JPH06503229A - 殺虫に有効なペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 殺虫に有効なペプチド・ 本発明は殺虫に有効なペプチドに関する。更に詳しくは本発明はとりわけて、デ ィグエチア（も毒液から単離しうる殺菌に有効なペプチド、このように殺虫に有 効なペプチドをコード化したＤＮＡ、該ペプチドの製造法、および無背椎害虫を 制御する方法に関する。

近年、大衆は合成殺虫剤の使用に伴う環境上の危険および哺乳動物の毒性に急激 に気が付いてきた。その結果として、これらの殺虫剤の使用は迅速に低下した。

然し、有効な昆虫制御の必要性は変化しなかった。これが研究者を昆虫制御の新 規な方法の開発にかりたてた。

最も広く使用されている抗菌性ペプチドはバクテリウム　バシラススリンジエン スイス（以後Ｂ、ｔ、と呼ぶ）から誘導される。この抗菌剤は種々の食葉毛虫、 ジャパニーズ　ビートルおよび蚊を制御するのに使用される。ナカムラらの米国 特許第４，７９７，２７９号（１９８９年１月ｌＯ日発行）にはＢ、ｔ、　クル スタキイ　デルタ−エンドトキシンをコードした遺伝子およびＢ、ｔ、テネブリ オニス　デルタ−エンドトキシンをコードした遺伝子を含むハイブリッド　バク テリア細胞およびそれらの製造か記載されている。Ｂ。

ｔ、ハイブリッドはＢ、ｔ、クルスタキイ菌株に敏感な害虫に対して、ならびに Ｂ、ｔ、テネブリオニス菌株に敏感な害虫に対して活性である。一般にこれらの ハイブリッドは有用な殺虫性をもち、その殺虫性は殺虫活性の水準の点で、また は活性のスペクトルの点で、あるいは両者の点で、親菌株の物理的混合物によっ て観察されるものよりもすぐれている。このような微生物を含む殺虫組成物は、 殺虫有効量のハイブリッドを昆虫にまたはその環境に加えることによって昆虫と 斗うために使用することができる。

バクテリウム　Ｂ、ｔ、からの別の誘導はジルロイおよびウィルコックスの欧州 特許出願公報Ｎｏ、０３２５４００ＡＩに記載された。この発明は鱗しよう類の 昆虫に対して毒性であるハイブリッド毒性遺伝子に関する。更に詳しくはこの発 明はＢ、ｔ、ｖａｒ、クルスタキイＨＤ−７３毒性遺伝子の一部およびＢ、ｔ、 ｖａｒ、クルスタキイ菌株ＨＤ　＝　１からの毒性遺伝子の一部を含むハイブリ ッド　デルタ−エンドトキシン遺伝子に関する。鱗しよう類昆虫に対シテ活性ヲ モツタンパクをコードしたハイブリッド毒性遺伝子が開示された。

バクテリウムＢ、ｔ、はまたウィルコックスらの欧州特許出願公報Ｎｏ、０３４ ０９°４８においてその殺虫性について利用されている。この発明はハイブリッ ド毒物に関し、この毒物はＢ、ｔ、遺伝子の昆虫腸線細胞認識領域をジフテリア トキシンＢ鎖に融合して鱗しよう類昆虫に対して活性なハイブリッドＢ、ｔ、毒 物を作ることによって製造される。ハイブリッドＢ、ｔ、遺伝子は植物に挿入す るか又はバキュロウィルスにクローンして回収可能なトキシンを作りつるという ことが示唆されている。あるいはまた、ハイブリッドＢ、ｔ、遺伝子を含む宿主 は目標とする昆虫の環境への直接の適用によって殺虫剤として使用することもで きる。

殺虫性化合物の研究において、サソリ毒液殺虫性を与える化合物の可能な資源と して確認された。さそりレイウルスクインクエストリアタス　クインクエストリ アタスの毒液から単離された２つの殺虫選択性トキシンがＺｌｏｔｋｉｎらの” Ａｎ　Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ　ａｎｄ　ａＤｅｐｒｅｓｓａｎｔ　Ｉｎ５ｅｃｔ 　Ｔｏｘｉｎ　ｆｒｏｍ　５ｃｏｒｐｉｏｎ　Ｖｅｎｏｍ　ｂｏｔｈ　Ａｆｆｅ ｃｔ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｐｏ５ｓｅｓｓ　ａ　 Ｃｏｍｍｏｎ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ”　Ａ　ｒ　ｃ　ｈＢｉｏｃｈｅｍ　 ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２４０：８７７−８７（１９８５）に現れた。

その化学的および薬理学的性質に関する研究において、一方の毒素かハエの幼虫 の早い刺戟収縮麻痺を誘発し他方の毒素かおそい低下軟弱麻痺を誘発することか わかった。

両者はいずれもナトリウム・コンダクタンスに影響を与えた。

Ｚｌｏｔｋｉｎらのカナダ国特許第２，００５，６５８号（１９９０年６月１９ 日発行）にはスコーピオン（さそり）レエイウルスクインクエストリアタス　ヘ ブラエウスブチナエ、ブチダニから誘導された殺虫に有効なタンパクが記載され ている。この発明では、毒液は凍結乾燥され、いくつかの留分に分離される。幼 虫に対して最高の毒性をもち、マウスに対して最低の毒性をもつ留分を更なる精 製にかけ、そして最終生成物が“Ｌｇｈ　Ｐ３５″と呼ばれるものである。

ＧｒｉｓｋｉｎのＴｏｘｉｃ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　Ｂｕｔｈｕｓ 　ｅｕｐｅｕｓ　ａｎｄＬｕｃｏｓａ　ｓｉｎｇｏｒｉｅｎｓｉｓ　ｖｅｎｏｍ ｓ、　”　Ｓｈｅｍｙａｋｉｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｏｒｇａｎ ｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＵＳＳＲＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ 、Ｍｏｓｃｏｗ　１１７９８８　。

ＧＳＰ−１，ＵＳＳＲにはスコーピオン（さそり）バサス　エユピーウスのベノ ムから単離された昆虫に対して毒性の４つのトキシンが記載されている。また、 タランチュラ　ルウコサ　スインゴリエンスイスの毒液の毒性成分の単離と特性 も記載されている。粗毒性は昆虫に対して無毒である。

殺虫性をもつ種々の組成物に関する研究と開発に対応して、研究者は殺虫性遺伝 子を製造しこれらを目標の宿主に導入する方法の開発に従事した。スミスおよび サンマーズらの米国特許第４，８７９゜２３６号（１９８９年１１月７日発行） は、バキュロウィルス　プロモーターと組合せたえらばれた遺伝子をバキュロウ ィルス遺伝子に導入して、昆虫細胞中のえらばれた遺伝子を発現しうる組換えバ キュロウィルス発現ベクターを作る方法に関する。この方法はポリヘトリン・プ ロモーターを含むポリヘトリン遺伝子またはそのタンパクを含むＤＮＡ断片を作 るためのバキュロウィルスＤＮＡの開裂を包含する。組換え転写ベクターを作る ために、ＤＮＡ断片をクローニング・ビヒルクに挿入し、次いでえらばれた遺伝 子をこの変性クローニング・ヒヒクルに挿入してそれがポリヘトリン・プロモー ターの制御のもとにあるようにする。組換え転写ベクターを次いで野生型のバキ ュロウィルスＤＮＡと接触させてバキュロウィルス遺伝子へのえらばれた遺伝子 の均一な組換えと結合を行う。バキュロウィルス　アウトグラノア　カルホルニ ア（ＡｃＭＮＰＶ）およびその関連ポリヘトリン・プロモーターは真核宿主細胞 中のえらばれた遺伝子の非常に高水準の発現をなしつるウィルス発現ベクターを 作るのに有用であることが見出された。

この発明者は、特定の昆虫に対して又は昆虫のスペクトルに対して毒性のあるタ ンパクを生ずる遺伝子をえらび、この遺伝子をＡｃＭＮＰＶ発現ベクターにクロ ーニングすることによって、上記の発現ベクターか昆虫の制御系に使用しうろこ とを示唆している。彼等はこのベクターが保護すべき植物または動物に適用しう ることを示唆している。組換えウィルスは昆虫により摂取された後の腸壁の細胞 に浸入することができる。別の示唆は遺伝子をバキュロウィルスのゲノムに挿入 して、それらをポリへドロンコーティングが昆虫腸管のアルカリ条件によって解 離して毒性生成物が放出されるように、ポリヘトリン構造配列に融合させること である。

殺虫性遺伝子を作ってこれを保護すべき目標に導入する更なる方法は、カットラ −のＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　：　Ｂｅｉｎｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　 ｔｏ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　Ｃｒｏｐｓ　：　５ｕｃｃｅｓｓ　ｗｉｔｈ　Ｍｏ ｄｅｌ　Ｃｒｏｐ　Ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ、　’　ＡＣＢｉｏｔｅｃｈ、Ｎｅｗｓ 　ｖｏｌ、７　（５）：３＆１７　（１９９０）に記載されている。この文献は 、ＤＮＡが発芽花粉中に直接に電気移植しうること、および花粉は花に戻って種 を作り、次いでこれか形質転換植物に成長しうろことを、教示している。この方 法はタバコに都合か良く、またトウモロコシ、ウマゴヤソにも都合か良い。この 方法は原形質の電気移植よりも容易でありうる。究極の目的は花を受粉させ、植 物の再生よりもむしろ“花を利用する“ことだからである。この方法は花粉を収 集し、これを３０〜６０分間発芽培地中で発芽させ、その後に花粉管を花粉顆粒 からスタートさせ、花粉を含む液体懸濁物に所望のＤＮＡを加え、花粉管中の開 放孔に電気ショックを与え、過剰のＤＮＡを除去し、そして変化した花粉を植物 の気孔に入れて種が生成するまで待つことから成る。この方法は遺伝子を穀物植 物に移動させる容易な方法でありうる。

追加の配送系はバーンズおよびエドワーズの米国特許第４，８６１．５９５号（ １９８９年８月２９日発行）に記載されている。この発明は動物およびヒトへの タンパク化合物の配送系として、処理した、実質的に手つかずの微生物細胞を使 用することに関する。この微生物細胞は始めに均一遺伝子を介して細胞内にタン パクを生ずる。このタンパク生成性微生物を、細胞は実質的に手つかずのままに 化学的または物理的手段によって処理する。この処理法の操作は細胞内化合物の 活性の目立った損失なしに非薬処理微生物細胞を生ずる。細胞はレプリカではな く、従って安定な細胞壁をもつので、この細胞壁は次いで動物またはヒトの消化 系の所望区域中で破壊することができ、従ってこの発明によってカプセルされた 生成物のタイミングされた又は目標とされた放出を可能にする。適当な処理の後 に、タンパク生成性微生物細胞それ自体は生成化合物の精製を必要とせずに配送 系として使用される。微生物手段によって生産されつる、殺虫剤を含めてすべて のタンパク、ポリペプチド、アミノ酸または化合物はこの発明の出発材料であり うる。

サソリ毒液中に見出される神経毒をコードした合成遺伝子をＤＮＡ技術を使用し てくみ入れることの可能性はカルボネルらの”５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ａ　 ｇｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ａｎ　１ｎｓｅｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　５ ｃｏｒｐｉｏｎｎｅｕｒｏｔＯＸｉｎ　ａｎｄ　ａｔｔｅｍｐｔｓ　ｔｏ　ｅＸ ｐｒｅＳＳ　ｉｔ　ｕｓｉｎｇ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ＶｅＣｔｏｒｓ、” Ｇｅｎｅ　７３：４０９−１８　（１９８８）において探究されている。この文 献はさそりの毒液中に見出される神経毒バサス・エウビウスをコードした合成遺 伝子をＤＮＡ技術を使用してバキュロウィルス・ゲノムに組み入れてバキュロウ ィルス・殺虫剤を改良する可能性を教示している。ポリへドロン・プロモーター 基材ＡｃＭＮＰＶ発現系を使用して毒性生産を行う３つの発現方法か研究された 。３６コドン遺伝子単独の発現は毒物の少量生産を与えた。

若干の成功は毒物への信号ペプチドの取付けにより見出された。かなりな水準の タンパクは、毒物遺伝子がポリへドロン遺伝子のＮ−末端に融合したときに生産 された。然しなから、生産はポリへドロンそれ自身について観察されたものより も１０〜２０倍小さかった。

発現の限定は転写の水準にあるとは信じられなかったが、転写およびタンパクの 安定性を含めて後転写水準にあると信ぜられた。前生成物の麻痺活性は検出され なかった。

欧州特許出願公報Ｎｏ、０４３１８２９にはトランスジェニック植物が記載され ており、これは植物組織を摂取する選択的昆虫に毒性を生せしめるに十分な量で 昆虫食肉者の昆虫特異性毒物をそれらの細胞に有効に発現する。記述された特定 の毒物がスコービオン（さそり）アンドロフトナス　オーストラリスのベノムか ら単離された。

研究者はまたクモの毒液から抽出した毒物を単離することもできた。ゲレンの“ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ　ａｎｄ　Ｎｅｃｒｏｔｏｘｉｎｓ　ｏｆ　５ｐｉｄｅ ｒ　Ｖｅｎｏｍｓ、”Ｊ、Ｔｏｘｉｃｏｌ、　−Ｔｏｘｉｎ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　 ５　（２）：１６１−１７０　（１９８６）は神経毒および壊死前を回顧して、 クモの毒液（スパイダーベノム）分子は特定の殺虫剤のモデルを提供しうること を示唆している。

ジャクソンおよびバークスの米国特許第４．９２５．６６４号（１９９０年５月 １５日発行）にはクモ（スパイダー）から誘導される毒物アジニレノブスイス　 アベルタ　アンド　ホロノナクルタを適用することによる心臓および神経学的疾 患の治療法が記載されている。この毒物はまた、昆虫および関連害虫に対して使 用しつる特定のカルシウムチャンネルもしくは興奮アミノ酸受容体遮断剤として も有効である。

欧州特許出願公報第０３９５３５７号にはスパイダー（くも）アジニレノブシス 　アペルタの毒液から単離されたポリアミン類およびポリペプチド類が記載され ている。このポリアミンは興奮アミノ酸神経伝達剤に拮抗する。ポリペプチド類 、およびポリアミン類の１つ、は種々の有機体の生きた細胞のカルシウムチャン ネルを遮断する。無背椎害虫の制御に該カルシウムチャンネル遮断剤の使用が示 唆される。

欧州特許出願第０３７４９４０号にはスパイダー（くも）ホロシナ　クルタの毒 液から単離した毒物が記載されている。ポリペプチドは殺虫剤として宵月であり 、そして医薬においてたとえばカルシウムチャンネルおよびグルタメート拮抗剤 として宵月である。

ポウアーらのＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ａｎ　１ｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ　ｎｅｕ ｒｏｔｏｘｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｖｅｎｏｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｐｉｄｅｒ Ｈｏｌｏｌｅｎａｃｕｒｔａ、　”　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、８４：３５０６−３５１０　（１９８７）には、スパイダー（くも）ホロ シナ　クルタの毒液から単離したタンパク質神経毒およびそのドロソフイラ幼虫 における神経筋肉伝達の阻止が記載されている。著者はこの毒物がドロソフイラ 　モーター　ニューロンにおけるプレシナブチイック・カルシウムチャンネルを 阻止することを示唆している。

キスタドらの“Ｐａｒａｌｙｔｉｃ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔｉｃｉｄａｌ　Ｔｏ ｘｉｎｓ　ｆｒｏｍｔｈｅ　Ｆｕｎｎｅｌ　Ｗｅｂ　５ｐｉｄｅｒ　、　Ｈｏ１ ｏｌｅｎａ　Ｃｕｒｔａ、”　Ｔｏ　ｘ　ｉ　ｏ　ｎ　２９　（３）：３２９− ３３６　（１９９１）には、ホロシナ・カルクの毒液から精製した１種のペプチ ドおよび１０種のカルタトキンンおよび鱗しよう類幼虫に注入したときの効果が 記載されている。

スタブレトンらの”Ｃｕｒｔａｔｏｘｉｎｓ　：　Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ　１ｎ ｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｏｒｍ 　ｔｈｅ　ｆｕｎｎｅｌ−ｗｅｂ　５ｐｉｄｅｒ　Ｈｏ１ｏｌｅｎａ　ｃｕｒｔ ａ、”Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５　（４）；２０５４−２０５９（１９９ ０）には、スパイダー（くも）ホロシナ　カルクの毒液から単離した３種のポリ ペプチド神経毒およびクリケラト・アチェタ・トメステイカに及ぼす効果が記載 されている。

クイッケおよびユシャーウッドの“Ｅｘｔｅｎｄｅｄ　Ｓｕｍｍａｒｉｅｓ　Ｐ ｅ５ｔｉｃｉｄｅｓ　Ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ　 ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｐａｎｅｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｎｏｖｅ ｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｉｎ　Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ、　”　Ｐ　ｅ　ｓ　ｔ　ｉ　ｃ　。

Ｓｃｉ、２０：３１５−３１７　（１９８７）には、寄生スズメバチの毒液に存 在する及び若干のクモの毒液に存在する毒物は昆虫に注射したときに迅速な麻痺 を生せしめることが記載されている。著者はこのクモの毒物が、イナゴの筋肉の グルタメート受容体によってゲートを開く開放チャンネルと相互作用する受容体 ゲートのカチオン選択性膜チャンネルの遮断剤であることを示唆している。この 刊行物はアルジオーブおよびアラネウスのクモの毒液中の低分子量の毒物ならび に文部クモ（ネフィラ・クラバタ）の毒液腺から単離した毒物に言及している。

単離されたクモの毒液からの毒物の性質に関する別の研究は、クモ（ファンネル −ウェブ　スパイダー）の毒液から単離した低分子量因子のカルシウムチャンネ ルへの可逆的結合の能力を明らかにした。チェルスキイらのＷＯ３９１０７６０ ８（１９８９年８月２４日発行）には、これらの活性な低分子量因子が十分な特 異性および親和性をもってカルシウム・チャンネルに可逆的に結合してニューロ ン中のカルシウム・コンダクタンスをなくし、カルシウム・チャンネル構造体の 単離と精製を可能にすることが記載されている。これらの毒液はヒトに対して毒 性であることが見出された。

