JP2023535831A - 生体刺激および生体防御ペプチドならびにその農業における使用 - Google Patents

生体刺激および生体防御ペプチドならびにその農業における使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、植物の生体刺激および生体防御活性を有する新規な単離ペプチド、および該ペプチドを含む組成物に関する。好ましくは、本発明のペプチドは、ソラナム・リコペルシコン(トマト)植物に由来し、組換え法または合成法で製造される。また、植物における生物的ストレスおよび／または非生物的ストレスに対する耐性を高めるための該ペプチドおよび／または組成物の使用にも関する。

Description

本発明は、農業の分野、より具体的には、植物の成長促進および生産性を向上することを目的とした農業手段に関する。特に、本発明は、植物の生物的ストレスに対する生体刺激（バイオスティミュラント）および生体防御（バイオプロテクティブ）活性を有する新規なペプチドに関する。
農業の分野では、植物の成長、健康を促進することおよび生産性を向上させることが必要不可欠である。長年にわたり、農業方法では、植物および作物が受ける生物的ストレス、すなわちウイルス、細菌、真菌などの微生物、および線虫、昆虫、ダニなどのマイクロ微生物による攻撃、さらには水不足、高温、極寒、高塩分などの非生物的ストレスによる被害を食い止めるために様々なアプローチが開発されてきた。
従来、植物の生物的ストレスおよび非生物的ストレスは、肥料および農薬の使用、物理的な土壌改良の導入などにより制御されてきた。しかしながら、農薬の使用は、過剰に使用されたり、環境中に残留し、食用部分への有害物質の残留により、ヒトの健康に大きな被害を与えるなど、長期的に環境に深刻な影響を与え得る。また、作物保護剤は、その作用に対する耐性株が病原菌の集団の中に出現することにより、時間の経過とともにその効果を失うことがある。
危険な戦略の使用を制限するため、植物の成長およびストレス耐性を促進することで作物の生産性を向上させる試みにより、生態学的に慎重かつ持続可能なアプローチを開発し、それを実施するために、多くの努力が払われてきた。
米国特許第ＵＳ５，３７８，８１９号、同第ＵＳ５，８８３，０７６号および同第ＵＳ６，０２２，７３９号は、植物ペプチドホルモンであるシステミン（Systemin）の単離、および咀嚼害虫または機械的損傷によって引き起こされる損傷に応答したソラナム・リコペルシコン（トマト）植物の防御遺伝子の活性化に該ペプチドが関与することを記載している。
システミンは、プロシステミン（ＰｒｏＳｙｓ）と呼ばれる２００アミノ酸の前駆体のカルボキシ末端領域の末端に位置する１８アミノ酸のペプチドホルモンである。植物が傷つけられると、前駆体であるプロシステミンは、おそらくスブチラーゼファミリーのアスパラギン酸特異的プロテアーゼであるフィタスパーゼを介したタンパク質分解作用を受け、システミンの放出が可能となる。このペプチドはアポプラスト（apoplast）に放出され、膜受容体ＳＹＲ１との相互作用により、防御シグナルを活性化する（Narvaez-Vasquez and Orozco-Cardenas, (2008) “Systemins and AtPeps: Defense-related peptide signals”; In Induced plant resistance to herbivory (pp. 313-328). Springer, Dordrecht; Wang L. et al., (2018) “The systemin receptor SYR1 enhances resistance of tomato against herbivorous insects”, Nature plants, 4(3), 152-156)。
生理的条件下では、プロシステミン遺伝子は植物の葉、花弁および茎にフェムトモル（femtomolar）レベルで発現されるが、根には発現されない（Pearce G. et al., (1991) “A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor protein”, Science, 253(5022), 895-897; Narvaez-Vasquez, J., and Ryan, C. A., (2004) “The cellular localization of prosystemin: a functional role for phloem parenchyma in systemic wound signaling”, Planta, 218(3), 360-369）。逆に、機械的損傷または咀嚼害虫の攻撃による傷の場合は、プロシステミン遺伝子の発現が増加する。
