CN116535480B - Fubp及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了FUBP及其应用。本发明首次公开了FUBP以及与FUBP相关的生物材料，FUBP以及与FUBP相关的生物材料与蜚蠊目昆虫翅发育显著相关，通过降低蜚蠊目昆虫中FUBP的表达量和/或活性可以导致蜚蠊目昆虫翅发育受阻，从而导致蜚蠊目昆虫成虫卵子发育等生殖过程无法正常进行，达到防治蜚蠊目昆虫的效果，并且在防治过程中，不会产生抗药性、对人畜没有危害，且对环境没有污染。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及FUBP及其应用。
背景技术
目前，全世界记录的蜚蠊约有5千余种，蜚蠊是重要的病媒生物，因其经常出入污垢场合，会携带大量病原菌，直接影响了人们的生活，已被列为世界卫生害虫(Silva etal.,2020)。在我国，栖息于室内的蜚蠊主要以德国小蠊，美洲大蠊，日本大蠊，澳洲大蠊，黑胸大蠊为主。其中，德国小蠊是分布最广泛，也是最难治理的一类世界性家居卫生害虫。它除了盗食、污染食物，损害衣物、书籍，破坏电脑等精密仪器，造成经济损失外，还传播大量疾病(Gonzalez-Garcia et al.,2017)。蟑螂作为重要的卫生害虫，分布在家庭、菜市场、社区和医院，和人类活动密切相关，目前仍然是以化学防治为主，但随着其长期大量化学试剂的使用，环境污染和对人的安全等一系列负面问题日益凸显。因此，开发环境友好、高效、低毒的蟑螂防治方法是对于国家经济发展、社会进步和食品安全具有重要意义。
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)介导的靶标基因沉默机制，具有高度的序列特异性，基于RNAi技术的害虫防治策略具有专一性，且对非靶标生物安全。基于RNAi技术的害虫防治策略核心是寻找关键的分子靶标基因并获得特异高效的dsRNA片段序列。RNA干扰技术使用生物学手段，不会对环境造成污染，是一种环境友好的害虫防治手段。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供FUBP。
本发明第二方面的目的，在于提供与本发明第一方面的FUBP相关的生物材料。
本发明第三方面的目的，在于提供扩增编码本发明第一方面的FUBP的基因的引物组。
本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的FUBP和/或本发明第二方面的生物材料的应用。
本发明第五方面的目的，在于提供一种dsRNA。
本发明第六方面的目的，在于提供与本发明第五方面的dsRNA相关的生物材料。
本发明第七方面的目的，在于提供一种产品。
本发明第八方面的目的，在于提供一种方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供FUBP，所述FUBP的氨基酸序列包含：
a1)SEQ ID No.6；或
a2)将SEQ ID NO.6经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.6具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.6具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与SEQ ID NO.6具有相同功能的氨基酸序列；或
a4)SEQ ID No.2；或
a5)将SEQ ID NO.2经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.2具有相同功能的氨基酸序列；或
a6)与SEQ ID NO.2具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与SEQ ID NO.2具有相同功能的氨基酸序列。
本发明的第二个方面，提供与FUBP相关的生物材料，所述生物材料包含b1)～b8)中任一种：
b1)编码本发明第一个方面的FUBP的核酸分子；
b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；
b3)包含b1)所述核酸分子的载体；
b4)包含b2)所述表达盒的载体；
b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；
b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；
b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；
b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系。
优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
优选地，所述核酸分子的序列包含：
c1)SEQ ID NO.5；或