クモの毒物の他の応用はジャクソンおよびバークスの“５ｐｉｄｅｒＴｏｘｉｎ ｓ　：　Ｒｅｃｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ、　”　Ａｎ　ｎ　Ｒｅｖ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　１２：４０５−１４　（ １９８９）に論じられている。この文献は種々の毒物には毒性の非常な不均一性 か存在することを教示している。それは実験がカルシウム・チャンネルの種特異 性を示唆したこと及びクモ毒液がカルシウム・チャンネル拮抗剤を提供しうるこ とを認めている。論じられたクモ毒液は背椎動物に悪影響を与えることが見出さ れる。この文献はまたクモ毒液を農業用途の昆虫特異性毒物の可能な資源と確認 している。

アダムスらの“ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｃｔｉ ｖｉｔｙ　ｏｆ　５ｙｎａｐｔｉｃ　Ｔｏｘｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｖｅｎ ｏｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｕｎｎｅｌ　Ｗｅｂ　５ｐｉｄｅｒ、　Ａｇｅｌｅｎｏ ｐｓｉｓＡｐｅｒｔａ、＝ｉｎ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ　Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１９８６．Ｂｏｒｋｏｖｅｃ　ａｎ ｄ　Ｇｅｌｍａｎ編集、ヒューマナ・プレス、米国ニュージャー州　１９８６年 には、昆虫のシナプス伝達に拮抗する多重ペプチド毒物がクモＡｇｅｌｅｎｏｐ ｓｉｓ　ａｐｅｒｔａがら単離されたことが記載されている。

ヨシ才力らの米国特許第４，８５５，４０５号（１９８９年８月９日発行）には 文部グモ毒液腺からえられた受容体阻止剤およびその製造法が記載されている。

この化合物は、昆虫が液体または固体に担持された該化合物に接触するとき、殺 虫効果をもつ。

ナカジマらの米国特許第４，９１８，１０７号（１９９０年４月１７日発行）に はグルタメート受容体抑止剤活性をもつ化合物、該化合物の製造法、および該化 合物を含む殺虫剤組成物が記載されている。該化合物は分散剤を加えた液体また は固体キャリヤー中に担持され、保護すべき植物または動物に直接に適用される 。低い調剤量は殺虫剤として効果的であり、哺乳動物および魚に対して非常に低 い毒性しかもたず、そして環境に対して小さい悪影響しかもたない。

バイオ殺虫剤としてのバキュロウィルスの使用も探究された。バイオ殺虫剤とし ての野生型のバキュロウィルスの主な欠点はそれらが遅効性であることである。

野生型のバキュロウィルスを摂取する幼虫は一般に５〜７日間以内に死ぬ。感染 幼虫はこの時間のかなりな部分のあいだ食物を摂出しつづけ、実質的な穀物の損 害が起こりつる。

毒性、環境の危害、および抵抗による効力の損失を含めた合成殺虫剤に伴う問題 の組合せにより、バキュロウィルス感染自体よりも迅速に宿主を不能になしつる タンパク毒物を発現する遺伝子工学組換えバキュロウィルスの開発を含む無背椎 動物制御の新規手段の開発の必要性がひきつづいて存在する。本発明によれば、 ディグエチアくも毒液から実質的に精製され単離しつる新規な殺虫に有効なペプ チドおよびその農業的または園芸的に許容しつる塩が提供される。

本発明の殺虫に有効なペプチドは無背椎動物とくに昆虫に対して高度の選択性を もつと信ぜられる。その上、本発明の殺虫に有効なペプチドは農業的に重要な害 虫に対して高度に有効な殺虫剤であることが実証され、従って無背椎害虫制御の 分野に重要な貢献を示すと信ぜられる。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しつる殺虫に有効 なペプチドをコードした新規な実質的に単離されたＤＮＡ配列が提供される。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しつる殺虫に有効 なペプチドをコードしたＤＮＡ配列を含む新規な組換え表現ベクターが提供され る。このベクターは該コード化配列の発現を形質転換細胞中に行うことができる 。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫に有効 なペプチドをコートしたＤＮＡ配列で、宿主細胞か該ペプチドを発現するように 、形質転換させた新規な組換え宿主細胞か提供される。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫に有効 なペプチドをコードしたＤＮＡ配列を、宿主に又は宿主昆虫細胞に発現しつる、 新規な組換えバキュロウィルス発現ベクターか提供される。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しつる殺虫に有効 なペプチドを製造する新規な方法、およびその方法によって生産されるペプチド 、が提供される。この方法は宿主細胞中で形質転換した組換え発現ベクターかデ ィグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコードした ＤＮＡ配列をもち、このベクターが形質転換細胞中で該コード配列の発現を行い うる組換え宿主細胞を培養する工程、およびこの組換え宿主細胞の培養物から殺 虫に有効なペプチドを回収する工程：を含む。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しつる殺虫に有効 なペプチドをコードしたＤＮＡ配列を含み、これを植物または植物の先祖の生殖 細胞系列に導入して、ＤＮＡ配列の発現の特徴が有性伝播または無性伝播により 植物の次の世代に引きつがれる、新規な世代交替植物か提供される。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫に有効 なペプチドおよび農業的に又は園芸的に許容しつる塩の有効量に害虫を接触させ ることから成る無背椎害虫を制御する新規な方法か提供される。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的（゛こ単離しうる殺虫に 有効なペプチドおよびその農業的または園芸的に許容しつる塩の有効量を発現し うる組換えバキュロウィルスを害虫と接触させることから成る無背椎害虫の新規 な制御法が提供される。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しつる殺虫に有効 なペプチドおよびその農業的にまたは園芸的に許容しつる塩を農業的または園芸 的に許容しつるキャリヤーに含む新規な殺虫剤組成物か提供される。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫に有効 なペプチドおよび農業的または園芸的に許容しつるその塩と実質的に急疫反応性 の新規な抗体か提供される。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫に有効 なペプチドの存在を検出するために本発明の抗体を使用する新規な方法であって 次の諸工程すなわちくも毒液を得る工程；くも毒液を検出可能な標識に結合した 抗体と接触させる工程：および該ペプチドに結合した標識のついた抗体を検出す る工程：を含む新規な方法が提供される。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に抽出しうる殺虫有効性 ペプチドを精製するために本発明の抗体を使用する新規な方法であって次の諸工 程すなわち抗体を固体支持体に結合させる工程：該ペプチドを含む溶液を固体支 持体に結合した抗体と接触させて溶液中に存在するペプチドを抗体に付着させる 工程：固体支持体に結合した抗体に付着したペプチドを除去する工程：および精 製ペプチドを収集する工程を含む新規な方法が提供される。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しつる殺虫に有効 なペプチドをコードしたＤＮＡ配列から誘導される新規なりＮＡプローブが提供 される。

更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫に有効 なペプチドをコードした核酸の存在を検知する新規な方法であって次の諸工程す なわちくもの核酸を得る工程；この核酸を本発明のＤＮＡプローブと接触させる 工程：および核酸に結合したプローブを検出する工程；を含む新規な方法が提供 される。

図１は全ディグエチア・カニテイーズ毒物のＲＰ　ＨＰＬＣを示し、マウスで試 験した３群の成分を示す０．１％ＴＦＡ・アセトニトリルの勾配を使用するＲＰ 　ＨＰＬＣである。留分２はＴＢＷ活性成分を表す。

図２はラットのハイポキャンパルのスライス中の５ｃｈａ　ｆ　ｆ　ｅｒコレテ ラールＣＡ−１ピラミダル細胞シナプスにおけるシナプス伝達（励起集団スパイ ク）のｌμＭにおいて試験したＤＫ９−２を示す。描かれたデータは（ａ）ＤＫ ９．２添加前５分間の及び（ｂ）　ＤＫ９．２添加後１５〜２０分間の時間平均 集団スパイクの記録を表す。これらの記録は同じであり、このことはこの濃度に おいて、ＤＫ９，２はこの分析で検出されつるラットＣＮＳの活性をもたないこ とを示すものである。

図３はｐｒｅＤＫ９．２をコードした遺伝子をはこぶバキュロウィルス転換ベク ターｐＷＲ９の地図である。

図４はネオネート・タバコ毛虫（１０００，０ＯＯＦＩＢ／ｇｍ食飼）の連続ウ ィルス供給分析（ｆｅｅｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ）である。

図５はＤＫ９．２＝誘起バースチング（ｂｕｒｓｔｉｎｇ）を阻止または反転さ せるＴＴＸの能力を示す。

Ａ、定義 ここに使用する「ディグエチアくも毒液から実質的に単離しつる殺虫に有効なペ プチド」とは殺虫に有効なペプチドならびに該ペプチドが従来技術において知ら れる技術のいずれかによってディグエチアから実質的に単離しえたものである限 りすべての技術からのペプチドの殺虫に有効な断片、を包含する。このような資 源としてたとえば組換えで生産された殺虫に有効なペプチドがあげられる。

ここに使用する「発現ベクター」はそこに含まれたＤＮＡ配列を発現しつる、そ してこのような配列がその発現を行いうる他の配列に操作可能に結合されるベク ターを包含する。必ずしもはっきりと述べていないけれども、これらの発現ベク ターは宿主有機体中でエビソームとして又は染色体ＤＮＡの一体的な一部として 再生可能でなければならないということがそれとなく述べられている。明らかに 複製能力の欠如はそれらを効果的に操作不能にする。要約して、「発現ベクター 」は機能的な定義で与えられ、ここで取り扱われる特定化されたＤＮＡコードの 発現を行いつるすべてのＤＮＡ配列はそれが特定化された配列に利用されるとい う点でこの用語に含まれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において利用される発現 ベクターは多くの場合「プラスミド」の形体にあり、これは環状２重らせんＤＮ Ａと呼ばれ、このものはそれらのベクターの形体において染色体に結合してはい ない。「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用される。プラスミドはベク ターの最もふつうに使用される形体だからである。然しなから、本発明は等価な 機能を果し、その後の技術において知られるようになったそのような他の形体の 発現ベクターを含むことが意図される。

１組換え宿主細胞」とは組換えＤＮＡ技術を使用して構成されたベクターで形質 転換を受けた細胞のことをいう。

クモ科ディグエチダエは現在同一の属ディグエチアから成る。ディグエチア種は 一般に南米（カルホルニアを含む）およびメキシコで見出される。これらの小さ いクモはサボテンを含む多くの種類の植物および潅木に大きい不規則な巣を張る 。種々のディグエチア種は、はとんどのクモと同様に、一般に肉食動物であり、 遭遇する多くの種類のギセイ昆虫を容易に捕食する。

本発明は理論的理由に限定されることを意味しないけれども、本発明の殺虫に有 効なペプチドを昆虫に注射する際にみられる異常な症候はアルカロイドＮａ＋チ ャンネル活性化剤ベラトリジンまたは科ブチダニおよび属ブサスからのサソリ毒 物、Ｎａ＋チャンネル活性剤として知られる、を昆虫に注射するときにみられる 症候に非常に類似している。この殺虫に有効なペプチドは、多分Ｎａ“またはに ′″チヤンネル影響する、筋肉および／または神経膜の部分的な脱分極を生ぜし めうると信ぜられる。更に詳しくは、この殺虫に有効なペプチドはテトロドトキ シンによるブロックに敏感な神経の反復的なバースト放電を誘起すると信ぜられ る。従って、これらのペプチドの作用の場となるのは神経膜上の電圧に敏感なナ トリウム・チャンネルである。

Ｂ、ディグエチア毒液からのペプチドの単離クモ毒液はセファロトラックスから のクモの毒液線抽出のような知られた方法によってディグエチアから除くことが できる。然しなから、クモ毒液および単離された毒物の内部の不純物を避けるた めに、クモ毒液はクモを電気的に刺戟して毒液を放出させ、次いで放出毒液を吸 引によって集めることによって得るのか好ましい。吐出またはヘモリンパ球によ る毒液の汚染の阻止は米国特許第４，９２５．６６４号に記載されている。

クモ毒液を電気ミルキング技術によってえたならば、それは高性能液体クロマト グラフ（“ＨＰＬＣ”　）またはゲル濾過クロマトグラフまたは他の宵月な分離 技術を使用してそのペプチド（毒物）成分に分別することができる。また、それ はＨＰＬＣによって行われるクモ毒液の最終分別にとって望ましいことが多い。

従って、クモの電気的ミルキングの技術をゲル濾過クロマトグラフおよび／また は高性能液体クロマトおよび他の関連技術たとえば疎水性相互作用クロマトグラ フと組合せて使用して、実質的に精製されたクモ毒液を得ることができる。然し なから、他の等価な技術を本発明の範囲内で使用してクモ毒液を単離することが できるということが理解されるであろう。このように単離された毒物は当業者に 周知の方法によってアミノ酸配列および殺虫活性を検査することができる。

Ｃ９殺虫に有効なペプチド 本発明はその一面において、ジクエチアくも毒液から実質的に精製および単離し つる殺虫に有効なペプチドおよび殺虫に有効なその断片、ならびに農業的に又は 園芸的に許容しつるそれらの塩を提供する。

殺虫に有効なペプチド含存留分が単離および精製されたならば、アミノ酸配列の 決定は当業者に周知の方法たとえばＮ−末端アミノ酸シーケンシングおよび自動 アミノ酸シークエンサーの使用により行うことができる。

この開示から、追加の殺虫に有効なタンパクが本発明の範囲内にあると予期され ることが理解されるであろう。すなわち、他の殺虫有効ペプチドがここに詳細に 述べる３種の他にディグエチアから単離可能であると信ぜられる。ジグエチアか ら単離される殺虫に有効なペプチドのこのファミリーのメンバーは次の特性を分 かち合っていると思われる。

ｌ）寸法：すべで約６２００〜約７２００ダルトンの範囲および長さで約５５〜 約６５アミノ酸の範囲： ２）保存アミノ末端：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯＳ：１，３および５は最初の５個のア ミノ酸について同じである；３）ＳＥＱ　ＩＳ　ＮＯ３：１，３および５は４０ ％より大きい配列相同性をもつ； ４）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３：　１．３および５は約７または８のシスティン残基 をもつ； ５）遺伝子のクラスタリング：これらの毒物の１つ以上はゲノムＤＮＡの共−局 在化部分であるようにみえ、このことは多分これらの遺伝子がすべて単一祖先の 遺伝子からひきつがれたものでありうることを示すものである。

更に詳しくは、３つの殺虫可動ペプチドか単離され特徴づけられた。第１に、Ｄ Ｋ９．２が単離され、そのアミノ酸配列は、単離ｃＤＮＡからホンヤクして、Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に定義されるようにみえる。マス・スペクトルデータは位 置２６に保存置換を含む２つのイソ酵素を示唆している。一方のイソ酵素は位置 ２６にスレオニンを含み、他方は位置２６にグルタミンを含む。グルタミン・イ ソ酵素はスレオニン・イソ酵素より大きい約２７の原子量単位である。以後Ｄ９ ．２はいずれかの及び／又は他方のイソ酵素のことをいうものと解釈すべきであ る。ＤＫ９．２はマス・スペクトルによって決定して約６３７１〜６３９７ダル トンの分子量および反転相ＨＰＬＣ上の単一ピークとしての運動によって特徴づ けられる。

第２に、ＤＫＩＩが単離され、マス・スペクトルによって決定して約６７００ダ ルトンまたは約６７４０ダルトンの分子量および反転相ＨＰＬＣ上の単一ピーク としての運動によって特徴づけられる。

更に詳しくは、この活性ＨＰＬＣ留分はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３に示すように、 単離ｃＤＮＡからホンヤクしてアミノ酸配列をもつものと確認された。最後に今 日まで、この殺虫有効タンパク・ファミリーの第３メンバーＤＫ１２はマス・ス ペクトルによって決定して約７１００ダルトンまたは約７０８０ダルトンの分子 量、および反転相ＨＰＬＣの単一ピークとしての運動によって特徴づけられた。

更に詳しくはこの活性留分はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５に示すようにアミノ酸配列 をもつことが仮に示された。単離された３つのペプチドはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯＳ ：１．３および５に相当し、実質的に同じ殺虫活性を示す。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ３：１，３またハ５（７）４０％配列相同性より大きい約５５〜６５個のアミノ 酸および約７また８個のシスティン残基をもつ他のペプチドも実質的に同し殺虫 活性を示すことが予期される。このようなペプチドは天然に存在するが、または 当業者に知られている組換えＤＮＡ技術の方法によって製造することかできる。

このようなペプチドは天然産のものであれ、組換え技術によって生産されたもの であれ、本発明の範囲内であることか意図される。

Ｄ１本発明の殺虫有効ペプチドのコード配列の確認本発明の別の面によれば、デ ィグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫可動ペプチドをコードに入れた 実質的に単離されたＤＮＡ配列か提供される。

上記のようにしてえた部分アミノ酸配列のデータを使用して、クモから単離しつ るタンパクの生産を行いつる遺伝子が単離および確認しうる。ペプチドの生産を 行いつる遺伝子を得るために多数の方法を利用することかできる。例としてフク ア・ニスらの“Ａ　ｓｉｍｐｌｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｌｏｗ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉ ｐｔ、”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、ｖｏｌ、９　Ｎｏ、２　（１９９０年８月 ）；７０−７ン、Ｍ、　Ａ、の”Ｒａｃｅ　：　Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃ ａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ’、ＰＣＲｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、イニシスら編 集、米国力ルホルニア州すンジエゴのアカデミツク・プレス（２９９０年）刊行 ；および米国特許第４，７０３，００８号“ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｅｎ ｃｏｄｉｎｇ　Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｊｅｔｊｎ　”があげられる。上記の米国特 許を引用によってここにくみ入れる。

