CN107873052A - 用于害虫控制管理的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

公开了能够通过昆虫性传播、可用于控制害虫群体的遗传修饰裸病毒。所述遗传修饰裸病毒能够导致目标昆虫群体不育。还公开了用所公开的遗传修饰裸病毒感染的昆虫、制备所述遗传修饰裸病毒的方法以及使用所述遗传修饰裸病毒控制昆虫害虫群体的方法。

Description

用于害虫控制管理的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年5月14日提交、标题为“Mutant Nudivirus and Method forUsing Same for Insect Control”的美国临时申请序列号62/161,674的权益和优先权，所述临时申请的内容整体并入本文用于所有目的。

关于联邦政府资助研究的声明

本发明是在政府的支持下根据国家科学基金会(National Science Foundation)的1338775进行的。政府对本发明拥有某些权利。

背景

昆虫害虫在全世界造成作物损害，导致粮食和纤维作物受到重大损失，并增加了为了实现控制此类害虫的生产成本。例如，在美国，鳞翅目蛾的实夜蛾亚科(Heliothine)复合体每年造成超过2B美元的损失和控制成本。虽然所有作物易受类似的害虫压力，但是苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素的转基因表达被开发来控制鳞翅目害虫并且已变成用于控制这些害虫和其他昆虫害虫的主要工具。自从1996年商业引入Bt作物，其已在世界各地被采用，并且已在全球种植超过十亿英亩。在美国，81％的玉米和84％的棉花表达一种或多种Bt毒素。(http://www.ers.usda.gov/data-products/adoption-of-genetically-engineered-crops-in-the-us/recent-trends-in-ge-adoption.aspx，2015年报道。)遗憾的是，由于昆虫适应杀虫剂的显著能力，预测到对Bt毒素的抗性并且野外进化抗性和功效降低的报道也在增加。这种抗性是对美国和其他地方中的重要Bt作物的可持续性的一种威胁。因此，持续需要开发控制昆虫害虫的新方法。例如，谷实夜蛾(Helicoverpa zea)(H.zea，常称为玉米穗虫)是美国中实夜蛾亚科复合体中的主要多食性蛾害虫并且每年对玉米和棉花植物造成数百万美元的损害。

蛾的实夜蛾亚科复合体中的多种害虫，尤其H.zea、棉铃虫(H.armigera)和烟芽夜蛾(Heliothis virescens)是高度多食性的并且对许多作物造成经济上的显著损害。通常由H.zea损害的作物包括棉花、玉米、大豆、向日葵、番茄、高粱、草莓、辣椒、豆类、茄子、秋葵、菜豆、粟、黄瓜、甜瓜、莴苣、花椰菜和卷心菜。因为H.zea攻击多种多样的植物，并且在许多情况下正在发展对Bt作物的抗性，所以农民严重依赖杀虫剂来控制这种昆虫害虫。

诸如田地、水果和蔬菜作物中的害虫管理需要是本领域的一个需要，所述需要只有在Bt抗性扩大时才会变得更加关键。此外，需要不涉及使用诸如有机作物耕作制中的常规杀虫剂或转基因技术的害虫管理。本发明满足了本领域中的一个或多个前述需要。

简述

公开了能够通过昆虫性传播、可用于控制害虫群体的遗传修饰裸病毒(nudiviruse)。所述遗传修饰裸病毒能够导致目标昆虫群体不育。还公开了用所公开的遗传修饰裸病毒感染的昆虫、制备所述遗传修饰裸病毒的方法以及使用所述遗传修饰裸病毒控制昆虫害虫群体的方法。

附图简述

图1.裸病毒基因组的示意图，其示出已知参与或涉及不育化突变的基因。

图2.无性腺雌性F1子代的百分比。在羽化的当天将野生型(WT)HzNV-2和通过化学诱变产生的突变体HzNV-2(KS-3、KS-38、KS-39、KS-45、KS-51和KS-52)注射到成年雌性蛾中，并且在产卵第2天(OviD2)和第3天(OviD3)收集卵。将雌性F1子代饲养到成年蛾，并且评价其指示无性腺病理学的病毒塞(viral plug)的存在(OviD2-WT n＝17、KS-3 n＝24、KS-38 n＝23、KS-39 n＝26、KS-45 n＝19、KS-51 n＝14、KS-52 n＝18；OviD3-WT n＝15、KS-3n＝16、KS-38 n＝22、KS-39 n＝16、KS-45 n＝19、KS-51 n＝18、KS-52 n＝23)。

图3.完全不育在无性腺雌性F1子代中的发生率。在羽化的当天将野生型(WT)HzNV-2和突变体HzNV-2(KS-3、KS-38、KS-39、KS-45、KS-51和KS-52)注射到成年雌性蛾中，并且在产卵第2天(OviD2)和第3天(OviD3)收集后代卵。将雌性F1子代饲养到成年蛾，并且对其评价产生存活卵的能力。不能产卵或不能产存活卵指示完全不育(OviD2-WT n＝17、KS-3 n＝24、KS-38 n＝23、KS-39 n＝26、KS-45 n＝19、KS-51 n＝14、KS-52 n＝18；OviD3-WT n＝15、KS-3 n＝16、KS-38 n＝22、KS-39 n＝16、KS-45 n＝19、KS-51 n＝18，、KS-52 n＝23)。这说明这些突变体HzNV-2导致产卵量降低和不育。

图4.病毒滴度对H.zea产卵量的影响。对雌性成年蛾(7)注射分离自细胞培养物的100μl wt HzNV-2(高剂量:4x10⁴pfu/ml；低剂量:40pfu/ml)或yfp重组HzNV-2(高剂量：1x10⁷pfu/ml；低剂量：1x10⁴pfu/ml)，并且使所述雌性成年蛾与未感染的雌性蛾(9)交配。在产卵第2-5天收集卵并且对其计数。使未感染的雌性与未感染的雄性交配以作为对照。

图5.对昆虫幼虫的直接接种导致大量无性腺蛾。将野生型(WT)HzNV-2和突变体KS3在Sf9昆虫细胞培养物中扩增并且通过胰岛素注射器注射到三龄幼虫中。通过预灭菌的针将来自无性腺雌性蛾的病毒塞的WT HzNV-2和突变体yfp HzNV-2病毒用于感染三龄幼虫。在两种感染类型之后，将幼虫饲养到成年蛾，并且检查雌性是否存在病毒塞即病毒感染和无性腺病理学的指示物(注射器，WT n＝20、KS3 n＝25；针，WT n＝20、yfp HzNV-2 n＝21)。

图6.示出yfp HzNV-2为pag1突变体的PCR结果的1.5％琼脂糖凝胶。在PCR反应中使用野生型(WT)HzNV-2(对照)和yfp HzNV-2病毒DNA以及用于同源重组以制备yfp HzNV-2病毒的质粒yfp-pUC57(对照)作为DNA模板。当存在时，使用yfp引物扩增黄色荧光蛋白基因(547bp)；使用pag1引物扩增pag1DNA；使用ORF78引物扩增DNA来自HzNV-2的假定基因ORF78(403bp)。

详细描述

如本文和在所附权利要求书中所使用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“所述(the)”包括复数对象，除非上下文另外清楚地规定。因此，例如，提及“一种方法”包括复数种此类方法并且提及“一种剂量”包括提及一种或多种剂量及其为本领域技术人员所知的等效物等。

术语“约”或“近似”意指由本领域普通技术人员测定的具体值处于可接受的误差范围内，这将部分取决于所述值的测量或测定方式，例如，测量系统的限制性。例如，“约”可以意指本领域内每次操作在1个标准偏差以内，或多于1个标准偏差。可替代地，“约”可意指给定值的至多20％、或至多10％、或至多5％或至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或方法，所述术语可意谓在值的一个数量级以内，优选在5倍以内，且更优选在2倍以内。当特定值在申请和权利要求书中描述时，除非另外规定，否则应假定术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。

