IT202000018811A1 - Peptidi biostimolanti e bioprotettivi e loro impiego in agricoltura - Google Patents

Description

Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo: ?Peptidi biostimolanti e bioprotettivi e loro impiego in agricoltura?

DESCRIZIONE

La presente invenzione rientra nel campo dell?agricoltura, pi? specificamente delle procedure agronomiche volte a favorire la crescita e la produttivit? delle piante. In particolare, la presente invenzione riguarda nuovi peptidi dotati di attivit? biostimolante e bioprotettiva nei confronti di stress abiotici e biotici delle piante.

Nel campo dell?agricoltura riveste fondamentale importanza promuovere la crescita, la salute e la produttivit? delle piante. Negli anni le pratiche agronomiche hanno sviluppato approcci diversi al fine di fronteggiare ed arginare i danni causati alle piante e alle coltivazioni ad opera di stress biotici, ovvero l?attacco da parte di microrganismi, quali virus, batteri, funghi, e macrorganismi, tra cui nematodi, insetti e acari, nonch? a stress abiotici, quali ad esempio la carenza di acqua, l?eccesso di calore, il freddo estremo, o una elevata salinit?.

Tradizionalmente, il controllo degli stress biotici e abiotici nelle piante ? stato conseguito mediante l?impiego di fertilizzanti e pesticidi, e introducendo modifiche fisiche del suolo. Tuttavia, l?uso di prodotti agrochimici pu? comportare gravi conseguenze ambientali a lungo termine se questi prodotti sono usati in eccesso o permangono nell?ambiente, e pu? arrecare danni significativi alla salute umana per i residui tossici nelle parti edibili. Inoltre, gli agrofarmaci possono perdere nel tempo di efficacia a causa dell?insorgenza di ceppi resistenti alla loro azione nelle popolazioni dei patogeni.

Allo scopo di limitare l?uso di strategie pericolose, nel tentativo di migliorare la produttivit? delle colture promuovendo la crescita delle piante e la loro resistenza agli stress, sono stati compiuti numerosi sforzi mirati a sviluppare e implementare approcci ecologicamente cauti e sostenibili.

Nei brevetti statunitensi US 5,378,819, US 5,883,076 e US 6,022,739 ? descritto l?isolamento dell?ormone peptidico vegetale Sistemina nonch? il coinvolgimento di detto peptide nell?attivazione dei geni di difesa nelle piante di Solanum lycopersicum (pomodoro) in risposta alla ferita indotta da insetti masticatori o da danno meccanico.

La Sistemina ? un ormone peptidico di 18 amminoacidi di lunghezza, localizzato all?estremit? della regione carbossi-terminale di un precursore di 200 amminoacidi chiamato Prosistemina (ProSys). In seguito alla ferita di una pianta, il precursore Prosistemina ? sottoposto ad azione proteolitica mediata probabilmente da una fitaspasi, una proteasi aspartato-specifica della famiglia delle subtiliasi, che consente il rilascio della Sistemina. Questo peptide viene rilasciato nell?apoplasto dove, attraverso l?interazione con il recettore di membrana SYR1, attiva i segnali di difesa (Narv?ez-V?squez e Orozco-C?rdenas, (2008) ?Systemins and AtPeps: Defense-related peptide signals?; In Induced plant resistance to herbivory (pp. 313-328). Springer, Dordrecht; Wang L. et al., (2018) ?The systemin receptor SYR1 enhances resistance of tomato against herbivorous insects?, Nature plants, 4(3), 152-156).

In condizioni fisiologiche il gene della Prosistemina ? espresso a livelli femtomolari nelle foglie, nei petali e nei fusti delle piante, ma non nelle radici (Pearce G. et al., (1991) ?A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor protein?, Science, 253(5022), 895-897; Narv?ez-V?squez, J., and Ryan, C. A., (2004) ?The cellular localization of prosystemin: a functional role for phloem parenchyma in systemic wound signaling?, Planta, 218(3), 360-369). Viceversa, in caso di danno meccanico o ferita determinata dall'attacco di insetti masticatori, il gene Prosistemina incrementa la sua espressione.

Il ruolo della Prosistemina/Sistemina nei meccanismi di difesa della pianta di pomodoro ? stato ampiamente documentato attraverso lo studio di piante transgeniche sovraesprimenti il gene codificante la Prosistemina oppure silenziate per lo stesso gene. In particolare, a seguito della sovraespressione della Prosistemina, ? stato rilevato un aumento della sintesi di proteine inibitrici delle proteasi presenti nell'intestino degli insetti riducendone in tal modo fortemente la capacit? digestiva e il successivo assorbimento di nutrienti (McGurl B. et al., (1994) ?Overexpression of the ProSystemin gene in transgenic tomato plants generates a systemic signal that constitutively induces proteinase inhibitor synthesis?, Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(21), 9799-9802). Al contrario, la sottoespressione del gene della Prosistemina determina la soppressione quasi completa della produzione degli inibitori di proteasi in seguito a ferita, con conseguente maggiore suscettibilit? della pianta nei confronti di larve di Manduca sexta (Orozco-Cardenas et al., (1993) ?Expression of an antisense prosystemin gene in tomato plants reduces resistance toward Manduca sexta larvae?, Proceedings of the National Academy of Sciences, 90(17), 8273-8276).

Studi recenti hanno confermato che piante che esprimono in modo costitutivo il gene della Prosistemina sono in grado di difendersi da numerosi stress biotici, attivando una vasta gamma di segnali difensivi (Coppola M. et al., (2015) ?Prosystemin overexpression in tomato enhances resistance to different biotic stresses by activating genes of multiple signaling pathways?, Plant molecular biology reporter, 33(5), 1270-1285). In particolare, queste piante sono capaci di rilasciare una miscela di composti volatili che attraggono predatori e parassitoidi di insetti erbivori, incrementando cos? le difese indirette della pianta, (Corrado G. et al., (2007), ?Systemin regulates both systemic and volatile signaling in tomato plants?, Journal of chemical ecology, 33(4), 669-681), sono resistenti all?attacco di funghi necrotrofi (El Oirdi et al., (2011) ?Botrytis cinerea manipulates the antagonistic e ?ects between immune pathways to promote disease development in tomato?, Plant Cell 23, 2405?2421) e di afidi, tollerano meglio alcune infezioni virali (Bubici G. et al., (2017) ?Prosystemin overexpression induces transcriptional modifications of defense-related and receptor-like kinase genes and reduces the susceptibility to Cucumber mosaic virus and its satellite RNAs in transgenic tomato plants?, PloSone, 12(2), e0171902), e allo stesso tempo sono tolleranti a condizioni di stress salino (Orsini F. et al., (2010) ?Systemin?dependent salinity tolerance in tomato: evidence of specific convergence of abiotic and biotic stress responses?, Physiologia plantarum, 138(1), 10-21).

? noto inoltre che anche la porzione della proteina precursore Prosistemina priva del peptide Sistemina ? capace di indurre l?attivazione di geni di difesa. Gli studi descritti in Corrado G. et al, (2016) ?The expression of the tomato prosystemin in tobacco induces alterations irrespective of its functional domain?, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 125(3), 509-519, condotti sulle piante di tabacco che al posto del gene della Prosistemina contengono un ortologo funzionale completamente diverso dal punto strutturale, hanno dimostrato che, trasformando queste piante con la sequenza codificante la Prosistemina priva della Sistemina, la proteina precursore deleta viene sintetizzata e porta all?attivazione di una serie di geni associati alla difesa e maggiore tolleranza nei confronti del fungo Botrytis cinerea.

