ES2764134T3 - Sistema de control de plagas - Google Patents
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Abstract
Una célula bacteriana transfectada o transformada genéticamente en la que dicha bacteria es un simbionte intestinal de un insecto que pertenece al orden Thysanoptera, caracterizada porque dicha célula bacteriana se transforma o se transfecta con ácido nucleico para expresar dsARN contra al menos una parte del gen de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento del insecto.
Description
DESCRIPCIÓN
Sistema de control de plagas
Campo de la invención
La invención se refiere a una célula bacteriana transfectada o transformada genéticamente que es un simbionte intestinal de un insecto que pertenece al orden Thysanoptera, en la que dicha célula se transforma para expresar ARN de cadena doble (dsARN) activo contra al menos un gen de insecto seleccionado; un vector para transformar o transfectar dicha célula bacteriana; un insecto que incluye dicha célula bacteriana transformada y un procedimiento de control de plagas que emplea el uso de dicha célula bacteriana y/o dicho insecto.
Antecedentes de la invención
Los invertebrados y otras plagas son vectores comunes para los organismos patógenos, típicamente microorganismos que son responsables de diversas enfermedades que pueden afectar los cultivos.
En los últimos 30 años, insectos como el tisanóptaro occidental de las flores (WFT), Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera: Thripidae), se han convertido en una de las plagas agrícolas más importantes a nivel mundial. La condición de plaga se puede atribuir a diversos factores, entre ellos el potencial reproductivo, la capacidad de invasión (endémica en el oeste de América del Norte, ha invadido muchos países de Europa, África y Asia), la variedad de cultivos huéspedes, la capacidad de transmitir virus de plantas y la resistencia a insecticidas. Todos estos factores están interrelacionados, y están vinculados con el ciclo vital y la estrategia de la historia de vida de la especie. Es una plaga importante de los cultivos de invernadero y de campo y de los frutos rojos en Europa, y de alimentos básicos como frijoles, caupís y cacahuetes en África y Asia, y esto puede tener efectos devastadores para los seres humanos y los animales que dependen de esos cultivos para su alimentación.
El daño directo a los cultivos se debe tanto a la alimentación como al daño de las plantas por oviposición. Los tisanóptaros también transmiten varios tospovirus diferentes, incluidos el virus de la mancha anular del cacahuete (GRSV) y el virus del bronceado del tomate (TSWV), y se ha calculado que el TSWV solo provoca más de mil millones de dólares en pérdidas por año. Más de 1,000 especies de plantas en 84 familias son susceptibles al TSWV, lo que le proporciona uno de los intervalos de hospedadores más amplios entre los patógenos vegetales.
En consecuencia, existe un interés continuo para desarrollar procedimientos de control dirigidos a la reducción o la erradicación de la incidencia de las plagas agrícolas anteriores. Esto se suele lograr ya sea mediante el direccionamiento al propio patógeno (GRSV/TSWV) o al vector (WFT) asociado comúnmente a la transmisión. Los procedimientos para controlar las infestaciones y la infección por insectos típicamente se han encontrado en forma de; barreras físicas que impiden la transmisión; composiciones químicas, tales como insecticidas, fármacos químicos y repelentes; y también controles biológicos.
Los avances recientes en genética han permitido comprender mejor el desarrollo de una amplia gama de organismos y allanado el camino para las nuevas vías de control biológico de plagas. El estudio de la función génica de los insectos constituye una etapa crucial para comprender la fisiología, el comportamiento, la inmunología e incluso la transmisión de enfermedades en este grupo de organismos tan diverso y exitoso. Gracias a este conocimiento es posible desarrollar formas para luchar contra los daños a los cultivos y desarrollar estrategias para controlar las poblaciones de insectos plaga.
La interferencia de ARN (iARN) es una técnica poderosa de regulación por disminución específica de secuencia de la expresión génica para interrogar la función génica eucariota basándose en un gen individual.
La iARN es una forma de silenciamiento génico postranscripcional, en la que un ARNm específico de un gen particular se destruye o se bloquea, lo que impide la traducción y la formación de un producto génico activo. La iARN se produce naturalmente dentro de las células vivas para modular la actividad génica, y también es importante en la defensa contra los parásitos y la infección viral. Por ejemplo, cuando una célula se inyecta con ARN en una forma de cadena doble (cd), una proteína llamada Dicer (o ARNsa III) escinde las moléculas de dsARN en fragmentos cortos de ARN (20-25 nucleótidos), denominados ARN interferente pequeño (ARNip) debido a su capacidad de interferir con la expresión de un gen específico. Estas moléculas de ARNip se desenrollan para formar ARN de cadena simple (cs), después de lo cual la denominada cadena guía se incorpora en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). A menudo, esta cadena guía formará pares de bases con una secuencia complementaria de ARNm en la célula que induce su escisión por el componente catalítico del complejo RISC. El ARNm no se traduce y no se produce ninguna proteína funcional, y por lo tanto los efectos del gen que codifica el ARNm específico son “silenciados”. Este procedimiento se denomina iARN autónomo celular, en el que el silenciamiento génico se limita a la célula en la cual
se introduce el dsARN. Alternativamente, el iARN ambiental y sistémico son las dos formas de iARN autónomo no celular, en los que el efecto de interferencia se produce en células/tejidos diferentes del lugar donde se introdujo/produjo el dsARN. En este caso, el dsARN es absorbido por múltiples células (iARN ambiental tal como en las infecciones virales), o la señal de silenciamiento se transporta desde la célula en la cual el dsARN se aplica o se expresa a otras células donde se observa el efecto (iARN sistémico).
