SI9210212A - Insekticidno učinkoviti peptid - Google Patents

Insekticidno učinkoviti peptid Download PDF

Info

Publication number
SI9210212A
SI9210212A SI9210212A SI9210212A SI9210212A SI 9210212 A SI9210212 A SI 9210212A SI 9210212 A SI9210212 A SI 9210212A SI 9210212 A SI9210212 A SI 9210212A SI 9210212 A SI9210212 A SI 9210212A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
peptide
dna sequence
insecticidally effective
seq
sequence
Prior art date
Application number
SI9210212A
Other languages
English (en)
Inventor
Karen J Krapcho
Bradford C Vanwagenen
John R H Jackson
Original Assignee
Fmc Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fmc Corp filed Critical Fmc Corp
Priority claimed from YU21292A external-priority patent/YU21292A/sh
Publication of SI9210212A publication Critical patent/SI9210212A/sl

Links

Abstract

Izum omogoča insekticidno učinkovite peptide, ki jih lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia, metode za pripravo in uporabo insekticidov in DNA, ki kodira take insekticidno učinkovite peptide.

Description

INSEKTICIDNO UČINKOVITI PEPTIDI
Ta izum se nanaša na insekticidno učinkovite peptide. Bolj natančno, izum se nanaša, inter alia, na insekticidno učinkovite peptide, ki jih lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia, na DNA, ki kodira take insekticidno učinkovite peptide, metode za proizvodnjo omenjenih peptidov in metode za zatiranje brezvretenčarskih škodljivcev.
Nedavno se je javnost jasno zavedla nevarnosti za okolje in toksičnosti za sesalce, ki so povezane z uporabo sintetskih insekticidov. Rezultat tega je bilo hitro zmanjšanje uporabe teh insekticidov. Toda, potreba za učinkovito kontrolo insektov se ni spremenila. To je vzbudilo raziskovalce, da razvijejo nove metode zatiranja insektov.
Najbolj široko uporabljane mikrobne insekticide dobimo iz bakterije Bacillus thurigensis (v tem besedilu B. t.). To bakterijsko učinkovino uporabljamo za zatiranje različnih gosenic, ki jedo listje, japonskih hroščev in komarjev. U.S. Patent No. 4,797,279, izdan 10. januarja 1989 za Karamata et al., odkriva hibridne bakterijske celice, ki vsebujejo gen, ki kodira B. T. kurstaki δ-endotoksin, ter njihovo pripravo.
B.t. hibridi so aktivni proti škodljivcem, ki so občutljivi na seve B.t. kurstaki kakor tudi proti škodljivcem, ki so občutljivi na seve B.t. tenebrionis. Na splošno imajo ti hibridi koristne insekticidne lastnosti, ki so, glede na nivo insekticidne aktivnosti ali spekter aktivnosti ali pa obeh, boljše od tistih, ki so jih opazili pri fizičnih zmeseh roditeljskih sevov. Insekticidne sestavke, ki vsebujejo take mikroorganizme, lahko uporabimo za borbo proti insektom z apliciranjem hibridov v insekticidno učinkoviti količini na insekte ali njihovo okolje.
Drugo izpeljavo iz bakterije B.t. so razkrili v Evropski patentni prijavi, objava št. 0 325 400 Al, izdani Gilrovu in Wilcoxu. Ta izum se nanaša na hibridni gen za toksin, ki je strupen za metuljne insekte. Specifično, izum vsebuje hibridni gen za δendotoksin, ki vsebuje del gena za HD-73 toksin iz B.t. var. kurstaki in del gena za toksin iz B.t. var. kurstaki seva HD-1. Odkrili so hibridni gen za toksin (DNA), ki kodira protein, aktiven zoper metuljne insekte.
Bakterijo B.t. so uporabili, zaradi njenih insekticidnih lastnosti, tudi v
Evropski patentni prijavi št. 0 340 948, izdani Wilcoxu et al. Ta izum se nanaša na hibridne insekticidne toksine, ki jih proizvajajo s fuzijo dela B.t. gena, ki prepozna epitelno celico čreva insekta in B verige toksina davice, da bi pripravili hibridni toksin 13.t., ki je aktiven proti metuljnim insektom. Sugerirali so, naj se hibridni gen vstavi v rastlino ali klonira v bakulovirus, da bi proizvajali toksin, ki ga lahko izoliramo. Alternativno lahko gostitelja, ki vsebuje hibridni B.l. gen, uporabimo kot insekticida z neposredno aplikacijo v okolje tarčnega insekta.
V iskanju insekticidnih spojin so strup škorpijona identificirali kot možen vir spojin, ki imajo insekticidne lastnosti. Dva za insekte selektivna toksina, ki so jih izolirali iz strupa škorpijona Leiurus quinqueslriatus quinquestriatus, sta bila objavljena v: Zlotkin ei al., An Excitatory and a Depressant Insect Toxin from Scorpion Venom both Affect Sodium Conductance and Possess a Common Binding Site, Arch. Biochem. Biophys., 240: 877-87 (1985). V študiji, ki se nanaša na njihove kemijske in farmakološke lastnosti, so odkrili, da cn toksin povzroča hitro vzdražljivo krčno paralizo ličinke muhe, drugi pa počasno pomirjevalno šibko paralizo. Oba vplivata na prevodnost natrija.
Kanadski patent 2,005,658 izdan 19. junija Zlotkinu et al., odkriva inscklicidno učinkovit protein, ki izvira iz škorpijona Leiurus quinquestriatus hebraeus Buthinae, Buthidae. V tem izumu so strup liofizirali in ga podelili v frakcije. Frakcijo z največjo toksičnostjo za ličinke in najnižjo za miši so podvrgli nadaljnem čiščenju in dobili končni produkt, ki ga označujejo kot LghP35.
Grishin, Toxic components from Buthus eupeus in Lucosa singoriensis venoms, Shemyakin Institute of Bioorganic Chemistry, USSR Academy of Sciences, Moscovv 117988, GSP-1, USSR, razkriva štiri toksine, ki so jih izolirali iz strupa škorpijona Buthus eupeus, ki je toksičen za insekte. Razodeli so tudi izolacijo in karakterizacijo toksične komponente strupa tarantole Lucosa Singoriensis. Neočiščen strup je bil za insekte netoksičen.
Ustrezno raziskavam in razvoju, ki so se nanašali na različne sestavke z insekticidnimi lastnostmi, so raziskovalci delali na razvoju metod za proizvajanje insekticidnih genov in njihovo vstavitev v tarčne škodljivce. U.S. patent No. 4,879,236 ki je 7. novembra 1989 izdan Smithu in Summersu, se nanaša na metodo vključitve izbranega gena, združenega z bakulovirosnim promotorjem, v genom bakulovirusa, da bi proizvedli rekombinantni bakulovirosni ekspresijski vektor, zmožen ekspresije izbranega gena v celici insekta. Metoda vključuje cepitev bakulovirusne DNA, da bi dobili fragment DNA, ki vsebuje polihedrinski gen ali njegov del, vključno polihedrinski promotor. Da bi pripravili rekombinantni vektor za premestitev, so fragment DNA vstavili v klonirajočega nosilca in nato vstavili še izbrani gen, tako da je pod kontrolo polihedrinskega promotorja. Rekombinantni vektor za premestitev potem pripeljejo v stik z DNA iz divjega tipa bakulovirusa, tako da se izvrši homologna rekombinacija in inkorporacija izbranega gena v bakulovirusni genom. Odkrili so, da sta bakulovirus Autographa californica (AcMNPV) in njegov pridruženi polihedrinski promotor koristna v proizvodnji viralnega ekspresijskega vektorja, zmožnega izredno visokih nivojev ekspresije izbranega gena v eukariontski gostiteljski celici.
Izumitelji sugerirajo, da bi lahko ekspresijski vektor uporabili v sistemu za kontrolo insešktov s selekcijo gena, ki proizvaja protein, toksičen za specifičnega insekta ali za vrsto insektov in s kloniranjem tega gena v AcMNPV ekspresijski vektor. Sugerirali so, da lahko vektor uporabimo na rastlini ali živali, ki naj bi jo zaščitili. Rekombinantni virus lahko napade celice črevesne stene, potem ko ga je insekt zaužil, nakar se začne replikacija. Alternativna sugestija je, da se gen vstavi v bakulovirusni genom, tako da bi se združil s strukturno sekvenco polihedrina na tak način, da bi polihedrinska obloga v alkalnih pogojih v črevu insekta disocirala in bi se produkt sprostil.
Nadaljna metoda za proizvodnjo insekticidnih genov in njihovo vstavljanje v tarčo, ki jo je treba zaščititi, je bila opisana v: Cutler, Electroporation: Being Developed to Transform Crops: Success with Model Crop Confirmed, AG Biotch. News vol. 7(5): 3 & 17 (1990). Ta članek pouči, da lahko DNA neposredno eleklroporiramo v kaleči pelod in da pelod lahko položimo nazaj na cvet, da naredi semena, iz katerih bodo zrasle transformirane rastline. To metodo so uspešno uporabili pri rastlinah tobaka in je ravno tako lahko uspešna pri koruzi in lucerni; lahko je lažje izvedljiva kot elektroporacija protoplastov, ker je končni cilj oprašitev cvetov in pustiti cvetove, da opravijo delo raje kot regeneracija rastline. Postopek se sestoji iz zbiranja peloda, njegove kalitve v gojišču za kalitev v toku 30-60 minut, nakar bo pelodova cev začela prihajati iz pelodovega zrna, dodatka želene DNA tekoči suspenziji, ki vsebuje pelod, dajanja električnega šoka, da bi se odprle pore v pelodovi cevi, spiranja presežka DNA in polaganja spremenjenega peloda na stigmo rastline in čakanja, da nastanejo semena. To je lahko lažji postopek za prenos kakršnega koli gena v poljedelske rastline.
Še en sistem za predajanje genov so razkrili v U.S. patentu No. 4,861,595 izdanemu Barnesu in Edwardsu 29. avgusta 1989. Ta izum se nanaša na uporabo obdelanih, bistveno nedotaknjenih mikrobnih celic, kot sistema za dostavo proteinskih spojin živalim in ljudem. Mikrobne celice na začetku proizvajajo protein znotraj celice, preko homolognega gena. Mikroba, ki proizvaja protein, obdelajo s kemičnimi ali fizičnimi sredstvi, medtem ko je celica bistveno nedotaknjena. Z manipulacijo postopka obdelave dobijo neproliferativno tretirano mikrobno celico brez pomembne izgube aktivnosti spojine, ki se v celici nahaja. Ker sc celica ne bo replicirala in bo imela stabilno celično steno, ki se potem lahko razgradi v želenem delu digestivnega sistema živali ali človeka, je omogočeno časovno kontrolirano ali ciljano sproščanje produktov inkapsuliranih z izumljeno celico. Po primerni obdelavi uporabljajo kot dostavni sistem samo mikrobno celico, ki proizvaja protein, tako da proizvedeno spojino ni potrebno očististi. Katerikoli protein, polipeptid, aminokislina ali spojina, vključno insekticidi, ki jih lahko proizvajamo z mikrobi, je lahko začetna snov izuma.
Možnost uporabe DNA tehnologije za vgraditev sintetskega gena, ki kodira nevrotoksin, najden v škorpijonovem strupu, so raziskovali Carbonell et al., Synthesis ol' a gene coding for an insect-specific scorpion neurotoxin and attemps to express it using baculovirus vectors, Gene 73:409-18 (1988). Ta članek kaže možnost uporabe DNA tehnologije za vgraditev sintetskega gena, ki kodira za nevrotoksin, najden v strupu škorpijona Buthus eupeus, v bakulovirusni genom, da bi izboljšali bakulovirusne pesticide. Preučevali so tri metode ekspresije, uporabljajoč AcMNPV ekspresijski sistem, utemeljen na polihedrinskem promotorju. Ekspresija samega gena s 36 kodoni preskrbi zelo majhno produkcijo toksina. Nekak uspeh so dosegli z vezavo signalnega peptida na toksin. Proizvodnja proteina je dosegla pomembne nivoje, ko je gen za toksin vezan na N-konec polihedrinskega gena. Toda, proizvodnja je bila deset do dvajsetkrat manjša od tiste za sam polihedrin. Ne verjamejo, da do omejitve ekspresije pride na nivoju transkripcije, temveč na posttranskripcijskem nivoju, vključno s translacijo in stabilnostjo proteina. Paralizne aktivnosti toksinskih produktov niso odkrili.
Evropska patentna prijava, št. objave 0 431 829, razkriva transgenske rastline, ki v svojih celicah učinkovito eksprimirajo toksin napadalca insektov, ki je specifičen z ozirom na insekta, v količini zadostni, da povzroči toksičnost za izbrane insekte, ki se hranijo z rastlinskim tkivom. Poseben toksin, ki so ga opisali, so izolirali iz strupa škorpijona Androctonus australis.
Raziskovalci so lahko izolirali tudi toksine, ki so jih ekstrahirali iz strupa pajkov. Geren, Neurotoxins and Necrotoxins of Spider venoms, J. Toxicol. Τοχίη Reviews 5(2):161-170 (1986), podaja pregled del, ki se nanašajo na nevrotoksine in nekrotoksine in sugerira, da molekule pajkovega strupa lahko preskrbijo model za specifične insekticide.
U.S. Patent No. 4,925,664 izdan Jacksonu in Parksu 15. maja 1990, odkriva metode zdravljenja srčnih in nevroloških bolezni z uporabo toksinov, ki izvirajo iz pajka Agelenopsis aperta in' Hololena curta. Ti toksini so učinkoviti tudi kot specifični blokatorji kalcijevih kanalčkov ali vzdražljivih aminokislinskih receptorjev, kijih lahko uporabimo proti insektom in sorodnim škodljivcem.
Evropska patentna prijava, št. publikacije 0 395 357, razodeva poliamine in polipeptide, ki so jih izolirali iz strupa pajka Agelenopsis aperta. Poliamini so antagonisti vzdražljivih aminokislinskih nevrotransmiterjev. Polipetidi in eden od poliaminov blokirajo kalcijumove kanalčke v živih celicah različnih organizmov. Sugerirajo uporabo omenjenih blokatorjev kalcijumovih kanalčkov pri kontroli brezvretenčarskih škodljivcev.
Evropska patentna prijava, št. objave 0 374 940, odkriva toksine, ki so jih izolirali iz strupa pajka Hololena curta. Polipeptidi so koristni kot insekticidi in v farmacevtskih pripravkih, na primer kot antagonisti kalcijumovih kanalčkov in glutamata.
Bowers cl al., Identification and purification of an irreversible presynaptic neurotoxin from the venom of the spider Hololena curta, Proč. Natl. Acad. Sci. 84:3506-3510 (1987) opisujejo proteinski nevrotoksin, ki so ga izolirali iz strupa pajka Hololena curta in njegovo inhibicijo živčno-mišičnega prenosa pri ličinki Drosophila. Avtorji sugerirajo, da toksin blokira presinaptične kalcijeve kanalčke v motoričnih živcih Drosophila.
Quisted et al., Paralylic and Inseeticidal Toxins from the Funnel Web Spiders Hololena curta, Toxicon 29(3):329-336 (1991) opisujejo en peptid in deset kurtatoksinov, ki so jih prečistili iz strupa Hololena curta in njihov učinek, ko jih injicirajo v ličinke metuljev.
Stapleton et al., Curtatoxins: Neurotoxic insecticidial polypeptides isolated from the funnel-web spider Hololena curta, J. Biol. Chem. 265(4):2054-2059 (1990), opisujejo tri polipetidne nevrotoksine, ki so jih izolirali iz strupa pajka Hololena curta in njihov učinek na črička Acheta domestica.
Quicke & Usherwood, Extended Summaries Pesticides Group and Physicochemical and Biophysical Panel Symposium Novel Approaches in Agrochemical research, Pestič. Sci 20:315-317 (1987), odkrivajo da toksini, ki se nahajajo v strupih nekaterih parazitnih os in v strupih nekaterih pajkov, ki delajo pajčevine v obliki krogle, povzročajo hitro paralizo, ko jih injicirajo v insekte. Avtorji sugerirajo, da so pajkovi toksini blokatorji membranskih kanalčkov selektivnih za katione, kontroliranih z receptorjem, ki ostvarijo interakcijo z odprtim kanalom z glutamatnim receptorjem, ki se nahaja v skeletnih mišicah kobilice. Publikacija se nanaša na toksine majhne molekulske mase, ki se nahajajo v strupih pajkov Argiope in Araneus, kakor tudi na toksin, ki so ga izolirali iz strupnih žlez Joro pajka Nephila dava la.
Druga študija, ki se nanaša na lastnosti izoliranih toksinov pajkovega strupa, je razkril zmožnost faktorjev z malo molekulsko maso, ki so jih izolirali iz strupa pajka, ki dela pajčevino v obliki lijaka, da se reverzibilno vežejo na kalcijeve kanalčke. WO 89/07608, izdan 24. avgusta 1989 Cherskeyu et al., odkriva, da se ti aktivni faktorji z malo molekulsko maso reverzibilno vežejo na kalcijeve kanalčke z zadostno specifičnostjo in afiniteto, da prekinejo prevodnost kalcija v živcih in dovolijo izolacijo in očiščenje struktur kalcijevega kanalčka. Ugotovili so, da so ti strupi toksični za sesalce.
O drugih uporabah toksinov pajkov razpravljajo v Jackson in Parks, “Spider Toxins: Recent Applications in Neurobiology”, Ann. Rev. Neurosci. 12:405-414 (1989), Ta članek uči, da obstaja velika heterogenost pri toksinih različnih rodov. On kaže, da so eksperimenti sugerirali lastnosti kalcijevih kanalčkov, ki so odvisne od vrste in da pajkovi strupi lahko preskrbijo antagoniste kalcijevega kanalčka. Ugotovili so, da strupi pajkov, ki so predmet razprave, vplivajo na vretenčarje. Članek tudi identificira strupe pajkov kot možen vir toksinov specifičnih za insekte, ki jih lahko uporabijo v poljedelstvu.
Adams et al., ‘Tsolation and Biological Activity of Synaptic Toxin from the Venom of the Funnel Web Spider, Agelenopsis aperta, v Insect Neurochemistry and Neurophysiology 1986, Borkovec and Gelman eds., Humana Press, New Jersey, 1986, poučuje, da so iz pajka Agelenopsis aperta izolirali mnogokratne toksine, ki so antagonisti sinaptičnega prevajanja v insektih.
U.S. Patent No, 4,855,405, izdan 8. avgusta 1989 Yoshiokajo et al.,odkriva receptorski inhibitor, ki so ga pridobili iz strupnih žlez pajka Joro in metodo za njegovo proizvodnjo. Spojina, v tekočem ali trdnem nosilcu, kaže insekticidni učinek, ko insekt pride v stik z njo.
U.S. Patent No. 4,918,107, izdan 17. aprila 1990 Nakajimaju et al., se nanaša na spojino, ki kaže aktivnost inhibitorja glutamatnega receptorja, na postopek za pripravo iste in insekticidne sestavek, ki isto vsebuje. Spojino nosi tekoči ali trdni nosilec z dodanim sredstvom za dispergiranje in jo neposredno apliciramo na rastlino ali žival, ki jo je treba zaščititi. Majhna doza je učinkovita kot insekticid in kaže zelo majhno toksičnost za sesalce in ribe in majhen neugoden vpliv na okolje.
Raziskovali so tudi uporabo bakulovirusov kot insekticidov. Največja pomanjkljivost bakulovirusov divjega tipa kot insekticidov je, da oni učinkujejo počasi. Ličinke, ki pojedo bakuloviruse divjega tipa na splošno umrejo v toku 5 do 7
Ί dni. Inficirana ličinka nadaljuje z jemanjem hrane v toku pomembnega dela tega časa in lahko pride do znatne poškodbe poljščin.