Nonostante i promettenti risultati degli studi sugli effetti dell?espressione/sovraespressione endogena della proteina Prosistemina, approcci agronomici basati su procedure di ingegnerizzazione genetica delle piante presentano per? l?indubbia limitazione di richiedere procedure tecniche complesse, laboriose e dispendiose, con conseguente restrizione del loro ambito di applicazione. Alle limitazioni precedentemente menzionate si accompagnano inoltre difficili problematiche di natura normativa e legislativa.

Si pone pertanto la necessit? di mettere a disposizione procedimenti mirati che consentano con efficacia di preservare e migliorare il benessere e la salute delle piante e di incrementare la qualit? delle colture, e che siano al contempo di facile esecuzione pratica e di minimo impatto sull?ambiente.

Questa ed altre necessit? sono state ora soddisfatte dalla presente invenzione che mette a disposizione un peptide isolato come definito nell?annessa rivendicazione 1, una composizione biostimolante e bioprotettiva come definita nell?annessa rivendicazione 7 e un procedimento per promuovere la risposta a stress biotici e/o abiotici in una pianta come definito nell?annessa rivendicazione 12.

Le annesse rivendicazioni indipendenti e dipendenti formano parte integrante della presente descrizione.

Come verr? illustrato pi? in dettaglio nella parte sperimentale che segue, i presenti inventori hanno sorprendentemente isolato dal polipeptide Prosistemina, e successivamente prodotto, peptidi che, quando somministrati per via esogena ad una pianta, ad esempio mediante spruzzo sul fogliame o irriguo, sono vantaggiosamente capaci di esplicare su detta pianta un?attivit? biostimolante della crescita e al contempo di innescare meccanismi di difesa contro stress biotici ed abiotici, senza alcuna azione biocida diretta sugli agenti patogeni.

Senza voler essere legati ad alcuna teoria, i presenti inventori ritengono che la resistenza indotta nelle piante a seguito del trattamento con i peptidi dell?invenzione, in particolare nelle piante di pomodoro, contro l?azione di insetti e funghi dannosi sia mediata dall?attivazione di geni coinvolti nella regolazione dei meccanismi di difesa endogeni della pianta (come illustrato nella Figura 9).

I risultati presentati nella Figura 12 dimostrano inoltre che i peptidi secondo l?invenzione sono altres? capaci sorprendentemente di innescare nelle piante trattate segnali chiave di resistenza nei confronti di stress abiotici quali l?elevata salinit? e l?alta temperatura.

Forma quindi oggetto della presente invenzione un peptide isolato consistente di una sequenza aminoacidica scelta dal gruppo che consiste delle sequenze aminoacidiche SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e loro frammenti di almeno 8 aminoacidi di lunghezza aventi attivit? biostimolante e bioprotettiva nei confronti di stress abiotici e biotici delle piante, detto peptide essendo opzionalmente coniugato con una coda di istidine all?estremit? amino-terminale o all?estremit? carbossi-terminale.

Gli studi condotti dai presenti inventori hanno rivelato che i peptidi secondo l?invenzione, denominati di seguito PS1-70 (SEQ ID NO. 1) e PS1-120 (SEQ ID NO. 2), sono contenuti nella regione amino(N-)terminale del polipeptide Prosistemina, pi? specificamente nella porzione del precursore che ? priva dell?ormone Sistemina.

Come descritto nell?esempio sperimentale 2, a causa degli aberranti profili di migrazione elettroforetica, l?identificazione da parte degli inventori dei peptidi oggetto dell?invenzione ? stata particolarmente difficoltosa ed ha richiesto indagini complesse. La successiva analisi delle sequenze aminoacidiche di detti peptidi ha infatti rivelato la presenza in dette sequenze di una significativa componente di residui aminoacidici noti per promuovere disordine ed instabilit? nella struttura tridimensionale delle proteine.

Con l?espressione ?frammento?, come qui utilizzata in riferimento ad una sequenza aminoacidica, si intende una sequenza continua di residui aminoacidici che rappresenta una porzione di una sequenza aminoacidica pi? lunga.

Secondo una forma di realizzazione, il peptide isolato consiste di un frammento della sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2 avente almeno 9, almeno 10, almeno 15, almeno 20, almeno 25, almeno 30, almeno 35, almeno 40, almeno 45, almeno 50, almeno 55, almeno 60, almeno 65, almeno 70, almeno 75, almeno 80, almeno 85, almeno 90, almeno 95, almeno 100, almeno 110, o almeno 120 aminoacidi di lunghezza.

In una forma di realizzazione preferita, il peptide isolato consiste di un frammento della sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2 avente 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 o 120 aminoacidi di lunghezza.

Le seguenti sequenze aminoacidiche specifiche sono particolarmente preferite: EKETPSQDI (SEQ ID NO. 3), EKETISQYI (SEQ ID NO. 4), DDMQEEPKVKLHHEKG (SEQ ID NO. 5), DDTQEIPKMEHEEG (SEQ ID NO. 6), DDAQEKLKVEYEEE (SEQ ID NO. 7), DDMQEEPKVKLHHEKGGDEKEKIIEKETPSQDI (SEQ ID NO. 8) e DDTQEIPKMEHEEGGYVKEKIVEKETISQYI (SEQ ID NO. 9).

Secondo l?invenzione, il peptide ? opzionalmente coniugato con una coda di istidine all?estremit? amino-terminale (N-terminale) o carbossi-terminale (C-terminale).

Nell?ambito della presente invenzione, con il termine ?coniugato? si intende la presenza di un legame covalente tra l?aminoacido all?estremit? N-terminale del peptide dell?invenzione e l?aminoacido all?estremit? C-terminale della coda di istidine (come esemplificato nelle Figure 2B e 3B) o, viceversa, la presenza di un legame covalente tra l?aminoacido all?estremit? C-terminale del peptide dell?invenzione e l?aminoacido all?estremit? N-terminale della coda di istidine, preceduto o meno da un linker.

Come ? noto nella tecnica, la coniugazione con code di istidine viene abitualmente impiegata nelle scienze delle proteine poich? consente di semplificare le procedure di purificazione delle proteine su matrici contenenti ioni metallici di transizione e l'uso di anticorpi anti-code di istidine rappresenta inoltre uno strumento utile negli studi di localizzazione e immunoprecipitazione.

Metodi per la produzione di peptidi coniugati ad una coda di istidine sono noti e descritti nello stato della tecnica, ad esempio mediante espressione di un prodotto proteico ricombinante.

Forma ulteriore oggetto dell?invenzione una sequenza di acido nucleico isolata codificante un peptide isolato come precedentemente definito.

Preferibilmente, la sequenza isolata di acido nucleico comprende o consiste di una sequenza nucleotidica scelta tra le sequenze nucleotidiche SEQ ID NO. 10 e SEQ ID NO. 11.

Nell?ambito della presente invenzione rientra altres? un vettore di espressione comprendente una sequenza di acido nucleico come sopra definita e opzionalmente comprendente altres? una sequenza promotore e una sequenza segnale di poliadenilazione, nonch? una cellula ospite comprendente il suddetto vettore di espressione.