如本文关于术语昆虫和/或蛾使用的术语“紧密相关的”意指物种紧密相关以便支持HzNV-2病毒的复制。

术语“表达(express)”和“表达(expression)”意指使得或引起基因或DNA序列中的信息显示出，例如通过激活涉及对应基因或DNA序列的转录和翻译的细胞功能产生蛋白质。DNA序列在细胞中或由细胞表达以形成诸如蛋白质的“表达产物”。表达产物本身，例如所得的蛋白质也可以说是“表达的”。表达产物可以表征为细胞内的、细胞外的或分泌的。术语“细胞内的”意指在细胞内部的物质。术语“细胞外的”意指在细胞外部的物质。如果物质在细胞外部、从细胞上的某处或在细胞内部以显著量度显现，则所述物质是由细胞“分泌”的。

术语“基因”(也称为“结构基因”)意指编码编码或对应于构成一种或多种蛋白质或酶的全部或部分的氨基酸的特定序列的DNA序列，并且可以或可以不包括内含子和调控DNA序列，诸如影响例如基因表达的条件的启动子序列、5'未翻译区或3'未翻译区。一些非结构基因的基因可以从DNA转录成RNA，但不能翻译成氨基酸序列。其他基因可以作为结构基因的调节子或作为DNA转录的调节子。

“遗传修饰的”意指从天然状态进行改变的基因。如本文所用的术语“遗传修饰的”包括含有多于一种生物体的遗传物质的序列(例如病毒)。所述术语还包括从天然状态例如通过缺失或插入进行修饰并且不包括来自多于一种生物体的遗传物质的序列。后者可以称之为如本文所用的“突变体”。

本公开满足了如上所述的本领域中的一个或多个需要。在一方面，本公开满足了对用于在由昆虫害虫威胁的作物中控制此类害虫的新方法的全球重要需要。在另一方面，本公开解决了日益重要的问题，即威胁抗昆虫转基因作物的可持续性的Bt抗性。

已知性传播昆虫病毒谷实夜蛾裸病毒2(HzNV-2，登录号NC_004156.)导致大约33％的感染的H.zea不育。(Raina 1995)。然而，野生型(WT)HzNV-2由于高比例的无症状携带者蛾而不是潜在的生物控制剂。申请人已发现可以修饰HzNV-2使得极高百分比例如高达100％或大于约90％的感染的H.zea变得不育。因此，突变体HzNV-2可以是通过导致目标昆虫群体崩溃来控制各种昆虫害虫的重要工具。继而，这种修饰的病毒可用于感染目标昆虫，并且在不使用传统杀虫剂的情况下控制昆虫群体，或者，可与传统杀虫剂组合使用，使得所使用的杀虫剂的量最小化。这种技术在控制Bt抗性昆虫群体和传统杀虫剂无效的侵入性昆虫群体方面可能具有特定效用。申请人的方法通过释放用可通过在目标农田区中交配传播的性传播病毒感染的昆虫实现害虫控制。申请人开发的方法对于转基因和/或非转基因作物都是有效的，并且能够靶向病毒在其中复制并被性传播的害虫物种。

通过遗传操纵作物来控制昆虫群体的尝试目前由于昆虫快速发展对遗传添加毒素的抗性而受限，并且进一步受限于生产者使用此类修饰作物的成本。例如，二十年前引进表达苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素的作物来控制毛虫害虫。此后，所述作物在全球被采用、种植超过十亿英亩，并且成为自20世纪中期的“绿色革命”以来最成功和最迅速采用的农业技术之一(James，2012)。截止2015年，在美国，81％的玉米和84％的棉花表达一种或多种Bt毒素。然而，Bt技术的广泛采用具有重大的风险，即过度使用将不可避免地导致昆虫对Bt毒素的抗性和作物歉收的发展，这威胁到技术的持续生存(Carriere等人，2010；Tabashnik等人，2013；Tabashnik等人，2009)。这种风险一直被监管机构、行业和研究人员所认可，已通过抗性监测和使用庇护区(refuge)策略延迟抗性来管理。已经由美国的EPA要求(在其他国家具有类似的要求)的这些庇护区策略需要在附近种植非转基因植物以维护易感昆虫群体(EPA，1998；Huang等人，2011)。遗憾的是，这种做法由于生产者的成本而并不总是被遵循，并且由于昆虫进化杀虫剂抗性的显著能力而不总是有效的。据报道，昆虫对Bt植物的抗性日益增加，并且一些昆虫表现出具有遗传支配性的抗性特征(Campagne等人，2013)。总之，Bt抗性昆虫对于Bt作物的持续功效以及美国和全世界的食品和纤维生产而言是持续和日益重要的威胁。

一种昆虫害虫威胁的Bt作物是玉米穗虫，谷实夜蛾，一种鳞翅目蛾。例如，H.zea发现于整个北美洲，在北美洲它是第二大费成本的作物害虫(Fitt，1989)，并且也发现于中美洲、加勒比和南美洲。H.zea靠许多不同的植物为生，并且具有若干种常用命(例如，玉米穗虫、棉花蚜虫、柿铃虫)，具有Bt毒素抗性比易感昆虫大1000倍的株系(Ali和Luttrell，2007；Ali等人，2006)。

申请人开发了一种抑制昆虫害虫群体的新方法。在另一方面，申请人开发了一种管理Bt抗性的新方法，所述方法依赖于对使感染的昆虫不育(包括完全或部分不育)的性传播昆虫病毒进行工程化或诱变。可以将含有突变体病毒的昆虫释放于在H.zea群体中存在Bt抗性的区域中，从而抑制这些目标群体并保留Bt转基因植物和/或非转基因植物的效用。类似地，易感有害昆虫在全世界通常是侵入性的，并且所公开的方法可以用于减少和消除侵入性昆虫害虫群体。由申请人开发的病毒是感染H.zea的天然存在的(即野生型)病毒谷实夜蛾裸病毒2(HzNV-2)的突变形式和重组形式。HzNV-2是唯一已显示出是性传播的并且导致雄性和雌性不育的鳞翅目昆虫病毒。在一方面，感染的昆虫可以具有部分不育性，所述部分不育性定义为雌性H.zea蛾由于对其生殖器官的损害而每天产少于30个存活卵的情况。在一方面，感染的昆虫可以具有完全不育性，所述完全不育性定义为雌性蛾由于对其生殖器官的损害而不能产存活卵的情况。

在一方面，公开了野生型裸病毒的遗传修饰裸病毒。本文涵盖的遗传修饰裸病毒通常能够通过昆虫性传播并且能够在用包含遗传突变的所述裸病毒感染昆虫之后导致大于约50％、或约50％至约100％、或约80％至约95％或约90％至约100％的比率的所述昆虫不育。

在一方面，野生型裸病毒与谷实夜蛾裸病毒2(HzNV-2)病毒具有至少约80％序列同一性。野生型裸病毒可以特征在于：其具有潜伏期；与谷实夜蛾裸病毒2(HzNV-2，也称之为玉米夜蛾(Heliothis zea)裸病毒或性腺特异性病毒)病毒具有约80％或更大的序列同一性；并且能够在一种或多种蛾中复制。

在一方面，遗传修饰裸病毒可含有所述野生型裸病毒的潜伏期的破坏。

在一方面，昆虫可以是夜蛾科中的鳞翅目蛾，其支持HzNV-2病毒在生殖组织中复制以足以导致50％或更大比率的不育。昆虫可选自谷实夜蛾(H.zea)、棉铃虫、烟青虫(H.assulta)、烟芽夜蛾、小地老虎(Agrotis ipsilon)、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exiguae)、紧密相关蛾、夜蛾或其组合。

