CN109680009A - 小菜蛾ABCC2基因敲除的CRISPR/Cas9系统的建立及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非模式昆虫小菜蛾中用于敲除ABCC2基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立及其在Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性机制分子研究中的应用。所述CRISPR/Cas9基因编辑系统主要包括：小菜蛾ABCC2基因特异性sgRNA靶标序列、小菜蛾卵的显微注射方法和突变个体及其基因型的无损检测方法。将构建的可稳定遗传的小菜蛾ABCC2基因纯合突变种群用于Bt Cry1Ac杀虫蛋白毒力生物测定，结果证实小菜蛾ABCC2基因突变可以导致其对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生高抗性。本发明对于小菜蛾Bt Cry1Ac抗性的功能基因筛选、田间抗性水平检测以及田间防治均具有重要的理论和实践意义，应用前景广泛。

Description

小菜蛾ABCC2基因敲除的CRISPR/Cas9系统的建立及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及小菜蛾CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立及应用。

背景技术

小菜蛾Plutella xylostella (L.)，属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，现已成为世界范围内十字花科蔬菜和作物的主要害虫。小菜蛾最早发源于地中海地区，后逐渐传播到热带和亚热带地区，在我国，上世纪70年代以来，小菜蛾的危害也从南方向北方逐渐扩展，其侵害的叶片呈网状，能导致蔬菜作物品质下降、减产、甚至绝收，每年其为害在世界和我国均引起巨大的经济损失。小菜蛾的危害之所以如此严重是因为其极易对杀虫剂产生抗药性，目前小菜蛾已经对50多种杀虫剂产生不同程度的抗药性，抗性谱极广，田间化学防治十分困难。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它能产生多种杀虫蛋白，是世界用量最大的微生物杀虫剂，而且编码的Bt杀虫蛋白基因被克隆转入到了多种重要棉粮作物中，Bt制剂和Bt作物在降低害虫危害和减少化学农药使用等方面发挥了重要的作用。但害虫对于Bt抗药性的上升正严重威胁着Bt制剂和Bt作物的使用。小菜蛾是世界上第一个也是目前唯一的一个被报道在田间对Bt制剂产生抗性的害虫，因而，可以作为害虫Bt抗性分子机制研究的良好材料。鉴定小菜蛾对Bt杀虫蛋白产生抗性的关键基因并阐述小菜蛾对Bt杀虫蛋白产生抗性的分子机制，对于Bt制剂和Bt作物的可持续利用具有重要的理论和实践意义。

ABC转运蛋白(ABC transporter)是一个蛋白超家族，它广泛分布于各种生物中，并在昆虫抗药性中发挥重要作用，以前的报道指出，昆虫ABC转运蛋白有ABCA到H共8个亚家族，其中ABCB、ABCC、ABCG家族基因在昆虫抗药性中存在重要作用。Baxter等在2011年发现ABCC2基因在小菜蛾NO-QA抗性品系中发生缺失突变并可能最终导致其对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生了高抗性。随后，本申请人实验室于2015年证明小菜蛾中的ABCC2基因的表达量下调也与小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白的抗性性状紧密连锁。然而，ABCC2基因在小菜蛾Bt Cry1Ac抗性中发挥的作用需要进一步的实验证据证实。

规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统(CRISPR/Cas9, clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)，组成了一个可以实现精确基因编辑的系统，该系统最初是在细菌和古细菌的天然免疫机制中发现的，可以使细菌和古细菌抵抗外界病毒、噬菌体以及质粒的侵袭。其工作原理是通过人工合成crRNA (CRISPR-derived RNA)与tracrRNA (trans-activating crRNA)两种互补配对的RNA，形成具有引导作用的sgRNA (single guide RNA)，随后sgRNA结合Cas9核酸酶并且指导Cas9切割互补的目标DNA序列，其中Cas9切割的DNA双链不是任意的，它可以识别目标DNA链上的PAM位点，典型的PAM位点的序列为NGG (N为任意碱基)，通过Cas9的切割，形成DNA双链的断裂(Double-strand break, DSB)。Cas9核酸内切酶诱导的DSBs可以通过两种方式修复，一种是非同源末端直接修复(Non-homologous end-joining, NHEJ)，另一种是同源直接修复(Homologous-direct repair, HDR)，NHEJ引起插入或缺失突变，可以破坏目标基因的开放性阅读框(ORF)，从而我们可以实现目标基因的敲除，而我们可以通过HDR的修复方式敲除一段特定的序列或者插入一段我们感兴趣的基因片段，继而实现同源重组。利用CRISPR/Cas9技术在生物体内进行遗传改造使基因功能的研究更加便捷，并且也为我们探索新的以反向遗传学为基础的害虫防治策略提供新思路。