Zahvaljujoč kombinaciji problemov, povezanih z nekaterimi sintetskimi insekticidi, vključno toksičnost, nevarnost za okolje in izgubo učinkovitosti zaradi odpornosti, obstaja kontinuirana potreba za razvojem novih sredstev za kontrolo vretenčarjev, vključno razvoj bakulovirusov, pridobljenih z genetskim inženirstvom, ki eksprimirajo proteinske toksine, zmožne da onesposobijo gostitelja hitreje kot infekcija z bakulovirusom perse.
Ta izum omogoča nov insekticidno učinkovit peptid, ki je bistveno očiščen in ga lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia in njegove poljedelsko ali vrtnarsko sprejemljive soli.
Verjamemo, da insekticidno učinkoviti peptidi tega izuma kažejo visoko stopnjo selektivnosti za brezvretenčarje in zlasti insekte. Vrhu tega smo pokazali, da so insekticidno učinkoviti peptidi izuma visoko učinkoviti insekticidi proti poljedelsko pomembnim škodljivcem in zato verjamemo, da so pomemben prispevek području kontrole brezvretenčarskih škodljivcev.
Nadalje je s tem izumom priskrbljena nova bistveno izolirana sekvenca DNA, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia.
Nadalje je s lem izumom preskrbljen novi rekombinantni ekspresijski vektor, ki vsebuje sekvenco DNA, kodirajočo insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz sirupa pajka Diguetia, vektor, ki je sposoben, da izvrši ekspresijo omenjene sekvence v transformiranih celicah.
Nadalje je s tem izumom preskrbljena nova rekombinantna gostiteljska celica, transformirana ali transfektirana s sekvenco DNA, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga v bistvu lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia na način, ki dopušča, da gostiteljska celica eksprimira omenjeni peptid.
Nadalje je s tem izumom preskrbljen nov bakulovirusni ekspresijski vektor, zmožen ekspresije sekvence DNA, kodirajoče za insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia, v gostitelju ali gostiteljski insektni celici.
Nadalje je s tem izumom preskrbljena nova metoda za proizvodnjo insekticidno učinkovitega peptida, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia in peptid, ki ga z njo proizvajamo. Metoda obsega stopnje vzgajanja rekombinantnih gostiteljskih celic v kulturi, kjer ima rekombinantni ekspresijski vektor, transformiran ali transfektiran v omenjenih gostiteljskih celicah, sekvenco
DNA, kodirajočo insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia, omenjeni vektor je pri tem sposoben, da izvrši ekspresijo omenjene kodirajoče sekvence v transformiranih celicah; omogočeno je tudi pridobijanje omenjenega insekticidno učnkovitega peptida iz kulture rekombinantnih gostiteljskih celic.
Nadalje je s tem izumom preskrbljena nova transgenska rastlina, ki vsebuje sekvenco DNA, kodirajočo insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia, ki smo jo vstavili v klično linijo omenjene rastline ali prednika omenjene rastline, tako da naslednje generacije omenjene rastline preko spolne ali nespolne propagacije podedujejo karakteristiko ekspresije omenjene sekvence DNA.
Nadalje je s tem izumom preskrbljena nova metoda kontrole brezvretenčarskih škodljivcev, ki obsega usvtarjanje stika omenjenega škodljivca z učinkovito količino insekticidno učinkovitega peptida, ki ga v bistvu lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia in njegovih poljedelsko ali vrtnarsko sprejemljivih soli. Nadalje je s tem izumom preskrbljena nova metoda kontrole brezvretenčarskih škodljivcev, ki obsega ustvarjanje stika omenjenega škodljivca z rekombinantim bakulovirusom, zmožnim ekspresije učinkovite količine insekticidno učinkovitega peptida, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia in njegovih poljedelsko ali vrtnarsko sprejemljivih soli.
Nadalje je s tem izumom preskrbljen nov insekticidni sestavek, ki vsebuje insekticidno učinkovito količino insekticidno učinkovitega peptida, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia in njegovih poljedelsko ali vrtnarsko sprejemlivih soli, v njegovem poljedelsko ali vrtnarsko sprejemljivem nosilcu.
Nadalje je s tem izumom preskrbljeno novo protitelo bistveno imunoreaktivno z insekticidno učinkovitim peptidom, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia in njegovimi poljedelsko ali vrtnarsko sprejemljivimi solmi.
Nadalje je s tem izumom preskrbljena nova metoda uporabe protiteles tega izuma za odkrivanje prisotnosti insekticidno učinkovitega peptida, ki ga v. bistvu lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia, ki obsega stopnje pridobijanja pajkovega strupa, stik pajkovega strupa z omenjenimi protitelesi, vezanimi na označbo, ki jo lahko določimo ter odkrivanje označenih protiteles vezanih na omenjeni peptid.
Nadalje je s tem izumom preskrbljena nova metoda uporabe protiteles tega izuma za čiščenje insekticidno učinkovitega peptida, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia, ki obsega stopnje vezave protitelesa na trdno osnovo, stik raztopine, ki vsebuje omenjeni peptid, z omenjenim protitelesom vezanim na omenjeno trdno osnovo, s čimer se omenjeni peptid, ki sc nahaja v raztopini, pritrdi na omenjeno protitelo, odstranitev omenjenega peptida pritrjenega na omenjeno protitelo, ki je vezano na omenjeno trdno osnovo, ter zbiranja omenjenega očiščenega peptida.
Nadalje je s tem izumom preskrbljena nova DNA sonda, dobljena iz sekvence DNA, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia.
Nadalje je s tem izumom preskrbljena nova metoda za odkrivanje prisotnosti nukleinske kisline, ki kodira isekticidno učinkovit peptid, ki ga v bistvu lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia, ki obsega stopnje pridobijanja pajkovih nukleinskih kislin, stik omenjenih nukleinskih kislin z DNA sondo tega izuma, ter odkrivanje omenjene sonde vezane na omenjeno nukleinsko kislino.
Slika 1 opisuje obratno fazno tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (reverse phase high performance liquid chromatography - RP HPLC) celotnega strupa Diguetia canities, z uporabo gradienta 0,1% TFA v acetonitrilu, ki kaže tri skupine sestavin, testiranih v muškatovem cvetu. Frakcija 2 so sestavine aktivne proti tobačnemu vršičnemu črvu (tobaeco budworm - TBW).
Slika 2 kaže DK 9.2, ki smo ga testirali v koncentraciji 1 μΜ na sinaptični prenos (obujen populacijski vrh) na sinapsi Schafferjevih kolateralnih-CA 1 piramidalnih celic v podganjih hipokampusnih režnjih. Ponazorjeni podatki predstavljajo časovno povprečne zapise populacijskega vrha (a) 5 minut pred dodatkom DK 9.2 in (b) za časa 15-20 minutnega intervala, ki sledi dodatku DK 9.2. Ti zapisi so identični, kar pokazuje, da DK 9.2 pri teh koncentracijah v podganjem centralnem živčnem sistemu (CŽS) ne kaže aktivnosti, ki bi jo v tem poskusu lahko odkrili.
Slika 3 je mapa PWR9 bukulovirusnega transfernega vektorja, ki nosi gen, ki kodira preDK 9.2.
Slika 4 je neprekinjeni poskus hranjenja pri novorojenem tobačnem vršičnem črvu (1000,000 PIB-gm dieta).
Slika 5 opisuje sposobnost ΤΤΧ, da prepreči ali obme pokanje mišice, ki ga inducira DK 9.2.
A. Definicije
Kot ga tu uporabljamo, “insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia vključuje insekticidno učinkovite peptide, kakor tudi insekticidno učinkovite fragmente omenjenih peptidov iz kateregakoli vira, dokler bi lahko ta peptid bistveno izolirali iz Diguetia s katerokoli tehniko znano strokovnjakom. Taki viri vključujejo na primer rekombinantno proizvedene insekticidno učinkovite peptide.
Kot ga tu uporabljamo, “ekspresijski vektor” vključuje vektorje, ki lahko eksprimirajo sekvence DNA, ki se v njih nahajajo, pri tem so take sekvence funkcionalno vezane na druge sekvence, zmožne da učinkujejo na njihovo ekspresijo. To pomeni, čeprav tega nismo vedno eksplicitno navedli, da ti ekspresijski vektorji morajo biti taki, da se lahko replicirajo v gostiteljskih organizmih bodisi kot episomi, bodisi kot integralni del kromosomske DNA. Jasno je, da bi jih pomanjkanje zmožnosti replikacije naredilo nefunkcionalne. Na kratko, “ekspresijski vektor” je funkcionalna definicija in v ta termin je vključena katerakoli sekvenca DNA, ki je zmožna izvršiti ekspresijo specificiranega koda DNA, ki se v njej nahaja, kolikor je uporabljamo za specificirano sekvenco. Na splošno, ekspresijski vektorji, ki so koristni za tehnike rekombinantne DNA, so često v obliki “plazmidov”, ki se nanašajo na krožne dvojne DNA, ki v svoji vektorski obliki niso vezane na kromosom. “Plazmid” in “vektor” uporabljamo medsebojno zamenljivo, ker je plazmid najbolj splošno uporabljana oblika vektorja, doda, namen izuma je, da vključi take druge oblike ekspresijskih vektorjev, ki služijo istim funkcijam in ki postajajo za tem znani v stroki.
“Rekombinantne gostiteljske celice” se nanaša na celice, ki smo jih transformirali z vektorji, napravljenimi z uporabo tehnik rekombinantne DNA.
Družina pajkov Digetia se splošno sestoji iz enega rodu, Diguetia. Vrste Diguetia večinoma najdemo na jugozahodu Združenih Držav (vključno Kalifornij o) in v Mehiki. Ti majhni pajki spredejo raztegljive, nepravilne pajčevine na mnogih vrstah rastlin in grmičevja, vključno kakteje. Različne vrste Diguetia so, kot večina pajkov, splošni roparji, ki z lahkoto zaužijejo večino tipov roparskih insektov, na katere naletijo.
Čeprav ni mišljeno, da je izum omejen na katerokoli teoretično razlaganje, je neobičajna simptomatologija, ki smo jo videli po injiciranju insekticidno učinkovitih peptidov tega izuma v insekte, zelo podobna simptomom, ki so jih opazili, ko v insekte injicirajo veratridin, alkaloid, ki je aktivator Na+ kanalčkov ali škorpijonske toksine iz družine Buthidae in rodu Buthus, znane aktivatorje presinaptičnih Na+ kanalčkov. Verjamemo, da omenjeni insekticidno učinkoviti peptidi lahko povzročijo delno depolarizacijo mišične in/ali živčne membrane, verjetno vplivajoč na Na+ ali K+ kanalčke. Bolj specifično, verjamemo, da omenjeni insekticidno učinkoviti peptidi v živcih, ki so občutljivi na blokiranje s tetrodotoksinom, sprožijo eksplozivno depolarizacijo, ki se ponavlja. Tako je verjetno mesto delovanja teh peptidov natrijev kanalček živčne membrane, ki je občutljiv na napetost.
B. Izolacija peptidov iz strupa Diguetia
Pajkov strup lahko odstranimo iz Diguetia s katerokoli znano metodo, tako kot je ekstrakcija pajkove žleze iz cefolotoraksa. Toda, da bi se izognili nečistočam v pajkovem strupu in izoliranih toksinih, dajemo prednost pridobivanju pajkovega strupa z električno stimulacijo pajkov, da bi povzročili sproščanje strupa in kasnejšem vsesavanju, da bi zbrali sproščeni strup in preprečili kontaminacijo strupa z izbljuvano hrano ali hemolimfo, kot so opisali v U.S. 4,925,664.
Ko pajkov strup pridobimo z električnim odvzemanjem, ga lahko frakcioniramo v njegove peptidne (toksin) sestavine, uporabljajoč tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (“HPLC”), ali kromatografijo z gelsko filtracijo, ali katerokoli drugo koristno frakcionimo tehniko. Poleg tega je pogosto zaželeno, da končno frakcioniranje pajkovega strupa izvršimo s HPLC.
Tako je mogoče, uporabljajoč tehniko električnega odvzemanja pajkovega strupa povezano s kromatografijo z gelsko filtracijo in/ali tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti in drugimi sorodnimi tehnikami, takimi kot je kromatografija na osnovi hidrofobnih interakcij, dobiti bistveno očiščene pajkove toksine. Toda, razume se, da lahko v obegu pričujočega izuma uporabimo tudi druge ekvivalentne tehnike, da bi izolirali pajkove toksine. Tako izoliranim toksinom lahko določimo aminokislinsko zaporedje in insekticidno aktivnost z metodami znanimi strokovnjaku.
C. Insekticidno učinkoviti peptidi
Ta izum, v enem od svojih vidikov, omogoča insekticidno učinkovit peptid in njegove insekticidno učinkovite fragmente, ki so bistveno očiščeni in jih lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia in njegove poljedelsko ali vrtnarsko sprejemljive soli.
Potem ko izoliramo insekticidno učinkovito frakcijo, ki vsebuje peptide, in jo očistimo kot smo tu opisali, lahko izvedemo določanje aminokislinskega zaporedja na katerikoli način znan strokovnjakom, tak kot je aminokislinsko sekveniranje na N-koncu in uporaba avtomatičnega aminokislinskega sekvenatorja.
Na osnovi tega poročila bo razumljivo, da pričakujemo, da so v okviru tega izuma dodatni insekticidno učinkoviti proteini. To se pravi, da verjamemo, da lahko iz Diguetia izoliramo druge insekticidno učinkovite peptide, poleg treh o katerih tu podrobno poročamo. Zdi se, da člani te družine insekticidno učinkovitih peptidov, ki smo jih izolirali iz Diguetia, delijo sledeče značilnosti:
1) veličina: vsi so med približno 6200 do približno 7200 daltonov in po dolžini od približno 55 do 65 aminokislin;
2) ohranjeni amino terminalni del: SEQ ID NO: 1, 3 in 5 so identične za prvih pet aminokislin;
3) SEQ ID NOS: 1, 3 in 5 so več kot 40% homologne;
4) SEQ ID NOS: 1, 3 in 5 imajo približno 7 ali 8 cisteinskih ostankov;
5) nakopičenje genov: izgleda, da so geni za več kot enega teh toksinov ko-lokalizarine sekcije genomske DNA, kar verjetno kaže, da ti geni lahko vsi izhajajo iz enega samega predniškega gena.
Bolj specifično, izolirali smo in karakterizirali tri insekticidno učinkovite peptide. Prvo, izolirali smo DK 9.2 in njegova aminokislinska sekvenca, kot jo dobimo s translacijo z izolirane cDNA izgleda kot je definirana v SEQ ID NO:1. Podatki dobljeni z masno spektroskopijo sugerirajo dva izozima, ki vsebujeta ohranjeno zamenjavo na položaju 26. En izozim vsebuje treonin na položaju 26 in drugi vsebuje glutamin na položaju 26. Glutaminski izozim je za približno 27 enot atomske mase večji od treoninskega izozima. Za tem je treba vsako sklicevanje na DK 9.2 interpretirati kot sklicevanje na enega od obeh in/ali oba izozima. DK 9.2 je značilen po molekulski masi približno 6371-6397 daltonov, kot smo določili z masno spektrometrijo, ter premikanju na obratno fazni HPLC v obliki enega samega vrha. Drugo, izolirali smo DK 11 in za njega je značilna molekulska masa približno 6740 daltonov ali približno 6740 daltonov, kot smo jo določili z masno spektrometrijo, ter premikanje v obliki enega vrha na obratno fazni HPLC. Bolj natančno, dognali smo, da ima ta aktivna HPLC frakcija aminokislinsko sekvenco, tako kot jo dobimo s translacijo izolirane cDNA, kot smo pokazali v SEQ ID NO:3. Končno, do sedaj smo določili lastnosti tretjega člana te insekticidno učinkovite proteinske družine, DK12, z molekulsko maso približno 7100 daltonov ali približno 7080 daltonov, kot smo določili z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enega vrha na obratno fazni HPLC. Bolj natančno, za to frakcijo smo poskusno pokazali, da ima aminokislinsko sekvenco, kot je pokazano v SEQ ID NO:5.
Trije izolirani peptidi, ki ustrezajo SEQ ID NO: 1, 3 in 5, kažejo bistveno isto insekticidno aktivnost. Pričakujemo, da bodo drugi peptidi, ki imajo sekvenčno homologijo, obsegajočo približno 55 do 65 aminokislin, s SEQ ID NO:1, 3 in 5 večjo od 40%, ter približno 7 ali 8 cisteinskih ostankov, kazali bistveno isto insekticidno aktivnost. Taki peptidi lahko obstajajo v naravi, ali pa jih lahko proizvajamo z metodami tehnologije rekombinantne DNA, znanimi tistim, ki so običajno izkušeni v stroki. Pričakujemo, da so taki peptidi, bodisi da se nahajajo v naravi ali, da jih rekombinantno proizvajamo, v okviru tega izuma.
D. Identifikacija sekvence, ki kodira insekticidno učinkovite peptidc tega izuma
Drugi vidik tega izuma omogoča bistveno izolirano sekvenco DNA, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, bistveno izoliran iz pajka Diguctia.
Uporabljajoč podatke o delni aminokislinski sekvenci, ki smo jih dobili kot smo zgoraj opisali, lahko izoliramo in identificiramo gene, odgovorne za proizvodnjo proteinov, ki se jih lahko izolira iz pajka. Razpoložljive so Številne metode za pridobivanje gena, ki je odgovoren za proizvodnjo peptida. Primeri vključujejo Fugua, S. et al, A simple PCR method for detection and cloning low abundant transeript, Biotechnique, Vol. 9, No. 2 (Aug 1990); Froman, M.A., “RACE: Rapid amplification of cDNA ends”, PCRprotocols, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, CA, (1990) in U.S. Patent No. 4,703,008 “DNA sequences eneoding erythropoietin”, patent ki je inkorporiran z referenco.
