<211 >24_____________________________________________

<212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 183

cctgcagaag aagatccagc agat 24

<210> 184 <211> 32 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 184

aagatgcagg cgatgaagct ggagaaggac aa 32

<210> 186 <211> 26 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 186

gttgtcggca acaacctgaa gtccct 26

<210> 187 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 187

aaggaggctg aagctcgtgc tga 23

<210> 188 <211> 27 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<210> 185 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 185

gagaaggaca aggccctgca g

21

<400> 188

gaggcccaga gcaagagagg tatcctc

27

<210> 189 <211> 23 * 45/46 Ψ

<212> DNA_____________________________________... ......................_.......

<213> Blattella germanica

<400> 189

cagagcaaga gaggtatcct cac

<210> 190 <211> 34 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 190

gcccagagca agagaggtat cctcactctg aagt

<210> 191 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 191

aaggccaaca gggagaagat gac

<210> 192 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 192

gagaagatga ctcaaatcat gtt

W <210> 193 <211> 29 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 193

ggtatcctca ctctgaagta cccattga

<210> 194 <211> 21 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 194

atcatgtttg agaccttcaa c

<210> 195 <211> 26 <212> DNA

Yoy

23

34

23

23

29 Λ

Yo^

46/46

<213> Blattella germanica <400> 195

gagaccttca acaccccgc catgta 26

<210> 196 <211> 23 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 196

gccatccagg ccgtgctgtc cct 23

<210> 197 <211> 35 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 197

gtctcccaca ccgtacccat ctatgaaggt tacgc

<210> 198 <211> 40 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 198

tcaccaactg ggatgacatg gagaagatct ggcatcacac

<210> 199 <211> 35 <212> DNA

<213> Blattella germanica <400> 199

gacatggaga agatctggca tcacaccttc tacaa

<210> 200 <211> 41 <212> DNA

<213> Blattella germanica

<400> 200

atggagaaga tctggcatca caccttctac aatgaactcc g

41

Claims (76)

1.) Molécula de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 1 1, 16, ,17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, ,27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180 e 181, ou uma seqüência ortóloga de nucleotídeos de uma espécie de insetos ou aracnídeos, caracterizada pelo fato de que a seqüência ortóloga de nucleotídeos tem pelo menos 70% da seqüência de identidade da seqüência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nes 1, 11, 21 e 31.

2.) Construção de RNA compreendendo pelo menos uma região de RNA de dupla cepa, onde pelo menos uma cepa compreende a seqüência de nucleotídeos que é complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos de qualquer uma das (i) moléculas de ácido nucléico definidas na reivindicação 1 ou (ii) moléculas de ácido nucléico que compreendem a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em uma das SEQ ID Nss 41, 43, 44, 47, 48, 109 a , 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179 e 188 a 200, ou uma de suas seqüências ortólogas de nucleotídeos de uma espécie de insetos e/ou de aracnídeos.

3.) Construção de RNA de acordo com a reivindicação 2 caracterizada pelo ^O fato de que a referida pelo menos uma região de RNA de dupla cepa tem um comprimento de pelo menos 17 bp.

4.) Construção de RNA de acordo com a reivindicação 2 ou 3 caracterizada pelo fato de que a complementaridade da referida seqüência de nucleotídeos compreende pelo menos 70% da identidade da seqüência de nucleotídeos com (i) a porção da seqüência de nucleotídeos das moléculas de ácido nucléico definida na reivindicação 1 ou reivindicação 2 ou (ii) as moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID N25 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, ,49,51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179 e 188 a 200, ou uma seqüência ortóloga de nucleotídeos de uma espécie de insetos ou aracnídeos, em que a identidade da seqüência porcentual é calculada no mesmo comprimento.

5. Construção de RNA de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 4 caracterizada pelo fato de que pelo menos uma cepa que compreende uma seqüência de nucleotídeos que é complementar (i) à porção da seqüência de nucleotídeos das moléculas de ácido nucléico definida na reivindicação 1 ou na reivindicação 2 ou (ii) às moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID N2s 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, B-O 63, 64, 151 a 179 e 188 a 200, ou de uma de suas seqüências ortólogas de nucleotídeos de uma espécie de insetos ou aracnídeos tem menos que 12,5% da identidade da seqüência relativa a 24 nucleotídeos contíguos da correspondente seqüência de nucleotídeos de uma espécie mamífera.