Vettori di espressione ricombinanti per l?impiego nella produzione di peptidi o proteine sono noti e descritti nello stato della tecnica, per cui la loro scelta e il loro impiego rientrano nelle capacit? del tecnico medio del settore. Tali vettori possono essere procariotici od eucariotici. A titolo di esempio non limitativo si citano i vettori procariotici della serie pET (Novagen) quali pET15 o pET30, e della serie pGEX (GE Healthcare).

Esempi di vettori eucariotici includono quelli della serie pPIC utilizzati in cellule di lievito Pichia Pastoris.

Preferibilmente, il sistema cellulare impiegato per l?espressione del vettore di espressione dell?invenzione ? scelto tra sistemi procariotici, ad esempio cellule batteriche di E. coli.

Alternativamente, il sistema cellulare di espressione pu? essere un sistema eucariotico, ad esempio cellule di lievito quali S. cerevisiae e Pichia pastoris.

Forma oggetto della presente invenzione anche un procedimento per la preparazione del peptide dell?invenzione, secondo il quale la cellula ospite trasformata viene coltivata in condizioni idonee e per un tempo sufficiente per l?espressione del peptide dell?invenzione. Tipicamente le condizioni ed i tempi di coltura idonei dipendono dal sistema cellulare impiegato e possono riguardare, ad esempio, la composizione del mezzo di coltura, il pH, l?umidit? relativa, la componente gassosa di O2 e CO2, nonch? la temperatura. La selezione delle condizioni e dei tempi di coltura pi? idonei ad essere impiegati nel procedimento dell?invenzione rientra ampiamente nelle conoscenze e capacit? del tecnico medio del settore.

In una forma di realizzazione preferita, il procedimento secondo l?invenzione prevede in aggiunta il passaggio di recuperare dalla coltura cellulare il peptide prodotto. Il passaggio di recupero pu? essere condotto impiegando metodiche di purificazione proteica che fanno parte della tecnica nota, ad esempio mediante uno o pi? passaggi cromatografici, ad esempio attraverso cromatografia per affinit? o cromatografia per esclusione o cromatografia a scambio ionico, oppure mediante ultrafiltrazione, dialisi e/o liofilizzazione.

Metodi alternativi idonei per la produzione di un peptide secondo l?invenzione includono, ad esempio procedure di sintesi chimica, o tecniche di taglio proteolitico della proteina precursore, impiegando ad esempio proteasi specifiche o agenti chimici. La selezione della metodica pi? adeguata ad essere impiegata nell?ambito della presente invenzione per la produzione di un peptide rientra ampiamente nelle capacit? del tecnico medio del settore.

Grazie alle caratteristiche vantaggiose precedentemente illustrate, i peptidi secondo l?invenzione sono particolarmente idonei ad essere impiegati nelle pratiche agronomiche mirate ad un miglioramento dello sviluppo e della resa di coltura delle piante permettendo al contempo una corretta gestione del suolo e dell?ambiente. In particolare, l?azione esplicata dai peptidi secondo l?invenzione, essendo priva di qualsiasi effetto biocida diretto, vantaggiosamente non genera conseguenze dannose sulle popolazioni degli insetti utili impollinatori.

L?impiego di molecole di dimensioni ridotte quali i peptidi rappresenta un ulteriore vantaggio della presente invenzione poich? esse si prestano meglio ad essere progettate e/o modificate mirando a conservare o ad amplificare una specifica attivit?. In aggiunta, diversamente da proteine di maggiore lunghezza, quali ad esempio l?intera Prosistemina, le dimensioni ridotte di un peptide abbattono notevolmente i costi di sintesi e purificazione.

Forma quindi oggetto della presente invenzione una composizione biostimolante e bioprotettiva nei confronti di stress abiotici e biotici delle piante comprendente almeno un peptide come precedentemente definito, o qualsiasi loro combinazione, e opzionalmente un agente tampone, preferibilmente tampone fosfato salino.

In una forma di realizzazione, la composizione dell?invenzione comprende almeno il peptide di sequenza aminoacidica SEQ ID NO:1 e il peptide di sequenza aminoacidica SEQ ID NO:2.

In un?altra forma di realizzazione, la composizione dell?invenzione comprende la seguente combinazione di peptidi:

peptide di sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 1;

peptide di sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 2;

peptide di sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 3;

peptide di sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 4;

peptide di sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 5;

peptide di sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 6;

peptide di sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 7; peptide di sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 8; e

peptide di sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 9.

Secondo la definizione ufficiale formulata dall?European Biostimulant Industry Council (EBIC), con il termine ?biostimolante? si intende una sostanza e/o microrganismo la cui funzione, quando applicata alle piante o alla rizosfera, ? stimolare il processo naturale per migliorare/favorire l'assorbimento dei nutrienti, l'efficienza dei nutrienti, tollerare lo stress abiotico e la qualit? delle colture.

Nell?ambito della presente invenzione, con il termine ?bioprotettore? si intende una sostanza e/o microrganismo che, a seguito di somministrazione alle piante o alla rizosfera, induce l?attivazione delle difese naturali delle piante contro gli stress biotici e abiotici.

Con il termine ?pianta?, come qui utilizzato, si intende un organismo pluricellulare vegetale vivente.

Preferibilmente, la pianta appartiene ad una famiglia scelta dal gruppo che consiste di Solanacee, come per esempio Solanum lycopersicum e Solanum melongena, Vitacee, come per esempio Vitis vinifera, Rosaceae, come per esempio Malus domestica, Oleaceae, come per esempio Olea europaea, e loro combinazioni.

Con riferimento agli stress biotici, si citano a titolo di esempio non limitativo insetti erbivori, funghi fitopatogeni, batteri fitopatogeni e virus.

In questo contesto, gli insetti erbivori sono preferibilmente scelti dal gruppo che consiste di lepidotteri, come per esempio Spodoptera littoralis e Tuta absoluta, fitomizi come afidi, ad esempio Macrosiphum euphorbiae, omotteri come per esempio Bemisia tabaci e trialeurode svaporariorum, e loro combinazioni.

I funghi fitopatogeni sono preferibilmente scelti dal gruppo che consiste di Botrytis cinerea, Alternaria alternata e Alternaria solani, e loro combinazioni.

I batteri fitopatogeni sono preferibilmente batteri Pseudomonas syringae.

I virus sono preferibilmente scelti tra Tomato spotted wilt virus e Cucumber Mosaic Virus.

Nell?ambito degli stress abiotici si citano ad esempio, anche se non esclusivamente, basse temperature che provocano, ad esempio, congelamento, temperature elevate, siccit?, intensit? luminosa elevata, intensit? luminosa bassa, eccesso di salinit?, eccesso di acqua, e loro combinazioni.

Tra gli agenti tampone idonei ad essere impiegati nella composizione biostimolante e bioprotettiva dell?invenzione ? particolarmente preferito un tampone fosfato, ancor pi? preferibilmente un tampone fosfato salino. Tuttavia, ? da intendersi che nella presente invenzione possono essere impiegati altri agenti tampone, la cui scelta rientra nella capacit? del tecnico media del settore.

