CN116157018A - 生物刺激素和生物保护肽及它们在农业中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抗植物中的非生物胁迫和生物胁迫的生物刺激素和生物保护活性的新型经分离的肽，以及包含所述肽的组合物。优选地，根据本发明的肽来自西红柿(番茄)植物，并且以重组或合成的方式生产。还描述了所述肽和/或所述组合物在增加对植物中生物胁迫和/或非生物胁迫的抗性中的用途。

Description

生物刺激素和生物保护肽及它们在农业中的用途
本发明属于农业领域，更具体地，旨在促进植物的生长和生产率的农业过程。具体地，本发明涉及赋予对植物中非生物胁迫和生物胁迫(biotic stress)抗性的生物刺激素(biostimulant)和生物保护(bioprotective)活性的新型肽。
在农业领域中，促进植物的生长、健康和生产率是必要的。这些年来，为了应对和遏制生物胁迫(即，诸如病毒、细菌、真菌和大型生物体(包括线虫、昆虫和螨虫)的微生物的攻击)以及非生物胁迫(诸如为缺水、过热、极冷或高盐度)对植物和农作物造成的损害，农业技术已经开发了不同的方法。
传统上，通过使用肥料和农药以及引入物理土壤改良剂来控制植物中的生物胁迫和非生物胁迫。然而，如果这些产品过量使用或残留在环境中，则农用化学品的使用可能具有严重的长期环境后果，并且由于可食用部分中的有毒残留物对人类健康造成显著损害。此外，由于在病原体群体中出现了对它们的作用具有抗性的菌株，因此农作物保护产品可能随时间丧失其效力。
为了限制危险策略的使用，力图通过促进植物生长和抗逆性来提高农作物的生产率，已经作出了许多努力来开发和实施生态谨慎和可持续的方法。
美国专利US5,378,819、US5,883,076和US6,022,739描述了响应于由咀嚼昆虫引起的损伤或机械损伤而分离植物肽激素系统素(Systemin)、以及所述肽参与西红柿(Solanum lycopersicum)，(番茄)植物中的防御基因的激活。
系统素是一种长度为18个氨基酸的肽激素，位于被称为系统素前体(Prosystemin，ProSys)的200个氨基酸前体的羧基末端区域的末端。植物受伤后，前体系统素前体经历蛋白水解作用，该蛋白水解作用可能是由植酸酶(phytaspase)(枯草酶属的天冬氨酸特异性蛋白酶)介导的，该植酸酶可以释放系统素。这种肽被释放到质外体(apoplast)中，通过与膜受体SYR1的相互作用，该钛激活防御信号(Narvàez-Vàsquez和Orozco-Càrdenas,(2008)“Systemins and AtPeps:Defense-related peptide signals”；In Induced plant resistance to herbivory(pp.313-328).Springer,Dordrecht；Wang等,(2018)“The systemin receptor SYR1 enhances resistance of tomato againstherbivorous insects”,Nature plants,4(3),152-156)。
在生理条件下，系统素前体基因在植物的叶片、瓣和茎中，但不在根中以飞摩尔水平表达(Pearce G.et al.,(1991)“A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor protein”,Science,253(5022),895-897；Narváez-Vásquez,J.,和Ryan,C.A.,(2004)“The cellular localization of prosystemin:afunctional role for phloem parenchyma in systemic wound signaling”,Planta,218(3),360-369)。相反地，在机械损伤或由咀嚼昆虫攻击而引起的受伤的情况下，系统素前体基因增加其表达。
通过研究转基因植物的系统素编码基因的过表达或相同基因沉默，已经广泛地证实了在番茄植物防御机制中的系统素前体/系统素的作用。具体地，在系统素前体过表达后，在昆虫的肠中检测到了蛋白酶抑制蛋白的合成的增加，从而极大地降低了它们的消化能力和随后的营养物的吸收(McGurl B.等,(1994)“Overexpression of the ProSystemingene in transgenic tomato plants generates a systemic signal thatconstitutively induces proteinase inhibitor synthesis”,Proceedings of theNational Academy of Sciences,91(21),9799-9802)。相反地，系统素前体基因的表达不足导致蛋白酶抑制剂的产生在受伤后几乎被完全抑制，从而导致植物对烟草天蛾(Manducasexta)幼虫的更大易感性(Orozco-Cardenas等,(1993)“Expression of an antisenseprosystemin gene in tomato plants reduces resistance toward Manduca sextalarvae”,Proceedings of the National Academy of Sciences,90(17),8273-8276)。
最近的研究证实了组成性表达系统素前体基因的植物可以通过激活广泛的防御信号来抵御多种生物胁迫(Coppola M等,(2015)“Prosystemin overexpression intomato enhances resistance to different biotic stresses by activating genesof multiple signaling pathways”,Plant molecular biology reporter,33(5),1270-1285)。特别地，这些植物能够释放吸引食草昆虫的捕食者和拟寄生物的挥发性化合物的混合物，从而提高植物的间接防御(Corrado G.等,(2007),“Systemin regulates bothsystemic and volatile signaling in tomato plants”,Journal of chemicalecology,33(4),669-681)，抵抗坏死性真菌(El Oirdi等,(2011)“Botrytis cinereamanipulates the antagonistic effects between immune pathways to promotedisease development in tomato”,Plant Cell 23,2405–2421)和蚜虫的攻击，更好地耐受某些病毒感染(Bubici G.等,(2017)“Prosystemin overexpression inducestranscriptional modifications of defense-related and receptor-like kinasegenes and reduces the susceptibility to Cucumber mosaic virus and itssatellite RNAs in transgenic tomato plants”,PloSone,12(2),e0171902)，并且同时耐受盐胁迫的条件(Orsini F.等,(2010)“Systemin-dependent salinity tolerance intomato:evidence of specific convergence of abiotic and biotic stressresponses”,Physiologia plantarum,138(1),10-21)。
还已知的是，缺乏系统素蛋白的系统素前体的前体蛋白的部分也能够诱导防御基因的激活。Corrado G等(2016)“The expression of the tomato prosystemin intobacco induces alterations irrespective of its functional domain”,PlantCell,Tissue and Organ Culture(PCTOC),125(3),509-519中描述的研究在烟草植物进行，该烟草织物包含结构上完全不同的、功能性直向同源物，而不是系统素前体基因，该研究表明通过用编码缺乏系统素的系统素前体的序列转化这些植物，合成了缺失的前体蛋白并导致一系列防御相关基因的激活和对真菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的更高耐受性。
尽管对系统素前体蛋白的内源性表达/过度表达的影响的研究取得了希望的结果，但基于植物基因工程工艺的农业方法无疑具有需要复杂、费力和昂贵的技术工艺的限制，从而限制了其应用范围。上述限制也伴随着困难的立法和监管问题。
因此，需要提供旨在在易于实施并且对环境的影响最小的情况下、有效地保持和改善植物福祉和健康以及提高农作物质量的方法。
本发明现在已经满足了这一需求和其他需求，本发明提供了如所附权利要求1所限定的经分离的肽、如所附权利要求8所限定的生物刺激素和生物保护组合物(biostimulant and bioprotective composition)、以及如所附权利要求13所限定的用于提高对植物中生物胁迫和/或非生物胁迫的抗性的方法。
所附的独立权利要求和从属权利要求形成本说明书的整体部分。
如将在下面的实验部分中更详细地说明的，本发明人已从系统素前体多肽中意外地分离出肽并随后产生了肽，当将这种肽外源性地施用于植物(例如，通过喷洒在叶片上或灌溉)时，该肽能够有利地在所述植物上执行生长生物刺激素活性、并同时触发针对生物胁迫和非生物胁迫的防御机制，而对病原体没有任何直接的杀生作用。
不希望受任何理论的束缚，本发明人认为，在用本发明的肽处理后，在植物中(特别是番茄植物中)诱导的对有害昆虫和真菌的抗性是通过激活参与调节植物内源性防御机制的基因来介导的(如图9所示)。
在图17-20中呈现的结果还表明，根据本发明的肽还令人惊讶地能够在经处理的植物中触发对非生物胁迫(例如，高盐度)的抗性的关键信号。
因此，本发明的一个目的是一种经分离的肽，该经分离的肽由选自由以下构成的组的氨基酸序列构成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:23-26以及至少8个氨基酸长度的SEQ ID NO:2的片段，并且具有抗植物中的非生物胁迫和生物胁迫的生物刺激素和生物保护活性，所述肽任选地在氨基末端或羧基末端与组氨酸尾缀合。
由本发明人进行的研究揭示了本发明的肽(以下称为PS1-70(SEQ ID NO.1)和PS1-120(SEQ ID NO.2))包含在系统素前体多肽的氨基(N-)末端区域，更具体地，包含在不含激素系统素的前体部分中。
在利用基于重复氨基酸基序存在的生物信息学方法进行的进一步研究的背景下，本发明人还鉴定了以下氨基酸序列构成的肽：DDAQEKPKVEHEEG(SEQ ID NO.23)、DKETPSQDI(SEQ ID NO.24)、DDAQEKLKVEYEEEEYEKEKIVEKETPSQDI(SEQ ID NO.25)和DDAQEKPKVEHEEGDDKETPSQDI(SEQ ID NO.26)。
如实验例2中所描述的，由于异常的电泳迁移曲线，发明人对本发明的肽对象的识别特别困难，并且需要复杂的调查。对所述肽的氨基酸序列的后续分析实际上揭示了在所述序列中存在已知促进结构紊乱的氨基酸残基的重要组分。
如本文中参考氨基酸序列所使用的，术语“片段”是指表示较长氨基酸序列的部分的氨基酸残基的连续序列。
根据一实施方案，经分离的肽由至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少110个或至少120个氨基酸长度的氨基酸序列SEQ ID NO.2的片段构成。
在优选的实施方案中，经分离的肽由9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120个氨基酸长度的氨基酸序列SEQ ID NO.2的片段组成。
下面的具体氨基酸序列是特别优选的：EKETPSQDI(SEQ ID NO.3)、EKETISQYI(SEQID NO.4)、DDMQEEPKVKLHHEKG(SEQ ID NO.5)、DDTQEIPKMEHEEG(SEQ ID NO.6)、DDAQEKLKVEYEEE(SEQ ID NO.7)、DDMQEEPKVKLHHEKGGDEKEKIIEKETPSQDI(SEQ ID NO.8)和DDTQEIPKMEHEEGGYVKEKIVEKETISQYI(SEQ ID NO.9).