Al sintetizar artificialmente el dsARN (o las moléculas de ARNip) con una secuencia conocida complementaria de un gen de interés, e introducirlo en las células diana, es posible comprender la función de un gen específico mediante la observación de las consecuencias de su pérdida de actividad. El iARN y otras denominadas técnicas de genética inversa están revolucionando las ciencias biológicas, con aplicaciones en genómica, biotecnología y medicina.
El iARN en los invertebrados es una tecnología establecida, en la que se administra dsARN más comúnmente mediante inyección. Sin embargo, este procedimiento suele tener tasas de mortalidad altas debido al traumatismo por la inyección y la anestesia, y también requiere cantidades altas de muestras. Los insectos grandes también requieren la síntesis de cantidades costosas de dsARN. Además, como se estableció, esto produce silenciamiento génico autónomo celular que logra efectos de iARN transitorios y, por lo tanto, no se puede aplicar para el control de las plagas de insectos en el campo. Como resultado, para el control de plagas de insectos eficaz, se requiere iARN autónomo no celular, que se ha demostrado que se logra mediante la alimentación de insectos con una fuente biológica tal como bacterias modificadas genéticamente o material vegetal. Por lo tanto, esto comienza con la absorción de dsARN de manera ambiental en el lumen intestinal del insecto, desde donde se extiende a tejidos de otras partes (iARN sistémico). El logro del iARN depende de un procedimiento confiable de administración, o absorción, de una copia de dsARN de parte de un gen diana al insecto. Para algunas especies de insectos esto se ha logrado mediante la inclusión en su alimentación de células de E. coli vivas o muertas que expresan dsARN. Las bacterias se digieren en el intestino y el dsARN es absorbido y se administra sistémicamente a diferentes tejidos, en los que puede mediar el iARN transitorio. El documento EP2374462A2 establece que el iARN se puede introducir mediante la ingesta de: dsARN desnudo, alimentos contaminados con E. coli que expresan dsARN, por ejemplo, mediante la pulverización con bacterias transformadas, o material vegetal modificado genéticamente que expresa dsARN. El documento WO2011017137A2 establece un procedimiento a través del cual un cebo alimenticio del insecto se contamina con bacterias modificadas genéticamente que expresan dsARN y el cebo se devuelve a una colonia para su alimentación por los insectos. Además, el documento WO2011025860A1 presenta el uso de iARN contra insectos que se alimentan con plantas, en los que las bacterias que infectan plantas específicas están modificadas genéticamente para expresar un dsARN específico. de manera similar, el documento WO2011036536A2 presenta dianas de genes de iARN específicos que son silenciadas por la administración de dsARN mediante la pulverización de bacterias muertas en las plantas de cultivo.
Sin embargo, muchas de las técnicas desarrolladas actualmente suelen ser poco prácticas o tienen poca eficacia y no están dirigidas a organismos que provocan un daño específico al ambiente. Por ejemplo, la contaminación de fuentes de alimentos (plantas u otros) con bacterias modificadas genéticamente puede ser perjudicial para otros insectos que pueden ser alimentadores ocasionales. Además, la pulverización de composiciones químicas que contienen dsARN desnudo sobre insectos o su fuente de alimentación también puede tener consecuencias en otros organismos no plagas. Lo que es más importante, todos los procedimientos existentes solo presentan procedimientos de administración mediante los cuales se observan efectos de silenciamiento génico transitorios. Muchas de las técnicas empleadas actualmente solo presentan duraciones de silenciamiento cortas, que a menudo son demasiado transitorias para determinadas dianas, por ejemplo, aquellas para estudios hormonales y del desarrollo. Por lo tanto, a menudo se requiere la reaplicación de dsARN (u otras construcciones de iARN), lo cual es costoso y requiere mucho tiempo. Además, como las técnicas empleadas actualmente no son transferibles, ha resultado difícil demostrar el control eficaz de plagas. Por lo tanto, la tecnología en su estado actual es inadecuada para muchas especies de insectos y se necesita una eficacia y procedimientos de aplicación mejorados.
Por lo tanto, hemos desarrollado una nueva técnica de iARN eficaz contra los insectos pertenecientes al Orden Thysanoptera que se basa en la síntesis in vivo de dsARN por bacterias intestinales simbióticas transgénicas de una especie que reside naturalmente en el insecto. Además, desarrollamos una nueva técnica de iARN que destruye los insectos en la etapa de larva y adulta, pero particularmente la etapa de larva, por lo tanto, de manera conveniente, antes de que se produzca la reproducción de plagas de insectos y la alimentación y antes de la transmisión de patógenos de plantas entre las plantas individuales.
Declaraciones de la invención
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona, por lo tanto, una célula bacteriana transfectada o transformada genéticamente, en la que dicha bacteria es un simbionte intestinal de un insecto que pertenece al orden Thysanoptera, caracterizada porque dicha célula bacteriana se transforma para expresar dsARN contra al menos una parte del gen de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento del insecto.
En una realización preferida de la invención, dicha célula bacteriana se transforma para expresar dsARN contra al menos una parte del gen de la cadena alfa 1 de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento 1 alfa del insecto.
La referencia en la presente al gen de cadena de tubulina alfa 1 es al gen que tiene el número de acceso GT305545 (GenBank; NCBI), y la referencia en la presente al gen del factor de alargamiento 1 alfa es al gen que tiene el número de acceso GT303726 (GenBank; NCBI).
