CN116790679B - 德国小蠊Dnmt1基因在肢体再生及害虫防治中的应用 - Google Patents
德国小蠊Dnmt1基因在肢体再生及害虫防治中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了德国小蠊Dnmt1基因在肢体再生及害虫防治中的应用，其中，基于德国小蠊Dnmt1基因构建得到了一种dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。在本发明中，发明人首次发现了蜚蠊目昆虫Dnmt1基因对于其断肢再生能力的影响，并开发得到了一种能够有效抑制蟑螂断肢再生的dsRNA试剂，从而通过施用该试剂，使蟑螂在脱皮后无法实现附肢再生，从而限制了其活动能力，降低了其生存能力，达到了防治的效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及德国小蠊Dnmt1基因在肢体再生及害虫防治中的应用。
背景技术
蟑螂原产于非洲，主要分布在温暖潮湿的地区，如厨房、卫生间、书柜等隐蔽的缝隙中。蟑螂是夜行动物且繁殖能力强大，因此可以短时间构建起数量庞大的种群，而且基于其特殊的生活习性也是其很难被人们所消灭。
德国小蠊是蟑螂的一种，也被称为厨房小蟑螂。德国小蠊成年体长大约1.3至1.6厘米，身体扁平，呈橙黄色至棕色。它们是广泛分布于全球的害虫之一，尤其在城市和城镇中非常常见。通常被发现在厨房、卫生间、床头柜和电器、水管等细缝中。德国小蠊是杂食动物，会吃任何可腐烂的有机物，如食品残渣、纸张、糖、头发、皮肤和动植物残骸。德国小蠊的耐饥饿能力较强，在饥饿状态下，德国小蠊群体中会出现互相残食的情况。水对德国小蠊的生存比食物更为重要，在条件适宜的情况下，德国小蠊成虫能存活约3-4个月并产下超过4个蛹鞘，每个蛹鞘内又含有40至50只卵。德国小蠊的卵包裹在一个耐高温的鞘里，即使暴露在高温环境中，仍然能够有较高的存活率。因此，该物种极容易出现爆发性数量增长，控制起来也十分困难。
德国小蠊体积小，捕杀困难，而且对人体健康的危害性大。德国小蠊携带有大量的对人体健康存在危害性的致病菌，例如沙门氏菌和肠道病毒，因此，如果它们爬过食物或厨房物品，就会将致病菌传播到表面上，从而有机会进入人体，引起食物中毒。而且，基于其杂食性，其会摄取一切的食物，而在摄食过程中，其在食物上留下的残渣和排泄物会导致交叉污染，使食品变质或变得不适宜食用，造成潜在的浪费和安全风险。而且，德国小蠊的出现会降低人们生活空间的卫生标准并破坏正常的生活品质，其入侵会导致餐厅、酒店、食品加工厂和其它商业环境中的食品被污染、破坏或丢失，从而带来经济损失。此外，部分人群对于德国小蠊会存在过敏反应，例如呼吸困难、哮喘和皮肤过敏等，有一定的健康风险，因此，控制德国小蠊具有极为重要的意义。
从上世纪40年代开始，化学农药和有机杀虫剂在害虫防治实践中表现的十分活跃，但这种做法也存在着诸多风险，如杀虫剂毒性残留、抗性的产生、非靶标生物的毒害以及对生态环境的破坏等等。因此，需要研究和探索新的防治方法，以替代传统的化学农药和有机杀虫剂，在高效防止害虫的同时，还能兼具保护环境、维护消费者身体健康和生态环境的效果。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供德国小蠊Dnmt1基因在肢体再生及害虫防治中的应用。在本发明中，发明人首次发现了蜚蠊目昆虫Dnmt1基因对于其断肢再生能力的影响，并开发得到了一种能够有效抑制蟑螂断肢再生的dsRNA试剂，从而通过施用该试剂，使蟑螂在脱皮后无法实现附肢再生，从而限制了其活动能力，降低了其生存能力，达到了防治的效果。
本发明的第一个方面，提供一种昆虫防治产品，所述蟑螂防治产品中含有调控蜚蠊目昆虫Dnmt1基因的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述调控蜚蠊目昆虫Dnmt1基因的物质包括(1)～(3)中的至少一种：
(1)dsRNA；
(2)含有(1)中所述dsRNA的表达子；
(3)含有(1)中所述dsRNA和/或(2)中所述表达子的转化子；
其中，所述转化子包括细胞或工程菌。
在本发明的一些实施方式中，所述表达子包括质粒载体。
在本发明的一些实施方式中，所述质粒载体包括本领域中常规使用的质粒载体，包括但不限于本发明中所使用的pTOPO载体。
在本发明的一些实施方式中，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在本发明的一些实施方式中，所述dsRNA的制备方法为：
使用SEQ ID NO：2和3所示引物，以德国小蠊Dnmt1基因为模板进行扩增，将扩增产物克隆到表达子中。使用SEQ ID NO：5和6所示引物对表达子进行扩增，并在扩增产物两端引入T7启动子，依次使用T7 RNA聚合酶和DNase I处理后，得到正反向RNA，70℃处理10min，即得dsRNA。