发明内容

本发明针对现有的小菜蛾Bt抗性分子机制验证方法的不足，提供了一种小菜蛾CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立方法及其应用，本发明利用反向遗传学技术CRISPR/Cas9实现小菜蛾体内ABCC2基因的敲除，获得了ABCC2基因的纯合突变系，通过Bt毒素Cry1Ac的生物学测定，检测ABCC2基因突变的小菜蛾个体对Bt Cry1Ac杀虫蛋白的抗性水平，阐述了小菜蛾ABCC2基因与Bt Cry1Ac杀虫蛋白之间的抗性关系。

本发明提供的技术方案是：一种基于CRISPR/Cas9技术的小菜蛾ABCC2基因的敲除方法，该方法利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，设计并合成小菜蛾ABCC2基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位，以小菜蛾四龄幼虫新鲜蛹蜕的痕量gDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增和直接测序鉴定G0代突变个体，G0代突变个体相互交配获得G1代，直接和TA测序鉴定后选取数量足够且具有相同突变型的杂合子个体进行自交获得G2代，TA测序鉴定得到能稳定遗传的G2代纯合子个体，随后自交获得G3代的ABCC2纯合基因突变型种群。

进一步地，所述的方法，sgRNA靶标序列设计在小菜蛾ABCC23基因编码区的第三个外显子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；sgRNA靶标位点的合成引物为：CRISPR正向引物如SEQ ID NO. 2所示，以及CRISPR反向引物如SEQ ID NO. 3所示。

所述的方法，所述sgRNA终浓度为150 ng/μl，Cas9蛋白的终浓度为300 ng/μl。

所述的方法，进一步地，利用正向引物SEQ ID NO. 4和反向引物SEQ ID NO. 5可以特异性扩增ABCC2基因sgRNA靶标位点附近的gDNA序列。

同时，本发明还提供一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的小菜蛾ABCC2基因敲除试剂盒，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示sgRNA靶标序列和Cas9蛋白。

所述的试剂盒，进一步包括配套的检测试剂，用于检测所述基因的剪切效果和评估基因敲除效率。

所述的试剂盒，进一步包括SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示序列的引物；以及SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示序列的引物。

本发明提供了一种小菜蛾CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立方法，对于其他非模式生物（尤其农业昆虫）基因编辑体系的建立具有很好的借鉴价值。

本发明对于基因功能的深入发掘与体内功能验证奠定良好的基础，在小菜蛾中，对于抗性基因的功能验证提供技术支撑，同时，对于新的害虫防治策略的产生提供新思路，为田间昆虫Bt抗性治理和使用反向遗传学手段防治田间害虫提供理论和实践基础。

与现有的其他基因操作技术相比，本发明中构建的CRISPR/Cas9技术具有以下优点：与RNA干扰（RNAi）技术相比，CRISPR/Cas9技术并非仅仅是在转录水平降低靶标基因的表达，而是从基因水平阻断靶标基因的表达，且纯合突变性状可稳定遗传；与同为基因编辑技术的锌指核酸内切酶(Zinc finger nucleases, ZFNs)和转录激活因子类效应核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs)技术相比，CRISPR/Cas9技术操作简单，省时省力，基因编辑效率高。这对于小菜蛾基因功能的研究和新型的高效安全的害虫防治策略具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1是位于靶标位点附近的一段305-bp的脱氧核苷酸序列，其中斜体加下划线的序列为扩增时使用的引物，分别是正向引物(ABCC2-F)和反向引物(ABCC2-R)，箭头标明了上下游引物的方向。

图2为sgRNA设计图，图中按比例标注了小菜蛾ABCC2基因的基因组结构，sgRNA设计在ABCC2基因的第三个外显子区域，虚线内的序列代表sgRNA靶标序列的核心片段，下划线标注的是PAM位点，黑色倒三角形代表Cas9切割位点；