Preferibilmente, l?almeno un peptide ? presente nella composizione biostimolante e bioprotettiva secondo l?invenzione in una concentrazione compresa fra 0,02 picomolare (pM) e 100 pM, pi? preferibilmente fra 0,02 pM e 0,08 pM, o fra 0,085 pM e 0,1 pM, oppure fra 1 pM e 100 pM.

Secondo una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la composizione biostimolante e bioprotettiva comprende altres? un microorganismo scelto dal gruppo che consiste di funghi micorrizici, funghi saprofiti, batteri che promuovono la crescita delle piante, spore di batterio Bacillus thuringiensis, e qualsiasi loro combinazione.

Come ? noto nella tecnica, i funghi micorrizici del sottosuolo instaurano associazioni simbiotiche con le radici di molte piante coltivate con vantaggi reciproci per gli organismi coinvolti. Pi? specificamente, i funghi micorrizici sono in grado di metabolizzare gli elementi minerali presenti nel suolo anche se fissati al potere assorbente del terreno mentre la pianta fornisce ai funghi simbionti gli zuccheri prodotti per fotosintesi.

Nell?ambito della presente invenzione, preferibilmente il fungo micorrizico ? scelto dal gruppo che consiste di Gigaspora fasciculatus, Glomus constrictum, Glomus tortuosum, Glomus geosporum, Gigaspora margarita, Acaulospora scrobicurata, e qualsiasi loro combinazione.

Nell?ambito dell?invenzione, preferibilmente il fungo saprofita appartiene al genere Trichoderma.

I funghi saprofiti sono noti per la loro benefica attivit? di degrado delle piante ed animali morti nel suolo.

Nell?ambito dell?invenzione, preferibilmente il batterio che promuove la crescita delle piante ? scelto tra Burkholderia cepacia e Pseudomonas fluorescens.

Il Bacillus thuringiensis ? un batterio sporigeno naturalmente presente nel terreno, noto per la produzione, in condizioni sfavorevoli, di una spora ed un corpo parasporale, comunemente detto cristallo, contenente endotossine ad azione insetticida. Queste, dopo ingestione da parte di insetti sensibili, si liberano dai corpi parasporali e provocano la lisi delle cellule epiteliali intestinali con conseguente paralisi e morte dell?insetto.

Pi? preferibilmente, le spore nella composizione secondo l?invenzione sono del batterio Bacillus thuringiensis sottospecie aizawai.

La composizione biostimolante e bioprotettiva secondo l?invenzione pu? altres? comprendere almeno un adiuvante e/o un veicolo di uso convenzionale nelle tecniche agronomiche. La scelta dell?eventuale adiuvante e/o o veicolo idoneo ad essere impiegato nelle pratiche agricole rientra nelle capacit? del tecnico medio del settore.

Secondo la presente invenzione, la composizione biostimolante e bioprotettiva pu? essere in forma di liofilizzato. In questa modalit? realizzativa, la composizione secondo l?invenzione ? stabile a temperatura ambiente per almeno 3 mesi.

In un?altra forma di realizzazione, la composizione della presente invenzione pu? essere sotto forma di una composizione liquida a base di acqua o di un tampone fosfato salino. In questa forma, la composizione secondo l?invenzione pu? essere impiegata direttamente o diluita prima dell?uso.

Nell?ambito dell?invenzione rientra inoltre un procedimento per promuovere la risposta a stress biotici e/o abiotici in una pianta, comprendente il passaggio di applicare sulla pianta, parti della pianta, materiale di propagazione della pianta, e/o luogo di crescita della pianta una composizione biostimolante e bioprotettiva come precedentemente definita.

Secondo il procedimento dell'invenzione, la composizione biostimolante e bioprotettiva pu? essere applicata su una variet? di piante in varie forme o parti di una pianta, come per esempio foglie, gemme, rami, gambi, corteccia, fiori, boccioli di fiori, frutti, radici, semi, bulbi, tuberi e/o germogli.

Con il termine "materiale di propagazione? come qui utilizzato, si intende qualsiasi materiale vegetale da cui possa essere derivata una pianta o una parte di una pianta. A titolo di esempio non limitativo, si citano semi, semenzali, talee, marze, portinnesti, espianti, bulbi, tuberi, e loro combinazioni.

In aggiunta o in alternativa, la composizione secondo l?invenzione pu? essere applicata sul luogo di crescita della pianta.

In una forma di realizzazione, la pianta ? coltivata nel suolo e l?applicazione della composizione secondo l?invenzione pu? avvenire, ad esempio, sull?intera superficie di coltivazione, in uno o pi? solchi e/o intorno ad essi, nelle buche di semina, nell'area sottostante il fusto o il tronco, e/o nell'area tra le radici.

In un?altra forma di realizzazione, la pianta ? coltivata fuori suolo o senza suolo. Tra le metodiche di coltivazione fuori suolo o senza suolo si cita a titolo di esempio non limitativo la tecnica della coltivazione idroponica in cui la terra ? sostituita da un substrato inerte, come per esempio argilla espansa, fibra di cocco, lana di roccia o zeolite, e la pianta assimila le sostanze nutritive grazie ad una soluzione composta da acqua ed elementi inorganici quali ad esempio Mg(NO3)2?6H2O, Ca(NO3)2?4H2O, KNO3, K2SO4, KH2PO4, che hanno lo scopo di apportare tutte le sostanze indispensabili per la normale nutrizione minerale dell?organismo vegetale. Un grande vantaggio della pratica colturale idroponica ? il fatto che questa tecnologia di coltura consente di ottenere una produzione costante e controllata per tutto l?anno, sia dal punto di vista qualitativo che da quello igienico e sanitario per l?assenza di antiparassitari, diserbanti e fitofarmaci.

La composizione biostimolante e bioprotettiva dell?invenzione pu? essere applicata alla pianta, parti della pianta, materiale di propagazione della pianta, e/o luogo di crescita della pianta con metodi convenzionali, ad esempio mediante spruzzo, nebulizzazione, aspersione, diffusione o irrorazione (a mano, con trattore, aereo e simili).

Secondo una forma di realizzazione preferita, la composizione della presente invenzione viene applicata mediante spruzzo o nebulizzazione sulla pianta o parti della pianta, preferibilmente sulle foglie.

Secondo un?altra forma di realizzazione preferita, la composizione della presente invenzione viene applicata per irriguo, ossia direttamente nel terreno, ad esempio sotto forma di liquido di irrigazione o mediante iniezione nel terreno.

Nel caso di una coltivazione idroponica, il procedimento secondo l?invenzione prevede che la composizione biostimolante e bioprotettiva venga somministrata alle piante nella soluzione nutritiva.

Secondo una forma di realizzazione dell?invenzione, il procedimento prevede di applicare la composizione almeno due volte, preferibilmente 4 volte, pi? preferibilmente 5 volte.

In questa forma di realizzazione, l'intervallo di tempo tra un?applicazione sulla pianta, ad esempio una prima, seconda, terza, quarta o quinta applicazione, e l?applicazione successiva, pu? essere compreso nell?intervallo da circa 3 settimane a circa 4 settimane.

Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? l?uso di un peptide isolato come precedentemente definito, o di una composizione biostimolante e bioprotettiva come precedentemente definita, per promuovere la risposta a stress biotici e/o abiotici in una pianta.