在一方面，遗传修饰可以是选自持久性相关基因(pag1)(其编码PAT1，或持久性相关转录物(SEQ ID NO：7)、ORF 90(SEQ ID NO：4)、ORF92(SEQ ID NO：5)、ORF 2(SEQ ID NO：3)或其组合的一个或多个基因中的突变，使得修饰足以破坏此类基因中的一个或多个的表达，例如，其中所述破坏减少表达或者是功能性敲除。在一方面，遗传修饰可以是持久性相关基因(pag1)中的足以破坏pag1基因表达的突变。在一方面，遗传修饰可以是PAT1基因(SEQ ID NO：7)中的突变，所述PAT1基因是持久性相关转录物并且已显示出涉及HzNV-1潜伏性感染的建立。在一方面，遗传修饰可以是选自以下各项的一种或多种序列中的突变：dr1(atgaagctgaggatgaatctgaac，SEQ ID NO：14)、dr2(gaaactcctaaatcaaaggatgaacctaaagcaaag，SEQ ID NO：15)、dr3(atgaaaaagcaaaggctgaggcgaaggctaaagccgatgctgctgcaaaagccaaagctg，SEQ ID NO：16)、dr4(ttataccagagagcaagccagaaa，SEQ ID NO：17)、dr5(acctaaagttgaatctaaagtagtggaaccacctaaagcggaatctaaaacagtggaagctcctactaaaacagttgaagt，SEQ ID NO：18)、dr6(agctgccgctaaacgcaaagccgaggctga，SEQ ID NO：19)或其组合。在一方面，遗传修饰可以是dr3(SEQ ID NO：16)中的突变，例如在175,550处存在bp插入的KS-3和在175,650处存在80bp插入的KS-45。在一方面，遗传修饰可以是dr6(SEQ ID NO：19)中的突变，例如，在180,270-180,299处具有29bp缺失的KS-51。

在另一方面，遗传修饰是病毒调控基因的活性来源于修饰的遗传修饰，其中所述病毒调控基因为hhi-1(SEQ ID NO：8)。在某些方面，可通过检测增加的hhi-1活性来确定感兴趣的遗传修饰的鉴定。

在一方面，可通过化学诱变获得遗传修饰裸病毒。在另一方面，可通过重组DNA技术获得遗传修饰裸病毒。本文公开了示例性的非限制性方法。在另一方面，遗传修饰裸病毒可以使用如本领域中已知的基因编辑技术获得。

在一方面，公开了减少鳞翅目蛾群体的方法。所述方法可包括将用如本文公开的遗传修饰裸病毒感染的昆虫引入到感兴趣的群体中的步骤。在一方面，可将单性别的感染的昆虫引入到目标群体，例如全雄性或全雌性昆虫群体中。在另一方面，可以引入感染的昆虫的混合群体。

在一方面，公开了如上所述的用病毒感染的昆虫。昆虫可以是鳞翅目蛾。在另外的方面中，昆虫可以是谷实夜蛾(H.zea)、棉铃虫、烟青虫、烟芽夜蛾、小地老虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾或紧密相关蛾，例如紧密相关蛾或夜蛾。昆虫可以是雌性或雄性。

在一方面，公开了使昆虫能够将如本文公开的遗传修饰裸病毒传播至昆虫群体的方法。所述方法可包括用如本文所述的遗传修饰裸病毒感染昆虫的步骤。在一方面，昆虫是鳞翅目蛾。昆虫可以是谷实夜蛾(H.zea)、棉铃虫、烟青虫、烟芽夜蛾、小地老虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾或紧密相关蛾或夜蛾。所述方法可利用雄性昆虫、雌性昆虫或两者。在一方面，遗传修饰裸病毒可来源于病毒塞。遗传修饰裸病毒可口服施用至昆虫。在其他方面，可通过使用含有来源于病毒塞的病毒接种物的针刺穿昆虫表皮而通过直接接种昆虫幼虫或成年蛾来将遗传修饰裸病毒施用至昆虫。在另一方面，可通过直接皮下注射到三龄幼虫或蛾中来将遗传修饰裸病毒施用至昆虫。

在一方面，公开了保护易受蛾害虫影响的作物免受蛾害虫损害的方法。在该方面，所述方法可包括将用如本文所述的遗传修饰裸病毒感染的昆虫引入到感兴趣的作物中的步骤。作物可以是受害虫威胁的任何作物，并且可包括例如以下非限制性作物列表：玉米、棉花、大豆、西红柿、高粱、朝鲜蓟、天门冬属、卷心菜、香瓜、甘蓝、豇豆、黄瓜、茄子、莴苣、利马豆、甜瓜、秋葵、豌豆、胡椒、马铃薯、南瓜、食荚菜豆、菠菜、南瓜、甘薯和西瓜、苜蓿、三叶草、棉花、亚麻、燕麦、粟、稻、高粱、大豆、甘蔗、向日葵、烟草、野豌豆和小麦、鳄梨、葡萄、桃子、梨、李子、覆盆子、草莓、康乃馨、天竺葵、剑兰、金莲花、玫瑰、金鱼草、百日草及其组合。(参见http://edis.ifas.ufl.edu/in302)。在某些方面，作物可以是产生苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素的作物。使用的昆虫可以是如上所述的任何昆虫。

在另一方面，公开了使昆虫群体不育的方法。所述方法可包括将如本文所述的遗传修饰裸病毒引入到目标昆虫群体中的步骤。所述目标昆虫群体可包括侵入性昆虫群体，并且还可包括具有Bt抗性的昆虫群体。一种这样的示例性昆虫是鳞翅目蛾，其还可包括谷实夜蛾(H.zea)、棉铃虫、烟青虫、烟芽夜蛾、小地老虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾和紧密相关蛾或夜蛾。

在一方面，公开了通过化学修饰制备遗传修饰裸病毒的方法。所述方法可包括以下步骤：

a)将用病毒感染的昆虫细胞的群体与约0.05mM至约0.1mM 1,3-丁二烯二环氧化物(或1,2,3,4-二环氧丁烷或“DEB”)在约26℃至约28℃的温度范围下孵育至少1小时且最多至5小时，其中感染的昆虫细胞的群体可包括Sf9昆虫细胞，例如进一步地，其中昆虫细胞可以用与野生型HzNV-2病毒(SEQ ID NO：1)具有至少80％同一性、或至少85％同一性、或至少90％同一性、或至少95％同一性、或至少99％同一性的病毒感染，并且其中孵育足以在HzNv-2病毒中诱导一个或多个突变；

b)纯化病毒，其中纯化步骤包括以下步骤：

i.将用病毒感染的昆虫细胞的群体在无DEB培养基中培养，其中在培养步骤之前，对感染的昆虫细胞的群体进行分离和洗涤；

ii.从无DEB培养基中收集上清液以获得DEB暴露的病毒群体；

c)扩增并收集来自DEB暴露的病毒群体的突变型病毒，其中收集步骤可包括从具有大空斑表型的空斑选择病毒。

下文提供了通过化学修饰制备遗传修饰裸病毒的示例性方法。

实施例

通过参考以下随本发明优选实施方案的详细描述和其中所包括的实施例，以及附图及其先前和以下描述，可以更容易理解本发明。尽管在实施或测试本发明中可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现将描述优选方法、装置和材料。本文提及的所有参考文献、出版物、专利、专利申请和商业材料出于描述和公开在出版物中报道的可与本发明结合使用的材料和/或方法的目的以引用的方式整体并入本文。不应将本文的任何内容解释为承认，本发明无权先于因先前发明所作的此类公开。

