BG62194B1 - Инсектицидно ефективни пептиди - Google Patents

Description

Изобретението се отнася до инсектицидно ефективни пептиди. По-специално изобретението се отнася до инсектицидно ефективни пептиди, които могат да бъдат изолирани от отровата на паяк Diguetia, до ДНК, кодираща такива инсектицидно ефективни пептиди, до методи за получаване на споменатите пептиди и до методи за контролиране на безгръбначни вредители.

Известно е, че през последните години обществеността остро осъзнава рисковете на околната среда и токсичността при бозайниците, свързана с употребата на синтетични инсектициди. В резултат на това използването на тези инсектициди е намалено рязко. Остава обаче необходимостта от ефективен контрол на инсектите.

Най-широко използваните микробни пестициди произхождат от бактерията Bacillus thuringiensis (по-нататък в текста посочена съкратено B.t.). Този бактериален агент се използва за контрол на различни листоядни гъсеници, Японски бръмбари и комари. В патент на US 4 797 279 от 10.01.1989 г. на Karamata et al. се описва хибридни бактериални клетки, съдържащи гена, кодиращ за B.t. kurstaki делта-ендотоксин и гена, кодиращ за B.t. tenebrionis делта-ендотоксин и тяхното получаване. Хибридите B.t. са активни спрямо вредители, чувствителни към B.t. kurstaki щамове, както и спрямо вредители, чувствителни към щамовете B.t. tenebrionis. Тези хибриди имат полезни инсектицидни свойства, които превъзхождат наблюдаваните от физически смеси на изходни (родителски) щамове в условията на определено ниво на инсектицидна активност или в условията на спектър от активност или и при двете. Инсектицидните състави, съдържащи такива микроорганизми, могат да бъдат използвани за унищожаване на инсекти чрез прилагане на хибридите в инсектицидно ефективно количество към инсектите или към тяхната среда.

Друго производно от бактерията B.t. е описано в ЕР 0 325 400 А1, издадена на Gilroy & Wilcox. Това изобретение се отнася до хибриден токсинов ген, който е токсичен към ципокрили инсекти. По-специално изобретението включва един хибриден делта-ендотокси нов ген, съдържащ част от B.t. var. kurstaki HD-73 токсинов ген, и част от токсиновия ген от B.t. var. kurstaki щам HD-1. Хибридният токсинов ген (ДНК), кодиращ протеин, който има активност спрямо ципокрили инсекти, също е описан.

Бактерията B.t. е използвана също поради нейните инсектицидни свойства в ЕР 0 340 948, издадена на Wilcox et al. Това изобретение се отнася до хибридни пестицидни токсини, които се получават чрез сливането на разпознат участък от епителиална клетка от черво на инсект с B.t. ген към В веригата на дифтериен токсин, за да се получи един хибрид B.t. токсин, който е активен спрямо ципокрили инсекти. Предполага се, че хибридният B.t. ген може да бъде вмъкнат в растение или да се клонира в бакуловирус, за да се произведе токсин, който може да бъде извлечен. Алтернативно гостоприемникът, съдържащ хибридния B.t. ген, може да бъде използван като инсектицид чрез пряко приложение към околната среда на посочените инсекти.

При проучването за инсектицидни съединения е идентифицирана отровата на скорпион като един възможен източник на съединения, осигуряващи инсектицидни свойства. Два селективни спрямо инсекти токсина, изолирани от отровата на скорпиона Leiurus quinquestriatus quinquestriatus, са посочени от Zlotkin et al. в статията “Стимулиращ и потискащ инсекти токсин, извлечен от отрова на скорпион, който едновременно влияе върху електропроводимостта на натрия и има общо място на свързване, Arch Biochem and Biophysics, 240 : 877-87 (1985).

При изследване на техните химически и фармакологични свойства е установено, че единият токсин предизвиква бърза стимулираща контрактивна (свиваща) парализа на ларви на муха, а другият токсин предизвиква бавна потискаща, отпускаща парализа. И двата токсина влияят върху електропроводимостта на натрия.

В патент на СА 2 005 658, издаден на 19 юни 1990 г. на Zlotkin et al. е описан инсектицидно ефективен протеин, получен от скорпиона Leiurus quinquestriatus hebraeus Buthinae, Buthidae. В това изобретение отровата се лиофилизира и се разделя на фракции. Фракцията с най-висока токсичност спрямо ларви и най-ниската токсичност спрямо мишки се под2 лага на допълнително пречистване и крайният продукт е посочен като LqhP35.

В лит.източник Grishin, “Токсични компоненти от отрови на Buthus eupeus и Lucosa signoriensis”, Shemyakin Institute of Bioorganic Chemistry, USSR Academy of Sciences, M. 117988, GSP-1, USSR, са описани четири токсина, изолирани от отровата на скорпиона Buthus eupeus, които са токсични спрямо инсекти. Описано е също така изолирането и характеристиката на токсичния компонент от отровата на тарантулата (вид паяк) Lucosa signoriensis. Необработената отрова не е токсична към инсектите.

В съответствие с проучването и разработките, свързани с различни състави с инсектицидни свойства, се разработват методи за получаване на инсектицидни гени и вмъкването на тези гени във вредители, обект на изследване. В патент на US 4 879 236 от 1989 г. на Smith и Summers, се отнася до метод за инкорпорация (включване) на избран ген, спрегнат с бакуловирусен промотор вътре в бакуловирусен геном, за да се получи рекомбинантен бакуловирусен експресионен вектор, способен да експресира избрания ген в дадена клетка на инсект. Методът включва отцепване на бакуловирусна ДНК, за да се получи ДНК фрагмент, съдържащ полихедринов ген или част от него, вкл. полихедринов промотор. За да се получи рекомбинантен преносим вектор, ДНК фрагментът се вмъква в клониращ носител и след това избран ген се вмъква в този модифициран клониращ носител, така че същият е под контрола на полихедриновия промотор. Рекомбинантният преносим вектор след това взаимодейства с бакуловирусна ДНК от див тип, така че да се повлияе хомоложната рекомбинация и включването на избрания ген в бакуловирусния геном. Бакуловирусът Autographa californica (AcMNPV) и свързаният с него полихедринов промотор е установено, че е полезен при получаването на вирусен експресионен вектор, способен на изключително високи нива на експресия на даден избран ген в еукариотна клетка на гостоприемник.

Предполага се, че експресионният вектор трябва да бъде използван в система за контролиране на инсекти чрез подбиране на ген, който произвежда протеин, токсичен към специфичен инсект или към определен спектър от инсекти и клониране на този ген в

AcMNPV експресионния вектор. Предполага се също така, че векторът би могъл да бъде приложен към растението или животното, което трябва да бъде защитено. Рекомбинантният вирус би могъл да обхване клетките на чревната стена след поглъщане от инсекта и да започне възпроизводство. Едно алтернативно предложение е да се вмъкне генът вътре в бакуловирусния геном, така че той би могъл да се присъедини към полихедриновата структурна последователност по такъв начин, че полихедроновото покритие би могло да бъде дисоциирано чрез алкалните условия в червата на инсекта и токсичния продукт би могъл да се освободи.

Друг метод за получаване на инсектицидни гени и въвеждането им в обект, който трябва да бъде защитен е описан в Cutler “Електропорация: Разработена за трансформиране на култури: Успех с потвърден образец на култура”, AG Biotech. News vol. 7(5) & 17 (1990). В тази статия е посочено, че ДНК може да бъде електропорирана директно в покълващ цветен прашец и че цветният прашец може да се постави обратно върху цветето, за да се образуват семена, които след това се развиват в трансформирани растения. Този метод е бил използван успешно при тютюневи растения, а също така може да бъде успешен при царевица и люцерна. Този метод може да бъде по-лесен, отколкото електропорацията на протопласти, тъй като основната цел е да се опрашат цветята, а цветовете по естествен път свършват работата, вместо да се регенерира растението. Методът се състои в събиране на цветен прашец, отглеждането му (покълване) в среда за развитие в продължение на 30-60 min, след което тръбичката на цветния прашец започва да излиза навън от поленовото зрънце, прибавяне на желаната ДНК към течната суспензия, съдържаща цветния прашец, прилагане на електрически шок, за да се отворят пори в тръбичката на прашеца, отмиване на излишната ДНК и поставяне на изменения цветен прашец върху близалцето на растението, след което се изчаква, докато се образуват семена. Това може да бъде един лесен метод за въвеждане на някакъв ген в културални растения.

В патент на US 4 861 595 от 1989 г. на Barnes и Edwardse е описана една допълнителна система на доставяне. Това изобретение се отнася до използването на обработени, по съ щество интактни микробни клетки, като система за доставяне на протеинови съединения на животни и хора. Микробните клетки първоначално произвеждат протеин вътреклетъчно чрез хомоложен ген. Продуциращият протеин микроб се обработва с химически или физически средства, докато клетката стане по същество интактна. Манипулацията на процеса на обработка води до получаване на непролиферационни обработени микробиални клетки без значителна загуба на активността на вътреклетъчното съединение. Тъй като клетката няма да се възпроизвежда и ще има здрава клетъчна стена, която може да бъде разчупена след това в желаното място от храносмилателната система на животното или човека, това създава възможност да се определи времето или да се планира освобождаването на продуктите, капсулирани съгласно посоченото изобретение. След подходяща обработка самата микробна клетка, продуцираща протеин, се използва като система за доставяне, така че не е необходимо никакво пречистване на полученото съединение. Който и да е протеин, полипептид, аминокиселина или съединение, вкл. инсектициди, които могат да се получат чрез микробни средства и начини, могат да бъдат използвани като изходен материал на изобретението.

Възможността от използване на ДНК технология за включване на синтетичен ген, който кодира невротоксин, намерен в отровата на скорпион, е описана от Carbonell и сътрудници, “Синтезиране на ген, кодиращ специфичен към дадени инсекти невротоксин на скорпион, и опити за неговото експресиране чрез използване на бакуловирусни вектори”, Gene 73:409-13 (1988). В тази статия е посочена възможността от използване на ДНК технология за инкорпориране (включване) на изкуствен ген, който кодира невротоксин, намерен в отровата на скорпион, Buthus eupeus в бакуловирусния геном, за да се подобрят бакуловирусните пестициди. Изследвани са три метода на експресия, като се използва полихедронова, базирана на промотор AcMNPV експресионна система за осъществяване на производството на токсин. Експресия на 36 кодон гена самостоятелно не осигурява произвеждане на токсина. Известен успех е постигнат с прикрепването на сигнален пептид към токсина. Значителни нива протеин се получават, когато токсиновият ген се свърже към N-терминала на поли хедронов ген. Производството обаче е десет до двадесет пъти по-малко, отколкото това се наблюдава за самия полихедрон. Не се счита, че ограничението на експресията е при нивото на транскрипция, а при пост-транскрипционното ниво, включващо транслация и стабилност на протеина. Не бе открита паралитична активност на токсиновите продукти.

В патент на ЕР 0431829 са описани трансгенетични растения, които ефективно експресират в своите клетки специфичен спрямо инсекти токсин на един инсектен хищник в количество, което е достатъчно да причини токсичност към определени инсекти, хранещи се с тъканите на растението. Описаният конкретен токсин е изолиран от отрова на скорпиона.

Освен това изследователите са изолирали токсини от отровата на паяци. В лит.източник Geren, “Невротоксини и некротоксини от отрова на паяк”, J. Toxicol.-Toxin Reviews 5(2):161-170 (1986) се описват невротоксини и некротоксини, като се предполага, че молекулите на отровата от паяк могат да осигурят модели за специфични инсектициди.

В патент на US 4 925 664 на Jackson и Parks от 1990 г. се описват методи за лечение на сърдечни и неврологични заболявания чрез прилагане на токсини, получени от паяците Agelenopsis aperta и Hololena curta. Токсините са ефективни също така и като специфичен калциев канал или като стимулиращи блокиращи средства за аминокиселинен рецептор, което може да бъде използвано спрямо инсекти и близки до тях вредители.

В ЕР 0 395 357 се описват полиамини и полипептиди, изолирани от отровата на паяка Agelenopsis aperta. Полиамините са антагонисти по отношение на стимулиращите аминокиселинни невротрансмитери. Полипептидите и един от полиамините блокират калциевите канали в живи клетки на различни организми. Предлага се използването на блокиращи калциевите канали средства при контрол на безгръбначни вредители.

В ЕР 0 374 940 се описват токсини, изолирани от отровата на паяка Hololena curta. Полипептидите са полезни като инсектициди и при фармацевтични препарати, например антагонисти спрямо калциев канал и глутамат.

В лит.източник Bowers и сътрудници, “Идентификация и пречистване на необратим пресинаптичен невротоксин от отровата на паяка Hololena curta, “Proc. Natl. Acad. Sci. 84:3506-3510 (1987) се описва протеинов невротоксин, изолиран от отровата на паяка Hololena curta и неговата инхибиция на невромускулната трансмисия (предаване) в ларви Drosophila. Авторите предполагат, че токсинът блокира пресинаптичните калциеви канали в двигателните канали при Drosophila.

В лит.източник Quistad et al., “Паралитични и инсектицидни токсини от паяк с фуниеобразна паяжина, Hololena Curta “Toxicon 29/ 3/:329-336 (1991), е описан пептид и десет куртатоксини, пречистени от отрова на паяка Hololena curta, и ефектът, когато се (инжектират) впръскват в ларви на ципокрили.

В лит.източник Stapleton et al., “Куртатоксини: Невротоксични инсектицидни полипептиди, изолирани от паяк с фуниеобразна паяжина Hololena curta”, J. Biol. Chem. 265/4/ :2054-2059 (1990), са описани три полипептидни невротоксина, изолирани от отровата на паяка Hololena curta, и ефектът по отношение на щуреца Acheta domestica.

В лит.източник Quickie и Usherwood, “Разширена, обобщена пестицидна група и списък на физико-химични и биофизични симпозиуми; Нови постижения в агрохимическата изследователна работа”, Pestic. Sci. 20:315 -317 (1987), се описват токсините, намиращи се в отровите на паразитните оси и в отровите на някои паяци, правещи кръгла паяжина, причиняват бърза парализа, когато се впръскват в инсектите. Авторите посочват, че токсините на паяка са блокиращи средства по отношение на рецепторите на затворените мембранни канали, селективни към даден катион, които взаимодействат с отворения канал, затварящ се от глутаматните рецептори на скелетните мускули на прелетния скакалец. Публикацията цитира токсини с ниско молекулно тегло в отровата на паяците Argiope и Araneus, както и токсин, изолиран от отровните жлези на паяка Joro, Nephila clavata.

Други изследвания се отнасят до свойствата на изолирани от отрова на паяк токсини, разкрили способността на факторите с ниско молекулно тегло, изолирани от отровата на паяк, правещ фуниеобразна паяжина, да се свързват обратимо с калциевите канали. В патент WO 89/07608 от 1989 г. на Cherksey et al. са описани тези активни фактори с ниско молекулно тегло, които се свързват обратимо към калциевите канали с достатъчна специфичност и афинитет за унищожаване проводимостта на калция в невроните и за да позволят изолиране и пречистване на структурите на калциевите канали. Установено е, че тези отрови са токсични спрямо бозайниците.

Други приложения на отровите на паяк са описани в Jackson и Parks “Токсини на паяци: Последни приложения в невробиологията” Ann Rev Neurosci 12:405-14 (1989). В тази статия е посочено, че съществува голяма хетерогенност в токсините на различните таксономии. Признава се, че експериментите показват специфични свойства на калциевите канали, в зависимост от видовете, и че отровата от паяк може да осигури антагонисти на калциевите канали. Установено е, че дискутираните отрови от паяк оказват влияние върху безгръбначни. Статията също така определя отровите от паяк като възможен източник на специфични токсини спрямо инсекти за приложение в земеделието.

В лит.източник Adams и сътрудници, “Изолиране и биологична активност на синаптични токсини от отровата на паяк, правещ фуниеобразна паяжина, Agelenopsis Aperta” в Insect Neurochemistry and Neurophysiology 1986, Borkovec and Gelman eds., Hamana Press, New Jersey 1986 се посочва, че редица пептидни токсини, които антагонизират синаптичната трансмисия (предаване) в инсекти, са били изолирани от паяка Agelenopsis aperta.

В патент на US 4 855 405 от 1989 г. на Yoshioka et al. се описва рецепторен инхибитор, получен от отровните жлези на паяка Joro, както и метода за неговото получаване. Съединението има инсектициден ефект, когато инсектите са в контакт със съединението, носено от течен или твърд носител.

В патент на US 4 918 107 от 1990 г. на Nakajima et al. се описва съединение, което има инхибираща активност спрямо глутаматния рецептор, метод за получаването на това съединение и инсектициден състав, съдържащ същото съединение. Съединението се носи в течен или твърд носител с прибавен диспергиращ агент и се прилага директно към растението или към животното, които трябва да бъдат защитени. Ниска доза е ефективна като инсектицид и има много ниска токсичност спрямо бозайници и риба и малко неблагоприятно влияние върху околната среда.

Изследвана е също така употребата на бакуловируси като биоинсектициди. Основният недостатък на дивия вид бакуловируси при използването им като биоинсектициди е, че те са бавнодействащи. Ларвите, които поемат дивия вид бакуловируси, обикновено умират след 5 до 7 дни. През този значителен период от време заразените ларви продължават да се хранят и може да настъпи значително увреждане на културите.

Поради комбинирането на проблемите, свързани с някои синтетични инсектициди, включващи токсичност, рискове по отношение на околната среда и загубване на ефикасността, поради резистентност, съществува непрекъсната нужда от разработването на нови средства и начини за контрол на безгръбначни, вкл. разработването на рекомбинантни бакуловируси чрез генното инженерство, които експресират протеинови токсини, способни да направят недееспособен гостоприемника по-бързо, отколкото бакуловирусната зараза per se.

Същност на изобретението

Съгласно изобретението се осигурява нов инсектицидно ефективен пептид, значително пречистен и изолиращ се от отрова на паяк, и неговите соли, приемливи в земеделието и градинарството.

Счита се, че инсектицидно ефективните пептиди съгласно изобретението имат по-висока степен на селективност за безгръбначни, по-специално инсекти. Освен това, инсектицидно ефективните пептиди съгласно изобретението показват, че са по-високо ефективни инсектициди спрямо важни за земеделието вредители и по този начин се счита, че представляват важен принос в областта на контролирането на безгръбначни вредители.

Допълнително съгласно изобретението се осигурява нова значително изолирана ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отрова на паяк Diguetia.