Na kratko, sintetiziramo molekulo DNA, ki kodira določeno aminokislinsko sekvenco ali, ki predstavlja DNA verigo komplementarno taki molekuli DNA, ki kodira določeno aminokislinsko sekvenco. To sintetsko molekulo DNA lahko potem uporabimo kot sondo za sekvenčno homologijo DNA v celičnih klonih, ki vsebujejo rekombinantne molekule DNA, v katerih se nahajajo, delno, sekvence DNA izvedene iz genomske DNA organizma kot je pajek ali pa izvedene iz cDNA kopij molekul mRNA, ki smo jih izolirali iz celic ali tkiv organizma kot je pajek. Na splošno, za eno identifikacijo homologne DNA so potrebne molekule DNA s petnajst (15) nukleotidov ali več, omenjeno število zahteva edino določanje najmanj pet (5) aminokislin v sekvenci. Cenjeno bo, da je število različnih molekul DNA, ki lahko kodirajo določeno aminokislinsko sekvenco, lahko zelo veliko ker lahko vsako aminokislino kodira do šest (6) edinstvenih trinukleotidnih sekvenc DNA ali kodonov. Zato je nepraktično posamezno testirati vse mogoče sintetske DNA sonde in hkratno uporabljamo kot sonde več takih združenih molekul DNA. Proizvodnja takih združenih molekul, katere navajamo kot “degenerirane” sonde, je v stroki dobro znana. Razume se tudi, da čeprav bo ena sama molekula DNA v sondni zmesi imela točno sekvenčno homologijo z genom, ki nas zanima, je v združenih molekulah DNA več sintetskih molekul DNA, ki so lahko sposobne da identificirajo izključno omenjeni gen, ker je potrebna samo visoka stopnja homologije. Zato lahko uspešno izolacijo gena, ki nas zanima, opravimo s združenimi sintetskimi DNA sondami, ki ne vsebujejo vse mogoče sekvence DNA sond. Na splošno ni potrebno, da so kodoni, ki jih organizem ne uporablja pogosto, prisotni v združenih sondah. V resnici lahko naredimo eno samo sondo za sekvenco DNA, tako da vključimo samo kodone DNA, ki jih organizem najbolj pogosto uporablja za vsako aminokislino, čeprav je treba razumeti, da ta pristop ni vedno uspešen.
Ena tehnika za identifikacijo genske sekvence uporablja polimerazno verižno reakcijo (the Polymerase Chain Reaction - PCR). Videti npr. U.S. Patent 4,683,195 in 4,683,202, ki so vključeni z referenco, kol da bi tu bili v celoti opisani. Bistveno je, da PCR omogoča pripravo izbrane sekvence DNA, kadar sta nam znana dva končna dela sekvence. Dobimo “primere” (začetne oligonukleotide) ali oligonukleotidne sonde, ki ustrezajo vsakem koncu sekvence, ki nas zanima. Uporablajoč PCR potem sintetiziramo centralni del sekvence DNA. V eni od takih metod uporabe PCR za pridobivanje gena, ki kodira edinstven gen pajkovega strupa, izoliramo RNA iz pajka in jo prečistimo. Potem kot začetni oligonukleotid uporabimo oligonukleotid, ki ima deoksitimidilatni konec, da bi z reverzno transkripcijo iz pajkove RNA sintetizirali cDNA. Potem pripravimo sintetsko molekulo DNA, ali zmes sintetskih molekul DNA kot v degenerirani sondi, ki smo jo zgoraj opisali, ki lahko kodira aminokislinsko sekvenco na N-koncu proteina iz strupa, kot smo jo predhodno določili. To zmes DNA uporabimo skupaj z oligonukleotidom, ki ima deoksitimidilatni konec, da sprožimo PCR reakcijo. Ker je sintetska molekula DNA, ki jo uporabimo za sprožitev PCR reakcije, specifična za želeno sekvenco mRNA, se bo učinkovito pomnožila (amplificirala) samo želena cDNA. Nastali produkt je pomnožena cDNA, ki jo lahko ligiramo z kateremkoli od številnih znanih vektorjev za kloniranje. Ne da bi temu nasprotovali, bo razumljivo da v strupih pajkov lahko obstajajo “družine” peptidov, ki bodo imele podobne aminokislinske sekvence in da v takih primerih lahko uporaba začetnih oligonukleotidov z mešanimi oligonukleotidi rezultira v pomnožitvi ene ali več sorodnih cDNA, ki kodirajo te sorodne peptide. Geni, ki kodirajo sorodne peptide, so tudi v obsegu izuma, ker imajo tudi sorodni peptidi koristne insekticidne aktivnosti.
Končno, nastalo sekvenco cDNA lahko kloniramo v primeren vektor, uporabljajoč običajne tehnike, jo analiziramo in določimo sekvenco nukleotidnih baz. Sekvence DNA, ki kodirajo insekticidno učinkovite proteine, podajamo npr. v
SEQ ID N0:2 in 4. Neposredna aminokislinska translacija teh PCR produktov bo odkrila, da oni ustrezajo celotnemu zapisu za zreli protein.
Poleg cDNA, ki kodira zreli DK 9.2, smo klonirali in sekvenirali cDNA sekvenco (SEQ ID NO:7), ki se nahaja pred zapisom za DK 9.2. Translacija celotne mRNA je odkrila, da se DK 9.2 sintetizira kot prekurzorski protein, ki vsebuje signalni peptid, propeptid in zreli toksin. Misli se, da je funkcija signalnega peptida pomembna za usmerjanje sintetiziranega polipeptida v izločanje. Signalna sekvenca ima pomembno vlogo v zagotavljanju prave lokalizacije novo sintetiziranega proteina. Na splošno ona preskrbi topogenske signale (Blobel, G. Proc.Nat.Acad.Sci., U.S.A. 77, 1496-1500 (1980), ki usmerjajo pritrjeno proteinsko sekvenco na različne cilje v ali izven celice. To je zlasti pomembno za izločene proteine, čigar tarčna mesta so izven celice. To pomaga tudi pri proizvodnji rekombinantnega proteina, ker je lahko lažje prečistiti sintetiziran protein iz izvenceličnega medija kot pa biti primoran lizirati celice in ga očistiti iz celotnega celičnega ekstrakta. Verjamemo, da signalni peptid, ki ga kodira cDNA zapis za protein, ki je prekurzor DK 9.2, vsebuje 17 aminokislin v sledečem zaporedju:
Met-Lys-Val-Phe-Val-Val-Leu-Leu-CysLeu-Ser-Leu-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala
Translacija mRNA, ki se nahaja pred zapisom za DK 9.2, poleg signalnega peptida odkrije propeptid. Funkcija propeptidne sekvence ni znana. Propeptid je peptid z 21 aminokislin v sledečem zaporedju:
-Leu-Glu-Glu-Arg-Leu-Asp-Lys-Asp-Ala-Asp-Ile
-Met-Leu-Asp-Ser-Pro-Ala-Asp-Met-Glu-ArgTi prekurzorski peptidi, ali preppro sekvence, lahko v veliki meri prispevajo k stabilnosti, ekspresiji in zvitju DK 9.2 ali drugih rekombinantnih proteinov, kadar jih eksprimiramo in vivo in/ali in vitro. Predvidevamo tudi, da se te sekvence, ali njihovi deli, lahko pokažejo za koristne v ekspresiji drugih molekul na primer v konstrukciji gena. Kot del tega izuma, bomo preskrbeli podatke, ki bodo potrdili, da za ekspresijo rekombinantnega DK 9.2 lahko uporabimo druge signalne in/ali propeptidne sekvence.
E. Rekombinantna ekspresija
Ta izum nadalje preskrbi rekombinantni ekspresijski vektor, ki vsebuje sekvenco DNA (zapis), ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia. Vektor je zmožen sprožiti ekspresijo zapisa v transformiranih celicah. Izum omogoča tudi rekombinantne gostiteljske celice, ki smo jih transformirali ali transfektirali z DNA zapisom za insekticidno učinkovit peptid (ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguclia) na tak način, ki dovoli gostiteljskim celicam, da ta peptid eksprimirajo.
Pridobitev primerne sekvence DNA, ki kodira želeni protein, omogoča proizvodnjo proteina z uporabo rekombinantnih tehnik sedaj znanih v stroki. Zapis lahko dobimo s cDNA ali genomsko sekvenco iz naravnega proteinskega vira ali pa jo lahko sintetsko pripravimo z uporabo točnega aminokislinskega zaporedja, ki smo ga izpeljali iz nukleotidnega zaporedja gena. Ko kodirajočo DNA pripravimo sintetsko, lahko izkoristimo ugodnost poznavanja kodonov, ki so prednostni za nameravanega gostitelja.
Ekspresijske sisteme, ki vsebujejo potrebne kontrolne sekvence, take kot so promotorji, ter prednostno pospeševalci in kontrolni faktorji konca sinteze, so brez težav razpoložljivi in znani v stroki za različne gostitelje. Videti npr. Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboralory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989).
Potemtakem lahko želene proteine pripravimo tako v prokariontskih kakor v eukariontskih sistemih, kar rezultira, v primeru mnogih proteinov, v vrsti predelanih (procesiranih) oblik.
Najbolj splošno uporabljan prokariontski sistem ostaja E. coli, čeprav pričakujemo, da bodo drugi sistemi, taki kot B. subtilis in Pseudomonas, tudi koristni. Ustrezne kontrolne sekvence za prokariontske sisteme vključujejo tako konstitutivne kot inducibilne promolorje, vključno lac promotor, tip promotor, hibridne promotorje take kot tac promotor, λ fag Pl promotor. Na splošno, tuje proteine lahko ti gostitelji proizvajajo kot fuzijske ali kot zrele proteine. Kadar želeno sekvenco proizvajamo kot zrel protein, je pred njo lahko metionin, ki ni nujno učinkovito odstranjen. Skladno s tem se pred peptidi in proteini, ki so tu predmet patentnih zahtevkov, lahko na N-koncu nahaja Met, kadar jih proizvajajo bakterije. Še več, lahko naredimo konstrukte, v katerih se bo pred zapisom za peptid nahajal funkcionalen signalni peptid, kar rezultira v izločanju proteina. Kadar se v prokariontskih gostiteljih proizvaja na ta način, se signalna sekvenca po izločanju odstrani.
Sedaj je za proizvodnjo rekombinantnih tujih proteinov na razpolago tudi veliko različnih eukariontskih gostiteljev. Kot v primeru bakterij lahko eukariontske gostitelje transformiramo z ekspresijskimi sistemi, ki proizvajajo želeni protein neposredno, toda bolj običajno preskrbimo signalne sekvence, ki učinkujejo na izločanje proteina. Eukariontski sistemi imajo dodatno prednost, da so zmožni procesiranja intronov, ki se lahko nahajajo v genomskih sekvencah, ki kodirajo proteine višjih organizmov. Eukariontski sistemi ravno tako preskrbijo različne mehanizme za predelovanje, ki omogočijo na primer glikozilacijo, oksidacijo ali derivatacijo določenih aminokislinskih ostankov, konformacijsko kontrolo itn.
Navadno uporabljani eukariontski sistemi vključujejo kvas, celice insektov, sesalske celice, ptičje celice in celice višjih rastlin. Seznam ni izčrpen. Razpoložljivi so primerni promotorji, ki so kompatibilni in funkcionalni za uporabo v vsakem od teh tipov gostiteljev, kakor so tudi končne sekvence in pospeševalci, kot npr. bakulovirosni polihedrinski promotor. Kot smo že navedli, promotorji so lahko bodisi konstitutivni ali inducibilni. Na primer, v sesalskih sistemih lahko MTII promotor induciramo z dodatkom ionov težkih kovin.
Podrobnosti konstrukcije ekspresijskih sistemov, primernih za želene gostitelje, so strokovnjakom znane. Za rekombinantno proizvodnjo proteina primerno ligiramo DNA, ki ga kodira, v izbrani ekspresijski sistem, in sistem nato transformiramo v kompatibilnega gostitelja, ki ga potem gojimo v kulturi in vzdržujemo v pogojih, v katerih se dogaja ekspresija tujega gena. Insekticidno učinkovit protein tega izuma, ki smo ga pridobili na ta način, nato zberemo iz kulture, bodisi z liziranjem celic ali iz medija za kulturo, kot primeren in znan strokovnjakom.
Razume se, da lahko najmanše spremembe primarne aminokislinske sekvence povzročijo nastanek proteinov, ki so bistveno enako ali povečano aktivni v primerjavi s tu ponazorjenimi peptidi. Te modifikacije so lahko namerne, kot z usmerjeno mutagenezo, ali pa slučajne, tako kot v primeru mutacij v gostiteljih, ki proizvajajo peptid izuma; vse te modifikacije so vključene tako dolgo dokler je obdržana insekticidna aktivnost. Mutacija v proteinu spremeni njegovo primarno strukturo (z ozirom na protein, ki se običajno nahaja ali pa je specifično opisan) zahvaljujoč spremembam nukleotidne sekvence DNA, ki ga kodira. Te mutacije specifično vključujejo alelne variante. Mutacijske spremembe v primarni strukturi proteina so rezultat delecij, adicij ali substitucij. Delecijo definiramo kot polipeptid v katerem je odsoten eden ali več notranjih aminokislinskih ostankov. Adicijo definiramo kot polipeptid, ki ima, v primerjavi z divjim tipom, enega ali več dodatnih notranjih aminokislinskih ostankov. Substitucija nastane kot rezulat zamenjave enega ali več aminokislinskih ostankov z drugimi ostanki. Proteinski fragment je polipeptid, ki sestoji iz primarnega aminokislinskega zaporedja, ki je identično delu primarne sekvence proteina, kateremu je polipeptid soroden.
Prednostne substitucije so tiste, ki so zelo ohranjene, tj. v katerih je ostanek zamenjan z drugim istega splošnega tipa. Kot se dobro razume, aminokisline ki se nahajajo v naravi, lahko razvrstimo v kisle, bazične, nevtralne in polarne, ali nevtralne in nepolarne in/ali aromatske. Na splošno raje vidimo, da kodirani peptidi, ki se razlikujejo od naravne oblike, vsebujejo substituirane kodone za aminokisline, ki so iz iste skupine iz katere je zamenjana aminokislina.
Tako so, na splošno, bazične aminokisline Lys, Arg in His medsebojno zamenljive; kisle aminokisline Asp in Glu so medsebojno zamenljive; nevtralne polarne aminokisline Ser, Thr, Cys, Gin in Asn so medsebojno zamenljive; nepolarne alifatske kisline Gly, Ala, Val, Ile in Leu so ohranjene ena z ozirom na drugo (toda zaradi velikosti sta Gly in Aia bolj sorodna, kakor so tudi bolj sorodni Val, Ile in Leu) in aromatske aminokisline Phe, Trp in Tyr so medsebojno zamenljive.
Čeprav je Pro nepolarna nevtralna aminokislina, predstavlja težave zaradi svojega učinka na konformaeijo ter zato substitucije Pro ali s Pro niso prednostne, razen kadar lahko dobimo iste ali podobne konformacijske rezultate. Polarne aminokisline, ki predstavljajo ohranjene spremembe, vključujejo Ser, Thr, Gin, Asn in, v manjšem obsegu, Met. Poleg tega se zdi, da so, čeprav jih razvrščamo v različne kategorije, Ala, Gly in Ser medsebojno zamenljivi in da se Cys dodatno ujema s to skupino ali pa ga lahko razvrstimo v polarne nevtralne aminokisline. Nekatere substitucije s kodoni za aminokisline iz različnih skupin so tudi lahko koristne.
Ker smo rekombinantne materiale za proteine izuma preskrbeli, lahko te proteine napravimo z rekombinantnimi tehnikami kakor tudi z aparatom za avtomatsko aminokislinsko sintezo. Zaradi različnih posttranslacijskih značilnosti, ki jih dajejo različne gostiteljske celice, bomo dobili tudi različne modifikacije za proteine, ki se nahajajo v naravi. Modificirani protein se razlikuje od nemodificiranega kot rezultat posttranslacijskih dogodkov, ki spremenijo vzorec glikoziliranja, amidiranja ali dodajanja lipidov, ali primarno, sekundarno ali terciarno strukturo proteina in so seveda vključeni v obseg izuma, kot se nahaja v zahtevkih.
Nadalje moramo upoštevati, da če proteine, kijih tu opisujemo, take kot SEQ ID NO:1, naredimo sintetsko, lahko naredimo tudi substitucijo z aminokislinami, ki niso kodirane z genom. Alternativni ostanki vključujejo na primer ω aminokisline s formulo H2N(CH2)nCOOH, v katerih je n 2-6. To so nevtralne, nepolarne aminokisline, kot so sarkozin (Sar), t-butilalanin (t-BuAla), t-butilglicin (t-BuGla), N-metil izoleucin (N-Melle) in norleucin (Nleu). S fenilglicinom se na primer lahko zamenja Trp, Tyr ali Phe, aromatsko nevtralno aminokislino; citrulin (Cit) in metionin sulfoksid (MSO) sta polami toda nevtralni, cikloheksil alanin (Cha) je nevtralen in nepolaren, cisteinska kislina (Cya)'je kisla in ornitin (Orn) je bazičen. Lastnosti prolinovega ostanka, ki vplivajo na konformacijo, lahko dobimo če enega ali več od teh ostankov substituiramo s hidroksiprolinom (Hyp).
F. Transgenske rastline
Ta izum nadalje omogoča transgenske rastline, ki vsebujejo DNA zapis za insekticidno učinkovit peptid, ki ga stvarno lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia, vstavljen v klično linijo rastline, tako da naslednje generacije rastline dedujejo ekspresijo te sekvence DNA s seksualno ali aseksualno propagacijo.
Gene, ki kodirajo insekticidno učinkovite peptide po pričujočem izumu, lahko vstavimo v rastlino s tehnikami genskega inženirstva, za kar pričakujemo, da bo, na osnovi proizvodnje peptida v rastlinski celici, koristno kot način kontrole škodljivih insektov. Potemtakem lahko proizvedemo rastlino, ki je bolj tolerantna do insektov kot varianta, ki se nahaja v naravi.
Kodirajoča regija insekticidno učinkovitega gena, ki jo lahko uporabimo za transformacijo rastline, je lahko celoten aktiven gen ali pa njegov del. Vendar je potrebno, da se genski zapis za peptid eksprimira in s tem v nastali rastlinski celici proizvaja funkcionalen peptid. Verjamemo, da za transformacijo lahko uporabimo tako genomsko DNA in cDNA, kakor sintetsko DNA, ki kodirajo inekticidno učinkovit peptid. Nadalje, gen lahko konstruiramo delno iz cDNA klona, delno iz genomskega klona in delno iz sinetskega gena in njihovih različnih kombinacij. Poleg tega, DNA zapis gena za peptid lahko vsebuje dele iz različnih vrst, ki so različne od vira izoliranega peptida.
Nadalje, verjamemo da lahko insekticidno učinkovit peptid združimo z drugo spojino ali spojinami, da bi v transformirani rastlini, ki vsebuje himerne gene in eksprimira spojino, proizvajali nepričakovane insekticidne lastnosti. 'I'e druge spojine so lahko na primer inhibitorji proteaz, ki so peroralno toksični za insekte, ali polipeptidi iz Bacillus thuringiensis. Protein iz B. thuringiensis povzroča spremembe v prepustnosti membrane črevesnih celic insekta za kalij in domnevamo, da. naredi majhne pore v membrani. V kombinaciji z insekticidno učinkovitimi peptidi lahko uporabimo tudi druge proteine, ki tvorijo pore. Primeri takih proteinov, ki tvorijo pore so magainini, cekropini, atacini, meitin, gramicidin S, proteini natrijevega kanalčka in sintetski fragmenti, α-toksin Staphylococcus aureus, apolipoproteini in njihovi fragmenti, alameticin in vrsta različnih sintetskih amfipatičnih peptidov. Lektini, ki se vežejo na celično membrano in povečajo endocitozo, so druga skupina proteinov, ki jih lahko uporabimo v kombinaciji z inekticidno učinkovitimi peptidi tega izuma, da bi genetsko modificirali rastline tako, da postanejo odporne na insekte.
Pričakujemo, da bo promotor peptidnega gena koristen za ekspresijo himerne genetske sekvence, toda enako velja tudi za druge promotorje. Učinkovit rastlinski promotor, ki je lahko koristen, je promotor, ki povzroči zelo veliko proizvodnjo. Ta promotor mora biti, v funkcionalni povezavi s zapisom za peptid, zmožen sprožiti ekspresijo peptida, tako da je transformirana rastlina bolj tolerantna do škodljivih insektov. Promotorji, ki povzročijo zelo veliko proizvodnjo, za katere pričakujemo, da bodo v tem izumu koristni, so znani.
