CN109680010A

CN109680010A - 基于CRISPR/Cas9的小菜蛾ABCC3基因的敲除和应用

Info

Publication number: CN109680010A
Application number: CN201811502875.6A
Authority: CN
Inventors: 郭兆将; 孙丹; 康师; 郭乐; 周君雷; 龚莉君; 覃舰莹; 朱流红; 白杨; 罗亮; 张友军
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2018-12-10
Publication date: 2019-04-26

Abstract

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9实现非模式生物小菜蛾ABCC3基因的敲除及其在Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性机制分子研究中的应用。本发明方法设计并合成小菜蛾ABCC3基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统筛选出可稳定遗传的小菜蛾ABCC3基因纯合突变种群并用于Bt Cry1Ac杀虫蛋白毒力生物测定，证实小菜蛾ABCC3基因突变可以导致其对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生高抗性。本发明方法简单高效，省时省力，不仅为非模式生物体内功能基因的深入研究提供技术支撑，也为探索新的害虫防治策略奠定了基础。

Description

基于CRISPR/Cas9的小菜蛾ABCC3基因的敲除和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及小菜蛾ABCC3基因的敲除以及在小菜蛾BtCry1Ac杀虫蛋白抗性分子机制研究中的应用。

背景技术

小菜蛾(Diamondback moth, Plutella xylostella)属于鳞翅目，菜蛾科，又名菜蛾，吊丝虫，是一种世界性分布的重要害虫。它主要危害十字花科蔬菜，如甘蓝、芥兰、花椰菜、芥菜、大白菜和萝卜等，严重发生时蔬菜能减产90%以上，甚至绝收，每年在世界范围内引起40-50亿美元的经济损失。小菜蛾的危害之所以如此严重是因为其极易对杀虫剂产生抗药性，目前小菜蛾已经对50多种杀虫剂产生不同程度的抗药性，抗性谱极广，田间化学防治十分困难。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)能产生Cry类杀虫晶体蛋白，对多种昆虫具有特异性毒杀作用，鉴于Bt制剂环境友好，高效无毒，目前已被广泛应用于蔬菜害虫的防治，而且编码Bt杀虫蛋白的基因也已被转入到多种重要的粮棉作物中。但是，由于人们对Bt毒理机制认识的局限性以及Bt的大量和不合理使用导致害虫对该生物源杀虫剂产生非常严重的抗性，其中，小菜蛾是最早被报道在田间对Bt制剂产生抗性的害虫，因此，寻找合理的科学手段研究小菜蛾Bt抗性分子机制，从根本上解决害虫抗药性问题就显得尤为重要。

ABC转运蛋白(ABC transporter)是一个基因超家族，它广泛分布于各种生物中，并在昆虫抗药性中发挥重要作用，以前的报道指出，昆虫ABC transporter有ABCA到H共8个亚家族，其中ABCB、ABCC、ABCG家族基因在昆虫抗药性中存在重要作用。Park等在2014年证明在甜菜夜蛾中沉默ABCC3基因的表达，会增加甜菜夜蛾对Cry1Ac的耐受性。本申请人实验室于2015年证明在敏感小菜蛾种群中使用RNA干扰（RNAi）技术下调ABCC2和ABCC3基因的表达会增加小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素的抗性水平。

CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats and the CRISPR-associated gene Cas9)全名统称为规律成簇的间隔短回文序列及CRISPR相关基因Cas9，是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。自从2013年起，该系统被科学家们应用到各个领域，分别对微生物、植物、动物以及人类等进行基因组编辑。该技术的原理首先是人工合成crRNA (CRISPR-derived RNA)与tracrRNA (trans-activating crRNA)两种互补配对的RNA，形成具有引导作用的sgRNA (single guide RNA)，由该sgRNA指导的，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行切割，Cas9/crRNA复合体能够识别PAM (NGG)位点导致DNA解旋，Cas9的两个切割活性位点被激活，切割靶DNA双链，形成DNA双链断裂(Double-strand break, DSB)，断裂后可以通过非同源末端接合(NHEJ)或者同源介导的修复(HDR)来进行修复，而非同源末端接合(NHEJ)会引起插入或者删除错误，从而达到定点敲除某种基因的目的。近几年来，CRISPR/Cas9技术作为一种强有力的基因编辑手段被应用到很多物种中，但该技术在昆虫领域方面的应用却是一个巨大的挑战，因为很多与昆虫抗药性相关的基因都是隐性的，我们需要得到纯合的突变个体，这就急切要求我们寻找简便省时的方法筛选及鉴定突变事件的发生。