Настоящото изобретение осигурява също така и нов рекомбинантен експресионен вектор, съдържащ ДНК последователност, която кодира инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отрова на паяк Diguetia, като векторът е способен да осъществи ек спресията на посочената кодираща последователност в трансформирани клетки.

В допълнение съгласно изобретението се осигуряват нови рекомбинантни клетки на гостоприемник, трансформирани или пресечени с ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отрова на паяк Diguetia по начин, създаващ възможност на клетката на гостоприемника да експресира посочения пептид.

Допълнително съгласно изобретението се осигурява нов рекомбинантен бакуловирусен експресионен вектор, способен да изрази или експресира ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отровата на паяк Diguetia в гостоприемник или в клетка на инсект гостоприемник.

Допълнително съгласно изобретението се осигурява нов метод за получаване на инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отровата на паяк и пептид, получен по този начин. Методът включва етапите на култивиране на рекомбинантни клетки на гостоприемник, като един рекомбинантен експресионен вектор, трансформиран или прекъснат в клетките на гостоприемник, има ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се .от отровата на паяк Diguetia, като посоченият вектор е способен да осъществи експресията на кодиращата последователност в трансформираните клетки, а инсектицидно ефективният пептид се извлича от рекомбинантната клетъчна култура от гостоприемник.

Допълнително съгласно изобретението се осигурява ново, трансгенетично растение, съдържащо ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отровата на паяк Diguetia, която ДНК последователност се вмъква в зародишната линия на посоченото растение или в негов предшественик, така че характерната черта на експресията на посочената ДНК последователност се унаследява от следващите поколения на третираното растение чрез полово размножаване или чрез безполово размножаване.

Допълнително съгласно изобретението се осигурява нов метод за контрол на безгръбначни вредители, който включва контак туване на споменатите вредители с ефективно количество от инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отровата на паяк Diguetia, и негови соли, приемливи в земеделието или в градинарството.

Допълнително съгласно изобретението се осигурява нов метод за контрол на безгръбначни вредители, който включва контактуване на споменатите вредители с рекомбинантен бакуловирус, способен да експресира ефективно количество от инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отровата на паяк Diguetia, и неговите приемливи в земеделието или в градинарството соли.

Допълнително съгласно изобретението се осигурява нов инсектициден състав, съдържащ инсектицидно ефективно количество от инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отровата на паяк Diguetia, и неговите приемливи в земеделието или в градинарството соли заедно с приемлив за земеделието или градинарството негов носител.

Допълнително съгласно изобретението се осигурява ново антитяло, по същество имунореакционоспособно, с инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отровата на паяк Diguetia, и неговите приемливи в земеделието или в градинарството соли.

Допълнително съгласно изобретението се осигурява нов метод за използване на антителата на това изобретение за откриване наличието на инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отровата на паяк Diguetia, включващ етапите на получаване на отрова от паяк; контактуване на отровата на паяка със споменатите антитела, свързани (спрегнати) към маркировка за откриване; и откриване на белязаните антитела, свързани към споменатия пептид.

Допълнително съгласно изобретението се осигурява нов метод за използване на антителата на това изобретение за пречистване на инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отрова на паяк Diguetia, включващ етапите на свързване на антитялото към твърда подложка; контактуване на разтвор, съдържащ пептида с антитялото, свързано към твърдата подложка, като по този начин пептидът, намиращ се в разтвора, се прикрепва към антитялото, отделяне на пептида, прикрепен към антитялото, свързано към твърдия носител (подложка), и събиране на пречистения пептид.

Допълнително съгласно изобретението се осигурява нова проба на ДНК, получена от ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отрова на паяк Diguetia.

В допълнение съгласно изобретението се осигурява нов метод за откриване наличието на нуклеинова киселина, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отровата на паяк Diguetia, включващ етапите на получаване на нуклеинови киселини от паяк; контактуване на споменатите нуклеинови киселини с ДНК пробата на това изобретение и откриване на споменатата проба, свързана към споменатата нуклеинова киселина.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 изобразява RP HPLC (високоефективна течна хроматография с обратна фаза) на общата отрова от паяка Diguetia Canities, като се използва градиент 0,1% TFA към ацетонитрил, показвайки три групи компоненти, тестувани при мускатов орех. Фракция 2 представлява TBW активните компоненти.

Фигура 2 показва DK 9,2, тестуван при 1 μΜ по отношение на синаптична трансмисия (предаване) при Schaffer колатерален-СА 1 пирамидален клетъчен синапс в хипокампални слоеве при плъх. Изобразените данни представят максималните отчитания на популацията при осреднено време /а/ за 5 min преди прибавянето на DK 9,2 и /б/ през интервал от 15-20 min след прибавянето на DK 9,2. Тези отчитания са идентични, което показва, че при тази концентрация DK 9,2 няма активност при плъх CNS, която да може да бъде открита при този опит.

Фигура 3 представлява карта на pWR9, един бакуловирусен преносим вектор, носещ гена, който кодира npeDK 9,2.

Фигура 4 представя един опит на непрекъснато хранене на вирус при тютюнева пъпка (1000,000 PIB/g диета).

Фигура 5 изобразява способността на ТТХ да предпазва или да променя предизвикано от DK 9,2 разпукване.

А. Дефиниции

Както е използван тук, изразът “инсектицидно ефективен пептид, по същество изо лиращ се от отрова на паяк Diguetia” включва инсектицидно ефективни пептиди, както и инсектицидно ефективни фрагменти от пептидите от всякакъв източник, доколкото пептидът е могъл да бъде изолиран по същество от Diguetia посредством която и да е от техниките, известни на специалистите. Такива източници са например рекомбинантно получени инсектицидно ефективни пептиди.

Както е използван тук, терминът “експресионен вектор” включва вектори, които са способни да експресират ДНК последователности, включени в тях, където такива последователности са оперативно свързани към други последователности, способни да осъществят тяхната експресия. Подразбира се, въпреки че не винаги се твърди конкретно, че тези експресионни вектори трябва да бъдат възпроизводими в организми гостоприемници или като епизоми или като неразделна част от хромозомната ДНК. Ясно е, че липсата на възпроизводимост би ги направила ефективно неоперативни. Обобщено, изразът “експресионен вектор” представлява една функционална дефиниция и всяка ДНК последователност, която е способна да осъществи експресия на един специфичен ДНК код, разположен в нея, е включен в този термин, като същият се прилага към специфичната последователност. Обикновено, използваните експресионни вектори в рекомбинантните ДНК техники често са във вид на “плазмиди”, които се отнасят до пръстеновидни двойно усукани ДНК, които в тяхната векторна форма не са свързани към хромозомата. “Плазмид” и “вектор” се използват заменяемо, като плазмидът е най-общоизползваната форма на вектор. Обаче, съгласно изобретението са включени и такива форми на експресионни вектори, които изпълняват еквивалентни функции и които последователно стават известни в практиката.

“Рекомбинантни клетки на гостоприемник” се отнасят до клетки, които са били трансформирани с вектори, създадени, като се използват рекомбинантни ДНК техники.

Паяците от семейство Diguetidae съставляват единствен род, Diguetia. Diguetia species обикновено се намират в югозападните Съединени щати (включително Калифорния) и Мексико. Тези малки паяци изплитат обширни паяжини с неправилна форма върху всякакъв вид растения и храсти, включително и върху кактуси.

Различните видове Diguetia са подобно на повечето паяци хищници, които с охота се хранят с връхлетяли ги инсекти.

Въпреки че изобретението не се ограничава до определени теоретически доводи, необикновената симптоматология, наблюдавана при впръскване на инсектицидно ефективните пептиди от изобретението в инсекти, е много подобна на симптомите, наблюдавани, когато се впръска вератридин, един алкалоиден активатор на Na⁺ канал или токсини от скорпион от семейство Buthidae и рода Buthus, известни като пресинаптични активатори на Na* канал. Предполага се, че посочените инсектицидно ефективни пептиди могат да причинят частична деполяризация на мускулните и/или нервните мембрани, възможно влияейки на Na⁺ или К⁺ канали. По-специално, очаква се, че инсектицидно ефективните пептиди причиняват повтарящо се експлозивно разтоварване в нервите, които са чувствителни към блокиране от тетродотоксин. Така вероятно чувствителните на напрежение натриеви канали на мембраните на нервите е мястото на действие на тези пептиди.

Б. Изолиране на пептиди от отрова на Diguetidae

Отрова от паяк може да бъде отделена от Diguetia, посредством който и да е известен метод, като екстракция от жлеза на паяк от цефалоторакс. С оглед обаче да се избегнат примеси с отровата на паяка и изолираните токсини, за предпочитане отровата на паяка се получава чрез електрическа стимулация на паяка, за да се причини освобождаване на отровата и последващо всмукване на освободената отрова, и предотвратяване замърсяването на отровата чрез изтичане назад или с хемолимфа, както е описано в патент на US 4 925 664.

След като се получи отровата от паяка чрез техниките на електрическо дозареждане, същата може да бъде фракционирана на нейните пептидни (токсинови) компоненти, като се използва високоефективна течна хроматография (“HPLC”) или хроматография с гелна филтрация или чрез други полезни методи на фракциониране. В допълнение, често е желателно за крайно фракциониране на отровата от паяк да бъде извършена високоефективна течна хроматография (HPLC).

Така, както се използва методът на елек трическо дозареждане, от паяка, свързан с хроматография с гелно филтруване и/или с течна хроматография с висока ефективност или други подобни техники, такива като хроматография с хидрофобно взаимодействие, е възможно да се получат значително пречистени токсини от паяк. Установено е, че и други еквивалентни техники също могат да бъдат използвани в обхвата на настоящото изобретение, за да се изолират токсини от паяк. Така изолираните токсини могат да бъдат оценени за аминокиселинна последователност и инсектицидна активност чрез познати на специалистите в тази област методи.

В. Инсектицидно ефективни пептиди Настоящото изобретение в един от аспектите си осигурява инсектицидно ефективен пептид и негови инсектицидно ефективни фрагменти, по същество пречистен и изолиращ се от отрова на паяк Diguetia, и неговите приемливи за земеделието или градинарството соли.

След изолирането на инсектицидно ефективната съдържаща пептид фракция и след като е пречистена, както е описано съгласно изобретението, определянето на аминокиселинната последователност може да бъде извършено по който и да е известен на специалистите в тази област начин, като например N-терминална аминокиселинна последователност и използването на автоматизиран секвентор на аминокиселини.

Възможно е други инсектицидно ефективни протеини също да бъдат включени в обхвата на изобретението, т.е., предполага се, че други инсектицидно ефективни пептиди е възможно да бъдат изолирани от Diguetia, освен подробно описаните тук три пептида. Следващото се отнася до семейство инсектицидно ефективни протеини, изолирани от Diguetia. Членове от това семейство инсектицидно ефективни пептиди, изолирани от Diguetia, имат следните характеристики:

1) Размер: при всички варира приблизително между 6200 до 7200 D и дължината на аминокиселинната верига варира от около 55 до около 65 аминокиселини;

2) запазен аминокиселинен терминал: SEQ ID NO: 1, 3 и 5 са идентични за първите пет аминокиселини;

3) SEQ ID NO: 1, 3 и 5 имат повече от 40% хомоложна последователност;

4) SEQ ID NO: 1, 3 и 5 имат около 7 или 8 цистеинови остатъци;

5) Групиране на гени: гените за повече от един от тези токсини изглежда са сълокализирани участъци на геномна ДНК, като е възможно всичките тези гени да произлизат от един единствен наследствен ген.

По-специално, три инсектицидно ефективни пептиди са изолирани и охарактеризирани. Първият, DK 9,2, е изолиран и неговата аминокиселинна последователност, както е разтълкувана от изолираната сДНК, изглежда, както е определена в SEQ ID N0:1. Данните от масова спектроскопия показват два изозима. съдържащи една запазваща субституция (заместване) при позиция 26. Единият изозим съдържа треонин при позиция 26, а другият съдържа глутамин при позиция 26. Глутаминовият изозим е с около 27 атомни масови единици по-голям, отколкото треониновият изозим. По-нататък в описанието всяко цитиране на DK 9,2 трябва да се интерпретира като цитиране на който и да е и/или и на двата изозима. DK 9,2 се характеризира с молекулно тегло около 6371-6397 D, както е определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза. Вторият пептид, DK 11, е изолиран и се характеризира с молекулно тегло около.6700 D или около 6740 D, както е определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза. По-специално тази активна фракция на високоефективната течна хроматография (HPLC) е идентифицирана, че има аминокиселинна последователност, както е разтълкувано от изолираната сДНК и както е показано в SEQ ID N0:3. Накрая, трети член на това инсектицидно ефективно протеиново семейство, DK 12, е охарактеризиран чрез молекулно тегло около 7100 D или около 7080 D, както е определено чрез масова спектрометрия, и се придвижва като единичен пик върху течна високоефективна хроматография с обратна фаза. По-специално, тази активна фракция експериментално показва, че има аминокиселинна последователност, както е показано в SEQ ID N0:5. Трите изолирани пептида, съответстващи на SEQ ID NOS: 1, 3 и 5, проявяват по същество еднаква инсектицидна активност. Очаква се, че другите пептиди, имащи около до 65 аминокиселини, по-голяма от 40% хомоложна последователност с SEQ ID NOS: 1, 3 и 5, и приблизително 7 или 8 цистеинови остатъка ще проявяват по същество същата инсектицидна активност. Такива пептиди могат да съществуват в природата или могат да бъдат получени чрез методи на рекомбинантна ДНК техника, познати на специалистите в тази област. Такива пептиди, независимо дали са естествено срещащи се или са получени рекомбинантно, се считат като включени в обхвата на това изобретение.

Г. Идентификация на кодиращата последователност на инсектицидно ефективните пептиди на това изобретение.

В друг аспект настоящото изобретение осигурява по същество изолирана ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиран от отровата на паяк Diguetia.

Като се използват данните за частичната аминокиселинна последователност, получена, както е описано по-горе, гените, отговорни за произвеждането на протеини, изолиращи се от паяк, могат да бъдат изолирани и идентифицирани. На разположение са редица методи за получаване на гени, отговорни за произвеждането на пептид. Примери за такива методи са Fuqua et al. “Asimple PCR method for detection and cloning low abundant transcript”, Biotechnique, Vol. 9, No. 2 (Aug 1990); Frohman, M.A., “RACE: Rapid amplification of cDNA ends”, PCR protocols, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, CA (1990) и патент на US 4 703 008 “DNA Sequences Encoding Erythropoietin”, който патент е включен тук чрез референция.

Накратко, синтезира се една ДНК молекула, която кодира определената аминокиселинна последователност или която представлява допълнителната ДНК нишка към такава ДНК молекула, която кодира определената аминокиселинна последователност. Тази синтетична ДНК молекула може да се използва след това за проба за хомоложната ДНК последователност в клетъчни клонове, съдържащи рекомбинантни ДНК молекули, които включват отчасти ДНК последователности, получени от геномна ДНК на даден организъм, например от паяк или пък получени от сДНК копия на ДНК молекули, изолирани от клетки или тъкани на даден организъм, като например от паяк. Обикновено са необходими ДНК моле кули с петнадесет /15/ нуклеотида или повече за уникална идентификация на хомоложна ДНК, като споменатият брой изисква уникално определение на най-малко пет /5/ аминокиселини в една последователност. Ще бъде оценено, че броят на различните ДНК молекули, които могат да кодират определената аминокиселинна последователност, може да бъде много голям, тъй като всяка аминокиселина може да бъде кодирана до шест /6/ уникални тринуклеотидни ДНК последователности или кодони. Следователно, не е практично да се тестуват всички възможни синтетични ДНК проби поотделно и се използват като проби сборове от няколко такива ДНК молекули едновременно. Получаването на такива сборове или пулове, които се цитират като “дегенератни” проби е добре известно в практиката. Ще бъде оценено също така, че докато само една ДНК молекула в пробната смес ще има точна хомоложна последователност за гена, обект на интерес, то няколко от синтетичните ДНК молекули в пула могат да бъдат способни на уникално идентифициране на споменатия ген, тъй като се изисква само висока степен на хомология. Освен това, успешно изолиране на гена, представляващ интерес, може да бъде извършено със сборове или пулове от синтетични ДНК проби, които не съдържат всички възможни ДНК пробни последователности. Обикновено кодони, които се използват рядко от организма, не е нужно да бъдат представени в пробния пул. Фактически една единична последователност на ДНК проба може да бъде получена чрез включване само на ДНК кодоните, които най-често се използват от организма за всяка аминокиселина, въпреки че ще бъде преценено, че това постижение не винаги е успешно.

Съгласно една техника на идентифициране на генна последователност (секвенция) се използва полимеразната верижна реакция (PCR). Виж например патенти на US 4 683 195 и 4 683 202, които са включени тук чрез референция. PCR полимеразната верижна реакция създава възможност за получаването на избрана ДНК последователност, когато двете терминални части на секвенцията са известни. Примерни или олигонуклеотидни проби се получават, които съответстват на всеки край на последователността (секвенцията) обект на интерес. Както се използва PCR, централна та част на ДНК последователността се получава след това синтетично.

При един такъв метод с използване на PCR за получаване на гена, който кодира уникалния ген на отровата на паяк, РНК се изолира от паяка и се пречиства. Олигонуклеотид, имащ за край деокситимидилат се използва след това като пример, за да се превърне РНК на паяка в сДНК. След това се получава една синтетична ДНК молекула или смес от синтетични ДНК молекули, както при дегенератната проба, описана по-горе, която може да кодира аминотерминалната аминокиселинна последователност на протеина на отровата, както е определено преди това. Тази ДНК смес се използва заедно с олигонуклеотида, окончаващ с деокситимидилат, за да започне PCR реакция. Тъй като използваната синтетична ДНК смес за започване на PCR реакцията е специфична за желаната мРНК последователност, само желаната сДНК ще бъде ефективно уголемена. Полученият продукт представлява увеличена сДНК, която може да бъде свързана, към който и да е от редицата известни клониращи вектори. Ще бъде преценено, че в отровата на паяците могат да съществуват “семейства” от пептиди, които ще имат подобни аминокиселинни последователности и че в такива случаи използването на смесени олигонуклеотидни примерни последователности може да доведе до увеличаване на един или повече от близките сДНК, кодиращи тези сродни пептиди. Гените, кодиращи сродни пептиди, са също в обхвата на изобретението, тъй като сродните пептиди също имат полезни инсектицидни активности.