Himerno gensko sekvenco, ki vsebuje gen za isnekticidno učinkovit peptid funkcionalno povezan s promotorjem, lahko ligiramo v primeren vektor za kloniranje, da bi transformirali želeno rastlino. Na splošno, uporabljamo plazmidne ali viralne (bakteriofagne) vektorje, vsebujoče sekvence za replikacijo in kontrolo, ki so izvedene iz vrst, kompatibilnih z gostiteljsko celico. Vektor za kloniranje bo tipično nosil mesto za začetek replikacije (replication origin), kakor tudi specifične gene, ki lahko preskrbijo pokazatelje fenotipske selekcije v transformiranih gostiteljskih celicah, tipično rezistenco na antibiotike. Vektorji za transformacijo so lahko s temi fenotipskimi pokazatelji izbrani po transformaciji v gostiteljski celici.
Gostiteljske celice, za katere pričakujemo, da bodo koristne, vključujejo prokarionte, vključno bakterijske gostitelje kot so E. coli, Salmonella typhimurium in Serratia marcenso?, ter eukariontske gostitelje kot so kvasovke ali filmentozne glive.
Vektor za kloniranje in gostiteljsko celico, ki jo vektor transformira, običajno uporabljamo, da bi povečali število kopij vektorja. S povečanim številom kopij lahko izoliramo vektorje, ki vsebujejo peptidni gen in jih na primer uporabimo, da bi vstavili tu opisane genske sekvence v rastlino ali druge gostiteljske celice.
Metode za proizvodnjo rastlin, ki eksprimirajo tuje gene, so znane. Na primer, rastlinsko tkivo lahko transformiramo z neposredno infekcijo ali sokultiviranjem rastlin, rastlinskega tkiva ali celic z A. tumefaciens, z neposrednim genskim prenosom eksogene DNA v protoplaste; z inkubacijo s PEG-om; z mikroinjeciranjem ter bombardiranjem z mikroprojektili.
Potrdili so transformacijo v tobaku z elektroporacijo, tehniko ki so jo opisali v Ag. Biotechnology News, Vol. 7 p. 3 in 17 (Sept/Oct 1990). S to tehniko rastlinske protoplaste elektroporiramo v prisotnosti plazmida, ki vsebuje genski sestavek za insekticidno učinkovit peptid. Električni impulzi visoke jakosti polja reverzibilno povzročijo prepustnost membrane, ki dopušča vnos plazmidov. Elektroporirani rastlinski protoplasti ponovno tvorijo celično steno, se delijo in tvorijo rastlinski kalus. Selekcijo transformiranih rastlinskih celic z eksprimiranim insekticidno učinkovitim peptidom lahko izvršimo z uporabo fenotipskih pokazateljev kot smo prej opisali. Protoplastom lahko dodamo eksogeno DNA v katerikoli obliki, tako kot na primer golo linearno, cirkulamo ali prek-zvito (supereoiled) DNA, DNA vkapsulirano v liposomih, DNA v sferoplastih, DNA v drugih rastlinskih protoplastih, DNA v kompleksih s solmi in podobno.
Vse rastlinske celice, ki jih lahko transformiramo z Agrobacterium in cele rastline, regenerirane iz transformiranih celic, lahko tudi transformiramo v skladu s tem izumom, da bi proizvedli transformirane cele rastline, ki vsebujejo prenešen gen za insekticidno učinkovit peptid. Transformacijo v rižu so potrdili D.M. Raineri et ai, Agrobacetrium-mediated transformation of rice (Oryza sativa L:), Biolcchnology, Vol.8, pp 33-38 (January 1990).
Druga metoda za vstavljanje gena za insekticidno učinkovit peptid v rastlinske celice je infekcija rastlinske stene z A. tumefaciens, ki smo ga transformirali z genom za insekticidno učinkovit peptid. V ustreznih pogojih, znanih v stroki, transformirane rastlinske celice rastejo in tvorijo poganjke, korenine in se nadalje razvijejo v transformirane rastline. Genski zapis za insekticidno učinkovit peptid lahko vstavimo v primerne rastlinske celice na primer preko Ti plazmida A. tumefaciens. Ti plazmid se prenese v rastlinske celice po infekciji z A. tumefaciens in sc stabilno integrira v rastlinski genom.
Ti plazmid vsebuje dve regiji, za katere se verjame, da sta bistveni za proizvodnjo transformiranih celic. Ena od njih, imenovana transfer DNA (T DNA), povzroči tvorbo tumorja. Druga, imenovana virulentna regija, je bistvena za tvorbo, toda ne tudi vzdrževanje tumorjev. T DNA regijo, ki se prenese v rastlinski genom, lahko povečamo z vstavljanjem genskega zapisa za neki encim, ne da bi vplivali na njeno zmožnost transferja. Po odstranitvi genov, ki povzročijo tumor, tako da oni nič več ne ovirajo, lahko modificiran Ti plazmid uporabimo kot vektor za transfer genskega sestavka tega izuma v primemo rastlinsko celico.
Transfer DNA v rastlinsko celico lahko dosežemo tudi z injiciranjem v izolirane protoplaste, celice in tkiva v kulturi in injiciranjem v meristemska tkiva kalic in rastlin. Transgenske rastline in njihovo potomstvo dobimo z običajnimi metodami znanimi v stroki.
Druga metoda za uvajanje tujih sekvenc DNA v rastlinske celice obsega pritrditev DNA na delce, katere potem z mehanizmom za sprožitev, genskimi pištolami, prisilimo da vstopijo v rastlinsko celico. Kot tarčo v tem postopku lahko uporabimo katerokoli rastlinsko tkivo ali rastlinski organ, vključno, toda ne omejeno na njih, embrije, vršne in druge meristeme, popke, somatska in spolna tkiva in vivo in in vitro. Transgenske celice in kalus izberemo po vpeljanih postopkih. Tarčna tkiva vzpodbudimo, da tvorijo somatske embrije ali regenerirajo poganjke in tako dajo transgenske rastline po uvedenih postopkih znanih v stroki. V skladu z uporabljeno rastlinsko vrsto lahko izberemo primeren postopek. Transgenske rastline koruze so pripravili z uporabo mikroprojektilov z veliko hitrostjo, da bi gene prenesli v embriogene celice. Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants, Biotechnology, Vol. 8, pp 833-838 (September 1990).
Regenerirana rastlina je lahko himema z ozirom na inkorporirano tujo DNA. Če se celice, ki vsebujejo tujo DNA, razvijejo bodisi v mikro- ali makrospore, bo integrirana tuja DNA prenesena v spolne potomke. Če so celice, ki vsebujejo tujo DNA, somatske celice rastline, ne-himerne transgenske rastline proizvajamo z običajnimi metodami vegetativne (aseksualne) propagacije bodisi in vivo, iz izrezkov popka ali stebla, ali in vitro, sledeč vpeljane postopke zane v stroki. Take postopke lahko izberemo v skladu z uporabljenimi rastlinskimi vrstami.
Po transformaciji rastlinske celice ali rastline, lahko tiste rastlinske celice ali rastline, ki so tako transformirane, da se peptid eksprimira, selekcioniramo s primernimi fenotipskimi pokazatelji. Ti fenotipski pokazatelji vključujejo, toda niso na njo omejeni, odpornost na antibiotike. V stroki so znani tudi drugi fenotipski pokazatelji in jih v tem izumu lahko uporabimo.
Zahvaljujoč vrsti različnih transformacijskih sistemov, lahko načelno transformiramo vse tipe rastlin, tako da one eksprimirajo insekticidno učinkovit peptid pričujočega izuma.
Število dokazov za to, da lahko praktično vse rastline regeneriramo iz celic ali tkiv v kulturi, vključno toda ne omejeno na vse glavne vrste žitaric, sladkorni trst, sladkorno peso, bombaž, sadno drevje, stročnice in zelenjavo, se povečuje. Naše znanje o tem, ali lahko sve rastline transformiramo z Agrobacterium, je za sedaj omejeno. Lahko, da se da vrste, ki so naravni rastlinski gostitelji za Agrobacterium, transformirati in vitro. Enokalične rastline, zlasti žitarice in trave, niso naravni gostitelji za Agrobacterium. Poskusi, da bi jih transformirali uporabljajoč Agrobacterium, so do nedavnega bili neuspešni. Sedaj se veča število dokazov da nekatere enokalične rastline lahko transformiramo z Agrobacterium. Uporabljajoč nove eksperimentalne pristope, lahko transformiramo tudi vrste, ki pripadajo žitaricam in travam.
Z Agrobactcrium lahko poleg tega transformiramo tudi rastlinske vrste, ki vključujejo: Ipomoea, Passiflora, Cyciamen, Malus, Prunus, Rosa, Rubus, Pop ul us, Santalion, Allium, Liiium, Nacissus, Ananas, Arachis, Phaseolus in Pisum.
Regeneracija se spreminja od vrste do vrste rastlin, toda na splošno najprej preskrbimo suspenzijo transformiranih protoplastov, ki vsebujejo večkratne kopije gena za insekticidno učinkovit peptid. Potem lahko sprožimo nastanek embrija iz suspenzije protoplastov, do stopnje zorenja in kalitve kot naravnih embrijev. Gojišče za kulturo bo na splošno vsebovalo različne aminokisline in hormone. Poganjki in korenine se normalno razvijajo istočasno. Učinkovita regeneracija bo odvisna od gojišča, genotipa in zgodovine kulture. Če kontroliramo te tri variable, potem bomo regeneracijo lahko popolnoma reproducirali in ponovili.
Zrele rastline, ki so zrastle iz transformiranih rastlinskih celic, lahko oprašimo same s seboj, da proizvajajo klonirane (inbred) rastline. Klonirane rastline proizvajajo semena, ki vsebujejo gene za insekticidno učinkovit peptid. Iz teh semen lahko z gojenjem proizvedemo rastline, ki eksprimirajo isnekticidno učinkovit peptid. Te klone lahko npr. uporabimo, da bi razvili hibride tolerantne do insektov. Po tej metodi klonirano linijo, ki je tolerantna na insekte, križamo z drugo klonirano linijo, da bi proizvedli hibrid.
V diploidnih rastlinah lahko tipično transformiramo enega roditelja z genskim zapisom za insekticidno učinkovit peptid (toksin), drugi roditelj je pa divji tip. Po križanju roditeljev, bodo hibridi prve generacije (Fj) kazali razpodelitev 1/2 toksin/divji tip : 1/2 toksin/divji tip. Te hibride prve generacije (Fj) lahko oprašimo same s seboj, da proizvedejo hibride druge generacije (F2). Genetska razpodelitev F2 hibridov je 1/4 toksin/toksin : 1/2 toksin/divji tip : 1/4 divji tip/divji tip; F2 hibride z genetsko strukturo toksin/toksin izberemo kot rastline tolerantne na insekte.
Kot jih tu uporabljamo, variante opisujejo fenotipske spremembe, ki so stabilne in dedne, vključno dedne spremembe, ki se seksualno prenašajo na potomstvo rastlin, pod pogojem, da varianta še zmeraj eksprimira insekticidno učinkovit peptid tega izuma. Ravno tako, kot jo tu uporabljamo, mutanta opisuje spremembe, ki so rezultat pogojev okolja, kot je žarčenje, ali rezultat genetskih sprememb v katerih se lastnost prenaša meiotično, v skladu z dobro dognanimi zakoni o dedni zasnovi. Toda, mutantna rastlina mora še zmeraj eksprimirati peptid izuma.
Na splošno bo idealen insekticidno učinkovit protein, ki ga izberemo za eksprimiranje v transgenski rastlini, eden od tistih, ki je značilen po svoji varnosti z ozirom na ne-tarčne insekte in vretenčarje. Ekspresijske sisteme bomo izbrali tako, da bo nivo ekspresije dal insekticidno učinkovitost. Tako pričakujemo, da bo ta tehnična možnost pridobivanja takih transgenskih poljedelsko pomembnih rastlin poljedelcem nudila dodatno orožje za uporabo v enotnem sistemu ravnanja s škodljivci, da bi zmanjšali poškodbe poljščin, ki jih povzročijo insekti, na način, ki odgovorno upošteva okolje.
G. Uporaba peptidov kot insekticidov
Verjamemo, da so insekticidno učinkoviti peptidi tega izuma koristni v kontroli brezvretenčarskih škodljivcev, takih kot je red Lepidoptera, s tem, da ustvarimo stik med škodljivci in učinkovito količino peptida tega izuma. Umestno je, da so insekti prednostni škodljivci.
Metode za omogočanje stika brezvretenčarkih škodljivcev s peptidom, z namenom kontrole omenjenih škodljivcev, so znane. Primeri vključujejo sintetsko inkapsuliranje proteina za peroralno zaužitje s strani škodljivca. Rekombinantne gostitelje, ki eksprimirajo proteine tega izuma, take kot je Pseudomonas Puorescens, lahko ubijemo s toploto in jih apliciramo insektom z namenom kasnejšega peroralncga zaužitja in kontrole.
Seveda lahko metode kontrole brezvretenčarskih škodljivcev z uporabo proteinov tega izuma uporabimo v kombinaciji z drugimi metodami kontrole škodljivcev. Na primer, transgenske rastline in E. coli, ki smo jih zgoraj omenili, lahko z genetskim inženiristvom tako spremenimo, da eksprimirajo druge brezvretenčarske toksine, odvisno od tipa škodljivcev, ki naj bi jih kontrolirali in drugih pomembnih variabl, ki so prisotne.
Omogočen je tudi insekticidni sestavek, ki vsebuje insekticidno' učinkovito količino peptida po tem izumu in njegovo poljedelsko ali vrtnarsko sprejemljivo sol, v njegovem poljedelsko ali vrtnarsko sprejemljivem nosilcu.
H. Protitelesa na isnekticidno učinkovite peptide
Drugi vidik tega izuma so protitelesa na insekticidno učinkovite peptide tega izuma. V naslednjem opisu se bomo sklicevali na različne metodologije, ki jih poznajo strokovnjaki na področju imunologije, za ugotavljanje in čiščenje peptidov, ki reagirajo s tukaj opisanimi protitelesi.
Za protitelo rečemo, da je sposobno vezave molekule, če je zmožno specifično reagirati z molekulo in na ta način vezati molekulo na protitelo. Termin epitop pomeni del peptidnega antigena, katerega lahko protitelo prepozna in se na njega veže. Antigen ima lahko enega ali več epitopov. Antigen je zmožen vzbuditi žival, da proizvaja protitelo, sposobno vezave na epitop tega antigena. Specifična reakcija, na katero se zgoraj sklicujemo, pomeni da bo antigen imunoreagiral, na visoko selektivni način, z njegovim ustreznim protitelesom in ne z množino drugih protiteles, kijih lahko izzovejo drugi antigeni.
Termin protitelo (antibody - Ab) ali monoklonsko protitelo (Mab), kot ga v tem besedilu uporabljamo, je mišljen tako, da vključuje intaktne molekule kakor tudi njihove fragmente (take kot sta na primer fragmenta Fab in F(ab')2), ki so zmožni vezave antigena. Fragmenta Fab in F(ab')2 nimata fragmenta Fc intaktnega protitelesa, se bolj hitro odstranita iz cirkulacije in lahko kažeta manj nespecifične tkivne vezave insektovega protitelesa.
Protitelesa pričujočega izuma lahko pripravimo po katerikoli od mnogih metod. Metode za proizvodnjo takih protiteles so dobro znane in v celoti opisane v literaturi. Videti npr. Sambrook et al., Molecular Cloning a laboratory manual, seeond ed. Cold Spring Harbor Press, Vol. 3, Ch. 181 (1989). Na primer, celice, ki eksprimirajo insekticidno učinkovit peptid ali njegov fragment, lahko dajemo živali, da bi vzbudili proizvodnjo serumov, ki vsebujejo poliklonska protitelesa, zmožna vezave insekticidno učinkovitega peptida. Na splošno, pripravimo insekticidno učinkoviti peptidni fragment in ga očistimo, da ga naredimo bistveno brez naravnih onesnaženosti, ali pa insekticidno učinkoviti fragment sintetiziramo v skladu z načini, znanimi v stroki. Bodisi očiščeni fragment ali sintetizirani fragment, ali kombinacijo očiščenega naravnega fragmenta in/ali sintetiziranega fragmenta, lahko vstavimo v žival, da bi proizvajala poliklonske serume z večjo specifično aktivnostjo.
Monoklonska protitelesa lahko pripravimo uporabljajoč znano tehnologijo hibridomov. Na splošno, taki postopki vključujejo imunizacijo živali z insekticidno učinkovitim peptidnim antigenom. Izločimo vranične celice take živali in jih podvržemo fuzji s primerno mielomsko celično linijo. V skladu s pričujočim izumom lahko uporabimo katerokoli primemo mielomsko celično linijo. Po fuziji nastale celice hibridoma selektivno vzdržujemo v primernem gojišču in jih nato kloniramo z omejeno razredčitvijo. Hibridomske celice, ki jih dobimo s tako selekcijo, potem preizkusimo, da bi identificirali klone, ki izločajo protitelesa, zmožna vezave insekticidno učinkovitega peptidnega protitelesa.
Ce je vir peptida nečist, bodo samo nekatere od hibridomskih celic proizvajale protitelesa, sposobna vezave na peptid (druge hibridomske celice bodo proizvajale protitelo, zmožno vezave na onesnažitve peptida). Torej bo mogoče potrebno hibridomske celice podvreči selekciji, da bi določili tiste, ki so zmožne izločanja protitelesa, ki je zmožno vezave na peptid. Tako selekcijo prednostno izvršimo z inkubiranjem vzorca pcptida (ali strupa) v prisotnosti monoklonskega protitelesa, izločenega iz vsake skupine posebnih hibridomskih celic, ter z identificiranjem katerekoli hibridomskc celice, zmožne izločanja protitelesa, ki je sposobno, da nevtralizira ali zmanjša zmožnost strupa, da paralizira insekta. Ko smo tako hibridomsko celico identificirali, jo lahko klonalno propagiramo s sredstvi znanimi v stroki, da bi proizvedli monoklonsko protitelo, specifično za ta peptid.
Da bi očistili toksin, ki je selektiven za insekte, naraven ali rekombinanten, uporabljajoč afinitetno kromatografijo z protitelesi, je potrebno uporabiti protitelo, zmožno vezave na insekticidno učinkovit peptid. Na splošno bo tako protitelo monoklonsko. Potem, ko smo pridobili tako specifično monoklonsko protitelo, ga lahko imobiliziramo z vezavo na trdno podlogo in uporabimo, da bi očistili peptid iz naravnega strupa ali drugih virov, uporabljajoč imunoafinitetno kromatografijo v skladu z metodami, ki so v stroki dobro znane. Take metode so zmožne posredovati visoko stopnjo čiščenja in, na ta način, proizvajanja peptida, ki je bistveno brez naravnih onesnažitev. Kot to uporabljamo v tem besedilu, za peptid rečemo, da je bistveno brez naravnih onesnažitev, če je prisoten v obliki, v kateri ni spojin s katerimi je on naravno in normano združen (tj. drugih proteinov, lipidov, ogljikovih hidratov, itn.).
Potem ko smo peptid očistili, ga lahko uporabimo za imunizacijo živali (take kot je miš ali zajec), da bi vzbudili proizvodnjo poliklonskega protitelesa, specifičnega za peptid.
DNA sonde primerne velikosti, na splošno med 10 do 50 nukleotidov, lahko dobimo iz sekvence DNA, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia. Take sonde lahko uporabimo za ugotavljanje prisotnosti DNA, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia, tako da omogočimo stik strupa z DNA sondo in izvršimo detekcijo sonde, vezane na omenjeno DNA, s strokovnjakom zanimi postopki.