发明内容

本发明针对现有的筛选小菜蛾隐性基因突变体方法上存在的耗时耗力，鉴定过程过于繁琐等问题，提供了一种突变个体及其基因型的无损检测方法及其在小菜蛾BtCry1Ac毒素抗性分子机制研究中的应用。本发明利用反向遗传学技术CRISPR/Cas9实现小菜蛾体内ABCC3基因的敲除，获得了ABCC3基因的纯合突变系，通过Bt毒素Cry1Ac的生物学测定，检测ABCC3基因突变的小菜蛾个体对Bt Cry1Ac杀虫蛋白的抗性水平，阐述了小菜蛾ABCC3基因与Bt Cry1Ac杀虫蛋白之间的抗性关系。

本发明提供的技术方案是：一种基于CRISPR/Cas9技术的小菜蛾ABCC3基因的敲除方法，该方法利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，设计并合成小菜蛾ABCC3基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位，以小菜蛾四龄幼虫新鲜蛹蜕的痕量gDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增和直接测序鉴定G0代突变个体，G0代突变个体相互交配获得G1代，直接和TA测序鉴定后选取数量足够且具有相同突变型的杂合子个体进行自交获得G2代，TA测序鉴定得到能稳定遗传的G2代纯合子个体，随后自交获得G3代的ABCC3纯合基因突变型种群。

进一步地，所述的方法，sgRNA靶标序列设计在小菜蛾ABCC3基因编码区的第三个外显子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；sgRNA靶标位点的合成引物为：CRISPR正向引物如SEQ ID NO. 2所示，以及CRISPR反向引物如SEQ ID NO. 3所示。

所述的方法，所述sgRNA终浓度为150 ng/μl，Cas9蛋白的终浓度为300 ng/μl。

所述的方法，进一步地，利用正向引物SEQ ID NO. 4和反向引物SEQ ID NO. 5可以特异性扩增ABCC3基因sgRNA靶标位点附近的gDNA序列。

同时，本发明还提供一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的小菜蛾ABCC3基因敲除试剂盒，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示sgRNA靶标序列和Cas9蛋白。

所述的试剂盒，进一步包括配套的检测试剂，用于检测所述基因的剪切效果和评估基因敲除效率。

所述的试剂盒，进一步包括SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示序列的引物；以及SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示序列的引物。

本发明人设计并合成小菜蛾ABCC3基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统筛选出可稳定遗传的小菜蛾ABCC3基因纯合突变种群并用于Bt Cry1Ac杀虫蛋白毒力生物测定，证实小菜蛾ABCC3基因突变可以导致其对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生高抗性。本发明方法简单高效，省时省力，不仅为非模式生物体内功能基因的深入研究提供技术支撑，也为探索新的害虫防治策略奠定了基础。

本发明提供了一种小菜蛾CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立方法，对于其他非模式生物（尤其农业昆虫）基因编辑体系的建立具有很好的借鉴价值。

本发明提供了一种筛选小菜蛾隐性基因突变体的方法，该方法是一种无需破坏任何小菜蛾形体结构的无损基因突变型鉴定方法，简单有效，对于其他类似的昆虫具有很好的借鉴价值。

本发明使用CRISPR/Cas9基因编辑系统结合突变个体筛选方法，建立的小菜蛾突变种群为ABCC3基因的体内功能研究以及揭示小菜蛾ABCC3基因与Bt毒素Cry1Ac之间的关系奠定了基础，为田间昆虫Bt抗性治理和使用反向遗传学手段防治田间害虫提供理论和实践基础，与现有的技术相比，该方法简单快速，节省工作时间与工作量。