En una realización preferida de la invención, dicho dsARN comprende una cadena de ARN que comparte un 50 % de complementariedad con al menos una parte de dicho gen de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento. Preferentemente, dicho dsARN comprende una cadena de ARN que comparte al menos el 75 % de complementariedad con al menos uno de dichos genes de dicho insecto y, en orden creciente de preferencia, al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de complementariedad con al menos uno de dicho gen diana de dicho insecto.
Más idealmente aún, dicho dsARN activo contra dicho gen de cadena de tubulina alfa 1 o dicho gen del factor de alargamiento 1 alfa del insecto es complementario a al menos una parte de la estructura de la secuencia que se muestra en la figura 13 o 14, respectivamente. Preferentemente, dicho dsARN comprende una cadena de ARN que comparte al menos el 75 % de complementariedad con al menos una parte de la estructura de la secuencia que se muestra en la figura 13 o 14 y, en orden creciente de preferencia, al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de complementariedad con al menos una parte de la estructura de la secuencia que se muestra en la figura 13 o 14.
De manera más ideal, dicha bacteria se refiere al género Pantoea, que es un simbionte intestinal de dicho insecto, idealmente, dicha bacteria es BFo2, con una secuencia de genoma que tiene el número de acceso SAGS00000000 (GenBank, NCBI). Alternativamente, dicha bacteria pertenece al género Erwinia, que es un simbionte intestinal de dicho insecto, idealmente, dicha bacteria es BFo1, con una secuencia de genoma que tiene el número de acceso LAGP00000000 (GenBank, NCBI).
Más preferentemente, dicho insecto es un miembro de la Familia Thripidae. Más preferentemente aún, dicho insecto pertenece al género Frankliniella, tal como la especie Frankliniella occidentalis.
En otra realización preferida adicional de la invención, se proporciona un vector de expresión para transformar o transfectar dicha célula bacteriana en el que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que expresa dsARN contra al menos una parte de dicho gen de tubulina o al menos una parte de dicho gen de factor de alargamiento del insecto.
En una realización preferida de la invención, dicho vector de expresión expresa dsARN contra al menos una parte del gen de la cadena alfa 1 de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento 1 alfa del insecto.
Más preferentemente aún, dicho vector de expresión para transformar o transfectar dicha célula bacteriana comprende al menos un promotor constitutivo, por ejemplo, Ptac. Más preferentemente aún, múltiples, tal como un par, de dichos promotores se proporcionan y están configurados para accionar la transcripción de manera convergente para garantizar la transcripción de ambas cadenas complementarias de ácido nucleico que expresan dicho dsARN. Más preferentemente aún, dicho vector de expresión para transformar o transfectar dicha célula bacteriana está configurado como se muestra en la figura 1, es decir, configurado según el vector Pex-A. Más idealmente aún, dicho vector de expresión para transformar o transfectar dicha célula bacteriana es pTub3 o pElong1. De manera conveniente, pTub3 o pElong1 comprenden secuencias de ácido nucleico que son plantillas para la síntesis de dsARN que están flanqueadas por promotores de Ptac convergentes para garantizar la transcripción constitutiva de dos cadenas de ARN complementarias, las cuales se hibridan para generar el ARN de cadena doble deseado.
En una realización preferida de la invención, dicha célula bacteriana se transforma o modifica genéticamente de modo tal que el ADN recombinante se integra de manera estable en el genoma de la célula huésped. Esto garantiza de manera conveniente el silenciamiento del gen diana a largo plazo y garantiza la expansión en las poblaciones de insectos. Idealmente, la integración estable se logra mediante integración específica del sitio, típicamente después del uso de sitios de integración específicos del sitio convencionales. Preferentemente, la integración específica del sitio se logra en el gen de la ARNsa III.
Los expertos en la materia sabrán que dicho insecto causa una enfermedad en las plantas, típicamente por la transmisión del organismo patógeno que pertenece a los tospovirus, incluyendo el virus de mancha de maní o el virus de la marchitez de tomate.
El trabajo de la invención es particularmente eficaz porque el insecto realiza transferencia intestinal horizontal, es decir, la adquisición de bacterias de flora intestinal mediante la ingesta de una fuente ambiental. Por lo tanto, el trabajo de la invención es particularmente eficaz porque dicha transferencia intestinal horizontal se logra mediante la ingesta de heces o excremento de otros insectos. Más idealmente aún, la ingesta de heces o excremento es específica del género, y se cree que es específica de la especie, por lo tanto, la generación progenitora de una especie transfiere el simbionte intestinal modificado genéticamente a una generación de descendientes. De este modo, dicho insecto puede adquirir dicha célula bacteriana transfectada o transformada de heces o excremento contaminado en el ambiente, lo que evita la necesidad del manejo de insectos y la mortalidad asociada. Además, de manera conveniente, esto permite la transferencia horizontal de dsARN que media iARN a lo largo de al menos una colonia de insectos y, típicamente, muchas colonias de insectos.
Además, o alternativamente a la integración específica del sitio mencionada anteriormente, en otra modalidad preferida de la invención, dicha célula bacteriana transfectada o transformada también se modifica genéticamente de modo que no produzca proteínas que degraden el ARN funcional, incluidas, entre otras, la ARNsa III. de manera conveniente, esto reduce el riesgo de la degradación enzimática de dicho dsARN codificado por la célula bacteriana transformada. Idealmente, esto se logra mediante la eliminación de la totalidad o parte del gen de la ARNsa III nativo e, idealmente, su reemplazo por un gen resistente a antibióticos, por ejemplo, un gen de resistencia a la apramicina.