簡単にいうと、決定されたアミノ酸配列をコードした、または決定されたアミノ 酸配列をコードしたＤＮＡ分子の補形ＤＮＡストランドを表す、ＤＮＡ分子が合 成される。この合成りＮＡ分子は次いで組換えＤＮＡ分子を含む細胞クローンの ＤＮＡ配列の相同性のプローブに使用することができる。組換えＤＮＡ分子は、 部分的に、クモのような有機体のゲノムＤＮＡから誘導された、またはクモのよ うな有機体の細胞または組織から単離されたｍＲＮＡのｃ　ＤＮＡコピーから誘 導されたＤＮＡ配列を部分的に含む。一般に、１５個以上のヌクレオチドのＤＮ Ａ分子か相同ＤＮＡの独特の確認のために必要である。この数は配列中の少なく とも５個のアミノ酸の独特な決定を必要とする。決定されたアミノ酸配列をコー ドすることのできる異なったＤＮＡ分子の数は非常に大きくありうるということ が理解されるであろう。それぞれのアミノ酸は６個までの独特なトリヌクレオチ ドＤＮＡ配列またはコドンをコードすることができるからである。それ故、すべ ての可能な合成りＮＡプローブを個々に試験し、若干のこのようなりＮＡ分子の プールを共存させてプローブとして使用するのが実用的である。「変性」プロー ブと呼ばれるこのようなプールの生産は当業技術において周知である。プローブ 混合物中の唯一個のＤＮＡ分子は関心のある遺伝子の正確な配列相同性をもつけ れども、プール中の合成りＮＡ分子の若干は該遺伝子を独特に確認することがで きるということも理解されるであろう。

高度の相同性のみが必要とされるからである。それ故、関心のある遺伝子の成功 裡の単離は可能なりＮＡプローブ配列のすへてを含んではいない合成プローブの プールを用いて達成されつる。一般に、有機体によって多くは利用されていない コドンはプローブのプール中に示される必要はない。事実、単一配列のＤＮＡプ ローブはそれぞれのアミノ酸について有機体によって最もしばしば利用されるＤ ＮＡコドンのみを含有させることによって製造される。然しこの試みは必ずしも 常に成功するものではないことが理解されるであろう。

遺伝子配列を確認するための１つの技術はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用 している。たとえば米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０ ２号を参照。これらの特許を引用によってここに組み入れる。本質的に、ＰＣＲ は配列の２つの末端部分か知られているときに、えらばれたＤＮＡ配列の生産を 可能にする。関心のある配列のそれぞれの末端に相当するプライマーまたはオリ ゴヌクレオチド・プローブかえられる。ＰＣＲを使用して、ＤＮＡ配列の中心部 分か次いて合成により生産される。

独特のクモ毒液遺伝子をコードした遺伝子を得るために、このようなＰＣＲを使 用する１つの方法において、ＲＮＡはクモから単離され、精製される。次いでデ オキシチミンレート末端オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してクモＲ ＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。上記の変性プローブにおけるように、合成りＮＡ 分子または合成りＮＡ分子の混合物は前記のように毒液タンパクのアミノ末端ア ミノ酸配列をコードしつるものとして製造される。このＤＮＡ混合物をデオキシ チミンレート末端オリゴヌクレオチドと共に使用してＰＣＲ反応を始動させる。

ＰＣＲ反応を始動させるのに使用する合成りＮＡ混合物は所望のｍＲＮＡ配列に 対して特異的であるので、所望のｃＤＮＡのみか有効に増幅される。えられる生 成物は知られたクローニング・ベクターのいずれかに結合しうる増幅ｃＤＮＡを 表す。これに逆らうことなしに、ペプチドの“ファミリー”が類似のアミノ酸配 列をもつクモ毒液中に存在しうること、およびこのような場合、混合オリゴヌク レオチドプライマー配列の使用はこれらの関連ペプチドをコードした１つ以上の 関係ｃＤＮＡの増幅をもたらすこと、が理解されるであろう。関連ペプチドをコ ードした遺伝子も本発明の範囲内にある。関連ペプチドも有用な殺虫活性をもつ からである。

最後に、生産されたｃＤＮＡ配列は通常の技術を使用して適当なベクター中にク ローンされ、分析されそしてヌクレオチド塩基配列か決定されつる、殺虫に有効 なタンパクをコードに入れたＤＮＡはたとえばＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２および４ に示される。これらのＰＣＲ生成物の直接アミノ酸ホンヤクは、それらか成熟タ ンパクの完全なコーディング配列に対応することを示すであろう。

ＣＤ　Ｎ　Ａをコードンた成熟ＤＫ９．２の他に、このＤＫ９，２工ンコーデイ ング配列のｃＤＮＡ配列の上流がクローンされシーケンシングされた（ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：）。この完全ｍＲＮＡのホンヤクはＤＫ９．２か信号ペプチド、プ ロペプチドおよび成熟毒物を含む前駆体タンパクとして合成されることを示した 。信号ペプチドは合成ポリペプチドを排泄させる目標として重要であると考えら れる。信号配列は新しく合成されたタンパクの適正な局在化を確保する上で重要 な役割を演じる。一般にそれらは“トポジェニック信号′　（プローベル、ジー のＰｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

Ｕ、Ｓ、Ａ、７７．１４９６−１５００　（１９８０））を提供し、これは細胞 の内部の又は外部の種々の届は先に付属のタンパク配列を目標にしている。これ は、その目標の場が細胞外である分泌タンパクにとって特に重要である。組換え タンパク生産にとってそれが全細胞抽出物から細胞を分解し精製するよりも細胞 外媒質から発現タンパクを精製する方か容易であることも有望である。ＤＫ９． ２の前駆体タンパクのｃＤＮＡコーディングによってコードした信号ペプチドは 次の配列の１７個のアミノ酸から成るものと信ぜられる。

Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ− Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｌａ信号ペプチ ドの他に、ＤＫ９．２工ンコーデイング配列の上流に配置されたｍ＝ＲＮＡのホ ンヤクはプロペプチドを表した。プロペプチドの機能は知られていない。プロペ プチドは次の配列の２１個のアミノ酸ペプチドである。

−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｐ−Ｌｙｓ−Ａｓ　ｐ −Ａ　１ａ−Ａｓ　ｐ−１１ｅ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａ ｌａ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−これらの前駆ペプチドもしくはプレプ ロ配列は生体内および／または試験管内で発現されるときＤＫ９．２または他の 組換えタンパクの安定性、発現およびホルディングに対して非常に貢献しつる。

これらの配列またはその部分は、他の分子の発現に、たとえば遺伝子の構成に存 用であることを実証しうるということも予見される。

本発明の一部として、我々はまた他の信号および／またはプロペプチド配列が組 換え体ＤＫ９．２の発現に使用しうることを確認するデータを供給することもで きる。

Ｅ９組換え体の発現 更に本発明によればディグエチアくも毒液から実質的に単離しつる殺虫に有効な ペプチドをコードしたＤＮＡを含む組換えをベクターが提供される。このベクタ ーは形質転換細胞中でコーディング配列の発現を行うことができる。また本発明 によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しつる殺虫に有効なペプチド をコードしたＤＮＡ配列で宿主細胞を、それが該ペプチドを発現させるように、 形質転換させた組換え宿主細胞が提供される。

所望のタンパクをコードした好適なりＮＡ配列の提供は、当業技術で今や知られ ている組換え技術を使用してタンパクの生産を行うことを可能にする。コーディ ング配列は、タンパクの天然資源からｃＤＮＡまたはゲノム配列を回収すること によって得ることができ、あるいは遺伝子のヌクレオチド配列から決定される正 確なアミノ酸配列を使用して合成的に製造することもできる。コーディングＤＮ Ａが合成的に製造されるとき、関心のある宿主について知られているコドンを優 先して取り入れることができるという利点がある。

必要なコントロール配列、たとえばプロモーター、および好ましくは増強剤およ び末端コントロールを含む発現系は容易に入手することができ、そして多種類の 宿主について当業技術において知られている。たとえばサンプルーフらのＭｏ１ ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第 ２版、コールド・スプリング・ハーバ−プレス（１９８９年）刊行を参照。

従って、所望のタンパクは原核および真核の双方の系で製造することができ、多 くのタンパクの場合、処理系のスペクトルをもたらす。

最もふつうに使用される原核系はイー　コリ（大腸菌）であるが、他の系たとえ ばビー　サブチリスおよびソニートモナスも宵月であると予期される。原核系の 好適なコントロール配列としてＩａｃブローモーター、ｔｒｐブローモーター、 ハイブリッドたとえばｔａＣプロモーター、ラムダ・ファージＰＬプロモーター 、を包含する競合および誘導の双方のプロモーターがあげられる。一般に、外来 タンパクは融合または成熟のいずれかのタンパクとしてこれらの宿主中で生産す ることかできる。所望の配列か成熟タンパクとして生産されるとき、生産された 配列は効果的に除く必要のないメチオニンが先行していてもよい。従って、ここ に請求されているペプチドおよびタンパクはバクテリアで生産されるときはＮ末 端メチオニンが先行してもよい。その上、構造は、ペプチドのコーディングがタ ンパクの分泌をもたらす操作性信号ペプチドを先行させる場合に製造することが できる。原核宿主にこのようにして生産されるときは、信号系列は分泌の際に除 去される。

広範囲の種類の組換え異種タンパクの生産も今や利用しつる。バクテリアの場合 のように、真核宿主は所望のタンパクを直接に生産する発現系で形質転換させる ことができるが、もっとふつうにはタンパク分泌に有効な信号配列が付与される 。真核系は高級有機体のタンパクをコーディングするゲノム配列中に起こりうる イントロンを処理しつるという追加の利点をもつ。真核系はまた、たとえば若干 のアミノ酸残基のグリコジル化、酸化または誘導体化、形態上の変化などをもた らす多数の処理機構を提供する。

ふつうに使用される真核系として、イースト、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細 胞、および高級細胞があげられる。リストは書きない。これらの宿主系のそれぞ れにおいて使用するのに適合し且つ操作可能な好適なプロモーター、ならびにタ ーミネーション配列および増強剤たとえばバキュロウィルスポリヘトリン・プロ モーター、が利用しつる。たとえば哺乳動物系において、ＭＴＩＩプロモーター は重金属イオンの添加によって誘起されつる。

所望の宿主に好適な発現系の構造は当業者に知られている。タンパクの組換え生 産について、それをコードしたＤＮＡはえらばれた発現系に好適に結合され、系 は次いで適合する宿主に形質転換され、次いて外来遺伝子の発現か起こる条件下 で培養され保持される。このようにして生産された本発明の殺虫に有効な成分は 、細胞を分解することによって、又は当業者に周知の培地からの分離によって、 培養物から回収される。

主となるアミノ酸配列の小さい変化は、ここに例示したペプチドに比べて実質的 に相同の又は増大した活性をもたらしうるということか理解される。これらの変 化は意図された突然変異の場所と考えることができるか、あるいは本発明ののペ プチドを生産する宿主の突然変異による事故と考えることができる。これらの変 化は殺虫活性か保持される限り誘起される。タンパクの突然変異はそれをコード するＤＮＡのヌクレオチド配列の変化により（ふつうに起こる又は特異的に記載 されるタンパクに対して）その−次構造を変える。

これらの突然変異体として具体的にアレリック変異体があげられる。

タンパクの一次構造の突然変異的変化は欠損付加または置換から生ずる。「欠損 」は１つ以上の内部アミノ酸残基が不在であるポリペプチドと定義される。「付 加」とは野生種に比べて１つ以上の付加的な内部アミノ酸残基をもつペプチドと 定義される。「置換」は１つ以上のアミノ酸残基が他の残基によって置換される ことから生ずる。タンパク「断片（フラグメント）」はポリペプチドが関係する タンパクの一部に等しい一次アミノ酸配列から成るポリペプチドである。

好ましい「置換」は保存性のもの、すなわち１つの残基が同じ一般型の別の置換 基によって置換されたものである。よく理解されるように、天然産アミノ酸は酸 性、塩基性、中性および極性、または中性、および非極性および／または芳香族 として下位分類されつる。

生米の形体とは異なるコード化ペプチドはアミノ酸の置換コドンをもち、これら が置換アミノ酸と同じ基からのものであるのか一般に好ましい。

従って一般に、塩基性アミノ酸ＬｙＳ、Ａｒｇ、およびＨｉｓは互換性があり； 酸性アミノ酸ＡｓｐおよびＧｌｕは互換性があり。

中性極性アミノ酸Ｓｅｒ、ＴｈｒＳＣｙｓＳＧｌｎ、およびＡｓｎは互変性があ り：非極性脂肪族酸Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕは相互に保 存性であり（ただし寸法のためにＧｌｙおよびＡｌａはより密接に関連があり、 そしてＶａｌ、ｌｉｅおよびＬｅｕはより密接に関連がある）、そして芳香族ア ミノ酸Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒは互変性かある。

Ｐｒｏは非極性中性アミノ酸であるけれども、それは立体配置に難点を表す。同 一の又は類似の立体配置かえられるときを除いてＰｒｏによる又はＰｒｏへの置 換は好ましくない。保存性の変化を表す極性アミノ酸としてＳｅｒ、ＴｈｒＳＧ ｌｎ、Ａｓｎがあげられより小さい程度にＭｅｔがあげられる。また、異なった カテゴリーの分類であるけれども、Ａｌａ、ＧｌｙおよびＳｅｒは互変性がある と思われ、そしてＣｙｓは付加的にこのグループに適合するが、または極性中性 アミノ酸に分離することができる。異なったクラスからのアミノ酸のコドンによ る置換も有用でありうる。

本発明のタンパクのための組換え材料が与えられるために、これらのタンパクは 組換え技術によって、ならびに自動化アミノ酸合成器によって製造することかで きる。種々の宿主細胞によって与えられる多数の後ホンヤク特性のために、天然 産タンパクの種々の修飾もえられる。タンパクのグリコジル化、アミド化または リピド化パターン、あるいはタンパクの一次、二次または三次構造を変化させる 後ホンヤクの場合の結果として「修飾」タンパクは未修飾タンパクとは異なるか 、もちろん本発明の範囲内に含まれる。

ここに述べるタンパクたとえばＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ、が合成で作られる場合 、遺伝子によってコードされていないアミノ酸による置換もなしうる、というこ とを更に注目すべきである。別法の残基の例としてたとえば式Ｈ，Ｎ　（ＣＨ， ）、Ｃ０ＯＨ（ｎは２〜６である）のωアミノ酸があげられる。これらは中性、 非極性のアミノ酸たとえばザルコシン（Ｓａｒ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−Ｂ ｕＡ　１　ａ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧＩｙ）　、Ｎ−メチルイソロ イシン（Ｎ−Ｍｅ　Ｉ　１　ｅ）　、およびノルロイシン（Ｎ　１　ｅ　ｕ）が あげられる。たとえばフェニルグリシンは芳香族中性アミノ酸ＴｒｐＳＴｙｒま たはＰｈｅの代わりになることができ、シトルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニン ・スルホキサイド（ＭＳＯ）は極性であるが中性であり、シクロへキシルアラニ ン（Ｃｈａ）は中性であって非極性であり、シスライン酸（Ｃｙａ）は酸性であ り、そしてオルニチン（Ｏｒｎ）は塩基性である。プロリンの立体配置−散性は 、これらの１つ以上がヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）によって置換されるときに えられる。

Ｆ１世代交替（トランスジェニック）植物更に本発明によれば、ジグエチアくも 毒液から実質的に単離しつる殺虫に有効なペプチドをコードしたＤＮＡ配列を、 そのＤＮＡ配列の発現が有性伝播または無性伝播を会して植物の次の世代にうけ つかれるように、植物の生殖細胞系列に導入して含む世代交替植物が提供される 。

本発明により殺虫に有効なペプチドをコードに入れた遺伝子は遺伝工学技術によ って植物に導入することができる。この技術により植物細胞中のペプチドの生産 は昆虫害虫の制御手段に有用であることが予期される。それ故、天然産品種より も昆虫に耐性の大きい植物を作ることが可能である。

植物を形質転換させるのに使用しうる殺虫に有効なペプチド遺伝子のコーディン グ領域は遺伝子の全長または部分的な活性の長さてありうる。然しなから、ペプ チドの遺伝子配列を発現させ、生成植物細胞中のペプチドの機能として生産させ ることか必要である。殺虫に有効なペプチドをコードしたゲノムＤＮＡとｃＤＮ Ａおよび合成りＮＡの双方を使用して形質転換植物を作ることかできる。更に、 遺伝子はｃＤＮＡクローンから部分的に、ゲノム・クローンから部分的に、およ び合成遺伝子および種々のそれらの組合せから部分的に構成されうる。また、ペ プチド遺伝子をコードしたＤＮＡは単離ペプチドの資源以外の種々の種からの部 分を含むことができる。

その上、殺虫に有効なペプチドは別の化合物（単数または複数）と組み合わせて これらの化合物を発現する予想外の遺伝子を含む形質転換植物中に予想外の殺虫 性を生せしめることもできると信ぜられる。これらの他種化合物としてプロテア ーゼ阻害剤、たとえば昆虫に対して経口毒性をもつプロテアーゼ阻害剤またはバ シリウスチューリンジエンシスからのペプチドがあげられる。ビー　チェーリン ジエンシス蛋白は昆虫の腸細胞膜のカリウム透過性の変化を生ぜしめて膜中に小 孔を発生させるようにする。他の孔形成性タンパクを殺虫に有効なペプチドと組 み合わせて使用することもできる。

このような孔形成性タンパクの例はマガイニン、セブロヒン、アラニン、メイイ ケン、ガラミシジンら、ナトリウム・チャンネル・タンパク、および合成断片、 スタフィロコッカス　アウレウス、アポリボたんばくおよびそれらの断片、アラ メケシンおよび種々の合成アンフィバシック・ペプチドである。細胞に結合して エンドシトシスを増強させるレクチンは別の種類のタンパクであるか、本発明の 殺虫に有効なペプチドと組合せて使用して植物を遺伝的に昆虫耐性のものにする ことかできる。