Накрая, получената сДНК последователност може да бъде клонирана в подходящ вектор, като се използват познати техники, анализира се и се определя нукелотидната базова последователност. ДНК последователностите, кодиращи инсектицидно ефективни протеини, са представени например в SEQ ID NO : 2 и 4. Едно директно тълкуване на аминокиселините на тези PCR продукти ще покаже, че те съответстват на завършената кодираща последователност за зрелия протеин.

В допълнение към сДНК кодиращата зряла DK 9.2, сДНК последователността по принципа на противотока на DK 9.2 кодиращата последователност се клонира и секвенира /SEQ ID NO :7/. Тълкуването на завърше ната тРНК показва, че DK 9.2 е синтезиран като един прекурсорен протеин, съдържащи сигнален пептид, пропептид и зрял токсин. Действието на сигналния пептид се счита, че е важно аз целевата секреция на синтезиран полипептид. Сигналната последователност играе важна роля при осигуряване на подходящата локализация на новосинтезирания протеин. Главно тя осигурява “топогенни сигнали” / Blobel, G.Proc.Nat.Acad.Sci., USA 77, 1496 - 1500 (1980), чиято задача е да прикрепят протеиновата последователност към различни местоназначения вътре в клетката или към външната страна на клетката. Това е особено важно за секретирани протеини, чиито сигнални места са извън клетката. Сигналната последователност е от полза също така и при производството на рекомбинантен протеин, тъй като може по-лесно да бъде пречистен експресираният протеин от извънклетъчната среда, вместо да трябва да се разтворят клетките и да се пречиства от общия клетъчен екстракт. Кодираният сигнален пептид от сДНК, кодираща за прекурсорния протеин на DK 9.2, се счита, че се състои от 17 аминокиселини с последователност:

-Leu-Glu-Glu-Arg-Leu-Asp-Lys-Asp-Ala-Asp-Ile -Met-Leu-Asp-Ser-Pro-Ala-Asp-Met-Glu-ArgMet-Lys-Val-Phe-Val-Val-Leu-CysLeu-Ser-Leu-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala В допълнение към сигналния пептид, разчитането на тРНК, разположена по принципа на противотока на DK 9.2 кодиращата последователност, показва един пропептид. Действието на пропептидната последователност е неизвестно. Пропептидът е един пептид с 21 аминокиселини с последователност: -Leu-Gly-Glu-Arg-Leu-Asp-Lys-Asp-Ala-Asp-Ile -Met-Leu-Asp-Ser-Pro-Ala-Asp-Met-Glu-ArgТези прекурсорни пептиди или препросеквенцията, могат да допринесат много за стабилността, експресията и дублирането на DK 9.2 или други рекомбинантни протеини, когато се експресират in vivo и/или in vitro. Предвижда се също така, че тези последователности или техни части биха могли да бъдат от полза при експресията на други молекули, например при конструиране на даден ген. Като част от това изобретение са и осигурените от нас данни, които да потвърдят, че и други сигнални и/или пропептидни последователности биха могли да бъдат използвани за експресията на рекомбинантен DK 9.2.

Д. Рекомбинантната експресия

Настоящото изобретение осигурява в допълнение рекомбинантен експресионен вектор, съдържащ ДНК последователност, която кодира инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиран от отрова на паяк Diguetia. Векторът е способен да осъществи експресията на кодиращата последователност в трансформирани клетки. Изобретението осигурява също така и рекомбинантни клетки от гостоприемник, трансформирани или трансфектирани с ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отрова на паяк Diguetid по начин, даващ възможност за клетката гостоприемник да експресира пептида.

Осигуряването на подходяща ДНК последователност, кодираща желания протеин, позволява производството на протеина, като се използват известни в практиката техники, кодиращата последователност може да бъде получена чрез подобряване на сДНК или геномна последователност от естествен източник на протеин или може да бъде получена по изкуствен начин, като се използва точната аминокиселинна последователност, определена от нуклеотидната последователност на гена. Когато кодиращата ДНК се получава синтетично е благоприятно да се вземе познат предпочитан кодон от гостоприемника, който се възнамерява да се използва.

Експресионните системи, съдържащи нужните контролни секвенции /или последователности/, например като промотори и за предпочитане усилватели и терминационни контроли са лесно достъпни и познати в практиката за различни гостоприемници. Виж например, Sambrook и сътрудници, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989).

Така, желаните протеини могат да бъдат получени както в прокариотични, така и в еукариотични системи, в резултата на което, в случая с много протеини се получава един спектър от обработени форми.

Най-широко използваната прокариотична система запазва E.coli, въпреки че други системи, като например B.subtilis и Pseudomonas се очаква също да бъде от полза. Подходящи контролни последователности за прокариотични системи включват както конститутивни, така и индуциращи промотори, включващи Lac промотора, trp промотора, хибридни промотори като например tac промотора и Lambda phage Pl промотор. Обикновено могат да се получат чужди протеини в тези гостоприемници или като сливане или като зрели протеини. Когато желаната последователност се получи като зрели протеини, получената последователност може да бъде предхождана от метоинин, който не е необходимо да бъде отстранен. Съответно, пептидите и протеините, за които се претендира тук, могат да бъдат предхождани от N-краен терминален Met, когато се получават в бактерия. Освен това, могат да бъдат направени структури, където кодиращата последователност за пептида се предхожда от оперативен сигнален пептид, което води до секрецията на протеина. Когато се произвежда в прокариотични гостоприемници по този начин, сигналната секвенция се отстранява при секрецията.

На разположение са понастоящем найразлични еукариотичин гостоприемници за произвеждане на рекомбинантни чужди протеини. Както в бактерията, еукариотичните гостоприемници могат да бъдат трансформирани с експресионни системи, които произвеждат желания протеин директно, но по-общоприето е осигуряването на сигналните последователности, за да се повлияе от секреция. та на протеина. Еукариотичните системи имат едно допълнително предимство, че те са в състояние да обработват интрони, които могат да се срещнат в геномните последователности, кодиращи протеини на висши организации. Еукариотичните системи осигуряват също така различни механизми на обработване, което води до например до гликозилация, оксидация /окисляване/ или дериватизация на някои аминокиселинни остатъци, структурен контрол и т.н.

Общоизползваните еукариотични системи включват дрожди, клетки от инсекти, клетки от бозайници, птичи клетки и клетки от висши растения. Изброяването не е изчерпателно. На разположение са подходящи промотори, които са съвместими и работоспособни при употреба във всеки от тези типове гостоприемници, а така също са терминационни секвенции и усилватели, например като бакуловирусния полихедринов промотор. Както е посочено по-горе, промоторите могат да бъдат конститутивни или индуциращи се. Например в системи на бозайници, МТП промоторът може да бъде индуциран чрез прибавянето на йони на тежки метали.

На специалистите в тази област са известни подробностите за изграждането на експресионни системи. За рекомбинантното произвеждане на протеин ДНК кодирането е подходящо да се свърже вътре в експресионната система по избор и след това системата се трансформира в съвместимия гостоприемник, който след това се отглежда и поддържа при условия, при които се извършва експресията на чуждия ген. Така полученият инсектицидно ефективен протеин на това изобретение се извлича от културата или чрез лизиране /разлагане/ на клетките или от културалната среда, както е подходящо и известно на специалистите в тази област.

Ясно е, че минимални модификации на първоначалната аминокиселинна последователност може да доведе до получаване на протеини, които имат по същество еквивалентна или засилена активност, в сравнение с пептидите, експериментирани тук. Тези модификации могат да бъдат предварително обмислени, като например мутагенезис, насочван през определено място или пък модификациите могат да бъдат случайни, като например чрез мутации в гостоприемника, който произвежда пептдита от изобретението, като всички тези модификации са включени дотолкова, доколкото инсектицидната активност е запазена. “Мутацията” в даден протеин променя неговата първоначална структура /отнася се до естествено срещащ се или специфично описан протеин/, което се дължи на промените в нуклеотидната последователност на ДНК, която го кодира. Тези мутации специфично включват алелни варианти. Мутационните промени в първоначалната структура на даден протеин, могат да бъдат получени в резултат на премахване, прибавяне или заместване. “Премахване” е определено като един полипептид, в който един или повече вътрешни аминокиселинни остатъка липсват.’’Прибавяне” е определено като полипептид, който има един или повече допълнителни вътрешни аминокиселинни остатъка, в сравнение с дивия тип. “Заместване” се постига чрез заместване на един или повече аминокиселинни остатъка с други остатъци. “Протеинов фрагмент” означава полипептид, съдържащ първоначална аминокиселинна последователност, която е идентична на една част от първоначалната последователност на протеина, към който се отнася полипептидът.

Предпочитани “замествания” са тези, които са консервативни, т.е. където даден остатък се замества с друг от същия основен тип. Ясно е, че естествено срещащите се аминокиселини могат да бъдат класифицирани в подкласове, например киселинни, алкални, неутрални и полярни и неутрални и неполярни и/ или ароматни. Обикновено се предпочитат тези кодирани пептиди, които се различават от естествените форми, съдържащи заместени кодони за аминокиселини, които са от същата група, както тези на заместената аминокиселина.

Главно алкалните аминокиселини Lys и His са взаимозаменяеми; киселинните аминокиселини Asp и С1у са взаимозаменяеми; неутралните полярни аминокиселини Sreq Thr, Cys, Gin и Asn са взаимозаменяеми; неполярните алифатни киселини Gly, Ala, Vai, Vai, lie и Leu са консервативни по отношение една към друга /но поради размера, Gly и Ala са по-близко свързани и Vai, Пе, и Leu са поблизко свързани/ и ароматните аминокиселини Phe, Trp и Туг са взаимозаменяеми.

Макар че Pro е неполярна неутрална аминокиселина, същата представлява трудност, доради нейното влияние върху конформацията и заместване със или вместо Pro не се предпочитат, с изключение когато могат да се получат същите или подобни конформационни резултати. Полярни аминокиселини, които представляват консервантивни промени, включва Ser, Thr, Gin, Asn; и до по-малка степен Met. В допълнение, въпреки че са класифицирани в различни категории, Ala, Gly и Ser изглежда че са взаимозаменяеми и Cys допълнително отива в тази група или може да бъде класифициран с полярните неутрални аминокиселини. Някои замествания с кодони за аминокиселини от различни класове могат също де бъдат от полза.

Поради осигуряването на рекомбинантни материали за протеините за изобретението, тези протеини могат да бъдат получени чрез рекомбинантна техника, както и чрез автоматизирани синтезатори на аминокиселини. Поради разнообразието от посттрансланционни характеристики, дадени от различни клетки гостоприемници, се получават също и различни модификации на естествено срещащите се протеини. Един “модифициран” протеин се различава от немодифицирания в резултат от посттранслационни случаи, които променят гликозилацията, амидацията, или модела на липидация или на първичната, вторичната или третичната структура на протеина и са включени разбира се в обхвата на изобретението, както е претендирано.

Би трябвало да бъде отбелязано освен това, че ако посочените тук протеини, такива като SEQ ID No:l, са получени синтетично, може да бъде направено заместване с аминокиселини, които не са кодирани от гена. Алтернативни остатъци включват например аминокиселините с формулата H₂N/CH₂/n СООН, в която η е 2-6. Те са неутрални неполярни аминокиселини, например саркозин /Sar/,T-6yтилаланин /t-BuAla/, т-бутилглицин /t-BuGly/, N-метил изолевцин /N-Melle/ и норлевцин / Nleu/, Фенилглицинът например може да бъде заместен с Тгр, Туг или Phe, ароматна неутрална аминокиселина; цитрулин /Cit/ и метинонинсулфоокис /MSO/ са полярни, но неутрални, циклохексилаланин /Cha/ е неутрален и неполярен, цистеиновата киселина / Суа/ е киселина и орнитин /Огп/ е алкален, Конформацията, даваща свойствата на пролиновите остатъци, може да бъде получена, ако един или повече от тези остатъци е заместен с хидроксипролин Нур/,

Е. Трансгенетични растения

Изобретението в допълнение осигурява трансгенетични растения, съдържащи ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отрова на паяк, въведена в генетичната линия на растението, така че характерните черти на експресия на ДНК последователността се унаследяват от следващите поколения на растението чрез полово размножаване или безполово размножаване.

Гените, кодиращи инсектицидно ефективните пептиди съгласно изобретението, могат да бъдат въведени в растението чрез техниките на генното инженерство, които при производството на пептида в клетките на растението се очаква да бъдат полезни като средство за контролиране на вредни насекоми. Освен това, възможно е да се получи растение, което по-лесно понася насекомите, отколкото естес твено срещащите се видове.

Кодиращият участък на инсектицидно ефективния пептиден ген, който може да бъде използван за трансформиране на растението, може да бъде цялата дължина или частична активна дължина на гена. Необходимо е обаче генетичната последователност, кодираща за пептида, да бъде експресирана и да се получи като един пептид в получената растителна клетка. Счита се, че ДНК от геномна ДНК и сДНК, така и от синтетична ДНК, кодираща инсектицидно ефективен пептид, може да бъде използвана за трансформация. Освен това, един гена може да бъде конструиран частично със сНДК клон, частично с геномен клон и частично със синтетичен ген и различни комбинации от тях. В допълнение ДНК, кодираща за пептиден ген, може да съдържа части от различни видове, различни от източника на изолирания пептид.

Освен това, очаква се инсектицидно ефективният пептид да може да бъде комбиниран с друго съединение или съединения, за да се получат неочакваните инсектицидни свойствата в трансформираното растение, съдържащо химерни гени, които експресират съединенията. Тези други съединения могат да включват протеазни инхибитори, като например такива, които имат орална токсичност спрямо и.нсекти или полипептиди от Bacillus . thuringiensis. Протеинът от B.thuringiensis причинява изменение в пропускливостта на калия в клетъчната мембрана на червото на инсекта и се предполага, че образува малки пори в мембраната. Други образуващи пори протеини също биха могли да бъдат използвани в комбинация с инсектицидно ефективните пептиди. Примери на такива образуващи пори протеини са магаините, цекропините, атацините, меитин, грамицидин S, протеини на натриевите канали и синтетични фрагменти, атоксинът на Staphylococcus aureus аполипопротеини и техни фрагменти, аламетицин и различни синтетични алифатни пептиди. Пектините, които се свързват към клетъчните мембрани и усилват ендоцитозата, са друг клас протеини, които биха могли да бъдат използвани в комбинация с инсектицидно ефективните пептини от изобретението, за да се модифицират генетично растенията за устойчивост спрямо инсекти.

Очаква се промоторът на пептидния ген да бъде полезен при експресиране на химерната генетична последователност, но се очаква също така и други промотори да бъдат от полза. Един ефикасен растителен промотор, който може да бъде полезен, е свръхпродуциращият промотор. Този промотор се свързва оперативно с генетичната последователност за пептида и би трябвало да бъде способен да спомага експресията на пептида, така че трансформираното растение да има повишена устойчивост към вредните инсекти. Свръхпродуциращите растителни промотори, които се очаква да бъдат полезни в това изобретение са известни.

Химерната генетична последователност, съдържаща инсектицидно ефективен пептиден ген, оперативно свързан към даден промотор, може да бъде свързана в подходящ клониращ вектор, за да се трансформира желаното растение. Обикновено плазмидни или вирусни / бактериофаг/ вектори, съдържащи възпроизвеждаща и контролна последователност, произлизат от видове, съвместими с използваната клетка гостоприемник. Клониращият вектор обикновено носи едно възпроизвеждащо начало както и специфични гени, които са способни да осигурят фенотипичните селектионни белези в трансформираните клетки гостоприменции, типично устойчиви на антибиотици. Трансформиращите вектори могат да бъдат подбрани чрез тези фенотипични белези след трансформация в клетка гостоприемник.

Клетки гостоприемници, които се очаква да бъдат полезни, са прокариоти, вкл. бактериални гостоприемници, като например Е.соli, Salmonella ryphimurium u Serratia marcesens; и еукариотични гостоприемници, такива като дрожди или нишковидни гъби.

Клониращият вектор и трансформираната клетка гостоприемник с вектора се използват главно за увеличаване броя на копията на вектора. С увеличения брой копия векторите, съдържащи пептидния ген, могат да бъдат изолирани и да се използват например за въвеждане генетичните последователности, описани тук, в растението или в други клетки гостоприемници.

Извести са методи за получаване на растения, които експресират чужди гени. Например, растителна тъкан може да бъде трансформирана чрез директно заразяване или едновременно култивиране на растения, расти телна тъкан или клетки с A.tumefaciens директно прехвърляне на ген на ексогенна ДНК към протопласти; инкубация с РЕС; микроинжектиране и бомбардиране чрез микроизстрелване.

Потвърдена е трансформацията в тютюневи растения чрез електропорация, една техника, описана в Biotechnology News, Vol. 7,р. 3 и 7 (Sept/Oct 1990). При този метод растителни протопласти се електропорират в присъствието на плазмиди, съдържащи инсектицидно ефективна пептидна генетична структура. Електрически импулси със силно поле обратимо преминават през биомембраните, което създава възможност за въвеждане на плазмидите. Електропорираните протопласти преобразуват клетъчната стена, разделят и образуват растителен калус. Селекция на трансформираните растителни клетки с експресиаран инсектицидно ефективен пептид може да бъде осъществена, като се използват фенотипични маркери, както е описано по-горе. Към протопластите може да се прибави екзогенна ДНК в каквато и да е форма, например линейна пръстеновидна или свръхспирална ДНК, ДНК, капсулирана в липозоми ДНК в сферопласти, ДНК в други растителни протопласти, ДНК в комплекс със соли и други.

Всички растителни клетки, които могат да бъдат трансформирани от Agrobacterium и цели растения, регенерирани от трансформираните клетки, могат също да бъдат трансформирани съгласно изобретението, така че да се произвеждат трансформирани цели растения, които съдържат прехвърлен инсектицидно ефективен пептиден ген. Трансформация при оризови растения е била потвърдена от D.M. Raineri et al., Трансформация на оризови растения чрез Агробактериум /Orysa sativa L./”, Biotechnology том 8, стр. 33-38 /януари 1990 г/.