根据一实施方案，本发明的经分离的肽对象任选地与在氨基末端(N-末端)或羧基末端(C-末端)末端处的组氨酸尾缀合。
在本发明的上下文中，术语“缀合”是指在本发明的肽的N-末端处的氨基酸与组氨酸尾的C-末端处的氨基酸之间存在共价键(如图2B和图3B中所示例的)，反之亦然，在本发明的肽的C-末端处的氨基酸与组氨酸尾的N-末端处的氨基酸之间存在共价键，无论前面是否有接头。
如本领域已知的，与组氨酸尾的缀合通常用于蛋白质科学中，因为它简化了含有过渡金属离子的基质上的蛋白纯化工艺，并且抗组氨酸尾抗体的使用也是定位和免疫沉淀研究中的有用工具。
用于制造与组氨酸尾缀合的肽的方法在现有技术中是已知，且进行了描述，例如通过表达重组蛋白质产品。
根据另一实施方案，本发明的经分离的肽对象包含乙酰化改性的氨基末端(N-末端)端和/或酰胺化改性的羧基末端(C-末端)端。如本领域中广泛描述的，上述改性有利地允许肽的稳定性及增加其对氨肽酶、外肽酶和合成酶的酶促降解的抗性增加。
本发明的另一目的是编码如上定义的经分离的肽的经分离的核酸序列。
优选地，经分离的核酸序列包括选自核苷酸序列SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的核苷酸序列、或由选自核苷酸序列SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的核苷酸序列构成。
包含如上所定义的核酸序列且任选地还包含启动子序列和多腺苷酸化信号序列的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞也在本发明的范围内。
用于制造肽或蛋白质的重组表达载体在现有技术中是已知且进行描述，因此它们的选择和使用在本领域普通技术人员的技能内。这样的载体可以是原核的或真核的。以非限制性实施例提及了PET系列(Novagen)(例如，pET15或pET30)和pGEX系列(GEHealthcare)的原核载体。
真核载体的实施例包括在毕赤酵母菌(Pichia pastoris)酵母细胞中使用的pPIC系列的那些。
优选地，用于表达本发明的表达载体的细胞系统选自原核系统，例如大肠杆菌(E.coli)细菌细胞。
替代地，表达细胞系统可以是真核系统，例如，诸如酿酒酵母菌(S.cerevisiae)和毕赤酵母菌的酵母细胞。
本发明的另一目的是用于制备本发明的肽的方法，根据所述方法，将经转化的宿主细胞在合适的条件下培养、且培养时间足以表达本发明的肽。典型地，合适的培养条件和时间取决于所使用的细胞系统，并且可以与例如培养基的组成、pH、相对湿度、O2和CO2的气体组分以及温度相关。用于本发明的方法的最合适的培养条件和时间的选择完全在本领域普通技术人员的知识和技能之内。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法另外包括从细胞培养物中回收产生的肽的步骤。回收步骤可以使用作为现有技术的一部分的蛋白纯化方法来进行，例如通过一个或多个色谱步骤(例如通过亲和色谱法、或排阻色谱法、或离子交换色谱法)或通过超滤、透析和/或冻干来进行。
用于制造根据本发明的肽的合适的替代方法包括，例如，化学合成工艺、或用于前体蛋白的蛋白酶裂解的技术，例如，通过使用特定的蛋白酶或化学试剂。在本发明的范围内用于生产肽的最合适的方法的选择落在本领域普通技术人员的技术范围内。
由于上述有利特征，根据本发明的肽特别适用于旨在改善植物生长和农作物产量的农业实践中，同时还允许正确管理土壤和环境。特别地，由于根据本发明的肽没有任何直接的杀生效果，因此由肽执行的作用有利地不会对有用的授粉昆虫种群产生有害后果。
诸如肽的小分子的使用代表本发明的另一优点，因为它们更好地适合于设计和/或改性，以便保存或扩增比活性。此外，不同于较长的蛋白(例如，全长系统素前体)，肽的小尺寸显著降低了合成和纯化成本。
因此，本发明的一个目的是抗植物中的非生物胁迫和生物胁迫的生物刺激素和生物保护组合物，该生物刺激素和生物保护组合物包含至少一种如上定义的肽或它们的任何组合，以及至少一种佐剂、稳定剂和/或防腐剂。组合物中的至少一种佐剂、稳定剂和/或防腐剂优选在农业技术中常规使用的，以允许例如在植物或种子上更好地均匀分布和/或避免过度起泡。
适于在根据本发明的组合物中使用的佐剂中，通过非限制性实施例提及了保湿剂、润湿剂和消泡剂。
示例性消泡剂包括硅氧烷、山梨醇和硅的混合物。
示例性的保湿剂或润湿剂包括表面活性剂化合物，例如十二烷基硫酸钠和甜菜碱、萜烯和醇的混合物。
本发明的组合物中的稳定剂包括例如pH调节剂，该pH调节剂包括柠檬酸、乙酸、氢氧化钠。
适于在本发明的生物刺激素和生物保护组合物中使用的防腐剂的实施例包括脱氢乙酸、苯甲酸、乙基己基甘油和苯氧基乙醇。
适于在根据本发明的组合物中使用的至少一种佐剂、稳定剂和/或防腐剂的选择落入本领域普通技术人员的技能内。
在一实施方案中，本发明的组合物至少包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的肽。
在另一实施方案中，本发明的组合物包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.3的肽与具有氨基酸序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8的肽的组合。
在又一实施方案中，本发明的组合物包含以下肽的组合：
具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID No.8的氨基酸序列的肽；以及
具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列的肽.