方法-产生重组HzNV-2病毒

为了使用重组DNA技术产生yfp插入突变体病毒，申请人通过同源重组用编码黄色荧光蛋白(yfp)的基因取代了pag1基因。pag1表达抑制病毒转录因子hhi-1表达的微小RNA，hhi-1是维持HzNV-1潜伏期所必需的RNA中间体(Chao，1998；Wu和Wu，2011)。为了使pag1基因失活，基于pUC57的转移载体yfp-pUC57被设计并且用由黄杉毒蛾多粒包埋型核多角体病毒立即早期2(Orgyia pseudotsugata multicapsid nuclear polyhedrosis virusimmediate early 2)(Op1E2)启动子控制的yfp基因合成，并且在pag1上游和下游侧接1.2kb病毒HzNV-2序列。

yfp HzNV-2重组病毒通过yfp/pag1-pUC57质粒与WT HzNV-2基因组DNA在转染到Sf9昆虫细胞中之后的同源重组产生。将突变体病毒空斑纯化、使用Zeiss observer A1荧光显微镜和AxioVision Rel.4.6程序针对YFP荧光进行筛选，并且在于25cm²组织培养烧瓶中的裸病毒培养基(1x补充Grace’s培养基，7％FBS，1％青霉素/链霉素)中的Sf9细胞中扩增。使用DNAzol(ThermoFisher Scientific#10503027)从细胞培养上清液中分离病毒DNA并且使用AmpliTaq Gold主混合物(ThermoFisherScientific#4398881)进行PCR。PCR结果分别确认了pag1的缺失和利用内部pag1(F 5’-GTGGTGCCAGACTTTCAGACATCAT-3’(SEQ IDNO：10)、R 5’-GGGTCTGTTGCGACCTAAAGGTCTA(SEQ ID NO：11))和yfp(F 5’-CGAAGAGCTCTTCACTGGCGTGGT-3’(SEQ ID NO：12)、R5’-GGTGTTTTGCTGGTAATGATCCGC-3’(SEQID NO：13))引物的yfp基因的存在(图6)。后续PCR反应检测到pag1DNA，这表明yfp HzNV-2病毒是yfp插入型突变体，而非完全取代这个基因。然而，pag1的失活足以产生导致高达100％的感染的昆虫不育的病毒。使用针对HzNV-2开放阅读框架ORF78(F 5’-GCACACCTATCGATCACCAT-3’、R5’-GCACGATTCGTAATGTTCAAGG-3’)的引物作为对照以便检测HzNv-2基因组。

靶向裸病毒基因组中的突变的方法

申请人开发了使用二环氧丁烷(DEB)通过化学诱变在裸病毒基因组中产生缺失的新型方法。已知DEB交联DNA并且常常在单基因内导致多个碱基(从～50个碱基至几千碱基)的缺失(Reardon等人，1987；Wijen等人，2001)。DEB往往在DNA的活跃转录的区域内引起突变。然而，公布的DEB诱变方案并未教导在裸病毒感染昆虫细胞时使所述裸病毒突变，使得涉及建立病毒溶原现象的基因优先突变。在文献中，DEB诱变通常涉及向昆虫喂食DEB(Reardon等人，1987，Genetics 115:323-331；Kimble等人，1990Genetics.1990年12月；126(4):991-1005；Olsen和Green1982Mutat Res.1982年2月22日；92(1-2):107-15)，或使DNA直接暴露于诱变剂(Yazaki等人,J Virol Methods.1986年11月；14(3-4):275-83)。还参见Gherezghiher等人(J Proteome Res 2013，12(5):2151-2164)、Kempf等人(Biosci Rep1990 10(4):363-374)、“Methods of identifying anti-viral agents”美国专利序列号7,476,499)，所述文献涉及化学诱变，但未描述用于靶向病毒突变以选择如本文公开的病毒基因种类的方法。该技术并未教导使用DEB在感染期间使裸病毒基因组突变或通过使化学暴露与细胞中的病毒感染过程的阶段同步来靶向病毒基因的方法。本文公开了满足以下目的中的一个或多个的新型方法：1)HzNV-2基因组中的早期表达基因高效突变；2)在避免病毒DNA损伤至损害病毒复制的水平的情况下引入突变；3)在避免杀死病毒感染的宿主Sf9昆虫细胞的情况下引入突变；以及4)允许在宿主细胞裂解并且病毒变得不稳定(通常在少于48h内)之前回收病毒突变体。

申请人建立了一种高效方案，其中Sf9细胞以1感染复数(MOI)用WT HzNV-2感染1.5小时。选择1.5小时的孵育时间是因为先前文献说明对于相关HzNV-1病毒(SEQ ID NO：2)进入Sf21昆虫细胞并转录pag1基因来说2h是足够长的时间(Chao等人，1992.J Virol 66(3):1442-1448)。申请人发现对有效方法的一个障碍是允许足够长的时间用于使病毒进入靶细胞(昆虫细胞)中并且开始病毒转录。在不意图受到理论限制的情况下，申请人发现约1.5小时足以实现此目的。在其他方面，感染时间可以是约45分钟或更长、或约1小时至约2小时。在此步骤之后，向培养物加入0.1mM DEB。申请人发现，在较高浓度的DEB(等于或大于约0.5mM)下，宿主细胞(例如Sf9细胞)不能存活。认为约0.05mM至约0.1mM DEB的范围足以进行所述方案。孵育三小时后通过离心收获细胞并且将所述细胞重新悬浮于新鲜培养基中。申请人发现三小时足以引起诱变，但未杀死宿主昆虫细胞。在其他方面，感染时间可以是约四至五小时。

进行空斑测定以分离突变型病毒，然后在Sf9细胞中扩增，并评价细胞裂解。因为感染的细胞未进入潜伏期，所以病毒潜伏期所需的基因座诸如pag1区域中的突变应导致细胞裂解增加。从裂解病毒突变体大于野生型病毒空斑的病毒空斑形态观察结果中可以明显看出病毒感染细胞的裂解增加。根据方案，申请人发现几乎一半的DEB处理的病毒空斑(66个中有26个)具有大空斑表型。空斑可以保存为DEB突变体HzNV-2病毒母液。进一步筛选31种DEB处理的病毒，以确定它们是否导致无性腺雌性蛾。简而言之，用浸在从细胞培养物收集的突变体病毒上清液中的预先灭菌的针接种3龄幼虫。将幼虫饲养到成虫，并且评价雌性蛾的产卵能力和病毒塞的存在。申请人发现，31种突变体中的11种(KS-3、KS-38、KS-39、KS-40、KS-45、KS-49、KS-50、KS-51、KS-54，KS-57，KS-65)与WT病毒相比导致更高百分比的无性腺雌性，并且一种病毒(KS-52)导致较低的产卵量。DEB诱变的结果是惊人高效的；在体内筛选中，30种病毒中有36％的病毒与WT病毒相比导致更多的无性腺雌性。预期HzNV-2基因组的随机突变预期基本不影响潜伏期，因为已知超过113个病毒基因中仅有2个在建立潜伏期中起作用。然而，在所述方法中，大约1/3的突变体似乎改变或消除潜伏期。

详细的示例性方法如下：

培养条件。将Sf9昆虫细胞以2.5x 10⁶个细胞/ml接种于在25cm²组织培养烧瓶中的2mL裸病毒培养基(1x补充Grace’s培养基，7％FBS，1％青霉素/链霉素)中。然后加入先前以1估计MOI在组织培养物中扩增的3mL野生型HzNV-2病毒。

首先通过将Sf9昆虫细胞以8x 10⁵个细胞/ml接种于6孔培养皿的所有孔中的2mL裸病毒培养基中来扩增WT HzNV-2病毒。在27℃下孵育1小时后，使用大孔尖端向每个孔加入从无性腺雌性蛾的病毒塞获得的50μl过滤的WT HzNV-2(在同一天获取的)。将板在27℃下孵育2天。然后收集病毒上清液，通过离心(900x g，10min，4℃)除去细胞和残骸，并且将所有孔的上清液用0.22μm过滤器过滤灭菌并合并。所述程序的近似病毒滴度为1.5x10⁶pfu/ml。

为了从感染的雌性蛾中分离WT HzNV-2，首先将来自感染的雌性蛾的病毒塞从体内提取出，并且移至1.5ml微量离心管。加入100μl 1xPBS，并且用移液管尖端手动匀化所述塞以释放病毒。然后去除昆虫表层和组织的大碎片。这种病毒溶液称为未过滤的病毒塞提取物(UVPE)。过滤的病毒塞提取物(FVPE)是1x补充Grace’s培养基、2％未过滤的病毒塞提取物和5％青霉素/链霉素抗生素的过滤溶液(使用0.22μm过滤器)。

这种诱变的对照是并行进行的。对照包括未感染Sf9培养物、用DEB处理的未感染Sf9培养物和病毒感染的Sf9培养物。这些培养物以与本文所述的诱变培养物相同的方式且同时地进行制备。