图3是小菜蛾前胚盘期卵收集与显微注射图片，A为24×50 mm的小菜蛾卵收集玻片的一部分；B为卵后极部位的显微注射图；C为显微注射针。

图4是小菜蛾蛹蜕的图片。

图5是以蛹蜕的gDNA为模板扩增的305-bp的DNA片段。

图6是G1代小菜蛾个体的突变基因型，星号为最终获得的纯合突变个体基因型，下划线标注的序列为靶标序列核心区域，黑色倒三角是Cas9切割位点。

图7从上到下依次是野生型个体（DBM1Ac-S敏感种群）、杂合子个体以及最终获得的4-bp缺失的（ABCC2KO种群）纯合子突变个体的测序峰图，黑色下划线代表纯合突变种群所缺失的4-bp碱基序列，箭头所指的位置为基因编辑开始的位点。

具体实施方式

一、小菜蛾ABCC2基因sgRNA靶标序列的设计与合成

1.利用Cas-Designer软件(http://www.rgenome.net/cas-designer/)在小菜蛾ABCC2基因第三个外显子设计sgRNA靶标序列（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示），如图2所示，并搜索小菜蛾DBM-DB基因组数据库(http://59.79.254.1/DBM/index.php)以及CRISPR脱靶效应检测Cas-OFFinder软件(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)，检测潜在的脱靶位点。

2.在sgRNA核心位点GCTGTGCAACTTCCTGGCCA前加上T7启动子序列，在sgRNA核心位点后加上与crRNA/tracrRNA互补的序列，组成sgRNA的完整5′端DNA片段。

3.将一段80-bp的crRNA/tracrRNA序列与步骤2中的sgRNA 5′端DNA片段经过PCR变性、退火、延伸合成完整的sgRNA脱氧核苷酸链，采用的试剂如表1所示，采用的引物如SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。

CRISPR正向引物(C2-CRI-F)：

5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCTGTGCAACTTCCTGGCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′；

CRISPR反向引物(CRI-R)：5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3′。

(1)sgRNA合成：使用TaKaRa公司的 PrimeSTAR Max Premix聚合酶，进行50 μl体系的无模板PCR反应，具体为：

表1

试剂	体系
		ddH<sub>2</sub>O	21 μl
10 μM CRISPR-F	2 μl
		10 μM CRISPR-R	2 μl
PrimeSTAR Max Premix (2×)	25 μl

(2)PCR反应条件为：98 °C 2 min；38个循环 (98 °C 10 s, 70 °C 5 s, 72 °C 30s)；72 °C 10 min；4 °C ∞。

(3)应用北京康为世纪生物科技有限公司的DNA clean-up试剂盒对上述PCR产物进行纯化，具体步骤如下：

100 μl PCR产物，加入500 μl Buffer PB，充分混匀。

向平衡柱中加入500 μl Buffer PS，13000 rpm离心1 min，倒掉废液。

将所得溶液装入吸附柱中，室温静置1 min，13000 rpm离心1 min，倒掉废液。

向吸附柱中加入500 μl Buffer PW，13000 rpm离心1 min，倒掉废液。

空管离心1 min，倒掉废液，彻底晾干。

将吸附柱放入新的离心管中，在吸附膜中间位置悬空滴加30 μl Buffer EB，室温静置1 min，收集DNA溶液，-20 °C保存。

将步骤3中得到的sgRNA脱氧核苷酸链体外反转录合成sgRNA核苷酸序列。

(1)sgRNA体外转录：利用Ambion公司的MEGAshortscript T7 High YieldTranscription试剂盒进行体外反转录，按照下表加入相应试剂：

表2

试剂	体系
		10×T7 Reaction Buffer	2 μl
DNA template	1 μg
		10mM ATP	2 μl
10mM CTP	2 μl
		10mM GTP	2 μl
10mM UTP	2 μl
		T7 Enzyme Mix	2 μl
Nuclease-free Water	至20 μl

轻轻混合反应试剂，37°C孵育4 h。

加入1 μl TURBO DNase，混匀，37 °C孵育15 min，去除DNA模板。

(2)使用MEGAclear试剂盒纯化sgRNA核苷酸链，具体步骤如下：

加115 μl的DEPC水和15 μl醋酸铵终止液，混匀。

加150 μl抽提液（苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1）剧烈震荡，室温静置5 min，4 °C离心15 min，取上清于新管中。