De manera conveniente, el direccionamiento del gen de cadena de tubulina alfa 1 o el gen del factor de alargamiento 1 alfa produce una mortalidad temprana de dicho insecto. De este modo, se reduce la capacidad del insecto de transmitir un microorganismo patógeno y se limita el daño al follaje debido a la alimentación o la puesta de huevos. En la práctica, el insecto adquiere la célula bacteriana de simbionte intestinal transfectada o transformada genéticamente por dsARN del ambiente mediante ingesta. Dicha célula bacteriana de este modo se establece como una población viva en el intestino del insecto, en la que la misma divide y transcribe activamente el dsARN que codifica. de manera conveniente, esto, por lo tanto, media el iARN en el insecto indefinidamente. El dsARN se direcciona idealmente contra el gen de cadena de tubulina alfa 1 o el factor de alargamiento 1 alfa, lo que produce su modulación y, más específicamente, su regulación por disminución. Dada la importancia de estos genes, el insecto resulta afectado adecuadamente y, por lo tanto, muere.
Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un insecto perteneciente al Orden Thysanoptera, caracterizado porque dicho insecto comprende una célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada en la que dicha bacteria es un simbionte intestinal de dicho insecto y se transforma para expresar dsARN contra al menos una parte del gen de cadena de tubulina alfa 1 o al menos una parte del gen del factor de alargamiento 1 alfa del insecto.
En una realización preferida de la invención, dicha bacteria se transforma o se transfecta para expresar dsARN contra al menos una parte del gen de la cadena alfa 1 de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento 1 alfa del insecto.
Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona el uso de la célula bacteriana descrita anteriormente en un procedimiento para modular la expresión de un gen diana de un insecto perteneciente al Orden Thysanoptera que comprende:
contaminar una composición que va a ser ingerida por el insecto con dicha célula bacteriana;
después de lo cual la ingesta de dicha célula bacteriana por dicho insecto produce que dicha célula bacteriana colonice el intestino de dicho insecto, en el que sintetiza dsARN contra al menos una parte del gen de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento para modular dicha expresión del gen del insecto.
En un uso preferido de dicha invención, dicha célula bacteriana se transforma o transfecta para expresar dsARN contra al menos una parte del gen de la cadena alfa 1 de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento 1 alfa del insecto.
En una realización preferida de la invención, dicha composición comprende una fuente de alimento para el insecto. Más preferentemente aún, dicha composición son las heces o el excremento de dicho insecto, o una fuente de alimentación del insecto joven, tal como, entre otras, una fuente de planta.
En una realización preferida adicional del tercer aspecto de la invención, la modulación de dicha expresión génica diana mata a dicho insecto, idealmente en la etapa larval y, por lo tanto, es un procedimiento eficaz de control o eliminación de plagas.
En las reivindicaciones a continuación y en la descripción anterior de la invención, salvo donde el contexto requiera lo
contrario debido al lenguaje expreso o una implicación necesaria, la palabra “comprende”, o variaciones tales como “comprenden” o “que comprende” se usa en un sentido inclusivo, es decir, para especificar la presencia de las características indicadas, pero no para excluir la presencia o adición de características adicionales en diversas realizaciones de la invención.
Las características preferidas de cada aspecto de la invención pueden ser como se describió con relación a cualquiera de los otros aspectos.
Otras características de la presente invención serán evidentes a partir de los ejemplos a continuación. En términos generales, la invención se extiende a cualquier característica novedosa, o cualquier combinación novedosa, de las características presentadas en la presente memoria descriptiva (incluidas las reivindicaciones y los dibujos adjuntos). Por lo tanto, los elementos, los números enteros, las características, los compuestos o los restos químicos descritos junto con un aspecto, modalidad o ejemplo específico de la invención se deben entender como aplicables a cualquier otro aspecto, modalidad o ejemplo descrito en la presente, a menos que sean incompatibles.
Además, a menos que se especifique lo contrario, cualquier característica descrita en la presente se puede reemplazar por una característica alternativa que tenga el mismo propósito o uno similar.
La invención se describirá únicamente a modo de ejemplo con respecto a las siguientes figuras, en las que:-Figura 1 muestra la configuración de un casete de tisanóptaros. Los promotores convergentes están indicados con rojo. Cabe señalar que los promotores Ptac no contienen una secuencia operadora, por lo tanto, no están sujetos a la represión de Lacl.
Figura 2: muestra un mapa vectorial de Pex-A (Eurofins, http://www.operon.com/products/genesynthesis/ListOfVectors.aspx).
Figura 3: muestra un mapa del casete de tisanóptaros pEX-A.
Figura 4: muestra mapas de plásmidos de pElong1 y pTub3. Las flechas rojas indican promotores Ptac y la sección azul indica la posición de la secuencia de la plantilla de dsARN.
Figura 5: muestra mapas de plásmidos de pRN1 y pRN2. El gen de ARNsa III se muestra en verde. Los recuadros celestes indican los terminadores de transcripción T4 y la flecha negra indica la posición del gen de resistencia a la apramicina.
Figura 6: muestra la expresión de tubulina relativa en F. occidentalis normalizada al control endógeno (18S ARN). Las barras representan la abundancia de transcripciones relativa media de tubulina en insectos jóvenes 48 horas después de la alimentación con bacterias (BFo2) que expresan agarosa de cadena doble (control) y tubulina de cadena doble (tubulina KD). Las barras representan la abundancia de transcripciones media, las barras de error representan la desviación estándar alrededor de la media. El eje Y representa la abundancia de transcripciones de tubulina relativa normalizada a 18S ARN. Cada panel representa un experimento separado que usa un grupo de aproximadamente 22 insectos de F. occidentalis por tratamiento.