Друг метод за въвеждане на инсектицидно ефективен пептиден ген в растителни клетки се състои в заразяване на растителна клетка с A.tumefaciens, трансформиран с инсектицидно ефективен пептиден ген. При подходящи, известни в практиката условия, трансформираните растителни клетки се отглеждат, за да се образуват израстъци, корени и да се развият допълнително в трансформирани растения. Инсектицидно ефективните пептидни генетични последователности могат да бъдат въведени в подходящи растителни клетки, например чрез Ti палазмид от

A.tumefaciens. Ti плазмидът се прехвърля към растителните клетки чрез заразяване с A.tumefaciens и се интегрира стабилно в растителния геном. Ti плазмидите съдържат два участъка, които се считат за важни при производството на трансформирани клетки. Единият от тях, наречен трансформирана ДНК /t ДНК/, индуцира /предизвиква/ образуването на тумор. Другият, наречен с термина вирулентен участък, е от значение за образуването, но не и за поддържането на туморите. Участъкът, който се пренася към растителния геном, може да бъде увеличен по размер чрез вмъкване на генетична секвенция на ензим, без да се повлияе върху неговата способност на прехвърляне. Чрез отстраняване на гените, предизвикващи тумори, така че те повече да не се намесват, модифицираният Ti плазмид може да бъде използван след това като един вектор за прехвърляне на гениите структури на изобретението в подходяща растителна клетка.

Генетичният материал може да бъде също така прехвърлен в растителна клетка чрез използване на полиетиленгликол /PEG/, който образува комплексна утайка с генетичния материал, който е взет от клетката.

Трансферът на ДНК в растителни клетки може да бъде постигнат също така и чрез впръскване в изолираните протопласти на култивирани клетки и тъкани и чрез впръскване в меристемни тъкани на млади растения /израстъци/ и растения. Трансгенетичните растения и техните потомства се получават чрез конвенционални познати в практиката методи.

Друг метод за въвеждане на чужди ДНК последователности /секвенции/ в растителните клетки се състои в прикрепването на ДНК към частици, които след това се вкарват принудително в растителни клетки чрез изстрелващо устройство, “генна пушка”. За целите на тази процедура може да бъде използвана всякаква тъкан или растителен орган, вкл. но без да се ограничава до ембриони, апикални /найгорни/ и други меристеми, пъпки, соматични и полови тъкани in vivo и in vitro. Трансгенните клетки и калус се подбират, като се следват установени в практиката процедури. Избраните тъкани се индуцират /предизвикват/, за да образуват соматични ембриони или регенеративни пъпки, които да дадат трансгенетични растения съгласно установени и познати в практиката процедури. Подходящата процедура мо же да бъде избрана в съответствие с използваните растителни видове. Трансгенетични царевични растения бяха получени чрез използване на високоскоростни микроснаряди за прехвърляне на гени в ембриогенни клетки. “Унаследяване и експресия на химерни гени в прогените на трансгенетични царевични растения”, Biotechnology, том 8, стр. 833-838 /септ.1990 г./.

Регенерираните растения могат да бъдат химерични по отношение на включената чужда ДНК. Ако клетките, съдържащи чужда ДНК, се развиват в микро- или макроспори, интегрираната чужда ДНК ще бъде предадена по наследство на поколението по полов начин. Ако клитките, съдържащи чуждата ДНК, са соматични клетки от растението, нехимерични трансгенетични растения се получават чрез конвенционалните методи на вегетационно /безполово/ размножаване или in vivo, от пъпки или части от стебло или in vitro, като се следват установени, добре известни в практиката процедури. Такива процедури могат да бъдат подбрани, в зависимост от използваните видове растения.

След транфромацията на растителната клетка и растението, тези растителни клетки или растения са така трансформирани, че пептидът е експресиран и може да бъде направено селекциониране чрез подходящ фенотипичен маркер. Тези фенотипични маркери /характерни особености/ включват, без да се ограничават, антибиотична резистентност. Други фенотипични маркери са също познати в практиката и могат да бъдат използвани в това изобретение.

Поради разнообразието от различни трансформационни системи, по принцип всички видове растения могат да бъдат трансформирани, така че те да експресират инсектицидно ефективен пептид от изобретението.

Има достатъчно доказателства, че практически всички растения могат да бъдат регенерирани от култивирани клетки или тъкани, включително, но без да се ограничава до всички основни видове зърнени култури, захарна тръстика, памук, плодови и други дървета, бобови растения и зеленчукови растения. Понастоящем има ограничени познания по отношение на това, дали всички тези растения могат да бъдат трансформирани чрез Agrobacterium. Видовете, които са естествен растителен гостоприменик за Agrobacterium, могат да бъ дат трансформирани in vitro. Едносемеделните растения, по-специално зърнените култури и тревните растения, не са естествените гостоприемници за Agrobacterium. Усилията за тяхното трансформиране, като се използва Agrobacterium, са били безуспешни досега. Сега се появи едно доказателство, че някои едносемеделни растения могат да бъдат трансформирани от Agrobacterium. Използвайки новите експериментални постижения, които сега станаха на разположение, зърнени култури и тревни растителни видове също могат да бъдат в състояние да се трансформират.

Други родове растения, които могат да бъдат трансформирани чрез Agrobacterium, включват Ipomoea, Passiflora, Cyclamen, Malus, Prunus, Rosa, Rubus, Papulus, Santalion, Allium, Lilium, Nacissus, Ananas, Arachis, Phaseolus u Pisum.

Регенерацията варира в зависимост от вида на растенията, но обикновено най-напред се осигурява суспензия от трансформирани протопласти, съдържащи многобройни копия на инсектицидно ефективния пептиден ген. След това може да се индуцира /предизвиква/ образуване на ембрион от протопластната суспензия до етапа на съзряване и покълване, както при естествените ембриони. Културалната среда обикновено съдържа различни аминокиселини и хормони. Пъпките и корените обикновено се развиват едновременно. Ефикасната регенерация ще зависи от средата, от генотипа и от историческите особености на растението. Ако тези три различни фактора се контролират, тогава регенерацията е напълно възпроизводима и ще бъде в състояние да се повтори.

Зрелите растения, отгледани от трансформирани растителни клетки, могат да се опрашват между си за получаване на растение с унаследени белези. Растението, което е получено по този начин, дава семена, съдържащи гена за инсектицидно ефективния пептид. Тези семена могат да бъдат отгледани до получаване на растения ,които експресират инсектицидно ефективния пептид. Растенията потомци могат да бъдат използвани например за развиване на хибриди, които са устойчиви /понасят/инсекти. При този метод потмоствената линия, която понася насекомите, се кръстосва с друга потомствена линия, за да се получи хибридът.

При диплоидните растения обикновено единият родител може да бъде трансформиран чрез инсектицидно ефективна пептидна /токсинова/ генетична последователност, а другият родител е от дивия тип. След кръстосване на родителските растения първата генерация хибриди /F,/ ще показва едно разпределение от 1/2 токсин/див тип: 1/2 токсин/ див тип. Тези хибриди от първото поколение /YJ се опрашват помежду си за получаване на второ поколение хибриди /F₂/. Генетичното разпределение на F, хибридите е 1 /4 токсин/токсин: 1/2 токсин/ див тип: 1/4 див тип/ див тип. F₂ хибридите с генетичния строеж токсин/ токсин са избрани като понасящи инсекти растения.

Както е използван тук, терминът вариант описва фенотипичните изменения, които са стабилни и наследствени, вкл. наследствена вариация, която е предадена по полов начин на потомствените растения, при условие, че вариантът ще експресира инсектицидно ефективния пептид на изобретението. Също така, както е използван тук, терминът “мутант” описва вариация, като резултат на условията на околната среда, като радиация, или пък в резултат на генетична вариация, в която характерните белези се предават по мейотчен път, съгласно установените закони на наследствеността, Мутанното растение обаче все още трябва да експресира пептида от изобретението.

Главно идеалният инсектицидно ефективен протеин, който е избран и който трябва да бъде експресиран в дадено трансгенетично растение, ще бъде този, който се характеризира със своята безопасност по отношение на непредвидени инсекти и гръбначни животни. Трябва да се изберат такива експресионни системи, чието ниво на експресия постига инсектицидна ефективност. Така тази техническа осъществимост за получаване на такива трансгенетични, важни за земеделието растения, се очаква да предложи на земеделските производители едно допълнително защитно средство за употреба в сложната система за контрол на вредители, за да се намали вредата от насекомите по отношение на културните растения по един екологически отговорен начин.

Ж. Приложение на пептидите като инсектициди.

Счита се, че инсектицидно ефективните пептиди от изобретението са полезни при контрол на безгръбначни вредители такива като рода Lepidoptera, чрез контактуване на вредителите с ефективно количество от пептид съгласно изобретението, по-специално срещу инсекти.

Известни са методи за контактуване на безгръбначни вредители с пептид за контрол на споменатите вредители. Примери за такива методи са синтетично капсулиране на протеина за орално поглъщане от вредителите. Рекомбинантни гостоприемници, експресиращи протеините от изобретението например Pseudomonas fluorescens, могат да бъдат умъртвени и да се приложат към вредителите за последващо орално поглъщане и контрол.

Разбира се методите за контролиране на безгръбначни вредители, като се използват протеините от изобретението, могат да бъдат използвани в комбинация с други методи за контрол на вредители. Например трангенетичните растения и E.coli, посочена по-горе, могат да бъдат конструирани да експресират други токсини на безгръбначни, в зависимост от типа на вредителите, които трябва да бъдат контролирани.

Осигурява се инсектицидно ефективен състав, съдържащ инсектицидно ефективно количество от пептид съгласно изобретението и негови соли, приемливи в земеделието или градинарството, в носител, който е приемлив за земеделието или градинарството.

3. Антитела към инсектицидно ефективни пептиди

Друг аспект на изобретението са антитела за инсектицидно-ефективните пептиди от изобретението. В описанието по-нататък ще бъдат цитирани различни методологии, известни на специалистите в тази област на имунологията за откриване и пречистване на пептиди, реакционо способни с антителата, описани понататък.

За едно антитяло се казва че е “способно да свързва” дадена молекула, ако то е в състояние да взаимодейства специфично с молекулата, докато свърже молекулата към антитялото. Терминът “епотоп” означава тази част на даден пептиден антиген, която може да бъде разпозната и свързана от антитялото. Даден антиген може да има един или повече от един епитоп. Даден “антиген” е способен да предизвика животното да произведе антитяло, което е в състояние да се свърже към епитоп на този антиген. Специфичната реакция, цитираната по-горе, означава че антигенът ще имуновзаимодейства по един високо селективен начин със съответстващото му антитяло, а не с множество други антитела, което може да бъде предизвикано от други антигени.

Терминът “антитяло” /АЬ/ или “моноклонално антитяло” /МаЬ/, както е използван тук, означава, че включва интактни молекули, както и фрагменти от тях, например Fab u F/ab’/₂ фрагмент, които са способни да свържат даден антиген, на фрагментите Fab и F-/ab/₂ им липсва Fc фрагментът на интактното антитяло, далеч по-бързо от циркулацията, и могат да имат по-малко неспецифично тьканно свързване на антитялото на инсекта.

Антителата от изобретението могат да бъдат получени по който и да е от различните методи. Методи за получаване на такива антитела са добре известни и описани напълно в литературата./ Виж например, Sambrook и сътрудници, “Лабораторно ръководство за молекулярно клониране”, второ издание, Cold Spring Harbor Press, том 3, глава 18 /1989 г/. Например клетки, експресиращи инсектицидно ефективен пептид или негов фрагмент, могат да бъдат приложени към животно с оглед да се предизвиква произвеждането на серум, съдържащ поликлонални антитела, които са способни да свързват инсектицидно ефективния пептид. Главно инсектицидно ефективен пептиден фрагмент се получава и пречиства, за да стане по същество свободен от естествени замърсявания или пък даден иснектицидно ефективен пептиден фрагмент се синтезира съгласно известни в практиката методи. Пречистеният фрагмент или синтезираният фрагмент или комбинация от пречистени естествени фрагменти и/или синтезирани фрагменти могат да бъдат въведени в животно, за да се произведе поликлонален антисурем с поголяма специфична активност.

Моноклонални антитела могат да бъдат получени, като се използва известна технология на хибридоми. Такива процедури включват главно имунизиран на дадено животно с инсектицидно активен пептиден антиген. Спленоцитите на такива животни се екстрахират и се смесват с подходяща меланомна кле тъчна линия. Всяка подходяща меланомна клетъчна линия може да бъде използвана съгласно изобретението. След сливането получените хибридомни клетки се поддържат селективно в подходяща среда и след това се клонират чрез ограничено разреждане. Хибридомните клетки, получени чрез такава селекция, след това се анализират, за да се идентифицират клоновете, които секретират антитела, способни да свързват инсектицидно ефективния пептиден антиген.

Ако пептидинят източник е онечистен, само някои от хибридомните клетки ще произведат антитела, способни да се свържат към пептида /други хибридомни клетки ще произведат антитяло, способно да свърже примесите на пептида/. Така може да се окаже необходимо да се сортират хибридомните клетки от тези, които са способни да секретират антитяло, което е в състояние да се свърже към пептида. Такъв скрининг или сортиране се извършва за предпочитане чрез инкубиране на проба от пептида /от отрова/ в присъствието на моноклонално антитяло, секретиарно от която и да е група на дадени хибридомни клети и идентифициране на всякакви хибридомни клетки, способни да секритират антитяло, което е в състояние да неутрализира или смекчи способността на отровата да парализира даден инсект. След като бъде идентифицирана такава хирбидомна клетка, тя може да бъде размножена клонално чрез използване на познати на специалистите в тази област методи, за да се получи специфичното по отношение на пептида моноклонално антитяло.

За пречистването на даден инсектен селективен токсин, естествен или рекомбинантен, като се използва афинитетна за антитяло хроматография е необходимо да се използва антитяло, което е способно да се свърже към инсектицидно ефективния пептид. Такова антитяло обикновено ще бъде едно моноклонално антитяло. След като се получи специфично за пептида моноклонално антитяло, същото може да се имобилизира /обездвижи/ чрез свързване към твърда подложка и да се използва за пречистване на пептида от естествена отрова или от други източници, като се използва имуноафинитетна хроматография съгласно методи, които са добре познати в практиката. Такива методи са в състояние да съдействат за голяма степен на пречистване и по този начин се по лучава пептид, който е по същество свободен от естествени замърсители. Както е употребено тук, за даден пептид са казва, че е “по същество свободен от естествени замърсители”, ако същият се намира във форма, в която липсват съединения, с които той е свързан естествено и нормално /т.е други протеини, липиди, карбохидрати и други/.

След като се пречисти, пиптидът може да бъде използван за имунизиране на животно /такова като мишка или заек/ с оглед да се предизвика произвеждането на поликлонално антитяло, специфично спрямо пептида.

ДНК проби с подходящ размер, обикновено от 10 до 50 нуклеотида, могат да бъдат получени от ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективния пептид, по същество изолиращ се от отрова на паяк Diguetia. Такива проби могат да бъдат използвани за откриване присъствието на ДНК, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отрова на паяк Diguetia, чрез контактуване на отрова с ДНК пробата и откриване на пробата, свързана към споменатата ДНК чрез начини, известни на специалистите в тази област.

I. Инстицидни микроби, получени чрез генно инженерство.

Инсектицидно ефективният пептид самостоятелно или в комбинация с друг токсин от инсект се очаква да бъде полезен при активиране или усилване на токсичността на микроби, като бакуловируси и хибридни бактерии.

Няколко бакуловируса, вкл. тези, които заразяват Heliothis virescens /червей по семенника на памукови растения/, Orgyia pseudotsugata /нощна пеперуда по борови туфи от Дъглас/ Lymantia dispar /гьботворка/, Autograpaha californica /вид гъсеница по люцерната/, Neobiprion sertife /вид муха по Европейски бор/ и Lanspcyresia pomonella /плодов молец/ са били регистрирани в някои страни и са използвани като пестициди. Въвеждането на най-малко един селективен спрямо инескти токсин в генома, се очаква да засилва значително активността на такива пестициди.

Счита се, че един рекомбинантен експресионен вектор би бил особено подходящ за използване в това изобретение, а именно бакуловирусен експресионен вектор, например от типа, описан в патент на US 4,879,236, който патент е включен тук чрез референция. Виж също Carbonell и сътрудници “Синтез на ген, кодиращ за невротоксин от скорпион, специфична спрямо инсекти и опити за неговото експресиране чрез използване на бакуловирусни вектори” Gene, 73:409-418 /1988 г./.Очаква се векторът да бъде полезен в система, в която ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиращ се от отрова на паяк Diguetia, може да бъде клонирана в бакуловиурс, такъв като Autographa californica /AcMNPV/, а експресионният вектор е описан в патент на US 4,879,236 и от Muller и сътрудници, Science, 219, 715-721 / 1983/. Вирусите с рекомбинантен експресионен вектор могат след това да се приложат към растението или към животното, върху което инсектът е вредител, и когато вредното насекомо погълне рекомбинантния вирус, той завладява клетките на чревната стена и започва възпроизвеждане. Па време на възпроизвеждането генът за инсектицидно ефективен протеин се експресира, в резултат на което инсектът става недееспособен или се умъртвява в по-кратък период от време, отколкото, ако инсектът е погълнал дивия тип вирус AcMNPV.

В патент на ЕР 0 340 948 се твърди, че даден хибриден вирус също се очаква да бъде полезен. Хибридният вирус, експресиращ ДНК от изобретението, се очаква да даде вирус, който има променен обхват по отношение на инсекти гостоприемници. Например слети протеини биха могли да бъдат експресирани като единичен полипептиден продукт с хибриден ген, съдържащ ДНК от изобретението и специфичен протеин, разпознаващ клетките на червото на инсекта, за да се насочи експресирания инсектицидно ефективен пептид към дадения инсект гостоприемник.

Различни прокариотични и еукариотичин микроби могат да бъдат трансформирани, за да експресират хибриден токсинов ген, кодиращ инсектицидно ефективен протеини чрез метода, описан в патент на ЕР 0 325 400.

Хибридни бактериални клетки, съдържащи плазмид с ген, кодиращ за протеина от изобретението, се очаква да бъдат полезни в метода на съгласно изобретението. Инсектите биха могли да бъдат контролирани чрез прилагане на хибридите към инсектите. Виж например патент на US 4,797,279, който патент е включен тук чрез референция.

Други примери на приложими бакуловируси, които могат да бъдат подходящи за използване от изобретението, са описани в Tomalski и сътрудници, “Парализа на инсекти чрез експресия чрез бакуловиурс на невротоксинов ген в червей”, Nature, 352 : 82-85 /1991/ и Stewrat et al, “Създаване на подобрен бакуловируесн инсектицид, съдържащ специфичен спрямо инсекти токсинов ген”, Nature, 352:85-88/1991/; McCutchen et al. “Разработване на рекомбинантен бакуловирус, експресиращ селективен към инсекти невротоксин: Възможност за контрол на вредители” Biotechnology, 9 : 848-851 /1991/.