c2)将SEQ ID NO.5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.5所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
c3)与SEQ ID NO.5具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ IDNO.5所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
c4)SEQ ID NO.1；或
c5)将SEQ ID NO.1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.1所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
c6)与SEQ ID NO.1具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ IDNO.1所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。
本发明的第三个方面，提供扩增本发明第二个方面的生物材料中的核酸分子的引物组。
优选地，所述引物组包含上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ IDNo.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ID No.4所示。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面的FUBP和/或本发明第二方面的生物材料在d1)～d6)中任一项中的应用：
d1)调控蜚蠊目昆虫翅发育；
d2)制备调控蜚蠊目昆虫翅发育的产品；
d3)防治蜚蠊目昆虫；
d4)制备防治蜚蠊目昆虫的产品；
d5)抑制蜚蠊目昆虫翅发育；
d6)制备抑制蜚蠊目昆虫翅发育的产品。
优选地，所述蜚蠊目昆虫包含黑胸大蠊、美洲大蠊、澳洲大蠊、德国小蠊、日本大蠊中的至少一种；进一步优选地，所述蜚蠊目昆虫包含德国小蠊。
优选地，FUBP抑制剂在上述d3)～d6)中任一项中的应用；所述FUBP为本发明第一个方面的FUBP。
优选地，所述FUBP抑制剂包含抑制FUBP活性的物质、降解FUBP的物质、降低FUBP表达水平的物质中的至少一种。
优选地，所述降低FUBP表达水平的物质包含靶向FUBP的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶、shRNA中的至少一种。
优选地，所述FUBP抑制剂包含靶向FUBP的dsRNA。
优选地，所述靶向FUBP的dsRNA包含由SEQ ID.NO.9所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。
本发明的第五个方面，提供一种dsRNA，所述dsRNA包含由SEQ ID.NO.9所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。
优选地，所述dsRNA具有如下功能：
e1)防治蜚蠊目昆虫；和/或
e2)抑制蜚蠊目昆虫翅发育。
优选地，所述蜚蠊目昆虫包含黑胸大蠊、美洲大蠊、澳洲大蠊、德国小蠊、日本大蠊中的至少一种；进一步优选地，所述蜚蠊目昆虫包含德国小蠊。
优选地，所述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：以编码本发明第一个方面的FUBP的核酸分子为模板，设计引物进行PCR扩增后体外转录合成得到。
优选地，所述引物包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明的第六个方面，提供与本发明第五个方面的dsRNA相关的生物材料，所述生物材料包含f1)～f8)中任一种：
f1)编码本发明第五个方面的dsRNA的核酸分子；
f2)包含f1)所述核酸分子的表达盒；
f3)包含f1)所述核酸分子的载体；
f4)包含f2)所述表达盒的载体；
f5)包含f1)所述核酸分子的转基因细胞系；
f6)包含f2)所述表达盒的转基因细胞系；
f7)包含f3)所述载体的转基因细胞系；
f8)包含f4)所述载体的转基因细胞系。
优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
优选地，所述生物材料具有如下功能：
e1)防治蜚蠊目昆虫；和/或
e2)抑制蜚蠊目昆虫翅发育。
优选地，所述蜚蠊目昆虫包含黑胸大蠊、美洲大蠊、澳洲大蠊、德国小蠊、日本大蠊中的至少一种；进一步优选地，所述蜚蠊目昆虫包含德国小蠊。
本发明的第七个方面，提供一种产品，包含：FUBP抑制剂；所述FUBP为本发明第一个方面的FUBP。
优选地，所述FUBP抑制剂包含抑制FUBP活性的物质、降解FUBP的物质、降低FUBP表达水平的物质中的至少一种。
优选地，所述降低FUBP表达水平的物质包含靶向FUBP的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶、shRNA中的至少一种。
优选地，所述FUBP抑制剂包含靶向FUBP的dsRNA。