Figura 7: muestra el panel superior: Composición de poblaciones de F. occindentalis después de 4 días de exposición oral a cepas de BFo2 modificadas que expresan dsARN de control o Tubulinacd, muestra un fenotipo de mortalidad significativa en las etapas de larva y adulta expuestas a Tubulinacd. Datos recogidos de 7 experimentos independientes; cantidad de insectos alimentados = 234 (control), 150 (muertos por calor [HK] Tubulinacd), 220 (Tubulinacd). Nota: las etapas de pre-pupa y pupa de los tisanóptaros son sin alimentación. Se observó un fenotipo de mortalidad de inactivación de tubulina altamente significativo entre las larvas de tisanóptaros, y específicamente en la primera (L1) etapa de larva. También se observó una mortalidad baja, pero significativa entre las F. occidentalis adultas. Las BFo2 muertas por calor (HK) que expresan Tubulinacd no provocaron el fenotipo de mortalidad, lo que resalta la importancia de la reintroducción de bacterias que expresan dsARN vivas en contraposición con simplemente dsARN previamente sintetizado. Panel inferior: Experimentos adicionales que identifican que la 1era etapa de larva es la más susceptible al fenotipo de mortalidad. Datos recogidos de 4 experimentos independientes; cantidad de insectos alimentados = 134 (control), 95 (TubulinacdHK) y 81 (Tubulinacd).
Figura 8: muestra el daño de la hoja en plántulas de pepino provocado por F. occidentalis con y sin iARN administrado por simbionte. Los grupos de plántulas de pepino se expusieron a larvas de WFT y adultos que habían sido infectados oralmente con bacterias (BFo2) que expresan ARN de Agarasacd (control) o ARN de Tubulinacd (Tubulina KD). Se produjo un daño significativamente inferior en las plantas expuestas a F. occidentalis que recibieron la inactivación de Tubulinacd en comparación con los controles.
Figura 9: muestra la estructura de la secuencia del vector de pEX-A (2450 pb).
Figura 10: muestra la estructura de la secuencia de la secuencia del promotor Ptac.
Figura 11: muestra la estructura de la secuencia del casete de tisanóptaros (138 pb, construcción sintética, secuencia Ptac subrayada).
Figura 12: muestra la estructura de la secuencia del casete de tisanóptaros pEX-A (2588pb).
Figura 13: muestra la estructura de la secuencia del gen de la cadena de tubulina alfa 1.
Figura 14: muestra la estructura de la secuencia del gen del factor de alargamiento 1 alfa.
Figura 15: muestra la estructura de la secuencia del plásmido de pTub3 (2898 pb).
Figura 16: muestra la estructura de la secuencia del plásmido de pElong1 (2982).
Figura 17: muestra la estructura de la secuencia de BFo2 de ARNsa III (amplificada por RCP).
Figura 18: muestra la estructura de la secuencia del plásmido de ARNp1.
Figura 19: muestra la estructura de la secuencia del plásmido de ARNp2.
Ejemplo 1
El procedimiento comprende establecer iARN mediado por simbionte como un medio nuevo, sólido y manejable para el silenciamiento génico prolongado sistémico, la supresión o la inactivación en WFT, lo que proporciona una herramienta de investigación vital para complementar el proyecto de secuenciación del genoma de WFT en curso (https://www.hgsc.bcm.edu/western-flower-thrips-genome-project) y una potencial estrategia de biocontrol novedosa. Los WFT contienen dos especies de bacterias intestinales, una que pertenece al género Erwinia, llamada BFo1, y la segunda se relaciona con el género Pantoea, llamada BFo2, que también puede crecer fuera del insecto huésped. Las bacterias presentes en el intestino de los tisanóptaros se transmiten a la progenie a través de las hojas que los adultos y las larvas comen y sobre las que defecan. En las larvas de segundo estadio, todos los tisanóptaros se infectan con la bacteria y hay hasta 105 células bacterianas presentes por cada tisanóptaro. Las bacterias alcanzan poblaciones altas en las larvas, se pueden cultivar en placas y son manejables para la manipulación genética. Los genomas de BFo1 y BFo2 se han secuenciado. El control de la transcripción es similar al de la E. coli.
La síntesis de dsARN estable depende de (i) la inactivación de ARNsa III bacteriana, y (ii) la integración del casete de expresión de dsARN en el genoma bacteriano. Esto se logra mediante la modificación genética del casete de expresión en un plásmido adecuado y la eliminación del gen de BFo2 de la ARNsa III. Se aíslan recombinantes en los cuales el gen de la ARNsa III nativo se elimina y se reemplaza por un gen de resistencia a la apramicina. Se introducen plásmidos que expresan dsARN (optimizados para iARN) para dirigirse a los siguientes genes de WFT: cadena de tubulina alfa 1 (número de acceso GT305545; GenBank, NCBI); o factor de alargamiento 1 alfa (número de acceso GT303726; GenBank, NCBI). La inactivación de cualquiera de los dos genes diana deshabilita gravemente a las larvas e indica que la tecnología es eficaz contra los WFT. La síntesis de dsARN estable para cada casete se determina para cada cepa bacteriana recombinante por Q-RTRCP.