トマトの植物防御機構におけるプロシステミン／システミンの役割は、プロシステミンをコードする遺伝子を過剰発現させたまたは同遺伝子をサイレンシングしたトランスジェニック植物の研究を通じて、広く知られている。特に、プロシステミンの過剰発現に伴い、昆虫の腸内でプロテアーゼ阻害タンパク質の合成が増加し、消化能力およびその後の栄養吸収が大きく低下することが検出されている（McGurl B. et al., (1994) “Overexpression of the ProSystemin gene in transgenic tomato plants generates a systemic signal that constitutively induces proteinase inhibitor synthesis”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(21), 9799-9802）。これに対し、プロシステミン遺伝子を過小発現させると、創傷後のプロテアーゼ阻害剤の産生がほぼ完全に抑制され、その結果、植物がタバコスズメガ（Manduca sexta）幼虫に対してより感受性を示す（Orozco-Cardenas et al., (1993) “Expression of an antisense prosystemin gene in tomato plants reduces resistance toward Manduca sexta larvae”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 90(17), 8273-8276）。
最近の研究では、プロシステミン遺伝子を構成的に発現する植物が、幅広い防御シグナルを活性化することで、数多くの生物ストレスから身を守り得ることが確認されている（Coppola M. et al., (2015) “Prosystemin overexpression in tomato enhances resistance to different biotic stresses by activating genes of multiple signaling pathways”, Plant molecular biology reporter, 33(5), 1270-1285）。特に、これらの植物は、草食性昆虫の捕食者および寄生虫を誘引する揮発性化合物の混合物を放出できるため、植物の間接的な防御力が向上し（Corrado G. et al., (2007), “Systemin regulates both systemic and volatile signaling in tomato plants”, Journal of chemical ecology, 33(4), 669-681)、死体栄養性の菌（necrotrophic fungi）およびアブラムシによる攻撃に対して抵抗力があり（El Oirdi et al., (2011) “Botrytis cinerea manipulates the antagonistic effects between immune pathways to promote disease development in tomato”, Plant Cell 23, 2405-2421）、ウイルス感染にもより耐性であり（Bubici G. et al., (2017) “Prosystemin overexpression induces transcriptional modifications of defense-related and receptor-like kinase genes and reduces the susceptibility to Cucumber mosaic virus and its satellite RNAs in transgenic tomato plants”, PloSone, 12(2), e0171902）、そして同時に塩ストレス条件に対して耐性がある（Orsini F. et al., (2010) “Systemin‐dependent salinity tolerance in tomato: evidence of specific convergence of abiotic and biotic stress responses”, Physiologia plantarum, 138(1), 10-21）。