ヘブチド遺伝子のプロモーターは予想外の遺伝子配列を発現させるのに有効であ ると予期されるか、他のプロモーターも有用であると予期される。有用でありう る効率的な植物プロモーターは過失産性プロモーターである。ペプチドの遺伝子 配列と操作可能なこのプロモーターは、形質転換植物が害虫に対して耐性か増大 するように、ペプチドの発現を促進しうるものであるべきである。本発明に有用 であると予想される過生産性植物プロモーターは知られている。プロモーターに 操作上結合する殺虫有効ペプチド遺伝子を含む予想外の遺伝子配列は所望の植物 を形質転換させるため好適なりローニング・ベクターに結合させることかできる 。一般に、宿主細胞に適合しつる種から誘導されるレプリカおよび制御配列を含 むプラスミドまたはウィルス（バクテリオファージ）ベクターが使用される。ク ローニング・ベクターはもとのもののレプリカならびに形質転換宿主細胞中の表 現型選択マーカー、代表的に抗体、を提供しつる特異遺伝子をはこぶ。形質転換 用ベクターは宿主細胞の形質転換後にこれらの表現型マーカーによってえらばれ る。

有用であると予期される宿主細胞としてバクテリアたとえばイー・コリイ、サラ ルモネラ　リフイミリウム、およびセラチア　マルセスセンス；および真核宿主 たとえばイーストまたはフィラメンタス　ファフジがあげられる。

クローニング・ベクターおよび該ベクターで形質転換した宿主細胞は一般に、ベ クターのコピーの数を増幅させるために使用される。

増幅したコピーの数を用いて、ペプチド遺伝子を含むベクターは単離することが でき、そしてたとえば、ユニ記述した遺伝子配列を植物または他の宿主細胞に導 入するのに使用される。

外来遺伝子を発現する植物の製造法は知られている。たとえば、植物組織は植物 の直接感染または植物の共培養、エイ　チュメファシエンスによる植物組織また は細胞の感染；外因性ＤＮＡのプロトプラストへの直接の遺伝子転移；、ＰＥＧ の接種：ミクロ注射およびマクロブロジエクティル・ホンバードメント：によっ て形質転換させることができる。

エレクトロポレーションによるタバコの形質転換はＡｇ、Ｂｉ。

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｎｅｗｓ、Ｖｏｌ、７．ｐ、３および１７（１９９０年 ９月／り０月号）に記載の技術によって確立された。

この技術において、植物のプロトプラスト（原形質）は殺虫に有効なペプチド遺 伝子構造を含むプラスミドの存在下でエレクトロボレートされる。高いフィール ド強度の電気パルスは生体膜を透過性にしてプラスミドの導入を可能にする。エ レクトロポレートされた植物のプロトプラストは細胞壁を再構築し、分割して植 物カルスを生成する。発現した殺虫有効ペプチドによる形質転換植物細胞の選択 は上記の表現型マーカーを使用して達成される。外因性ＤＮＡは任意の形態で、 たとえば裸の線状、環状または超コイル型のＤＮＡ、リポソームに包まれたＤＮ Ａ、球形ブラスト中のＤＮＡ、他の植物プロトプラスト中のＤＮＡ、塩で複合さ れたＤＮＡの形態で、プロトプラストに加えることができる。

アグロバクテリウムによって形質転換させうるすべての植物細胞、および形質転 換細胞から再生された全植物も本発明により形質転換させて、転写した殺虫有効 遺伝子を含む形質転換した全植物を生産することもできる。コメの形質転換はデ ィ・エム・ライネリらのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒ ａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　（Ｏｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ１． ）”、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、８．ｐｐ３３−３８　（１９９０ 年１月）によって確立された。

殺菌に有効なペプチド遺伝子を植物細胞に導入する別の方法は植物細胞を、殺虫 作動タンパク遺伝子で形質転換させたエイ、ツメファシェンスに感染させること である。当業技術において知られている適当な条件下に、形質転換植物細胞を生 育してシェード、ルーツ（根）を生成させ、更に形質転換植物に成長させること である。殺虫に有効なペプチド遺伝配列は適当な植物細胞に、たとえばエイ。

ツメファシェンスのＴｉプラスミドによって、導入することができる。Ｔｉプラ スミドはエイ、チェメファシエンスによる感染の際に植物細胞に伝達され、植物 ゲノムに安定して一体化される。

Ｔｉプラスミドは形質転換細胞の生産に不可欠と信じられる２つの領域を含む。

これらの１つはトランスファーＤＮＡ（Ｔ　ＤＮＡ）と呼ばれ、腫瘍の形成を誘 起する。他方はウィルス性と呼ばれ、腫瘍の形成に必須であるがその維持には必 須でない。植物ゲノムに移るＴＤＮＡは、その形質転換能力に悪影響を及ぼすこ となしに、酵素の遺伝子配列の挿入によって大きさを増大させることができる。

腫瘍の原因の遺伝子を除いてそれらがもはや妨害しないようにすることによって 、修飾Ｔｉプラスミドは本発明の遺伝子構造を適当な植物細胞に伝達するための ベクターとして使用することができる。

遺伝子材料はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用することによって 植物細胞に伝達することができる。ＰＥＧは細胞が取り込む遺伝子材料と沈殿錯 体を形成する。

植物細胞へのＤＮＡの移動はまた、単離プロトプラスト、培養細胞および組織へ の注入および苗および植物のメリステマチック組織への注入によって達成されつ る。世代交替植物およびそれからのプロトジエニイは当業技術に知られる常法に よってえられる。

外来ＤＮＡ配列を植物細胞に導入する別の方法は、粒子にＤＮＡを付着させ、こ れを「遺伝子銃」と呼ばれるシューテイング装置によって植物細胞に押し込むこ とから成る。すべての植物組織または植物器官をこの目的の目標として使用する ことができ、例として生体内および試験管内の胚、先端組織および他の分裂組織 、つぼみ、体組織および生殖組織があげられるが、これらに限定されない。世代 交替細胞およびカルスはえらばれた次の確立された方法である。

目標とする組織を誘起してツマティック胚または再生シュートを形成させて、当 業技術で知られる確立された方法により世代交替植物を与える。適当な植物は使 用する植物種に従ってえらばれる。世代交替メイズ植物は高速ミクロプロジェク トを使用して遺伝子を胚芽発生細胞に移すことによって製造された。“Ｉｎｈｅ ｒｉｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｇ ｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｅｎｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍａ ｉｚｅｐｌａｎｔｓ’、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、８．ｐｐ８３３ −８３８　（１９９０年９月）参照。

再生された植物はくみ入れた外来ＤＮＡに対してキメラてありうる。外来ＤＮＡ を含む細胞か大小の胞子嚢に発達すると、組み入れられた外来ＤＮＡは生殖器官 に伝達される。外来ＤＮＡを含む細胞が植物の体細胞であると、キメラでない世 代交替植物はつぼみまたは茎の切口から生体内で、または当業技術に知られてい る次の確立された方法で、植物（無性）伝播の通常の方法によって生産される。

このような方法は使用する植物種に応じてえらばれる。

植物細胞または植物の形質転換後に、ペプチドが発現されるように形質転換した 植物細胞または植物は、適当な表現型マーカーによってえらばれる。これらの表 現型マーカーとして、抗生物質耐性体があげられるが、これに限定されない。そ の他の表現型マーカーも当業技術で知られており、本発明に使用することができ る。

種々の異なった形質転換系により、すべての植物の種類は原則として、それらが 本発明の殺虫有効ペプチドを発現するように、形質転換させることができる。

実際にすべての植物が培養細胞または組織から再生しうろことを示す証拠が増大 しつつある。これらの培養細胞の例としてすべての主要な穀物、シュガー・ケー ン、シュガー・ビート、綿、フルーツおよびその他の樹木、マメ類および野菜が あげられるが、これらに限定されない。これらの植物のすべてがアグロバクテリ ウムによって形質転換しつるか否かについての知識は現在のところ限られている 。アグロバクテリウムの中間宿主である種は試験管内で形質転換しつる。モノコ チレンドナス植物、とくに穀類および草はアグロバクテリウムに対して中間宿主 ではない。アグロバクテリウムを使用してそれらを形質転換させる試みは現在ま で不成功であった。若干の単子葉植物がアグロバクテリウムによって形質転換さ せつるという証拠が今や成長しつつある。今や入手しつるようになった新規な実 験的試みを使用して、穀類および草も形質転換させることができる。

アグロバクテリウムによって形質転換させうる追加の植物種としてイソモニア、 バシフロラ、シクラメン、マラス、ブーン、ローザ、ルバス、サンタリオン、ア リウム、リリウム、ナシサス、アナナス、アラチス、ファゼオラスおよびビサム があげられる。

再生は植物の種から種に変わるか、一般に殺虫に有効なペプチド遺伝子の多重コ ピーを含む形質転換プロトプラストの懸濁液がまず提供される。次いでプロトプ ラスト懸濁液からの胚形成が誘起されて、天然の胚のような成熟と発芽の段階に 進む。培地は一般に種々のアミノ酸とホルモンを含む。シュートとルーツ（根） はふつう同時に発生する。効率的な再生は培地、遺伝子型および培養の履歴に依 存する。これら３つの可変因子が制御されるならば、再生は十分に再現性があり 反復可能である。

形質転換植物細胞から生育した成熟植物は自己増殖して同族繁殖の植物を生じつ る。同族植物は殺虫活性ペプチドの遺伝子を含む種子を生ずる。これらの種子は 殺虫活性ペプチドを発現する植物を生じるように生育しつる。同族繁殖を使用し て昆虫耐性ノへイブリッドを発達させることができる。この方法において、昆虫 耐性の同族繁殖系列は別の同族繁殖系列と交差してハイブリッドを生じる。

二倍鉢植物において、代表的に１方の親は殺虫に有効なペプチド（毒物）遺伝子 配列によって形質転換させることができ、他方の親は野生種である。植物の交差 後、第一世代ハイブリッド（Ｆ、）は１／２毒物／野生種：ｌ／２毒物／野生種 の分布を示す。これらの第一世代ハイブリッド（Ｆ、）は自己増殖して第二世代 ハイブリッド（Ｆ、）を生ずる。Ｆ、ハイブリッドの遺伝子分布は１／４毒物／ 毒物、ｌ／２毒物野生種：ｌ／４野生種／野生種である。毒物／毒物の遺伝子メ ーキャブをもつＦ、ハイブリッドは昆虫耐性植物としてえらばれる。

ここに使用する変異体は表現型変化を記述し、これは安定で遺伝性であり、例と して育性的に伝達されて植物の子孫ができる遺伝性変異体があげられる。ただし 変異体は依然として本発明の殺虫に有効なペプチドを発現する。また、ここに使 用する突然変異体は、環境条件たとえば照射により、又はよく知られる遺伝の法 則により減数分裂的に伝達される遺伝子変異の結果として、変異を特徴に有する 。然しなから、突然変異体植物は本発明のペプチドを依然として発現するもので なければならない。

世代交替植物中で発現されるようにえらばれた理想的な殺虫有効ペプチドは非目 標の昆虫または背椎動物に対するその安定性に特徴があるものである。発現系は 発現水準が殺虫効力を与えるようにえらばれる。従って、このような世代交替の 農業的に重要な植物を得る技術的容易さが、環境に対して責任を有しながらして 作物への昆虫の損害を減少させる総合的害虫管理法に使用する付加的武器を農家 に与えることが期待される。

Ｇ、殺虫剤としてのペプチドの応用 本発明の殺虫に有効なペプチドは、害虫を有効量の本発明のペプチドと接触させ ることによって、レビドブテラのような無背椎害虫を制御するのに有効であると 信ぜられる。好都合に、昆虫は好ましい害虫である。

無背椎害虫をペプチドと接触させて害虫を制御する方法は知られている。例とし て合成的にカプセル化した害虫の経口摂取用のタンパクかあげられる。本発明の タンパクを発現する組換え宿主、たとえばシュードモナス　フルオレスセンス、 は熱で死滅して害虫に適用して爾後の経口摂取および制御に利用することができ る。

いうまでもなく、本発明のタンパクを使用して無背椎害虫を制御する方法は、他 の害虫制御法と組合せて使用することもできる。たとえば、世代交替植物および イー、コリイは、制御すべき害虫の種類および存在する他の可変因子に応じて、 他の無背椎毒物を発現させるようにすることができる。

本発明によるペプチドおよび農業的に又は園芸的に許容しつるその塩の殺虫有効 量を農業的に又は園芸的に許容しうるキャリヤー中に含む殺虫剤組成物も提供さ れる。

Ｈ９殺虫有効ペプチドに対する抗体 本発明の別の面によれば、本発明の殺虫有効ペプチドに対する抗体が提供される 。次の記述において、ここに述べる抗体と反応性のペプチドを検出および精製す るための免疫技術の当業者に知られる種々の方法論について言及がなされる。

抗体は、それが分子と特異的に反応して該分子を抗体に結合しうる場合の分子に “結合しうる“ものと言われる。“エピトープ″は抗体によって認識され結合さ れつるペプチド抗原の部分のことをいう。抗原は１個以上のエピトープをもつこ とができる。“抗原″は動物を誘発してその抗原のエピトープに結合しうる抗体 を生成させることができる。上記の特異反応は、抗原がその対応する抗体と高度 に選択的に免疫反応し、他の抗原によって誘発されつる他の等級の抗体とは反応 しないということを示す意味である。

ここに使用する用語“抗体”　（Ａｂ）または“モノクロナール抗体”　（Ｍａ ｂ）とは抗原に結合しつる手つかずの分子ならびにその断片（たとえばＦａｂお よびＦ　（ａｂ’　）、断片）を含む意味である。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ 断片は、円形から更に容易に明らかなように、手つかずの抗体のＦｅ断片を欠き 、昆虫抗体の非特異性組織結合を少なくもちつる。

本発明の抗体は種々の方法のいずれかによって製造することかできる。このよう な抗体の製造法は周知であり、文献に十分に記載されている。たとえばサンプル ーフらの“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａ＋　”　、第２版、コールド・スプリング・ハーバ− ・プレス、Ｖｏｌ、３、Ｃｈ、１８　（１９８９参照）。たとえば、殺虫作動ペ プチドを発現する細胞またはその断片は動物に投与して殺虫有効ペプチドに結合 しうるポリクロナール抗体を含む血清の生産を誘起させることができる。一般に 、殺虫有効ペプチド断片を製造し精製してこれを天然の夾雑物を実質的に含まな いもにするか、または殺虫可動ペプチド断片を当業技術に知られている方法によ り合成する。精製断片または合成断片または精製天然断片および／または合成断 片を動物に導入して大きな特異活性のポリクロナール抗血清を製造する。

モノクロナール抗体は周知のハイブリドーマ技術を使用して製造することができ る。一般に、このような方法は動物を殺虫有効ペプチド抗原で免疫にすることを 含む。このような動物の牌繊細胞を抽出して好適なミエロマ細胞と融合させる。

すべての好適なミエロマ細胞を本発明により使用することができる。融合後に、 生成ハイブリドーマ細胞を好適な培地中に選択的に保持し、次いで限定希釈によ ってクローニングを行う。このような選択によりえられたハイブリドーマ細胞を 次いで分析して殺虫有効ペプチド抗原に結合しうる抗体を分泌するクローンを確 認する。

ペプチド資源か不純であると、ハイブリドーマ細胞の若干のみがペプチドに結合 しつる抗体を生産する（他のハイブリドーマ細胞はペプチド夾雑物に結合しつる 抗体を生産する。）従って、ペプチドに結合しうる抗体を分泌しつるものをハイ ブリドーマ細胞のあいだから選抜（スクリーニング）することか必要になる。こ のような選抜は、ペプチド（または毒液）の試料を特定のハイブリドーマ細胞の グループのそれぞれから分泌された特定のモノクロナール抗体の存在下で培養し 、そして昆虫を麻痺させる毒液の能力を中和または減衰させうる抗体を分泌する ことのできるハイブリドーマを確認してなされるのが好ましい。このようなハイ ブリドーマが確認されたならば、それは当業技術に知られる手段によってクロナ ール伝播させてペプチド特異性モノクロナール抗体を生産させることかできる。

昆虫選択性の毒物、天然または組換体を、抗体親和性クロマトグラフを使用して 精製するために、殺虫有効ペプチドに結合しつる抗体を使用することか必要であ る。一般に、このような抗体はモノクロナール抗体である。ひとたびペプチド特 異性モノクロナール抗体かえられたならば、それは固体担体に結合させることに よって不動化して、天然毒物または他の資源からのペプチドを、当業技術に周知 の方法による免疫親和クロマトグラフを使用して精製するのに使用することがで きる。このような方法は高度の精製を調停することができ、天然夾雑物を実質的 に含まないペプチドを生産することができる。ここに使用するように、ペプチド は天然に及び自然に付随する化合物（すなわち他のタンパク、脂質、炭化水素な ど）を欠く形体で存在するならば“天然夾雑物を実質的に含まない“ものといわ れる。

ひとたびペプチドが精製されたならば、それはペプチド特異性ポリクロナール抗 体の生産を引き出すために動物（たとえばマウスまたはラビット）を免疫するの に使用することができる。

好適な大きさの、一般に１０〜５０個のヌクレオチドのＤＮＡプローブはディグ エチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫作動ペプチドをコードしたＤＮＡか ら誘導することかできる。このようなプローブは、ディグエチアくも毒から実質 的に単離しうる殺虫有効ペプチドをコードしたＤＮＡの存在を、毒液とＤＮＡプ ローブを接触させ、該ＤＮＡに結合したプローブを当業者に周知の方法で検出す ることによって、検出することができる。

■、遺伝子工学による殺虫性微生物 殺虫有効ペプチド単独または別の昆虫毒物との組合せは、バキュロウィルスおよ びハイブリッド・バクテリアのような微生物の毒性を活性化または増大させるの に有用であると予期される。

へりオシメ　ビレスセンス（線玉虫）、オルギア　シュードラガタ（ダクラス・ ファー・ツソック蛾）リマンチア　ディスパー（ジブシー蛾）、オートグラファ 　カルフォルニア（アルファアルファのシャクトリ虫）、ネオディブリオン　サ ーティファ−（ヨーロッパ　パイン　はえ）、およびランスブシレシア　ボノネ ラ（コードリング蛾）を感染させるものを含む若干のバキュロウィルスが若干の 国で登録され、殺虫剤として使用された。少なくとも１種の昆虫選択性毒物のゲ ノムへの導入は、このようなペプチドの能力を著しく増大させると予期される。