Las infecciones experimentales se realizaron en diferentes etapas de desarrollo de los WFT al alimentarlos con ARN recombinante que expresa las cepas de Erwinia TAC, resuspendidas en una mezcla de alimentación artificial. Los tisanóptaros se alimentaron por membrana con esta mezcla como la única fuente de alimentación durante 2-4 días. Se incluyó tinta en la mezcla para identificar de manera no invasiva los WFT que se habían alimentado. Se confirmó el crecimiento bacteriano y la viabilidad en la mezcla de alimentación en el comienzo y el final de cada experimento mediante el cultivo en medios selectivos. El contenido del intestino de los WFT también se cultivó en medios selectivos para verificar la viabilidad y la población de bacterias de BFo2 recombinantes ingeridas. La retención de las características simbióticas de las bacterias se evaluó siguiendo el desarrollo de los WFT en los insectos repoblados que expresan Agarasacd (control negativo) y Tubulinacd, la correlación de estas mediciones con la presencia de bacterias recombinantes en el intestino y mediante Q-RTRCP de ARNm de tubulina presente en las preparaciones de ARN de los insectos.
Los insectos poblados con cepas de BFo2 que expresan dsARN dirigidos a los genes de tubulina se compararon con
los insectos poblados con las bacterias que expresan dsARN de control negativo. Se determinaron los datos de mortalidad de los insectos en cada caso. Estos datos se correlacionaron con los ensayos de Q-RTRCP para medir la abundancia de ARNm de los genes diana respectivos.
Esta nueva estrategia de iARN puede prevenir la infección de plantas por tospovirus (matando insectos juveniles antes de que puedan volar, atacando los genes de la competencia vectorial del insecto, por ejemplo, codificando una proteína de unión para el virus [Kikkert M., Meurs C., van de Wetering F., Dormüller S., Peters D., Kormelink R., Goldbach R., 1998. Phytopathology 88: 63-69.]y/o la expresión de genes virales), y proporciona una plataforma para diseñar una estrategia efectiva de protección de cultivos usando las bacterias recombinantes como bioplaguicidas.
Las bacterias típicamente expresan una enzima, ARNsa lll, que degrada específicamente dsARN. De hecho, hemos establecido que el dsARN es inestable después de que se expresa en BFo2. Para eludir este problema, hemos diseñado una cepa mutante de BFo2, en la cual el gen codificante de la ARNsa III se altera, y que expresa de manera estable el dsARN.
Materiales y procedimiento
Cepas bacterianas y medios
Los procedimientos de clonación se realizaron en E. coli JM109. La alteración del gen de la ARNsa III se realizó en una BFo2 que contiene pIJ790 para permitir la recombinación mediada por rojo Lambda (Gust B, Challis GL, Fowler K, Kieser T, Chater KF (2003) Proc Natl Acad Sci, Estados Unidos, 18 de febrero; 100(4):1541-6.)). El cultivo de cepas de E. coli fue como se recomendó en Sambrook y Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-0-87969-577-4). Se cultivó BFo2 a 30 °C en cultivo líquido (LB, con agitación) y en la superficie de placas de agar L. La identidad del mutante de alteración de la ARNsa III fue confirmada por RCP.
Sistema de expresión de dsARN
Construcción del vector de expresión para accionar la expresión constitutiva de ARN de cadena doble en BFo2.
Se usó un casete de expresión sintética de 138 pb (Eurofins), que contenía varios sitios de restricción flanqueados por dos copias del promotor constitutivo modificado Ptac. Se diseñaron las secuencias promotoras para accionar la transcripción de manera convergente (figura 1), para garantizar la transcripción de ambas cadenas complementarias de fragmentos de ADN subclonados en el sitio Mc . El casete de expresión sintético se clonó entre los sitios NotI del plásmido resistente a la ampicilina pEX-A (Eurofins, La figura 2), lo que genera el casete del plásmido tisanóptaros pEX-A.
Para ayudar a predecir los genes de F. occidentalis usados como candidatos diana para la interferencia mediada por ARN bicatenario, se usó Deqor (Henschel y col., 2004, Nucleic Acids Research, 32(problema del servidor web):W113-20). Las secuencias consideradas como candidatas adecuados se obtuvieron mediante síntesis (Eurofins), flanqueadas por sitios Xbal. Estos fragmentos de ADN se proporcionaron como insertos clonados en los vectores pEX-A o RCP2 (Tabla 2).
Los fragmentos de ADN a usar como plantillas para la síntesis de dsARN se subclonaron en el sitio Xbal del casete pEX-A-tisanóptaros y, por lo tanto, se flanquearon mediante promotores Ptac convergentes para asegurar la transcripción constitutiva de dos cadenas de a Rn complementarias que se hibridarían para generar el ARN bicatenario deseado. Los plásmidos resultantes fueron pElong1 y pTub3. Estas construcciones se verificaron mediante restricción y secuenciación de ADN (La figura 4).
Generación de un mutante de alteración de BFo2.
El gen de ARNsa III se amplificó por RCP a partir de BFo2 de tipo salvaje usando los cebadores RIIIBfo2F1 y RIIIBfo2R1 (Tabla 1). El producto (759 pb de longitud) se digirió con EcoRI/HindIII y se ligó en pIJ2925 previamente digerido con el plásmido de ARNp1 generador de EcoRI/HindIII. La alteración de esta copia del gen de la ARNsa III se logró mediante digestión de EcoRV de ARNp1 e inserción del gen de resistencia a la apramicina (flanqueado por terminadores de transcripción T4) extirpado del plásmido pQM5062 mediante digestión de restricción de Hindlll y extremo romo usando ADN polimerasa T4 en presencia de dNTP 1 mM, lo que dio lugar a la ARNp2 (La figura 5). Para facilitar la transformación mediada por rojo lambda, se crearon células BFo2 electrocompetentes, como se recomienda para la E. coli (Sambrook y Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-0-87969-577-4) y se las transformó por electroporación con el plásmido pIJ790 (Gust B, Challis GL, Fowler K, Kieser T, Chater KF (2003) Proc Natl Acad Sci, Estados Unidos, 18 de
febrero;100(4):1541-6.)). - Creación de la cepa BFo2/pIJ790. El gen alterado de la ARNsa III se extirpó del ARNp2 mediante digestión de BglII y después se introdujo purificación en gel en BFo2/pIJ790 electrocompetentes mediante electroporación. Se seleccionaron transformantes de cruzamiento doble mediante colocación en placas de réplica en medios selectivos que contenían ampicilina o apramicina. Se evaluaron colonias viables para detectar la presencia de la alteración por rCp de colonias usando los cebadores BFo2RNasetestF y BFo2RNasetestR. Todos los plásmidos se confirmaron mediante digestión de restricción y secuenciación.