La parte sperimentale che segue ? fornita a scopo puramente illustrativo e non limitativo della portata dell?invenzione come definita dalle annesse rivendicazioni. Nella parte sperimentale viene fatto riferimento ai disegni annessi, in cui:

La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica del vettore di clonaggio pETM11 impiegato dai presenti inventori per la produzione ricombinante dei peptidi dell?invenzione.

La Figura 2 mostra una rappresentazione schematica dell?inserto contenente la sequenza nucleotidica codificante il peptide PS1-70 dopo clonaggio nel vettore pETM11. (A) Sequenza dell?inserto ricombinante (SEQ ID NO. 12) ottenuta mediante sequenziamento Sanger. La sequenza nucleotidica codificante il peptide PS1-70 (SEQ ID NO. 10), correttamente inserita nel vettore di clonaggio, ? sottolineata in nero; la sequenza codificante per la coda di istidine (His-tag) (SEQ ID NO. 14) ? evidenziata in grassetto maiuscolo; il sito di riconoscimento della proteasi del Virus Etch del Tabacco (Tobacco Etch Virus, TEV) (SEQ ID NO.

16), posto a valle della coda di istidine per consentire la rimozione di quest?ultima, ? evidenziato in corsivo maiuscolo sottolineato in grigio. Le sequenze del primer forward P11F1 (SEQ ID NO. 17) e del primer reverse P11R1 (SEQ ID NO. 18) utilizzati per l?amplificazione e il clonaggio della sequenza nucleotidica codificante il peptide PS1-70 sono evidenziate, rispettivamente, in grigio chiaro e in grigio scuro. B) Sequenza aminoacidica del peptide PS1-70 (in grassetto, SEQ ID NO. 1), coniugata in posizione N-terminale all?estremit? C-terminale di una coda di istidine (sequenza sottolineata, SEQ ID NO. 15).

La Figura 3 mostra una rappresentazione schematica dell?inserto contenente la sequenza nucleotidica codificante il peptide PS1-120 dopo clonaggio nel vettore pETM11. (A) Sequenza dell?inserto ricombinante ottenuta mediante sequenziamento Sanger (SEQ ID NO. 13). La sequenza nucleotidica codificante il peptide PS1-120 (SEQ ID NO. 11), correttamente inserita nel vettore di clonaggio, ? sottolineata in nero; la sequenza codificante per la coda di istidine (His-tag) (SEQ ID NO. 14) ? evidenziata in grassetto; il sito di riconoscimento della proteasi del Virus Etch del Tabacco (Tobacco Etch Virus, TEV) (SEQ ID NO. 16), posto a valle della coda di istidine per consentire la rimozione di quest?ultima, ? evidenziato in corsivo maiuscolo sottolineato in grigio. Le sequenze del primer P11F1 forward (SEQ ID NO. 17) e del primer P11R3 reverse (SEQ ID NO. 19) utilizzati per l?amplificazione e il clonaggio della sequenza nucleotidica codificante il peptide PS1-120 sono evidenziate, rispettivamente, in grigio chiaro e in grigio scuro. (B) Sequenza aminoacidica del peptide PS1-120 (in grassetto, SEQ ID NO. 2), coniugata in posizione N-terminale all?estremit? C-terminale di una coda di istidine (sequenza sottolineata, SEQ ID NO. 15).

La Figura 4 mostra una tabella che riporta le sequenze nucleotidiche e le caratteristiche dei primers utilizzati per l?amplificazione e il clonaggio delle sequenze nucleotidiche codificanti rispettivamente i peptidi PS1-70 e PS1-120.

La Figura 5 mostra i risultati della cromatografia di affinit? (IMAC), dell?analisi delle frazioni eluite mediante elettroforesi con SDS-PAGE 15% e dell?analisi Western blot condotte sui peptidi PS1-70 e PS1-120 purificati. (A1 e B1) Profili cromatografici del primo passaggio di purificazione dei peptidi PS1-70 e PS1-120 che eluiscono, rispettivamente, con 150mM e 50 mM di imidazolo. (A2 e B2) Analisi su gel di poliacrilammide delle frazioni eluite; M: marcatore di peso molecolare; rettangolo nero: frazioni eluite contenenti i peptidi PS1-70 e PS1-120. (A3 e B3) Identificazione dei peptidi PS1-70 e PS1-120 mediante analisi Western Blot; M: marcatore di peso molecolare; rettangolo nero: peptidi PS1-70 e PS1-120.

La Figura 6 mostra i risultati della cromatografia ad esclusione molecolare (SEC) e dell?analisi delle frazioni eluite mediante elettroforesi con SDS-PAGE 15%. (A1 e B1) Profili cromatografici del secondo passaggio di purificazione dei peptidi PS1-70 e PS1-120 che presentano, rispettivamente, il picco di eluizione ad un volume di eluizione pari a 12,16 ml e 10,92 ml. (A2 e B2) Analisi su gel di poliacrilammide delle frazioni eluite; M: marcatore di peso molecolare; rettangolo nero: frazioni eluite contenenti i peptidi PS1-70 e PS1-120. (A3 e B3) Massa deconvoluta dei peptidi PS1-70 e PS1-120.

La Figura 7 mostra i profili della composizione amminoacidica dei peptidi PS1-70 (A) e PS1-120 (B). I grafici della figura indicano che le sequenze aminoacidiche di detti peptidi contengono entrambe una significativa rappresentazione di amminoacidi promotori di disordine strutturale (grigio scuro) rispetto agli aminoacidi che promuovono una struttura secondaria ordinata (grigio chiaro).

Nella Figura 8, i grafici A e B illustrano i risultati degli esperimenti di Light Scattering condotti mediante SEC-MALS-QELS sui peptidi PS1-70 (A) e PS1-120 (B) a pH 8,0 come descritto negli esempi 1 e 2. I picchi delle curve sono rappresentativi di proteine monomeriche in soluzione. La Figura 8 (C,D) mostra gli spettri dicroici dei peptidi purificati PS1-70 (C) e PS1-120 (D) registrati alla temperatura di 20?C utilizzando i peptidi PS1-70 e PS1-120 alle concentrazioni, rispettivamente, 4,4 ?M e 3,5 ?M in 10 mM tampone fosfato. Sull?asse delle ascisse ? riportata la lunghezza d?onda (nm), sull?asse delle ordinate ? riportato il valore dell?ellitticit? molare media per residuo.

La Figura 9 mostra la quantificazione relativa dell?espressione di geni indotti in piante di pomodoro dopo 6 ore (A) e 24 ore (B) dall?applicazione fogliare dei peptidi PS1-70 e PS1-120 a concentrazione 100 pM. L?analisi ? stata condotta sui geni Lox C, AOS, Pin I e Pin II. Le lettere indicano la significativit? statistica dei dati (ANOVA), ogni lettera rappresenta un gruppo statistico.

La Figura 10 illustra gli effetti del trattamento di foglie di piante di pomodoro con i peptidi PS1-70 e PS1-120 su larve del lepidottero S. littoralis. L?istogramma (A) mostra la variazione del peso medio, espresso in grammi, delle larve alimentate con le foglie trattate con i peptidi PS1-70 e PS1-120 e del relativo controllo, misurato ai giorni 1, 3, 5, 8, 10, 12, 15. Le lettere indicano la significativit? statistica dei dati (ANOVA), ogni lettera rappresenta un gruppo statistico. L?istogramma (B) riporta il tasso di mortalit? registrato ogni giorno per le larve alimentate con le foglie di piante di pomodoro trattate con i peptidi dell?invenzione e relativo controllo (Long-Rank test; ****p<0,0001).