6. Construção de RNA de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 5 compreendendo pelo menos duas seqüências de nucleotídeos escolhidas independentemente de qualquer das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40,94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55,56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179 e 188 a 200, por exemplo, qualquer dasSEQID Nes 65 a 70.

7. Construção do DNA (i) compreendendo a seqüência de nucleotídeos da reivindicação 1 ou (ii) compreendendo uma região que codifica uma construção de RNA de qualquer das reivindicações 2 a 6.

8. Construção de expressão compreendendo uma construção do DNA de acordo com a reivindicação 7.

9. Construção de expressão de acordo com a reivindicação 8 compreendendo ainda uma ou mais seqüências de controle capazes de direcionar a expressão do ácido nucléico definido na reivindicação 7; e opcionalmente uma seqüência de terminação de transcrição.

10. Célula hospedeira compreendendo uma construção de RNA de qualquer das reivindicações 2 a 6, da construção do DNA da reivindicação 7 ou 8 e/ou uma construção da expressão da reivindicação 9.

11. Composição pesticida compreendendo uma construção de RNA como definida em uma das reivindicações 2 a 6 e/ou a construção do DNA definido na reivindicação 7 ou 8 e/ou uma construção da expressão definida na reivindicação 9 e/ou uma célula hospedeira como definida na reivindicação juntamente com um portador adequado.

12. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o portador compreende um pó ou partículas carregadas eletrostaticamente ou partículas e/ou partículas magnéticas, preferivelmente partículas metálicas que sejam inicialmente desmagnetizadas, mas que sejam capazes de se tornarem magneticamente polarizadas quando submetidas ao campo elétrico provido pelo corpo do inseto ou do aracnídeo, cujo pó ou partículas aderem à cutícula do inseto ou do aracnídeo e que podem ser ingeridas pelo inseto ou pelo aracnídeo.

13. Alojamento ou armadilha para insetos e/ou aracnídeos que contém uma composição como definida na reivindicação 11 ou 12.

14. Uso de uma construção de RNA definida em uma das reivindicações 2 a 6 e/ou uma construção do DNA definidas na reivindicação 7 ou 8 e/ou uma construção da expressão como definida na reivindicação 9 e/ou uma célula hospedeira como definida na reivindicação 10 e/ou uma composição como definida na reivindicação 11 ou 12 e/ou um alojamento ou armadilha como definida na reivindicação 13 para o controle de insetos e/ou de aracnídeos pela interferência do RNA.

15. Método para o controle de insetos e/ou aracnídeos compreendendo a administração a um inseto e/ou aracnídeo de uma construção de RNA como definida em qualquer das reivindicações 2 a 6 e/ou a construção do DNA como definida na reivindicação 7 ou 8 e/ou uma construção da expressão como definida na reivindicação 9 e/ou uma célula hospedeira como definida na reivindicação 10 e/ou uma composição como definida na reivindicação 11 ou 12 e/ou alojamento ou armadilha como definida na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o RNA de dupla cepa é capaz de fazer a regulação a jusante da expressão de pelo menos um gene de inseto e/ou de aracnídeo pela interferência do RNA.

16.) Método da reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que são administradas aos referidos insetos e/ou aracnídeos múltiplas construções de RNA como definidas em qualquer uma das reivindicações 2 a 6, e/ou a construção do DNA definida na reivindicação 7 ou 8, e/ou a construção da expressão definida na reivindicação 9, e/ou as células hospedeiras definidas na reivindicação 10, e/ou as composições definidas nas reivindicações 11 ou 12, e/ou o alojamento ou armadilha definida na reivindicação 13.