优选地，所述靶向FUBP的dsRNA包含由SEQ ID.NO.9所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。
优选地，所述产品包含：试剂、药物、和/或试剂盒。
优选地，所述产品具有如下功能：
e1)防治蜚蠊目昆虫；和/或
e2)抑制蜚蠊目昆虫翅发育。
优选地，所述蜚蠊目昆虫包含黑胸大蠊、美洲大蠊、澳洲大蠊、德国小蠊、日本大蠊中的至少一种；进一步优选地，所述蜚蠊目昆虫包含德国小蠊。
本发明的第八个方面，提供一种方法，包含：降低蜚蠊目昆虫中FUBP的表达量和/或活性的步骤；所述FUBP为本发明第一个方面的FUBP。
所述方法为g1)～g2)中任一种：
g1)抑制蜚蠊目昆虫翅发育的方法；
g2)防治蜚蠊目昆虫的方法。
优选地，所述降低蜚蠊目昆虫中FUBP的表达量和/或活性的步骤是将FUBP抑制剂导入蜚蠊目昆虫体内。
优选地，所述FUBP抑制剂包含抑制FUBP活性的物质、降解FUBP的物质、降低FUBP表达水平的物质中的至少一种。
优选地，所述降低FUBP表达水平的物质包含靶向FUBP的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶、shRNA中的至少一种。
优选地，所述FUBP抑制剂包含靶向FUBP的dsRNA。
优选地，所述靶向FUBP的dsRNA包含由SEQ ID.NO.9所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。
优选地，所述蜚蠊目昆虫包含黑胸大蠊、美洲大蠊、澳洲大蠊、德国小蠊、日本大蠊中的至少一种；进一步优选地，所述蜚蠊目昆虫包含德国小蠊。
本发明的有益效果是：
本发明首次公开了FUBP以及与FUBP相关的生物材料，FUBP以及与FUBP相关的生物材料与蜚蠊目昆虫翅发育显著相关，通过降低蜚蠊目昆虫中FUBP的表达量和/或活性可以导致蜚蠊目昆虫翅发育受阻(发育障碍)，从而导致蜚蠊目昆虫成虫卵子发育等生殖过程无法正常进行，达到防治蜚蠊目昆虫的效果，并且在防治过程中，不会产生抗药性、对人畜没有危害，且对环境没有污染。
附图说明
图1是本发明实施例2中FUBP基因RNAi效率检测图：***表示p<0.001。
图2是本发明实施例2中注射dsCK和dsFUBP后德国小蠊翅形态对照图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1dsRNA的设计与合成
使用TRIzol(Life Technologies)方法提取德国小蠊翅的总RNA，然后使用OligodT引物进行反转录(PrimeScript II reverse transcriptase(Takara Bio,Shiga,Japan))合成cDNA第一条链。
根据已有的德国小蠊基因组信息，通过与其他物种进行比对找到德国小蠊FUBP基因的完整序列，如SEQ ID No.1所示：
ATGAGTGATTATTCAGCGGTTGCTCCGCCTACGAATTTTAGTCAAAGTTCAGCTTTTGCAGCTGCCCTTCAGCGTGCTAGACAGATTGCAGCTAAGATCAACCCCAGTGGATCAAGCGACAGTGTAGGCCAGAAACGTCCATTGGAAGACGGGTCAGAACCAGAACCAAAAAAGGTGGCTGCAGTGAATGACCCAGCAGGAGTGCAGCTGGCAGCCGTATCAATCGTACCGCGTGTTTACACAGCTGCTGCGTTCCAGAGTCCTTACCTCGGAGCTGCGCCTTCTAGCAATGTGGCGTCACGCAGGCAACTGTGCAGTCCAGAAAAAGTTATTGGAAGAGGTGGTGAACAAATTAGTCGACTTCAAAATGAGTCTGGGTGCAAAATTCAAATGGCACCTGATAGTGCAGGAATGCCAGATAGGAGTTGTACACTGACTGGTTCACGAGAGGCAATCAATCGAGCCAAAGAACTAATTATGAATATTGTTCAACAACGCAGTAGAACAGAAGGTACAGGTTCAAATATGGGTGATATGAACATGGGTGGCGGACCTGGGAATCATGCCCACGTTGAAATCATGGTTCCTGGACCAAAAGTAGGATTGATCATAGGTAAAGGAGGAGAAACTATAAAACAGCTCCAAGAGAAATCAGGAGCTAAAATGGTTGTGATCCAAGATGGACCCACACAAGAACAGGAGAAACCACTTAGAATTAGTGGTGAGCCCCAGAAAGTCGAGTATGCAAAGCAGTTGGTGTACGACTTAATAGCTGAAAAGGAAATGCAGGTAAATATTTATATAGAGGTTGCTGTTCCAAGAGCAGCTGTTGGAGTTGTTATTGGTAAAGGTGGAGATATGATAAAGAAAATCCAAAATGAAACAGGAGCTCGTGTTCAGTTCCAACAGGGACGTGATGATGGACCTGGAGAAAGGAGATGTCTTTTAACAGGAAAACCTAATCAAGTTGATCAGGCAAGACGAAGAATAGAAGAACTAATTGATAGTGTACTGAGGAGAGACAGTGAAATAGGTCGTGGCAGAGGGAGAGGAGGGCCTGGTGGACCAGGAGGCCCCTATGATCGTATGGGTGGTGGTCAGATGGACAAACAAGAAGCCACATTCACAATTCCAGCTGCTAAATGTGGCATAGTAATTGGTAGAGGAGGAGAGACAATCAAACAAATTAATCAACAAACTGGAGCACATTGCGAATTAGATCGAAGACCGCCTCCAAATCCTAACGAGAAAGTTTTTGTAATCAGAGGGTCTCCTGATCAGATAGAGCAAGCGAAGAGAATAATCAGTGAAAAAATTGGAATGCCACCTGGACCTGGTGGAGCTCCTCCAACACAGTATCCCATTGGTGGTCAAGGTCCACCTGGAGGACAAGGTCCACCCCAACAGTTTGCACCTCAGGGATGGGGTGGTGGTTACCAACCATGGCATAACCAGCAACACCCTGGAAGTGATCCAAATGCTGGTGGGCAAGTCCAAGTAAATCCTGCAACTGGTCAACCAGATTATAGCATTCAGTGGGCTGAATACTATCGCTCCCTTGGTATGCATAGAGAAGCAGAAATGATAGAACAGCAAGCTAAAGCAAGTAAGGGTCTACAGCCTCAACAAGCTGCACAACCTCAACCGCAACCGGCTGGCCCGCAACCTGGTGCTGCAGCACAGAATGGACAGCCGGACTACAGTGCCCAATGGGCAGAATACTATAGATCCATTGGCAAAGTTAAGGAAGCAGAAGCCATTGAGGCACAAATGAAAGCAAACAAGGCTGGGCAACCTGCTGCCGCTGCAGGTTACTACGGAGGTGCGCCAGGAGGCCCCCAACCACCCCAACAACCAGGTCAGCAGCAACCGTACAACTATCCCAGTTATGGCGGATATGGTGGACAACCAGGTGGACCAGACAATCAGTGA(SEQ ID No.1)；其对应的氨基酸序列为：MSDYSAVAPPTNFSQSSAFAAALQRARQIAAKINPSGSS DSVGQKRPLEDGSEPEPKKVAAVNDPAGVQLAAVSIVPRVYTAAAFQSPYLGAAPSSNVASRRQLCSPEKVIGRGGEQISRLQNESGCKIQMAPDSAGMPDRSCTLTGSREAINRAKELIMNIVQQRSRTEGTGSNMGDMNMGGGPGNHAHVEIMVPGPKVGLIIGKGGETIKQLQEKSGAKMVVIQDGPTQEQEKPLRISGEPQKVEYAKQLVYDLIAEKEMQVNIYIEVAVPRAAVGVVIGKGGDMIKKIQNETGARVQFQQGRDDGPGERRCLLTGKPNQVDQARRRIEELIDSVLRRDSEIGRGRGRGGPGGPGGPYDRMGGGQMDKQEATFTIPAAKCGIVIGRGGETIKQINQQTGAHCELDRRPPPNPNEKVFVIRGSPDQIEQAKRIISEKIGMPPGPGGAPPTQYPIGGQGPPGGQGPPQQFAPQGWGGGYQPWHNQQHPGSDPNAGGQVQVNPATGQPDYSIQWAEYYRSLGMHREAEMIEQQAKASKGLQPQQAAQPQPQPAGPQPGAAAQNGQPDYSAQWAEYYRSIGKVKEAEAIEAQMKANKAGQPAAAAGYYGGAPGGPQPPQQPGQQQPYNYPSYGGYGGQPGGPDNQ*(SEQ ID No.2)。
利用dsRNA设计网站E-RNAi(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/)，将整个靶向的德国小蠊FUBP基因开放阅读框序列复制粘贴到网站中，通过设计参数筛选得到最佳的dsRNA靶向序列。然后设计引物对：CTGCGTTCCAGAGTCCTT(SEQ ID No.3)和GCATTTCCTTTTCAGCTATT(SEQ ID No.4)。以cDNA为模板扩增得到含有靶向序列的DNA片段，并将其克隆到pTOPO载体(Aidlab，China)中，测序验证序列是否存在碱基突变，挑选没有任何突变的克隆用于后续实验，载体命名为pTOPO-FUBP。