また、プロシステミン前駆体タンパク質のシステミンペプチドを欠く部分にはまた、防御遺伝子の活性化を誘導する機能があることも知られている。Corrado G. et al, (2016) “The expression of the tomato prosystemin in tobacco induces alterations irrespective of its functional domain”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 125(3), 509-519に記載されている、プロシステミン遺伝子の代わりに、構造的に全く異なる機能的なオルソログを含むタバコ植物で行われた研究は、システミンを除いたプロシステミンをコードする配列でこれらの植物を形質転換することにより、欠失した前駆タンパク質が合成され、一連の防御関連遺伝子が活性化されるとともに、ボトリチスシネレア菌に対する耐性が高まることを示している。
プロシステミンタンパク質の内因性発現／過剰発現の効果に関する研究は有望であるものの、植物の遺伝子工学的手法に基づく農学的アプローチは、複雑で手間がかかり、かつ費用のかかる技術的手順を必要とし、結果として適用範囲が限定されるという疑いようのない限界がある。また、上記のような限界は、難しい法律および規制の問題を伴う。
そのため、植物の良好な状態および健康状態を効果的に保全および改善し、作物の品質を高めることを目的とし、かつ実施が容易かつ環境への負荷が少ない方法を提供することが必要とされている。
このニーズおよび他のニーズは、本発明が、添付の特許請求の範囲の請求項１に記載の単離ペプチド、請求項８に記載の生体刺激および生体防御組成物、ならびに請求項１３に記載の植物における生物的ストレスおよび／または非生物的ストレスに対する耐性を増大させる方法を提供することにより、解決された。
添付の特許請求の範囲の独立請求項および従属請求項は、本明細書の不可欠な部分を構成している。
以下の実験部分でより詳細に説明されるように、本発明者らは、驚くべきことに、プロシステミンポリペプチドから単離し、その後、例えば葉面への散布または灌漑によって植物に外から投与されたとき、有利には、病原体に対する直接的な殺生作用なしに、該植物に成長生体刺激活性をもたらし、同時に生物的ストレスおよび非生物的ストレスに対する防御メカニズムを誘発できるペプチドを作製した。
理論にとらわれることを望むものではないが、本発明者らは、有害な昆虫および菌類の作用に対する、本発明のペプチドによる処理後に植物、特にトマト植物に誘導される耐性は、植物の内因性防御機構の制御に関与する遺伝子の活性化によって介在されると考える（図９に示す）。
図１７～２０に示した結果は、本発明によるペプチドが、処理された植物において高塩分などの外来ストレスに対する耐性の重要なシグナルを誘発できることも驚くべきことに示している。
従って、本発明の１つの目的は、配列番号１、２、２３～２６および少なくとも８アミノ酸長の配列番号２のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、かつ植物の生物的ストレスおよび非生物的ストレスに対する生体刺激活性および生体防御活性を有する単離ペプチドであって、該ペプチドは要すればアミノ末端またはカルボキシ末端にヒスチジンテールを連結していてよい。
本発明者らの研究により、本発明のペプチド（以下、ＰＳ１－７０（配列番号１）およびＰＳ１－１２０（配列番号２）と称する）は、プロシステミンポリペプチドのアミノ（Ｎ－）末端領域に、より具体的には前駆体のうちホルモンであるシステミンを含まない部分に含まれていることが明らかになった。
反復アミノ酸モチーフの存在に基づくバイオインフォマティクスアプローチを用いて実施されたさらなる研究において、本発明者らは、アミノ酸配列ＤＤＡＱＥＫＰＫＶＥＨＥＥＧ（配列番号２３）、ＤＫＥＴＰＳＱＤＩ（配列番号２４）、ＤＤＡＱＥＫＬＫＶＥＹＥＥＥＥＹＥＫＥＫＩＶＥＫＥＴＰＳＱＤＩ（配列番号２５）およびＤＤＡＱＥＫＰＫＶＥＨＥＥＧＤＤＫＥＴＰＳＱＤＩ（配列番号２６）からなるペプチドもまた同定した。
実施例２に記載の通り、電気泳動移動プロファイルが異常であるため、本発明者らによる本発明の目的ペプチドの同定は特に困難であり、複雑な検討を要した。その後、当該ペプチドのアミノ酸配列を解析した結果、構造的混乱(structural disorder)を助長することが知られているアミノ酸残基が当該配列に多く含まれていることが明らかになった。