И. Кръстосана хибридизация: ДНК последователности /секвензии/ като проби за близки съединения.

ДНК проби с подходящ размер могат да бъдат получени от ДНК последователност от това изобретение. Такива проби могат да бъдат използвани за откриване наличието на нуклеионва киселина, кодираща инсектицидно ефективен пептид от изобретението, чрез хибридизация с нуклеинови киселини от други източници. Пресяването или сортирането с олигонуклеотидни проби, кодиращи сигналната секвениця, фрагменти от сДНК или даже цялата сДНК при условия на понижена строгост ще даде възможност за достъп до други ектавни пептиди с функционална хомология спрямо семейството на описаните тук токсинови молекули. Източници на нукелинови киселини, които биха могли да бъдат подходящи за кръстосана хибридизация с нуклеотидни проби, получени от ДНК последователност от изобретението, включват, без да се ограничава до тях, паяци от същия род , но различни видове, паяци от близък род и паяци от същия род, но от различни места.

Й. Идентификация на А промоторна последователност.

Друг аспект на това изобретение осигурява промоторна последователност^ като контролира синтезирането на ДК 9.2 в паяк.

Организацията на гена за ДК 9.2 е изследвана чрез скрининг /на геномна библиотека, като се използва за проба сДНК на зрял токсин. Анализът на геномната ДНК по принципа на противотока на транскрипционния старт /счита се, че е 5' края на сДНК/ не показва наличието на предполагаем промотор. ДНК последователността за 421 базови двой20 ки на промоторния участък се намира в SEQ ID NO :8. Този предполагаем промотор съдържа много от важните контролни сигнали, които се намират главно в участъка, директно насочен нагоре от трансланционното стартово място. /За преглед на промоторни контролни сигнали виж McKnight et al., 1982 г., “Транскрипционни контролни сигнали на еукариотичен, протеинкодиращ ген. Science 217:316./. Един ТАТА депозит се явява при позиция -30 от предложеното транскрипционно стартово място и се счита за важен при контролирането на стартовата точка на синтезирането на РНК. Освен противоток, съществуват две крайни палиндромни последователности, едната от които съдържа съгласувания СААТ депозит, който се счита за важен за свързването на РНК полимеразния II ензим. Предвижда се, че този промотор или участъците на този промотор ще намерят приложение при транскрипцията и експресията на различни гени в растения, животно или бактериални клетки, например при даден рекомбинантен строеж.

Примери за изпълнение на изобретението

Следващите примери са представени, за да илюстрират дадени състави и методи в обхвата на изобретението, но без да го ограничат.

Материали и методи

Паяците се доставят и видовете се определят от Spider Pharm, Inc. of Black City, Az.

Паяци Diguetia canities се доят електрически за отрова, като се използва метод, който прилага защитни мерки за предотвратяване онечистването на отровата чрез обратно изтичане или с хемолимфа.

Пречистване на токсини. Необработена отрова, съхранена при -80°С, се размразява, размесва се напълно и се разтваря в 0,1% разтвор на трифлуороцетна киселина /TFA/, преди да се подложи на хроматография. Необработената отрова се фракционира чрез течна хроматография с обратна фаза /RPLC/, като се включва разтворителна система Бекмън Голд 126 и 168 фотодиодни подредени детекторни модули. Ацетонитрил и изопропанола се използват в комбинации с TFA като реагент с йонни двойки. Следващите колони със защитни колони от същия модел се използват за пречистванията: Dynamax 300 A RP С₁₈ колона /25 cm х 4,6 mm вътрешен диаметър, 12 цт размер на частиците/, Vydac 300 А С₁₈ аналитична колона / 25 cm х 4,6 mm вътрешен диаметър, 5 цт размер на частиците/ и Vydac 300 А С₁₈ полупрепаративна колона /25 cm х 10 mm вътрешен диаметър, 5 цт размер на частиците/. Откриването на пика се извършва чрез контролиране при 220 mm и фракциите се събират с микрофракционен колектор GILSON 208. Всички фракции се лиофилизират до сухо след фракционирането и се съхраняват при -80°С.

Масова спектрометрия с бързо бомбардиране с атом /FAB-MS/. Масовият спектър беше отчетен при Университета в Илиноис върху VG инструменти на /АВ-SE масов спектрометър при стандартни FAB условия /ксенонов газ, разделяне 1000, увеличаващ се волтаж 8 kV, температура на източника на нагряване 40°С/. Пробите /около 1 ng/ се анализират в 4 ц1 тиоглицерол, съдържащ 25% воден разтвор на TFA /1,0%/.

Пример 1. Първоначално фракциониране и идентификация на фракциите, съдържащи инсектициден пептид, от общата отрова на Diguetia canities.

Лиофилизирана обща отрова, 25 ц1, добита от Diguetia canities, както е описано по-горе, се разтваря в 0,1 % разтвора на трифлуороцетна киселина /TFA/ и се подлага на фракциониране чрез течна хроматография с обратна фаза върху полупрепаративна Vyoac С₁₈ колона, като се използва елюиране със скорост на потока от 3,5 ml в минута. Използва се линеен градиент на елюента, като се започва със смес 85:15 на водена разтвор 0,1% TFA: 50% ацетонитрил, 0,1 % TFA и се завършва със смес 50:50 след 180 min.

Фракция	Време на задържане/ приблизително, min/
1	3,2
4	29,6
6	48,2
8	57,1
9	62,8
10	66,4
11	68,7
12	71,4
13	77,1
16	126,1
17	131,4
Всяка фракци	я се концентрира чрез

лиофилизация от елюента, последвано от лиофилизация от вода. Остатъкът се съхранява при -80°С. Всяка фракция се разтваря в 25 μΐ буфериран физиологичен солен разтвор за инсектицидна оценка. Инсектицидната активност на ня- 5 кои фракции се потвърждава чрез тестуване спрямо червея по пъпките на тютюневите растения /Heliothis virescens/”TBW” /таблица 1/.

TBW ларви, пет отделни за всяка фракция, се инжектират с 3 μΐ от тестувания разтвор, като се използва 50-микролитрова спринцовка Hemilton, свързана с 33 манометрични игли и РВ 600 повтарящ микродозатор. Инжектирането става чрез вмъкване на иглата в страничната средна линия на корема /близо до единия от краката/, при един плитък ъгъл, за да се избегне увреждането на вътрешни органи. След инжектиране всеки инсект се поставя в отделен контейнер, съдържащ изкуствена диета, наблюденията се извършват периодично; па рализата се измерва 24 h след инжектиране. Средната телесна маса от 0,3 mg за червея по тютюневите пъпки се използва при изчисляване на дозата. Една серия от контролни инсекти се инжектират само с буфериран солен разтвор.

Парализата се развива постепенно и се предшества от един период на ясно изразени мускулни спазми. При острите случаи тези спазми започват 15-30 min след инжектиране и постепенно се увеличават по интензитет, докато ларвата стане напълно негодна. Понякога треперенето се запазва за повече от 48 h след инжектирането. Това понякога се случва дори когато е приложена доза под леталната и ларвата евентуално се възстановява. Силата на треперене е най-сигурният индикатор на токсичността; ларви, повлияни до точката на пълна парализа и/или контракции на тялото, не се възстановяват.

Таблица 1

Токсичност на RPI С фракции от отрова на паяка Diguetia canities по отношение на TBW /7,5 WVE/g инсект**

Фракция	Първоначална парализа, %*	% парализа след 24 h
1	0	0
4	0	0
6	0	0
8	100	100
9	100	100
10	100	100
11	100	100
12	100	100
13	0	0
16	0	0
17	0	0
контрола	0	0

* парализата е определена като неспособност на инсекта да се държи правилно, когато се върти или обратно.

** WVE, еквивалент на общата отрова е количеството от който и да е токсин, което се намира нормално в един μΐ от цялата издоена отрова; 5 W VE от 25 μΐ разделяне е 20% от възстановения остатък.

Пример 2. Пречистване на фракция 9 от Diguetia canities

Главните компоненти на TBW активната фракция 9 се пречистват до хомогенност / една видима ивица или зона, получена чрез SDSPAGE електрофореза, приблизително в молекулно тегло е в границата на 6,500 D/ чрез една допълнителна хроматография през Vydac RP С₁₈ колона /25 cm х 10 mm вътрешен диаметър/, като се използва линеен /1,0%/min/ разтворителен градиент от изопропанол/ 0,1 % TFA при 3,5 ml/min и при контролиране при

220 nm /нанометра/.

Откриването на пик и събирането на фракции се извършва, както е описано в пример 1. Събират се две фракции: първата, като се елюира 21,81 min /фракция 9.1/, а втората при елюиране 22,30 min /фракция 9.2/.

Фракции 9.1 и 9.2 се концентрират чрез лиофилизация от елюента, последвано от лиофилизация от вода, при което остават остатъците 9.1 и 9.2, съответно. Пречистването на лиофилизираните фракции се установи, че е най-малко 99%. Установи се, че остатъкът 9.2, получен от 25 μΐ обща отрова, съдържаща около 6 pg чист протеин. Остатъкът 9.2 се тестува за инсектицидна активност спрямо червея по пъпките на тютюневите растения, както е описано в пример 1, чрез инжектиране на всеки от пет инсекта с 6,3 pg остатък в буфериран солен разтвор и пет инсекти само с буфериран солен разтвор, за да служат за контрола. Инсектите се изследват след 24 h и след 48 h. Отчитането на резултатати след 24 h при всички тези инсекти, третирани с остатъка 9,2 във вид на разтвор, показва, че те са парализирани и след това умират, докато контролните инсекти изглеждат нормално. Никаква промяна не се забелязва след 48 h.

Анализът на този полипептид чрез масова спектрометрия с бързо бомбардиране с атом показва молекулно тегло 6371±2. Анализът на N-терминалната аминокиселинна последователност, получена в дадена аминокиселинна последователност за остатъка 9,2, е по същество, както е показано в SEQ ID N0:1, аминокиселини 1-33.

LD₅₀ по токсин от Diguetia 9,2 в H.virescens (TBW) е приблизително 1,0 nmol/g. Симптомите са подобни на тези, свързани с прилагането на обща отрова, както е описано в пример 1.

Пример 3. Пречистване на фракция 11 от Diguetia canities

Работи се, както в пример 2, като фракция 11, изолирана от общата отрова на Diguetia canities, както в пример 1, се пречиства допълнително чрез течна хроматография с обратна фаза, като се получава една фракция. Тази фракция се концентрира чрез лиофилизиране от елюента, последвано от лиофилизиране от вода, при което остава остатък, обозначен като остатък 11. Този остатъка се тестува за инсектицидна активност спрямо чер вея по пъпките на тютюневи растения при 5,0 WVE/g, както е посочено в пример 2. След 24 h 80% от инсектите, третирани с остатък 11, доказват парализа, а след 48 h 60% от инсектите, третирани с този пептид, проявяват парализа. Контролните инсекти изглеждат нормално.

Анализът на този полипептид чрез масова спектрометрия с бързо бомбардиране с атом показва молекулно тегло 6740±2. Анализът на N-терминалната аминокиселинна последователност , получава в една частична аминокиселинна последователност за остатък 11, е по същество, както е показано в SEQ ID N0:3, аминокисени 1-29.

Пример 4. Пречистване на фракция 12 от Diguetia canities

По начин, подобен на този от пример 2, фракция 12 се изолира от общата отрова от Diguetia canities, както в пример 1, и се пречиства допълнително чрез течна хроматография с обратна фаза, при което се получава една фракция. Тази фракция се концентрира чрез лиофилизиране от елюента, последвано от лиофилизиране от вода, при което остава един остатък, наречен остатък 12. Този остатък се тестува за инсектицидна активност спрямо червей по тютюневите пъпки, както е посочено в пример 2. След 24 h 100% от инсектите, третирани с остатък 12 проявяват парализа, а след 48 h 80% от инсектите, третирани с остатък 12, проявяват парализа. Контролните инсекти изглеждат нормално.

Анализът на този полипептид чрез масова спектрометрия с бързо бомбардиране с атома показва молекулно тегло 7080±2. Анализът на N-терминалната аминокиселинна последователност, получена в експерименталната частична аминокиселинна последователност за остатък 12 е, както е показано в SEQ ID N0:5.

Ограниченото подаване на материал не дава възможност за прецизна стандартизация на токсичността; в резултат, остатък 9,2 се тестува при дози /nmol/g/ 39% и 67% поголеми, отколкото остатък 11 и 12 съответно. Избраните дози имат за цел да покрият обхвата от минимална летална доза до ниво без ефект, но това не се постига при всички случаи. Въпреки това резултатите показват, че тези пептиди имат твърде подобна токсичност. Остатъкът 9,2 може да бъде малко по-активен, отколкото други, но разликата вероятно е по малка от един фактор 3. Минималната 100% летална доза за тези пептиди /остатък 9.2, 11 и 12/ е от 3.0 до 5,0 nmol/g. Тя се сравнява благоприятно с намиращите се на пазара инсектициди; тефлубензурон например има повърхностна LD_J0 (SAW) от 1,0 nmol/g.

Пример 5. Изолиране на гени, кодиращи за остатъци 9,2 и 11, изолирани от отрова на Diguetia canities

Етап 1: Изолиране на РНК

Паяци се събират от външни източници и се идентифицират като Diguetia canities. Пет паяка се замразяват и главогръдът се отстранява под течен азот. РНК се екстрахира от главогръдите, като се използва протокола на Chomczynski and Sachhi, Analytical Biochemistry 162, 156 /1987/. Полиаденилатна носеща РНК /мРНК/ се пречиства, като се използва олиго d /Т/ целулозна (Pharmacia LKB, Sweden) хроматография.

Етап 2. Синтезиране на сДНК

Преносимата РНК се връща транскрибирана до сДНК с обратима транскриптаза от левкимиен вирус от мишка /Bethesda Research Laboratories, MD), като се използва протоколът на производителя. 20 μΐ реакционна смес съдържа ензимния буфер, доставен в сДНК синтезен кит /Boehrienger Mannheim, IN), 50 ng мРНК, 2 единици RNase Η, 30 ng d(T)Not I пример /Promega, Medison, WI), 1 nmol от всяка от деоксинуклеозидни трифосфати и 100 g от обратима транскриптаза. Реакционната смес се инкубира в продължение на 1 h при температура 37°С и продължава още 10 min при 42°С. Реакционната смес се утаява с етанол и отново се суспендира в 20 μΐ вода.

Етап 3: Синтез на пример

Смес от дегенератна примерна ДНК последователност, която може да кодира за аминокиселините остатъци 1 до 8 съгласно SEQ ID N0:1 се съставя, като се използват някои кодонови предпочитания на Drosophila, за да се намали дегенерацията. Този пример се синтезира от Университета в Rtah, Howard Hughes Medical Institute на договорна основа.

Етап 4. Разширяване

Насочвано от пример ензимно разширяване на ДНК с термоустойчива ДНК полимераза е описано най-напред от Saikki и сътрудници, Science, 239:487 /1988 г./. Съгласно изобретението 5 μΐ цефалотораксна сДНК от Diguetia се използва като шаблон в полимеразна верижна реакция, включваща реагенти, които се съдържат в кит за разширяване на ДНК GeneAmp /Perkin Elmer Cetus, СА/. Реакцията на разширяване съдържа чувствителни и нечувствителни примери в 2 mol концентрация, 100 μπιοί от всеки деоксинуклеотиден трифосфат и 4 единици от термоустойчива рекомбинантна Tao I полимераза. Реакцията протича в ДНК термичен циклер, производство на Perkin Elmer Cetus. Селективното разширяване на гена, кодиращ за остатък 9,2 от семейство на близки токсини, с подобна NHj-терминална аминокиселинна последователност, се постига, като се използва строго определена отвръщаща температура (58°С/. Тези условия разширяват една единична ДНК, която има около 275 основни двойки в дължината си, както е определено чрез електрофореза с агарозен гел. Когато се използват по-малко строги условия на отвръщане, повече от пет разширени продукта биха могли да бъдат открити чрез електрофореза с агарозен гел с размер в границите на около 200 до 360 основни двойки. Тези различни PCR продукти, получени при по малка точност, вероятно кодират полипептиди, които са близки по аминокиселинна последователност, в приблизителен размер и в инсектицидна активност до остатък 92.2. Такива близки полипептиди би могло да се очаква да включват остатъци 11 и 12, тъй . като N-терминалните последователности на тези полипептиди са много подобни една на друга и към остатък 9,2, както е показано в SEQ ID NOS: 1, 3 и 5.

Етап 5. Клониране на PCR продукти

Продуктите PCR, както от реакцията с висока строгост, така и от реакцията с ниска строгост, се пречистват, за да се отстранят невключените примери, като се използва устройство за разделяне по молекулен размер Центрикон-100 /Амикон/. Запазените продукти след това се смилат с рестрикционния ензим Not I /MBR/ Milwaukee, WI/, който разцепва спускащия се надолу /3' край/ праймер, оставайки един лепкав край. Векторът ρτδ / Stratagene, La Jolla, СА/ се смила двойно с EcoR V /US Biochemical/ и с Not I, за да се образуват местата, специфични за ръководено клониране. Вектор и инсърт се свързват и трансформират с комплекс DH5 F’. Колония лифтове се пресява с ³²Р белязана вътрешна проба и предполагаемите колонии се охарак теризират допълнително чрез определяне на последователността /US Biochemical’s Sequenase Version 2.0/ на минипрепаративна ДНК, като се използва вътрешната проба като праймер.

Целите ДНК последователности на сДНК инсъртите на два клона са показани в SEQ ID N0:2 и 4. Само предният е получен в клонове, произлезли от строгата PCR реакция, докато и двата типа на сДНК инсърти са намерени в клонове, получени от продуктите на реакцията PCR с по-малка строгост. Аминокиселинната последователност на полипептида, кодирана от SEQ ID N0:2, е показана в SEQ ID N0:1. Този полипептид на N-терминална последователност, идентична с определената за остатък 9.2. Изчисленото молекулно тегло на този полипептид е 6377,9 D. Допускайки, че всички цистеини в естествения полипептид присъстват във формата на вътрешномолекулни дисулфидни връзки /цистеин/, изчисленото молекулно тегло би могло да бъде 6369,7 D. Следователно, този полипептид изглежда, че е идентичен с полипептида, изолиран в остатък 9.2, който показва молекулно тегло 6371±2 чрез масова спектрометрия. Аминокиселинната последователност на полипептида, кодирана чрез SEQ ID N0:4, е показана в SEQ ID N0:3. Този полипептид има N-терминална последователност, идентична с определената за остатък 11. Освен това, този полипептид изглежда, че е същият полипептид, изолиран в остатък 11.