在另一实施方案中，本发明的组合物包含以下肽的组合：
具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列的肽；
在另一实施方案中，本发明的组合物包含以下的肽组合：
具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.23的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.24的氨基酸序列的肽；
具有SEQ ID NO.25的氨基酸序列的肽；和
具有SEQ ID NO.26的氨基酸序列的肽。
根据欧洲生物刺激素工业理事会(European Biostimulant Industry Council，EBIC)制定的官方定义，术语“生物刺激素”是指当施用于植物或根围时，其作用是刺激自然过程以改善/促进营养吸收、营养效率、农作物质量和耐受非生物胁迫的物质和/或微生物。
在本发明的范围内，术语“生物保护物(bioprotector)”是指在施用到植物或根围之后诱导激活植物抗生物胁迫和非生物胁迫的天然防御的物质和/或微生物。
如本文所使用的，术语“植物”是指活的多细胞植物生物体。
优选地，植物属于选自由以下构成的组的科：茄科(Solanacee)，例如西红柿和茄子(Solanum melongena)；葡萄科(Vitacee)，例如葡萄(Vitis vinifera)；蔷薇科，例如苹果(Malus domestica)；木犀科(Oleaceae)，例如油橄榄；以及它们的组合。
参考生物胁迫，通过非限制性实施例提及了食草昆虫、植物病原真菌、植物病原细菌和病毒。
在这种情况下，食草昆虫优选选自有以下构成的组：鳞翅目昆虫，例如海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)和番茄潜叶蛾(Tuta absoluta)；植物螨类，诸如蚜虫，例如马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae)；同翅目昆虫，例如烟粉虱(Bemisia tabaci)和白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)；以及它们的组合。
植物病原真菌优选选自由以下构成的组：灰葡萄孢菌、链格孢菌(Alternariaalternata)、茄链格孢菌(Alternaria solani)以及它们的组合。
植物病原细菌优选为洋丁香病假单胞菌(Pseudomonas syringae)细菌。
病毒优选选自番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)和黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus)。
在非生物胁迫中，虽然不是排他地，但例如提到了引起例如冻结、高温、干旱、高光强度、低光强度、过量盐分、过量水分及它们的组合的低温。
优选地，根据本发明的组合物还包含缓冲剂。在适用于本发明的生物刺激素和生物保护组合物的缓冲剂中，特别优选磷酸盐缓冲剂，甚至更优选磷酸盐缓冲盐水。然而，应当理解的是，在本发明中可以使用其它缓冲剂，其他缓冲剂的选择落入本领域普通技术人员的技能之内。
优选地，所述至少一种肽以0.02皮摩尔(pM)至100pM、更优选0.02pM至0.08pM、或0.085pM至0.1pM、或0.095pM至0.25pM、或1pM至100pM的浓度存在于根据本发明的生物刺激素和生物保护组合物中。
根据本发明的优选实施方案，所述生物刺激素和生物保护组合物还包括选自由以下构成的组的微生物：菌根真菌、腐生真菌、植物生长促进细菌(plant growth promotingbacteria)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)孢子及它们的任意组合。
如本领域已知的，地下菌根真菌与许多农作物的根建立共生体(symbiotic)，对所涉及的生物体互惠互利。更具体地，菌根真菌能够代谢土壤中存在的矿物元素，即使它们被固定到土壤的吸收能力，而植物为共生真菌提供通过光合作用产生的糖。
在本发明的范围内，菌根真菌优选选自由以下构成的组：束花蓝钟花巨孢囊霉(Gigaspora fasciculatus)、缩球囊霉(Glomus constrictum)、扭形球囊霉(Glomustortuosum)、地球囊霉(Glomus geosporum)、珠状巨孢囊霉(Gigaspora margarita)、细凹无梗囊霉(Acaulospora scrobicurata)以及它们的任何组合。
在本发明的范围内，腐生真菌优选属于木霉属(Trichoderma)。
已知的是，腐生真菌对其降解土壤中的死植物和死动物的有益活性是已知的。
根据本发明，高度优选包含至少一种如上定义的肽的生物刺激素和生物保护组合物与属于木霉属的腐生真菌组合，因为所述组合(如图15所示)对植物病原体具有明显的协同作用。
在本发明的范围内，促进植物生长的细菌优选选自伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)和萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
苏云金芽孢杆菌是一种天然存在于土壤中的孢子生细菌，已知在不利条件下产生含有具有杀虫作用的内毒素的孢子和类芽孢体(通常称为晶体)。在被敏感的昆虫摄入后，这些内毒素会从类芽孢体释放，并且导致肠上皮细胞溶解，从而导致昆虫瘫痪和死亡。
更优选地，根据本发明的组合物中的孢子来自细菌苏云金芽孢杆鲇泽亚种(Bacillus thuringiensis subspecies aizawai)。
根据本发明，生物刺激素和生物保护组合物可以是冻干剂的形式。在这种实施方案中，根据本发明的组合物在室温下稳定至少3个月。
在另一实施方案中，本发明的组合物可以是水系液体组合物(water-basedliquid composition)或磷酸盐缓冲盐水的形式。在这种形式中，根据本发明的组合物可以原样使用或在使用前稀释。
用于增加植物中对生物胁迫和/或非生物胁迫的抗性的方法，该方法包括将如上定义的生物刺激素和生物保护组合物施用到植物、植物的部分、植物繁殖材料和/或植物生长位点的步骤，该方法也在本发明的范围内。
根据本发明的方法，生物刺激素和生物保护组合物可以以各种形式施用于各种植物或植物的部分，例如叶片、叶芽、树枝、茎、树皮、花、花蕾、果实、根、种子、鳞茎、块茎和/或芽。
如本文所用，术语“繁殖材料”是指可以从中衍生植物或植物部分的任何植物材料。作为非限制性实施例，提及了种子、幼苗、插枝、接穗、根茎、外植体、鳞茎、块茎、以及它们的组合。
另外地或替代地，根据本发明的组合物可以施用于植物生长位点。
在一实施方案中，植物在土壤中生长，并且根据本发明的组合物的施用可以例如在整个种植表面上、在一个或多个犁沟中和/或其周围、在播种孔中、在茎或树干下面的区域中、和/或在根之间的区域中进行。
在另一实施方案中，植物是从土壤中生长出来的或无土栽培。在土壤外或无土栽培方法中，作为非限制性实施例提及了水培栽培技术，其中土壤被惰性基质替代，例如膨胀粘土、椰子纤维、岩棉或沸石，并且植物通过由水和无机元素(例如，Mg(NO3)2·6H2O、Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、K2SO4、KH2PO4)构成的溶液吸收营养物，该无机元素的目的是提供植物生物体的正常矿物营养所需的所有物质。水培栽培实践的很大优点在于，由于不使用农药、除草剂和植物保护产品，无论是从质量角度还是从卫生和清洁角度来看，这种栽培技术允许全年恒定且受控的产量。
本发明的生物刺激素和生物保护组合物可以通过常规方法施用于植物、植物的部分、植物繁殖材料和/或植物生长位点，该常规方法例如通过喷洒、雾化、喷雾、铺展或灌溉(用手、利用拖拉机、用飞机等)。
根据优选的实施方案，本发明的组合物通过在植物或植物部分上(优选地在叶片上)喷洒或雾化来施用。
根据另一优选的实施方案，本发明的组合物通过灌溉(即，直接到土壤中)施用，例如以灌溉液体的形式或通过注射到土壤中。
在水培栽培的情况下，根据本发明的方法提供了将生物刺激素和生物保护组合物在营养物溶液中施用至植物。
根据本发明的一实施方案，该方法包括施用该组合物至少两次，优选4次，更优选5次。
在这种实施方案中，在植物上的一次施用(例如，第一次、第二次、第三次、第四次或第五次施用)与随后的施用之间的时间间隔可以在约3周至约4周的范围内。
本发明的另一目的是使用先前定义的经分离的肽或先前定义的生物刺激素和生物保护组合物来提高对植物中生物胁迫和/或非生物胁迫的抗性。
下面的实验章节仅用于说明目的，并不限制所附权利要求中定义的本发明的范围。在实验章节中，参考附图，其中：
图1示出了本发明人用于重组生产本发明的肽所使用的克隆载体pETM11的示意图。
图2示出了在克隆到载体pETM11中之后包含编码肽PS1-70的核苷酸序列的插入物的示意图。(A)通过桑格(Sanger)测序获得的重组插入物(SEQ ID NO.12)的序列。正确插入到克隆载体中的编码肽PS1-70(SEQ ID NO.10)的核苷酸序列用黑色下划线表示；编码用于组氨酸尾(His-标签)(SEQ ID NO.14)的序列以粗体大写字母突出显示；位于组氨酸尾的下游以允许去除后者的烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)蛋白酶识别位点(SEQ IDNO.16)以灰色下划线的大写斜体突出显示。用于扩增和克隆编码肽PS1-70的核苷酸序列的正向引物P11F1(SEQ ID NO.17)和反向引物P11R1(SEQ ID NO.18)的序列分别以浅灰色和深灰色突出显示。B)肽PS1-70的氨基酸序列(粗体，SEQ ID NO.1)在N-末端位置与组氨酸尾的C-末端(下划线的序列，SEQ ID NO.15)缀合。