17.) Método da reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as múltiplas construções de RNA como definidas em qualquer uma das reivindicações 2 a 6 e/ou a construção do DNA como definida na reivindicação 7 ou 8 e/ou a construção da expressão como definida na reivindicação 9 e/ou as células hospedeiras como definidas na reivindicação 10 e/ou as composições como definidas nas reivindicações 11 ou 12 e/ou o alojamento ou armadilha como definidos na reivindicação 13 são administrados seqüencialmente para reduzir a probabilidade da aquisição de resistência pelos insetos e/ou aracnídeos.

18.) Uso de acordo com a reivindicação 14 ou o método de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que os insetos e/ou aracnídeos compreendem insetos domésticos, ectoparasitas e insetos e/ou aracnídeos relevantes para a saúde e higiene públicas, preferivelmente moscas, ácaros de aranhas, tripses, carrapatos, ácaro vermelho das aves, formigas, baratas, cupins, grilos, incluindo grilos domésticos, traças de livros, piolhos de livros, besouros, centopéias, mosquitos e pulgas.

19.) Uso ou método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o inseto e/ou os aracnídeos compreendem baratas (Blattodea) como, sem limitação, Blatella spp. (ex., Blatella germanica (barata alemã)), Periplaneta spp. (ex., Periplaneta americana (barata americana) e Periplaneta australiasiae (barata australiana)), Blatta spp. (ex., Blatta orientalis (barata oriental)) e Supella spp. (ex., Supella longipalpa (barata de estrias marrons); formigas (Formicoidea) como, sem limitações, a Solenopsis spp. (ex., Solenopsis invicta (formiga do fogo)), Monomorium spp. (ex., Monomorium pharaonis (Formiga Faraó)), Camponotus spp. (ex., Camponotus spp (Formigas carpinteiras)), lasius spp. (ex., Iasius niger (pequena formiga negra)), Tetramorium spp. (ex., Tetramorium caespitum (Formiga do solo)), Myrmica spp. (ex., Myrmica rubra (Formiga vermelha)), Formica spp (formiga da madeira), Crematogaster spp. (ex., Crematogaster lineolata (Formiga acrobata)), Iridomyrmex spp. (ex., Iridomyrmex humilis (Formiga argentina)), Pheidole spp. (Formigas de Cabeças Grandes) e Dasymutilla spp. (ex., Dasymutilla occidentalis (Formiga veludo)); ácaros (Isoptera e/ou Termitidae) como, sem limitações, a Amitermes spp. (ex., Amitermes floridensis (ácaro subterrâneo de asas negras da Flórida)), Reticulitermes spp. (ex., Reticulitermes flavipes (ácaro subterrâneo do leste), Retieulitermes hesperus (Ácaro Subterrâneo do Oeste)), Coptotermes spp. (ex., Coptotermesformosanus (Ácaro Subterrâneo de Formosa)), Incisitermes spp. (ex., Ineisitermes minor (Ácaro Ocidental da Madeira Seca)), Neotermes spp. (ex., Neotermes connexus (Ácaro de Árvores das Florestas)) e mais preferivelmente a Barata alemã (Blatella germanica).

20. Kit para uso com o método de qualquer das reivindicações 15 a 19, que compreende a construção de RNA como definida em quaisquer das reivindicações 2 a 6 e/ou a construção do DNA como definido na reivindicação 7 ou 8 e/ou uma construção da expressão como definida na reivindicação 9 e/ou uma célula hospedeira como definida na reivindicação e/ou uma composição como definida na reivindicação 11 ou 12 e/ou o alojamento ou armadilha como definida na reivindicação 13, juntamente com as instruções para uso, caracterizadas pelo fato de que o RNA de dupla cepa é capaz de fazer a regulação a jusante da expressão de pelo menos um gene de infestação pela interferência do RNA.

21. Kit da reivindicação 20 que compreende múltiplas construções de RNA como definidas em quaisquer das reivindicações 2 a 6 e/ou as construções do DNA como definidas na reivindicação 7 ou 8 e/ou a construção da expressão como definida na reivindicação 9 e/ou as células hospedeiras como definidas na reivindicação 10 ou 11 e/ou as composições como definidas nas reivindicações 11 ou 12 e/ou o alojamento ou armadilha como definida na reivindicação 13, caracterizadas pelo fato de que cada RNA de cepa dupla é capaz de fazer a regulação a jusante da expressão de pelo menos um gene de infestação pela interferência do RNA.