La Figura 11 mostra la riduzione delle aree di necrosi generate dal fungo necrotrofo B. cinerea sulle foglie di piante di pomodoro (A) e sulle foglie di piante di melanzana (B) dopo trattamento con i peptidi PS1-70 e PS1-120, rispetto ai controlli non trattati, come illustrato nell?esempio 4. Le aree medie delle necrosi sono state misurate dopo 1, 3, 5 e 8 giorni dall?inoculo del patogeno. Le lettere indicano la significativit? statistica dei dati (ANOVA), ogni lettera rappresenta un gruppo statistico.

La Figura 12 mostra la quantificazione relativa dell?espressione di geni indotti in piante di pomodoro trattate per irriguo con il peptide PS1-70 a concentrazione 100 pM, in assenza di sale (A) (0 mM NaCl) e in presenza di sale (B) (80 mM NaCl). L?analisi ? stata condotta sui geni cat1, tft1, Sam, HSFA2, HSP70, HSP90, MPK1 e WRKY40. Gli asterischi indicano la significativit? statistica dei dati al test t di Student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001).

La Figura 13 mostra una tabella con i risultati della valutazione dell?effetto tossico diretto dei peptidi dell?invenzione saggiati a concentrazioni crescenti su larve di S. littoralis, come illustrato nell?esempio 4. Il tasso di sopravvivenza ? stato registrato fino allo stadio di crisalide per le larve a cui sono stato iniettati o applicati sull?epidermide i peptidi PS1-70 e PS1-120.

La Figura 14 mostra la valutazione dell?effetto tossico diretto dei peptidi PS1-70 e PS1-120 saggiati a concentrazioni crescenti quando aggiunti al mezzo di crescita di due diversi funghi: B. cinerea (A)e Trichoderma T22 (B). La crescita del fungo ? stata misurata dopo 24 ore dall?aggiunta dei peptidi dell?invenzione come livello di torbidit? del mezzo (assorbanza a 600 nm). Le lettere indicano la significativit? statistica dei dati (ANOVA), ogni lettera rappresenta un gruppo statistico.

ESEMPIO 1: Clonaggio, espressione e purificazione dei peptidi secondo l?invenzione

Allo scopo di isolare le sequenze nucleotidiche codificanti i peptidi dell?invenzione, sono state allestite reazioni PCR impiegando le coppie di primer di amplificazione le cui sequenze sono riportate nella tabella della Figura 4, e usando come stampo il cDNA codificante per l?intera Prosistemina.

Gli amplificati sono stati sottoposti a digestione tramite l?utilizzo degli enzimi di restrizione NcoI e XhoI, e successivamente clonati nel vettore pETM11 precedentemente digerito con i medesimi enzimi. Il pETM11 (gentile concessione da EMBL, Heidelberg) ? un vettore di espressione procariotico che ? in grado di aggiungere una coda di sei istidine (His-tag) nella porzione amino(N-)terminale della proteina clonata e che presenta un sito di riconoscimento per la proteasi TEV (Tobacco Etch Virus), a valle della sequenza His-tag per consentire la rimozione di quest?ultima (Figura 1).

L'integrit? dei frammenti clonati e l?assenza di possibili mutazioni occorse durante la reazione di ligazione ? stata confermata attraverso il sequenziamento dei costrutti ottenuti (Figure 2A e 3A). Dopo iniziale screening, l?espressione su larga scala dei peptidi dell?invenzione PS1-70 e PS1-120 ? stata condotta nel ceppo di Escherichia coli BL21(DE3) per 16 ore a 22?C in presenza di 2 mM IPTG in terreno di coltura LB e 2-YT. Le Figure 2B e 3B mostrano, rispettivamente, le sequenze aminoacidiche dei peptidi ottenuti PS1-70 (SEQ ID NO. 1) e PS1-120 (SEQ ID NO. 2), evidenziate in grassetto, ciascuna coniugata all?estremit? N-terminale all?estremit? C-terminale di una coda di istidine, evidenziata con sottolineature.

La purificazione dei peptidi dopo l?espressione ? stata eseguita a temperatura ambiente su FPLC-?KTA (GE Healthcare) attraverso cromatografia di affinit? (IMAC) (Figura 5) e cromatografia ad esclusione molecolare (SEC) (Figura 6) ottenendo rese di 2mg/L di coltura cellulare.

ESEMPIO 2: Analisi della struttura dei peptidi secondo l?invenzione

Nel corso della procedura di identificazione dei peptidi dell?invenzione i presenti inventori hanno riscontrato notevoli difficolt? a causa delle caratteristiche peculiari dei peptidi PS1-70 e PS1120, primariamente la significativa presenza nella loro sequenza primaria di residui aminoacidici che promuovono il disordine strutturale (Figura 7). Entrambi i peptidi PS1-70 e PS1-120 hanno presentato una migrazione aberrante quando sottoposti ad elettroforesi SDS-PAGE, migrando con un peso molecolare apparente di 20-25 kDa rispetto al loro reale peso (PM PS1-70 = 11kDa; PM PS1-120 = 17kDa) e anche in questo caso, la spettrometria di massa ha confermato il peso molecolare esatto dei due peptidi ricombinanti (Figura 6, A3 e B3).

Inoltre durante la cromatografia ad esclusione molecolare (SEC), i peptidi PS1-70 e PS1-120 hanno mostrato un volume di ritenzione rispettivamente di 12,16 ml e 10,92 ml (Figura 6) indicativo di un oligomero o di una proteina avente scarsa compattezza. Esperimenti di Light Scattering condotti mediante SEC-MALS-QELS hanno evidenziato che, indipendentemente dal volume di ritenzione, i peptidi dell?invenzione sono presenti in soluzione come proteine monomeriche monodisperse aventi un peso molecolare rispettivamente di 9,36 ? 0,6 kDa per PS1-70 e 19,98 ? 1,5 kDa per PS1-120 in accordo con quello teorico (Figura 8A, 8B).

La struttura secondaria dei peptidi PS1-70 e PS1-120 ? stata poi analizzata mediante dicroismo circolare (CD). Lo spettro CD Far-UV ottenuto ha mostrato per entrambi i peptidi analizzati valori di ellitticit? molare negativa a 198 e 190 nm. Tuttavia i valori di ellitticit? osservati a 200 e 222 nm sono indicativi di una qualche struttura secondaria (Figura 8C, 8D). Le suddette caratteristiche sono tipiche di una proteina disordinata che possiede larghe porzioni non strutturate. Ci? ? probabilmente correlato sia all'alto numero di residui acidi (carichi negativamente a pH fisiologico) responsabili della repulsione intrinseca, sia al basso contenuto di residui idrofobici che generalmente aiutano le proteine ad assumere un corretto ripiegamento (folding).