图3示出了在克隆到载体pETM11中之后、包含编码肽PS1-120的核苷酸序列的插入物的示意图。(A)通过桑格测序获得的重组插入物的序列(SEQ ID NO.13)。正确插入到克隆载体中的编码肽PS1-120(SEQ ID NO.11)的核苷酸序列用黑色下划线表示；编码用于组氨酸尾(His-标签)(SEQ ID NO.14)的序列以粗体突出显示；位于组氨酸尾的下游以允许去除后者的烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶识别位点(SEQ ID NO.16)以灰色下划线的大写斜体突出显示。用于扩增和克隆编码肽PS1-120的核苷酸序列的正向引物P11F1(SEQ ID NO.17)和反向引物P11R3(SEQ ID NO.19)的序列分别以浅灰色和深灰色突出显示。(B)肽PS1-120的氨基酸序列(粗体，SEQ ID NO.2)在N-末端位置与组氨酸尾的C-末端(下划线的序列，SEQ IDNO.15)缀合。
图4为示出了分别用于扩增和克隆分别编码肽PS1-70和PS1-120的核苷酸序列的引物的核苷酸序列和特性的表。
图5示出了亲和色谱(affinity chromatography，IMAC)的结果、通过15％SDS-PAGE电泳分析洗脱级分的结果、和对在经纯化的PSA-70和PS1-120肽上执行的蛋白质印迹(Western blot)分析的结果。(A1和B1)分别用150mM和50mM咪唑洗脱的肽PS1-70和PS1-120的纯化的第一步骤的色谱图。(A2和B2)洗脱级分的聚丙烯酰胺凝胶分析；M：分子量标记；黑色矩形：含有肽PS1-70和PS1-120的洗脱级分。(A3和B3)通过蛋白质印迹分析鉴定肽PS1-70和PS1-120；M：分子量标记；黑色矩形：PS1-70肽和PS1-120肽。
图6示出了排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)的结果、和通过15％SDS-PAGE电泳分析洗脱级分的结果。(A1和B1)肽PS1-70和PS1-120的纯化的第二步骤的色谱图，肽PS1-70和PS1-120分别在12.16ml和10.92ml的洗脱体积处具有洗脱峰。(A2和B2)洗脱级分的聚丙烯酰胺凝胶分析；M：分子量标记；黑色矩形：含有肽PS1-70和PS1-120的洗脱级分。(A3和B3)肽PS1-70和PS1-120的去卷积质量。
图7示出了肽PS1-70(A)和PS1-120(B)的氨基酸组成的分布。该图的曲线图表明，与促进有序二级结构(浅灰色)的氨基酸相比，所述肽的氨基酸序列都包含促进结构紊乱(深灰色)的氨基酸的显著表示。
在图8中，曲线图A和曲线图B示出了由如实施例1和实施例2中所描述的在pH8.0的肽PS1-70(A)和PS1-120(B)上通过SEC-MALS-QELS进行的光散射实验的结果。曲线的峰代表溶液中的单体蛋白质。图8(C、D)示出了在10mM磷酸盐缓冲液中、分别使用浓度为4.4μM和3.5μM的PS1-70和PS1-120肽在20℃的温度下记录的经纯化的PS1-70肽(C)和PS1-120肽(D)的二向色性光谱。横坐标轴示出波长(nm)，纵坐标轴示出平均残基摩尔椭圆率值。
图9示出了在100pM和100fM浓度下叶面施用肽PS1-70和PS1-120后6小时(A、C)和24小时(B、D)番茄植物中诱导基因表达的相对定量。分析在Lox C、AOS、Pin I和Pin II基因上进行的。字母a、b、c表明数据的统计显著性(ANOVA)，每个字母表示统计组。
图10示出了用肽PS1-70和PS1-120处理番茄植物叶片对海灰翅夜蛾(S.littoralis)鳞翅目昆虫幼虫的影响。柱状图(A、C)示出了用分别在100pM和100fM下用肽PS1-70和肽PS1-120处理的叶片喂养的幼虫、以及在随后几天测量的相关对照的平均重量(以克表示)的变化。字母a、b表明数据的统计显著性(ANOVA)，每个字母表示统计组。曲线图(B、D)示出了每天记录的用本发明肽和相关对照处理的番茄植物叶片喂养的幼虫的死亡率(对数秩检验；***p<0.0001)。
图11示出了用肽PS1-70和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8处理番茄植物叶片对海灰翅夜蛾鳞翅目昆虫幼虫的影响。柱状图(A)示出了在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19天测得的用上面提及的肽和相关对照处理的叶片喂养的幼虫的平均体重(以克表示)的变化。字母a、b表明数据的统计显著性(ANOVA)，每个字母表示统计组。图表(B)示出了每天记录的用本发明的肽和相关对照处理的番茄植物叶片喂养的幼虫的死亡率(对数秩检验；***p<0.0001)。
图12示出了与未处理的对照相比，用PS1-70和PS1-120肽处理后番茄植物叶片(A、B)、茄子叶片(C)和葡萄植物叶片(D)上的坏死性灰葡萄孢菌真菌产生的坏死面积的减少。接种病原体后1、3、5和8天测量平均坏死面积。字母a、b、c、d表明数据的统计显著性(ANOVA)，每个字母表示统计组。
图13示出了与未经处理的对照相比，用PS1-70、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQID NO.8处理后番茄植物叶片上坏死性灰葡萄孢菌真菌产生的坏死区域减少。接种病原体后1、3、5和8天测量平均坏死面积。字母a、b、c、d表明数据的统计显著性(ANOVA)，每个字母表示统计组。
图14示出了与未经处理的对照相比，在用肽PS1-70和PS1-120(A)以及用PS1-70、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8(B)处理后番茄植物叶片上的坏死性链格孢菌(A.alternata)真菌产生的坏死面积的减少。接种病原体后1、3、5和8天测量平均坏死面积。字母a、b表明数据的统计显著性(ANOVA)，每个字母表示统计组。
图15示出了肽PS1-70、PS1-120和系统素(Sys)与哈茨木霉(Trichodermaharzianum)T22菌株孢子组合处理对4周生植物(从与木霉T22孢子共感染的种子中产生)的影响、对海灰翅夜蛾鳞翅目昆虫幼虫的存活的影响(A1、A2和A3)、以及坏死性灰葡萄孢菌病菌(B1)和链格孢菌(B2)真菌在叶片的定殖(colonization)的影响。每天测量幼虫存活率(对数秩检验；；***p<0.0001)，每个字母代表一个统计组。接种病原体后1、3、5和8天测量平均坏死面积。字母a、b、c、d、e、f表明数据的统计显著性(ANOVA)，每个字母表示统计组。
图16示出了在用100fM的肽PS1-70和PS1-120悬浮液处理的种子和相应的对照中，4周龄番茄植物叶片上由坏死性灰葡萄孢菌真菌产生的坏死面积的减少。接种病原体后1、3和5天测量平均坏死面积。字母a、b表明数据的统计显著性(ANOVA)，每个字母表示统计组。
图17示出了在不存在盐(A)(0mM的NaCl)和存在盐(B)(80mM的NaCl)的条件下、用浓度为100pM的PS1-70肽灌溉的番茄植物中诱导的基因表达的相对定量。在cat1、tft1、Sam、HSFA2、HSP70、HSP90、MPK1和WRKY40基因上进行分析。星号表明通过学生t检验的数据的统计学显着性(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图18示出了在不存在盐(0mM的NaCl)、存在盐(B)(150mM的NaCl)和相关对照的条件下、用肽PS1-70，PS1-120和SEQ ID NO.5(100fM)灌溉的番茄植物中诱导的基因表达的相对定量。在CAT2(A)、SAM(B)和APX2(C)基因上进行分析。星号表明通过学生t检验的数据的统计学显着性(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图19示出了在不存在盐(0mM的NaCl)、存在盐(150mM的NaCl)和相关对照的条件下、用肽PS1-70，PS1-120和SEQ ID NO.5(100fM)灌溉的植物叶片中的平均脯氨酸含量。字母a、b、c表明数据的统计显著性(ANOVA)，每个字母表示统计组。
图20示出了用100fM浓度的肽PS1-70、PS1-120和SEQ ID NO.5灌溉处理对番茄植物的生物计量参数的效果。柱形图(A)示出了在不存在盐(0mM的NaCl)和存在盐(150mM的NaCl)、以及相关对照的条件下，用本发明的肽对象处理的植物和相关对照的根面积(以平方厘米表示)。柱形图(B)示出了在不存在盐(0mM的NaCl)的情况下，用本发明的肽对象处理的植物和相关对照中的地上部分的新鲜重量(fresh weight)(以克表示)的变化。星号表明通过学生t检验的数据的统计学显着性(*p<0.05)。
图21示出了在增加的浓度下对海灰翅夜蛾幼虫(如实施例4所示)测定的、本发明的肽的直接毒性作用的评估结果的表格。将肽PS1-70和PS1-120注射或施用于表皮，记录幼虫在蛹(chrysalis)阶段的存活率。
图22示出了当添加到以下两种不同真菌的生长培养基中时，在增加的浓度下测定的本发明肽的直接毒性作用的评估：灰葡萄孢菌(A)PS1-70和PS1-120，(B)PS1-80、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8，以及木霉T22，(C)PS1-90和PS1-10。在添加本发明的肽24小时后，作为培养基的浊度水平(600nm处的吸光度)来测量真菌的生长情况。字母a、b表明数据的统计显著性(ANOVA)，每个字母代表一个统计组。