22. Kit da reivindicação 20 caracterizado pelo fato de que as múltiplas construções de RNA como definidas em qualquer das reivindicações 2 a 6 e/ou as construções de DNA como definidas na reivindicação 7 ou 8 e/ou a construção da expressão como definida na reivindicação 9 e/ou as células hospedeiras como definidas na reivindicação 10 e/ou as composições como definidas na reivindicação 11 ou 12 e/ou o alojamento ou armadilha como definidos na reivindicação 13 são usados seqüencialmente de maneira a reduzir a probabilidade da aquisição de resistência pela infestação.

23. Método para o controle de infestações de baratas, compreendendo prover à barata uma construção de RNA que compreende pelo menos uma região de RNA de dupla cepa, pelo menos uma cepa que compreende uma seqüência de nucleotídeos complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína ribossomal da barata.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cepa de pelo menos uma região de RNA de dupla cepa compreende pelo menos 17, 18, 19, 20, 21 ou mais nucleotídeos de qualquer das moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos estabelecida em qualquer das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79,11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56,148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179 e 188 a 200 ou seus complementos.

25.) Construção de RNA de qualquer das reivindicações 2 a 6 que compreende pelo menos uma outra região dsRNA, pelo menos uma cepa da qual compreende uma seqüência de nucleotídeos complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos de um outro gene de uma espécie de insetos e/ou de aracnídeos.

26.) Construção de RNA de qualquer uma das reivindicações 2 a 6 ou 25, compreendendo ainda pelo menos uma outra seqüência funcional e, opcionalmente um ligante.

27.) Construção de RNA de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo rI 0 fato de que a referida outra seqüência funcional é escolhida a partir do grupo que compreende (i) uma seqüência que facilita a produção em grande escala de construção de RNA; (ii) uma seqüência que efetue um aumento ou uma redução na estabilidade do dsRNA; (iii) uma seqüência que permita a ligação de proteínas ou de outras moléculas para facilitar a captação da construção de RNA por um inseto e/ou um aracnídeo; (iv) uma seqüência que seja um aptâmero que ligue aos receptores ou às moléculas no intestino de um inseto para facilitar a captação, a endocitose e/ou a transcitose pelo inseto e/ou pelo aracnídeo.

28.) Construção de RNA de acordo com a reivindicação 26 ou 27, y2 o caracterizada pelo fato de que o ligante é uma seqüência de RNA condicionalmente de auto-clivagem, de preferência um ligante sensível ao pH ou um ligante hidrofóbico sensível.

29.) Construção de RNA de acordo com as reivindicações 26 ou 27, caracterizada pelo fato de que o ligante é um intron.

30.) Construção de RNA de acordo com uma das reivindicações 23 a 27, caracterizada pelo fato de que a complementaridade da referida seqüência de nucleotídeos compreende pelo menos 70% da identidade da seqüência de nucleotídeos com (i) a porção da seqüência de nucleotídeos das moléculas de ácido nucléico definida na reivindicação 1 ou na reivindicação 2 ou (ii) as moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID N- 41, 43, 44, 47, 48, 109 a147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179 e 188 a200 ou uma seqüência ortóloga de nucleotídeos de uma espécie de insetos e/ou de aracnídeos, onde a identidade da seqüência porcentual é calculada no mesmo comprimento.

31. Construção de RNA de acordo com qualquer das reivindicações 25 a 30, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma cepa que compreende uma seqüência de nucleotídeos que é complementar (i) à porção da seqüência de nucleotídeos das moléculas de ácido nucléico definidas na reivindicação 1 ou plIO na reivindicação 2 ou (ii) às moléculas de ácido nucléico e/ou aracnídeos compreendendo a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID N2s 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55,56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179 e 188 a 200, ou de uma seqüênciaortóloga de nucleotídeos de uma espécie de insetos tem menos que 12.5% da identidade da seqüência em 24 nucleotídeos contíguos com a correspondente seqüência de nucleotídeos de uma espécie mamífera.