其中，所述正向和反向RNA为如SEQ ID NO：7所示序列及其反向互补序列。
在本发明的一些实施方式中，所述调控为沉默蜚蠊目昆虫Dnmt1基因的表达。
在本发明的一些实施方式中，所述蜚蠊目昆虫包括德国小蠊。当然，本领域技术人员也可以尝试用于其他蜚蠊目昆虫，包括但不限于上述的德国小蠊。
在本发明的一些实施方式中，所述蜚蠊目昆虫为德国小蠊。
本发明的第二个方面，提供调控蜚蠊目昆虫Dnmt1基因的物质在防治德国小蠊中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述调控蜚蠊目昆虫Dnmt1基因的物质为dsRNA。
在本发明的一些实施方式中，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明的第三个方面，提供dsRNA在制备组织再生抑制剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在本发明的一些实施方式中，所述组织包括昆虫器官组织或肢体。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现了蜚蠊目昆虫Dnmt1基因对于其断肢再生能力的影响，并基于RNAi干扰技术，开发得到了一种能够有效抑制蟑螂断肢再生的dsRNA试剂。通过合成的dsRNA来靶向DNA去甲基化相关基因Dnmt1来影响德国小蠊的断肢再生，限制其活动能力，降低了其生存能力，从而达到了蟑螂防治的效果。
附图说明
图1为本发明实施例中的dsRNA(dsDnmt1)和dsCK对靶基因Dnmt1的表达干扰效果对比图。
图2为未经处理的德国小蠊不同组织的DNA甲基化水平分布情况。
图3为dsRNA处理后的德国小蠊组织的DNA甲基化水平分布情况。
图4为dsRNA处理对德国小蠊附肢再生的影响。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。
一种用于阻断蟑螂断肢再生能力的dsRNA
在本实施例中，发明人设计并合成了一种可以有效阻断蟑螂断肢再生能力的dsRNA，从而用于蟑螂的防治。
(1)dsRNA的设计与合成：
使用TRIzol方法(使用提取试剂盒，购自Thermo Fisher，按照说明书执行)提取德国小蠊附肢转节部位的总RNA，然后使用oligo(dT)引物和反转录酶PrimeScript IIreverse transcriptase(购自Takara)进行反转录，得到cDNA。
在现有数据库中进行物种比对和数据检索，获得德国小蠊Dnmt1基因的完整序列。
得到的德国小蠊Dnmt1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
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GCGGGCAACTATGGAGTTCCCCAGACAAGAAGAAGGGCCATCATCATTGCTGCAGCCCC
TGGCGAAGTCCTTCCCAAGTATCCGGAGCCAACTCACGTGTTCAGCCCCAAAGCTTGCC
AACTCTCCGTCTTGGTGGACGACAGGAAGTTCCTCACAAACAGTCGGTGGGTGATGTC
GGCCCCCTTGAGGACCATCACGGTGCGCGATGCCATCTCGGACCTCCCGGAAATCCGAA
ACGGACACAAGAAGGAGGAAATGGCATACGGCGGGGAACCCATGTCTCATTTCCAGCG
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CCCCCATCATGGAGGCAAGAATTGCCAACATTCCCACGGCGAGCGGATCCGACTGGCGG
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TTTGTACAACGACAAGAAGAACGGCAAGTCGTCGAGTGGAGCCCTGAGAGGAGTTTGC
GCATGTGCATCGGAAAAATCGTGCGACCCCATGGACCGACAGTACAACACGCTCATTCC
GTGGTGTCTGCCCCACACCGGAAACCGCAACAATCACTGGGCCGGACTATATGGTCGTC
TCGAGTGGGACGGCTACTTCAGCACGACCGTCACAAATCCTGAGCCCATGGCCAAACA
GGGACGAGTGCTGCATCCAGAACAGACGCGAGTCGTGAGCGTGCGGGAGTGTGCACGT
TCGCAAGGATTCCCGGACACGTACCGCTTCTTTGGCAATGTTATCGACAAACACAGACA