实施例1：根据本发明的肽的生产
克隆、表达和纯化
为了分离编码本发明的肽的核苷酸序列，使用扩增引物对以及使用编码全长系统素前体的cDNA作为模板来建立PCR反应，该扩增引物对的序列在图4的表中示出。
使用NcoI和XhoI限制性酶消化扩增子，随后克隆到先前用相同酶消化的pETM11载体中。pETM11(EMBL提供，海德堡)是原核表达载体，pETM11能够在经克隆的蛋白的氨基(N-)末端部分处添加6个组氨酸(His-tag)的尾，并且在His-标签序列的下游具有TEV(TobaccoEtch Virus，烟草蚀纹病毒)蛋白酶识别位点，以允许除去后者(图1)。
通过测序获得的构建体来确认在扩增反应期间发生的克隆片段的完整性和不存在可能的突变(图2A和3A)。在初始筛选之后，在22℃、2mM IPTG的LB和2-YT培养基中，将本发明的肽PS1-70和PS1-120在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株中大规模表达16小时。图2B和图3B分别示出了获得的肽PS1-70(SEQ ID NO.1)和PS1-120(SEQ ID NO.2)的氨基酸序列(以粗体突出显示)，每个肽在N-末端处缀合到组氨酸尾的C-末端(以下划线突出显示)。
表达后，在通过亲和色谱(IMAC)(图5)和排阻色谱(SEC)(图6)在FPLC-
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(通用电气医疗集团)上在室温下执行肽的纯化，获得的产率为2mg/L细胞培养物。
肽合成
具有序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8的本发明的肽是使用标准方案通过固相化学合成而生产的(Chandrudu S.等,“Chemical methods for peptide andprotein production”；Molecules.2013Apr 12；18(4):4373-88)。这种工艺涉及树脂的使用，这使得可以获得通过羧基末端处的酰胺化改性的肽。在合成结束时，肽的氨基末端也通过乙酰化来改性。通过反相HPLC进行纯化。
实施例2：根据本发明的肽结构的分析
在鉴定本发明肽的过程中，本发明人遇到了相当大的困难，这是由于PS1-70和PS1-120肽的特殊特性，主要是它们的一级序列中显著存在促进结构紊乱的氨基酸残基(图7)。当经受SDS-PAGE电泳时，肽PS1-70和PS1-120都表现出异常迁移，相对于它们的实际重量(MW PS1-70＝11kDa；MW PS1-120＝17kDa)以20-25kDa的表观分子量迁移，质谱再次确认了两种重组肽的确切分子量(图6、A3和B3)。
此外，在排阻色谱法(SEC)期间，肽PS1-70和PS1-120分别示出了12.16ml和10.92ml的保留量(图6)，表明是低聚物或低致密的蛋白。由SEC-MALS-QELS进行的光散射实验示出了，无论保留量如何，本发明的肽以单分散的单体蛋白形式存在于溶液中，该肽的分子量分别是PS1-70为9.36±0.6kDa,PS1-120为19.98±1.5kDa，与理论结果一致(图8A、图8B)。
然后通过圆形二色性(circular dichroism，CD)分析肽PS1-70和PS1-120的二级结构。对于两种测试的肽，所获得的远紫外CD光谱在198nm和190nm处均示出了负摩尔椭圆率值。然而，在200nm和222nm处观察到的椭圆率值表明存在一些二级结构(图8C、图8D)。上述特征是具有较大非结构化部分的无序化蛋白的典型特征。这可能既与导致内在排斥的大量酸性残基(在生理pH值下带负电)有关，又与通常有助于蛋白正确折叠的低含量疏水残基有关。
实施例3：通过根据本发明的肽在植物中诱导防御基因表达
为了测试本发明的肽的生物活性，本发明人进行研究以测量在番茄植物上施用肽PS1-70和PS1-120后番茄植物中防御基因的表达。通过将2μl包含肽的水性组合物施加到4周龄番茄织物的展开叶片上侧的几个点上，在1X PBS缓冲液(0.14M的NaCl，0.0027M的KCl，0.01M的磷酸盐缓冲液，pH 7.4)中，在皮摩尔(pM)和飞摩尔(fM)浓度下测定所述肽。
在施用本发明的肽6小时和24小时后取叶片样品、以进行RNA提取和随后的基因表达分析。特别地，选择并测试了已知与植物防御相关的四个基因：两个在导致茉莉酸(Jasmonic Acid，JA)形成的十八烷类生物合成途径中有活性的早期表达基因，诸如，脂氧合酶C基因(Lox C)和丙二烯氧合酶基因(allene oxide synthase gene，AOS)；以及两个晚期表达基因，诸如，蛋白酶I抑制剂(Pin I)和蛋白酶II抑制剂(Pin II)基因。
在两种测试浓度下外源施用本发明的两种肽后，所有检测的基因都显著过度表达(图9)。
实施例4：根据本发明的肽促进对植物中的生物胁迫的抗性
为了证明本发明的肽能够促进植物对病原生物体的抗性，本发明人进行了研究以评估用具有氨基酸序列SEQ ID NO.1(PS1-70)、SEQ ID NO.2(PS1-120)、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5和SEQ ID NO.8的肽处理植物所产生的对食草昆虫或植物病原真菌的影响。更具体地说，本发明人监测了两个不同的参数，即海灰翅夜蛾(对番茄植物产生相当大损害鳞翅目昆虫)的幼虫的体重增加和存活率的变化、以及植物病原坏死性灰葡萄孢菌真菌和寄生性链格孢菌真菌在植物的定殖，该灰葡萄孢菌真菌是引起番茄灰霉的药剂。
对海灰翅夜蛾幼虫的实验
简而言之，海灰翅夜蛾幼虫在25℃、70％相对湿度(RH)的气候箱中、以16小时光照和8小时黑暗光的周期、人工饲料喂养直至第一次换羽完成。对于生物测定，每个论题的150只幼虫在番茄叶片上生长整个第二龄期，以适应不同的饮食。新换羽的第三龄期幼虫用植物喂养，直至换羽期，在植物上，以100pM和100fM浓度的1X PBS缓冲液施用含有PS1-70和PS1-120肽的组合物。以仅用1X PBS缓冲液处理过的植物喂养的幼虫作为对照。在相同的环境条件下，在含有1.5％(w/v)琼脂和0.005％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯的32-孔塑料托盘中进行生物测定，这有助于创造用于维持番茄叶片的细胞膨胀的潮湿环境。每个实验组由32个幼虫构成。每天监测幼虫的存活，每隔一天监测体重。与用对照叶片喂养的幼虫相比，用本发明的肽处理过的叶片喂养的幼虫在整个生物测定期体重下降，两种浓度早在第3天就开始出现显著差异。特别地，在生物测定的第15天，对于100pM浓度，用对照叶片喂养的幼虫具有38mg的平均重量，而用经肽PS1-70和PS1-120处理的叶片喂养的幼虫分别具有15mg和20mg的平均重量(图10A)。在使用100fM的浓度的本发明的肽进行的生物测定中，在第13天，用对照叶片喂养的幼虫具有44mg的平均重量，而用经肽PS1-70和PS1-120处理的叶片喂养的幼虫分别具有11mg和12mg的平均重量(图10C)。在这两种试验中也观察到，与用对照植物叶片喂养的幼虫相比，用经本发明的肽处理过的植物叶片喂养的幼虫的存活率显著下降(图10B和10D)。事实上，在生物测定的第15天，对于用对照叶片喂养的幼虫观察到96.87％的存活率，并且对于用100pM浓度的本发明的肽处理的叶片喂养的幼虫分别观察到34.37％和31.25％的存活率(图10B)。在100fM浓度下进行的生物测定中，在第13天，用对照叶片喂养的幼虫观察到100％的存活率，而用本发明的肽处理过的叶片喂养的幼虫分别观察到0％和21.87％的存活率(图10D)。
本发明人通过用肽PS1-70处理的叶片和用具有飞摩尔浓度的序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.8的肽处理的叶片喂养海灰翅夜蛾幼虫来进行相同的测定方案。与对照叶片相比，用经处理的叶片喂养的幼虫从第3天开始重量显著降低(图11)。特别地，在生物测定的第13天，用对照叶片喂养的幼虫的平均重量为59mg，而用肽PS1-70、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5处理叶片喂养的幼虫的平均重量分别为22mg、13mg、24mg和21mg(图11A)。与用对照叶片喂养的幼虫相比，观察到用肽处理的叶片喂养的幼虫存活率也显著降低(附图11B)。实际上，在生物测定的第13天，对于用对照叶片喂养的幼虫观察到100％的存活率，而对于用PS1-70、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.3和SEQ ID No.5处理过的叶片喂养的幼虫分别观察到31.25％、15.62％、43.75％和15.62％的存活率(图11B)。
在灰葡萄孢菌和链格孢菌上的实验
为了对植物植物病原性灰葡萄孢菌和链格孢菌真菌执行测定，本发明人使用了从固体PDA(Potato Dextrose Agar，马铃薯葡萄糖琼脂)产孢基质上培养获得的这种微生物的孢子。用20μl分生孢子悬浮液、以1×106孢子/ml浓度的接种平板，并在存在扩散光的条件下于25℃温育15天，以获得完整的产孢。然后将孢子收集在5ml无菌水中，并且为了除去菌丝体，通过玻璃棉过滤、用无菌蒸馏水洗涤、并通过在室温下离心收集。采用用于孢子计数的伯克细胞计数室连续稀释法测定适宜接种的孢子浓度(105-107孢子/ml)。