32. Construção de RNA de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 6 ou 25 a 28, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma cepa compreende pelo menos 17, 18, 19, 20, 21 nucleotídeos ou mais de qualquer das moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em qualquer das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79,11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56,148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179 e 188 a 200 ou seu complemento.

33. Construção de RNA de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que a espécie de mamífero é a humana.

34. Construção de RNA compreendendo pelo menos uma região de RNA de dupla cepa, onde pelo menos uma cepa compreende pelo menos 17, 18, 19,20, 21 nucleotídeos ou mais de quaisquer das moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em qualquer das SEQ ID N- 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a 79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, -21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40, 94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, -47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55, 56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a -179 e 188 a 200 ou seus complementos.

35.) Construção do DNA compreendendo uma região que codifica uma construção de RNA de qualquer das reivindicações 25 a 34.

36.) Construção da expressão compreendendo a construção do DNA de acordo com a reivindicação 35.

37.) Célula hospedeira compreendendo uma construção de RNA de qualquer das reivindicações 25 a 34, uma construção do DNA da reivindicação 35 ou uma construção da expressão da reivindicação 36.

38.) Célula hospedeira como definida na reivindicação 10 ou 37, que é uma célula bacteriana.

39.) Célula hospedeira como definida na reivindicação 38, que é uma célula bacteriana inativada.

40.) Método para a geração da construção de RNA de qualquer das reivindicações 2 a 6 ou 25 a 34, compreendendo as etapas de contatar uma construção do DNA da reivindicação 7 ou 35 ou uma construção da expressão da reivindicação 8, 9 ou 36 com componentes isentos de células; ou administrar uma construção do DNA da reivindicação 7 ou 35 ou uma construção da expressão da reivindicação 8, 9 ou 36 a uma célula, em condições que permitam a transcrição da referida construção do DNA para produzir a referida construção de RNA.

41.) Método da reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula bacteriana.

42.) Composição pesticida compreendendo uma construção de RNA como definida em qualquer das reivindicações 25 a 34 e/ou a construção do DNA como definida na reivindicação 35 e/ou uma construção da expressão como definida na reivindicação 36 e/ou uma célula hospedeira como definida em qualquer das reivindicações 37 a 39 em conjunto com um portador adequado

43. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 10, 11 ou 43 que é uma forma adequada para a ingestão por um inseto e/ou aracnídeo.

44. Composição de acordo com a reivindicação 42 ou 43, sob forma sólida como em forma de líquido, pó ou grânulos ou sob a forma de gel.

45. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 42 a 44 que está sob a forma de uma isca.

46. Composição de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a isca ainda inclui pelo menos uma substância alimentícia, como uma 0 proteína baseada em alimentos ou ácido bórico e/ou um atrativo, como um feromônio.

47. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 42 a 46 caracterizada pelo fato de que a composição é armazenada em um alojamento' ou armadilha onde pode entrar um inseto e/ou aracnídeo para ingerir a composição.

48. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 42 a 46 que está sob a forma de um spray, de preferência um spray pressurizado/aerossolizado ou um spray com bomba.

49. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 42 a 46 que está sob a forma de revestimento em uma superfície adequada que adere a um inseto e/ou aracnídeo quando entra em contato com o revestimento.

50. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 42 a 46 caracterizada pelo fato de que o portador compreende pós ou partículas' carregadas eletronicamente e/ou partículas magnéticas, de preferência partículas metálicas que estão inicialmente desmagnetizadas, mas que são capazes de se tornarem polarizadas magneticamente quando submetidas ao campo elétrico do corpo de um inseto e/ou de um aracnídeo, que aderem à cutícula do inseto e/ou do aracnídeo.

51. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 42 a 50 caracterizada pelo fato de que o portador aumenta a captação do RNA de cepa' dupla na infestação.

52.) Composição da reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o portador é um portador de base lipídica, compreendendo de preferência uma ou mais das emulsões óleo em água, colesterol, micelas, lipopoliaminas e lipossomos.