附图说明

图1是位于靶标位点附近的一段298-bp的脱氧核苷酸序列，其中斜体加下划线的序列为扩增时使用的引物，分别是正向引物(ABCC3-F)和反向引物(ABCC3-R)，箭头标明了上下游引物的方向。

图2为sgRNA设计图，图中按比例标注了小菜蛾ABCC3基因的基因组结构，sgRNA设计在ABCC3基因的第三个外显子区域，虚线内的序列代表sgRNA靶标序列的核心片段，下划线标注的是PAM位点，黑色倒三角形代表Cas9切割位点。

图3是以蛹蜕的gDNA为模板扩增的298-bp的DNA片段。

图4为G1代小菜蛾个体的突变类型，星号为最终获得的纯合突变个体基因型，下划线标注的序列为靶标序列核心区域，黑色倒三角是Cas9切割位点。

图5从上到下依次是野生型个体（DBM1Ac-S敏感种群）、杂合子个体以及最终获得的5-bp缺失的（ABCC3KO种群）纯合子突变个体的测序峰图，黑色下划线代表纯合突变种群所缺失的5-bp碱基序列，箭头所指的位置为基因编辑开始的位点。

具体实施方式

、小菜蛾ABCC3基因sgRNA靶标序列的设计与合成

1.利用Cas-Designer软件(http://www.rgenome.net/cas-designer/)在小菜蛾ABCC3基因第三个外显子设计sgRNA靶标序列（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示），如图2所示，并搜索小菜蛾DBM-DB基因组数据库(http://59.79.254.1/DBM/index.php)以及CRISPR脱靶效应检测Cas-OFFinder软件(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)，检测潜在的脱靶位点。

2.在sgRNA核心位点GCTGTGCAACTTCCTGGCCA前加上T7启动子序列，在sgRNA核心位点后加上与crRNA/tracrRNA互补的序列，组成sgRNA的完整5′端DNA片段。

3.将一段80-bp的crRNA/tracrRNA序列与步骤2中的sgRNA 5′端DNA片段经过PCR变性、退火、延伸合成完整的sgRNA脱氧核苷酸链，采用的引物如SEQ ID NO. 2和SEQ IDNO. 3所示。

CRISPR正向引物(C3-CRI-F)：

5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTACTACACGGTGGGCATGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′（SEQ ID NO. 2）；

CRISPR反向引物(CRI-R)：5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3′（SEQ ID NO. 3）。

(1)sgRNA合成：使用TaKaRa公司的 PrimeSTAR Max Premix聚合酶，进行50 μl体系的无模板PCR反应，具体为(10 μM CRISPR-F 2 μl；10 μM CRISPR-R 2 μl；PrimeSTARMax Premix (2×) 25 μl；ddH₂O 21 μl)。

(2)PCR反应条件为：98 °C 2 min；38个循环 (98 °C 10 s, 70 °C 5 s, 72 °C30 s)；72 °C 10 min；4 °C ∞。

(3)应用北京康为世纪生物科技有限公司的DNA clean-up试剂盒对上述PCR产物进行纯化，具体步骤如下：

将步骤3中得到的sgRNA脱氧核苷酸链体外反转录合成sgRNA核苷酸序列。

(1)sgRNA体外转录：利用Ambion公司的MEGAshortscript T7 High YieldTranscription试剂盒进行体外反转录，按照表1加入相应试剂：

表1

试剂	体系
		10×T7 Reaction Buffer	2 μl
DNA template	1 μg
		10mM ATP	2 μl
10mM CTP	2 μl
		10mM GTP	2 μl
10mM UTP	2 μl
		T7 Enzyme Mix	2 μl
Nuclease-free Water	至20 μl

轻轻混合反应试剂，37 °C孵育4 h。

加入1 μl TURBO DNase，混匀，37 °C孵育15 min，去除DNA模板。

(2)使用MEGAclear试剂盒纯化sgRNA核苷酸链，具体步骤如下：

加115 μl的DEPC水和15 μl醋酸铵终止液，混匀。

加150 μl抽提液（苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1）剧烈震荡，室温静置5 min，4 °C离心15 min，取上清于新管中。