将感染的Sf9昆虫培养物在27℃下孵育1.5小时。

化学诱变

在通风橱中，将DEB(其他名称1,3-丁二烯二环氧化物或1,2,3,4-二环氧丁烷)以0.1mM最终浓度加入培养物。然后将培养物在27℃下温育3小时。

孵育3h后，将培养物移至通风橱。使用细胞刮棒来将细胞从25cm²烧瓶中分离。将细胞和上清液移至50ml锥形管，并且在4℃下以900xg离心10min。将上清液移除至特定的废物容器。将细胞用10ml PBS洗涤、在通风橱中孵育5min，然后在4℃下以900x g离心10min。

将洗涤上清液移除至特定的废物容器。然后将细胞沉淀重新悬浮于5ml裸病毒培养基中并且移至新的25cm²组织培养瓶，其现在被认为是无DEB的。将培养物在27℃下孵育2天。

2天后，在以900x g离心10min后收集含有DEB暴露的HzNV-2的细胞培养基，并且使用0.22μm过滤器进行过滤灭菌。将2ml病毒原液加入新的25cm²组织培养瓶中，所述组织培养瓶含有以1x 10⁶个细胞/ml接种于5ml总体积的裸病毒培养基中的Sf9昆虫细胞。将病毒感染的培养物在27℃下孵育7天。

为了将病毒纯化并扩增到适用于昆虫感染的体积，在离心(3000rpm，10min，4℃)后收集含病毒培养基、使用0.22μm过滤器过滤灭菌，并且以1mL等分试样储存在-80℃下。病毒滴度大约为1x10⁴pfu/mL虽然已经显示HzNV-2感染了若干种鳞翅目细胞系(包括Sf-9和TN-368细胞)，但申请人发现难以传递昆虫细胞中的病毒这是由于病毒引起快速的细胞裂解。所公开的方法允许将病毒扩增至允许足够量的病毒用于储存并且还允许病毒适合于昆虫感染的体积。

使用传统的空斑测定分离病毒，所述空斑测定描述于例如Anderson，D.，Harris，R.，Polayes，D.，Ciccarone，V.，Donahue，R.，Gerard，G.和Jessee，J.(1996)RapidGeneration of Recombinant Baculoviruses and Expression of Foreign Genes Usingthe Bac-To-Baculovirus Expression System.Focus 17，53-58中。.对称之为p0病毒的大空斑进行进一步扩增。

对于p0至p1扩增，将Sf9昆虫细胞以5x 10⁵个细胞/ml接种于在12孔培养板中的最终2ml体积的裸病毒培养基中，并且在27℃下孵育1h。然后，使用大孔移液管尖端挑选病毒空斑并转移到一个孔。将板在27℃下孵育5天。在培养物离心(900x g，持续10m，在4℃下)后收集含有DEB处理的HzNV-2病毒的培养基，并且使用0.22μm过滤器进行过滤灭菌。

对于p1至p2扩增，将Sf9昆虫细胞以8x 10⁵个细胞/ml接种于在6孔培养板中的最终2ml体积的裸病毒培养基中，并且在27℃下孵育1h。然后，使用血清吸管将600μl p1病毒加入一个孔。将板在27℃下孵育4天。然后在培养物离心(900x g，持续10m，在4℃下)后收集含有DEB-突变型HzNV-2的培养基。

对于p2至p3扩增，将Sf9昆虫细胞以1x 10⁶个细胞/ml接种于在25cm²组织培养烧瓶中的5ml裸病毒培养基中，但不进行孵育。使用血清吸管将～1.5ml(或所有)p2病毒加入一个烧瓶。将烧瓶在27℃下孵育4天。然后在培养物离心(900x g，持续10min，在4℃下)后收集含有DEB-突变型HzNV-2的培养基，并且使用0.22μm过滤器进行过滤灭菌。将p3病毒以1ml等分试样储存在-80℃下。

通过直接接种方法使用p3病毒来感染3龄幼虫。每种突变体病毒在昆虫中引起感染，导致形成在无性腺雌性蛾中发现的病毒塞。来自这些病毒塞的病毒可以用于后续实验中。

确认重组HzNV-2病毒和化学突变型HzNV-2病毒的不育化活性

合在一起看，数据表明使用上述方法中的一个或多个可有效地实现重组HzNV-2病毒和突变体HzNV-2病毒。可以产生具有破坏的潜伏期的重组HzNV-2病毒和突变体HzNV-2病毒，其中影响潜伏期的基因被破坏或者建立或打破潜伏期所需的结构遗传元件被改变。所得到的遗传修饰突变体HzNV-2病毒在感染的H.zea蛾中导致不育水平升高。在一方面，被破坏的基因包括pag1、ORF90和ORF92中的一个或多个。值得注意的是，通过使病毒基因组的不同病毒基因和区域突变可以产生100％不育表型。

表1.化学突变体中的突变相对于HzNV-2的位置。用DEB使野生型(WT)HzNV-2病毒突变以形成HzNV-2化学突变体。对突变体KS-3、KS-45和KS-51进行测序并且鉴定出基因缺失。值得注意的是，三种突变体在不存在于HzNV-1基因组中的区域中均具有突变。

通过许多实验来评估所得突变体的不育活性，其中将病毒注射到H.zea成虫或3龄幼虫中。在典型的实验中，将WT-HzNV-2、重组yfpHzNV-2和突变体KS3病毒从存在于病毒感染的雌性蛾中的病毒塞中收集并纯化，并且然后注射到羽化2天后的新的健康雌性蛾中。在产卵第3天收集产卵，并且分析F1子代雌性成虫的不育性，如通过病毒塞的存在和产卵数指示的(表2)。用突变体yfp HzNV-2和KS-3感染的两个雌性组几乎不或不产卵，并且具有比WT感染组高得多的百分比的无性腺雌性。因此，使用所述方法获得的病毒适用于使易受所述病毒感染的害虫群体不育，并且可用于控制害虫群体。

表2.用突变体HzNV-2KS3、重组突变体yfp HzNV-2或野生型(WT)HzNV-2对雌性蛾的注射，以及如通过病毒塞的存在和产卵量确定的对其雌性后代的不育性的分析。

病毒	塞	产卵
			WT HzNV-2	34％	许多
KS3	95％	少量
			yfp HzNV-2	100％	无

在类似的实验中，评价WT和9种化学突变体病毒导致无性腺蛾的能力。简而言之，在羽化当天，对成年雌性蛾注射100μl～10⁸pfu/ml的分离自病毒塞的病毒。在产卵第2天和第3天收集产卵，并饲养到成年蛾。评价F1子代雌性蛾的产卵能力和病毒塞的存在。四种突变体(KS-3、KS-45、KS-52、KS-51)在100％的F1雌性子代中引起病毒塞形成(图2)。用三种突变体感染的雌性蛾的F1子代没有产卵(指示无性腺表型(KS3、KS45、KS51)(图3)。用另一种突变体KS52感染的雌性蛾的F1雌性子代在产卵第2天比用WT病毒感染的雌性蛾的F1雌性子代产卵少，并且在产卵第3天没有产卵。

由申请人定义的功能性突变KS-3、KS-45和KS-51鉴定并定位于具有若干个不相关直接重复序列的ORF，所述ORF大小范围为24至81bp，并且具有重复4至12次的这些序列。这些重复序列由Burand等人，(2012)鉴定。此类重复序列可以具有结构上以及编码的作用，并且重复序列的一些功能涉及DNA蛋白质的识别位点，并引导可以促进DNA复制、DNA重组和/或RNA转录(作为实例)的DNA构象变化。类似重复序列存在于ORF 2(直接重复序列1；表2；Burand等人，2012)中并且所述类似重复序列在本文中称为易受突变的鉴定序列、区和OFR，并且此类突变很可能影响DNA复制和重组以及关于对病毒溶原现象和用改变ORF2(SEQ IDNO：3)的突变增加感染的H.zea中的不育性的影响的病毒功能。值得注意的是由申请人定义的3种突变定位于含有HzNV2基因组中的6种重复序列中的4种的ORFs 90和92。ORF 2和ORF91仅含有病毒基因组中的其他大的重复序列，并且因此明显是用于诱变的候选物，同时预期的是其将影响HzNV2重复和溶原现象。