53.) Composição da reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o portador compreende um agente condensador de ácido nucléico, de preferência uma espermidina ou um sulfato de protamina.

54.) Composição de qualquer uma das reivindicações 11, 12 ou 42 a 53 em combinação com um outro pesticida.

55.) Alojamento ou armadilha para insetos e/ou aracnídeos que contenha uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a 46 ou 54.

56.) Uso de uma construção de RNA como definida em qualquer uma das reivindicações 25 a 34 e/ou uma construção do DNA como definida na reivindicação 35 e/ou uma construção da expressão como definida na reivindicação 36 e/ou uma célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 37 a 39 e/ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a 54 e/ou o alojamento ou armadilha como definida na reivindicação 55 para o controle de insetos e/ou aracnídeos por interferência RNA.

57.) Uso de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que os insetos e/ou aracnídeos compreendem insetos domésticos, ectoparasitas e insetos e/ou aracnídeos relevantes para a saúde e higiene públicas, preferivelmente moscas, ácaros de aranhas, tripses, carrapatos, ácaro vermelho das aves, formigas, baratas, cupins, grilos, incluindo grilos domésticos, traças de livros, piolhos de livros, besouros, centopéias, mosquitos e pulgas.

58.) Uso de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que os insetos e/ou aracnídeos compreendem baratas (Blattodea) como, sem limitações, a Blatella spp. (ex., Blatella germanica (barata alemã)), Periplaneta spp. (ex., Periplaneta americana (barata americana) e Periplaneta australiasiae (Barata australiana)), Blatta spp. (ex., Blatta orientalis (Barata oriental)) e Supella spp. (ex., Supella longipalpa (barata de estrias marrons); formigas (Formicoidea) como, sem limitações, a Solenopsis spp. (ex., Solenopsis invicta (Formiga do fogo)), Monomorium spp. (ex., Monomorium pharaonis (Formiga Faraó)), Camponotus spp. (ex., Camponotus spp (Formigas carpinteiras)), lasius spp. (ex, lasius niger (pequena formiga negra)), Tetramorium spp. (ex, Tetramorium caespitum (Formiga do solo)), Myrmica spp. (ex, Myrmica rubra (Formiga vermelha)), Formica spp (formiga da madeira), Crematogaster spp. (ex, Crematogaster lineolata (Formiga acrobata)), Iridomyrmex spp. (ex, Iridomyrmex humilis (Formiga argentina)), Pheidole spp. (Formigas de Cabeças Grandes) e Dasymutilla spp. (ex, Dasymutilla oceidentalis (Formiga veludo)); ácaros (Isoptera e/ou Termitidae) como, sem limitações, a Amitermes spp. (ex, Amitermes floridensis (ácaro subterrâneo de asas negras da Flórida)), Reticulitermes spp. (ex, Reticulitermes flavipes (ácaro subterrâneo do Iestey), Reticulitermes hesperus (Ácaro Subterrâneo do Oeste)), Coptotermes spp. (ex, Coptotermesformosanus (Ácaro Subterrâneo de Formosa)), Ineisitermes spp. (ex, Incisitermes minor (Ácaro Ocidental da Madeira Seca)), Neotermes spp. (ex, Neotermes eonnexus (Ácaro de Árvores das Florestas)) e mais preferivelmente a Barata alemã (Blatella germanica).

59. Uso de acordo com qualquer das reivindicações 14, 18 ou 56 a 58, caracterizado pelo fato de que o inseto e/ou aracnídeo tem crescimento retardado, paralisado, é tornado infértil ou morto.

60. Método para o controle de insetos e/ou aracnídeos compreendendo a administração a um inseto e/ou aracnídeo de uma construção de RNA como definida em qualquer das reivindicações 25 a 34 e/ou uma construção do DNA como definida na reivindicação 35 e/ou uma construção da expressão como definida na reivindicação 36 e/ou a célula hospedeira como definida em uma das reivindicações 37 a 39 e/ou uma composição como definida em uma das reivindicações 42 a 54 e/ou o alojamento ou armadilha como definido na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o RNA de dupla cepa é capaz de fazer a regulação a jusante da expressão de pelo menos um gene de inseto e/ou de aracnídeo pela interferência RNA.