本明細書でアミノ酸配列に関して用いられる用語“フラグメント”は、より長いアミノ酸配列の一部を表すアミノ酸残基の連続配列を意味する。
一態様によれば、単離ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列の、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長、少なくとも４０アミノ酸長、少なくとも４５アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、少なくとも５５アミノ酸長、少なくとも６０アミノ酸長、少なくとも６５アミノ酸長、少なくとも７０アミノ酸長、少なくとも７５アミノ酸長、少なくとも８０アミノ酸長、少なくとも８５アミノ酸長、少なくとも９０アミノ酸長、少なくとも９５アミノ酸長、少なくとも１００アミノ酸長、少なくとも１１０アミノ酸長、または少なくとも１２０アミノ酸長のフラグメントからなる。
好ましい態様において、単離ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列の、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、２１アミノ酸長、２２アミノ酸長、２３アミノ酸長、２４アミノ酸長、２５アミノ酸長、２６アミノ酸長、２７アミノ酸長、２８アミノ酸長、２９アミノ酸長、３０アミノ酸長、３１アミノ酸長、３２アミノ酸長、３３アミノ酸長、３４アミノ酸長、３５アミノ酸長、３６アミノ酸長、３７アミノ酸長、３８アミノ酸長、３９アミノ酸長、４０アミノ酸長、４１アミノ酸長、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、６０アミノ酸長、６１アミノ酸長、６２アミノ酸長、６３アミノ酸長、６４アミノ酸長、６５アミノ酸長、６６アミノ酸長、６７アミノ酸長、６８アミノ酸長、６９アミノ酸長、７０アミノ酸長、７１アミノ酸長、７２アミノ酸長、７３アミノ酸長、７４アミノ酸長、７５アミノ酸長、７６アミノ酸長、７７アミノ酸長、７８アミノ酸長、７９アミノ酸長、８０アミノ酸長、８１アミノ酸長、８２アミノ酸長、８３アミノ酸長、８４アミノ酸長、８５アミノ酸長、８６アミノ酸長、８７アミノ酸長、８８アミノ酸長、８９アミノ酸長、９０アミノ酸長、９１アミノ酸長、９２アミノ酸長、９３アミノ酸長、９４アミノ酸長、９５アミノ酸長、９６アミノ酸長、９７アミノ酸長、９８アミノ酸長、９９アミノ酸長、１００アミノ酸長、１０１アミノ酸長、１０２アミノ酸長、１０３アミノ酸長、１０４アミノ酸長、１０５アミノ酸長、１０６アミノ酸長、１０７アミノ酸長、１０８アミノ酸長、１０９アミノ酸長、１１０アミノ酸長、１１１アミノ酸長、１１２アミノ酸長、１１３アミノ酸長、１１４アミノ酸長、１１５アミノ酸長、１１６アミノ酸長、１１７アミノ酸長、１１８アミノ酸長、１１９アミノ酸長または１２０アミノ酸長のフラグメントからなる。
特に、以下の具体的なアミノ酸配列が好ましい：ＥＫＥＴＰＳＱＤＩ（配列番号３）、ＥＫＥＴＩＳＱＹＩ（配列番号４）、ＤＤＭＱＥＥＰＫＶＫＬＨＨＥＫＧ（配列番号５）、ＤＤＴＱＥＩＰＫＭＥＨＥＥＧ（配列番号６）、ＤＤＡＱＥＫＬＫＶＥＹＥＥＥ（配列番号７）、ＤＤＭＱＥＥＰＫＶＫＬＨＨＥＫＧＧＤＥＫＥＫＩＩＥＫＥＴＰＳＱＤＩ（配列番号８）およびＤＤＴＱＥＩＰＫＭＥＨＥＥＧＧＹＶＫＥＫＩＶＥＫＥＴＩＳＱＹＩ（配列番号９）。
一態様によれば、本発明の単離ペプチド対象は、要すればアミノ末端（Ｎ末端）またはカルボキシ末端（Ｃ末端）にヒスチジンテールを連結していてもよい。
本発明において、用語“連結された（conjugated）”とは、リンカーによって先行されるか否かにかかわらず、本発明のペプチドのＮ末端のアミノ酸とヒスチジンテールのＣ末端のアミノ酸との間の共有結合の存在（図２Ｂおよび３Ｂに例示される）、またはその逆の、本発明のペプチドのＣ末端のアミノ酸とヒスチジンテールのＮ末端のアミノ酸との間の共有結合の存在を意味する。
当技術分野で知られているように、ヒスチジンテールとの連結は、遷移金属イオンを含むマトリックス上でのタンパク質精製手順を単純化するため、タンパク質化学において日常的に使用されており、抗ヒスチジンテール抗体の使用は、局在化および免疫沈降試験において有用なツールともなっている。
ヒスチジンテールに連結されたペプチドの製造方法は、公知であり、例えば、組換えタンパク質産物を発現させることにより、当技術分野の技術水準において説明されている。