加150 μl氯仿，剧烈震荡，室温静置1 min，4 °C离心10 min，取上清于新管中，加300 μl乙醇，轻轻混匀，-20 °C放置30 min。

4 °C离心10 min，弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两次，晾干。

加30 μl水溶解，-70 °C保存。

二、小菜蛾卵的显微注射

1.显微注射前期实验准备：

(1)使用美国Sutter Instrument公司的P-97拉针仪与日本Narishige公司的EG-401磨针仪制作注射针。

(2)交配的小菜蛾应提前2天放出，以便达到产卵高峰期，产卵时要制造黑暗环境，养虫室内温度维持在26-28 °C。

(3)实验前一天将显微注射实验中用到的玻片镊子剪刀，蒸馏水，注射针进行消毒灭菌。

(4)显微注射前，榨取新鲜甘蓝汁，将玻片浸泡在甘蓝汁中20 min，取出晾干，两个玻片重叠，边缘用封口膜封口，放在产卵的小菜蛾笼中，每隔一个小时收集新鲜的小菜蛾卵。

(5)显微注射前，配制sgRNA/Cas9混合物，sgRNA与Cas9蛋白浓度分别为1500 ng/μl和1000 ng/μl，以至sgRNA与Cas9的终浓度分别为150 ng/μl和300 ng/μl，用灭菌蒸馏水补足至5 μl。

2.显微注射：

(1)取在黑暗环境下产下的小菜蛾卵，将封上封口膜的玻片展开，使用德国Eppendorf公司的FemtoJet 4i 和 InjectMan 4注射系统进行显微注射，注射时伤口尽量小，将伤害降到最低。

(2)将注射后的小菜蛾卵放于温度为26 °C，相对湿度为65%的环境中，等待卵孵化，计算孵化率。

、突变个体的检测与筛选：

(1)共注射DBM1Ac-S品系小菜蛾卵200颗，在G0代注射的小菜蛾卵中有120颗卵孵化，孵化率为66%，在这120个卵中有80个化蛹，提取新鲜蛹蜕的gDNA样品，蛹蜕gDNA提取使用的是KAPA Quick Extract试剂盒(KAPA Biosystems)。

将单个小菜蛾个体的蛹蜕分别收取置于1.5 ml离心管中，加入不锈钢珠，加入30 μl提取液，如表2所示，使用电动研磨仪将样品磨碎。

表2

试剂	体系
		10×KAPA Quick Extract Buffer	3 μl
1 U/μl KAPA Quick Extract Enzyme	0.5 μl
		PCR-grade water	26.5 μl

应用程序（75 °C 10 min；95 °C 5 min；4°C ∞）进行PCR。

所得PCR产物即为小菜蛾蛹蜕gDNA，于-20°C保存备用。

(2)利用特异性引物（正向引物ABCC3-F，如SEQ ID NO. 4所示；反向引物ABCC3-R，如SEQ ID NO. 5所示，具体序列如图1所示）进行PCR反应扩增（表3）sgRNA靶标位点附近序列（图3），将PCR产物直接测序，筛选得到40个杂合突变个体，即G0代的突变率约为59%。

表3

试剂	体系
		10 μM ABCC3-F	2 μl
10 μM ABCC3-R	2 μl
		PrimeSTAR Max Premix (2×)	12.5 μl
gDNA模板	150 ng
		ddH<sub>2</sub>O	至25 μl

(3)将G0代筛选得到的40个突变个体相互杂交，产生G1代，在G1代，得到96个蛹，继续提取新鲜蛹蜕的gDNA样品后，PCR产物直接测序，同时连接北京全式金生物科技有限公司的pEASY-T1克隆载体，转化大肠杆菌，进行TA测序，确定具体突变基因型，如图4所示，G1代杂合突变个体为43个，突变率为45%。