61.) Método da reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que são administradas as múltiplas construções de RNA como definidas em uma das reivindicações 25 a 34 e/ou as construções do DNA como definidas na reivindicação 35 e/ou a construção da expressão como definida na reivindicação 36 e/ou células hospedeiras como definidas em qualquer das reivindicações 37 a 39 e/ou composições como definidas em qualquer das reivindicações 42 a 54 e/ou o alojamento ou armadilha como definida na reivindicação 13.

62.) Método da reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que as múltiplas construções de RNA como definidas em uma das reivindicações 25 a 34 e/ou as construções do DNA como definidas na reivindicação 35 e/ou a construção da expressão como definida na reivindicação 36 e/ou as células hospedeiras como definidas em uma das reivindicações 37 a 39 e/ou composições como definidas em uma das reivindicações 42 a 54 e/ou o alojamento ou armadilha como definida na reivindicação 13 são administradas seqüencialmente para reduzir a probabilidade de a infestação adquirir resistência.

63.) Método de acordo com qualquer das reivindicações 60 a 62, caracterizado pelo fato de que os insetos e/ou aracnídeos compreendem insetos domésticos, ectoparasitas e insetos e/ou aracnídeos relevantes para a saúde e higiene públicas, preferivelmente moscas, ácaros de aranhas, tripses, carrapatos, ácaro vermelho das aves, formigas, baratas, cupins, grilos, incluindo grilos domésticos, traças de livros, piolhos de livros, besouros, centopéias, mosquitos e pulgas.

64.) Método de acordo com qualquer das reivindicações 60 a 63, caracterizado pelo fato de que os insetos e/ou aracnídeos compreendem baratas (Blattodea) como, sem limitações, a Blatella spp. (ex., Blatella germanica (barata alemã)), Periplaneta spp. (ex., Periplaneta americana (barata americana) e Periplaneta australiasiae (Barata australiana)), Blatta spp. (ex., Blatta orientalis (Barata oriental)) e Supella spp. (ex., Supella longipalpa (barata de estrias marrons); formigas (Formicoidea) como, sem limitações, a Solenopsis spp. (ex., Solenopsis invicta (Formiga do fogo)), Monomorium spp. (ex., Monomorium pharaonis (Formiga Faraó)), Camponotus spp. (ex., Camponotus spp (Formigas carpinteiras)), lasius spp. (ex., Iasius niger (pequena formiga negra)), Tetramorium spp. (ex., Tetramorium caespitum O (Formiga do solo)), Myrmica spp. (ex., Myrmica rubra (Formiga vermelha)), Formica spp (formiga da madeira), Crematogaster spp. (ex., Crematogaster lineolata (Formiga acrobata)), Iridomyrmex spp. (ex., Iridomyrmex humilis (Formiga argentina)), Pheidole spp. (Formigas de Cabeças Grandes) e Dasymutilla spp. (ex., Dasymutilla occidentalis (Formiga veludo)); ácaros (Isoptera e/ou Termitidae) como, sem limitações, a Amitermes spp. (ex., Amitermes floridensis (ácaro subterrâneo de asas negras da Flórida)), Reticulitermes spp. (ex., Reticulitermes flavipes (ácaro subterrâneo do leste), Reticulitermes hesperus (Ácaro Subterrâneo do Oeste)), Coptotermes spp. (ex., Coptotermesformosanus (Ácaro Subterrâneo de Formosa)), Incisitermes O spp. (ex., Ineisitermes minor (Ácaro Ocidental da Madeira Seca)), Neotermes spp. (ex., Neotermes connexus (Ácaro de Árvores das Florestas)).

65. Método de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 16 ou 6 a 62, caracterizado pelo fato de que o inseto e/ou aracnídeo tem o crescimento retardado, paralisado, tornado infértil ou morto.