別の態様によれば、本発明の単離ペプチド対象は、アセチル化修飾されたアミノ末端(Ｎ末端）および／またはアミド化修飾されたカルボキシ末端（Ｃ末端）を含む。当該技術分野で広く説明されているように、上記の改変は、有利には、ペプチドの安定性ならびにアミノペプチダーゼ、エキソペプチダーゼおよびシンテターゼによる酵素分解に対するその耐性を高めることを可能にする。
本発明のさらなる目的は、上記で定義されたような単離ペプチドをコードする単離核酸配列である。
好ましくは、単離された核酸配列は、配列番号１０および配列番号１１のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
上記で定義された核酸配列を含み、要すればプロモーター配列およびポリアデニル化シグナル配列をさらに含む発現ベクター、ならびに当該発現ベクターを含む宿主細胞も、本発明の範囲に含まれる。
ペプチドまたはタンパク質の製造に用いる組換え発現ベクターは、当技術分野で知られており、かつ記載されているため、その選択および使用は、当業者の技術範囲内である。このようなベクターは、原核生物であっても真核生物であってもよい。ｐＥＴ１５またはｐＥＴ３０などのＰＥＴシリーズ（Novagen）、およびｐＧＥＸシリーズ（GE Healthcare）の原核生物ベクターが、限定されない例として挙げられる。
真核生物ベクターの例としては、Pichia pastoris酵母細胞に用いられるｐＰＩＣシリーズのベクターが挙げられる。
好ましくは、本発明の発現ベクターを発現させるために用いられる細胞系は、原核生物系、例えば大腸菌細胞から選択される。
あるいは、発現細胞系は、真核生物系、例えば、出芽酵母およびピキアパストリスなどの酵母細胞であってもよい。
本発明のさらなる目的は、本発明のペプチドの製造方法であって、この方法により、形質転換された宿主細胞を、本発明のペプチドの発現に十分な時間、適切な条件下で培養する。一般的に、適切な培養条件および時間は、用いる細胞系によって変わり、例えば、培養液の組成、ｐＨ、相対湿度、Ｏ２およびＣＯ２のガス成分、および温度に関連し得る。本発明の方法で用いるための最も適切な培養条件および時間の選択は、当業者の知識および技術の範囲内である。
好ましい態様において、本発明による方法は、さらに、細胞培養物から産生されたペプチドを回収する工程を含む。回収工程は、先行技術の一部であるタンパク質精製方法を用いて、例えば、１回以上のクロマトグラフィー工程、例えば、アフィニティークロマトグラフィーもしくはサイズ排除クロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーによって、または限外ろ過、透析および／もしくは凍結乾燥によって実施できる。
本発明によるペプチドを製造するための適切な代替方法としては、例えば、化学合成手順、または、例えば、特定のプロテアーゼまたは化学材料を用いることによる前駆体タンパク質のタンパク質分解切断のための技術などが挙げられる。ペプチドを製造するために、本発明の範囲内で用いるための最も適切な方法の選択は、当業者の技術に十分含まれるものである。
上記の有利な特徴のために、本発明のペプチドは、土壌および環境の正しい管理を可能にしながら、植物成長および作物収量を改善することを目的とする農学的態様における使用に特に適している。特に、本発明によるペプチドによって行われる作用は、直接的な殺生物効果を持たないため、有利なことに、有用な受粉昆虫の集団に有害な結果を生じさせない。
ペプチドのような低分子の使用は、特定の活性を維持または増幅するために設計および／または改変するのに適しているため、本発明のさらなる利点を表している。また、ペプチドは、例えば全長のプロシステミンのような長いタンパク質と異なり、サイズが小さいため、合成や精製のコストを大幅に削減できる。
従って、本発明の１つの目的は、上記で定義された少なくとも１つのペプチド、またはそれらの何れかの組合せ、および少なくとも１つのアジュバント、安定剤および／または防腐剤を含む、植物の生物的ストレスおよび非生物的ストレスに対する生体刺激および生体防御組成物を提供することである。
組成物中の少なくとも１つのアジュバント、安定剤および／または防腐剤は、例えば、植物または種子への分配の均一性を良くするため、および／または過度の発泡を避けるために、農学技術において従来から用いられていることが好ましい。
本発明の組成物に用いるのに適したアジュバントのうち、限定されない例として、保湿剤、湿潤剤および消泡剤が挙げられる。
例示的な消泡剤には、シロキサン、ソルビトールおよびシリコンの混合物が含まれる。