GATTGGCAATGCGGTTCCTCCACCCATGGGAACGGCCATCGGCCTGGAAATCAAGAAATGCATTGCCCAAGTGGAAAATAGGGCACAAGAAGACACCGATATGGAAGTGGCCTGA-3’(SEQ ID NO：1)。
利用dsRNA设计网站E-RNAi(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/)对德国小蠊Dnmt1基因开放阅读框序列进行处理，并进一步设计dsRNA靶向序列，并通过参数调节进行筛选，得到最佳的dsRNA靶向序列。
其中，用于dsRNA靶向序列设计的引物为：
上游引物Dnmt1 F：5’-TGTATGAGGACAGAATGGGA-3’(SEQ ID NO：2)；
下游引物Dnmt1 R：5’-GTCTCACGAGTCCAAACAG-3’(SEQ ID NO：3)。
具体步骤为：使用上述引物，以上述得到的cDNA为模板进行扩增，得到含有靶向序列的DNA片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4)。将其采用本领域常规手段克隆到pTOPO载体(购自Aidlab)中，通过测序进行验证(确保其无其他突变)。取经过验证筛选的阳性克隆(无其他突变)用于后续实验。基于该步骤获得的重组载体命名为pTOPO-Dnmt1。
5’-TGTATGAGGACAGAATGGGACTGAAACGAGTGCATGGCCATTGGTTCAGCCGTG GTTCGGACACCGTCCTAGGCGAGACGTCGGATCCTTTGGAGCTGTTCGCGGTGGACGAGTGTGAGGACATGCTTCTTTCCGCCATCATGAAAAAGGCGGTCGTGACTTATAGGCCCATCCCTAGCAACTGGGCCGAACTCGGAGGGGTGGAATCTTCGGTAGAACCTATCGAGGATGACGGCAAGACGTTTTTCTATCAGAAGCAGTATGATTGGATTCATGGAAGGTTCGAAAACTTGTATCCCGATCCGCCTTGTTTAAGGGAGGACCTCAAATACAAGTTCTGCCCCTCATGTGAGCGCCTGTACTTGCAGCAGAAGTTTGATAGACCCATCATCGATGAAAAGCTGGGCATTGTCAACGAGAATCGAGAAGTGCTGTTTGGACTCGTGAGAC-3’(SEQ ID NO：4)。
使用SEQ ID NO：5～6所示引物，以pTOPO-Dnmt1重组载体为模板，通过PCR扩增在SEQ ID NO：4两端引入T7启动子，得到两端含有T7启动子的PCR产物。
其中，所用引物的核苷酸序列具体为：
上游引物Dnmt1 T7 F：5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTGTATGAGGACAGAA TGGGA-3’(SEQ ID NO：5)；
下游引物Dnmt1 T7 R：5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTCTCACGAGTCCA AACAG-3’(SEQ ID NO：6)。
基于两端含有T7启动子的PCR产物，利用T7RiboMAX Express RNAi System(购自Promega)合成正向和反向RNA，然后依次使用T7 RNA聚合酶和DNase I进行处理后，得到正反向RNA混合后，70℃处理10min，逐渐冷却至室温后得到dsRNA。得到的正向和反向RNA为如SEQ ID NO：7所示序列及其反向互补序列。
5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTGTATGAGGACAGAATGGGACTGAAACGA GTGCATGGCCATTGGTTCAGCCGTGGTTCGGACACCGTCCTAGGCGAGACGTCGGATCCTTTGGAGCTGTTCGCGGTGGACGAGTGTGAGGACATGCTTCTTTCCGCCATCATGAAAAAGGCGGTCGTGACTTATAGGCCCATCCCTAGCAACTGGGCCGAACTCGGAGGGGTGGAATCTTCGGTAGAACCTATCGAGGATGACGGCAAGACGTTTTTCTATCAGAAGCAGTATGATTGGATTCATGGAAGGTTCGAAAACTTGTATCCCGATCCGCCTTGTTTAAGGGAGGACCTCAAATACAAGTTCTGCCCCTCATGTGAGCGCCTGTACTTGCAGCAGAAGTTTGATAGACCCATCATCGATGAAAAGCTGGGCATTGTCAACGAGAATCGAGAAGTGCTGTTTGGACTCGTGAGACCCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC-3’(SEQ ID NO：7)。