66. Kit para uso no método de qualquer uma das reivindicações 60 a 65, que compreende a construção de RNA como definido em qualquer das reivindicações 25 a 34 e/ou uma construção do DNA como definida na reivindicação 35 e/ou uma construção da expressão como definida na reivindicação 36 e/ou uma célula hospedeira como definida em uma das reivindicações 37 a 39 e/ou uma composição como definida em uma das reivindicações 42 a 54 e/ou o alojamento ou armadilha como definida na reivindicação 13 juntamente com as instruções de uso, caracterizado pelo fato de que o RNA de dupla cepa é capaz de fazer a regulação a jusante da expressão de pelo menos um gene da infestação pela interferência do RNA.

67.) Kit da reivindicação 64 que compreende múltiplas construções de RNA como definidas em qualquer das reivindicações 53 a 34 e/ou a construção do DNA como definida na reivindicação 35 e/ou a construção da expressão como definida na reivindicação 36 e/ou células hospedeiras como definida em uma das reivindicações 37 a 39 e/ou composições como definidas em uma das reivindicações 42 a 54, caracterizada pelo fato de que cada RNA de cepa dupla é capaz de fazer a regulação a jusante da expressão de pelo menos um gene de infestação pela interferência do RNA.

68.) Kit da reivindicação 67 caracterizado pelo fato de que as múltiplas construções de RNA como definidas em uma das reivindicações 25 a 34 e/ou as construções de DNA como definidas na reivindicação 35 e/ou a construção da expressão como definida na reivindicação 36 e/ou as células hospedeiras como definidas em uma das reivindicações 37 a 39 e/ou as composições como definidas em uma das reivindicações 42 a 54 são usadas seqüencialmente para reduzir a probabilidade de aquisição de resistência pela infestação.

69.) Método para o controle das infestações de baratas compreendendo prover a administração à barata de uma construção de RNA compreendendo pelo menos uma região de RNA de dupla cepa, e pelo menos uma cepa do qual compreende uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a uma porção da seqüência de nucleotídeos que codifica uma tropomiosina, um gene da HMG-Coenzima A sintase ou um gene da actina 5C.

70.) Método de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cepa de pelo menos uma região de dupla cepa compreende pelo menos 17, 18, 19, 20, 21 nucleotídeos ou mais de quaisquer das moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos como estabelecida em qualquer das SEQID Nss 1, 4, 6, 7, 9, 10, 65 a 70, 71 a .79, 11, 16, 17, 19, 20, 80 a 87, 21, 26, 27, 29, 30, 88 a 93, 31, 36, 37, 39, 40,94 a 108, 180, 181, 41, 43, 44, 47, 48, 109 a 147, 182 a 187, 49, 51, 52, 55,56, 148 a 150, 57, 63, 64, 151 a 179 e 188 a 200 ou seus complementos.

71. Método de acordo com qualquer das reivindicações 23, 24, 69 ou 70, caracterizado pelo fato de que a referida infestação de baratas é escolhida a partir de espécies que pertence ao seguinte grupo de genes compreendendo Blatella, Periplaneta, Blatta e Supella.

72. Método de acordo com qualquer das reivindicações 23, 24 ou 69 a 71, caracterizado pelo fato de que a referida infestação de baratas é escolhida a í-0 partir do grupo que compreende a barata alemã (Blatella Germânico), a barata americana (Periplaneta americana), a Barata australiana (Periplaneta anstraliasiae), a Barata Oriental (Blatta orientalis) e a barata de estrias marrons (Supella longipalpa).

73. Proteína compreendendo a seqüência aminoácida como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID N- 2; 12, 22 ou 32 ou uma proteína ortóloga tendo uma seqüência aminoácida conservada a partir de uma outra espécie de insetos e/ou aracnídeos.

74. Proteína da reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que a ortóloga tem pelo menos 70% da identidade da seqüência aminoácida com a seqüência Ύ0 aminoácida como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID N25 2, 12, 22 ou 32.

75. Método para a geração da construção de RNA de quaisquer das reivindicações 2 a 6 ou 25 a 34, compreendendo a cultura da célula hospedeira como definida em uma das reivindicações 10 ou 37 a 39 sob condições que permitam a expressão da construção de RNA.

76. Método da reivindicação 75, compreendendo ainda a purificação da construção de RNA.