Пример 6. Токсичност спрямо бозайници

Обща отрова, 5 μΐ, получена от D.canitiee, както е описано тук, е фатална за мишка чрез интрапсритонеално инжектиране /1Р/ в три отделни теста. Третираната мишка първоначално не се различава от контролните, третирани със солен разтвор. Около 10 до 15 min след инжектирането третираната мишка става умерено хиперактивна, проявявайки характерна подскачаща походка. Това се последва от кратък период на некоординация, мъчително дишане и конвулсии. Смъртта настъпва след 2 min от първоначалната атака на симптомите.

Остатъци 9.2, 11 и 12 се инжектирата интраперитонеално в мишка в приблизителни дози от 4,2, 0,9 и 1,2 mg/kg съответно, като и за трите пептида не се наблюдават ефекти в период от 24 h.

Остатък 9,2 се инжектира в церебралните кухини при четири мишки /около 28 g/ при доза около 30 gg за животно /около 1 mg/ kg. Никакви ефекти не се забелязват през цялото време до 48 h след инжектирането. Други мишки се инжектират интраперитонеално /1Р/ с около 125 gg /4,2 mg/kg/ от остатък 9,2 и не се наблюдава никакъв ефект.

За охарактеризиране на токсичността на тази отрова спрямо гръбначни животни, обединени фазово обратими фракции на общата отрова се изследват при мишка /фигура 1/. Фракция 2 съдържа компонентите с активност спрямо червей по тютюневите пъпки. /TBW/. При доза, еквивалентна на 25 μΐ от общата отрова /WVE/, интраперитонеалното инжектиране на фракции 1 и 1 няма никакъв ефект; фракция 3 дава същите ефекти, наблюдавани при инжектиране на общата отрова. Тези резултати предполагат едно ясно разделяне между инсектицидно ефективната активност и токсичната активност към гръбначни животни, налични в компонентите на отровата от Diguetia canities.

Пример 7. Електрофизиологични данни

ДК 9,2 се изпитва при 1 μτηοΐ по отношение на синаптична трансмисия /предизвикан максимум на популация/ при Schaffer колатерален-СА 1 синапс на пирамидални клетки в срязъци /шайби/ от мозъчните коремчета на плъх. Данните, представени във фигура 2, показват отчитаните резултати при осреднено време на максимална популация /а/ за 5 min преди прибавянето на ДК 9,2 и /б/ през интервал от 15-20 min след прибавянето на ДК 9,2. Тези резултати показват, че при тази концентрация ДК 9,2 няма активност при плъх CNS, която да може да бъде открита в този опит. Опитът е в състояние да открие различни ефекти по отношение на различни йонни канали при бозайници и невропредавателни рецептори /T.V.Dunwiddie, “Използване на in vitro мозъчни срязъци в неврофармакологията, в електрофизиологичните техники във фармакологията”, издание на Н.М.Geller, Alan R.Liss, Inc., New York 1986/. По-специално, молекули които предотвратяват инактивирането на натриевите канали, такива като някои токсини от скорпион, причиняват ясно изразено разширяване на последната фаза на реакцията на популационен връх /Keneda М., Myama Y, Ikemoto Y и Akaike N. “Токсин от скорпион удължава фазата на инактивация на зависимия от напрежението натриев поток в изолирани от плъх единични хипокампални неврони”, Brain Res. 487: 192-195, 1989, Alan L.Mueller Natural Product Sciences, Inc., непубликувани наблюдения/. Напротив, ДК 9,2 е активен в препарати от инсекти /домашна муха/ при 100 пъти по-ниски концентрации и по един начин, който създава условия да се предполага, че той предотвратява инактивирането на натриевите канали при инсектите.

Пример 8. Насочени нагоре сДНК последователности /секвенции/, кодиращи прекурсора на ДК 9,2.

За да се получат насочени нагоре секвенции на сДНК, кодиращи ДК 9,2, се синтезира един вътрешен олигонуклеотид, съответстващ на нуклеотидно киселинни остатъци от 159 до 178 върху нечувствителната нишка на ДНК последователностите, представени в SEQ ID N0:2. Рестрикционно място Eco RI се намира при 5' края на този пример. Десет ц1 от единично спирализирана сДНК от отровна жлеза се използват и се отрязва опашката при нейния 3' край с деоксигуанозинови остатъци чрез ензимна терминална деоксинуклеотидна трансфераза /Bethesda Reserch Laboratories/. 20 μΐ реакционна смес, съдържаща 14 μ от ензима и 500 μΜ от dGTR, се инкубира при температура 37°С в продължение на 15 Min. Пробата се утаява с етанол и отново се суспендира в 20 μΐ Н₂0.

Насочените нагоре ДНК секвенции на генния специфичен праймер се разширяват, като се използва техника на закрепване на PCR, подобна на тази, използвана за сДНК секвенции с насочен надолу поток/зрял токсин. Разширителната реакция съдържа чувствителния пример /d/С/ праймер с отрязан край/ и нечувствителен праймер в концентрация 2 μΜ, 100 μΜ от всеки деоксинуклеотиден трифосфат и 4 единици термоустойчива рекомбинантна Taq полимераза. Температурният профил е, както следва: 2 min при 94°С, 2 min при 37°С, 1 min при 37°С. Този цикъл се повтаря два пъти и след това програмата се прекъсва до идентичен профил, като се включва повишена закаляваща температура от 54°С при втория етап. Този цикъл се повтаря 32 пъти.

Фиксирана PCR дава продукт при 380 Ьр фрагмент, както е доказано върху 4% агарозен гел в присъствието на етидиев бромид. Този реакционен продукт се използва за запълване на краищата, като се използва големият /

Klenow/ фрагмент на ДНК полимераза I от E.coli /Molecular Biology Resources, Madison WI/ и се утаява чрез прибавяне на етанол. Продуктът се суспендира отново и се смила с рестрикционен ензим, Eco RI. Усвоеният фрагмент се сближава в присъствието на 1 тМ АТР чрез ензима Т4 киназа и след това се свързва към Eco RI и Eco RV усвоен вектор pBluescriptsKS. Подклоновете се анализират чрез секвенцираща двойно спирализирана ДНК, като се използва секвеназа 2,0 /USB/.

Предаването на сДНК последователностите, съдържащи в насочения нагоре участък към зрелия пептиден токсин, показва ДК 9,2, който трябва да бъде синтезиран като един прекурсорен протеин. Насочената нагоре сДНК последователност е представена в SEQ ID N0:6. Кодираният прекурсорен протеин се състои от сигнална секвенция и пропенатиден участък /SEQ ID N0:7/, и се отстранява, за да се получи зрелият пептиден токсин, който е възможно да се изолира от отрова на паяк. Предполага се, че сигналната и пропептидната последователност са необходими за произвеждането и секретирането на ДК 9,2 в паяка.

Пример 9. Строеж на рекомбинантен бакуловирус

Сигнална секвенция /последователност/ на ципокрили /Jones и сътрудници, “Молекулярна регулация на клониране и пълна сек.венция на свързан с хемоцианин ювенилен хормон - потискащ протеин от хомолимфи на инсекти, J.Biol.Chem. 265:8596 /1990/, се конструира от два изкуствени олигонуклеотида, като се използва методът на Rossi et al. (J.Biol.Chem. 257: 9226 (1982). Два 48 меша се пречистват чрез йонообменна хроматография. Тези два олигонуклеотида споделята единадесет базови двойки на допълнителна последователност при техния 3' терминал. Когато секвенциите се закалят в присъствието на четирите деоксирибонуклеотидни трифосфата и фрагмента Klenow на ДНК полимераза I, се синтезира един двойно спирализиран продукт. Реакционните продукти се пречистват, като се използва хидроксилапатитна хроматография и двойно спирализирани ДНК молекули се усвояват с Aat II, рестрикционните ензими, подходящи за вмъкване на тази насочена нагоре секвенция на ДК 9,2, сДНК, се клонира в pK^s - ДК9с. Подклоновете се скринират / отсяват/ за вмъкване на сигналната секвен26 ция и се оценяват чрез ДНК секвенциране.

ДНК секвенирането потвърждава едно структурно сливане между двете сДНК последователности, цялостната синтетична генна конструкция се възбужда и адаптира за клониране в мястото Nhel на pBlueBac, един бакуловирусен преносим вектор /Vialard, J., et al., J.Virology 64:3-50 /1990//. Секвенират се субклонове, за да се потвърди правилното вмъкване на конструкцията. ДНК, секвенираща плазмид WR9, потвърждава вмъкването на синтезиран “обслужващ паяка” ген /pre ДК 9,2/ в бакуловирусния преносим вектор pBlueBac /фигура 3/. Използването на pBlueBac вектора ускорява скрининг процеса, като вмъкването на рекомбинантен ген съгласно изобретението в бакуловирусния геном се извършва чрез едновременна експресия на β-галактодидаза и се открива чрез промяна в цвета, когато се отглежда върху определена среда.

Рекомбинантните бакуловируси, кодиращи pre ДН 9,2, се получават чрез трансфекция на клетки на Spodoptera frugiperda щам Sf9 (ATCC, CRL1711) със смес на 1 μg AcMNPV вирусна ДНК и 2 μg плазмидна ДНК, като се използва протоколът на Sumer и Smith/ в “Ръководство за методи за бакуловирусни вектори и процедури за клетъчна култура от инсекти”, Texas Agricultural Experiment Bulletin No. 1555, 1988 г./. Четири дни след трансфекцията, разреждания от клетъчния супернатант се плакират върху 100 mm плочи, посети с 5 х 10⁶ Sf клетки, и се покриват с агароза, съдържаща Bluo-gal /Gibso BRL, Gaithersburg, MD/, като субстрат. В срок от 5 до 6 дни рекомбинантите се откриват чрез техния бледосин цвят. Плаките се разчовъркват с пипета на Пастьор и се промиват в 1 ml среда. Този елюент се използва повторно за заразяване с Sf9 клетки, посети в Т-25 колба. Три дена след зарязавенето се събира малък обем от супернатант от шест различни изолати и се използва за приготвяне на вирусна ДНК. Разширяването на PCR, като се използват вирусни специфични праймери от участъка, заобикалящ полихедриновия ген, потвърждава, че пет от шесте вирусни изолати съдържат подходящ по размер инсърт и липсва каквото и да е замърсяване с див тип. Титрувани изходни разтвори на рекомбинантни вируси се получават следа това за in vivo и in vitro тестване.

Пример 10. Биологична активност на ре комбинантен ДК 9,2.

Биологичната активност на рекомбинантен остатък 9,2 /ДК 9,2/, пречистен от съдържаща серум тъканна културална среда, се изследва в TBW ларви в стадий на развитие инстар. Дозите се изчисляват на базата на A_2g0 от тестовия разтвор. При доза 16 μg/g, рекомбинантния материал причинява изявени мускулни спазми 2 h след инжектиране. Половината /3 от 6/ от тези ларви се парализират и настъпват силни контракции след 48 h, докато другите 3 ларви все още проявяват слаби до умерени мускулни спазми. Доза от 8 μg/g също парализира 3 от 6 ларви, докато доза от 5,2 pg/g парализира 2 от 6 ларви. Резултатите потвърждават, че рекомбинантния ДК 9,2 е биологично активен.

Пример 11. Рекомбинантен вирус - in vivo тестуване

А. Биологична активност на ДК 9,2 рекомбинантен ядрен полихидрозисен вирус (VACDK9.2).

1/ Титруване на вирусни препарати

Вирусни изходни разтвори се титруват чрез метода на опита върху плака /Luria et al, “Обща вирусология”, 1978, р. 21-32; John Wiley and Sons, New York). Титрите се изразяват в условията на плакаобразуващи единици /PFU/ за единица обем, докато дозите се изразяват като PFU/ларва- Една PFU е функционалният еквивалент на един зрял вирион /вирус/ в препарата, където всеки вирион е в състояние успешно да заряди една клетка гостоприемник /Luria et al., ibid/. Например, 103 клетки гостоприемници биха могли да бъдат заразени от всеки микролитър вирусен препарат, съдържащ 106 PFU /ml/ т.е. 103 PFU /μΐ/.

2) Биоанализ

Биологичната активност на ДК 9,2 рекомбинантния ядрен полихидрозисен вирус / rNPV/, vAcDK 9,2 се изпитва в серии от опити с доза, предизвикваща реакция-отговор. В тези опити, TBW ларви /средна маса около 250 mg/ се инжектират с различни дози от vAcDK 9,2 в среда на тъканна култура или само със среда на тъканна култура /п = 10/. Както при експериментите с инжектиране на токсин, описани в пример 1, третираните ларви се държат в отделни контейнери с прибавяне на храна и се наблюдават периодично. Обединените резултати на два такива опита с инжектиране на вирус са илюстрирани в таб лица II. При дози от 5000 PFU /ларва и поголяма, типичните симптоми на ДК 9,2 токсичност /мускулно треперене и спазми/ започват да се явяват около 24 h след инжектирането и най-малко половината от тестуваните инсекти са недееспособни /т.е. парализирани или частично парализирани/ след 48 h. Изследваната най-ниска доза, 50 PFU/ларва предизвиква треперене и спазми в рамките на 48 h и прави неспособни най-малко 70% от ларвите в 96 до 120 h.

Б. Биологична активност на vAcDK 9,2 в сравнение с див тип

Проведени са допълнителни изследвания за определяне ефикасността на vAcDK 9,2 в сравнение с неговите прародителски вируси от див тип Autographa califomiaca NPA(wt-AcMNPV). Целта на тези опити е да се определи дали ларви, инжектирани с vAcDK 9,2, стават неспособни за по-малко време, отколкото ларви, заразени с идентична доза от wt-AcMNPV.

1) Инжекционен опит

Биологичните активности на vAcDK 9,2 и wt-AcMNPV се сравняват в серии от инжекационни опити. Ларви на червей по тютюневите пъпки в последен стадий на развитие / Heliothis virescens/, ларви на зелена гъсеница /Trichoplusia ni/ и ларви на памучен червей по цвеклото /Spodoptera exigua/ се инжектират с 5 х 10⁵PFU /ларва с VacDK9,2 или wtAcMNPV; контролни ларви се инжектират със среда на тъканна култура. Резултатите, сумирани в таблица III, показват, че VacDK9,2 е значително по-активен, отколкото wt-AcMNPV при всичките три вида.

2/ Опит на подаване

За да се изследва активността на vAcDK9,2 чрез поглъщане, е необходимо да се произведе този полихидрин отрицателен /ро1-/ рекомбинант във формата на орално заразяване. Това се извършва чрез едновременна оклузия на vAcDK9.2 с wt-AcMNPV, като се използват методи, посочени от други научни работници, за произвеждане на орално заразяващ pol-рекомбинант NPVs /например, Kuroda и сътрд., J. Virology 63/4/: 1677-1685 и Price и сътр., 1989 г., Proc. Natl.Acad.Sci 86: 14531456/. Клетките SF-9 се заразяват едновре менно с vAcDK9.2 и wt-AcMNPV при множество инфекции /МО1/ от 10 и 2, съответно. В съшото време втора група SF-9 клетки се заразяват само с Wt-AcMNPV /МО1/=2/. Пет дни след заразяването инклузионните тела се събират чрез разрушаване на клетката и диференциално центрофугиране, /например, Wood, 1980, Virology 104: 392-399/. Инклузионните тела се преброяват на хематицометър. Клетките, които се заразяват едновременно cvAcDK9.2 и wt-AcMNPV, произвеждат по-малко на брой и по-малки тела, отколкото клетките, заразени само с wtAcMNPV. Добивът на полихедралната инклузия /Р1В/ от смесеното заразяване е 4,6 Р1В/ клетка, докато добивът от чистото заразяване с wr-AcMNPV е 33,3 Р1В/клетка.

За оценката на биологичната активност на едновременно включения УАсДК 9,2 в сравнение с тази на wt-AcMNPV се използва опит с включване на диета. Смесена или див тип PIB се включва в храна на инсект не на агарова основа при концентрация 10⁵ PIB/g храна. Храната се разпределя в малки контейнери, които след това се заразяват с неонатни TBW ларви /1 за контейнер, п=20/. На контролни ларви се дават идентични количества нетретирана храна. Ларвите се оставят да се хранят колкото искат и се наблюдават периодично за развиването на симптомите. Резултатите са показани в таблица II. Не се наблюдават никакви ефекти за първите 48 h, но след 72 h повече от 50% от ларвите, които са се хранили със смесена PIB, са парализирани. По същото време вирусът от див тип се проявява ефект. След 96 h повече от 90% от ларвите, третирани рекомбинантно, са парализирани, докато само 10% от третираните ларви от дивия тип са умрели или умиращи. След 120 h, 100% от рекомбинантно-третираните ларви са мъртви или умиращи, в сравнение със 75%, ако ларвите са третирани с wt-AcMNPV. Така, при опит на хранене както при инжекционния опит, ларвите, третирани с УАсДК9,2, са недееспособни в значително по-кратък период от време, отколкото ларвите, третирани с wt-AcMNPV.

Таблица II

Опит с доза, предизвикваща реакция-отговор в TBW с vAcDK9.2 % парализа

Доза (PFU/ларва)	24 h	48 h	72 h	96 h	120 h
5.1 χ 105	0	80	100	100	100
5.1 χ 104	0	35	95	100	100
5.1 х 103	0	25	75	90	100
5.1 χ 102	0	0	55	85	100
5.1 χ 101	0	0	20	65	95
Контрола	0	0	0	0	0

Таблица III

Сравнение на vAcDK9.2 и wt-AcMNPV чрез инжектиране в ларви на червей по тютюневите пъпки (TBW), на зелева пеперуда (CL) и на памучен червей по цвеклото (В AW)

Третиране	Видове	24 h	48 h	72 h	96 h	120 h	168 h
vAcDK9.2	TBW2	0	0	100	100	100	100
wt-AcMNPV	TBW	03	0	0	0	0
Контрола	TBW	0	0	0	0	0	0
vAcDK9.2	cl5	0	100	100	100	100	N/A
wt-AcMNPV	CL	0	0	0	0	100	N/A
Контрола	CL	0	0	0	0	0	N/A
vAcDK9.2	BAW,	0	70	90	100	100	100
wt-AcMNPV	BAW	0	0	0	0	0	100
Контрола	BAW	0	0	0	0	0	30

1/ Вирусите са инжектирани при 5 χ 10³ PFU/ларва; контролите са инжектирани с идентични обеми от среда на тъканна култура.