Evaluación de la funcionalidad del sistema de expresión de dsARN
Se sedimentaron cultivos nocturnos de BFo2 que contenían los plásmidos de expresión de dsARN mediante centrifugado (13.000 X g durante 10 min) y se mezclaron con volúmenes iguales de RNAprotect (Qiagen). Se aisló el ARN total usando el kit de aislamiento de ARN RNeasy mini (Qiagen). Se digirió el ADN genómico usando el tratamiento ADNsa I en columna durante 45 minutos a temperatura ambiente. La transcripción inversa específica de la cadena se realizó en 1 ug de ARN total usando el kit de transcripción inversa iscript select (Biorad) que incluye el potenciador del cebador específico del gen (GSP) y uno de los siguientes pares de cebadores específicos del gen: tubulina - TubFoF1 y TubFoR1, factor de alargamiento - EFFoF1 y EFFoR1, (secuencias mostradas en la Tabla 3). Los ADNc se diluyeron 1/3 en agua libre de nucleasas (proveedor). Se realizó amplificación en tiempo real específica de cadena por triplicado usando Sybr-Green Supermix (Biorad) y los dos cebadores específicos de genes enumerados en la Tabla 1. No se usaron controles de plantilla (NTC, transcripción no inversa) para evaluar el grado de arrastre de ADN genómico.
Infección de tisanóptaros con cepas de BFo2
Se sedimentaron cultivos nocturnos de BFo2 que contenían los plásmidos de expresión de dsARN mediante centrifugado (3.000 X g durante 2 min) y se lavaron mediante resuspensión en caldo Luria, después se resuspendieron a 5x106/ml en una mezcla de alimentación artificial (20 % (v/v) de caldo Luria, 2,4 % (p/v) de sucrosa, 0,32 % (p/v) de NaCl y 0,03 % (p/v) de azul de metileno). Las Franliniella occidentalis de todas las etapas de desarrollo se alimentaron por membrana con esta mezcla como la única fuente de alimentación durante 2 a 4 días desde un depósito de un frasco Bijou invertido, cubierto con Parafilm estirado. Se incluyó azul de metileno para identificar de manera no invasiva los WFT que se habían alimentado (el color azul en el intestino resultó visible a través de la cutícula del insecto bajo un aumento de baja potencia en los WFT anestesiados por CO2). Se confirmó el crecimiento bacteriano y la viabilidad en la mezcla de alimentación en el comienzo y el final de cada experimento mediante el cultivo en agar LB complementado con 1,5 % (p/v) de sucrosa y el antibiótico selectivo adecuado (apramicina para BFo2 que expresa Agarasacd; apramicina y ampicilina para BFo2 que expresa Tubulinacd). El contenido del intestino teñido de WFT seleccionados aleatoriamente, esterilizados en la superficie también se cultivó en medios selectivos para verificar la viabilidad y la población de cepas de BFo2 ingeridas. Se prepararon controles adicionales usando cultivos nocturnos de BFo2 que expresan Tubulinacd, que se sometieron a muerte por calor mediante incubación a 65 °C durante 20 min antes de la incorporación en las mezclas de alimentación como se describió anteriormente.
Eficacia del iARN en los insectos infectados
Se tomaron muestras de los tisanóptaros juveniles (1er y 2d° estadio) 48 horas después de la infección con BFo2 recombinante, se extrajo el ARN y se cuantificaron los niveles de ARNm de tubulina alfa1 (La figura 6). Se aisló el ARN total de los grupos de aproximadamente 22 insectos jóvenes usando el kit ZR Tissue and insect RNA microprep kit (Zymo Research). Se realizó el tratamiento de ADNsa en columna a temperatura ambiente usando ADNsa libre de ARNsas (Qiagen). Para cada aislamiento, se realizó la transcripción inversa de 500 ng de ARN usando el kit de síntesis Iscript Select y cebadores oligodT (BioRad). Se realizaron Q RT-RCP por triplicado usando Sybr Green Supermix (BioRad). Se realizaron diluciones en serie de ADNc agrupado por duplicado y se usaron para generar curvas estándar y para evaluar la eficacia de la reacción de q RT RCP. Se calculó la abundancia de transcripciones relativa de tubulina alfa mediante la normalización a 18S. Todos los cebadores de Q RT RCP se enumeran en la Tabla 3.
Mortalidad de los insectos infectados
Las poblaciones de Frankliniella occidentalis se criaron en plantas de crisantemo y frijoles ad libitum del 70 % al 80 % de humedad relativa, de 26 a 27 °C, con un ciclo de luz:oscuridad de 14:10 horas respectivamente. Poblaciones de WFT de muestra que contenían todas las etapas de desarrollo de F. occidentalis se infectaron oralmente con BFo2 recombinante que expresaba ARN de Agarosacd (control) y Tubulinacd, y se monitorearon para detectar un fenotipo de inactivación después de 4 días. Se incluyó un control adicional que comprendía alimentar BFo2 muertas por calor que expresaban Tubulinacd.