I. Insekticidni mikrobi, dobljeni z genskim inženirstvom
Pričakujemo, da bo insekticidno učinkovit peptid, sam ali v kombinaciji z drugim insektnim toksinom, koristen za omogočanje ali povečanje toksičnosti mikrobov kot so bakulovirusi in hibridne bakterije.
Več bakulovirusov, vključno s tistimi, ki inficirajo Heliothis virescens, Orgyia pseudotsugata, Lymantia dispar, Autographa califomica, Neodiprion sertifier in
Lanspcyresia pomonella, je bilo registriranih v nekih državah in uporabljenih kot pesticidi. Pričakujemo, da bo vstavitev v genom vsaj enega toksina, selektivnega za insekte, pomembno povečala učinkovitost takih pesticidov.
Pričakujemo, da bo za uporabo v tem izumu zlasti primeren rekombinantni ekspresijski vektor tak kot je tip, odkrit v U.S. Patent No. 4,879,236 ki je tu vključen z referenco, kot da smo ga v celoti podali. Videti tudi Carbonell et al., Synthesis of a gene coding for an insect-specific scorpion neurotoxin and attemps to express it using baculovirus vectors, Gene, 73:409-418 (1988). Pričakujemo, da bo vektor koristen v sistemu, kjer lahko DNA sekvenco, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia, kloniramo v bakulovirusni, kot je Autographa californica (AcMNPV), ekspresijski vektor, tako kot so opisali v U.S. Patent No. 4,879,236 in Miller et al., Science, 219, 715-721 (1983). Virus, ki je rekombinantni ekpresijski vektor, lahko potem apliciramo na rastlino ali žival za katero je insekt škodljivec, in kjer bo, potem ko ga bo škodljivi insekt zaužil, rekombinantni virus napadel celice črevesne stene in se bo začela njegova replikacija. Za časa replikacije se bo gen za insekticidno učinkovit peptid eksprimiral, rezultat tega pa bo onemogočenje ali smrt insekta v krajšem razdobju kot če bi insekt zaužil divji tip AcMNPV virusa.
O hibridnem virusu, za katereg tudi pričakujemo, da bo koristen, govorijo v Evropski patentni prijavi 0 340 948. Pričakujemo, da bo hibridni virus, ki eksprimira DNA tega izuma, dal virus, ki bo imel spremenjen obseg gostiteljskih insektov. Na primer, fuzijski proteini so lahko eksprimirani kot en sam polipeptidni produkt hibridnega gena, ki se sestoji iz DNA tega izuma in specifičnega prepoznavnega proteina Črevesne celice insekta, da bi bil eksprimirani insekticidno učinkovit peptid usmerjen na tarčnega gostiteljskega insekta.
Različne prokariontske in eukariontske mikrobe lahko transformiramo tako, da eksprimirajo hibridni gen za toksin, ki kodira isnekticidno učinkovit protein, z metodo opisano v Evropski patentni prijavi 0 325 400.
Pričakujemo, da bodo hibridne bakterijske celice, ki vsebujejo plazmid z genom, ki kodira za protein tega izuma, koristne v metodi tega izuma. Insekte naj bi kontrolirali z aplikacijo hibridov na insekte. Videti npr. U.S. Patent No. 4,797,279 kateri je z referenco vključen v ta tekst, kot da bi bil v celoti podan.
Drugi primeri uporabe bakulovirusov, ki bi bili primerni za uporabo v tem izumu, so opisani v Tomalski et al., Insect paralysis by baculovirus-mediated expression of a mite neurotoxin gene, Nature, 352:82-85 (1991) in Stewart et al., Construction of an improved baculovirus insecticide containing an insect-specific toxin gene, Nature, 352: 85-88 (1991); McCutchen et al., Development of a recombinanl Baculovirus expressing an insect selective Neurotoxin: Potential for Pest Control, Biotechnology, 9:848-851 (1991).
J. Prečna hibridizacija: DNA sekvence kot sonde za sorodne spojine
DNA sonde ustrezne veličine lahko dobimo iz DNA sekvence tega izuma. Take probe lahko uporabimo, da bi ugotovili prisotnost nukleinske kisline, ki kodira insekticidno učinkovit peptid tega izuma, s hibridizacijo z nukleinskimi kislinami iz drugih virov. Selekcija z oligonukleotidno sondo, ki kodira za signalno sekvenco, s fragmenti cDNA, ali celo s celotno cDNA, v pogojih zmanjšane zahtevnosti, bo omogočila dostop do drugih aktivnih peptidov, ki so funkcionalno homologni z družino tu opisanih toksinskih molekul. Viri nukleinskih kislin, ki bi bile dobri kandidati za prečno hibridizacijo z nukleotidnimi sondami, proizvedenimi iz DNA sekvenc tega izuma, bi vključili, toda na njih nc bi bili omejeni, pajke istih rodov toda različnih vrst, pajke sorodnih rodov ter pajke istih rodov toda z različnih lokacij.
K. Identifikacija promotorske sekvence
Drugi vidik tega izuma omogoča promotorsko sekvenco, ki kontrolira sintezo DK 9. v pajku. Organizacijo gena za DK 9.2 smo preiskovali s pregledom genomske knjižnice s cDNA zrelega toksina kot sondo. Analiza genomske DNA, ki se nahaja pred mestom za začetek transkripcije (za katero domnevamo, da je 5' konec cDNA), kaže prisotnost dozdevnega promotorja. DNA sekvenca za 421 baznih parov promotorske regije je prisotna v SEQ ID NO:8. Ta domnevni promotor vsebuje mnoge od bistvenih kontrolnih signalov, ki so na splošno prisotni v regiji neposredno pred mestom začetka translacije. (Za pregled promotorskih kontrolnih signalov videti MeKnight et al., 1982. Transcriptional Control Signals of an Eucaryotic Protein-Coding Gene. Science TITPAB) Standardna TATA škatla se pojavlja na položaju -30 od predlaganega mesta za začetek transkripcije in za njo sugerirajo, da je pomembna v kontroli startne točke za sintezo RNA. Še naprej pred tem se nahajata dve končni palidromni sekvenci, od katerih ena vsebuje soglasno CAAT škatlo, za katero se misli, da je pomembna za vezavo encima RNA polimeraza II. Predvidevamo, da bo ta promotor, ali regije tega promotorja, koristen v transkripciji in ekspresiji različnih genov v rastlinskih, živalskih ali bakterijskih celicah, na primer v rekombinantni konstrukciji.
Primeri
Sledeče, primere podajamo, da bi ponazorili posamezne sestavke in metode v obsegu pričujočega izuma, njihov namen pa ni omejiti obseg pričujočega izuma.
Materiali in metode
Pajke smo dobili od Spider Pharm, Inc. iz Black Canyon City, AZ, ki so preskrbeli tudi identifikacijo vrst. Pajkom Diguctia canitics smo električno odvzeli strup po metodi, ki uporablja zaščito, da bi se preprečilo onesnaženje strupa z izbruhano hrano ali hcmolimfo.
Čiščenje toksina - Surov strup (shranili smo ga pri -80°C) smo odtajali, dobro zmešali in raztopili v 0.1% trifluorooeetni kislini (TFA) preden smo ga kromatografirali. Surov strup smo frakcionirali z obratno fazno tekočinsko kromatogrfijo (RPLC) z inkorporiranjem topila Beckman System Gold 126 in z detektorskimi moduli s 168 fotodiod v vrsti. Uporabili smo acetonitril ali izopropanol v kombinacijah s TFA kot reagetom za sparitev ionov. V čiščenjih smo uporabljali naslednje kolone, s zaščitnimi kolonami iste matrice: kolono Dynamic 300 A C18 (25 cm x 4,6 mm notranji premer (n.pr.), veličina delcev 12 pm), analitsko kolono Vydac 300 A Ci8 (25 cm x 4,6 mm n.pr., veličina delcev 5 pm) in polpreparativno kolono Vydac 300 A C18 (25 cm x 10 mm n.pr., veličina delcev 5 p
m). Vrh smo določili z registriranjem na 220 nm in zbiranjem frakcij z mikrofrakcionirnim kolektorjem Gilson 208. Vse frakcije smo liofilizirali do suhega in shranili pri -80°C.
Masna spektrometrija z bombardiranjem na podlagi hitrih atomov (FAB-MS) Masne spektre smo zabeležili na University of Illinois na ZAB-SE masnem spektrometru, VG instrumenti, uporabljajoč standadne FAB pogoje (plinski ksenon, rezolucija 1000, pospeševalna napetost 8 kV, vir temperature 40°C). Vzorce (približno Ipg) smo analizirali v 4 pl tioglicerola, ki je vseboval 25% vodne raztopine TFA (1,0%).
Primer 1
Začetno frakcioniranje in identifikacija frakcij, ki vsebujejo insekticidni peptid iz celotnega strupa Diguetia canities
Liofilizirani celotni strup, 25 pl, ki smo ga dobili iz Diguetia canities kot smo prej opisali, smo raztopili v 0,1% trifluoroocetni kislini (TFA) in ga frakcionirali z obratno fazno tekočinsko kromatografijo na polpreparativni koloni Vydac RP C18 ; eluirali smo s hitrostjo pretoka 3,5 mL na minuto. Uporabili smo linearni gradient eluenta, na začetku je bila zmes 85:15 vodna 0,l%TFA: 50% acetonitril, 0,1% TFA in na koncu, po 180 minutah, 50:50 zmes.
Frakcija Retencijski čas (približno, minute)
3.2
29.6
48.2
57.1
62,8
66.4
68.7
71.4
77.1
126.1
131.4
Vsako frakcijo smo koncentrirali z liofilizaeijo iz eluenta in nato z liofilizacijo iz vode. Ostanek smo shranili pri -80°C. Vsako frakcijo smo za vrednotenje insekticidnosti raztopili v 25 pL pufrne fiziološke slanice. Insekticidno aktivnost nekih frakcij amo potrdili s testiranjem na tobačnem vršičnem črvu (Heliothus virescens) TBW (Tabela I).
V ličinke TBW, pet posameznih za vsako frakcijo, smo injicirali 3 pL testne raztopine, uporabljajoč 50 pL Hamiltonovo štrcalko opremljeno s 33 kalibrirano iglo in PB 600 ponavljajočim mikrodispenzerjem. Injekcije smo dali tako, da smo iglo vstavili v lateralno srednjo črto abdomena (blizu ene od pro-nog) pod plitkim kotom, da ne bi poškodovali notranjih organov. Po injekciji smo vsakega insekta postavili v ločeno posodo, v kateri je bila umetna hrana. Opazovanja smo izvajali periodično; paralizo smo merili 24 ur po injiciranju. Za izračunavanje doz smo kol povprečno telesno maso črvov uporabljali 0,3 g. V serijo kontrolnih insektov smo injicirali samo puferno sianico.
Paraliza se je razvijala postopno, predhodilo ji je pa obdobje izraženih mišičnih krčev. V teških primerih so se ti krči začeli 15 -30 minut po injiciranju in se postopno večali, dokler ličinke niso bile popolnoma onemogočene. Tremor je včasih vztrajal več kot 48 ur po injiciranju. To se je včasih zgodilo celo ko smo dali subletalno dozo in so ličinke morebitno oživele. Resnost tremorja je bila najbolj zanesljiv pokaztelj toksičnosti; ličinke, ki so bile prizadete do popolne paralize in/ali telesne kontrakcije, niso oživele.
Razpredelnica I
Toksičnost RPLC frakcij celotnega strupa Diguetia canitics merjena na TBW (7,5 WVE/g insekta)**
Frakcija % paralize* začetni % paralize 24 ur
1 0 0
4 0 0
6 0 0
8 100 100
9 100 100
10 100 100
11 100 100
12 100 100
13 0 0
16 0 0
17 0 0
kontrola 0 0
* Paralizo smo definirali kot nezmožnost insektov, da se sami zravnajo ko jih obrnemo na stran ali hrbet.
** WVE (whole venome equivalent - ekvivalent celotnega strupa), je količina kateregakoli toksina, ki se normalno nahaja v enem mikrolitru celotnega, iz pajka dobljenega strupa; 5 WVE iz 25 mikrolitme separacije je 20% pridobljenega ostanka.
Primer 2
Čiščenje Diguetia canities, frakcija 9
Glavno komponento frakcije 9, ki je aktivna na TBW, smo očistili do homogenosti (ena vidna črta na SDS-PAGE elektroforezi, približno v območju molekulske mase 6500 daltonov) z dodatno kromatografijo skozi kolono Vydac RP
C18 (25 cm x 10 mm n.pr.), uporabljajoč linearni (1,0%/min) gradient topila isopropanol/0,1% TFA, pri 3,5 mL/min, ter z registriranjem pri 220 nm.
Detekcijo vrha in zbiranje frakcij smo izvršili tako kot smo opisali v primeru
1. Zbrali smo dve frakciji: prvo, ki se je eluirala pri 21,81 minutah (frakcija 9.1) in drugo, ki se je eluirala pri 22,39 minutah (frakcija 9.2).
Frakciji 9.1 in 9.2 smo koncentrirali z liofilizacijo iz eluenta in potem z liofilizaeijo iz vode, da smo dobili ostanke 9.1 oziroma 9.2. Ocenili smo, da je čistoča liofiliziranih frakcij najmanj 99%. Presodili s mo, da je ostanek 9.2, ki smo ga dobili iz 25 pl celotnega strupa, vseboval približno 6 pg čistega proteina. Ostanek 9.2 smo testirali na insekticidno aktivnost proti tobačnemu vršičnemu črvu kot smo opisali v primeru 1, z injiciranjem 6,3 pg ostanka v pufrni slanici v vsakega od pet insektov, v pet kontrolih insektov pa samo pufrne raztopine soli. Po 24 in 48 urah smo insekte preiskali. Pri odčitku po 24 urah so vsi tisti insekti, ki smo jih obdelali z raztopino ostanka 9.2, bili paralizirani in so kasneje umrli, medtem ko so kontrolni insekti izgledali normalno. Po 48 urah nismo opazili nikakršnih sprememb.
Analiza tega polipeptida z masno spektrometrijo na podlagi bombardiranja s hitrimi atomi je nakazala molekulsko maso 6371 ± 2. Aminokislinska sekvenčna analiza na N-koncu je rezultirala v delnem aminokislinskem zaporedju za ostanek 9.2, bistveno takem kot smo pokazali v SEQ ID NO:1, aminokisline 1-33.
LD5o za 9.2 Diguetia toksina v H. virescens (TBW) je bila približno 1,0 mol/gm. Simptomi so bili podobni tistim, ki so povezani z dajanjem celotnega strupa kot smo opisali v primeru 1.
Primer 3
Čiščenje Diguetia canities, frakcija 11
Frakcijo 11, ki smo jo izolirali iz celotnega strupa Diguetia canities kot v primeru 1, smo na način podoben tistemu iz primera 2 dalje očistili z obratno fazno tekočinsko kromatografijo, ter tako dobili eno frakcijo. To frakcijo smo koncentrirali z liofilizacijo iz eluenta in potem z liofilizacijo iz vode, da smo dobili ostanek, ki smo ga označili kol ostanek 11. Ta ostanek smo testirali na insekticidno aktivnost proti tobačnemu vršičnemu črvu pri 5,0 WVE/g kot smo opisali v primeru 2. Po 24 urah je bilo paralizirano 80% insektov od tistih, ki smo jih obdelali z ostankom 11, po 48 urah je pa bilo paraliziranih 60% insektov obdelanih s peptidom. Kontrolni insekti so izgledali normalno.
Analiza tega polipeptida z masno spektrometrijo na podlagi bombardiranja s hitrimi atomi je nakazala molekulsko maso 6740 ± 2. Aminokislinska sekvenčna analiza na N-koncu je rezultirala v delnem aminokislinskem zaporedju za ostanek 11, bistveno takem kot smo pokazali v SEQ 110 NO:3, aminokisline 1-29.
Primer 4
Čiščenje Diguetia canities, frakcija 12
Frakcijo 12, ki smo jo izolirali iz celotnega strupa Diguetia canities kot v primeru 1, smo na način podoben tistemu iz primera 2 dalje očistili z obratno fazno tekočinsko kromatografijo, ter tako dobili eno frakcijo. To frakcijo smo koncentrirali z liofilizacijo iz eluenta in potem z liofilizacijo iz vode, da smo dobili ostanek, ki smo ga označili kot ostanek 12. Ta ostanek smo testirali na insekticidno aktivnost proti tobačnemu vršičnemu črvu kot smo opisali v primeru 2. Po 24 urah je bilo paralizirano 100% insektov od tistih, ki smo jih obdelali z ostankom 12, po 48 urah je pa bilo paraliziranih 80% isnektov obdelanih z ostankom 12. Kontrolni insekti so izgledali normalno.
Analiza tega polipeptida z masno spektrometrijo na podlagi bombardiranja s hitrimi atomi je nakazala molekulsko maso 7080 ± 2. Aminokislinska sekvenčna analiza na N-koncu je rezultirala v poskušnem delnem aminokislinskem zaporedju za ostanek 12, bistveno takem kot smo pokazali v SEQ ID NO:5.
Omejene zaloge materiala niso dopustile precizne kalibracije toksičnosti; rezultat tega je bil, da smo ostanek 9.2 testirali pri dozah (nmol/g) 39% in 67% večjih kot v primeru ostanka 11 oziroma 12. Predvideno je bilo, da bodo izbrane doze pokrile območje od najmanše letalne doze do nivoja, ki nima učinka, toda to nismo dosegli v vsakem primeru. Vseeno rezultati kažejo, da imajo ti peptidi precej podobno toksičnost. Mogoče je ostanek 9.2 rahlo bolj učinkovit od drugih, toda razlika je verjetno manjša od faktorja 3. Izgleda, da je minimalna 100% letalna doza za te peptide (ostanki 9.2,11 in 12) od 3,0 do 5,0 nmol/g.To je ugodno v primerjavi s komercialnimi insekticidi; teflubenzuron na primer ima topično LD50 (SAW) 1,0 nmol/g.
Primer 5
Izolacija genov, ki kodirajo za ostanke 9.2 in 11, izolirane iz strupa Diguetia canities
Stopnja #1: Izolacija RNA
Pajke smo zbrali iz zunanjih virov in jih identificirali kot Diguetia canities. Žive pajke smo zamrznili in pod tekočim dušikom odstranili cefalotoraks. RNA smo ekstrahirali iz cefalotoraksa uporabljajoč predpis iz Chomczynski & Sacchi, Analytical lliochcmistry, 162, 156 (1987). Poliadenilirano informacijsko RNA (messenger RNA - mRNA) smo očistili s kromatografijo na oligo d(T) celulozi (Pharmacia LKB, Sweden).
Stopnja #2: Sinteza cDNA
Informacijsko RNA smo obratno transkribirali v cDNA z reverzno transkriptazo iz glodalskega virusa levkemije (Bethesda Research Laboratories, MI)), uporabljajoč protokol proizvajalca. 20 pl reakcijske zmesi je vsebovalo encimski pufer, ki je dostavljen v kitu za cDNA sintezo (Boehringer Mannheim, IN), 50 ng mRNA, 2 enote RNaze H, 30 ng d(T)AW I primer-a (začetnega oligonukleotida) (Promega, Madison, WI), 1 mM vsakega deoksinukleozid trifosfata in 100 pg reverzne transkriptaze. Reakcijsko zmes smo inkubirali 1 uro pri 37°C in nato še 10 minut pri 42°C. Reakcijsko zmes smo oborili z etanolom in jo resuspendirali v 20 pl vode.
Stopnja #3: Sinteza primer-a (začetnega oligonukleotida)
Zmes DNA sekvence, ki je degenerirani začetni oligonukleotid, ki lahko kodira aminokislinske ostanke 1-8 po SEQ ID NO:1, smo določili uporabljajoč neke kodonske preference iz Drosophila, da bi zmanjšali degeneracijo. Ta začetni oligonukleotid smo sintetizirali s pripomočki University of Utah, Howard Huges
Medical Institute.
Stopnja #4: Pomnoževanje (amplifikacija)