2/ η = 8; означава средна маса приблизително 300 mg за ларва.

3/ 2 от 8 ларви несъмнено са умрели от физическа травма, дължаща се на инжектирането и са изключени от по-нататъшен анализ.

4/ Смъртността от wt-AcMNPV е 100% на деветия ден.

5/ η = 10; означава средна маса, приблизително 165 mg за ларва.

6/ η = 20 за vAcDK9.2; η = 10 за wt-AcMNPVn контролите; средна маса приблизително 200 mg за ларва.

Пример 12. Промотор на генното кодиране на ДК9,2

За достъп на контролните елементи на гена, кодиращ ДК 9,2, се прави една геномна бибилиотека. ДНК се получава от паяци, като се използва един протокол, адаптиран от Herrmann and Frischauf /в “Методи в ензимологията”, том 152, Academic Press, Inc., 1987, стр. 180-183/. ДНК се разлага частично с Sau ЗА и се фракционира чрез центрофугиране в 10%

- 38% плътност захарозен градиент при 25,000 об./min в продължение на 16 h с ротор TIS-55 /Beckman Co., Ltd./. Обединени ДНК фракции с 35-45 kb се приготвят за инжектиране в Xho I усвоен космиден вектор, като се използва метода “частично запълване”. Една четвърт от лигационната смес се пакетира във фагови частички, като се използва Gigapak gold™ / Stratagene, LaJolla, СА/ и след трансформация се получава еквивалента с над 3 х 10’ Ьр на ДНК от паяк. Библиотеката се поставя в двадесет и пет 150 mm петриеви панички и се повдига върху найлонови филтри за изпробване с белязана с радиоактивен атом ДНК.

Колония лифтове на геномната библиотека на Diguetia се скринират в серии с белязана с радиоактивен атом сДНК, кодираща ДК 9,2, и олигонуклеотиди с белязан край, кодиращи аминотерминалите, карбокситерминалите и вътрешна проба. Един космид, сДК2 се хибридизира с всяка от пробите. Eco R1 усвоена космидна ДНК показва, че 3,0 kb фрагмент хибридизира както с вътрешната, така и със Стерминалните проби. Двойно усукано секвениране на космидната сДНК, като се използват трите праймера, определени по-горе, потвърждава изолирането на гена за ДК 9,2 и предполага възможността, че други /или друг/ гени от това семейство могат да пребивават на същото съседно място на ДНК, както аминотерминалния олигонуклеотид /който има висока степен на хомоложност към всички инсектицидно ефективни пептиди на Diguetia/ запълва многобройните места върху космидната ДНК.

За достъп до промоторния участък на гена за ДК 9,2 беше синтезиран олигонуклеотид, съответстващ на пре /сигнална секвенция на чувствителната нишка. PCR разширяването между този пример и друг от нашите ген специфични праймери бе планирано сигналната секвенция да бъде повече от 3,000 Ьр насочени нагоре потоци на аминотерминалния аксон. Праймер върху нечувствителната нишка след това се използва за секвениране на геномната ДНК в участъка, директно насочена нагоре към 5' края на сДНК, кодираща сигналния пептид.

Секвениращият ДНК, насочен нагоре поток на сигналната последователност върху геномната ДНК, предполага друг инатрон при Ьр-11 от началния метионинов кодон. Синтезира се олигонуклеотиден праймер, съответстващ на 5' участъка на прекурсора на ДК 9,2, сДНК и се използва за зареждане на PCR реакция за определяне големината на наместващата се секвенция, която е между транскрипционното и транслационното изходни места. Разширен продукт с 1,000 основни двойки потвърждава наличието на нитрон и осигурява определяне на неговия размер. ДНК секвениране на геномната ДНК, насочена нагоре към транскрипционното начало /приема се че е еквивалентно на 5' края на сДНК/ не показва наличие на промотор. ДНК последователността на промоторния участък е представена в Sequence LD Listing No.8. Този предполагаем промотор съдържа много от важните контролни сигнали, които присъстват главно в други еукариотични промотори в участъка, директно насочен нагоре от транслационното изходно място. Този промотор, или участъци от този промотор могат да бъдат използвани за транскрипция/транслация на други еукариотни гени в бактерии, вируси, растения или животни.

Пример 13. Неврофизиологични изследвания, свързани с начина на действие на ДК 9,2

Извършват се неврофизиологични изследвания за преценка на начина на действие на ДК 9,2. Отчетените резултати от невромускулна връзка и периферен нерв при личинка показват, че ДК 9,2 предизвиква повтарящо се избухващо разтоварване в нервите, които са чувствителни към блокиране с тетродотоксин. Така, мястото на действие на този токсин е вероятно чувствителния към напрежение натриев канал на нервната мембрана. Допълнителни изследвания показват, че ДК 9,2 последователно възбужда периферните нерви при прагова концентрация от 10 пМ. В допълнение, той е най-малко 50 пъти по-активен /силен/ в сравнение с токсин 4 от скор. пиона Leiurus quinquestriatus по отношение на бозайници.

Използваните експериментални животни в този опит са ларви на домашна муха Musca domesticab трети стадий на развитие. Ларвите се обездвижват с карфици и се отварят през гърба чрез среден стреловиден разрез. Тялото се закрепва с карфици и вътрешностите се отстраняват, за да се открие мускулатурата на стената на тялото. Където съществуват, периферните нерви се отделят и мозъкът се отстранява. Препаратът се потапя в солен разтвор за инсекти, съставен от /мМ/: NaCl / 140/, КС1 /5/, СаС1₂ /0,75/, MgCL, /4/, NaHCO₃ /5/ и HEPES /5/ pH = 7,2.

Електрод, стимулиращ всмукването, се прикрепва към който и да е удобен нервен ствол, за да се отчете невромускулната трансмисия. Граничната величана за стимулиране се повишава бавно, докато се наблюдават контракции на мускулно влакно 6 или 7. След това, това влакно се пробожда с отчитащ вътреклетъчен микроелектрод, свързан към вътрешноклетъчен превключвател, използван за следене на възбуждащите следсиноптични потенциали /EPSP/ в отговор на стимулиране на нерва.

За отчитане на повишаващата се електрическа активност в периферни нервни влакна всмукващият електрод се прикрепва към АС превключвател. Сигналите се увеличават 100 пъти и мощността прониква при 0,3 и 1 kHz. Всички отчетени резултати се внасят в компютъризираната инструментална система за демонстриране и анализ.

Първоначалните експерименти по отношение действието на ДК 9,2 използват препарат от невромускулно съединение. Единично стимулиране се подава към периферния нерв, което води до единичен EPSP в мускулатурата на телесната стена. В присъствието на ДК 9,2, единичен стимул води до високочестотно разтоварване на EPSP. В допълнение към разтоварването, предизвикано от стимулиране, спонтанно експлозивно разтоварване също може да се появи и може да се запази за няколко минути. Времетраенето на такова експлозивно разтоварване обикновено е над 1 s, а честотата на EPSP по това време е > 30 Hz. Наличието на експлозивно разтоварване причинява енергична контракция в мускулатурата на телесната стена, което създава трудности при поддържане на вътреклетъчните отчитания тъй като електродът се изхвърля от мускула по време на контракцията, предизвикана от експлозивното разтоварване. Съответно, повечето експерименти са извършени в солен разтвор, съдържащ висока концентрация захароза /300 тМ/, който потиска контракцията, но оставя електрическата активност неповлияна. Подобни резултати се получават, когато се използват нормални солени разтвори или солени разтвори с високо съдържание на захароза.

Бустерните разтоварвания, наблюдавани след третиране с ДК 9,2, са подобни на тези, наблюдавани в присъствието на токсини от скорпион, протеини, за които е известно, че взаимодействат с чувствителните към напрежение натриеви канали на нервните мембрани. Така, бустерните разтоварвания биха могли да бъдат блокирани чрез специфичния към нат риевите канали тетродотоксин /ТТХ/. Способността на ТТХ да предотвратява или премахва предизвиканото от ДК 9,2 взривяване е показано във фигура 5. Във фигура 5А, EPSP се блокира бързо от 1 pmol ТТХ, което прави препарата интензивен за последващо третиране с 100 пМ ДК 9,2. Подобен експеримент е показан във фигура 5В, където взривяване се предизвиква от ДК 9,2 и се спира чрез последващо прилагане на ТТХ. В този експеримент началото на взривяването измества електрода от мускула, което води до извършване на ново убождане, когато трябва да се възстанови записът. След като вече се намери подходящо място за провеждане на отчитането, следи се за взривяване около 2 min и препаратът показва прекъсване на активността секунди след третиране с ТТХ.

С оглед да се предварят проблемите, свързани с вътрешноклетъчното отчитане от мускул с контракции, горните експерименти се повтарят отново, като се използват извънклетъчни записи от периферни нерви на личинка. Тези записи включват увеличаваща се сетивна нервна активност наред със спонтанна антидромична активност на двигателни влакна. При 70 пМ, ДК 9,2 причинява увеличаване на нервното разтоварване, което не е повлияно от последващото третиране със солен разтвор, но се блокира бързо от 0,4 pmol ТТХ. Освен това, прилагането на ТТХ преди ДК 9,2 предотвратява появата на взривяване.

Предприети са допълнителни изследвания за определяне на чувствителността на нервите на инсект към ДК 9,2 и за сравняване на неговата активност с тази на стандартен токсин от скорпион. ДК 9,2 се тестува върху препарат от периферен нерв, като се започва при 1 пМ и концентрацията се повишава всеки 5 min или докато се наблюдава увеличаване на активността. Препаратът в количество 1 пМ и 5 пМ е неактивен, но в количество 10 пМ е след кратко забавяне. Резултатите от пет препарата се използват за определяне ефективната пределна концентрация на ДК 9,2 по отношение на нерв от инсект и са представени в таблица IV.

Таблица IV.

Концентрация -отговор	Брой третирания	Брой реакции-отговор	7 /о
1 пМ	2	0	0
2 пМ	1	0	0
5 пМ	3	1	33
10 пМ	3	3	100

Последната група експерименти определят по подобен начин чувствителността на инсектните нерви към токсин 4 от скорпиона Leiurus quinquestriatus (LqTX 4). Препаратите /п = 4/ са подложени на концентрации от LqTX 4 до 500 пМ, но не показват ефект. Това установяване е в съответствие с предишни изследвания, при които е установено, че LqTX 4 е специфичен за натриевите канали на бозайници. По-нататъшно предизвикване на тези препарати с ДК 9,2 изисква 10 - 30 пМ, за да се получи реакция-отговор. Слабото повишаване на ефективната пределна концентрация на ДК 9,2 вероятно се дължи на слабо блокиращо действие от неактивния LqTX 4. Тези експерименти демонстрират, че ДК 9,2 е най-малко 50 пъти по-активен, отколкото LqTX 4 по отношение нервите на насекоми.

Таблица V.

Секвенция ID /последователност/	Описание
1.	Аминокиселинна последователност на ДК 9,2
2.	Кодираща сДНК последователност на ДК 9,2
3.	Аминокиселинна последователност
	на ДК 11
4.	Кодираща сДНК последователност
	на ДК 11
5.	Аминокиселинна последователност
	на ДК 12
6.	Пълна сДНК последователност, кодираща ДК 9,2
7.	Аминокиселинна последователност за сигнална/водеща последователност на прекурсорния ДК 9,2
8.	ДНК последователност за промоторния участък ДК 9,2

Данни

1. Обща информация:

I. Заявител: Karen J. Krapcho; Bradford 45 Carr VanWagenen; J. R. Hunter Jackson

II. Заглавие на изобретението: Инсектицидно ефективни пептиди

III. Брой на секвенциите /последователностите/: 8 50

IV. Адрес за кореспонденция:

А. Получател: Woodcock, Washbum, Kurtz,

Mackiewicz & Norris

B. Улица: One Liberty Place - 46 th Floor

C. Град: Philadelphia

D. Щат: Pennsylvania

E. Страна: USA

F. Пощенски код: 19103

V. Компютърна форма на разчитане:

A. Среден тип: дискета 3,5 инча, 1,44

Mb съхранение

B. Компютър: IBM PS/2

C. Оперираща система: PC-DOS

D. Софтуер: WORDPERFECT 5,0

VI. Текущи данни на заявката:

A. Заявка номер:

B. Дата на подаване:

C. Класификация:

VII. Предишни данни за заявката:

A. Заявка номер: 662, 373

B. Дата на подаване: 1 март 1991 година

VIII. Адвокатска/агентска информация:

A. Име: John W. Caldwell, Esq.

B. Регистрационен номер: 28, 937

C. Референтен/списъчен номер: FMC-

0054

IX. Телекомуникационна информация:

A. Телефон: /215/ 568 - 3100

B. Телефакс: /215/ 568 - 3439

2. Информация за SEQ ID NO: 1:

I. Характеристики на последователно- стта:

A. Дължина: 56 аминокиселини

B. Тип: аминокиселина

D. Топология: неизвестна

XI. Описание на секвенцията: SEQ ID NO: 1:

Ala

Lys

Asp

Gly

Asp

Tai

Glit

Gly Fro

Ala

Gly

Cys

Lys

Lys

Tyr

5'

10

15

Asp

Vai

Girt

Cys

Asp

Ser

Gly

Gin Cys

Cys

Xaa

Lys

Gin.

Tyr

Ьеч

2G

25

30?

Trp

T'yr

Lys

Trp

Arg

Fro.

Leu-

Asp Cys

Arg

Cys

Heir

Lys

Ser

Gly

55

40

4-5

Bie

Phe

Ser

Ser

Lys

Cys

Tai

Cys Arg

Asp

Tai

50

55

стта:

2. Информация за SEQ ID NO: 2: С. Спирализация: двойна

I. Характеристики на последователно- 25 L Топология: неизвестна

XI. Описание на секвенцията: SEQ ID

A. Дължина: 275 бази двойки N0: 2:

B. Тип: нуклеинова киселина

GCC AAG GAC GGC GAC GTC GAG GGG OCT GCG30

Ala Lys Asp Gly Asp Tai Gin Gly Fro·Ala

5 .TO

GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC60

Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Vai Glu Cys Asp

1520

AGT'	GGA	GAG	TGC	TGC	ВШЗ	AAG	GAG	TAG	CTG	90
Ser	Gly	Gilt.	Cys	Cys	Xaa	Lys	Girt	Tyr	Leir
				25					30
TGG	TAC	AAG	TGG	CGA	CCC	CTG	GAT	TGC	CGI	120
Trp	Tyr	Lys	Trp	Arg	Fro	Lett	Asp	Cys	Arg
				35					40
TGC	CTA	AAG	AGC	GGT	TTC	TTC	AGC	AGG	AAG	193
Cys	Leu-	Lys	Ser	Gly	Pile	File	Ser	Ser	Lys
				45					50
TGC	G'TT	TGC	AGA	GAC	GTG	TAGATTTGAA ATGAIATTCG	188
Cys	Vai	Cys	Arg	Asp	Vai

TGTTGTTTTT TGGTTGTAGA TGACCTAATG AAAGAACTGA

22S

CATGAATIAAA ACAAAATT.GA ATGAATTGAA AAAAAAAAAA

AAAAAGC

268

275

2. Информация за SEQ ID NO: 3: C. Топология: неизвестна

I. Характеристики на последователността: XI. Описание на секвенцията: SEQ ID

A. Дължина: 58 аминокиселини N0: 3:

B. Тип: аминокиселини

ALa

Lys

Asp

Gly

Asp

Tai

Дуе

Gly Pro

Ala

Gly·

Cys

Met;

Lys

Tyr

5

ю

15

Uys

Ser

Gly

Asp

Cys

Arg

Gly

Lys Thr

Cys

Cys

Asp

Gilt

Glm

Tyr-

2©

25

50

Leu-

Trp

Tyr

Lys

ТГр

Arg

Asn.

Lew Ala

Cys

Arg

Cys

Phe

Thr

Vai

55Г

4P

¢5

Gilt

Tai

Phe

Lys

Lys

Asp

Cys

Trp Cys

Asn

Asp

He

Ser

50

55

2. Информация за SEQ ID NO: 4: 15

I. Характеристики на секвенцията:

A. Дължина: 204 основни двойки

B. Тип: нуклеинова киселина

С. Спирализация: двойна

I. Топология: неизвестна

XI. Описание на секвенцията:

N0: 4:

GCC:

AAG'

GAT

GGC

gat

GTC

AAG·

GOA

CCT: GCT

GGC

TGC ATG

AAG TAC AAG

Ala 1

Lys

Asp

Gly

Asp 5

Vai

Lys

Gly

Pro

Ala TO

Gly

Cys Met

Lys Tyr Lys 15

AGO:

GGA

GAC

TGC

AGA

GGC

AAA

act:

TGC

TGC

GAC

CAA CAG

TAC CTC TGG

95

Ser

Gly

Asp

Cys

Arg

Gly- Lys

Thr

Cys

Cys

Asp

Gin. Gin.

Tyr Lew Trp

20

25

50

TAC

AAG

TGG

CGG

A.AT!

CTT

GCA

TGC

AGO-

TGC

TT.C-

ACG GTC

GAA GTG TTC

144

Tyr

Lys

T2£

Arg

Asn.