加150 μl氯仿，剧烈震荡，室温静置1 min，4 °C离心10 min，取上清于新管中，加300 μl乙醇，轻轻混匀，-20 °C放置30 min。

4 °C离心10 min，弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两次，晾干。

加30 μl水溶解，-70 °C保存。

二、小菜蛾卵的显微注射

1.显微注射前期实验准备：

(1)使用美国Sutter Instrument公司的P-97拉针仪与日本Narishige公司的EG-401磨针仪制作注射针。

(2)交配的小菜蛾应提前2天放出，以便达到产卵高峰期，产卵时要制造黑暗环境，养虫室内温度维持在26-28 °C。

(3)实验前一天将显微注射实验中用到的玻片镊子剪刀，蒸馏水，注射针进行消毒灭菌。

(4)显微注射前，榨取新鲜甘蓝汁，将玻片浸泡在甘蓝汁中20 min，取出晾干，两个玻片重叠，边缘用封口膜封口，放在产卵的小菜蛾笼中，每隔一个小时收集新鲜的小菜蛾卵。

(5)显微注射前，配制sgRNA/Cas9混合物，sgRNA与Cas9蛋白浓度分别为1500 ng/μl和1000 ng/μl，以至sgRNA与Cas9的终浓度分别为150 ng/μl和300 ng/μl，用灭菌蒸馏水补足至5 μl。

2.显微注射：

(1)取在黑暗环境下产下的小菜蛾卵，将封上封口膜的玻片展开，使用德国Eppendorf公司的FemtoJet 4i 和 InjectMan 4注射系统进行显微注射，注射时伤口尽量小，将伤害降到最低，如图3所示。

(2)将注射后的小菜蛾卵放于温度为26 °C，相对湿度为65%的环境中，等待卵孵化，计算孵化率。

、突变个体的检测与筛选

(1)共注射DBM1Ac-S品系小菜蛾卵215颗，在G0代注射的小菜蛾卵中有140颗卵孵化，孵化率为65%，在这140个卵中有80个化蛹，提取新鲜蛹蜕（图4）的gDNA样品，蛹蜕gDNA提取使用的是KAPA Quick Extract试剂盒(KAPA Biosystems)。

将单个小菜蛾个体的蛹蜕分别收取置于1.5 ml离心管中，加入不锈钢珠，加入30 μl提取液，如表3所示，使用电动研磨仪将样品磨碎。

表3

试剂	体系
		10×KAPA Quick Extract Buffer	3 μl
1 U/μl KAPA Quick Extract Enzyme	0.5 μl
		PCR-grade water	26.5 μl

按照程序（75 °C 10 min；95 °C 5 min；4 °C ∞）进行PCR。

所得PCR产物即为小菜蛾蛹蜕gDNA，于-20 °C保存备用

(2)利用特异性引物（正向引物ABCC2-F，如SEQ ID NO. 4所示；反向引物ABCC2-R，如SEQ ID NO. 5所示，具体序列如图1所示）进行PCR反应扩增（表4）sgRNA靶标位点附近序列（图5），将PCR产物直接测序，筛选得到52个杂合突变个体，即G0代的突变率约为65%。

表4

试剂	体系
		10 μM ABCC2-F	2 μl
10 μM ABCC2-R	2 μl
		PrimeSTAR Max Premix (2×)	12.5 μl
gDNA模板	150 ng
		ddH<sub>2</sub>O	至25 μl

(3)将G0代筛选得到的52个突变个体相互杂交，产生G1代，在G1代，得到111个蛹，继续提取新鲜蛹蜕的gDNA样品后，PCR产物直接测序，同时连接北京全式金生物科技有限公司的pEASY-T1克隆载体，转化大肠杆菌，进行TA测序，确定具体突变基因型，如图6所示，G1代杂合突变个体为50个，突变率为45%。

(4)转化大肠杆菌：将表5中5 μl连接产物加到50 μl大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30 min；42 °C水浴锅中热击1 min，迅速置于冰上2 min；向管中加入150 μl LB液体培养基（不含卡那霉素），37 °C培养箱振荡1 h；将上述菌液取100 μl涂布于含卡那霉素的筛选平板上，37 °C培养12 h。