dsRNA靶向的DNA序列为：CT GCGTTCCAGAGTCCTTACCTCGGAGCTGCGCCTTCTAGCAATGTGGCGTCACGCAGGCAACTGTGCAGTCCAGAAAAAGTTATTGGAAGAGGTGGTGAACAAATTAGTCGACTTCAAAATGAGTCTGGGTGCAAAATTCAAATGGCACCTGATAGTGCAGGAATGCCAGATAGGAGTTGTACACTGACTGGTTCACGAGAGGCAATCAATCGAGCCAAAGAACTAATTATGAATATTGTTCAACAACGCAGTAGAACAGAAGGTACAGGTTCAAATATGGGTGATATGAACATGGGTGGCGGACCTGGGAATCATGCCCACGTTGAAATCATGGTTCCTGGACCAAAAGTAGGATTGATCATAGGTAAAGGAGGAGAAACTATAAAACAGCTCCAAGAGAAATCAGGAGCTAAAATGGTTGTGATCCAAGATGGACCCACACAAGAACAGGAGAAACCACTTAGAATTAGTGGTGAGCCCCAGAAAGTCGAGTATGCAAAGCAGTTGGTGTACGACTTAATAGCTGAAAAGGAAATGC(SEQ IDNo.5)；其对应的氨基酸序列为：AAFQSPYLGAAPSSNVASRRQL CSPEKVIGRGGEQISRLQNESGCKIQMAPDSAGMPDRSCTLTGSREAINRAKELIMNIVQQR SRTEGTGSNMGDMNMGGGPGNHAHVEIMVPGPKVGLIIGKGGETIKQLQEKSGAKMVVIQ DGPTQEQEKPLRISGEPQKVEYAKQLVYDLIAEKEM(SEQ ID No.6)。
采用PCR在靶向序列两侧引入T7启动子，具体方法为用设计两端含有T7启动子的引物，GGATCCTAATACGACTCACTATAGG CTGCGTTCCAGAGTCCTT(SEQ ID No.7)和GGATCCTAATACGACTCACTATAGG GCATTTCCTTTTCAGCTATT(SEQ ID No.8)。以pTO PO-FUBP载体为模板进行扩增，得到两端含有T7启动子的PCR产物，然后利用T7RiboMA XTM Express RNAiSystem(Promega Corporation)来合成正向和反向RNA，在T7 RNA聚合酶和DNaseI依次处理后将两条正反向的RNA混合并70℃处理10min，然后逐渐降温到室温使其退火变成dsRNA，序列为由SEQ ID No.9所示的核苷酸序列和相对应的反向互补的核苷酸组成的双链RNA(dsFUBP)：GCATTTCCTTTTCAGCTATTAAGTCGTACACCAAC TGCTTTGCATACTCGACTTTCTGGGGCTCACCACTAATTCTAAGTGGTTTCTCCTGTTCTTGTGTGGGTCCATCTTGGATCACAACCATTTTAGCTCCTGATTTCTCTTGGAGCTGTTTTATAGTTTCTCCTCCTTTACCTATGATCAATCCTACTTTTGGTCCAGGAACCATGATTTCAACGTGGGCATGATTCCCAGGTCCGCCACCCATGTTCATATCACCCATATTTGAACCTGTACCTTCTGTTCTACTGCGTTGTTGAACAATATTCATAATTAGTTCTTTGGCTCGATTGATTGCCTCTCGTGAACCAGTCAGTGTACAACTCCTATCTGGCATTCCTGCACTATCAGGTGCCATTTGAATTTTGCACCCAGACTCATTTTGAAGTCGACTAATTTGTTCACCACCTCTGCCAATAACTTTTTCTGGACTGCACAGTTGCCTGCGTGACGCCACATTGCTAGAAGGCGCAGCTCCGAGGTAAGGACTCTGGAACGCAG(SEQ ID No.9)。
实施例2dsRNA的应用(德国小蠊体内实验)
为了验证本发明制备的靶向FUBP基因的dsRNA在德国小蠊翅发育过程中的影响，对德国小蠊进行dsRNA注射的方式来实现(dsFUBP)。采用不靶向德国小蠊任何基因的CK作为dsRNA的阴性对照(dsCK)；其中，dsCK的核苷酸序列为：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA GCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG(SEQ ID No.12)；步骤如下：挑选刚6龄的德国小蠊进行饲养，第二天将其低温麻醉后放在显微镜解剖台上，然后使用显微注射方法将靶向FUBP基因的dsRNA按照一定的剂量(8μg)注射到德国小蠊的腹部，饲养2天后再注射一次，共2次(2μg/μL，每次2μL)，注射后持续观察dsRNA处理对德国小蠊翅的影响，在使基因表达量降低的情况下研究FUBP基因对德国小蠊翅表型的影响。其中，实验组和对照组各三个生物学重复，每个重复使用的德国小蠊为4只。
验证结果如下：
dsRNA对FUBP基因干扰效果验证：
在注射一次dsRNA后的48h将德国小蠊(4只/处理)麻醉并进行解剖，将翅解剖出来并提取RNA，使用RN28-EASYspin Plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒对翅进行处理，按照试剂盒说明书进行操作。利用Nanodrop One对RNA浓度进行测定，然后量取2μg RNA进行反转录得到cDNA。利用premier 5引物设计软件设计qPCR引物，设计的引物为GAGCAGCTGTTGGAGTTGTT(SEQ ID No.10)和TCTCCAGGTCCATCATCACG(SEQ ID No.11)，通过对定量结果进行分析，检测靶基因干扰效果，结果如图1所示。从图1中可以看出，dsFUBP处理可以显著干扰靶基因FUBP的表达。