通过为每个经处理的番茄植物和每个对照植物取复叶、在经分离的叶片上进行测定。在复叶的每个初生叶上标上3个标记，从而指导后续孢子的施用和病原体形成坏死区域的检测。
通过施用2μl包含100pM、100fM浓度的本发明的肽PS1-70和PS1-120的组合物来处理叶片，或通过施用1X PBS(用于对照叶片来处理叶片。6小时后(即感知肽所需的时间)，将叶片从植物上分离并在神经间隙和先前标记的点附近接种10μl孢子溶液。通过在接种病原体后1、3、5、8天测量坏死面积(以mm2表示)来进行监测。对照叶片上记录的坏死区域比用经本发明的肽处理的植物上检测到的坏死区域大得多。这种差异随着接种时间的推移而增加。从接种病原体的第一天到第八天，皮摩尔处理的抗性诱导作用已经具有统计学意义，在对照叶片上达到33mm2的值，与经处理的叶片不同，两种多肽的记录值都不超过18mm2(图12A)。
在施用飞摩尔浓度的本发明的肽对象后观察到类似的结果。特别地，早在接种植物病原菌的第1天，与对照叶片上的坏死区域相比，观察到在经处理的叶片上的坏死区域的发展的明显降低。这种降低持续到第8天，对照叶片达到20mm2的值,用PS1-70和PS1-120处理的叶片分别达到6.69mm2和5.19mm2的值(图12B)。
本发明人还进行了旨在确定在皮摩尔和飞摩尔浓度下外源施用本发明的肽对茄科(Solanum melongena，茄子)植物(图12C)和葡萄(葡萄树)植物(图12D)上的坏死性真菌发展的影响的测试。
如图12C所示，所进行的测试表明，与对照植物相比，经处理的植物的真菌定植显著减少，并且在用最低浓度的本发明的肽处理后观察到最显著的作用。从接种病原体的第3天到第8天，处理的正作用有统计学意义，在对照叶片上达到了11mm2的值，不同于经处理的叶片，用100pM浓度的肽PS1-70和PS1-120处理的叶片上记录的值为8.4mm2和6.0mm2，用100fM浓度的肽处理的叶片上记录的值为6.2mm2和4.10mm2(图12C)。在葡萄植物上也得到了类似的结果(图12D)。。从接种病原体的第1天到第8天，处理的正作用有统计学意义，在对照叶片上达到了43mm2的值，并且用100pM浓度的PS1-70和PS1-120肽处理过的叶片分别达到16.7mm2和13.6mm2的值，用100fM浓度的所述肽处理过的叶片分别达到12mm2和11.8mm2的值(图12D)。在橄榄树上也得到了类似的结果。
还评估了在番茄叶片上在飞摩尔浓度下施用具有序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8的肽对灰葡萄孢菌真菌的生长的影响。
如图13所示，对照叶片上记录的坏死区域比用本发明的肽处理的植物上检测到的坏死区域要大得多。从接种病原体的第1天开始，处理的正作用就具有统计学意义，一直持续到第8天，在对照叶片上达到11.72mm2的值，在用100fM浓度的PS1-70、SEQ ID NO.8、SEQID NO.3和SEQ ID NO.5处理的叶片上分别达到7.69mm2、7.67mm2、8.89mm2和6.81mm2的值(图13)。
本发明人还进行了旨在确定外源施用本发明的肽对番茄植物抗坏死性链格孢菌真菌生长的影响的试验(图14)。
如图14A和14B所示，所进行的试验表明，与对照植物相比，经处理的植物的真菌定植显著减少。从接种病原体的第1天到第8天，处理的正作用有统计学意义，在对照叶片上达到了24mm2的值，不同于经处理的叶片，用100fM浓度的PS1-70和PS1-120肽处理的叶片上记录的值为8.4mm2和8.0mm2(图14A)；在对照叶片上记录的值为17mm2，用PS1-70、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5肽处理的叶片上记录的值分别为8.3mm2、7.9mm2、8.9mm2和7.8mm2。
根据本发明的肽与木霉T22孢子组合的活性
本发明人进行了进一步的研究，以便确定飞摩尔浓度下本发明的肽与木霉T22孢子组合处理番茄植物对降低海灰翅夜蛾幼虫(A1,A2,A3)的存活率以及坏死性霉菌(B1)和链格孢菌(B2)真菌的生长的影响(图15)。
番茄种子用哈兹木霉T22菌株孢子的悬浮液(1X107孢子/ml)处理、或用水处理以作为对照，在24℃的无菌吸附纸上避光干燥并发芽。4周龄植物叶片通过施用2μl的100fM浓度下含有系统素(Sys)、PS1-70或PS1-120肽的组合物或1X PBS(用于对照叶片)来进行处理。6小时后(即感知多肽所需的时间)，从植物中分离叶片以海灰翅夜蛾幼虫和两种坏死性真菌灰葡萄孢菌和链格孢菌进行测定。
对于海灰翅夜蛾幼虫的测定，每天监测幼虫的存活情况。另一方面，为了监测两种植物病原真菌的生长，在之前处理过的番茄叶片上接种10μl孢子溶液(1X106孢子/ml)后，第1、3、5、8天测量坏死区域(以mm2表示)。
图15示出了与单独使用木霉T22或单独使用肽相比，用测试的肽与木霉T22组合处理在对抗幼虫的生长和存活方面产生令人惊讶的协同作用，并且对两种植物病原真菌的定殖具有显着更高的保护。这些效果的证据随着时间的推移而增加。此外，本发明的肽(单独使用或与木霉T22孢子组合使用)所产生的效果已被证明优于肽系统素。
根据本发明的肽的种子保护效果
本发明人还评估了通过用本发明的肽对象直接对种子进行处理所赋予的保护效果。用100fM浓度的含有肽的组合物或用1X PBS(作为对照)处理番茄种子，在24℃的无菌吸附纸上避光干燥并发芽。从4周龄植株分离叶片，在神经间隙和先前标记点附近接种10μl孢子溶液。如图16所示，该测试表明，与对照植物相比，用PS1-70和PS1-120处理过的种子生长的植物叶片上的真菌定植显著减少。
从接种病原菌的第1天到第8天，处理的正作用有统计学意义，在对照叶片上达到了11mm2的值，用100fM浓度的PS1-70和PS1-120肽处理的种子生长的植株的叶片上达到了7.1mm2和7.4mm2的值(图16)。本发明人进行了进一步的研究，以研究肽PS1-70和PS1-120对测试的病原生物体是否存在直接毒性作用。从图21表中报道的数据可以看出，本发明的肽通过口服或注射施用到海灰翅夜蛾幼虫的表皮中对其存活和发育没有影响。
此外，如图22A和图22B所示，当在生长培养基中加入本发明的肽PS1-70和PS1-120时，灰葡萄孢菌真菌的发育不受干扰。对哈兹木霉T22菌株进行了进一步的研究，如图22C所示，添加100pM和100fM浓度的肽PS1-70和PS1-120对真菌的发育没有影响。相反地，当将肽PS1-70添加到生长培养基中时，观察到T22真菌的生长增加，这表明真菌可能使用这种蛋白作为氨基酸的来源。
总之，上述实验结果表明，本发明的肽对象是具有生物活性的，并且其外源施用促进植物中对有害昆虫和真菌的抗性。
实施例5：根据本发明的肽促进对植物中非生物胁迫的抗性
在它们的研究期间，本发明人还建立了旨在验证本发明的肽在促进植物对各种非生物胁迫方面的抗性的功效的实验。
通过所进行的实验，发明人首先发现，将本发明的肽施用在番茄植物上会导致它们的生物量的增加，并且有利于产生具有更多种子数量的更大浆果。如在图17中所示，后续实验的结果示出了肽PS1-70的施用保护番茄植物免受盐胁迫的影响。简而言之，用100pM浓度的PS1-70肽灌溉48小时后，与对照植物不同的是，经处理的植物能够激活一系列响应于盐胁迫的基因和转录因子，从而证明本发明的肽能够刺激植物的警报状态(称为启动)。此外，在存在中等的盐胁迫(80mM的NaCl)的条件下，用本发明的肽处理的番茄植物比未经处理的对照植物对盐更耐受，特别示出了响应于这种胁迫的基因的更强诱导(图17B)。还建立了实验来验证当以飞摩尔浓度施用时，肽PS1-70、PS1-120和SEQ ID NO.5在促进对高盐胁迫条件的耐受性方面的效率。如图18所示，在用PS1-70、PS1-120和SEQ ID NO.5肽灌溉8天后，与对照植物不同，经处理的植物能够激活一系列响应于盐胁迫的基因，从而证实了本发明的肽即使在飞摩尔浓度下也能够刺激启动防御状态(图18A1、18B1和18C1)。此外，与未处理的对照植物相比，用上述多肽处理的并在高盐胁迫水平(150mM的NaCl)下24小时后灌溉7天的番茄植株对盐更耐受，特别是示出响应于这种胁迫的相同基因的更强诱导(图18A2,图18B2和图18C2)。
还对这些植物的平均脯氨酸含量进行了评估。脯氨酸是响应于盐胁迫和水分缺乏而以游离形式在植物细胞中产生的渗透保护物。实际上，在受盐胁迫的植物中，这种氨基酸参与了渗透电位的调节，保护细胞膜免受自由基的侵害，调节细胞质pH值，并且防止酶变性。
如图19所示，在高盐胁迫(150mM的NaCl)下，与盐渍化对照植物相比，用本发明肽处理的植物表现出更低的平均脯氨酸含量，从而表明它们对盐引起的渗透胁迫的感知较低。
在图20中示出了几个生物计量参数，该生物计量参数在14天的连续盐胁迫(150mM)和用100fM浓度的肽PS1-70、PS1-120和SEQ ID NO.5以及相应的对照物灌溉15天后测量。图20A示出了与未处理的对照植物相比，肽处理的植物表现出对胁迫更大的耐受性，特别是具有更大的根表面(图20A)。此外，在不存在盐的条件下，与对照植物不同，用本发明的肽对象处理的植物能够促进植物的地上部分的生长，从而证实本发明的肽即使在飞摩尔浓度下也具有生物刺激素作用(图20B)。
序列表
<110> 马特利艾斯有限责任公司（Materias s.r.l.）
<120> 生物刺激素和生物保护肽及它们在农业中的用途
<130> E0135467
<160> 26
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽PS1-70
<400> 1