阻断蟑螂断肢再生能力的dsRNA的实际使用效果
在本实施例中，选择刚蜕皮的5龄德国小蠊幼虫作为实验体。将其置于圆形塑料罐中，在28℃恒温培养箱中培养。在该恒定环境中适应培养一天后，对德国小蠊进行低温麻醉。在体视显微镜下，采用显微注射方法将上述实施例中制备得到的阻断蟑螂断肢再生能力的dsRNA注射入德国小蠊的腹部。注射量为4μg。三天后重复注射一次，使其Dnmt1基因表达水平降低，并观察其对德国小蠊断肢再生的实际影响。
在完成第二次dsRNA注射后48h时，麻醉德国小蠊并取其附肢转节部位，使用TRIzol法对样品进行核酸提取(按照试剂盒说明书进行操作提取组织RNA)。利用NanodropOne超微量分光光度计对RNA浓度进行测定。然后量取2μg RNA进行反转录得到cDNA。
使用Dnmt1基因检测引物(如SEQ ID NO：8和9所示)对cDNA进行PCR定量分析，以确定dsRNA对靶基因(Dnmt1)的干扰效果。以注射无法靶向德国小蠊任何內源基因的dsCK(如SEQ ID NO：10所示)作为对照。具体引物序列如下：
上游引物Dnmt1 T7 F：5’-ACTGGAAAAGCGAGACATTC-3’(SEQ ID NO：8)；
下游引物Dnmt1 T7 R：5’-GATGCAGTCGTTCTTTCGTATC-3’(SEQ ID NO：9)。
dsCK：5’-GATCCTTTCCTGGGACCCGGCAAGAACCAAAAACTCACTCTCTTCAAGGA AATCCGTAATGTTAAACCCGACACGATGAAGCTTGTCGTTGGATGGAAAGGAAAAGAGTTCTACAGGGAAACTTGGACCCGCTTCATGGAAGACAGCTTCCCCATTGTTAACGACCAAGAAGTGATGGATGTTTTCCTTGTTGTCAACATGCGTCCCACTAGACCCAACCGTTGTTACAAATTCCTGGCCCAACACGCTCTGCGTTGCGACCCCGACTATGTACCTCATGACGTGATTAGGATCGTCGAGCCTTCAT-3’(SEQ ID NO：10)。
结果如图1所示。
可以发现，与对照组相比，本发明实施例中的dsRNA处理可以显著干扰靶基因Dnmt1的表达。
在dsRNA注射前和完成第二次dsRNA注射后48h时，分别测定德国小蠊组织DNA甲基化水平分布情况，具体步骤为：
分别取德国小蠊头部(head)、胸部(thorax)、附肢(leg)、表皮(integument)、中肠(midgut)和卵巢(ovary)共6个组织作为样品，使用DNA提取试剂盒(Axygen)按照说明书提取德国小蠊组织的基因组DNA。使用5mC特异性抗体(anti-5mC，购自Abcam)检测其各个组织间的DNA甲基化水平。以注射无法靶向德国小蠊任何內源基因的dsCK作为对照。
结果如图2和图3所示。
有图2可见，德国小蠊不同组织间的DNA甲基化水平分布存在明显差异，其中，附肢、胸部、表皮以及卵巢中的DNA甲基化水平较高。如图3所示，进一步以附肢转节部位为样品，与对照组相比，可以明显发现Dnmt1基因沉默实验组的附肢转节部位的DNA甲基化水平显著性降低。
将完成第二次dsRNA注射后的5龄幼虫继续培养至经过一次蜕皮后，观察蜕皮后其附肢再生的状态，并对再生的新附肢的长度进行统计(表示为再生能力)。以注射无法靶向德国小蠊任何內源基因的dsCK作为对照。
结果如图4所示。
可以发现，对照组的德国小蠊在蜕皮断肢后可以正常长出新的正常附肢(新附肢的长度正常)，而dsRNA注射对Dnmt1基因进行干扰后，德国小蠊蜕皮断肢后无法长出正常功能的附肢(新附肢的长度显著低于对照组)，从而极大的影响了其活动能力，降低了其生存能力，从而达到了防治的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种昆虫防治产品，其特征在于，所述昆虫防治产品中含有调控蜚蠊目昆虫Dnmt1基因的如SEQ ID NO：4所示的dsRNA。
2.根据权利要求1所述的昆虫防治产品，其特征在于，所述调控包括降低蜚蠊目昆虫Dnmt1基因的表达量和沉默蜚蠊目昆虫Dnmt1基因的表达。
3.根据权利要求1所述的昆虫防治产品，其特征在于，所述蜚蠊目昆虫包括德国小蠊。
4.调控蜚蠊目昆虫Dnmt1基因的dsRNA在防治德国小蠊中的应用，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.dsRNA在制备德国小蠊附肢再生抑制剂中的应用；所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
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