观察干扰FUBP基因对德国小蠊翅发育的影响：
与对照组(注射无靶向德国小蠊任何内源基因的dsCK)进行比较，观察干扰组德国小蠊翅的异同。部分表型的实验结果图2所示，从图2中可以看出注射对照组的德国小蠊翅发育正常，翅平展且覆盖胸腹部，因此可以进行举翅等求偶行为，不影响两性的交配和生殖；从图2中可以看出，dsRNA注射导致翅严重卷曲、皱缩，发育不正常，因此，dsFUBP基因干扰组的德国小蠊绝大多数出现畸形，直接影响求偶和交配，进而亦可以达到蟑螂等蜚蠊目昆虫防治的目的。
综上所述，通过RNA干扰技术靶向沉默FUBP基因能够有效影响基因FUBP的表达，进而导致蟑螂等蜚蠊目昆虫翅发育障碍，导致其求偶行为无法正常进行，从而影响种群的生殖。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.FUBP，所述FUBP的氨基酸序列为：
a1）SEQ ID No.6；或
a2）SEQ ID No.2。
2.与权利要求1所述的FUBP相关的生物材料，所述生物材料包含b1)～b8)中任一种：
b1)编码权利要求1所述的FUBP的核酸分子；
b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；
b3)包含b1)所述核酸分子的载体；
b4)包含b2)所述表达盒的载体；
b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；
b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；
b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；
b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系；
所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
3. FUBP抑制剂在d1)～d4)中任一项中的应用：
d1)防治蜚蠊目昆虫；
d2)制备防治蜚蠊目昆虫的产品；
d3)抑制蜚蠊目昆虫翅发育；
d4)制备抑制蜚蠊目昆虫翅发育的产品；
所述蜚蠊目昆虫为德国小蠊；
所述FUBP抑制剂为降低FUBP表达水平的物质；
所述FUBP为权利要求1所述的FUBP。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述降低FUBP表达水平的物质包含靶向FUBP的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶、shRNA中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述降低FUBP表达水平的物质为靶向FUBP的dsRNA。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述靶向FUBP的dsRNA为由SEQ ID.NO.9所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。
7.一种dsRNA，所述dsRNA为由SEQ ID.NO.9所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。
8.与权利要求7所述的dsRNA相关的生物材料，所述生物材料包含f1)～f8)中任一种：
f1)编码权利要求7所述的dsRNA的核酸分子；
f2)包含f1)所述核酸分子的表达盒；
f3)包含f1)所述核酸分子的载体；
f4)包含f2)所述表达盒的载体；
f5)包含f1) 所述核酸分子的转基因细胞系；
f6) 包含f2)所述表达盒的转基因细胞系；
f7)包含f3)所述载体的转基因细胞系；
f8)包含f4)所述载体的转基因细胞系；
所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
9.一种产品，包含：FUBP抑制剂；所述FUBP抑制剂为靶向FUBP的dsRNA；
所述靶向FUBP的dsRNA为由SEQ ID.NO.9所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。
10.一种方法，包含：降低蜚蠊目昆虫中权利要求1所述的FUBP的表达量和/或活性的步骤；
所述方法为g1)～g2)中任一种：
g1) 抑制蜚蠊目昆虫翅发育的方法；
g2) 防治蜚蠊目昆虫的方法；
所述蜚蠊目昆虫为德国小蠊。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：
所述降低蜚蠊目昆虫中FUBP的表达量和/或活性的步骤是将FUBP抑制剂导入蜚蠊目昆虫体内。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：
所述FUBP抑制剂为权利要求3～6中任一项所述的FUBP抑制剂。
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