Encimsko pomnoževanje (amplifikacijo) DNA s termostabilno RNA polimerazo, ki jo usmerja začetni oligonukleotid, so prvi opisali Saikki et al., Science, 239:487 (1988). Za naše potrebe smo kot osnovo (template) v polimerazni verižni reakciji (polymerase chain reaction - PCR), ki je vsebovala reagente iz GeneAmp™ amplifikacijskega kita (Perkin Elmer Cetus, CA), uporabili 5 pl cDNA cefalotoraksa Diguetia. N reakciji pomnoževanja so se nahajali smiselni (sense) in protismiselni (antisense) začetni oligonukleotidi v 2 μΜ koncentraciji, 100 μΜ vsakega deoksinukleozid trifosfata in 4 enote termostabilne rekombinantne Taq /polimeraze. Reakcija je potekala v DNA Thermal Cycler, proizvedenem v Perkin Elmer Cetus. Selektivno pomnoževanje gena, ki kodira za ostanek 9.2, iz družine sorodnih toksinov s podobnimi zaporedji na NH2-koncu, smo dosegli z uporabo strogo določene temperature, na kateri pride do renaturacije (58°C). V teh pogojih se je pomnožila samo ena DNA, ki je bila dolga približno 275 baznih parov, kakor smo določili z elektroforezo na agaroznem gelu. Če smo uporabljali manj stroge pogoje renaturacije smo lahko z elektroforezo na agaroznem gelu ugotovili prisotnost več kot pet produktov pomnoževanja, ki so imeli veličine v obsegu med 200 do 360 baznih parov. Ti različni produkti PCR, ki smo jih dobili v manj strogih pogojih, verjetno kodirajo polipeptide, ki so po aminokislinskem zaporedju, približni veličini in inseskticidni aktivnosti, sorodni ostanku 9.2. Pričakovali bi, da bodo taki sorodni polipeptidi vključili ostanke 11 in 12, ker so sekvence teh polipeptidov na Nkoncu zelo podobne ena drugi in ostanku 9.2, kot smo pokazali v SEQ ID NO:1, 3 in 5.
Stopnja #5: Kloniranje produktov PCR
Produkte PCR iz obeh reakcij, v strogih in manj strogih pogojih, smo očistili, da bi odstranili nevgrajene začetne oligonukleotide, uporabljajoč Centricon-100 (Amicon) ločilno enoto na podlagi molekulske veličine. Zaostale produkte smo digerirali z restrikcijskim encimom Not I (MBR, Milwaukee, WI), ki cepi v začetnem oligonukleotidu na 3' koncu in ob tem pusti lepljiv konec. Vektor, pKS (Stratagene, LaJolla, CA), smo dvakrat digerirali z BcoR V (US Biochemical) in Not I, da bi dobili mesta specifična za usmerjevalno kloniranje. Vektor in vstavljeni del smo ligirali in transformirali v compex DH5aF\ Dvignjene kolonije smo pregledali s 32P označeno notranjo sondo in kolonije kandidate nadalje karakterizirali s sekveniranjem (US BiochemicaTs Sequenase Version 2.0) miniprep DNA, uporabljajoč notranjo sondo kot začetni oligonukleotid.
Popolne DNA sekvence vstavljenih cDNA dveh klonov ponazarjamo v SEQ ID NO:2 in 4. Samo pivo smo dobili v klonih, ki so nastali v PCR reakciji v strogih pogojih, med tem ko smo oba tipa vstavljenih cDNA našli v klonih, ki smo jih dobili iz produktov PCR reakcije v manj strogih pogojih. Aminokislinsko zaporedje polipeptida, ki ga kodira SEQ ID NO:2 smo pokazali v SEQ ID NO:1. Ta polipeptid ima sekvenco na N-koncu, identično tisti, ki smo jo določili za ostanek 9.2. Izračunana molekulska masa tega polipeptida je 6377,9 daltonov. Če dopuščamo, da vsi cisteini v nativnem polipeptidu obstajajo v obliki znotrajmolekulskih disulfidnih vezi (čistin), bi izračunana molekulska masa bila 6369,7 daltonov. torej se zdi, da je ta polipeptid identičen s polipeptidom, ki smo ga izolirali v ostanku 9.2, ki pri določanju z masno spektrometrijo kaže molekulsko maso 6371 ± 2. Aminokislinsko zaporedje polipeptida, ki ga kodira SEQ ID NO:4 ponazarjamo v SEQ ID NO:3. Ta polipeptid ima sekvenco na N-koncu, identično tisti, ki smo jo določili za ostanek
11. Torej se zdi, da je ta polipeptid isti kot tisti polipeptid, ki smo ga izolirali v ostanku 11.
Primer 6:
Toksičnost za sesalce
Celoten strup, 5 μΐ, ki so ga pridobili iz D. canities, kot je v tem izumu opisano, je bil po intraperitonealni aplikaciji (IP) smrten za miši v treh ločenih poskusih. Uporabljene miši se niso razlikovale od tistih, ki smo jih uporabili za kontrolno skupino, kjer smo aplicirali slanico. Po približno 10 do 15 minutah po injiciranju so miši postale zmerno hiperaktivne, njihova hoja je bila značilno poskakujoča; temu pa je sledila kratka doba nekoordiniranosti gibanja, s težkim dihanjem in krči. Smrt je nastopila po 2 minutah od začetka pojava omenjenih znakov.
Po intraperitonealni aplikaciji ostankov 9.2, 11 in 12 v miši v približnih odmerkih 4.2, 0.9 in 1.2 mg/kg, v obdobju 24-ih ur nismo opazili nobenih učinkov za vse tri peptide.
Štirim mišim smo injicirali v intracerebralne ventrikle ostanek 9.2 (približno 28 g) v odmerku približno 30 pg na žival (približno 1 mg/kg). V obdobju 48 ur po 20 injekcijah nismo opazili nobenih učinkov. Pri drugi miši po (IP) aplikaciji približno 125 pg (4.2 mg/kg) zaostanka 9.2 ni bilo opaziti učinka.
Za ugotavljanje toksičnosti tega strupa za vretenčarje smo preiskusili zbrane obratno fazne frakcije celotnega strupa na miših (slika 1). Frakcija 2 je obsegala spojine z aktivnostjo proti črvu vršička tobaka (TWB). Po dozi, ki je bila enaka 25 pg celotnega strupa (WVE), po intraperitonealni aplikaciji frakcij 1 in 2 nismo opazili učinkov; po frakciji 3 so se pokazali enaki učinki kot smo jih opazili po injiciranju celotnega strupa. Taki rezultati nakazujejo čisto ločevanje med insekticidno učinkovitostjo in toksičnostjo za vretenčarje, ki jih izkazujejo komponente strupa Diguctia canitics.
Primer 7:
Elektrofiziološki podatki
I)K 9.2 smo preiskusili pri 1 pg na sinaptičnem prenosu (izzvani populacijski odzivi) pri mišji Schafferjevi kolateralni CA 1 sinapsi piramidalne celice v hipokampalnem režnju. Podatki prikazani na sliki 2 predstavljajo posnete povprečne čase vrhov populacije (a) 5 minut pred dodatkom DK 9.2 in (b) med 15 do 20 minutnim intervalom po dodatku DK 9.2. Ti posnetki se lahko seštevajo, kar kaže na to, da pri tej koncentraciji DK 9.2 nima aktivnosti v centralnem živčnem sistemu (CNS) miši, ki jo drugače s tem testom zasledimo. S tem testom lahko zasledimo različne učinke na različnih ionskih kanalih pri sesalcih in receptorjih za živčne prenašalce (T.V. Dunwiddie, The Useofln Vitro Brain Slices v Neuropharmacology v Electrophysiological Techniques in Pharmacology, urednika H.G. Geller, Alan R. Liss, Inc., New York, 1986). Natančneje, molekule, ki preprečijo inaktivacijo natrijevih kanalčkov, kot so določeni strupi škorpijona, povzročijo opazno razširitev zadnje faze odziva pikov populacije (Kaneda M, Myama Y, Ikemoto Y in Akaike N., Scorpion toxin prolongs an inaetivation phase of the voltage-dependent sodium current in rat isolated single hippocampal neurons, Brain Res. 487: 192 - 195, 1989; Alan L. Mueller, Natural Product Science, Inc., neobjavljena opažanja). V nasprotju, DK 9.2 je aktiven v preparatih za mrčes (hišna muha) v 100-krat nižji koncentraciji in v obliki, ki nakazuje na to, da inaktivira natrijeve kanalčke pri mrčesu.
Primer 8:
Protitočna (upstrcam) cDNK sekvenca, ki označuje prckurzor DK 9.2
Da bi sintetizirali protitočno sekvenco cDNK, ki označuje DK 9.2, smo sintetizirali notranji oligonukleotid, ki ustreza delu nukleinske kisline od #159 do 178 na priležni (antisense) verigi DNK sekvence predstavljene v SEQ ID NO:2. Eco RI mesto je prisotno na 5' koncu te verige. 10 μΐ enojne cDNA žleznega strupa smo sintetizirali na njenem 3' koncu s pomočjo deoksigvanozina s pomočjo encima teminalna deoksinukleotid transferaza (Bethesda Research Laboratories). 20 μΐ reakcijske zmesi, ki je vsebovala 14 μ encima in 500 μΜ dGTP smo inkubirali pri 37° C 15 minut. Vzorec smo oborili z etanolom in ponovno suspendirali v 20 μΐ vode.
Protitočno sekvenca DNK specifičnega gena smo pomnožili z uporabo uveljavljene PCR tehnike, ki je podobna tisti, ki so jo uporabili za zrelo cDNK sekvenco strupa. V reakciji pomnoževanja sta bili prisotni prava (a d(c) pripeta veriga) in njej priležna veriga v 2 μΜ koncentraciji, 100 μΜ vsakega deoksinukleotidnega trifosfata in 4 enote termostabilne rekombinantne Taq polimeraze. temperaturni profil je bil sledeč: 2 minuti pri 94°C, 2 minuti pri 37°C in 1 minuto pri 37°C. Tak ciklus smo ponovili 2-krat in ga nato premaknili na podoben profil s tem, da smo vključili povišano temperaturo renaturacije 54°C v drugem koraku. Tak ciklus smo ponovili 32-krat.
Uveljavljena PCR je dala pri 380 bp fragment kot je razvidno na 4% agaroznem gelu v prisotnosti etidijevega bromida. Produkt reakcije smo vstavili na koncu velikega (Klenow-ega) fragmenta DNK polimeraze I E. coli (Molecular Biology Resources, Madison, Vri) in oborili z dodatkom etanola. Produkt smo ponovno suspendirali in ga razgradili s pomočjo encima, Eco RI. Digerirani fragment je kloniran v prisotnosti 1 mM ATP z encimom T4 kinaza nato ligiran v Eco RI in z Eco R V digeriran pBluescriptsKs vektor. Podklone smo analizirli s sekveniranjem dvojne vijačnice DNK, uporabljajoč Sekvenazo 2.0 (USB).
Translacija cDNK sekvence, ki se nahaja v področju pred zrelim peptidnim toksinom odkriva, da naj bo DK 9.2 sintetiziran kot prekurzorski protein. Protitočna cDNK sekvenca je predstavljena v SEQ ID NO: 6. Prekurzorski protein obsega signalno sekvenco in propeptidno področje (SEQ ID NO:7), ki jih odstranimo, da dobimo zrel epptidni toksin, ki ga lahko izoliramo iz pajkovega strupa. Menimo, da sta signal in propeptidna sekvenca potrebni za proizvodnjo in izločanje DK 9.2 v pajku.
Primer 9:
Rekombinantna kosntrukcija z bakulovirusom
Lepidopteranska signalna sekvenca (Jones et al., Molecular Cloning Regulation and Complete Sequence of a Hemocyanin-Related Juvenile HormonSupressible Protein from Inscct Hemolymphs, J. Biol. Chem. 265: 8596 (1990)) je bila sestavljena iz dveh sintetičnih oligonukleotidov s pomočjo metode po Rossiju et. al. (J. Biol. Chem. 257:9226 (1982)). Dve 48meri sta bili očiščeni z ionsko izmenjalno kromatografijo. Ta dva oligonukleotida delita enajst baznih parov komplementarne sekvence na njunih 3' koncih. Ko so bile sekvence toplotno renaturirane v prisotnosti štirih deoksiribonukleidnih trifosfatov in Klenowega fragmenta DNK ploimeraze I, smo sintetizirali produkt z dvojno vijačnico. Reakcijski produkt smo čistili s hidroksilapatitno kromatografijo in dvojno vijačnico smo nato digerirali z Aat II, restrikcijskim encimom ustreznim za vstavitev te sekvence v verigo DK 9.2 cDNK klonirane v pKS-DK9c. Podklone smo pregledali za vstavitev signalne sekvence in vrednotili z ugotavljanjem DNK sekvence.
Ugotavljanje DNK sekvence je potrdilo združitev dveh cDNK sekvenc. Celoten izdelani gen smo izločili in priredili za kolniranje v Nhel mesto bBlueBac, bakulovirusni transferni vektor (Vialar, J., et al., J. Virology 64: 3-50 (1990)). Podklonom smo ugotavljali sekvenco, da smo potrdili pravilnost namestitve v konstrukt. Ugotavljanje sekvence pri DNK plazmidu WR9 je potrdila vstavitev sintetiziranega preskrbljenega pajkovega gena (preDk 9.2) v bakulovirusni transferni vektor pBlueBac (slika 3). Uporaba pBlueBac vektorja je izboljšala postopek pregledovanja, ker vnos našega rekombinantnega gena v genom bakulovirusa spremlja so-ekspresija β-galaktodidaze in jo lahko spremljamo s spremembo barve, če raste na mediju z indikatorjem.
Rekombinantne bakuloviruse, ki so označevali preDK 9.2, smo proizvajali s pomočjo okužbe celic seva Spodoptera frugiperda Sf9 (ATCC# CRL1711) z mešanico lpg AvMNPV virusne DNK and 2pg plazmidne DNK s postopkom po Summersu in Smithu (v A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Celi Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Bulletin No. 1555, 1988). Štiri dni po infekciji smo supernatant celic redčili in ga nanesli na 100 mm ploščice posejane z 5 χ 106 Sf9 celicami in jih nato prekrili z agarozo, ki je kot substrat vsebovala Bluo-gal (Gibso BRL, Gaithersburg, MD). V 5. do 6. dneh smo rekombinante opazili po njihovi bledi modri barvi. Te celice smo odvzeli s pomočjo Pasteurjeve pipete in jih redčili v 1 ml medija. Ta eluent smo uporabili za ponovno infekcijo celic Sf9, ki so bile zasejane v bučki T-25. Tri dni po inficiranju smo majhen volumen supernatanta, ki smo ga izolirali iz šestih različnih področij, uporabili za pripravo virusne DNK. PCR pomnoževanje z uporabo virusnih specifičnih začetnih oligonukleotidov iz področja, ki je obdajalo polihedrinski gen, je potrdilo, da je pet ali šest virusnih izoliranih področij vsebovalo primerno velik vstavljeni del in nima nobene onesnažitve divjega tipa. Potem smo pripravili titrirane vzorce rekombinantnega virusa in vivoin in vitro testiranja.
Primer 10:
Biološka aktivnost rekombinantnega DK 9.2
Biološka aktivnost rekombinantnega ostanka 9.2 (DK 9.2), izoliranega iz tkivne kulture, ki je vsebovala serum, je bila testirana na ličinki TBW. Odmerke smo izračunali na podlagi testne raztopine A280. Pri dozi 16pg/g je rekombinantni material izzval izrazite mišične krče po 2. urah po injieiranju. Polovica (3. od 6.) vseh ličink so bile paralizirane in močno skrčene po 48.urah, medtem, ko smo pri preostalih treh ličinkah opazili rahle do zmerne mišične spazme. Pri odmerku 8 pg/g so bile paralizirane 3 ličinke od 6, medtem, ko so pri odmerku 5.2pg/g bile paralizirane 2 ličinke od 6. Rezultati potrjujejo, da ima rekombinantna DK 9.2 biološko aktivnost.
Primer 11:
Rekombinantni bakulovirus - in v/Vopreiskušanje
A. Biološka aktivnost DK 9.2 rekombinantnega jedrnega polihidrosis virusa (vACDK9.2)
1. Titririranje virusnih preparatov
Virusne vzorce smo titrirali po metodi plaque assay (Luria et. al., General
Virology, 1978, str. 21-32; John Wiley & Sons, New York). Titre smo izrazili v obliki enot, ki tvorijo madeže (PFU - plaque forming units) na enoto volumna, medtem ko smo odmerke izrazili kot PFU/ličinko. En PFU je funkcionalno enaka enemu zrelemu virusu v preparatu, kjer je vsak virus sposoben uspešne infekcije gostiteljske celice (Luria et. al., ibid). Na primer, 103 gostiteljske celice je možno inficirati z vsakim mikrolitrom virusnega preparata v katerem je 106 PFU/ml (t.j. 103 PFU/μΙ).
2. Biološki testi
Biološko aktivnost DK 9.2 rekombinantnega jedrnega polihidrosis virusa (rNPV), vAcDK9.2 smo preiskušali v seriji poskusov, ki se odzivajo na odmerek. V teh preizkusih so bile v TBW ličinke (povprečna masa približno 250 mg) injicirani različni odmerki vAcDK9.2 v gojišču za tkivno kulturo ali s samo tkivno kulturo samo (n = 10). Kot je bilo opisano že pri poskusih z injiciranjem strupa v primeru 1, smo uporabljene ličinke shranjevali v posameznih škatlah z virom hrane in jih redno opazovali. Združene ugotovitve iz dveh takih preizkusov z injiciranjem virusa so prikazane v preglednici II. Pri odmerkih enakih in večjih od 5000 PFU/ličinko smo opazili značilne znake strupenosti DK 9.2 približno 24 ur po inficiranju, in najmanj polovica uporabljenih insektov je bila onesposobljena (t.j. popolnoma ali delno paralizirana) v 48 urah. Najnižji preizkušani odmerki, 50 PFU/ličinko, so povzročili tresenje in spazme v 48 urah in onesposobili najmanj 70% ličink v 96 do 120 urah.
B. Biološka aktivnost vAcDK9.2 v primerjavi z divjim tipom NPV
Nadaljne študije so bile izvedene z namenom določitve učinkovitosti vAcDK9.2 v primerjavi z izvirnim divjim tipom virusa, Autographa californica NPV (wtAcMNPV). Predmet tega preizkusa je bil določiti ali so bile ličinke inficirane z vAcDK9.2 onesposobljene v krajšem času kot ličinke inficirane z enakim odmerkom wt-AcMNPV.
1. Preiskus z injiciranjem
Biološko aktivnost vAcDK9.2 in wt-AcMNPV smo primerjali v seriji preizkusov z injiciranjem. V ličinke črvov vršička tobaka (Heliothis virescens), ličinke zeljne gosenice (Trichoplusia ni) in ličinke pese {Spodoptera exigua) smo injicirali 5 x 105 PFU/ličinko vACDK9.2 ali wt-AcMNPV; ličinkam v kontrolni skupini smo injicirali tkivno kulturo. Izsledki so zbrani v preglednici III, in kažejo da je vAcDJK).2 učinkovitejši od wt-AcMNPV pri vseh treh vrstah.
2. Preiskus s hranjenjem
Z namenom da preizkusimo aktivnost vAcDK9.2 po zaužitju smo morali pripraviti ta polihedrin-negativni (pol-) rekombinant v obliki, ki bo učinkovita po zaužitju. To smo izvedli z kookluzijo vAcDK9.2 z wt-AcMNPV z uporabo metode, ki jo opisujejo drugi znanstveniki za izdelavo po zaužitju učinkovitih polrekombinantov NPVs (t.j. Kuroda et. al., 1989, J. Virology 63(4): 1677-1685 in Priče et al., 1989, Proč. Natl. Acad. Sci. 86:1453-1456). Celice SF-9 smo simultano inficirali z vAcDI<9.2 in wt-AcMNPV kot večkratno ponavljanje infekcij (MOI) 10 in 2. Istočasno smo drugo skupino celic SF-9 inficirali samo z wt-AcMNPV (MOI - 2). Pet dni po inficiranju smo inkluzijska telesa pridobili z razbitjem celic in diferencialnim centrifugiranjem (npr. Wood, 1980, Virology 104:392-399). Prešteli smo inkluzijska telesa s pomočjo hemacitometra. Celice, ki so bile inficirane z vAcDK9.2 in wtAcMNPV, so proizvedle manj in manjša inkluzijska telesa kot celice inficirane samo z wt-AeMNPv. Izkoristek vključevanja polihedrala (PIB) iz mešane infekcije je bila 4.6 PIB/celico, medtem ko je bil izkoristek iz čiste wt-AcMNPV infekcije 33.3 PIB/celico.