Protección de plantas
Los grupos de tres plántulas de pepino de 15 días se expusieron a 50 larvas y 15 adultas jóvenes de F. occidentalis que habían sido infectadas oralmente con BFo2 que expresaban ARN de Agarasacd (control) o ARN de Tubulinacd (Tubulina KD). Después de 5 días, se evaluó el porcentaje de la superficie de la hoja que estaba cubierta con lesiones mediante el software de análisis de imagen Assess 2.0 para la cuantificación de enfermedades (Lamari, Sociedad Fitopatológica Amer; 2008; http://www.apsnet.org/press/assess); (la figura 5).
Tabla 1: Cepas y plásmidos.
Tabla 2: dianas de genes usadas para generar fragmentos de ADN sintético para usar como plantilla para la síntesis de dsARN.
Tabla 3. Oligonucleótidos usados para RCP y Q RT-RCP.
Claims (25)
1. Una célula bacteriana transfectada o transformada genéticamente en la que dicha bacteria es un simbionte intestinal de un insecto que pertenece al orden Thysanoptera, caracterizada porque dicha célula bacteriana se transforma o se transfecta con ácido nucleico para expresar dsARN contra al menos una parte del gen de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento del insecto.
2. La célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada según la reivindicación 1, en el que dicho dsARN es contra al menos una parte del gen de cadena de tubulina alfa 1 o al menos una parte del factor de alargamiento 1 alfa del insecto.
3. La célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicho dsARN comprende una cadena de ARN que comparte 50 % de complementariedad con al menos uno de dichos genes.
4. La célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada según la reivindicación 3, en la que dicho dsARN comprende una cadena de ARN que comparte al menos el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de complementariedad con al menos uno de dichos genes.
5. La célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada según la reivindicación 3 o 4, en la que dicho dsARN activo contra dicho gen de tubulina o dicho gen del factor de alargamiento del insecto es complementario al menos a una parte de la estructura de secuencia mostrada en la figura 13 o 14.
6. La célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada según la reivindicación 3 o 4, en la que el dsARN comprende una cadena de ARN que comparte al menos el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o 99 % de complementariedad con una parte de la estructura de secuencia que se muestra en la figura 13 o 14.
7. La célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho insecto pertenece a la familia Thripidae.
8. La célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada según la reivindicación 7, en la que dicho insecto pertenece al género. Frankliniella.
9. La célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada según la reivindicación 8, en la que dicho insecto pertenece a la especie Frankliniella occidentalis.
10. La célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha bacteria es un simbionte intestinal del género Pantoea; o un simbionte intestinal de la especie Erwinia.
11. La célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada según la reivindicación 10, en la que dicha bacteria es la bacteria F. occidentalis 2 (BFo2) o la bacteria F. occidentalis 1 (BFo1).
12. Un insecto perteneciente al Orden Thysanoptera caracterizado porque dicho insecto comprende una célula bacteriana genéticamente transformada o transfectada en la que dicha bacteria es un simbionte intestinal de dicho insecto y se transforma para expresar dsARN contra al menos una parte del gen de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento del insecto.
13. El insecto según la reivindicación 12, en el que dicho dsARN es contra al menos una parte del gen de cadena de tubulina alfa 1 o al menos una parte del factor de alargamiento 1 alfa del insecto.
14. El uso de la célula bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en un procedimiento para modular la expresión de un gen diana de un insecto que pertenece al orden Thysanoptera que comprende: contaminar una composición que va a ser ingerida por el insecto con dicha célula bacteriana;
después de lo cual la ingesta de dicha célula bacteriana por dicho insecto produce que dicha célula bacteriana colonice el intestino de dicho insecto, en el que sintetiza dsARN contra al menos una parte del gen de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento para modular dicha expresión del gen del insecto.
15. El uso según la reivindicación 14, en el que dicho dsARN es contra al menos una parte del gen de cadena de tubulina alfa 1 o al menos una parte del factor de alargamiento 1 alfa del insecto.
16. Un procedimiento para modular la expresión de un gen diana de un insecto que pertenece al orden Thysanoptera que comprende:
contaminar una composición que va a ser ingerida por el insecto con una célula bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 1-11;
después de lo cual la ingesta de dicha célula bacteriana por dicho insecto produce que dicha célula bacteriana colonice el intestino de dicho insecto, en el que sintetiza dsARN contra al menos una parte del gen de tubulina o al menos una parte del gen del factor de alargamiento para modular dicha expresión del gen del insecto.
17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho dsARN es contra al menos una parte del gen de cadena de tubulina alfa 1 o al menos una parte del factor de alargamiento 1 alfa del insecto.
18. El procedimiento según la reivindicación 16 o 17, en el que dicha célula bacteriana se transforma o modifica genéticamente de modo que el ADN recombinante se integra de manera estable en el genoma de la célula huésped.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho ácido nucleico o ADN recombinante se integra de manera estable en el gen de la ARNsa III.
20. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que dicha modulación de la expresión de un gen diana causa la muerte del insecto.
21. El procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicha muerte ocurre en la etapa larval.
22. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, en el que dicha modulación de la expresión de un gen diana evita la transmisión de un organismo patógeno.
23. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicho organismo patógeno es un tospovirus.
24. El uso según las reivindicaciones 14 a 15 o un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicha composición comprende una fuente de alimento para el insecto.
25. El uso según las reivindicaciones 14 a 15 o un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicha composición comprende una planta, heces o excremento.
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