本発明に使用するのに特に好適であると予期される組換え発現ベクターは米国特 許第４，８７９．２３６号に記載されている種類のようなバキュロウィルス発現 ベクターである。該米国特許を引用によってここに組み入れる。またカーボネル らの“５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ａｇｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ａｎ　 １ｎｓｅｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　５ｃｏｒｐｉｏｎ　ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ　 ａｎｄａｔｔｅｍｐｔｓ　ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｉｔ　ｕｓｉｎｇ　ｂａｃｕ ｌｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ、　”　Ｇ　ｅ　ｎ　ｅ　。

７３：４０９−４１８　（１９８８）も参照されたい。このようなベクターは、 ディグエチアくも毒液から実質的に単離しつる殺虫有効ペプチドをコードしたＤ ＮＡ配列がオートグラファ　力ルホルニア（ＡｃＭＮＰＶ）のようなバキュロウ ィルスにクローンされつる系において有用であると予期される。米国特許第４， ８７９，２３６号およびミラーらの５ｃｉｅｎｃｅ、２１９，７１５−７２１　 （１９８３）に記載の発現ベクター参照。組換え発現ベクター・ウィルスは次い で植物または動物に適用することができる。その際の昆虫は害虫であり、ウィル スか害虫に摂取されるとき、組換えウィルスは腸壁細胞に浸入して複製を始める 。複製中、殺虫有効タンパクの遺伝子は発現されて、昆虫が野生種のＡｃＭＮＰ Ｖウィルスを摂取した場合よりも短い時間で昆虫の無能化もしくは死をもたらす 。

ハイブリッド・ウィルスはまた欧州特許出願０３４０９４８号にも有用であると 予想されることが教示されている。本発明のＤＮＡを発現するハイブリッド・ウ ィルスは変化した昆虫宿主範囲をもつウィルスを生ずると予期される。たとえば 、融合タンパクは本発明のＤＮＡと特異昆虫腸管細胞認識タンパクとから成るハ イブリッド遺伝子の単一ポリペプチド生成物として発現されて、発現された殺虫 有効ペプチドを宿主昆虫目標に指向させることができる。

種々の原核および真核の微生物を形質転換させて欧州特許出願０３２５４００号 に教示されている方法によって殺虫可動タンパクをコードしたハイブリッド毒物 遺伝子を発現させることができる。

本発明のタンパクをコードした遺伝子をもつプラスミドから成るハイブリッドバ クテリア細胞は本発明の方法に有用であると期待される。昆虫はこのハイブリッ ドを昆虫に適用することによって制御される。たとえば米国特許第４，７９７． ２７９号を参照。この特許を上記のことを十分に示すものとして引用によってこ こに組み入れる。

本発明に使用するのに好適である他のバキュロウィルスの例はトマルスキイらの “Ｉｎ５ｅｃｔ　ｐａｒａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄ ｉａｔｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍ１ｔｅ　ｎｅｕｒｏｔＯＸｉ ｒｌ　ｇｅｎ８″、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：８２−８５　（１９９１）およびス テワードらの−ＣｏｎｓｔｒｕｃＨｏｎ　ｏｆａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｂａｃ ｕｌｏ、ｖｉｒｕｓ　１ｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｎ　 ｉｎｓｅｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｔｏｘｉｎｇｅｎｅ”、Ｎａｔｕｒｅ、３５２ ：８５−８８　（１９９１）：マックカチェンらの−Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　 ｏｆ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｇ　ａｎ　１ｎｓｅｃｔ　５ｅｅｃｔｉｖｅ　Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ　：　 ＰｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒＰｅｓｔ　Ｃｏｔｒｏｌ、”　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ、９　：　８４８−８５１（＋９９１）、に記載されている。

Ｊ、交差ハイブリッド化　関連化合物のプローブとしてのＤＮＡ配列 好適な寸法のＤＮＡプローブは本発明のＤＮＡ系列から誘導することかできる。

このようなプローブは、他の資源からの核酸を用いるハイブリッド化によって、 本発明の殺虫有効ペプチドをコードに入れた核酸の存在を検知するのに使用する ことかできる。信号配列、ｃＤＮＡの断片、または厳密さの少ない条件下の全ｃ ＤＮＡでさえ、これをコードしたオリゴヌクレオチドを用いる選抜は、ここに述 へた毒牙子のファミリーと機能上同族の他の活ペプチドへの接近を可能にする。

本発明のＤＮＡ配列から生じるヌクレオチド・プローブを用いる交差ハイブリッ ト化の良好な候補である核酸の資源として、同じ属であるか異なった種のクモ、 関連する属のクモ、および同じ属であるが異なったロケーションのクモがあげら れるか、これらに限定されない。

Ｋ、プロモーター配列の確認 本発明の別の面はクモのＤＫ９．２の合成を制御するプロモーター配列を提供す る。ＤＫ９．２の遺伝子の構成は、成熟した毒ｃＤＮＡをプローブとして用いて ゲノム・ライブラリーをスクリーニングすることによって試験された。転写スタ ート（ｃＤＮＡの５′端部であると推定される）の上流のゲノムＤＮＡの分析は 推定のプロモーターの存在を示す。プロモーター領域の４２１の塩基対のＤＮＡ 配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８で示される。この推定プロモーターは、転写スタ ートの場のすぐの上流の領域に一般に存在する本質的な制御信号の多くを含む。

（プロモーター制御信号の記載については、マツフナイトらの１９８２年　Ｔｒ ａｎｓｃｒ　ｉｐｔ　１ｏｎａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｓｉｇｎａｌｓ　ｏｆ　ａ ｎ　Ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｄｉｎｇ　Ｇｅｎｅ、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２１７：３１６を参照されたい。）カノニカルＴＡＴＡボックスは提 案された転写スタートの場から−３０の位置に現れ、ＲＮＡのスタート点を制御 するのに重要であると示唆される。更に上流には２つの末梢パリンドローム配列 が存在し、そのうちの１つはＲＮＡポリメラーゼＩＩ酵素の結合に重要であると 考えられるコンセンサスＣＡＡＴボックスを含む。このプロモーター、またはこ のプロモーターの領域は植物、動物またはバクテリア細胞中の種々の遺伝子の、 たとえば組換え構造中の、転写および発現に用途をもつ、ということが予見され る。

実施例 次の実施例は本発明の範囲内の特定の組成物および方法を具体的に示すためのも のであるが、それらは本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

材料および方法 クモは米国アリシナ州ブラック・キャニオン・シティのスパイダー・ファーム・ インコボレーテッドから入手し、種の確認はスパイダー・ファーム・インコポレ ーテッドによって提供された。ディグエチア・キャニティーズのクモを電気的に ミルク化して毒液を採取した。安全ガードを使用する方法を用いて毒液がレグル ジテートまたはヘモリンパ球によって汚染させるのを防いだ。

毒物の精製、粗毒液（−８０°Ｃで貯蔵）を解凍し、十分に混合して０．１％ト リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）にとかしてからクロマトグラフにかけた。ベックマン ・システム・ゴールド１２６溶媒および１６０光ダイオードアレイ検出器を組み 入れた反転相液体クロマトグラフィ（ＲＰ　Ｌ　Ｃ）によって粗毒液を分別した 。アセトニトリルまたはイソプロパツールをＴＦＡと組合せてイオン対試剤とし て使用した。同じマトリックスのガード・カラムをもつ次のカラムを精製に使用 した。Ｄ　ｙｎ　ａ　ｍ　ａ　Ｘ　３００　Ａ　ＲＰ　Ｃ＋　ｓカラム（２５ｃ ｍＸ４．６ｍｍ内径、５μｍ粒子）、およびＶｙｄａｃ　３００Ａ　ＣＩ＝　半 プレバレーテイプ・カラム（２５ｃｍｘ１０ｍｍ内径、５μｍ粒子サイズ）。ピ ークの検出はＧＩＬＳＯＮ　２０８微分別コレクターを用いる２２０ｎｍでのモ ニタおよびフラクションの収集によって行った。すべてのフラクションは分別後 に凍結乾燥し、−８０°Ｃで貯蔵した。

ファスト・アトム・ボンバードメント質量分析計（ＦＡＢ−ＭＳ）マス・スペク トルをイリノイ大学のＶＧ機器ＺＡＢ−３Ｅ質量分析計を使用して標準ＦＡＢ条 件（キセノンガス、解像１０００、加速電圧８ＫＶ、原料温度４０°Ｃ）のもと で記録した。試料（約ｌμｇ）は２５％水性ＴＦＡ（１，０％）を含むチオグリ セロール４μｌ中で分析した。

実施例１ ディグエチア　キャニテイーズの全毒液からの殺虫性ペプチド含有フラクション の初期の分別と確認前記のディグエチア　キャニテイーズからえた凍結全毒液２ ５μｍを０．１％トリフロロ酢（ＴＦＡ）にとかし、３．５ｍｌ／分の流量で溶 離する半プレパレーテイブＶｙｄａｃ　ＲＰ　Ｃ＋ｓカラム上の反転相液体クロ マトグラフィーによる分別にかけた。水性０゜１％ＴＦＡ　：　５０％アセトニ トリル、０．１％ＴＦＡの８５：１５混合物で始まり１８０分後に５０：５０％ 混合物で終わる線状勾配の溶離液を使用した。

フラクション　リテンション・タイム（おおよその分）１０　６６．４ １６　１２６．１ １７　１３１．４ それぞれのフラクションを溶離液からの凍結乾燥、次いで水からの凍結乾燥によ って濃縮した。残渣を一８０°Ｃで貯蔵した。それぞれのフラクションを緩衝生 理学的食塩溶液の２５μｍにとかして殺虫性を検査した。若干のフラクションの 殺虫活性はタバコ毛虫（へりオシメ　ライレスセンス）“ＴＢＷ”に対して試験 することによって確認した。

ＴＢＷ幼虫、それぞれのフラクションについて５匹、に試験溶液３μｍを、３３ ゲージ針およびＰＢ６００反復マイクロディスペンサーを備える５０μｍハミル トン注射器を使用して注射した。注射は注射針を腹部（前脚の１つの近く）の横 方向中央に浅い角度で注入することによって行い、内部器官の損傷を避けた。注 射後、それぞれの昆虫を人工飼料を含む別個の容器に入れた。観察を周期的に行 い、注射後２４時間で麻痺を測定した。タバコ毛虫について０゜３ｇの平均体重 を投与量の計算に使用した。１セツトのコントロール昆虫には緩衝食塩溶液のみ を注射した。

麻痺は除々に進行し、その前に筋肉のケイレンかあった。ひどい場合には、これ らのケイレンは注射後１５〜３０分以内に始まり、除々に強さを増し、遂には幼 虫は完全に無能力になった。時としてフルエは注射後４８時間以上も続いた。致 死量以下の薬量を投与したときにさえ時としてこれか起こり、幼虫は究極的に回 復した。フルエのひどさは毒性の最も信頼しうる指標であり、全麻痺および／ま たは体濃度の点にまで影響を受けた幼虫は回復しなかった。

表　１ ディグエチア　キャニテイーズ全毒液の毒性ＴＢＷ上（７）ＲＰＬＣフラクシｈ ン（７，５ｖＩＶ”　／ｇ昆虫）”８麻痺は側部または背部で回転させたときの 昆虫の右へ動くことのできないこととして定義される。

”ＷＶＥ全毒液当量は全ミルク化毒液１μｍにふつうに存在する毒物の量であり 、２５μｍ分離からの５ＷＶＥは回収残渣の２０％である。

実施例２ ディグエチア　キャニテイーズのフラクション９の精製ＴＢＷ活性フラクション ９の主要成分を、イソブロノくノール１０゜１％ＴＦＡの線状溶媒勾配を使用し て、Ｖ　ｙ　ｄ　ａ　ｃ　ＲＰ　Ｃ＋　ｓ（２５ｃｍｘ　１０ｍｍ内径）の１つ の追加クロマトグラフィーによって３．５ｍｌ／分で２２０　ｎｍでモニタして 同質に精製した（生じ６，５００ダルトンの分子量範囲で、５ＤＳ−ＰＡＧＥ電 気泳動によりそれぞれ１つの可視帯域）。

ピークの検出とフラクション収集は、実施例１に述べたように行った。２つのフ ラクションを集めた。第１は２１．８１分（フラクション９．１）で溶離し、第 ２は２２．３９分（フラクション９゜２）で溶離した。

フラクション９．１および９．２を溶離液からの凍結乾燥およびその後の水から の凍結乾燥によって凍結し、それぞれ９．　１および９．２の残渣を残した。凍 結乾燥したフラクションの純度は少な（とも９９％であると見積られた。全毒液 の２５μｌからえられた残渣９．２は６μｇの純タンパクを含むと推定された。

残渣９．２をタバコ毛虫に対する殺虫活性について試験した。実施例１で述べた ようにして、５匹の昆虫のそれぞれに緩衝食塩溶液中の６．３μｇの残渣を注射 し、そして別の５匹の昆虫にはコントロールとして緩衝食塩溶液のみを注射する ことによって試験を行った。２４時間後、および４８時間後に昆虫を試験した。

２４時間の読みをおいて、残渣９．２溶液で処理した昆虫のすべては麻痺し、次 いで死んだが、コントロール昆虫は通常のようにみえた。４８時間後にも変化は 認められなかった。

ファスト・アトム・ボンバードメント質量分析計は６３７１±２の分子量を示し た。Ｎ末端アミノ酸配列分析は、ＳＥＱ　Ｎ）　ＮＯ：ｌに実質的に示すように 残渣９．２の部分アミノ酸配列、アミノ酸１−３３、をもたらした。

エッチ　バーレスセンス（ＴＢＷ）中のディグエチア毒物９．２のＬＤ、。は約 １．０ナノモル／ｇであった。症候は実施例１で述へた全毒液の投与に伴うもの と類似していた。

実施例３ ディグエチア　キャニティーズの精製、フラクション１１実施例２と同様にして 、実施例゛ｌのディグエチア　キャニティーズ全毒液から単離したフラクション １１を、反転相液体クロマトグラフィによって更に精製して１つのフラクション を得た。このフラクションを、溶離液からの凍結乾燥およびその後の水からの凍 結乾燥によって濃縮して残渣、標識残渣１１、を残した。この残渣を実施例２で 述べたように５．０ＷＶＥ／ｇでタバコ毛虫に対する殺虫活性について試験した 。２４時間後に、残渣１１で処理した昆虫の８０％は麻痺を示し、そして４８時 間後にはこのペプチドで処理した昆虫の６０％が麻痺を示した。

このポリペプチドのファスト・アトム・ボンバードメント質量分析計は６７４０ ±２の分子量を示した。Ｎ末端アミノ酸配列分析はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３に実 質的に示す部分アミノ酸配列、アミノ酸１−２９、をもたらした。

実施例４ ディグエチア　キャニテイーズの精製、フラクション１２実施例２と同様にして 、実施例１のようにディグエチア　キャニテイーズ全毒液から単離したフラクシ ョン１２を反転相液体クロマトグラフィによって更に精製して１つのフラクショ ンを得た。このフラクションを溶離液からの凍結乾燥、およびその後の水からの 凍結乾燥によって濃縮して、残渣、すなわち標識残渣１２を残した。

この残渣を実施例２で述べたようにタバコ毛虫に対する殺虫活性について試験し た。２４時間後に、残渣１２で処理した昆虫の１００％は麻痺を示し、４８時間 には残渣１２で処理した昆虫の８０％が麻痺を示した。コントロール昆虫は通常 のようにみえた。

ファスト・アトム・ボンバードメント質量分析計によるこのポリペプチドの分析 は７０８０±２の分子量を示した。Ｎ末端アミノ酸系列分析はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：５に示すように残渣１２の仮の部分アミノ酸配列をもたらした。

この材料の限定された供給は毒性の正確な目盛りを示さず、その結果として残渣 ９．２は残渣１１および１２よりそれぞれ３９％および６７％高い薬量（ナノモ ル／ｇ）で試験した。えらばれた薬量は最小致死量から効果のない水準までの範 囲をカバーするように意図された。それにもかかわらず、結果はこれらのペプチ ドが全く同様な毒性をもつことを示した。残渣９．２は他のものよりやや大きい 能力をもつといえるが、その差は多分因子３よりも小さい。これらのペプチド（ 残渣９，２．１１および１２）の最小１００％致死量は３．０〜５．０ナノモル ／ｇであるようにみえる。これは商業的殺虫剤に優に匹敵する。たとえばテフル ベンズロン（ｔｅｆｌｕｔ＋ｅｎｚｕｒｏｎ　）は１．０ナノモル／ｇの代表的 なＬ　Ｄ　＝ｏ　（Ｓ　ＡＷ）をもつ。

実施例５ ディグエチア　キャニティーズ毒液から単離された残渣９．２および】１のコー ディング遺伝子の単離 工程＃１：ＲＮＡの単離 外部資源からの且つディグエチア　キャニテイーズと確認されたクモを収集した 。生きたクモを凍結し、液上窒素下にセファロンラックを除いた。Ａｎａｌｙｔ ｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１６２．１５６　（１９８７）に記載のＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　ａｎｄ　５ａ ｃｃｈｉのプロトコールを使用してセファロンラックスからＲＮＡを抽出した。

オリゴｄ　（Ｔ）セルロース（スエーデンのファーマシアＬ　Ｋ　Ｂ、）クロマ トグラフィを使用してポリアデニル化メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を精 製した。