Met Gly Thr Pro Ser Tyr Asp Ile Lys Asn Lys Gly Asp Asp Met Gln
1 5 10 15
Glu Glu Pro Lys Val Lys Leu His His Glu Lys Gly Gly Asp Glu Lys
20 25 30
Glu Lys Ile Ile Glu Lys Glu Thr Pro Ser Gln Asp Ile Asn Asn Lys
35 40 45
Asp Thr Ile Ser Ser Tyr Val Leu Arg Asp Asp Thr Gln Glu Ile Pro
50 55 60
Lys Met Glu His Glu Glu
65 70
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽PS1-120
<400> 2
Met Gly Thr Pro Ser Tyr Asp Ile Lys Asn Lys Gly Asp Asp Met Gln
1 5 10 15
Glu Glu Pro Lys Val Lys Leu His His Glu Lys Gly Gly Asp Glu Lys
20 25 30
Glu Lys Ile Ile Glu Lys Glu Thr Pro Ser Gln Asp Ile Asn Asn Lys
35 40 45
Asp Thr Ile Ser Ser Tyr Val Leu Arg Asp Asp Thr Gln Glu Ile Pro
50 55 60
Lys Met Glu His Glu Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Lys Ile Val Glu
65 70 75 80
Lys Glu Thr Ile Ser Gln Tyr Ile Ile Lys Ile Glu Gly Asp Asp Asp
85 90 95
Ala Gln Glu Lys Leu Lys Val Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Lys
100 105 110
Glu Lys Ile Val Glu Lys Glu Thr
115 120
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 3
Glu Lys Glu Thr Pro Ser Gln Asp Ile
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 4
Glu Lys Glu Thr Ile Ser Gln Tyr Ile
1 5
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 5
Asp Asp Met Gln Glu Glu Pro Lys Val Lys Leu His His Glu Lys Gly
1 5 10 15
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 6
Asp Asp Thr Gln Glu Ile Pro Lys Met Glu His Glu Glu Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 7
Asp Asp Ala Gln Glu Lys Leu Lys Val Glu Tyr Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 8
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 8
Asp Asp Met Gln Glu Glu Pro Lys Val Lys Leu His His Glu Lys Gly
1 5 10 15
Gly Asp Glu Lys Glu Lys Ile Ile Glu Lys Glu Thr Pro Ser Gln Asp
20 25 30
Ile
<210> 9
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 9
Asp Asp Thr Gln Glu Ile Pro Lys Met Glu His Glu Glu Gly Gly Tyr
1 5 10 15
Val Lys Glu Lys Ile Val Glu Lys Glu Thr Ile Ser Gln Tyr Ile
20 25 30
<210> 10
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码PS1-70的序列
<400> 10
atgggaactc cttcatatga tatcaaaaac aaaggagatg acatgcaaga agaaccaaag 60
gtgaaacttc accatgagaa gggaggagat gaaaaggaaa aaataattga aaaagagact 120
ccatcccaag atatcaacaa caaagatacc atctcttcat atgttttaag agatgataca 180
caagaaatac caaagatgga acatgaggag 210
<210> 11
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码PS1-120的序列
<400> 11
atgggaactc cttcatatga tatcaaaaac aaaggagatg acatgcaaga agaaccaaag 60
gtgaaacttc accatgagaa gggaggagat gaaaaggaaa aaataattga aaaagagact 120
ccatcccaag atatcaacaa caaagatacc atctcttcat atgttttaag agatgataca 180
caagaaatac caaagatgga acatgaggag ggaggatatg taaaggagaa aattgttgaa 240
aaggagacta tatcccaata tatcatcaag attgaaggag atgatgatgc acaagaaaaa 300
ctaaaggttg agtatgagga ggaagaatat gaaaaagaga aaatagttga aaaagagact 360
<210> 12
<211> 436
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PS1-70重组插入物
<400> 12
gagatctcga tcccgcgaaa ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca 60
attcccctct agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatataccat gaaacatcac 120
catcaccatc accccatgag cgattacgac atccccacta ctgagaatct ttattttcag 180
ggcgccatgg gaactccttc atatgatatc aaaaacaaag gagatgacat gcaagaagaa 240
ccaaaggtga aacttcacca tgagaaggga ggagatgaaa aggaaaaaat aattgaaaaa 300
gagactccat cccaagatat caacaacaaa gataccatct cttcatatgt tttaagagat 360
gatacacaag aaataccaaa gatggaacat gaggagtagt aactcgagca ccaccaccac 420
caccactgag atccgg 436
<210> 13
<211> 513
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PS1-120重组插入物
<400> 13
ataattttgt ttaactttaa gaaggagata taccatgaaa catcaccatc accatcaccc 60
catgagcgat tacgacatcc ccactactga gaatctttat tttcagggcg ccatgggaac 120
tccttcatat gatatcaaaa acaaaggaga tgacatgcaa gaagaaccaa aggtgaaact 180
tcaccatgag aagggaggag atgaaaagga aaaaataatt gaaaaagaga ctccatccca 240
agatatcaac aacaaagata ccatctcttc atatgtttta agagatgata cacaagaaat 300
accaaagatg gaacatgagg agggaggata tgtaaaggag aaaattgttg aaaaggagac 360
tatatcccaa tatatcatca agattgaagg agatgatgat gcacaagaaa aactaaaggt 420
tgagtatgag gaggaagaat atgaaaaaga gaaaatagtt gaaaaagaga cttagtaact 480
cgagcaccac caccaccacc actgagatcc ggc 513
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码序列的组氨酸标签
<400> 14