表2示出将遗传工程化病毒和化学突变体病毒进行比较的另外数据。从用遗传工程化的重组病毒yfp HzNV-2感染的雌性蛾发育的子代雌性蛾没有产卵，并且所有F1雌性子代都具有病毒塞，这指示了其不育性。类似地，用化学突变体病毒KS3、KS45、KS51和KS52感染的雌性蛾的基本上所有F1子代都具有病毒塞并且表现出不育性(表2，图2和3)。相比之下，非常小百分比(～33％)的用WT病毒感染的昆虫是无性腺的(具有塞)，其中用WT HzNV-2感染的大多数蛾是可育的并且产下许多卵(表2，图3)。在其他产卵天数也看到类似的结果，但是如文献报道的那样，注射有WT HzNV-2的雌性蛾的F1子代中的雌性不育蛾的数量在后来的产卵天数处增加(Hamm等人，1996；Burand 2013)。这些结果支持了下述假设:若干个裸病毒基因，例如pag1(SEQ ID NO：6)、ORF90(SEQ ID NO：4)和ORF92(SEQ ID NO：5)的失活可导致基本上100％的感染昆虫不育。

虽然应认识到能够在昆虫害虫物种之间性传播的病毒可以使用所述方案进行突变和选择而无需知道涉及所得病毒(例如，使用以上所述的DEB方案)的表型的特定基因，但是申请人已经鉴定了与病毒感染后不育性增加相关联的一些基因。例如，申请人已经发现pag1、ORF90和ORF92基因与病毒感染的昆虫的不育性增加相关联。

使用修饰HzNV-2感染昆虫

已发表的裸病毒文献描述了用WT HzNV-2感染H.zea蛾和使H.zea蛾不育的各种技术，但是缺乏使得可以进行有意义的方案的各个方面。申请人开发了高效1)感染成年蛾，2)感染蛾后代，和3)模拟田地中蛾群体的自然感染的方案。

使成年蛾的后代不育的方法。用于使用WT HzNV-2产生无性腺感染的方案。

为了感染成年蛾，使用胰岛素注射器将病毒注射到成年蛾的腹部中。在此类实验中，从病毒塞收集的WT病毒有效地感染雌性成年蛾和F1子代，模拟了自然感染的蛾群体(即20-50％无性腺的)(表3)。通过从腹部取出所述塞并将所述塞悬浮于100μl PBS中来收集病毒；此病毒称为未过滤的病毒塞提取物(UVPE)。然后将病毒在1x Grace’s培养基中稀释至2％，并通过0.22微米过滤器过滤灭菌；此病毒称为过滤的病毒塞提取物(FVPE)。申请人确定，当使用UVPE或FVPE进行注射时，无性腺F1代子代的百分比无差异。(表3.)申请人使用FVPE进行大多数实验。

表3.未过滤的病毒塞提取物(UVPE)与过滤的病毒塞提取物(FVPE)在其用塞导致无性腺F1子代的能力方面的比较。产卵天数是感染的雌性蛾产卵的天数。将在产卵第3天和第4天的产的卵饲养到成虫。

开发产生大量无性腺蛾的方案

后续实验确定，与注射由培养物中Sf9细胞的感染产生病毒相比，注射从病毒塞中提取的病毒导致更高比例的无性腺F1子代。简而言之，向成年雌性蛾注射50-60μl的在细胞培养物中扩增的FVPE或病毒。在产卵第3天收集卵并且将所述卵饲养到成虫。评价F1雌性子代的塞的存在。如果向F0雌性蛾注射病毒塞提取物，则几乎所有的F1雌性子代显现塞；但是如果注射从感染的Sf9细胞收集的病毒，则仅有10％的F1子代显现塞。(表4)。

表4.分离自感染的Sf9昆虫细胞的病毒(细胞培养物)和分离自病毒塞的病毒(塞病毒)在其导致无性腺F1子代(如通过病毒塞的存在指示)的能力方面的比较。

因此，在用于感染成年蛾的细胞培养物中扩增的病毒的滴度不是最佳的。滴度是开发用于产生大量不育昆虫的方法的重要因素。最佳病毒滴度将是尽可能低，但足以导致无性腺成虫。为了评估病毒滴度的影响，用10⁷、10⁴或10¹pfu/ml病毒(WT或yfp HzNV-2)注射成年雌性蛾，并且使其与未感染的雄性配对。在产卵第3-5天收集卵，并且饲养到成虫阶段。评价蛾的病毒塞的存在和产卵量。10⁴pfu/ml的病毒滴度在产卵第5天导致大量的无性腺F1子代(表5)，这表明宿主蛾中的病毒复制对于将病毒有效传播给后代卵是重要的。

表5.蛾是未感染的或者是用野生型(WT)或重组yfp HzNV-2病毒情况下的低(10¹pfu/ml)、中(10⁴pfu/ml)或高(10⁷pfu/ml)剂量感染的。在产卵第3-5天收集卵、饲养到成虫，并且通过塞的存在评价每个雌性的无性腺状态。

将重组病毒注射到初始雄性蛾中，然后使其与健康雌性交配未显著降低雌性蛾的产卵数，但是感染可以此方式传播。然而，当向新羽化的雌性蛾注射重组yfp HzNV-2并使其与健康雌性交配时，卵数显著降低(图4)。这种效应是剂量依赖性的，因为1x10⁶pfu病毒剂量与1x10³pfu病毒剂量相比表现出较少卵。相对于培养基注射的对照，注射有WTHzNV-2的雌性蛾的产卵总数未降低；这种效应仅在突变体病毒和重组病毒的情况下观察到。

通过在幼虫阶段向昆虫注射病毒来使成年蛾不育的方法

用于诱导不育的替代方案是将病毒注射到3龄幼虫中，使得注射的昆虫在成虫时表现出不育病理学。虽然这不是正常的传播模式，但是幼虫注射快得多、便于自动化并且很可能模拟病毒复制的激活(Rallis等人，2002-a)。申请人已经产生用于在3龄幼虫中诱导不育的两个方案：注射器注射和直接接种。

利用注射器注射的感染

将来自病毒感染细胞的培养物的上清液注射到成年蛾中未产生大量的无性腺后代(表4)。为了确定由感染的、培养的昆虫细胞产生的病毒是否在注射到幼虫中时有效启动生产性病毒感染，申请人将含病毒的组织培养基注入到3龄幼虫中。3龄幼虫(83只幼虫/组)是使用胰岛素注射器注射有WT HzNV-2、yfp HzNV-2或KS-3病毒(25-50μl)的或未注射的。将幼虫饲养到成虫。令人惊讶的是，yfp HzNV-2注射的幼虫中都未化蛹并且最终死亡(表6)。然而，用WT HzNV-2或KS-3病毒感染的～95％的雌性幼虫在成虫时产生病毒塞(图5)。申请人的结论是，虽然将在组织培养物中扩增的病毒注射到成年蛾中未产生许多无性腺后代，但是将在组织培养物中扩增的病毒注射到3龄幼虫中是一种有效方法，因为几乎所有蛾变为无性腺的。

表6.在向3龄幼虫注射来源于病毒感染的昆虫细胞培养物的WTHzNV-2、重组HzNV-2和突变体HzNV-2之后幼虫阶段和蛹阶段死亡率。

还评价了用胰岛素注射器将病毒塞提取物向3龄幼虫中的注射。简而言之，将WTHzNV-2和yfp HzNV-2FVPE稀释至7x 10³pfu/ml和2.5x 10²pfu/ml，并且向3龄幼虫中注射25μl。将幼虫饲养到成虫，并且评价雌性蛾的塞的存在。在幼虫时注射有10³pfu/ml滴度的雌性蛾显现病毒塞，而只有～80％的注射有10²pfu/ml的那些蛾显现病毒塞(表7)。申请人的结论是，向3龄幼虫注射病毒塞提取物在产生无性腺成虫方面也是高度有效的，但是滴度应在10³pfu/ml左右。