Leu

Ala

Cys

Arg

Cys

Phe

Thr Tai

Glw Vai. Phe

35

40

45

AAG

AAG

GAC

TGC

TGG

TGC

AAC

GAC

ATC

AGT

TAATTCCACA TGAAGAAGTA 194

Lys

Lys

Asp

Cys

ТГр Cys

Asm

Asp

He

Ser-

55

AGCATCTCCT'

2. Информация за SEQ ID N0: 5:

I. Характеристики на секвенцията: SEQ ID N0: 5:

А. Дължина: 62 аминокиселини

204

В. Тип: аминокиселини

I. Топология: неизвестна

XI. Описание на секвенцията: SEQ ID

N0: 5:

Ala	lys	Asp	Gly	Asp	Phe	a».	0y Pro Pro	Gly	Zaa	Lew	Lys Met
1				5			10				15
Gly	Glw	Lew	Zaa	Lys	Gly	Gly	Thr Zaa- Zaa	Thr	Lys	Tai	Tyr Lys
				20			25				30
Tyr	Trp	lys	Trp	Arg	Lys	Lew	Gill-. Cys Leu	Gly	Lys	Asn	Asp Gly
				35			40				45
Trp	Phe	Lys	Lys	Lys	Plie	He	Cys Asp Glu-	Arg	Zaa	Asn.	Pro Zaa
				50			. 55				SO
laa	laa

2. Информация за SEQID NO: 6: I. Характеристики на секвенцията:

A. Дължина: 359 основни двойки

B. Тип: нуклеинова киселина

C. Спирализация: двойна

D. Топология: неизвестна

XI. Описание на секвенцията: SEQ ID

NO: 6:

ATATTACAAG CCGCTCCAGT AGCCGAAGAA GCCTAAGCCA AGAACCCAGG TCCGCCACA 60

ATG AAG GTT '

гтт: ι

GTT 1

GTA '

CTG TTG TGC TTG· ί

PCT· CTG ί

1CA I

GCA I

GTT

T&C1-05

KeJ. Lys

VaL

Phe

Vai

Vai

Leu: Leu

Cys

Leu Ser

Leu.

Ala

Ala

Vai

Tyr

-35

-30

-25

GCC TTG

GAG

GAA

AGA

CEA

GAC AAA

GAC

GCC

GAC

ATC

ATG

CTT

GAT'

Ala Беи.

Glu

Glu

Arg

Leu

Asp Lys

Asp

Ala

Asp

He

liet

Leu

Asp

Ser·

-20

-15

-10

CCA GCC

GAC

ATG

GAA

AGA

GCG AAG

GAC

GGT

GAC

GTG

GAA

GGG

CCT

Pro ALa

Asp

Met

Glu.

Arg.

Ala Lys

Asp

Gly Asp

Vai

Glu

Gly Pio

Ala

-5

1

5

1O

GGC TGC

AAG

AAA

TA.C

GAC

GTA GAG

TGC

GAC

AGT

GGA

GAG

TGC

TGC

MMS

-252

Gly Cys

Lys

Lys

Tyr

Asp

VaL GLix Cys

Asp

Ser Gly Glu Cys

Cys

XaS

15

20

25

AAG C AG

TAG

CTG

TGG

TAG

AAG EGG CGA

CCC

CTG GAT

TGC

CGA

TGC

CTA

300

Lys Gin

Tyr

Leu

Trp

Tyr

Lys Tip

Arg

Pro?

Leu..

Asp

Cys

Arg

Cys

Lett

30

35

40

AAG AGC

GGT

TTC

TIC

AGC

AGC AAG

TGC

GTT

TGC

AGA

GAC

GTG

342

Lys Ser

Gly Plie

Pile

Ser

Ser Lys

Cys

Vai. Cys

Arg

Asp

Vai

45

50

55

TAGATTTGAA TTCCAAC . 559

2. Информация за SEQ ID NO: 7: I. Характеристики на секвенцията:

A. Дължина: 38 аминокиселини

B. Тип: аминокиселини

C. Спирализация:

D. Топология: неизвестна

XI. Описание на секвенцията: SEQ ID

N0: 7:

Met

Lys

VaL

Pile

VaL

VaL

Leu

Leu

Cys

Leu

Ser

Leu

x\La

ALa

—35

-30

-25

Vai

Tyr

Ala

Leu

Glu

GLu

Arg

Leu

Asp

Lys

Asp

Ala

Asp

lie

-23

-15

•

Ket

Leu

Asp

Ser

Pro

Ala

Asp

Met

Glu

Arg

-та —5 -ι°

2. Информация за SEQ ID N0: 8: I. Характеристики на секвенцията:

A. Дължина: 421 основни двойки

B. Тип: нуклеинови киселини

С. Спирализация: двойна

I. Топология: неизвестна

XI. Описание на секвенцията: SEQ ID

N0: 8:

TTTAGCAGCC

CAAG'GCTAGA GAGCTGCCGG

ACAGGTAAAC

CTGAACTACA

C AATGGCCCAgQ.

roCCCACGCT

САААССАСАГ

CCCAACTTTT

TTTTTGGTrAA

AGACAG’ETG'JJ¹^

TGCATTCTAA aagcacgttt: tactgcasct

QCTCAGACTG

TCTGCTGCTG

CTCOAGGCA^j

AGTATGTTTC

CTACAGAATT

CCA.CC&AAGC

AET.CTTCGTG

GTACGACGCA gtaagcaisa_24C)

CGCTCAOTTT

TTTTTGAATC

GGAATAEGTA

ATASCTGCAG

CGACACTTAT

TGAAATGTTI

CTCCTTCG-AC

AAGCAATCGC

TTTATCGGAA

EACCTGCATG

ACATAACTGA

CAAAACACA^

GW3CTCCAG

AAACAACGAA

AACATTCATT. CCTCTATATA

ACTAICGGAG

G-AG^LGCTOTA.

420

421

Claims (69)

1. Патентни претенции 15

   1. Съществено пречистен, инсектицидно ефективен пептид, изолиращ се от отрова на паяк Diguetia canities или негова приемлива в земеделието или в градинарството сол. 20
2. 2. Пептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че отровата от паяк е от Diguetia canities.
3. 3. Инсектицидно ефективен пептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, 25 че има молекулно тегло около 6371 - 6397 D, определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза, и негова приемлива в земеделието или в гради- 30 нарството сол.
4. 4. Инсектицидно ефективен пептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че има по същество същата аминокиселинна последователност като определената в SEQ ID 35 NO : 1.
5. 5. Инсектицидно ефективен пептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че има молекулно тегло около 6740 D, както е определено чрез масова спектрометрия и пре- 40 местване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза, и негова приемлива в земеделието или в градинарството сол.
6. 6. Инсектицидно ефективен пептид съг- 45 ласно претенция 1, характеризиращ се с това, че има същата аминокиселинна последователност, като определената в SEQ ID NO : 3.
7. 7. Инсектицидно ефективен пептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че има молекулно тегло около 7080 D, както е определена чрез масова спектрометрия и пре местване като единичен пик при високоефективна течна хроматография с обратна фаза, и негова приемлива в земеделието или в градинарството сол.
8. 8. Инсектицидно ефективен пептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че има по същество същата аминокиселинна последователност, като определената в SEQ ID NO : 5.
9. 9. Съществено изолирана ДНК последователност, характеризираща се с това, че ДНК последователност кодира инсектицидно ефективен пептид, съществено изолиран от отрова на паяк Diguetia canities.
10. 10. ДНК съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че отровата от паяк е от Diguetia canities.
11. 11. Съществено изолирана ДНК последователност съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че ДНК последователността е като определената в SEQ ID NO : 2.
12. 12. Съществено изолирана ДНК последователност съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че ДНК последователността е като определената в SEQ ID NO : 4.
13. 13. Съществено изолирана ДНК последователност съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че ДНК последователността е като определената в SEQ ID NO : 6.
14. 14. Рекомбинантен експресионен вектор, характеризиращ се с ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, съществено изолиран от отрова на паяк Diguetia, характеризиращ се с това, че векторът е способен да осъществи експресия на посочената кодираща последователност в трансформирани клетки.
15. 15. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че отровата от паяк е от Diguetia canities.
16. 16. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че ДНК последователността кодира инсектицидно ефективен пептид, охарактеризиран с молекулно тегло около 6371 - 6397 D, както е определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза.
17. 17. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че ДНК последователността по същество кодира пептида, определен в SEQ ID NO : 1.
18. 18. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че ДНК последователността кодира инсектицидно ефективен пептид, като споменатият пептид е охарактеризиран с молекулно тегло около 6740 D, определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза.
19. 19. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че ДНК последователността по същество кодира пептида, определен в SEQ ID N0 : 3.
20. 20. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че ДНК последователността кодира инсектицидно ефективен пептид, охарактеризиран с молекулно тегло около 7080 D, определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза.
21. 21. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че ДНК последователността по същество кодира пептида, определен в SEQ ID N0 : 5.
22. 22. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че ДНК последователността е по същество като определената в SEQ ID N0 : 2.
23. 23. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че ДНК последователността е по същество като определената в SEQ ID N0 : 4.
24. 24. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че ДНК последователността е по същество като определената в SEQ ID N0 : 6.
25. 25. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че трансформираните клетки са от растения, поддаващи се на масово нападане от инсекти.
26. 26. Трансгенно растение, характеризиращо се с това, че има една ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиран от отрова на паяк Diguetia canities, вмъкната в зародишната линия на растението или в негов прародител, така че характерната черта на експресията на ДНК последователността се унаследява от последващите поколения на растението чрез полово или безполово размножаване.
27. 27. Рекомбинантен бакуловирусен експресионен вектор, способен да експресира ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиран от отрова на паяк Diguetia canities, в гостоприемник или в клетка на инсект гостоприемник.
28. 28. Рекомбинантен бакуловирусен експресионен вектор съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че експресионният вектор е бакуловирусен геном, охарактеризиран чрез посочената ДНК последователност, вмъкната в полихедринов ген, и при транскрипционен контрол на бакуловирусен полихедринов промотор.
29. 29. Рекомбинантни клетка от гостоприемник, трансформирана или трансфектирана с ДНК последователност, характеризираща се с това, че ДНК последователността кодира инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиран от отрова на паяк Diguetia canities, по начин, създаващ възможност на клетката гостоприемник да експресира посочения пептид.
30. 30. Рекомбинантни клетки на гостоприемник съгласно претенция 29, характеризиращи се с това, че отровата от паяк е извлечена от вида Diguetia canities.
31. 31. Ракомбинантни клетки на гостоприемник съгласно претенция 29, характерзиращи се с това, че ДНК последователността кодира инсектицидно ефективен пептид, охарактеризиран чрез молекулно тегло около 6371 6397 D, както е определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза.
32. 32. Рекомбинантни клетки на гостоприемник съгласно претенция 29, характеризиращи се с това, че ДНК последователността по същество кодира пептида, определен в SEQ ID NO: 1.
33. 33. Рекомбинантни клетки на гостоприемник съгласно претенция 29, характеризиращи се с това, че ДНК последователността кодира инсектицидно ефективен пептид, охарактеризиран с молекулно тегло около 6740 D, както е определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза.
34. 34. Рекомбинантни клетки на гостоприемник съгласно претенция 29, характеризиращи се с това, че ДНК последователността по същество кодира пептида, определен в SEQ ID NO: 3.
35. 35. Рекомбинантни клетки на гостоприемник съгласно претенция 29, характеризиращи се с това, че ДНК последователността кодира инсектицидно ефективен пептид, охарактеризиран чрез молекулно тегло около 7080 D, както е определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза.
36. 36. Рекомбинантни клетки на гостоприемник съгласно претенция 29, характеризиращи се с това, че ДНК последователността по същество кодира пептида, определен в SEQ ID NO: 5.
37. 37. Рекомбинантни клетки на гостоприемник съгласно претенция 29, характеризиращи се с това, че ДНК последователността е по същество определената в SEQ ID NO: 2.
38. 38. Рекомбинантни клетки на гостоприемник съгласно претенция 29, характеризиращи се с това, че ДНК последователността е по същество определената в SEQ ID NO: 4.
39. 39. Рекомбинантни клетки на гостоприемник съгласно претенция 29, характеризиращи се с това, че ДНК последователността е по същество определената в SEQ ID NO: 6.
40. 40. Метод за получаване на инсектицидно ефективен пептид, характеризиращ се с това, че включва:

    а/ култивиране на рекомбинантни клетки на гостоприемник, характеризиращо се с това, че рекомбинантен експресионен вектор, трансформиран или трансфектиран в клетките на гостоприемник, има ДНК последователност, код!фаща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолирана от отрова на паяк Diguetia canities, характеризиращ се с това, че векторът е способен да осъществи експресия на кодиращата последователност в трансформирани клетки; и б/ извличане на инсектицидно ефективния пептид от рекомбинантната клетъчна култура на гостоприемника.
41. 41. Рекомбинантен пептид, характеризиращ се с това, че култивирането на рекомбинантните клетки и извличането на инсектицидно ефективен пептид се осъществява съгласно претенция 40.
42. 42. Метод съгласно претенция 40, характеризиращ се с това, че ДНК последователността кодира инсектицидно ефективен пептид, охарактеризиран чрез молекулно тегло около 6371 - 97 D, както е определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза.
43. 43. Метод съгласно претенция 40, характеризиращ се с това, че ДНК последователността по същество кодира пептид, определен в SEQ ID NO: 1.
44. 44. Метод съгласно претенция 40, характеризиращ се с това, че ДНК последователността кодира инсектицидно ефективен пептид, охарактеризиран чрез молекулно тегло около 6740 D, както е определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза.
45. 45. Метод съгласно претенция 40, характеризиращ се с това, че ДНК последователността по същество кодира пептида, определен в SEQ ID NO: 3.
46. 46. Метод съгласно претенция 40, характеризиращ се с това, че ДНК последователността кодира инсектицидно ефективен пептид, охарактеризиран чрез молекулно тегло около 7080 D, както е определено чрез масова спектрометрия и преместване като единичен пик върху високоефективна течна хроматография с обратна фаза.
47. 47. Метод съгласно претенция 40, характеризиращ се с това, че ДНК последователността по същество кодира пептида, определен в SEQ ID N0: 5.
48. 48. Метод съгласно претенция 40, ха рактеризиращ се с това, че споменатата ДНК последователност е по същество като определената в SEQ ID NO: 2.
49. 49. Метод съгласно претенция 40, характеризиращ се с това, че ДНК последователността е по същество като определената в SEQ ID NO: 4.
50. 50. Метод съгласно претенция 40, характеризиращ се с това, че ДНК последователността е по същество като определената в SEQ ID NO: 6.
51. 51. Метод за контролиране на безгръбначни вредители, характеризиращ се с това, че посочените вредители контактуват с ефективно количество пептид, изолиран от отрова на паяк Diguetia canities, или негова сол, приемлива в земеделието или градинарството.
52. 52. Метод съгласно претенция 51, характеризиращ се с това, че отровата от паяк е от Diguetia canities.
53. 53. Метод съгласно претенция 51, характеризиращ се с това, че вредителите са инсекти.
54. 54. Метод съгласно претенция 51, характеризиращ се с това, че вредителите са Lepidoptera.
55. 55. Метод за контролиране на безгръбначни вредители, характеризиращ се с това, че посочените вредители контактуват с рекомбинантен бакуловирус, способен да експресира ефективно количество от пептид, изолиран от отрова на паяк Diguetia canities.
56. 56. Инсектициден състав, характеризиращ се с това, че съдържа инсектицидно ефективно количество от пептид съгласно претенция 55 или негова сол, приемлива в земеделието или градинарството, и приемлив в земеделието или градинарството носител.
57. 57. Антитяло, характеризиращо се с това, че по същество е имунореактивно с пептида, изолиран от отрова на паяк Diguetia canities.
58. 58. Антитяло съгласно претенция 57, характеризиращо се с това, че отровата от паяк е извлечена от вида Diguetia canities.
59. 59. Метод за приложение на антителата съгласно претенция 57, за откриване наличието на инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиран от отрова на паяк Diguetia canities, характеризиращ се с това, че включва: а/ получаване на отрова от паяк; б/ контактуване на отровата от паяка с посочените антитела, спретнати към маркировка за откриване и в/ откриване на белязаните антитела, свър зани към пептида.
60. 60. Метод съгласно претенция 59, характеризиращ се с това, че отровата от паяк е извлечена от вида Diguetia canities.
61. 61. ДНК сонда, характеризираща се с това, че е получена от ДНК последователност, кодираща инсектицидно ефективен пептид, който по същество е изолиран от отрова на паяк Diguetia canities.
62. 62. Метод за откриване наличието на нуклеинова киселина, кодираща инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиран от отрова на паяк Diguetia canities, характеризиращ се с това, че включва: а/ получаване на нуклеинова киселина от паяк; б/ контактуване на нуклеиновата киселина с ДНК пробата съгласно претенция 61; и в/ откриване на посочената проба, свързана към нуклеиновата киселина.
63. 63. Метод за използване на антителата съгласно претенция 57 за пречистване на инсектицидно ефективен пептид, по същество изолиран от отрова на паяк Diguetia canities, характеризиращ се с това, че включва: а/ съединяване на антитялото към твърд носител; б/ контактуване на разтвор, съдържащ пептида, със споменатото антитяло, свързано към твърдия носител, като по този начин пептидът се намира в разтвора, прикрепен към антитялото; в/ отделяне на пептида, прикрепен към .антитялото, свързано към твърдия носител; и г/ събиране на отделения пептид.
64. 64. Препро последователност, охарактеризирана чрез аминокиселинна последователност, имаща по същество секвенциалната хомология с аминокиселинната последователност, определена в SEQ ID NO: 7, или част от нея, характеризираща се с това, че посочената препро последователност или част от нея контролира секрецията и/или нагъването на напълно развития, зрял пептид.
65. 65. Генна структура, характеризираща се с това, че включва аминокиселинна последователност, имаща по същество същата хомоложна последователност с аминокиселинната последователност, определена в SEQ ID NO: 7, или част от нея, оперативно свързана към пептид.
66. 66. Промоторна последователност, характеризираща се с една последователност, имаща по същество хомоложната последователност на аминокиселинната последователност, определена в SEQ ID NO: 8, или част от нея, характеризираща се с това, че посочената промоторна последователност насочва експресията на гена в рекомбинантната структура.
67. 67. Рекомбинантна структура, характеризираща се с това, че има една последователност, по същество с еднаква хомология с тази на последователността, определена в SEQ ID NO: 8, или част от нея, оперативно свързана към гена, който трябва да бъде експресиран.
68. 68. Инсектицидно ефективен пептид, характеризиращ се с това, че посоченият пептид съдържа: а/ дължина на веригата около 55 до около 65 аминокиселини; б/ има повече от 40 % хомоложна последователност с SEQ ID NO: 1, 3 или 5; и в/ има приблизително 7 или 8 цистеинови остатъка.
69. 69. Пептид съгласно претенция 68, характеризиращ се с това, че източникът на пеп- тида е отрова от паяк Diguetia canities.

    Приложение: 5 фигури

    5 Литература

    1. US 4797279.

    2. ЕР 0325400.

    3. ЕР 0340948.

    4. СА 2005658.

    10 5. US 4879236.

    6. US 4861595.

    7. ЕР 0431829.

    8. US 4925664.

    9. ЕР 0395357.

    15 10. ЕР 0374940.

    11. WO 89/07608.

    12. US 4855405.