工程１２　：　ｃＤＮＡの合成 製造者のプロトコールを使用してネズミ科すューケミア・ウィルス逆転写酵素（ 米国ミズリー州のベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）でメツセンジャーＲＮ ＡをｃＤＮＡに逆転写した。２０ｕ１の反応混合物はｃＤＮ八合へキット（米国 インディアナ州マンハイムのホーエリンガー）に供給されるような酵素緩衝液、 ５０μｇのｍＲＮＡ、２単位のＲＮアーセＩ（，３０μｇのｄ（Ｔ）Ｎｏｔ　Ｉ プライマー（米国ウィスコンンー州マジソンのプロメガ）、ＩｍＭのそれぞれの デオキシーヌクレオチドートリホスフェート、および１００μｇの逆転写酵素を 含んでいた。この反応混合物を３７°Ｃて１時間加温し、４２°Ｃで１０分間続 けた。反応混合物をエタノールで沈殿させ、２０μｍの水中に再懸濁させた。

工程＃３ニプライマーの合成 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉによりアミノ酸残渣ｌ〜８をコードしうる退化プライマ ーＤＮＡ配列混合物を、若干のドロソフィラのコドン選択を使用して設計して変 性を減少させた。このプライマーはユタ州立大学ハワード・ヒーエス・メディカ ル・インスティテユート・コントラクト・ファシリティによって合成された。

工程＃４・増幅 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡのプライマー指向酵素的増幅はサイキ らの５ｃｉｅｎｃｅ、２３９：４８７　（１９８８）によって始めて記述された 。我々の利用にとって、ディグエチアセ７ｙ０７ラツクｃＤＮＡの５μｍを、Ｇ ｅｎｅ　Ａｍｐ（商Ｎ）ＤＮＡ増幅キット（米国力リホルニア州セタスのパーキ ン・エルマー）に収納の試剤を含むポリメラーゼ鎖反応のテンプレートとして使 用した。この増幅反応は２μＭ１１度のセンスおよびアンチセンスプライマー、 １００μＭのそれぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェートおよび４単位の 熱安定性組換えＴａｇ　Ｉ　ポリメラーゼを含んでいた。この反応は米国力リホ ルニア州セタスのパーキン・エルマーによって製造されたＤＮＡ熱サーすラー中 で行われた。

ＮＨ，末端アミノ酸配列を用いる関連毒物のファミリーからの、残渣９．２の遺 伝子コードの選択的増加は厳密なアンニーリング温度（５８℃）を使用して達成 された。これらの条件は、アガロース・ゲル電気泳動によって測定して、約２７ ５個の塩基の対の長さをもつ単−ＤＮＡを増幅した。厳密さの少ないアンニーリ ング条件を使用すれば、５個より多い増幅生成物かアガロース・ゲル電気泳動に よって検出されることかあり、その大きさは約２００〜３６０個の範囲の塩基の 対になる。これらの種々のＰＣＲ生成物は低い厳密さてえられ、アミノ酸配列に 関連のあるポリペプチドを近似寸法で恐らくコードに入れており、殺虫活性を残 渣９．２に与える。このような関連ポリペプチドは残渣１１および１２を含むも のと予期される。これらのポリペプチドのＮ末端配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。

１．３および５に示すように、相互に及び残渣９．２に非常に類似しているから である。

工程＃５：ＰＣＲ生成物のクローニング高および低の厳密反応の両者からのＰＣ Ｒ生成物は、セントリコン−１００（アミコン）分子サイズ分離装置を使用して 精製して組み込まれなかったプライマーを除く。保持された生成物は次いで制限 酵素Ｎｏｔ　Ｉ　（ＭＢＲ）（ウィスコンシン州ミルウォー牛−）に消化させる 。この制限酵素は下流（３′端部）のプライマー内でｙ！Ｊ裂して粘着端部を残 す。ベクターｐＫＳ　（米国力ルホルニア州うジョラのストラテジェン）はＥｃ ｏＲＶ（ニーニス・バイオケミカル）およびＮｏｔ　Ｉで２重消化されて直接ク ローニングに特異の場を生成する。ベクターと昆虫を結合して錯体ＤＨ５αＦ゛ に形質転換させる。″Ｐ標識内部プローブを用いてコロニイ・リフトを選抜し、 候補コロニーをプライマーとしての内部プローブを使用してシーフェンシング（ ニーニス・バイオケミカルのシーケナーゼ・バージ３ン２．　０）　ミニブレブ ＤＮＡに更に特徴づける。

２つのクローンのｃＤＮＡ挿入子の全ＤＮＡ系列はＳＥＱ　ＩＤＮ０：２および ４に示される。前者のみが厳密ＰＣＲ反応から誘導されたクローン中にえられ、 これに対して両方の種類のｃ　ＤＮＡ挿入子は低い厳密のＰＣＲ反応の生成物か らえられるクローン中に見出された。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２によってコードさ れたポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１中に示される。この ポリペプチドは残渣９．２について決定されたのと同じＮ−末端配列をもつ。こ のポリペプチドの計算された分子量は６３７７．９ダルトンである。天然ポリペ プチド中のすべてのシスティンが分子内ジサルファイド結合（シスチン）の形体 で存在したとすると、計算された分子量は６３６９．７ダルトンになる。それ故 、このポリペプチドは質量分析計によって６３７１±２の分子量を示した残渣９ ．２中に単離されたブペチドと同じであるように思われる。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：４によってコードされたペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３に 示される。このポリペプチドは残渣１１について決定されたものと同じＮ末端配 列をもつ。それ故、このペプチドは残渣１１中で単離された同じポリペプチドで あると思われる。

実施例６ 哺乳動物への毒性 ここに述べたり、キャニテイーズから全毒液５μｍを３回の別々の試験で胎児マ ウスの腹膜内注射した。処理したマウスは食塩水コントロールのものとは始には 区別できなかった。注射後約３０分で、マウスはやや過度に活発になり、特徴あ る跳ぶような歩行を示した。

この後に短い期間調整不調、疲労した息使いと脈拍が続いた。死は症候の初期の 開始の２分以内に起こった。

残渣９．２．１１および１２をそれぞれ４．２．０．９および１゜２ｍｇ／ｋｇ の薬量でマウスに腹膜内注射したが３種のペプチドのすべてについて効果はみら れなかった。

残渣９，２を４匹のマウス（約２８ｇ）の背椎内室に約３０μｇ／マウス（約１ ｍｇ／ｋｇ）の薬量で注射した。注射後４８時間までのすべての時間においてな んらの効果も認められなかった。別のマウスには約１２５μｇ　（４，２ｍｇ／ ｋｇ）の残渣９．２を（ＩＰ）投与したが、なんの効果もみられなかった。

この毒液の背椎動物に対する毒性を特徴づけるために、全毒液のプールした反転 相フラクションをマウスについて試験した（図１）。

フラクション２はタバコ毛虫（ＴＢＷ）活性をもつ成分を含んでいた。２５μｍ の全毒液（ＷＶ　Ｅ　＞に等しい薬量で、フラクション１および２の腹膜内注射 はなんの効果ももたなかった。フラクション３は全毒液の注射について観察され たのと同じ効果を生じた。これらの結果は、ディグエチア　キャニテイーズ毒液 の諸成分中に存在する殺虫に有効な活性と背椎動物に対する活性（毒性）との間 の明瞭な分断を示唆している。

実施例７ 電気生理学データ ラットの海鳥スライスのシャファー・コラテリアル−ＣＡ　１ビラミダル細胞シ ナプスにおけるシナプス伝達について、ＤＫ９．２を１μＭで試験した。図２に 示すデータは（ａ）ＤＫ９．２添加前５分間の、（ｄ）ＤＫ９．２添加後ｌＯ〜 ２０分のあいだの、時間平均集団スパイクの記録を表す。これらの記録は重ね合 わすことができ、この濃度において、ＤＫ９．２はこの分析で検出しうるラット ＣＮＳに活性をもたないことを示している。この分析は種々の哺乳動物のイオン チャンおよび神経伝達受容体に及ぼす種々の効果を検出することかできる（ティ ・ヴイ・ダンウィトイーの、Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　ＩｎＶｉｔｒｏ　Ｂｒａｉ ｎ　５ｌｉｃｅｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、ｉｎ　Ｅｌｅ ｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｔ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒ ｍａｃｏｌｏｇｙ、エッチ、エム、ゲラ−編集、米国ニューヨーク州アラン・ア ール・リス・インニーボレーチット（１９８６年）刊行）。とくに、ナトリウム ・チャンネルの不活性化を阻止する分子、たとえばある種のサソリ毒、は集団ス パイク応答の接続相の著しい拡大を生せしめる（カネダ・エム、ミャマ　Ｙ。

イケモト　Ｙおよびアカイケ　Ｎ、の５ｃｏｒｐｉｏｎ　ｔｏｘｉｎ　ｐｒｏｌ ｏｎｇｓ　ａｎｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖｏｌ ｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｕｒｒｅｎｔｉｎ　ｒａｔ　 １ｓｏｌａｔｅｄ　ｓｉｎｇｌｅ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ、 Ｂ　ｒ　ａ　ｉ　ｎ　Ｒｅｓ、４８７・＋９２−１９５．１９８９．アラン・エ ル・ミューラーのＮａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ 。

、ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ）ｃ＋　これとは対照的 に、ＤＫ９．２は１００倍も低い濃度の昆虫処方（家バエ）において活性であり 、昆虫ナトリウム・チャンネルの不活性化を阻害することを示唆している。

実施例８ ＤＫ９．２の前駆体をコードした上流ｃＤＮＡ配列ＤＫ９．２をコードしたｃＤ ＮＡの上流配列を得るために、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２中に存在するＤＮＡ配列 のアンチセンス・ストランド上の核酸残基＃１５９〜１７８に相当する内部オリ ゴヌクレオチド、を合成した。Ｅｃｏ　Ｒ１制限部位はこのプライマーの５重端 部に存在する。単一ストランドの毒液線のｌＯμｌは末端デオキシヌクレオチド ・トランスファラーゼ酵素を（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）使用して デオキシグアノシン残基によりその３重端部において続いているようにした。１ ４μの酵素および５００μＭのｄＧＴＰを含む２０μＩの反応物を３７℃で１５ 分間加温した。試料をエタノールで沈殿させ、２０μｌの８２０に懸濁させた。

遺伝子特異性プライマーのＤＮＡ配列上流を、下流／成熟毒物ＣＤＮＡ配列に使 用したのと同様のアンカーＰＣＲ技術を使用して増幅させた。増幅反応物はセン ス・プライマー（ａｄ（ｃ）ティルのプライマー）およびアンチセンス・プライ マーを２μＭ濃度で含み、１００μＭのそれぞれのデオキシヌクレオチド・トリ ポスフエート、および４重位の熱安定性組換えＴａｇポリメラーゼを含んでいた 。温度プロフィールは次のとおりであった。９４°Ｃで２分、３７℃で２分、３ ７℃で１分。このサイクルを２回繰り返し、次いでプログラムを第２工程で５４ ℃の昇温アンニーリング温度をくみ入れた同じプロフィールに切り換えた。この サイクルを３２回繰り返した。

アンカーのＰＣＲは、エチジウム・ブロマイドの存在下に４％アガロース・ゲル 上に明示されるように、３８０ｂｐ断片を生じた。

この反応生成物を、イー　コリイ　ＤＮＡポリメラーゼ■（米国ウシコンシン州 マジソンのモレキュラー・バイオロジー・リソーシズ）の大きな（Ｋｌｅｎｏｗ ）断片を使用して、端部に充填し、エタノールの沈澱によって沈澱させた。生成 物を再懸濁させて制限酵素ＥｃｏＲＩで消化させた。消化した断片を酵素Ｔ４キ ナーゼによりＩｍＭのＡＴＰの存在下にキネート化し、次いでＥｃｏＲＩとＥｃ ｏＲＶ消化ｐ１３０イスクリブッＫＳベクターに接合させた。シーケナーゼ２． ０　（ＵＳＢ）を使用する２重ストランドＤＮＡシークエンシングによってサブ クローンを分析した。

成熟ペプチド毒物の上流区域に含まれるｃＤＮＡＤＮＡシーフェンスンスレーシ ョンは前駆体タンパクとして合成されるべきＤＫ９゜２を明らかにした。上流ｃ ＤＮＡ系列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｖ６に示された。フードに入れられた前駆体タ ンパクは信号配列とプロペプチド領域（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア）を含み、これ らを除いてりモ毒液から単離しうる成熟ペプチド毒物をえた。信号配列とプロペ プチド配列はクモの中でのＤＫ９．２の生産と分泌に必要であると考えられる。

実施例９ 組換えバキュロウィルスの構成 鱗しよう類信号配列（ジョネスらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｒｅ ｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　 Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｊｕｖｅｎｉｌｅ　ｔ（。

ｒｍｏｎｅ−３ｕｐｒｅｓｓｉｂｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｍ　ｆｒｏｍ　Ｉｎ５ｅｃ ｔ　Ｈｅｍｏｌｙｍｐｈｓ、Ｊ、Ｂ　ｉ　。

］、Ｃｈｅｍ、２６５：８５９６　（１９９０））を、Ｒｏｓｓｉらの方法（Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７：９２２６　（１９８２））を使用して、２つの 合成オリゴヌクレオチドから構成した。２つの４８マーズをイオン交換クロマト グラフィによって精製した。これらの２つのオリゴヌクレオチドは、それらの３ ′末端において、相補配列の１１個の塩基対を共有する。この配列を４個のデオ キシリボヌクレオシド・トリホスフェートとＤＮＡ−ポリメラーゼＩのＫｌｅｎ ｏｗ断片の存在下でアンニーリングするとき、２重ストランドの生成物が合成さ れた。反応生成物をヒドロキシラバティト・クロマトグラフィを使用して精製し 、２重ストランドＤＮＡ分子をＡａｔＩＩで消化させ、ＤＫ９．２ｃＤＮＡのこ の配列の上流を挿入するのに適した制限酵素をｐＫＳ−ＤＫ９　ｃにり０−ンし た。サブクローンを、信号配列の挿入のために選抜し、ＤＮＡシークエンシング によって検査した。

ＤＮＡシークエンシングは２つのｃＤＮＡ系列の間の枠内融合を確認した。全合 成遺伝子構造を、バキュロウィルス伝達ベクターｄＢｌｕｅ　ＢａｃのＮｈｅ１ 部位にクローニングするために実施し適合させた〔ビアラード、ジェイらのＪ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６４：３−５０　（１９９０））。サブクローンのシーフェ ンスを行って構造物の正確な挿入を確認した。プラスミドＷＲ９のＤＮＡシーク エンシングはバキュロウィルス伝導ベクターｐＢｌｕｅ　Ｂａｃ中の合成された “カテルスパイダー”遺伝子（ｐｒｅ　ＤＫ９．２）の挿入を確認した（図３） 。ｐＢｌｕｅ　Ｂａｃベクターの使用は選抜法を促進する。我々の組換え遺伝子 のバキュロウィルス・ゲノムへの挿入はβ−ガラクトシダーゼの共発現を伴い、 指示培地で成長するときの色調変化によって検出可能だからである。

ｐｒｅ　ＤＫ９．２をコードした組換えバキュロウィルスは、ｌμｇのＡｃＭＮ ＰＶウィルスＤＮＡと２μｇのプラスミドＤＮＡとの混合物による、サンマ−お よびスミスのプロトコール（“Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏ ｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ″、Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔ ｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、１５５５．１９８ ８）を使用する、スボダブテラ　クルジペルダ菌株Ｓｆ　９　（ＡＴＣＣ＃ＣＲ Ｌ１７１１）細胞の転写によって生産された。４日の後転写の後に、細胞上澄液 の希釈物を１００ｍｍのプレートにのせて５×１０１個のＳｆ９細胞で種付けし て培地としてのＢｌｕｏ−ｇａｌ（Ｇｉｂｒｏ　ＢＲＬ、米国ミズリー州ゲイザ ースパーク）を含むアガロースで覆った。５〜６日以内に、組換え体はその淡青 色によって検出可能であった。パスツール・ピペットを使用してプラークを拾い 、培地１ｍｌに溶離させた。この溶離液を使用して種付けＳｆ９細胞をＴ−２５ フラスコ中に再感染させた。３日の後感染の後に、６種の異なったアイソレート から小容量の上澄液を集めて、ウィルスＤＮＡの製造に使用した。ポリヘトリン 遺伝子を包囲する領域からのウィルス特異性プライマーを使用するＰＣＲ増幅に より、６種のウィルス・アイソレートのうちの５種が適切な寸法の挿入及び欠損 を含み、野生種の汚染はないことを確認した。組換えウィルスの滴定したストッ クを次いで生体内および試験管内の試験のために製造した。

実施例１０ 組換えＤＫ９．２の生物学的活性 血清含存組織培養媒質から精製した組換え残渣９．２　（ＤＫ９゜２）の生物学 的活性を１ｎｓｔａｒ　ＴＢＷ幼虫て試験した。試験溶液のＡ、。を基準にして 薬量を計算した。１６μｇ／ｇの薬量で、組換え体は注射２時間以内で著しい筋 肉けいれんを起こした。これらの幼虫の半数（３又は６匹）は麻痺して４８時間 後にひとく収縮したか、他の３匹の幼虫は依然として僅少から中程度の筋肉ケイ リンを示しつづけた。８μｇ／ｇの薬量でも３〜６匹の幼虫は麻痺したか、５． ２μｇ／ｇの薬量では２〜６匹の幼虫か麻痺した。これらの結果は組換えＤＫ９ ．２か生物学的に活性であることを確認するものである。

実施例１１ 組換えバキュロウィルス−生体内試験 Ａ、ＤＫ９．２組換え核ポリヒドロシス・ウィルス（ｖＡＣＤＫ９゜２）の生物 学的活性 １）ウィルス処方物の滴定 ウィルス・ストックをプラーク分析法（ルリアらの“Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ”、１９７８．　ｐｐ２１−３２；米国ニューヨーク州ジョン・ワイリ イ・アンド・サンズ刊行）によって滴定した。滴定は単位容量当りのプラーク形 成性単位（ＰＦＵ）の単位で表現された。これに対して薬量はＰＦＵ／幼虫とし て表現された。ＩＰＦＵは処方物、すべてのウィルスのそれぞれが１つの宿主細 胞（ルリアら、の上記文献）を感染しつる処方物、における１つの成熟ウィルス の機能上の当量である。たとえば、１０３個の宿主細胞は１０６ＰＦＵ／ｍ１　 （すなわち１０３ＰＦＵ／ｍＩ）を含むウィルス処方物のそれぞれの微小滴定に よって感染することかできた。