Za dosego biološke učinkovitosti adsorbiranega vAcDK9.2 v primerjavi z wtAcMNPV smo se poslužili vključevanja diete v poskus. Mešani ali divji tip PIB smo vključili v dieto za insekte brez agarja, pri koncentraciji 105 PIB/g dietne prehrane. Dietno prehrano smo razdelili v majhne posode v katere smo nato dodali tudi mlade ličinke TWB (1/posodo, n = 20). Ličinkam v kontrolni skupini smo dodali enako količino neobdelane dietne prehrane. Ličinkam smo pustili jesti po želji in smo redno opazovali razvoj znakov. Ugotovitve so podane v preglednici II. V prvih 48-ih urah nismo opazili nobenega učinka, po 72-ih urah pa je bilo paraliziranih več kot 50% ličink, ki so se hranile z mešano PIB. Divji tip virusa ob istem času ni povzročil nobenega učinka. Po 96-ih urah je bilo več kot 90% ličink hranjenih z rekombinantom paraliziranih, medtem ko je bilo le 10% ličink hranjenih z divjim tipom mrtvih ali so umirale. Po 120-ih urah je bilo vseh 100% ličink hranjenih z rekombinantom mrtvih ali so umirale, v primerjavi z 75%, če so bile hranjene z wtAcMNPV. Torej v preizkusu s prehrano, kot tudi v preizkusu z injiciranjem, so bile ličinke po dodatku vAcDK9.2 onesposobljene značilno krajši čas kot ličinke po dodatku wt-AcMNPV.
Preglednica II
Preizkusi odvisnosti odgovora od količine odmerka pri TBW z vAcDK9.2 % paraliziranih
odmerek (PFU/ličinko) 24 ur 48 ur 72 ur 96 ur 120 ur
5.1 χ 105 0 80 100 100 100
5.1 χ 104 0 35 95 100 100
5.1 χ 103 0 25 75 90 100
5.1 χ 102 0 0 55 85 100
5.1 x IO-54 0 0 20 65 95
kontrola 0 0 0 0 0
Primer 12:
Promotor za gen, ki kodira DK 9.2
Da bi dobili na voljo kontrolni elemet za gen, ki kodira DI< 9.2, smo pripravili genomsko knjižnjieo. DNK smo pripravili iz pajkov z uporabo prirejenega postopka po Herrmannu in Frischauferju (v Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc. 1987, str. 180-183). DNK smo delno razgradili z Sau 3A in razdelili po frakcijah z centrifugiranjem v 10% do 38% saharoze z gravitacijskim gradientom 25,000 obratov na minuto 16 ur z TLS-55 rotorjem (Beckman Co., Ltd). Zbrane frakcije 35-45 kb smo pripravili za vnos v kosmidni vektor, digeriran s Xho I z uporabo delne fill-in metode. Četrtino pripravljene ligacijske mešanice smo zapakirali v fage s pomočjo Gigapak gold™ (Stratagene, LaJolla, CA) in po pretvorbi dobili ekvivalent preko 3 χ 109 bp pajkove DNK. Knjižnico smo dali v petindvajset 150 mm petrijevk in dvignili na najlonske filtre za preizkus z radioaktivno označeno DNK.
Dvignjene kolonije genomske knižnice Diguetiae smo pregledali v serijah z radioaktivno označeno cDNK, ki kodira DK 9.2 in z oligonukleotid, označenimi na koncu, ki kodirajo amino- konec, karboksilni konec in notranjo sondo. En kosmid, cDK2, se je hibridiziral z vsemi sondami. Southeren blot kosmidne DNK, ki smo jo digerirali z Eco RI, nakazuje 3.0 kb fragment, ki je hibridiziral z obema, notranjo in C-terminalno sondo. Določitev zaporedja dvojne vijačnice kosmidne cDK2z
- 44 Razprede I niea lil. Pr i tiw ja ν;ι v.Ael)K9-P in wL-AeKNPV z in j.i.ci ran jem v ličinke tobačnega vršičnega črva (TBW), zeljnega pedica (CL) in armi jakega črva repe (ΒΛ .:..)
o
L
4->
i-J □
Ds:
c >
•H
Ds:
-U
TO
N
TO >o >to r-l
Z
TO e
TO s
e
E >
e c
>o •H
S
L σ>
c
TO n
TO c
Ds:
>0 ·- c
Di
C ϋ
•O O C O
TO
C >N •J-i <3
TO — N o
>s •n ς c o o C O E I > O co
r.
Oj CO
PO za vAcPKO.P; ri - 10 za wt-AcMNPV in kontr uporabo treh začetnih nukleotidov, ki smo jih zgoraj identificirali, je potrdila izolacijo gena za DK9.2 in potrdila, da se drug (ali drugi) geni te družine lahko nahajajo na istem poleg ležečem delu DNK, kot oligonukleotid na N-koncu (ki ima enako visoko stopnjo homologije kot vsi insekticidno učinkoviti peptidi Diguetiae), začeti na multiplih mestih kosmidove DNK.
Da bi dosegli področje promotorja gena za DK 9.2, smo sintetizirali oligonukleotid, ki ustreza pre/signalni sekvenci na smiselni (sense) verigi. PCR pomnoževanje med tema začetnim oligonukleotidom in drugimi za naš gen specifičnimi začetnimi oligonukleotidi je mapiralo signalno sekvenco in pokazalo, da je za več kot 3000 bp pred eksonom na N-koncu. Začetni nukleotid na nesmiselni (antisense) verigi smo potem uporabili za ugotavljanje zaporedja genomske DNK v področju neposredno pred 5' konca eDNK, ki kodira signalni peptid.
Sekveniranje DNA pred signalno sekvenco na genomski DNA sugerira, da se drugi intron nahaja na bp -11 od inieiacijskega kodona za metionin. Sintetizirali smo začetni oligonukleotid, ki ustreza 5' regiji cDNA prekurzorja DK 9.2, in ga uporabili, da začne PCR reakcijo, da bi ugotovili kako velika interventna sekvenca se nahaja med začetnimi mesti za transkripcijo in translacijo. Produkt pomnoževanja 1000 baznih parov je potrdil prisotnost introna in omogočil oceno njoegove velikosti. Sekveniranje genomske DNA, ki se nahaja pred začetnim mestom za transkripcijo (predvidevamo, da je ekvivalentno 5' koncu cDNA), nakazuje prisotnost promotorja. DNA sekvenco promotorske regije podajamo v seznamu sekvenc ID NO:8. Ta domneven promotor obsega mnoge od bistvenih kontrolnih signalov, ki so splošno prisotni pri drugih eukariontskih promotorjih v področju, ki se nahaja neposredno pred začetnim mestom translacije. Ta promotor ali dele tega promotorja lahko uporabimo za transkripcijo/translacijo drugih eukariontskih genov v bakterijah, virusih, rastlinah ali živalih.
Primer 13:
Nevrofiziološke študije povezane z mehanizmom delovanja DK 9.2
Nevrofiziološke študije smo izvedli, da bi ugotovili mehanizem delovanja DK 9.2. Posnetki nevromuskulamega stika pri ličinki in perifernega živčevja kažejo, da DK 9.2 izziva ponavljajoče izbruhe praznjenja v živčnih končičih, ki so občutljivi na blokado s tetrodotoksinom. Torej so mesto delovanja tega strupa verjetno na napetost občutljivi natrijevi kanalčki na živčnih membranah. Dodatne študije so pokazale, da DK 9.2 konstantno vzburja periferno živčevje pri koncenteraciji 10 nM.
Dodatno, je najmanj 50-krat bolj učinkovit kot sesalski strup 4, ki ga proizvaja škorpjon Leiurus quinquestriatus.
Poskusne živali uporabljene v tej študiji so bile ličinke hišne muhe, Musca domestica, v tretji fazi. Ličinke smo imobilizirali z iglami za insekte, jih odprli dorsalno s sredinskim rezom. Telo smo ravno razprostrli, in odstranili drobovje, da smo izpostavili telesno steno z muskulaturo. Periferno živčevje je bilo najmočnejše, ko je izhajalo iz možganov, ki smo jih odstranili. Preparat smo prelili z slanico za mrčes, sestavljeno iz (mM): NaCl (140), KC1 (5), CaCl2 (0.75), MgCl2 (4), NaHCO3 (5) in HEPES (5) pH = 7.2.
Stimulacijsko sukcijsko elektrodo smo namestili na primeren živčni pletež, da smo zaznali nevromuskularni prenos. Stimulacijski prag smo počasi dvigovali, dokler nismo opazili kontrakcije mišičnega tkiva 6 ali 7. Nato smo tako vlakno prebodli z snemalno intracelularno mikroelektrodo, ki je bila povezana v intracelularni predojačcvalee, ki jo uporabljamo za opazovanje ekscitatornega postsinaptičnega potenciala (EPSP), kot odgovor na živčno stimulacijo.
Za snemanje acsendentne električne aktivnosti v perifernem živčnem vlaknu, smo elektrodo namestili na AC predojačevalec. Signal smo 100-krat ojačali in izhod filtrirali na 0.3 in 1 kHz. Vse signale smo pretvorili s pomočjo računalniško vodenega sistema MacLab za prikaz in analizo.
Začetni poskusi o delovanju DK 9.2 so nakazali na preparat, ki deluje na nevromuskularni stik. Posamezni signal, ki smo ga poslali na periferni živec, se je spremenil v samostojen EPSP v telesni muskulaturi. V prisotnosti DK 9.2 je posamezen dražljaj postal visokofrekvenčno praznjenje EPSP. Kot dodatek praznjenju, ki so ga izzvali dražljaji, se je pojavil tudi spontan izbruh praznjenja, ki je trajal več minut. Trajanje izbruha je bil običajno daljše od 1 sekunde, frekvenca EPSP med izbruhom je bila > 30 Hz. Ob nastopu izbruha praznjenja je nastopila močna kontrakcija v steni telesne muskulature, ki je povzročila težko ločevanje intracelulamega posnetka, ker je elektroda izpadla iz mišice med izbruhom kontrakcij. Večina poskusov je bila izvedena v slani raztopini, ki je vsebovala visoko koncentracijo saharoze (300 mM), ki je zavirala kontrakcijo, ki pa ni vplivala na električni aktivnost. Podobne rezultate smo opazili pri uporabi normalne ali visoko koncentrirane saharozne slane raztopine.
Izbruhi praznjenja, ki smo jih opazili po dodajanju DK 9.2, so bili podobni tistim, ki smo jih opazili ob aplikaciji škorpijonovih α toksinov, proteinov, ki so poznani da vplivajo na napetostno občutljive natrijeve kanalčke živčnih membran. Torej lahko izbruhe praznjenja zaustavimo s specifičnim blokatorjem natrijevih kanalckov s tetrodoksinom (ΤΤΧ). Sposobnost TTx, da prepreči ali nasprotuje praznjenjem, ki jih povzroči DK 9.2, je prikazano na sliki 5. Na sliki 5A, je bil EPSP hitro blokiran z 1 μΜ, ki vrne neobčutljivost preparata za nadaljnje zdravljenje z 100 nM DK 9.2. Podoben poskus je predstavljen na sliki 5B, kjer je praznjenje izzval DK
9.2 in je bilo povrnjeno po aplikaciji ΤΤΧ. V tem poskusu je začetek praznjenja povzročil izpad elektrode iz mišice, kar je povzročilo nataknitev, ko smo poskusili ponovno snemanje. Ko smo našli primerno mesto za snemanje, smo izbruh opazovali približno 2 minuti, in preparat je kazal prenehanje aktivnosti v nekaj sekundah po dodatku ΤΤΧ.
Da bi premagali problem povezan s snemanjem v notranjosti mišice, ki se krči, smo zgoraj opisani poskus ponovili tako, da smo za ekstracelularno snemanje uporabili periferno živčevje ličinke. Ti posnetki predstavljajo ascendentno aktivnost senzornega živca, skupaj s spontano antidromično aktivacijo motoričnega vlakna. Pri 70 nM je DK 9.2 povzročil dvig pri praznjenju živca, ki je neprizadet pri dodajanju slane raztopine, vendar ga 0,4 pg ΤΤΧ hitro blokira. Dodajanje ΤΤΧ pred DK 9.2 preprači pojav izbruha.
Dodatne študije smo izvedli, da smo določili občutljivost živcev mrčesa na DK
9.2 in primerjali njegovo učinkovitost z učinkovitostjo standardnega škorpijonovega strupa. DK 9.2 smo preiskusiii na perifernem živčevju preparata začenši pri 1 nM in povečevali koncentracijo vsakih pet minut, dokler nismo opazili povečanje aktivnosti. Pri tem preparatu je bil neaktiven 1 nM in 5 nM DK 9.2 pri 10 nM smo opazili aktivnost preparata po kratki zamudi. Rezultati petih preparatov živčevja, ki smo jih uporabili za določitev mejne koncentracije DK 9.2 na živčevje mrčesa, so zbrani v preglednici IV.
Preglednica IV
koncentracija odgovor število obravnavanj število odgovorov %
1 nM 2 0 0
2 nM 1 0 0
5 nM 3 1 33
10 nM 3 3 100
Z zadnjo skupino poskusov smo določili, na podoben način, občutljivost živčevja mrčesi na toksin 4 škorpijona Leurus quinquestriatus (LqTX 4). Preparat (n=4) smo izpostavili LqTX 4 v koncentraciji do 500 nM brez učinka. Ugotovitve se skladajo s predhodnimi študijami, kjer smo ugotovili da je LqTX 4 specifičen za natrijeve kanalčke sesalcev. Nadalnjo izzivanje teh preparatov z DK 9.2 je zahtevalo 10 - 30 nM, da bi dobili odgovor. Rahel dvig učinkovite mejne koncentracije Dk 9.2 je verjetno zaradi šibke blokadne aktivnosti z inaktivnim LqTX 4. Ti poskusi kažejo, daje DK 9.2 najmanj 50- krat učinkovitejši kot LqTX 4 na živčevju mrčesi.
Preglednica V
IDENTIFIKACIJSKA ŠTEVILKA ZAPOREDJA (SEKVENCE) OPIS
1 zaporedje aminokislin DK 9.2
2 zaporedje cDNK, ki kodira DK 9.2
3 zaporedje aminokislin DK 11
4 zaporedje cDNK, ki kpdira DK 11
5 zaporedje aminokislin DK 12
6 celotno zaporeje cDNK, ki kodira DK 9.2
7 zaporedje aminokislin za signal/vodilno sekvenco prekurzorja DK 9.2
8 DNK sekvenca za promotor DK 9.2
LISTA SEKVENC (1) Splošne informacije (i) prijavitelja: Karen J. Krafcho; Bradford Carr VanWagenen; J. R. Hunter Jackson (ii) naslov izuma: Insekticidno učinkoviti peptidi (iii) število sekvenc: 8 (iv) naslov:
(A) naslov: Woocock, Washburn, Kurtz, Mackiewitz & Norris (B) ulica: One Liberty Plače - 46th Floor (C) mesto: Philadelphia (D) zvezna država: Pennsylvania (E) država: ZDA (F) poštna številka (ΖΙΡ): 19103 (v) računalniška oblika:
(A) srednji tip: disketa 3.5 palčna, 1.44 Mb (B) osebni računalnik: IBM PS/2 (C) operacijski sistem: PC-DOS (D) prigramska oprema: WORDPERFECT 5.0 (vi) podatki o sedanju prijavi:
(A) številka prijave:
(B) datum prijave:
(C) razvrstitev (vii) podatki o predhodni prijavi:
(A) številka prijave: 662,373 (B) datum prijave: 1. marec 1991 (viii) informacija o odvetniku/agentu:
(A) ime: John W. Caldwell, Esq.
(B) številka registracije: 28,937 (C) številka reference/dosjeja: FMC-0054 (ix) podatki o telekomunikaciji:
(A) telefon: (215) 568-3100 (B) telefaks: (215) 568-3439 (2) Informacije za SEQ ID NO: 1:
(i) značilnost sekvence:
(A) dolžina: 56 amino kislin (B) tip: amino kisline (B) topologija: neznana (ii) opis sekvence: SEQ ID NO. 1:
Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr 5 10 15
Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gin Tyr Leu 20 25 30
Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly 35 40 45
Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val 50 55 (3) Informacije za SEQ ID NO: 1:
(i) značilnost sekvence:
(A) dolžina: 275 baznih parov (B) tip: nukleinska kislina (C) vrsta verige: dvojna (D) topologija: nepoznana (xi) opis sekvence: SEQ ID NO. 2:
GCC AAG GAC GGC GAC GTC GAG GGG CCT GCG Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala 1 5 10
GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp
20
AGT GGA GAG TGC TGC MMS AAG CAG TAC CTG Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gin Tyr Leu
30
TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg
40
TGC GTA AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG
Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys 45 50
TGC GTT TGC AGA GAC GTG TAGATTTGAA ATGAAATTCG Cys Val Cys Arg Asp Val
TGTTCTTTTT TGGTTGTAGA TGACCTAATG AAACAACTGA
CATGAATAAA ACAAAATTGA ATGAATTGAA AAAAAAAAAA
AAAAAGC (2) Informacije za SEQ ID NO: 3:
(i) značilnost sekvence:
(A) dolžina: 58 amino kislin (B) tip: amino kisline (D) topologija: neznana (ii) opis sekvence: SEQ ID NO. 3:
Ala Ays Asp Gly Asp Val Lys Gly Pro Ala Gly Cys Met Lys Tyr 5 10 15
Lys Ser Gly Asp Cys Arg Gly Lys Thr Cys Cys Asp Gin Gin Tyr 20 25 30
Leu Trp Tyr Lys Tip Arg Asn Leu Ala Cys Arg Cys Phe Thr Val 35 40 45
Glu Val Phe Lys Lys Asp Cys Trp Cys Asn Asp Ile Ser 50 55 (2) Informacije za SEQ ID NO: 4:
(i) značilnost sekvence:
(A) dolžina: 204 baznih parov (B) tip: nukleinska kislina (C) vrsta verige: dvojna (D) topologija: neznana (ii) opis sekvence: SEQ ID NO. 4:
GCC AAG GAT GGC GAT GTC AAG GGA CCT GCT GGC TGC ATG AAG TAC AAG
Ala Lys Asp Gly Asp Val Lys Gly Pro Ala Gly CysMet Lys Tyr Lys 1 5 10 15
AGC GGA GAG TGC' AGA GGC AAA ACT TGC TGC GAG CAA CAG TAC CTC TGG
Ser Gly Asp Cys Arg Gly Lys Thr Cys Cys Asp Gin Gin Tyr Leu Tip 20 25 30
TAC AAG TGG CGG AAT CTT GCA TGC AGG TGC TTC ACG GTC GAA GTG TTC
Tyr Lys Trp Arg Asn Leu Ala Cys Arg Cys Phe Thr Val Glu Val Phe 35 40 45
AAG AAG GAC TGC TGG TGC AAC GAC ATC AGT TAATTCCACA TGAAGAAGTA
Lys Lys Asp Cys Tip Cys Asn Asp Ue Ser 50 55
AGCATCTCCT (2) Informacije za SEQ ID NO: 5:
(i) značilnost sekvence:
(A) dolžina: 62 amino kislin (B) tip: amino kislina (D) topologija: neznana (xi) opis sekvence: SEQ ID NO. 5:
Ala Lys Asp Gly Asp Phe Glu Gly Pro Pro Gly Xaa Leu Lys Met 1 5 10 15
Gly Glu Leu Xaa Lys Gly Gly Thr Xaa Xaa Thr Lys Val Tyr Lys 20 25 30
Tyr Tip Lys Trp Arg Lys Leu Glu Cys Leu Gly Lys Asn Asp Gly 35 40 * 45
Trp Phe Lys Lys Lys Phe Ile Cys Asp Glu Arg Xaa Asn Pro Xaa 50 55 60
Xaa Xaa (2) Informacije za SEQ ID NO: 6:
(i) značilnost sekvence:
(A) dolžina: 359 baznih parov (B) tip: nukleinska kislina (C) vrsta vezi: dvojna (D) topologija: neznana (xi) opis sekvence: SEQ ID NO. 6:
ATATTACAAG CCGCTCCAGT AGCCGAAGAA GCCTAAGCCA AGAACCCAGG TCCGCCACA
ATG AAG GTT TTT GTT GTA CTG TTG TGC TTG TCT CTG GCA GCA GTT TAC
Met Lys Val Phe Val Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala Val Tyr -35 -30 -25
GCC Ti'G GAG GAA AGA CTA GAC AAA GAC GCC GAC ATC ATG CTT GATTCA
Ala Leu Giu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp Ile Met Leu Asp Ser -20 -15 -10
CCA GCC GAC ATG GAA AGA GCG AAG GAC GGT GAC GTG GAA GGG CCT GCG
Pro Ala Asp Met Glu Arg Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala -5 1 5 10
GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC AGT GGA GAG TGC TGC MMS
Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa 15 20 25
AAG CAG TAC CTG TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA TGC CTA
Lys Gin Tyr Leu Trp TyrLys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu 30 35 40
AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG TGC GTT TGC AGA GAC GTG Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val
50 55
TAGATTTGAA TTCCAAC (2) Informacije za SEQ ID NO: 7:
(i) značilnost sekvence:
(A) dolžina: 38 amino kislin (B) tip: amino kisline (B) topologija: neznana (ii) opis sekvence: SEQ ID NO. 7:
Met Lys Val Phe Val Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala -35 -30 -25
Val Tyr Ala Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp Ile -20 -15
Met Leu Asp Ser Pro Ala Asp Met Glu Arg -10 -5 -1 (2) Informacije za SEQ ID NO: 8:
(i) značilnost sekvence:
(A) dolžina: 412 baznih parov (B) tip: nukleinske kisline (C) vrsta verige: dvojna (D) topologija: neznana (ii) opis sekvence: SEQ ID NO. 8:
TTTAGCAGCC CAAGGCTACA CTGAACTACA CAATGCCCCA
TGCCCACGCT CAAACCACAT TTTTTGGTAA AGACAGTTGT
TGCATTCTAA AAGCAGTTT TCTGCTGCTG GTCGAGGCAG
AGTATGTTTC CTACAGAATT GTACGACGCA GTAAGCATGA
CGCTCAGTTT TTTTTGAATC CG ACACTTAT TGAAATGTTT
GAGCTGCCGC
ACACTCTTTC
120
TACTGCAGCT
180
CCACCGCCGC
240
GGAATATGTA
300
ACAGGTAAAC
CCCAACTTTT
GCTCAGACTG
ATTGTTCGTG
ATATCTGCAG
CTCCTTCGAC AAGCAATCGC TTTATCGGAA TACCTGCATG ACATAACTGA CAAAACACAT 360
GTGGCTCTCCAG AAACAACGAA AACATTCATT CCTGTATATA AGTATCGGAG GAGTGCTGTA 420 T 421
Za
FMC CORPORATION:
PATENTNA PISARNA
LJUBLJANA
PATENTNI ZAHTEVKI