表7.在用野生型(WT)HzNV-2或重组yfp HzNV-2\以10²至8x10³pfu/ml之间的病毒剂量感染3龄幼虫之后病毒塞的发生率。

利用使用针的直接接种的感染

直接注射三龄幼虫或蛾是实验室中感染HzNV-2的有效方法，但喂养是优选的方法。

通过口服感染途径用WT HzNV-2感染H.zea是可能的。Raina等人(2006)将WTHzNV-2喂养到1龄幼虫，持续1-3天，并且发现9％-17％(基于性别和喂养持续时间而变化)的成虫变为无性腺的。Hamm等人(1996)将于水性溶液中的WT HzNV-2喂养到成年蛾，并且60％-100％的后代成虫是无性腺的。HzNV-2基因组还编码与蛋白质产物涉及病毒的经口进入的四种杆状病毒基因(p74、pif-1、pif-2和pif-3)相关的基因(Burand，Kim，Afonso等人2012)。虽然HzNV-2的自然感染途径是通过交配和/或经卵传播，但是用于感染昆虫的其他方法包括直接接种和喂养幼虫和成虫。

开发了将病毒传播到3龄幼虫的直接接种方法(表8)，并且可以便于自动化。所述方法类似于Hamm等人(1996)用于用病毒塞提取物感染1龄幼虫的方法，其中10只幼虫中有9只在成虫时变为无性腺的。直接接种是向H.zea幼虫中引入病毒的快速手段，其中将无菌针浸入到病毒溶液中，并且然后用于使用足够的力在头壳和腹部之间刺破幼虫以穿透表层并进入昆虫体腔。使用从两种不同细胞培养感染物A和B)获得的WTHzNV-2(A、B)病毒进行直接接种。将刺破的幼虫饲养到成年蛾，并且评价雌性蛾的塞的存在。57％(WT A)和16％(WT B)的蛾是无性腺的。

为了测试分离自塞的病毒，将～10⁸pfu/ml WT HzNV-2或重组yfpHzNV-2病毒分离出、过滤灭菌并且用于直接的接种实验中。将接种幼虫饲养到成年蛾并使其交配。由用重组yfp HzNV-2接种的幼虫发育的所有雌性蛾是不育的(未产卵；塞在100％雌性中)。在解剖后，发现检查的所有雄性蛾是无性腺的。

对于用WT HzNV-2接种的幼虫，90％的雌性蛾具有病毒塞，相对于对照，产卵数相当减少(表8)。总之，直接接种方法不仅与将病毒注射到幼虫中一样有效，而且其还快得多。

表8.向3龄幼虫直接接种纯化自病毒塞的野生型(WT)和yfp重组HzNV-2对蛾不育性的影响。^*高：>700个卵；低<200个卵；^**如通过解剖H.zea雌性的生殖器官确定的。

为了研究滴度对直接接种方法的影响，将从病毒塞分离的WTHzNV-2稀释至10⁶pfu/ml，并且用于接种3龄幼虫。在10⁶pfu/ml接种物的情况下，只有18％的WT-HzNV-2刺破的雌性是无性腺的。被称为携带者的许多雌性感染有病毒，但具有无活性或潜伏感染。具有潜伏感染的蛾具有完整的功能性生殖道，但是可以将病毒水平地和垂直地传播至其后代。进行使用针对HzNV-2ORF78的引物组的PCR，并且没有测试出病毒塞的所有20只雌性是携带者。申请人的结论是，使用10⁶pfu/ml的低滴度直接接种来感染3龄幼虫产生了携带者群体。

用所公开的病毒感染昆虫的方法

用于引入昆虫裸病毒和杆状病毒的替代方法在科学文献和专利文献中有所报道。文献表明：通过向新羽化的(初生仔)一龄幼虫喂养、通过向成虫喂养在蔗糖溶液中的病毒、通过向幼虫饮食添加荧光增白剂或通过使用粉末状或液滴形式的病毒进行气溶胶感染可以高效地感染(Kirkpatrick等人，1994；美国专利号7,261,886)。最近的专利申请报告了通过将幼虫浸没在病毒溶液中而实现高效杆状病毒感染(美国专利公布US2011/0314562)。

根据本公开，可以如下使用用于感染大量幼虫的三种不同的方法：

1.病毒喂养。可以使用由Raina和Lupiani(2006)利用的方案。简而言之，新孵出的H.zea幼虫可以放置在含有具有1000pfu突变体HzNV-2的饮食的100x15mm培养皿中。为了增加病毒的高效度吸收，可以向饮食加入荧光增白剂Blankophor(Martinez等人，2009)。可以将幼虫喂养48小时，然后放置在含饮食的杯中。H.zea是极其具有同类相食性的，所以必须单独安置在年轻龄虫处。蛹是有性特征的并且对羽化的雌性分析病毒塞、交配后产卵的能力，以及完整的生殖器官的存在。

然后可以解剖雄性，并且检查其生殖器官以确定它们是否是无性腺的。突变体HzNV-2的存在可以通过PCR确认，如上所述。

2.病毒气溶胶。病毒可以冻干粉末(Kirkpatrick等人，1994)或水性雾剂(美国专利7,261,886)的形式递送。3龄H.zea幼虫可以用CO₂麻醉并且放置在测试腔室中。冻干的突变型病毒可以不同剂量放置在腔室中，并且通过温和的空气流连续分散在整个腔室中，总暴露时间为30min。每只昆虫在其化蛹后可以是有性特征的，并且在羽化后，可以如上所述分析每只蛾的不育性。对于水性雾剂递送，可以使用Potter精密实验室喷雾塔(BurkardScientific)，并且3龄幼虫可以接收10²至10⁴pfu/ml的突变体HzNV-2的剂量。可以在成年蛾中评估无性腺病理学。

3.浸没。将H.zea幼虫浸没在HzNV-2溶液中，如Lu等人所述(2011)。这种处理方法包括首先在4℃下刺激(stressing)昆虫15小时，然后将3龄幼虫在不同浓度的突变体HzNV-2(10³-10⁶pfu/ml)中浸泡1小时。成年蛾的不育性可以如上所述确定。

保护作物免受昆虫害虫的方法

本公开涉及通过由于使用突变体或转基因HzNV-2感染使鳞翅目害虫蛾不育的方法来控制鳞翅目害虫蛾的方法。根据所公开的方法和组合物向目标群体递送HzNV-2或其突变体形式可以通过对蛾已建立的用于不育昆虫控制的释放方法。在一方面，将如本文公开的用突变体病毒感染的蛾或其他害虫释放在点位置处并允许其分散在一定范围内。所述范围可以例如离释放位点约800米，或者从飞机、直升机或无人机空中释放。在使用一种或多种所公开的方法感染后，用突变体或重组HzNV-2感染的蛾可以0.1个感染蛾/个田地群体中的WT蛾至10个感染蛾/个田地群体中的WT蛾的比例释放。较低比例的定向释放可能依赖于感染的代谢传播来进行控制，并且可能需要对病毒感染的成年蛾的补充性释放。

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除非另有指明，否则所有百分比和比例都是以重量计计算。

除非另有指明，否则所有百分比和比率均基于总体组合物计算。

应当理解意欲在本说明书通篇中给出的每个最大数值限制包括每个较低的数值限制，如同所述较低的数值限制被清楚地写在本文中一般。在本说明书通篇中给出的每个最小数值限制将包括每个较高的数值限制，如同所述较高的数值限制被清楚地写在本文中一般。在本说明书通篇中给出的每个数值范围将包括每个落在所述较宽的数值范围之内的较窄的数值范围，如同所述较窄的数值范围都被清楚地写在本文中一般。

本文所公开的尺寸和值不应被理解为严格限制于所引用的确切数值。相反，除非另外指明，否则每个这种尺寸意在意指所引用的值和围绕该值的功能上等效的范围。例如，公开为“20mm”的尺寸意在意指“约20mm”。