ESEMPIO 3: Induzione dell?espressione di geni di difesa nelle piante da parte dei peptidi secondo l?invenzione

Allo scopo di analizzare l?attivit? biologica dei peptidi dell?invenzione, i presenti inventori hanno condotto studi atti a misurare l'espressione di geni di difesa nelle piante di pomodoro (Solanum lycopersicum) dopo l?applicazione dei peptidi PS1-70 e PS1-120 su queste piante. Detti peptidi sono stati saggiati a concentrazioni picomolari (pM) in tampone PBS 1X (NaCl 0,14 M, KCl 0,0027 M, tampone fosfato 0,01 M, pH 7,4) applicando 2 ?l della composizione acquosa comprendente i peptidi su diversi punti della pagina superiore di foglie espanse di piante di pomodoro dell?et? di quattro settimane.

I campioni fogliari sono stati prelevati dopo 6 ore e 24 ore dall?applicazione dei peptidi dell?invenzione per essere sottoposti all?estrazione dell?RNA e alla successiva analisi dell?espressione genica. In particolare, sono stati selezionati e analizzati quattro geni noti per essere correlati alla difesa nelle piante: due geni con espressione precoce attivi nella via biosintetica degli ottadecanoidi che porta alla formazione dell?acido Jasmonico (JA), quali il gene Lipossigenasi C (Lox C) ed il gene allene ossido sintasi (AOS), e due geni con espressione tardiva quali il gene inibitore di proteinasi I (Pin I) ed inibitore di proteinasi II (Pin II).

Tutti i geni analizzati sono risultati significativamente sovra-espressi in seguito all?applicazione esogena di entrambi i peptidi dell?invenzione (Figura 9).

ESEMPIO 4: I peptidi secondo l?invenzione promuovono la resistenza agli stress biotici nelle piante Al fine di dimostrare che i peptidi dell?invenzione sono capaci di promuovere la resistenza delle piante contro organismi patogeni, i presenti inventori hanno condotto studi mirati a verificare gli effetti che conseguono al trattamento delle piante con i peptidi PS1-70 e PS1-120 su insetti erbivori o funghi fitopatogeni. Pi? specificamente, i presenti inventori hanno monitorato due diversi parametri, ossia le variazioni nell?accrescimento ponderale e nel tasso di sopravvivenza di larve di Spodoptera littoralis, un lepidottero che produce considerevoli danni alle piante di pomodoro, e la colonizzazione delle piante da parte del fungo fitopatogeno necrotrofo Botrytis cinerea, agente del marciume grigio del pomodoro.

In breve, larve di S. littoralis sono state allevate in camera climatica a 25?C, al 70% di umidit? relativa (RH), con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 di buio, alimentate su dieta artificiale fino al completamento della prima muta. Per i biosaggi, 150 larve per ogni tesi sono state allevate su foglie di pomodoro per tutta la durata della seconda et? per adattarle al diverso regime alimentare. Le larve appena mutate in terza et? e fino allo stadio di muta sono state alimentate con piante su cui era stata applicata una composizione comprendente i peptidi PS1-70 e PS1-120 alla concentrazione 100 pM in tampone PBS 1X. Come controllo, sono state impiegate larve alimentate con piante trattate soltanto con tampone PBS 1X. I biosaggi sono stati condotti nelle medesime condizioni ambientali, in vassoi di plastica da 32 pozzetti contenenti agar 1,5% (p/v) emetilparaidrossibenzoato 0,005% (p/v) utili a creare un ambiente umido per il mantenimento del turgore cellulare delle foglie di pomodoro. Ogni gruppo sperimentale era costituito da 32 larve. La sopravvivenza delle larve ? stata monitorata ogni giorno e, ogni due giorni, il peso delle stesse. Le larve alimentate con foglie trattate con i peptidi dell?invenzione hanno mostrato una riduzione di peso durante tutta la durata del biosaggio rispetto a quelle alimentate con le foglie controllo, facendo registrare una differenza significativa a partire gi? dal terzo giorno. In particolare, al giorno 15 del biosaggio, le larve alimentate con le foglie controllo presentavano un peso medio di 38 mg mentre quelle alimentate con foglie trattate con i peptidi PS1-70 e PS1-120 presentavano un peso medio rispettivamente di 15 e 20 mg (Figura 10A). ? stata inoltre osservata una diminuzione significativa della sopravvivenza delle larve alimentate con foglie di piante trattate con i peptidi dell?invenzione, rispetto a quelle alimentate con le foglie di piante controllo (Figura 10B). Infatti, al giorno 15 del biosaggio si ? osservato una percentuale di sopravvivenza del 96,78% per le larve alimentate con le foglie controllo e rispettivamente del 34,37% e del 31,25% per quelle alimentate con le foglie trattate con i peptidi dell?invenzione (Figura 10B). Risultati simili sono stati ottenuti a seguito dell?applicazione di composizioni contenenti concentrazione femtomolari dei peptidi PS1-70 e PS1-120.

Per l?esecuzione dei saggi sul fungo fitopatogeno Botrytis cinerea, i presenti inventori hanno impiegato spore di questo microorganismo ottenute da colture su substrato solido di sporulazione MEP. Le piastre sono state inoculate con 20 ?l di sospensione conidica alla concentrazione di 1x10<6 >spore/ml ed incubate per 15 giorni a 22?C in presenza di luce diffusa, in modo da ottenere una completa sporulazione. Le spore sono quindi state raccolte in 5 ml di acqua sterile e, allo scopo di allontanare il micelio, sono state filtrate mediante lana di vetro, lavate con acqua distillata sterile e raccolte mediante centrifugazione a temperatura ambiente. La concentrazione delle spore idonea per l?inoculo (10<5>-10<7 >spore/ml) ? stata determinata con il metodo delle diluizioni seriali e usando una camera contaglobuli di Burker per la conta delle spore. Il saggio ? stato condotto su foglia staccata prelevando una foglia composta per ciascuna pianta di pomodoro trattata e per ogni pianta controllo. Ogni fogliolina della foglia composta ? stata contrassegnata con 3 segni di pennarello in modo da guidare la successiva applicazione delle spore e rilevazione delle aree necrotiche di sviluppo del patogeno.

Le foglie sono state trattate effettuando applicazioni di 2 ?l di una composizione comprendente i peptidi PS1-70 e PS1-120 dell?invenzione alla concentrazione 100 pM o di PBS 1X per le foglie controllo. Trascorse 6 ore, tempo necessario per la percezione dei peptidi, le foglie sono state staccate dalla pianta e sono stati effettuati degli inoculi con 10 ?l di soluzione di spore negli spazi internevali e in prossimit? dei punti precedentemente segnati. Per il monitoraggio sono state effettuate misurazioni delle aree di necrosi (espresse in mm<2>) dopo 1, 3, 5, 8 giorni dall?inoculo del patogeno. Le aree delle necrosi registrate sulle foglie controllo sono risultate molto pi? ampie rispetto a quelle rilevate su piante trattate con i peptidi dell?invenzione. Questa differenza ? aumentata in funzione del tempo trascorso dall?inoculo. L?effetto di induttore di resistenza del trattamento risulta essere statisticamente significativo gi? dal primo giorno dall?inoculo del patogeno fino all?ottavo giorno dove sono stati raggiunti valori di 33 mm<2 >per le foglie controllo, a differenza delle foglie trattate dove sono stati registrati valori non superiori ai 18 mm<2 >per entrambi i peptidi (Figura 11A).

I presenti inventori hanno anche condotto dei saggi mirati a determinare gli effetti dell?applicazione esogena dei peptidi dell?invenzione, a concentrazioni picomolari e femtomolari, contro lo sviluppo del fungo necrotrofo su piante di Solanum melongena (melanzana).