(4)选取G1代测序筛选得到的，数量最多的(n=17)且同时含有5-bp (CATGG)缺失的杂合子小菜蛾个体进行杂交，产生G2代。

(5)G2代小菜蛾化蛹后，提取127个新鲜蛹蜕的gDNA样品后，PCR扩增靶标位点附近序列，将PCR产物直接测序，筛选得到23个纯合突变个体，纯合率约为18%。将这些纯合突变个体进行杂交后产生的G3代即为纯合突变种群，如图5所示。

四、小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白毒力生物测定

(1)使用叶片浸渍法，以原始Bt敏感种群DBM1Ac-S作为阴性对照，将Bt Cry1Ac杀虫蛋白按等比稀释法顺次配制成7个系列浓度（DBM1Ac-S：10 mg/L、5 mg/L、2.5 mg/L、1.25 mg/L、0.625 mg/L、0.3125 mg/L和0.15625 mg/L；ABCC3KO：1200 mg/L、600 mg/L、300 mg/L、150 mg/L、75 mg/L、37.5 mg/L和18.75 mg/L）进行毒力生物测定。

(2)毒力生测结果显示，与DBM1Ac-S种群相比，ABCC3基因纯合突变种群对BtCry1Ac杀虫蛋白的抗性倍数达到了413倍，形成了显著的Cry1Ac抗性表型（表4）。

表4. 小菜蛾种群Bt Cry1Ac杀虫蛋白的毒力生物测定

种群	数量	LC<sub>50 </sub>(95%置信区间)<sup>a</sup>	斜率	卡方（自由度）	相对抗性倍数<sup>b</sup>
						DBM1Ac-S	210	0.74 (0.58-0.95)	2.08 ± 0.25	3.19(5)	1.00
ABCC3KO	210	305.75 (240.12-397.79)	2.11 ± 0.25	1.31(5)	413.18

^aLC₅₀值即为杀死50%小菜蛾幼虫的Cry1Ac杀虫蛋白浓度(mg/L)，若两个种群LC₅₀值的95%置信区间不重叠视为显著性差异；

^b相对抗性倍数=ABCC3KO种群的LC₅₀值/DBM1Ac-S种群的LC₅₀值。

(3)因此，本发明通过CRISPR/Cas9技术，在小菜蛾体内验证了ABCC3可以作为BtCry1Ac杀虫蛋白的功能性受体，其基因突变可以导致小菜蛾对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生高抗性。

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 基于CRISPR/Cas9的小菜蛾ABCC3基因的敲除和应用

<160> 5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<400> 1

GTACTACACGGTGGGCATGGTGG

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<400> 2

GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTACTACACGGTGGGCATGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<400> 3

AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<400> 4

CACGGAATCATCTTACGGTT

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<400> 5

GTAAGTACCAGATTTGCTAA

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas9技术的小菜蛾ABCC3基因的敲除方法。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，设计并合成小菜蛾ABCC3基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以小菜蛾四龄幼虫新鲜蛹蜕的痕量gDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增和直接测序鉴定G0代突变个体，G0代突变个体相互交配获得G1代，直接和TA测序鉴定后选取数量足够且具有相同突变型的杂合子个体进行自交获得G2代，TA测序鉴定得到能稳定遗传的G2代纯合子个体，随后自交获得G3代的ABCC3纯合基因突变型种群。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，sgRNA靶标序列设计在小菜蛾ABCC3基因编码区的第三个外显子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，sgRNA靶标位点的合成引物为：

CRISPR正向引物如SEQ ID NO. 2所示，以及CRISPR反向引物如SEQ ID NO. 3所示。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA终浓度为150 ng/μl，Cas9蛋白的终浓度为300 ng/μl。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，利用正向引物SEQ ID NO. 4和反向引物SEQID NO. 5可以特异性扩增ABCC3基因sgRNA靶标位点附近的gDNA序列。

8.一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的小菜蛾ABCC3基因敲除试剂盒，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示sgRNA靶标序列和Cas9蛋白。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括配套的检测试剂，用于检测所述基因的剪切效果和评估基因敲除效率。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO.3所示序列的引物；以及SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示序列的引物。