除非明确排除或以其他方式限制，否则本文所引用的每个文献，包括任何交叉引用或相关的专利或申请，均以引用的方式整体并入本文。任何文献的引用均不是对其作为本文公开或保护的任何发明的现有技术的任何，或者对其独立地、或以与任何其他参考文献的任何组合的方式参考、教示、建议或公开任何此类发明的任何。另外，如果本文献中的术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中的相同术语的任何含义或定义相冲突，则将以赋予本文献中的术语的含义或定义为准。

虽然已说明和描述了本发明的具体实施方案，但本领域技术人员将清楚，可在不脱离本公开的精神和范围的情况下做出各种其他变化和修改。因此，在所附权利要求书中意图涵盖处于本发明范围内的所有此类变化和修改。

Claims (15)

1.一种野生型裸病毒的遗传修饰裸病毒，所述野生型裸病毒优选与谷实夜蛾裸病毒2病毒具有至少约80％序列同一性，其中所述遗传修饰裸病毒能够通过昆虫性传播；并且

其中所述遗传修饰裸病毒能够在用包含遗传突变的所述裸病毒感染昆虫之后导致大于约50％、优选约50％至约100％、更优选约80％至约95％、最优选约90％至约100％的比率的所述昆虫不育，其中所述昆虫优选选自谷实夜蛾(H.zea)、棉铃虫、烟青虫、烟芽夜蛾、小地老虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、夜蛾、紧密相关夜蛾或其组合，更优选地其中所述昆虫是鳞翅目蛾；并且

进一步地，其中，所述遗传修饰优选通过基因编辑技术、更优选通过重组DNA技术并且最优选通过化学诱变实现。

2.如权利要求1所述的遗传修饰裸病毒，其中所述野生型裸病毒特征在于：其具有潜伏期；与谷实夜蛾裸病毒2(HzNV-2，也称之为玉米夜蛾裸病毒或性腺特异性病毒)病毒具有约80％或更大的序列同一性；并且能够在一种或多种蛾中复制。

3.如前述任一项权利要求所述的遗传修饰裸病毒，其中遗传修饰裸病毒具有所述野生型裸病毒的潜伏期的破坏。

4.如前述任一项权利要求所述的遗传修饰裸病毒，其中所述昆虫是夜蛾科中的鳞翅目蛾，其支持所述HzNV-2病毒在生殖组织中复制以足以导致50％或更大比率的不育。

5.如前述任一项权利要求所述的遗传修饰裸病毒，其中所述遗传修饰是选自ORF 2(SEQ ID NO：3)、ORF 90(SEQ ID NO：4)、ORF92(SEQ ID NO：5)、pag1(SEQ ID NO：6)、PAT1基因(SEQ ID NO：7)、ORF91(SEQ ID NO：9)、dr1(SEQ ID NO：14)、dr2(SEQ ID NO：15)、dr3(SEQ ID NO：16)、dr4(SEQ ID NO：17)、dr5(SEQ ID NO：18)、dr6(SEQ ID NO：19)或其组合的一个或多个区域中的突变，所述突变足以破坏所述区域的表达和/或减少所述区域的表达，优选地其中所述破坏是功能性敲除。

6.如权利要1所述的遗传修饰裸病毒，其中所述遗传修饰是pag1(SEQ ID NO：6)中足以破坏所述pag1基因的表达的突变。

7.如前述任一项权利要求所述的遗传修饰裸病毒，其中所述遗传修饰导致病毒调控基因的活性增加，其中所述病毒调控基因是hhi-1(SEQ ID NO：8)。

8.一种减少鳞翅目蛾群体的方法，其包括将用如权利要求1至7中任一项所述的病毒感染的昆虫引入到所述群体中的步骤。

9.一种用如权利要求1至7中任一项所述的病毒感染的昆虫，优选地其中所述昆虫是鳞翅目蛾，并且更优选地其中所述昆虫是谷实夜蛾(H.zea)、棉铃虫、烟青虫、烟芽夜蛾、小地老虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾和紧密相关夜蛾。

10.使昆虫能够将如权利要求1至7中任一项所述的遗传修饰裸病毒传播至昆虫群体、优选地鳞翅目蛾的群体、更优选地谷实夜蛾(H.zea)、棉铃虫、烟青虫、烟芽夜蛾、小地老虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾和紧密相关夜蛾的群体的方法，所述方法包括用如权利要求1至7中任一项所述的遗传修饰裸病毒感染所述昆虫的步骤，其中所述遗传修饰裸病毒优选来源于病毒塞。

11.如权利要求10所述的方法，其中通过直接皮下注射到三龄幼虫或蛾中来将所述遗传修饰裸病毒施用至所述昆虫，更优选地其中通过使用含有来源于病毒塞的病毒接种物的针刺穿表皮而通过直接接种昆虫幼虫或成年蛾来将所述遗传修饰裸病毒施用至所述昆虫，并且最优选地其中将所述遗传修饰裸病毒口服施用至所述昆虫。

12.一种保护易受蛾害虫影响的作物免受所述蛾害虫损害的方法，优选地其中所述蛾害虫选自谷实夜蛾(H.zea)、棉铃虫、烟青虫、烟芽夜蛾、小地老虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾和相关夜蛾，更优选地其中所述昆虫是鳞翅目蛾，并且其中所述作物优选地选自以下各项中的任一项：玉米、棉花、大豆、西红柿、高粱、朝鲜蓟、天门冬属、卷心菜、香瓜、甘蓝、豇豆、黄瓜、茄子、莴苣、利马豆、甜瓜、秋葵、豌豆、胡椒、马铃薯、南瓜、食荚菜豆、菠菜、南瓜、甘薯和西瓜、苜蓿、三叶草、棉花、亚麻、燕麦、粟、稻、高粱、大豆、甘蔗、向日葵、烟草、野豌豆和小麦、鳄梨、葡萄、桃子、梨、李子、覆盆子、草莓、康乃馨、天竺葵、剑兰、金莲花、玫瑰、金鱼草、百日草及其组合，更优选地其中所述作物是产生苏云金芽孢杆菌毒素(Bt)的作物，所述方法包括将用如权利要求1至7中任一项所述的遗传修饰裸病毒感染的昆虫引入到所述作物中的步骤。

13.一种使昆虫群体、优选具有Bt抗性并且更优选具有侵入性的昆虫群体不育的方法，所述方法包括将如权利要求1至7中任一项所述的遗传修饰裸病毒引入到所述昆虫群体中的步骤。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述昆虫是鳞翅目蛾，优选地其中所述昆虫是谷实夜蛾(H.zea)、棉铃虫、烟青虫、烟芽夜蛾、小地老虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾和紧密相关夜蛾，最优选地其中所述昆虫是谷实夜蛾(H.zea)、棉铃虫、烟青虫、烟芽夜蛾、小地老虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾和紧密相关夜蛾。

15.一种制备如权利要求1至7中任一项所述的遗传修饰裸病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将用病毒感染的昆虫细胞的群体与约0.05mM至约0.1mM 1,3-丁二烯二环氧化物(或1,2,3,4-二环氧丁烷或“DEB”)在26℃-28℃下孵育至少1小时且最多至5小时，优选地其中所述感染的昆虫细胞的群体包括Sf9昆虫细胞，优选地其中所述昆虫细胞用与野生型HzNV-2病毒具有至少80％同一性的病毒感染，其中所述孵育足以在所述WT HzNv-2病毒中诱导一个或多个突变；

b)纯化所述病毒，其中所述纯化步骤包括以下步骤：

i.将所述用病毒感染的昆虫细胞的群体在无DEB培养基中培养，其中在所述培养步骤之前，对所述感染的昆虫细胞的群体进行分离和洗涤；

ii.从所述无DEB培养基中收集上清液以获得DEB暴露的病毒群体；

c)扩增并收集来自所述DEB暴露的病毒群体的所述突变型病毒，其中所述收集步骤包括从具有大空斑表型的空斑选择病毒。