Claims (69)

1. Bistveno očiščen, insekticidno učinkovit peptid, označen s tem, da ga lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia, ali njegova poljedelsko ali vrtnarsko sprejemljiva sol.
2. Peptid po zahtevku 1, označen s tem, da je strup iz pajka Diguelia canities.
3. Insekticidno učinkoviti peptid po zahtevku 1, označen s tem, da je njegova molekulska masa približno 6371-6379 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti, ter njegove poljedelsko ali vrtnarsko učinkovite soli.
4. Insekticidno učinkoviti peptid po zahtevku 1, označen s tem, da ima bistveno enako aminokislinsko zaporedje, kot je definirano v SEQ ID NO:1.
5. Insekticidno učinkoviti peptid po zahtevku 1, označen s tem, da je njegova molekulska masa približno 6740 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti, ter njegove poljedelsko ali vrtnarsko učinkovite soli.
6. Insekticidno učinkoviti peptid po zahtevku 1, označen s tem, da ima bistveno enako aminokislinsko zaporedje, kot je definirano v SEQ ID NO:3.
7. Insekticidno učinkoviti peptid po zahtevku 1, označen s tem, da je njegova molekulska masa približno 7080 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti, ter njegove poljedelsko ali vrtnarsko učinkovite soli.
8. Insekticidno učinkoviti peptid po zahtevku 1, označen s tem, da ima bistveno enako aminokislinsko zaporedje, kot je definirano v SEQ ID NO:5.
9. Bistveno izolirana DNA sekvenca, označena s tem, da zapis kodira za insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguctia.
10. DNA po zahtevku 3, označena s tem, da je pajkov strup iz Diguetia canities.
11. Bistveno izolirana DNA sekvenca po zahtevku 9, označena s tem, da ima DNA sekvenco, kot je definirana v SEQ ID NO:2.
12. Bistveno izolirana DNA sekvenca po zahtevku 9, označena s tem, da ima DNA sekvenco, kot je definirana v SEQ ID NO:4.
13. Bistveno izolirana DNA sekvenca po zahtevku 9, označena s tem, da ima DNA sekvenco, kot je definirana v SEQ ID NO:6.
14. Rekombinanten ekspresijski vektor, značilen po tem, da ima DNA sekvenco, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia, označen s tem, da vektor lahko izvrši ekspresijo omenjene kodirajoče sekvence v transformiranih celicah.
15. Rekombinanten ekspresijski vektor po zahtevku 14, označen s tem, da je pajkov strup iz Diguetia canities.
16. Rekombinantni ekspresijski vektor po zahtevku 14, označen s tem, da omenjena DNA sekvenca kodira insekticidno učinkoviti peptid, karakteriziran z molekulsko maso približno 6371-6379 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti.
17. Rekombinantni ekspresijski vektor po zahtevku 14, označen s tem, da omenjena DNA sekvenca bistveno kodira peptid, definiran v SEQ ID NO:1.
18. Rekombinantni ekspresijski vektor po zahtevku 14, označen s tem, da omenjena DNA sekvenca kodira insekticidno učinkoviti peptid, karakteriziran z molekulsko maso približno 6740 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti.
19. Rekombinantni ekspresijski vektor po zahtevku 14, označen s lem, da omenjena DNA sekvenca bistveno kodira peptid, definiran v SEQ ID NO:3.
20. Rekombinantni ekspresijski vektor po zahtevku 14, označen s tem, da omenjena DNA sekvenca kodira insekticidno učinkoviti peptid, karakteriziran z molekulsko maso približno 7080 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti.
21. Rekombinantni ekspresijski vektor po zahtevku 14, označen s tem, da omenjena DNA sekvenca bistveno kodira peptid, definiran v SEQ ID NO:5.
22. Rekombinantni ekspresijski vektor po zahtevku 14, označen s tem, da je omenjena DNA sekvenca bistveno taka, kot je definirana v SEQ ID NO:2.
23. Rekombinantni ekspresijški vektor po zahtevku 14, označen s tem, da je omenjena DNA sekvenca bistveno taka, kot je definirana v SEQ ID
NO:4.
24. Rekombinanten ekspresijski vektor po zahtevku 14, označen s tem, da je omenjena DNA sekvenca bistveno taka, kot je definirana v SEQ ID NO:6.
25. Rekombinantni ekspresijski vektor po zahtevku 14, označen s tem, da so omenjene transformirane celice iz rastlin, ki so občutljive na napad insektov.
26. Transgenska rastlina, ožnčena s tem, da vsebuje DNA sekvenco, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguctia, vstavljeno v klično linijo omenjene rastline ali prednika omenjene rastline, tako da naslednje generacije omenjene rastline dedujejo karakter ekspresije omenjene DNA sekvence skozi seksualno propagacijo ali aseksualno propagacijo.
27. Rekombinanten bakulovirusni ekspresijski vektor, označen s teni, da je zmožen ekspresije DNA sekvence, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia, v gostitelju ali v gostiteljski celici insekta,
28. Rekombinanten bakulovirusni ekspresijski vektor po zahtevku 27, označen s tem, da je omenjeni ekspresijski vektor genom bakulovirusa, značilen po omenjeni DNA sekvenci, vstavljeni v polihedrinski gen in pod transkripcijsko kontrolo bakulovirusnega polihedrinskega promotorja.
29. Rekombinantna gostiteljska celica, transformirana aii transfektirana z DNA sekvenco, označena z DNA sekvenco, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguctia, na način, ki gostiteljski celici dopušča, da eksprimira omenjeni peptid.
30. Rekombinantne gostiteljske celice po zahtevku 29, označene s tem, da je omenjeni pajkov strup iz Diguctia canities.
31. Rekombinantne gostiteljske celice po zahtevku 29, označene s tem, da omenjena DNA sekvenca kodira insekticidno učinkoviti peptid, karakteriziran z molekulsko maso približno 6371-6379 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti.
32. Rekombinantne gostiteljske celice po zahtevku 29, označene s tem, da omenjena DNA sekvenca bistveno kodira peptid, definiran v SEQ ID NO.T.
33. Rekombinantne gostiteljske celice po zahtevku 29, označene s tem, da omenjena DNA sekvenca kodira insekticidno učinkoviti peptid, karakteriziran z molekulsko maso približno 6740 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti.
34. Rekombinantne gostiteljske celice po zahtevku 29, označene s tem, da omenjena DNA sekvenca bistveno kodira peptid, definiran v SEQ ID NO:3.
35. Rekombinantne gostiteljske celice po zahtevku 29, označene s tem, da omenjena DNA sekvenca kodira insekticidno učinkoviti peptid, karakteriziran z molekulsko maso približno 7080 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti.
36. Rekombinantne gostiteljske celice po zahtevku 29, označene s tem, da omenjena DNA sekvenca bistveno kodira peptid, definiran v SEQ ID NO:5.
37. Rekombinantne gostiteljske celice po zahtevku 29, označene s tem, da je omenjena DNA sekvenca bistveno taka, kot je definirana v SEQ ID NO:2.
38. Rekombinantne gostiteljske celice po zahtevku 29, označene s tem, da je omenjena DNA sekvenca bistveno definirana v SEQ ID NO:4.
39. Rekombinantne gostiteljske celice po zahtevku 29, označene s tem, da je omenjena DNA sekvenca bistveno definirana v SEQ ID NO:6.
40. Metoda za proizvodnjo insekticidno učinkovitega peptida, označena s tem, da obsega:
(a) vzdrževanje v kulturi rekombinantnih gostiteljskih celic, karakterističnih po tem, da ima rekombinantni ekspresijski vektor, transformiran ali transfektiran v omenjenih gostiteljskih celicah, DNA sekvenco, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia, karakteriziran s tem, da vektor lahko izvrši ekspresijo omenjene kodirajoče sekvence v transformiranih celicah, ter (b) regeneriranje omenjenega insekticidno učinkovitega peptida iz kulture rekombinantnih gostiteljskih celic.
41. Rekombinantno proizveden peptid, označen s tem, da ga proizvajamo s postopkom po zahtevku 40.
42. Metoda po zahtevku 40, označena s tem, da omenjena DNA sekvenca kodira insekticidno učinkoviti peptid, karakteriziran z molekulsko maso približno 6371-6379 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti.
43. Metoda po zahtevku 40, označena s tem, da omenjena DNA sekvenca bistveno kodira peptid, definiran v SEQ ID NO:1.
44. Metoda po zahtevku 40, označena s tem, da omenjena DNA sekvenca kodira insekticidno učinkoviti peptid, karakteriziran z molekulsko maso približno 6740 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti.
45. Metoda po zahtevku 40, označena s tem, da omenjena DNA sekvenca bistveno kodira peptid, definiran v SEQ ID NO:3.
46. Metoda po zahtevku 40, označena s tem, da omenjena DNA sekvenca kodira insekticidno učinkoviti peptid, karakteriziran z molekulsko maso približno 7080 daltonov, kot je določeno z masno spektrometrijo in premikanjem v obliki enojnega vrha na obratno fazni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti.
47. Metoda po zahtevku 40, označena s tem, da omenjena DNA sekvenca bistveno kodira peptid, definiran v SEQ ID NO:5.
48.. Metoda po zahtevku 40, označena s tem, da je omenjena DNA sekvenca bistveno definirana v SEQ ID NO:2.
49. Metoda po zahtevku 40, označena s tem, da je omenjena DNA sekvenca bistveno definirana v SEQ ID NO:4.
50. Metoda po zahtevku 40, označena s tem, da je omenjena DNA sekvenca bistveno definirana v SEQ ID NO:6.
51. Metoda kontrole brezvretenčarskih škodljivcev, označena s tem, da omenjene škodljivce pripeljemo v stik z učinkovito količino peptida, ki ga lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia, ali njegovo poljedelsko alo vrtnarsko sprejemljivo soljo.
52. Metoda po zahtevku 51, označena s tem, da je pajkov strup iz Diguetia canities.
53. Metoda po zahtevku 51, označena s tem, da so škodljivci insekti.
54. Metoda po zahtevku 51, označena s tem, da so škodljivci
Lepidoptera.
55. Metoda za kontrolo brezvretenčarskih škodljivcev, označena s tem, da omenjene škodljivce pripeljemo v stik z rekombinantnim bakulovirosom, zmožnim ekspresije učinkovite količine peptida, ki ga lahko izoliramo iz strupa pajka Diguctia.
56. Insekticidni sestavek, označen s tem, da vsebuje insekticidno učinkovito količino peptida po zahtevku 55 in njegovo poljedelsko ali vrtnarsko sprejemljivo sol v poljedelsko ali vrtnarsko sprejemljivem nosilcu.
57. Protitelo, označeno s tem, da je bistveno imunoreaktivno s peptidom, ki ga lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia.
58. Protitelo iz zahtevka 57, označeno s tem, da je pajkov strup iz Diguctia canitics.
59. Metoda uporabe protiteles po zahtevku 57 za detekcijo prisotnosti inekticidno učinkovitega peptida, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguctia, označena s tem, da obsega:
(a) pridobijanje pajkovega strupa;
(b) stik pajkovega strupa z omenjenimi protitelesi, vezanimi na označbo, ki jo lahko ugotovimo; in (e) detekcijo označenih protiteles, vezanih na omenjeni peptid.
60. Metoda po zahtevku 59, označena s tem, da je pajkov strup iz Diguctia canitics.
61. DNA sonda, označena s tem, da je izpeljana iz DNA sekvence, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia.
62. Metoda za detekcijo prisotnosti nukleinske kisline, ki kodira insekticidno učinkovit peptid, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia, označena s tem, da obsega:
(a) pridobijanje nukleinske kisline iz pajka;
(b) stik omenjene nukleinske kisline z DNA sondo po zahtevku 61; in (c) detekcijo omenjene sonde, vezane za omenjeno nukleinsko ksilino.
63. Metoda uporabe protiteles po zahtevku 57, za čiščenje insekticidno učinkovitega peptida, ki ga lahko bistveno izoliramo iz strupa pajka Diguetia, označena s tem, da obsega:
(a) vezavo protitelesa na trdno podlogo;
(b) stik raztopine, ki vsebuje omenjeni peptid z omenjenim protitelesom, vezanim za omenjeno trdno podlogo, pri čemer se omenjeni peptid, ki je prisoten v raztopini, veže na omenjeno protitelo;
(c) odstranitev omenjenega peptida, ki je pritrjen na omenjeno protitelo, vezano na omenjeno trdno podlogo; in (d) zbiranje omenjenega odstranjenega peptida.
64. Prepro sekvenca, označena s tem, da vsebuje aminokislinsko zaporedje, ki kaže bistveno sekvenčno homologijo z aminokislinskim zaporedjem, definiranim v SEQ ID NO:7, ali njenim delom, značilna po tem, da omenjena prepro sekvenca, ali njen del, usmerja izločanje in/ali zvitje zrelega peptida.
65. Genski sestavek, označen s tem, da ima zapis za aminokislinsko zaporedje, ki kaže bistveno sekvenčno homologijo z aminokislinskim zaporedjem, definiranim v SEQ ID NO:7, ali njenim delom, funkcionalno povezanim na peptid.
66. Promotorska sekvenca, označena s tem, da ima sekvenco, ki kaže bistveno sekvenčno homologijo z aminokislinskim zaporedjem, definiranim v SEO ID NO:8, ali njenim delom, značilna po tem, da omenjena promotorska sekvenca, vodi ekspresijo gena v rekombinantnem sestavku.
67. Rekombinantni sestavek, označen s tem, da ima sekvenco, ki kaže bistveno sekvenčno homologijo z aminokislinskim zaporedjem, definiranim v SEO ID NO:8, ali njenim delom, funkcionalno vezan na gen, ki se mora cksprimirati.
68. Insekticidno učinkoviti peptid, označen s tem, da omenjeni peptid :
(a) vsebuje približno 55 do približno 65 aminokislin po dolžini;
(b) kaže več kot 40% sekvenčno homologijo s SEQ ID NOS:l,3in5;
(c) ima približno 7 ali 8 cisteinskih ostankov.
69. Peptid po zahtevku 68, označen s tem, da je vir peptida strup pajka Diguetia.
FMC CORPORATI n v*
II
LJUBLJANA
Povzetek
INSEKTICIDNO UČINKOVITI PEPTIDI
Izum omogoča insekticidno učinkovite peptide, kijih lahko izoliramo iz strupa pajka Diguetia, metode za pripravo in uporabo insekticidov in DNA, ki kodira take insekticidno učinkovite peptide.
SLIKA 2 patema PISALA
LJUBLJANA synDK 9.2
BamH 18038 HindlU8138 KpnI8468 HindlU 9068 Sair 10088
SI9210212A 1991-03-01 1992-02-28 Insekticidno učinkoviti peptid SI9210212A (sl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US66237391A 1991-03-01 1991-03-01
YU21292A YU21292A (sh) 1991-03-01 1992-02-28 Insekticidno efektivni peptidi

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI9210212A true SI9210212A (sl) 1995-06-30

Family

ID=27098509

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9210212A SI9210212A (sl) 1991-03-01 1992-02-28 Insekticidno učinkoviti peptid

Country Status (1)

Country Link
SI (1) SI9210212A (sl)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6096304A (en) Recombinant baculovirus insecticides
AU692290B2 (en) Insect viruses, sequences, insecticidal compositions and methods of use
AU673974B2 (en) Insecticidally effective peptides
HU215253B (hu) Eljárás rovarspecifikus bénító neurotoxin gének előállítására biológiai rovarvédelem céljára
KR0145513B1 (ko) 살충 효과를 갖는 펩타이드
US5658781A (en) Insecticidally effective peptides
WO2001059146A1 (en) Insecticidal compounds and methods for selection thereof
EP0812129A1 (en) Insecticidal peptides from spider venom
US5756459A (en) Insecticidally effective peptides isolatable from phidippus spider venom
SI9210212A (sl) Insekticidno učinkoviti peptid
EP1018875A1 (en) Insecticidal peptides from segestria sp. spider venom
WO1998017107A1 (en) Insecticidally effective peptides isolatable from phidippus spider venom