表5

试剂	体系
		T1载体	0.5 μl
PCR产物	1 μl
		ddH<sub>2</sub>O	3.5 μl

(5)选取G1代测序筛选得到的，数量最多的(n=16)且同时含有4-bp (GGCC)缺失的杂合子小菜蛾个体进行杂交，产生G2代。

(6)G2代小菜蛾化蛹后，提取119个新鲜蛹蜕的gDNA样品后，PCR扩增靶标位点附近序列，将PCR产物直接测序，筛选得到19个纯合突变个体，纯合率约为16%。将这些纯合突变个体进行杂交后产生的G3代即为纯合突变种群，如图7所示。

四、小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白毒力生物测定

(1)使用叶片浸渍法，以原始Bt敏感种群DBM1Ac-S作为阴性对照，将Bt Cry1Ac杀虫蛋白按等比稀释法顺次配制成7个系列浓度（DBM1Ac-S：10 mg/L、5 mg/L、2.5 mg/L、1.25 mg/L、0.625 mg/L、0.3125 mg/L和0.15625 mg/L；ABCC2KO：1200 mg/L、600 mg/L、300 mg/L、150 mg/L、75 mg/L、37.5 mg/L和18.75 mg/L）进行毒力生物测定。

(2)毒力生测结果显示，与DBM1Ac-S种群相比，ABCC2基因纯合突变种群ABCC2KO对Bt Cry1Ac杀虫蛋白的抗性倍数达到了724倍，形成了显著的Cry1Ac抗性表型（表6）。

表6. 小菜蛾种群Bt Cry1Ac杀虫蛋白的毒力生物测定

种群	数量	LC<sub>50 </sub>(95%置信区间)<sup>a</sup>	斜率	卡方（自由度）	相对抗性倍数<sup>b</sup>
						DBM1Ac-S	210	0.74 (0.58-0.95)	2.08 ± 0.25	3.19(5)	1.00
ABCC2KO	210	535.49 (409.59-749.18)	1.98 ± 0.28	0.99(5)	723.64

^aLC₅₀值即为杀死50%小菜蛾幼虫的Cry1Ac杀虫蛋白浓度(mg/L)，若两个种群LC₅₀值的95%置信区间不重叠视为显著性差异；

^b相对抗性倍数=ABCC2KO种群的LC₅₀值/DBM1Ac-S种群的LC₅₀值。

因此，本发明通过CRISPR/Cas9技术，在小菜蛾体内验证了ABCC2可以作为BtCry1Ac杀虫蛋白的功能性受体，其基因突变可以导致小菜蛾对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生高抗性。

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 小菜蛾ABCC2基因敲除的CRISPR/Cas9系统的建立及应用

<160> 5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<400> 1

GCTGTGCAACTTCCTGGCCAtgg

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<400> 2

GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCTGTGCAACTTCCTGGCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<400> 3

AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<400> 4

TTGTTGATCAAACTTGCCCTAC

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<400> 5

CTTCCGATACACATACCTTA

Claims (10)

1.一种基于CRISPR/Cas9技术的小菜蛾ABCC2基因的敲除方法。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，设计并合成小菜蛾ABCC2基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以小菜蛾四龄幼虫新鲜蛹蜕的痕量gDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增和直接测序鉴定G0代突变个体，G0代突变个体相互交配获得G1代，直接和TA测序鉴定后选取数量足够且具有相同突变型的杂合子个体进行自交获得G2代，TA测序鉴定得到能稳定遗传的G2代纯合子个体，随后自交获得G3代的ABCC2纯合基因突变型种群。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA靶标序列设计在小菜蛾ABCC2基因编码区的第三个外显子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，sgRNA靶标位点的合成引物为：

CRISPR正向引物如SEQ ID NO. 2所示，以及CRISPR反向引物如SEQ ID NO. 3所示。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA终浓度为150 ng/μl，Cas9蛋白的终浓度为300 ng/μl。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，利用正向引物SEQ ID NO. 4和反向引物SEQID NO. 5可以特异性扩增ABCC2基因sgRNA靶标位点附近的gDNA序列。

8.一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的小菜蛾ABCC3基因敲除试剂盒，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示sgRNA靶标序列和Cas9蛋白。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括配套的检测试剂，用于检测所述基因的剪切效果和评估基因敲除效率。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO.3所示序列的引物；以及SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示序列的引物。