２）バイオ分析 ＤＫ９．２組換え核ポリヒドロシス・ウィルス（ｒＮＰＶ）の生物学的活性ｖＡ ｃＤＫ９．２を、一連の薬量応答分析において試験した。これらの分析において 、ＴＢＷ（幼虫）（平均質量的２５０ｍｇ）に組織培養培地中のｖＡｃＤＫ９． ２の種々の薬量を、又は組織培養培地単独のみを、注射した（ｎ＝１０）。実施 例１に記載の毒物注射実験のように、処理した幼虫を食餌の供給を伴う個々の容 器に保持して周期的に観察した。２つのこのような注射分析の組合せ結果を表■ に示す。５０００ＰＦＵ／幼虫およびそれ以上の薬量において、ＤＫ９．２の毒 性の代表的症候（筋肉のフルエ、および麻痺）か感染後約２４時間で現れはじめ 、そして４８時間以内に少なくとも半分の試験昆虫か無能になった（すなわち麻 痺または部分的に麻痺した）。試験した最低薬量、すなわち５０ＰＦＵ／幼虫、 は４８時間以内にフルエとケイレンを誘起させ、そして９６〜１２０時間で幼虫 の少なくとも７０％か無能になった。

Ｂ、野生壓ＮＰＶと比較したｖＡｃＤＫ９．２の生物学的活性更に研究を行って 、親の野生型ウィルス、オートグラファ・カルフォルニアＮＰＶ　（ｗｔ−Ａｃ ＭＮＰＶ）との比較においてｖＡｃＤＫ９．２の効力を決定した。これらの分析 の目的はｖＡｃＤＫ９゜２を注射した幼虫が等しい薬量のｗｔ−ＡｃＭＮＰＶに 感染した幼虫よりも少ない時間で無能になるか否かを決定することにあった。

１）注射分析 ｖＡｃＤＫ９．２およびｗｔ−ＡｃＭＮＰＶの生物学的活性を一連の注射分析に おいて比較した。最終齢のタバコ・毛虫（へりオシス　ビレスセンス）幼虫、キ ャベツ・しゃくとりむしくトリコブルシア　ニ）幼虫、およびビートよとうむし くスボドブテラ　エクイグア）幼虫に５ＸＩＯ’ＰＦＵ／幼虫のｖＡｃＤＫ９． ２またはＷｔ−ＡｃＭＮＰＶ注射した。コントロール幼虫には組織培養培地を注 射した。表■に要約した結果は、ｖＡｃＤＫ９．２が上記３種のすべてにおいて ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶよりも実質的により効果的であることを実証している。

２）飼分析 摂取によるｖＡｃＤＫ９．２の活性を試験するために、このポリヘトリン・ネガ ティブ（ｐｏｌ−）組換え体を経口感染の形体で製造することが必要であった。

これは、経ロ感染ｐａｌ−組換え体ＮＰＶｓについての他の研究者によって報告 された方法（たとえば、クロダらの１９８９年のＪ、Ｖｉｒｏｌｏｇ７　６３　 （４）：１６７７−１６８５、およびプライスらの１９８９年のＰｒｏｃ　Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８６：１４５３−１４５６）を使用して、ｖＡｃＤＫ ９．２とｗｔ−ＡｃＭＮＰＶとの共吸蔵によって達成された。５Ｆ−９細胞を、 ｖＡｃＤＫ９．２およびＡｃＭＮＰＶによりそれぞれｌＯおよび２の感染倍率（ Ｍｏｌ）で同時に感染させた。

同時に、５Ｆ−９（７）第２グループの細胞をｗｔ−ＡｃＭＮＰＶ単独（ＭＯＩ ＝２）に感染させた。感染後５８目に、含有体を細胞分裂および示差遠心分離（ たとえば、ウッドの１９８０年のＶｉｒｏｌｏｇｙ　１０４：３９２−３９９） によって収穫した。ｖＡｃＤＫ９．２とｗｔ−ＡｃＭＮＰＶに共感染した細胞は ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶ単独に感染した細胞よりも少なくて小さな含有体を生じた。

混合感染からのポリヘドラル含有体（ＰＩＢ）の収率は４．６ＰＩＢ／細胞であ るのに対して、純ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶ感染からの収率は３３．３ＰＩＢ／細胞で あった。

共吸蔵ｖＡｃＤＫ９．２の生物学的活性をｗｔ−ＡｃＭＮＰＶのそれとの比較に おいて見積もるために、食餌（ダイエツト）組入れ分析を使用した。混合または 野生種ＰＩＢを１０’ＰＩＢ／ｇダイエツトの濃度で非カンテン基材の昆虫ダイ エツト中にくみ入れた。

ダイエツトは小さい容器に分配し、次いでネオネートＴＢＷ幼虫に食べさせた（ 容器当り１匹、ｎ＝２０）。コントロール幼虫には非処理ダイエツトの同量を与 えた。幼虫にａｄリビタムを食餌させ、症候の発達を周期的に観察した。結果を 表■に示す。最初の４８時間には効果は認められなかったが、７２時間後には混 合ＰＩＢを与えた幼虫の５０％以上は麻痺した。野生種ウィルスはこの時点で効 果をもたなかった。９６時間後に、組換え処理幼虫の９０％以上は麻痺したのに 対して、野生種処理幼虫はその１０％のみが死んだか又は死にかかったにすぎな かった。１００時間後には、組換え処理幼虫の１００％が、ｗｔ−ＡｃＭＮＰＣ で処理した場合の７５％に比べて、死んだか死にかかった。従って、給飼分析に おいても、注射分析におけるように、ｖＡｃＤＫ９．２処理幼虫はｗｔ−ＡｃＭ ＮＰＶ処理幼虫よりも著しく短い時間で無能になった。

表　■ ｖＡｃＤＫ９．２によるＴＢＷの薬量応答分析麻痺の％ 実施例１２ ＤＫ９．２をコードに入れた遺伝子のプロモーターＤＫ９．２をコードに入れた 遺伝子のコントロール要素を見積もるために、ゲノム・ライブラリーを作った。

ノ１−マンおよびフリシャラフからの適合したプロトコール（“Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　”　。

Ｖｏｌ、１５２．アカデミツク・プレス、インコーホレーテッド刊行、ｐｐ１８ ０−１８３）を使用して、クモからＤＮＡを調製した。

二のＤＮＡをＳａｕ　３Ａにより部分的に消化させ、ＴＬＳ−５５０−ター（ベ ックマン・カンパニー、リミテッド）を用いて２５゜０００ｒｐｍで１６時間、 １０％−３８％サクロース密度勾配の遠心分離によって分別した。プールしたＤ ＮＡの２５−４５ｋｂフラクシヨンを調製して、部分充填法を使用してＸｈｏ　 Ｉ消化コスミド・ベクターに挿入した。結合性混合物の１／４をＧｉｇａｐａｋ ｇｏｌｄ（商標）（米国力リホルニア州うジョラのストラタジーン）を使用する ファージ粒子に充填し、形質転換後にクモＤＮＡの３ＸｌＯ”ｂｐ以上の当量を えた。このライブラリーを２５個の１５０ｍｍペトリ板にプレートし、ナイロン ・フィルター上にのせて放射線標識ＤＮＡでプローブした。

ディグエチア・ゲノム・ライブラリーのコロニイ・シフトを、ＤＫ９．２をコー ドに入れた放射標識ｃＤＮＡおよびアミノ末端、カルボキシ末端および内部プロ ーブをコードに入れた端部標識オリゴヌクレオチドを用いる系列で選抜した。１ つのコスミドｃＤＫ２はプローブのすべてでハイブリッド化された。Ｅｃｏ　Ｒ １消化コスミドは３．０ｋｂ断片を内部プローブおよびＣ−末端プローブの両者 でハイブリッド化するように示した。上記の確認された３つのプライマーを使用 するコスミドｃＤＫ２の２重ストランド配列は、ＤＫ９．２の遺伝子の単離に適 合し、このファミリーからの別の（又は他の）遺伝子が、ＤＮＡの同じ連続片の 上に存在する可能性を示唆している。アミノ末端オリゴヌクレオチド（ジクエチ ア殺虫活性ペプチドのすべてに対して高度の類似性をもつ）はコメミドＤＮＡ上 の多重の場に始まるからである。

ＤＫ９．２の遺伝子のｔｈｅのプロモーター領域に接近するために、我々はセン ス・ストランド上のプレ／信号配列に相当するオリゴヌクレオチドを合成した。

このプライマーと我々の遺伝子特異性プライマーとの間のＰＣＲ増輻は信号配列 がアミノ末端エクソンの３、ｏｏｏｂｐ以上の上流ある地形を示す。次いでアン チセンス・ストランドのプライマーを使用して、信号ペプチドをコードに入れる ｃＤＮＡの５′端部の直接上流の領域にゲノムＤＮＡの配列を続ける。

ゲノムＤＮＡの信号配列の上流のＤＮＡシーケンシングは開始メチオニン・コー ドンからｂｐ−１１における別のイントロンを示唆した。前駆体ＤＫ９．２ｃＤ ＮＡの５′領域に相当するオリゴヌクレオチド・プライマーを合成して、ＰＣＲ 反応を始動させるのに使用し、転写とトランスレーションの開始位置間に存在す る介在配列の大きさを決定した。１．０００の塩基対の増幅生成物はイントロン の存在を確認し、その大きさの推定を与えた。転写スタートまでのゲノムＤＮＡ 上流のＤＮＡシーケンシング（ｃＤＮＡの５′端部に等しいと推定される）はプ ロモーターの存在を示さない。プロモーター領域のＤＮＡ配列は配列ＩＤリステ ィングＮｏ、８中に存在する。この想像上のプロモーターは、転写スタートの場 の直接上流の領域中の他の真核プロモーター中に一般に存在する多くの本質的な 制御信号を含む。このプロモーターまたはこのプロモーターの区分を使用して、 バクテリア、ウィルス、植物または動物の他の真核遺伝子の転写／トランスレー ションを行うことができる。

実施例１３ ＤＫ９．２の使用形体に関連のある神経生理学的研究ＤＫ９．２の作用形体を明 らかにするための神経生理学的研究を行った。姐の神経筋肉結合および周縁神経 からの記録は、ＤＫ９゜２か、テトロドトキシンによるブロックに敏感な神経中 にくりかえしの破裂放電を誘発することを示す。すなわち、この毒の作用の場は 恐らく神経膜の電圧感受性ナトリウム・チャンネルである。追加の研究は、ＤＫ ９．２が１０ｎＭの閾値濃度で周縁神経を絶えず励起することを示した。また、 それはサソリ、レイウラス　クィンクエストリアタス、の通常の哺乳動物の毒４ の少なくとも５０倍である。

この研究に使用した実験動物は家バエ（ムスカ　トメステイカ）の第３インスタ ー幼虫、である。幼虫を虫ピンで動けなくして、医療用切開によって背中を開け た。体部をビンで平らにし、内蔵を除いて体壁筋肉組織を露出させた。脳に出る 周縁神経を切断し、脳を除いた。この処方物を次のもの（ｍＭ）から成る昆虫食 塩水であふれさせた：ＮａＣ１（１４０）、ＫＣＩ　（５）、ＣａＣ１，（０゜ ７５）　、ＭｇＣ１！　（４）　、ＮａＨＣＯ＊　（５）およびＨＥＰＥＳ（５ ）　、ＰＨ＝７．２゜ 刺激吸引電極をいずれかの便利な胴部に取付け、神経筋肉伝達を記録した。刺激 の閾値は除々に上昇して遂には筋肉収縮繊維６〜７本が観察された。次いで、こ の筋肉に記録用細胞内ミクロ電極を突き刺し、これを細胞内予備増幅器に接続し て、神経刺激に対する応答としてのＥｘｃｉｔａｔｏｒｙ　Ｐｏ５ｔ　５ｙｎａ ｐｔｉｃＰｏｔｅｎｔ　１ａｌｓ　（ＥＰＳＰ）をモニターした。

周縁神経繊維の上昇する電気活性を記録するために、吸引電極をＡＣ予備増幅器 に取り付けた。信号を１００倍に増幅し、出力を０゜３およびＩＫＨｚで濾過し た。すべての記録をＭａｃ　Ｌａｂコンピュータ化器機系でデジタル化して表示 （ディスプレー）し分析した。

ＤＫ９．２の作用の初期実験は神経筋肉連結プレバレージョンを利用した。周縁 神経に加えた単一刺激は体壁筋肉中に単−ＥＰＳＰをもたらした。ＤＫ９．２の 存在において、単一刺激はＥＰＳＰの高周波数放電をもたらした。刺激−誘起放 電の他に、自然の破裂放電も現れ、それらは数分間続いた。破裂の持続は通常１ 秒以上であったか、破裂の間のＥＰＳＰの周波数は＞３０Ｈｚであった。破裂放 電の存在は体壁神経筋肉中に激しい収縮を生ぜしめ、これか細胞内の読みを保つ のを困難にした。破裂開始による収縮の期間中、電極か筋肉から排斥されるため である。それ故、はとんどの実験は、収縮は抑圧するが、幼虫の電気活性は変わ らない、高濃度のサクロース（３００ｍＭ）を含む食塩水中で行った。通常の、 あるいは高濃度サクロース食塩水、のいずれかを使用して同様の結果をえた。

ＤＫ９．２処理後に観察される破裂放電はサソリ毒αトキシンの存在において観 察されたものと似ている。サソリ毒αトキシンは神経膜の電圧感受性ナトリウム ・チャンネルと相互作用のあるタンパクであることか知られている。従って、破 裂放電は特異性ナトリウム・チャンネルのブロッカ−であるテトロドトキシン（ ＴＴＸ）によってブロックされるべきである。ＤＫ９．２−誘起の破裂を阻止も しくは反転させるＴＴＸの能力を図５に示す。図５において、ＥＰＳＰは１　μ ＭＴＴＸによって容易に阻止され、１１００ｎのＤＫ９．２による爾後の処理に 対して処方物を不活性にする。同様の実験を図５Ｂにも示すが、そこでは破裂は ＤＫ９．２によって誘起され、爾後のＴＴＸの適用によって反転する。この実験 において、破裂の開始は筋肉から電極を駆逐し、記録を再確立する試みを行うと きに突き刺し人工島をもたらす。好適な記録の場か見出されたならば、破裂を約 ２分間モニターし、そして処方物はＴＴＸ処理後の数秒以内に活性の停止を示し た。収縮する筋肉からの細胞内記録に付随する問題を迂回するために、姐の周縁 神経からの細胞外の記録を使用して上記の実験をくりかえす。これらの記録は、 運動神経繊維の自然の抗飛行活性と共に、上昇センスの神経活性から構成される 。

７０ｎＭにおいて、ＤＫ９．２は食塩水による処理によって影響されない神経放 電の増大をもたらすか、０．４μＴＴＸによって容易にブロックされる。また、 ＤＫ９．２前のＴＴＸの適用は破裂の出現を阻止する。

ＤＫ９．．２に対する昆虫神経の感受性を検出し、その能力を標準サソリ毒のそ れと比較するために、追加の研究を行った。ＤＫ９゜２を１ｎＭで始まる周縁神 経プレバレージョンについて試験し、５分毎に濃度を増大させるか、または活性 の増大が観察されるまでそれを行った。このプレバレージョンにおいて、１ｎＭ および５ｎＭのＤＫ９．２は不活性であったが、１０ｎＭは短い遅延後にプレバ レージョンの活性を誘発した。５つの神経プレバレージョンからの結果を使用し て昆虫細胞のＤＫ９．２の有効閾値濃度を決定した。

これらの結果を表■に要約して示す。

表　■ 濃　度　処理の数　応答の数　％ １ｎＭ　２　０　０ ２ｎＭ　１　０　０ ５ｎＭ　３　１　３３ １０ｎＭ　３　３　１００ 実験の最後のグループは同様にして、サソリ（レイウレス　クインクエストリア タス）ＬｇＴＸ４の毒物に対する昆虫神経の感受性を決定した。プレバレージョ ン（ｎ＝４）を５００ｎＭまでのＬｇＴＸ４の濃度に露出させたか、効果はなか った。この発見は、ＬｇＴＸ４が哺乳動物のナトリウム・チャンネルに特異性か あることを見出した前述の研究に一致する。ＤＫ９．２によるこれらのプレバレ ージョンの次の挑戦は応答を得るためにｌＯ〜３０ｎＭを必要とした。ＤＫ９． ２の前動閾値濃度の僅かな上昇は恐らく不活性ＬｇＴＸ４による弱いブロック作 用に起因する。これらの実験は、ＬｇＴＸ４よりも少なくとも５０倍も昆虫神経 に対して活性であることを実証するものである。

配列のリスト ■）一般情報 （ｉ）出願人：カレン・ジエイ・クラプコ；ブラ・ソドフオード・カル・パンワ ゲネン；ジエイ・アール・ノ１ンター・ジャ、ツクソン　、 （ｉｉ）発明の名称：殺虫に有効なペプチド（ｉｉ）配列の番号＝８ （神）通信の宛先 （Ａ）宛先人：ウッドコック、ウオツシュバウム、カーツ。

マキエビッツおよびノリス （Ｂ）ストリート：ワン　ライブラリー　プレース　４６階（Ｃ）市：フィラデ ルフィア （Ｄ）州：ペンシルバニア （Ｅ）国：Ｕ、　ｓ、　Ａ。

（Ｆ）郵便番号：１９１０３ （Ｖ）コンピュータ読み出し形体 （Ａ）　ＭＥＤＩＵＭ　ＴＹＰＥ：　ＤＩＳＫＥＴＴＥ、　３．５　ｒＮｃＨ， １，４４Ｍｂ　５ＴＯＲＡＧＥ（Ｂ）　ＣＯＭＰＵＴＥＲ：　ＩＢＭ　ＰＳ／２ （Ｃ）　０ＰＥＲＡＴＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭ：　ＰＣ−ＤＯＳ（Ｄ）　５ＯＦＴ ＷＡＲＥ：　ＷＯＲＤＰＥＲＦＥＣＴ　５．０（ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｆｉ）先願データ： （Ａ）出願番号：６６２，３７３ （Ｂ）出願口：１９９１年３月１日 （ｖｉ）代理人／エイジェント情報。