catcaccatc accatcac 18
<210> 15
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 组氨酸标签
<400> 15
Met Lys His His His His His His Pro Met Ser Asp Tyr Asp Ile Pro
1 5 10 15
Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala
20 25
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEV位点
<400> 16
gagaatcttt attttcaggg c 21
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物P11F1
<400> 17
cgcgcgccat gggaactcct tcatatgata tca 33
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物P11R1
<400> 18
cgcgcgctcg agttactact cctcatgttc catctttggt a 41
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物P11R3
<400> 19
cgcgcgctcg agttactaag tctctttttc aactattttc tctttttc 48
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 组氨酸标签与TEV位点之间的序列
<400> 20
cccatgagcg attacgacat ccccactact 30
<210> 21
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有组氨酸标签的肽PS1-70
<400> 21
Met Lys His His His His His His Pro Met Ser Asp Tyr Asp Ile Pro
1 5 10 15
Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Gly Thr Pro Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Lys Asn Lys Gly Asp Asp Met Gln Glu Glu Pro Lys Val Lys
35 40 45
Leu His His Glu Lys Gly Gly Asp Glu Lys Glu Lys Ile Ile Glu Lys
50 55 60
Glu Thr Pro Ser Gln Asp Ile Asn Asn Lys Asp Thr Ile Ser Ser Tyr
65 70 75 80
Val Leu Arg Asp Asp Thr Gln Glu Ile Pro Lys Met Glu His Glu Glu
85 90 95
<210> 22
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有组氨酸标签的肽PS1-120
<400> 22
Met Lys His His His His His His Pro Met Ser Asp Tyr Asp Ile Pro
1 5 10 15
Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Gly Thr Pro Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Lys Asn Lys Gly Asp Asp Met Gln Glu Glu Pro Lys Val Lys
35 40 45
Leu His His Glu Lys Gly Gly Asp Glu Lys Glu Lys Ile Ile Glu Lys
50 55 60
Glu Thr Pro Ser Gln Asp Ile Asn Asn Lys Asp Thr Ile Ser Ser Tyr
65 70 75 80
Val Leu Arg Asp Asp Thr Gln Glu Ile Pro Lys Met Glu His Glu Glu
85 90 95
Gly Gly Tyr Val Lys Glu Lys Ile Val Glu Lys Glu Thr Ile Ser Gln
100 105 110
Tyr Ile Ile Lys Ile Glu Gly Asp Asp Asp Ala Gln Glu Lys Leu Lys
115 120 125
Val Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Lys Glu Lys Ile Val Glu Lys
130 135 140
Glu Thr
145
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 23
Asp Asp Ala Gln Glu Lys Pro Lys Val Glu His Glu Glu Gly
1 5 10
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 24
Asp Lys Glu Thr Pro Ser Gln Asp Ile
1 5
<210> 25
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 25
Asp Asp Ala Gln Glu Lys Leu Lys Val Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr
1 5 10 15
Glu Lys Glu Lys Ile Val Glu Lys Glu Thr Pro Ser Gln Asp Ile
20 25 30
<210> 26
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 26
Asp Asp Ala Gln Glu Lys Pro Lys Val Glu His Glu Glu Gly Asp Asp
1 5 10 15
Lys Glu Thr Pro Ser Gln Asp Ile
20

Claims (16)

1.一种经分离的肽，所述经分离的肽由选自由以下构成的组的氨基酸序列构成：SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.23–26以及至少8个氨基酸长度的SEQ ID NO.2的片段，并且所述经分离的肽具有抗植物中的非生物胁迫和生物胁迫的生物刺激素和生物保护活性，所述肽任选地在氨基末端处或羧基末端处与组氨酸尾缀合。
2.根据权利要求1所述的经分离的肽，其中，所述片段选自由氨基酸序列SEQ ID NO.3-9构成的组。
3.根据权利要求1或2所述的经分离的肽，其中，所述氨基末端通过乙酰化改性、和/或所述羧基末端通过酰胺化改性。
4.一种经分离的核酸序列，所述经分离的核酸序列编码根据权利要求1至3中任一项所述的肽。
5.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求4所述的核酸序列。
6.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求5所述的表达载体。
7.一种用于制备根据权利要求1或2所述的肽的方法，所述方法包括在适当的条件下培养根据权利要求6所述的宿主细胞、且时间足以表达所述肽的步骤，并且任选地包括从培养物中回收所述肽的步骤。
8.一种抗植物中的非生物胁迫和生物胁迫的生物刺激素和生物保护组合物，所述生物刺激素和生物保护组合物包括根据权利要求1至3中任一项所述的至少一种肽或他们的任意组合，以及至少一种佐剂、稳定剂和/或防腐剂。
9.根据权利要求8所述的生物刺激素和生物保护组合物，其中，所述至少一种肽以0.01皮摩尔(pM)至100pM的浓度存在。
10.根据权利要求8或9所述的生物刺激素和生物保护组合物，所述生物刺激素和生物保护组合物还包括选自由以下构成的组的微生物：菌根真菌、腐生真菌、植物生长促进细菌、苏云金芽孢杆菌孢子、以及它们的任意组合。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的生物刺激素和生物保护组合物，所述生物刺激素和生物保护组合物是水系液体组合物。
12.根据权利要求8至10中任一项所述的生物刺激素和生物保护组合物，所述生物刺激素和生物保护组合物是冻干形式。
13.一种用于提高对植物中生物胁迫和/或非生物胁迫的抗性的方法，所述方法包括将根据权利要求8至12中任一项所述的生物刺激素和生物保护组合物施用至所述植物、所述植物的部分、植物繁殖材料和/或植物生长位点的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述生物刺激素和生物保护组合物通过喷洒、灌溉或在水培溶液中施用。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述植物是属于茄科、葡萄科、蔷薇科或木犀科的植物。
16.根据权利要求1至3中任一项所述的经分离的肽，和/或根据权利要求8至12中任一项所述的生物刺激素和生物保护组合物在增加对植物中非生物胁迫和/或生物胁迫的抗性中的用途。
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