Come illustrato nella Figura 11B, i saggi che sono stati condotti hanno evidenziato una riduzione significativa della colonizzazione delle piante trattate da parte del fungo rispetto a quelle di controllo, e l?effetto pi? marcato ? stato osservato in seguito al trattamento con la pi? bassa concentrazione dei peptidi dell?invenzione. L?effetto positivo del trattamento risulta essere statisticamente significativo dal terzo giorno dall?inoculo del patogeno fino all?ottavo giorno dove sono stati raggiunti valori di 11 mm<2 >per le foglie controllo, a differenza delle foglie trattate dove sono stati registrati valori di 8,4 e 6,0 mm<2 >per le foglie trattate con i peptidi PS1-70 e PS1-120 alla concentrazione 100 pM e valori di 6,2 e 4,10 mm<2 >per le foglie trattate con detti peptidi alla concentrazione 100 fM (Figura 11B). Simili risultati sono stati ottenuti su piante di vite ed olivo.

Ulteriori studi sono stati condotti dai presenti inventori allo scopo di indagare la presenza di un eventuale effetto tossico diretto dei peptidi PS1-70 e PS1-120 sugli organismi patogeni testati. Come si evince dai dati riportati nella tabella di Figura 13, la somministrazione dei peptidi dell?invenzione per via orale o mediante iniezione sull?epidermide di larve di S. littoralis non ha avuto alcun effetto sulla sopravvivenza e sullo sviluppo di queste.

Inoltre, come illustrato in Figura 14A, la crescita del fungo B. cinerea non ? risultata essere perturbata quando al mezzo di crescita sono stati aggiunti i due peptidi dell?invenzione. Ulteriori studi sono stati condotti sul ceppo T22 di Trichoderma harzianum e anche in questo caso, come si evince dalla figura 14B, l?aggiunta dei peptidi PS1-70 e PS1-120, sia alla concentrazione 100 pM che 100 fM, non ha avuto alcun effetto sulla crescita del fungo. Si ? osservato invece un aumento della crescita del fungo T22 quando al mezzo di crescita ? stato aggiunto il peptide PS1-70, suggerendo la possibilit? che il fungo utilizzi tale proteina come fonte di amminoacidi.

In sintesi, i risultati sperimentali precedentemente descritti dimostrano che i peptidi PS1-70 e PS1-120 dell?invenzione sono biologicamente attivi e che la loro applicazione esogena promuove nelle piante la resistenza ad insetti e funghi dannosi.

ESEMPIO 5: I peptidi secondo l?invenzione promuovono la resistenza agli stress abiotici nelle piante Nel corso dei loro studi, i presenti inventori hanno altres? allestito esperimenti mirati a verificare l?efficacia dei peptidi dell?invenzione nel promuovere la resistenza delle piante contro diversi stress abiotici.

Attraverso gli esperimenti condotti, gli inventori hanno rilevato innanzitutto che l?applicazione dei peptidi dell?invenzione su piante di pomodoro provoca un incremento della biomassa delle stesse e favorisce la produzione di bacche pi? grandi e con un maggior numero di semi. I risultati di esperimenti successivi, come illustrati nella Figura 12, hanno dimostrato che l'applicazione dei peptidi PS1-70 e PS1-120 protegge la pianta di pomodoro dallo stress salino. In breve, dopo 48 ore dall?applicazione per irriguo dei peptidi PS1-70 e PS1-120 alla concentrazione 100 pM, le piante trattate, diversamente da quelle di controllo, sono risultate in grado di attivare una serie di geni e fattori trascrizionali responsivi allo stress salino, dimostrando in tal modo che i peptidi dell?invenzione sono in grado di stimolare uno stato di allerta nella pianta, noto come priming. Inoltre, in presenza di uno stress salino (80 mM NaCl) le piante di pomodoro trattate con i peptidi dell?invenzione sono risultate pi? tolleranti al sale rispetto alle piante controllo non trattate, mostrando in particolare una maggiore induzione dei geni responsivi a tale stress (Figura 12B). Esperimenti simili hanno inoltre dimostrato che l'applicazione del peptide PS1-120 su piante di pomodoro provoca una riduzione del danno da alta temperatura.

Claims (15)

RIVENDICAZIONI

1. Peptide isolato consistente di una sequenza aminoacidica scelta dal gruppo che consiste delle sequenze aminoacidiche SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 e loro frammenti di almeno 8 aminoacidi di lunghezza aventi attivit? biostimolante e bioprotettiva nei confronti di stress abiotici e biotici delle piante, detto peptide essendo opzionalmente coniugato con una coda di istidine all?estremit? amino-terminale o all?estremit? carbossi-terminale.

2. Peptide isolato secondo la rivendicazione 1, in cui detti frammenti sono scelti dal gruppo che consiste delle sequenze aminoacidiche SEQ ID NO. 3 - 9.

3. Sequenza isolata di acido nucleico codificante un peptide secondo la rivendicazione 1 o 2.

4. Vettore di espressione comprendente una sequenza di acido nucleico secondo la rivendicazione 3.

5. Cellula ospite comprendente un vettore di espressione secondo la rivendicazione 4.

6. Procedimento per la preparazione di un peptide secondo la rivendicazione 1 o 2, comprendente il passaggio di coltivare una cellula ospite secondo la rivendicazione 5 in condizioni idonee e per un tempo sufficiente per l?espressione del peptide e, opzionalmente, il passaggio di recuperare il peptide dalla coltura.

7. Composizione biostimolante e bioprotettiva nei confronti di stress abiotici e biotici delle piante comprendente almeno un peptide secondo la rivendicazione 1 o 2, o qualsiasi loro combinazione, e opzionalmente un agente tampone, preferibilmente tampone fosfato salino.

8. Composizione biostimolante e bioprotettiva secondo la rivendicazione 7, in cui l?almeno un peptide ? presente in una concentrazione compresa fra 0,01 picomolare (pM) e 100 pM.

9. Composizione biostimolante e bioprotettiva secondo la rivendicazione 7 o 8, comprendente altres? un microorganismo scelto dal gruppo che consiste di funghi micorrizici, funghi saprofiti, batteri che promuovono la crescita delle piante, spore di batterio Bacillus thuringiensis, e qualsiasi loro combinazione.

10. Composizione biostimolante e bioprotettiva secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 a 9, che ? una composizione liquida a base di acqua.

11. Composizione biostimolante e bioprotettiva secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 a 9, che ? in forma liofilizzata.

12. Procedimento per promuovere la risposta a stress biotici e/o abiotici in una pianta, comprendente il passaggio di applicare sulla pianta, parti della pianta, materiale di propagazione della pianta, e/o luogo di crescita della pianta una composizione biostimolante e bioprotettiva secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 a 11.

13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui la composizione biostimolante e bioprotettiva viene applicata mediante spruzzo, irriguo o in soluzione idroponica.

14. Procedimento secondo la rivendicazione 12 o 13, in cui la pianta ? una pianta appartenente alla famiglia delle Solanaceae, Vitaceae, Rosaceae o Oleaceae.

15. Uso di un peptide isolato secondo la rivendicazione 1 o 2, e/o di una composizione biostimolante e bioprotettiva secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 a 11, per promuovere la risposta a stress biotici e/o biotici in una pianta.