（Ａ）名前：ジョン・ダブリュー・カルドウニル氏（Ｂ）登録番号：２８，９３ ７ （Ｃ）リファレンス／ドケット番号・ＦＭＣ−００５４（辷）電話通信情報・ （Ａ）電話：　（２＋５）５６８−３１００（Ｂ）テレファックス：　（２１５ ）５６８−３４３９（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ（７）情報（ｉ）配列の特性 ： （Ａ）長さ２５６個のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー、未知 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ１２７５個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド性＝２重 （Ｄ）トポロジー：未知 （Ｘｌ）配列の記述：ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：２：ＡＡＡＡＡＧＣ２７５ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３の情報：（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：５８＠のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４ の情報・（＋）配列の特性： （Ａ）長さ、２０４個の塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）ストランド性：２重 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋４：ＡＧＣＡＴＣＴＣＣＴ　２゜４ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の情報：（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝６２個のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：未知 （ｘｌ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌ ｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｘａａ　Ｌｅ ｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔｌ　５　１０　１５ Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｘａａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｘａａ　 Ｘａａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＬｙｓＴｙｒ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｔ ｒｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａ ｓｎ　Ａｓｐ　ＧｌｙＴｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉｌ ｅ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｘａａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＸａａＸａａ 　Ｘａａ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６の情報。

（ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ、３５９個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド性＝２重 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｌ）配列の記述：ＳＥｏ　１Ｄ　ＮＯ：６：ＡＴＡＴＴＡＣＡＡＧ　ＣＣＧ ＣＴＣＣＡＧＴ　ＡＧＣＣＧＡＡＧＡＡ　ＧＣＣＴＡＡＧＣＣＡ　ＡＧＡＡＣＣ ＣＡＧＧ　ＴＣＣＧＣＣＡＣ`　６０ ＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡ　ＴＴＣＣＡＡＣ３５９（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアの 情報：（ｆ）配列の特性： （Ａ）長さ＝３８個のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）ストランド性： （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア（２）ＳＥＱ　Ｉ　ＮＯ：８の情 報： （ｉ）配列の特性・ （Ａ）長さ１４２１個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド性、２重 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８ＴＴＴＡＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧ ＣＴＡＣＡ　ＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＣＡＧＧＴＡＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＡＣＡ 　ＣＡＡＴＧＣＣＣＣＡ　U０ ＴＧＣＣＣＡＣＧＣＴ　ＣＡＡＡＣＣＡＣＡＴ　ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡ ＡＣＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＧＧＴＡＡ　ＡＧＡＣＡＧＴＴＧs　１２０ ＴＧＣＡＴＴＣＴＡＡ　ＡＡＧＣＡＣＧＴＴＴ　ＴＡＣＴＧＣＡＧＣＴ　ＧＣＴ ＣＡＧＡＣＴＧ　ＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧ　ＧＴＣＧＡＧＧＣ`Ｇ　１８０ ＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＴ　ＣＣＡＣＣＧＡＡＧＣＡＴＴＧＴ ＴＣＧＴＧ　ＧＴＡＣＧＡＣＧＣＡ　ＧＴＡＡＧＣＡＴＧＡ@２４０ ＣＧＣＴＣＡＧＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＧＧＡＡＴＡＴＧＴＡ　ＡＴＡＴ ＣＴＧＣＡＧ　ＣＧＡＣＡＣＴＴＡＴ　ＴＧＡＡＡＴＧＴＴs　３００ ＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＴＡＴＣＧＧＡＡ　ＴＡＣＣＴ ＧＣＡＴＧ　ＡＣＡＴＡＡＣＴＧＡ　ＣＡＡＡＡＣＡＣＡＴ@３６０ ＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧ　ＡＡＡＣＡＡＣＧＡＡ　ＡＡＣＡＴＴＣＡＴＴ　ＣＣＴ ＧＴＡＴＡＴＡ　ＡＧＴＡＴＣＧＧＡＧ　ＧＡＧＴＧＣＴＧsＡ　４２０ Ｔ　４２１ ５ｙｎＤＫ　９．２ 麻痺または死　％ Ｏコ 国際調査報告 Ｐゴ／Ｌ５９２／Ｉ’　５０３ シｒ＋ＩＭｕｌＮ＋）＋ｊｊ−Ｊｎｊｐ＋”：ｉｆ＋ＣＪＩｏｃｄｌｉｕ＠ｔｌ ｌ　ｃｚｎｉｔｉｅｓ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　７／１０　８ ３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４Ｂ ＣＩ　２　Ｐ　２１１０８　８２１４−４Ｂ（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ 、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、Ｒ○、ＲＵ、５Ｄ （７２）発明者　クラプチョ、　カレン、ジョーンアメリカ合衆国ユタ州　８４ １０９　ソールトレイク　シティ　サン　ラフアニル　アベニュー　３８４０ ＦＩ （７２）発明者　ヴアンワーゲネン、　ブラッドフォード。

カル アメリカ合衆国ユタ州　８４１０２　ソールトレイク　シティ　１０７０イース ト　３００サウス　アパートメント　５０７ （７２）発明者　ジャクソン、　ジョン、ランドルフ、ハンター アメリカ合衆国ユタ州　８４１０９　ソールトレイク　シティ　ギルロイ　ロー ド

Claims (69)

【特許請求の範囲】
1. １．ディグエチア（Ｄｉｇｕｅｔｉａ）くも毒液から単離しうる実質的に精製さ れた殺虫有効性ペプチドまたはその農業的または園芸的に許容しうるその塩。
2. ２．くも毒液がディグエチアキャニテイーズ（Ｄｉｇｕｅｔｉａｃａｎｉｔｉｅ ｓからのものである請求項１のペプチド。
3. ３．質量分析計によって決定した約６３７１〜６３９７ダルトンの分子量および 反転相高性能液体クロマトグラフィーの上の単一ピークとしての運動を特徴とす る請求項１の殺虫有効性ペプチドおよびその農業的または園芸的に許容しうるそ の塩。
4. ４．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で決定したものと実質的に同じアミノ酸配列をもつ ことを特徴とする請求項１の殺虫有効性ペプチド。
5. ５．質量分析法によって決定した約６７４０ダルトンの分子量および反転相高性 能液体クロマトグラフィー上の単一ピークとしての運動を特徴とする請求項１の 殺虫有効性ペプチドおよびその農業的または園芸的に許容しうるその塩。
6. ６．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３で決定したものと実質的に同じアミノ酸配列をもつ ことを特徴とする請求項１の殺虫有効性ペプチド。
7. ７．質量分析法によって決定して約７０８０ダルトンの分子量および反転相高性 能液体クロマトグラフィー上の単一ピークとしての運動を特徴とする殺虫有効性 ペプチドおよびその農業的または園芸的に許容しうるその塩。
8. ８．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５で決定したものと実質的に同じアミノ酸配列をもつ ことを特徴とする請求項１の殺虫有効性ペプチド。
9. ９．ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫有効性ペプチドをコード するＤＮＡ配列を特徴とする実質的に単離したＤＮＡ配列。
10. １０．くも毒液がディグエチアキャニテイーズからのものである請求項３のＤＮ Ａ。
11. １１．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２で決定したＤＮＡ配列を特徴とする請求項９の実 質的に単離したＤＮＡ配列。
12. １２．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４で決定したＤＮＡ配列を特徴とする請求項９の実 質的に単離したＤＮＡ配列。
13. １３．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６で決定したＤＮＡ配列を特徴とする請求項９の実 質的に単離したＤＮＡ配列。
14. １４．ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫有効ペプチドをコード するＤＮＡ配列を特徴とする組換え発現ベクターであって、該ベクターが形質転 換細胞中で該コード配列の発現を行いうることを特徴とする組換えベクター。
15. １５．くも毒液がディグエチアキャニテイーズからのものである請求項１４の組 換え発現ベクター。
16. １６．該ＤＮＡ配列が質量分析法で決定した約６３７１〜６３９７ダルトンの分 子量および反転相高性能液体クロマトグラフィー上の単一ピークとしての運動を 特徴とする殺虫有効ペプチド、をコードすることを特徴とする請求項１４の組換 え発現ベクター。
17. １７．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で決定するペプチドを実質的にコ ードすることを特徴とする請求項１４の組換え発現ベクター。
18. １８．該ＤＮＡ配列が質量分析法で決定した約６７４０ダルトンの分子量および 反転相高性能液体クロマトグラフィー上の単一ピークとしての運動を特徴とする 殺虫有効ペプチドをコードすることを特徴とする請求項１４の組換え発現ベクタ ー。
19. １９．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３で決定するペプチドをコードする ことを特徴とする請求項１４の組換え発現ベクター。
20. ２０．該ＤＮＡ配列が質量分析法で決定した約７０８０の分子量および反転相高 性能液体クロマトグラフィー上の単一ピークとしての運動を特徴とする殺虫有効 ペプチドをコードすることを特徴とする請求項１４の組換え発現ベクター。
21. ２１．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５で決定するペプチドを実質的にコ ードすることを特徴とする請求項１４の組換え発現ベクター。
22. ２２．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２で実質的に決定されることを特徴 とする請求項１４の組換え発現ベクター。
23. ２３．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４で実質的に決定されることを特徴 とする請求項１４の組換え発現ベクター。
24. ２４．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６で実質的に決定されることを特徴 とする請求項１４の組換え発現ベクター。
25. ２５．該形質転換細胞が昆虫によって外寄生を受けやすい植物からのものである ことを特徴とする請求項１４の組換え発現ベクター。
26. ２６．ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫有効性ペプチドをコー ドするＤＮＡ配列を特徴とするトランスジェニックプラントであって、該ペプチ ドを植物の胚芽系または植物の先祖に、ＤＮＡ配列の発現の特徴が有性繁殖また は無性繁殖によって植物の次世代に遺伝されるように導入することを特徴とする トランスジェニックプラント。
27. ２７．ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫有効ペプチドを宿主に 又は宿主昆虫細胞にコードするＤＮＡ配列を発現しうる組換えバキュロウイルス 発現ベクター。
28. ２８．該発現ベクターが、ポリヘドリン遺伝子を挿入した及びバキュロウイルス ・ポリヘドリン・プロモーターの転写コントロールのもとで挿入したバキュロウ イルス・ゲノムであることを特徴とする請求項２７の組換えバキュロウイルス発 現ベクター。
29. ２９．ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫有効ペプチドをコード するＤＮＡ配列を特徴とするＤＮＡ配列で、形質転換または形質導入させて宿主 細胞が該ペプチドを発現するようにした組換え宿主細胞。
30. ３０．該毒液がディグエチア・キャニテイーズからのものである請求項２９の組 換え宿主細胞。
31. ３１．該ＤＮＡ配列が、質量分析法で決定して約６３７１〜６３９７ダルトンの 分子量および反転相高性能液体クロマトグラフィー上の単一ピークとしての運動 を特徴とする殺虫有効ペプチドをコードに入れていることを特徴とする請求項２ ９の組換え宿主細胞。
32. ３２．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で決定されるペプチドを実質的に コードすることを特徴とする組換え宿主細胞。
33. ３３．該ＤＮＡ配列が、質量分析法で決定して約６７４０ダルトンの分子量およ び反転相高性能液体クロマトグラフィー上の単一ピークとしての運動を特徴とす る殺虫有効ペプチドをコードすることを特徴とする請求項２９の組換え宿主細胞 。
34. ３４．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３で決定されるペプチドを実質的に コードすることを特徴とする組換え宿主細胞。
35. ３５．該ＤＮＡ配列が、質量分析法で決定して約７０８０ダルトンの分子量およ び反転相高性能液体クロマトグラフィー上の単一ピークとしての運動を特徴とす る殺虫有効ペプチドをコードに入れていることを特徴とする請求項２９の組換え 宿主細胞。
36. ３６．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５で決定されるペプチドを実質的に コードすることを特徴とする組換え宿主細胞。
37. ３７．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２で実質的に決定されることを特徴 とする請求項２９の組換え宿主細胞。
38. ３８．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４で実質的に決定されることを特徴 とする請求項２９の組換え宿主細胞。
39. ３９．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６で実質的に決定されることを特徴 とする請求項２９の組換え宿主細胞。
40. ４０．（ａ）宿主細胞中で形質転換または形質導入された組換え発現ベクターが ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫有効ペプチドをコードするＤ ＮＡ配列をもち、該ベクターが形質転換細胞中に該コード配列の発現を行いうる ことを特徴とする組換え宿主細胞を培養し、そして （ｂ）該殺虫有効ペプチドを組換え宿主細胞培養物から採取する、ことを特徴と する殺虫有効ペプチドの製造方法。
41. ４１．請求項４０の方法によって産生される組換体産生ペプチド。
42. ４２．該ＤＮＡ配列が、質量分析法で決定して約６３７１〜９７ダルトンの分子 量および反転相高性能液体クロマトグラフィー上の単一ピークとしての運動を特 徴とする殺虫有効ペプチドをコードに入れていることを特徴とする請求項４０の 方法。
43. ４３．該ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で決定されるペプチドをコード することを特徴とする請求項４０の方法。
44. ４４．該ＤＮＡ配列が、質量分析法で決定して約６７４０ダルトンの分子量およ び反転相高性能液体クロマトグラフィー上の単一ピークとしての運動を特徴とす る殺虫有効ペプチドをコードに入れていることを特徴とする請求項４０の方法。
45. ４５．該ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３で決定されるペプチドを実質的 にコードすることを特徴とする請求項４０の方法。
46. ４６．該ＤＮＡ配列が、質量分析法で決定して約７０８０の分子量および反転相 高性能液体クロマトグラフィー上の単一のピークとしての運動を特徴とする殺虫 有効ペプチドをコードすることを特徴とする請求項４０の方法。
47. ４７．該ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５で決定されるペプチドをコード することを特徴とする請求項４０の方法。
48. ４８．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２で実質的に決定されることを特徴 とする請求項４０の方法。
49. ４９．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４で実質的に決定されることを特徴 とする請求項４０の方法。
50. ５０．該ＤＮＡ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６で実質的に決定されることを特徴 とする請求項４０の方法。
51. ５１．ディグエチアくも毒液から単離しうるペプチドまたはその農業的または園 芸的に許容しうるその塩の有効量を害虫と接触させることを特徴とする無背椎害 虫（ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ｐｅｓｔｓ）の制御方法。
52. ５２．くも毒液がディグエチアキャニテイーズからのものである請求項５１の方 法。
53. ５３．害虫が昆虫である請求項５１の方法。
54. ５４．害虫が鱗しょう類である請求項５１の方法。
55. ５５．ディグエチアくも毒液から単離しうるペプチドの有効量を発現しうる組換 えバキュロウイルスを害虫と接触させることを特徴とする無背椎害虫の制御方法 。
56. ５６．請求項５５のペプチドおよびその農業的または園芸的に許容しうる塩の殺 虫有効量を農業的または園芸的に許容しうるキャリヤー中に含むことを特徴とす る殺虫組成物。
57. ５７．ディグエチアくも毒液から単離しうるペプチドと実質的に免疫反応性であ ることを特徴とする抗体。
58. ５８．くも毒液がディグエチアキャニテイーズからのものである請求項５７の抗 体。
59. ５９．（ａ）クモ毒液を採取し、（ｂ）このクモ毒液を検出可能な標識に結合さ せた抗体と接触させ、そして（ｃ）実質的に単離しうる殺虫有効ペプチドに結合 した標識抗体を検出することを特徴とする、請求項５７の抗体を使用してディグ エチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫有効ペプチドの存在を検出する方法 。
60. ６０．くも毒液がディグエチアキャニテイーズからのものである請求項５９の方 法。
61. ６１．ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫有効ペプチドをコード するＤＮＡ配列から誘導されたＤＮＡプローブ。
62. ６２．（ａ）クモから核酸を採取し、（ｂ）この核酸を請求項６１のＤＮＡプロ ーブと接触させ、そして（ｃ）上記の核酸に結合したプローブを検出する、こと を特徴とするディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫有効ペプチドを コードする核酸の存在を検出する方法。
63. ６３．（ａ）抗体を固体支持体に結合させ、（ｂ）殺虫有効ペプチドを含む溶液 を、固体支持体に結合した抗体と接触させて、溶液中に存在するペプチドを該抗 体に結合させ、（ｃ）固体支持体に結合した抗体に結合したペプチドを除去し、 そして（ｄ）除去したペプチドを収集する、ことを特徴とするディグエチアくも 毒液から実質的に単離しうる殺虫有効ペプチドを請求項５７の抗体を使用して精 製する方法。
64. ６４．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７で決定されるアミノ酸配列またはその部分で実質 的な配列均一性をもたせたアミノ酸配列を特徴とするプレプロ配列であって、該 プレプロ配列またはその部分が成熟ペプチドの分泌および／または折り重なりを 指示することを特徴とするプレプロ配列。
65. ６５．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７で決定されるアミノ酸配列またはその部分で実質 的な配列均一性をもたせたアミノ酸配列を操作的にペプチドに結合させたことを 特徴とする遺伝子構造体。
66. ６６．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８で決定されるアミノ酸配列またはその部分で実質 的な配列均一性をもたせた配列を特徴とするプロモーター配列であって、該プロ モーター配列が組換え構造体中の遺伝子の発現を指示することを特徴とするプロ モーター配列。
67. ６７．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８で決定されるアミノ酸配列またはその部分で実質 的な均一性をもたせた配列を操作的に遺伝子に結合させ発現させるようにしたこ とを特徴とする組換え構造体。
68. ６８．ペプチドが（ａ）長さ約５５〜約６５個のアミノ酸、（ｂ）ＳＥＱＩＤ　 ＮＯ：１、３または５により４０％以上の配列均一性、および（ｃ）７または８ 個のシスティン残基、をもつことを特徴とする殺虫有効ペプチド。
69. ６９．ペプチド源がディグエチアくも毒液である請求項６８のペプチド。