例示的な保湿剤または湿潤剤には、界面活性化合物、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびベタイン、テルペン類およびアルコールの混合物などが含まれる。
本発明の組成物における安定化剤としては、例えば、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウムを含むｐＨ調整剤などが挙げられる。
本発明の生体刺激および生体防御剤組成物に使用するのに適した保存剤の例としては、デヒドロ酢酸、安息香酸、エチルヘキシルグリセリン、およびフェノキシエタノールを挙げ得る。
本発明の組成物において使用するのに適した少なくとも１つのアジュバント、安定剤および／または保存剤の選択は、当業者の技術範囲内である。
一態様では、本発明の組成物は、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドとを含む。
別の態様では、本発明の組成物は、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドを、配列番号５および配列番号８のアミノ酸配列を有するペプチドと組み合わせて含む。
さらに別の態様において、本発明の組成物は、以下のペプチドの組合せを含む：
配列番号1を有するペプチド。
配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号８のアミノ酸配列を有するペプチド；および、
配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチド。
さらなる態様において、本発明の組成物は、以下のペプチドの組合せを含む：
配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号８のアミノ酸配列を有するペプチド；および、
配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチド。
さらに別の態様において、本発明の組成物は、以下のペプチドの組合せを含む：
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号８のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号２３のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号２４のアミノ酸配列を有するペプチド；
配列番号２５のアミノ酸配列を有するペプチド；および、
配列番号２６のアミノ酸配列を有するペプチド。
欧州バイオスティミュラント産業協議会（ＥＢＩＣ）の公式定義によると、“バイオスティミュラント”とは、植物や根圏に適用することで、自然のプロセスを刺激し、栄養吸収、栄養効率、作物の品質、および生物的ストレスへの耐性を改善／促進する機能を有する物質および／または微生物を意味する。
本発明の範囲において、用語“バイオプロテクター”とは、植物または根圏に投与した後、生物的ストレスおよび非生物的ストレスに対する植物の自然な防御力の活性化を誘導する物質および／または微生物を意味する。
本明細書で用いる用語“植物”とは、生きている多細胞の植物生物を意味する。
好ましくは、植物は、例えばソラナム・リコペルシコンおよびソラナム・メロンゲナ（Solanum melongena）などのナス科植物、例えばヴィティス・ヴィニフェラ（Vitis vinifera）などのブドウ科植物、バラ科植物、例えばマルス ドメスティカ（Malus domestica）などのリンゴ科植物、例えばオリーワ オリーヴァ（Olea europaea）などのオリーブ、およびこれらの組合せからなる群より選択される科に属する。
生物学的ストレスに関しては、限定されない例として、草食性昆虫、植物病原性真菌、植物病原性細菌、ウイルスが挙げられる。
本明細書中、草食性昆虫は、例えばスポドプテラ・リットラリス（Spodoptera littoralis）およびツタ・アブソルタ（Tuta absoluta）などの鱗翅目、例えばマクロシファム・ユーフォルビアエ（Macrosiphum euphorbiae）などのアブラムシ類、例えばベミシア・タバキ（Bemisia tabaci）およびオンシツコナジラミ（Trialeurodes vaporariorum）などの同翅目、およびそれらの組合せからなる群より選択されることが好ましい。
植物病原性真菌は、好ましくは、ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、アルテルナリア・アルテルナータ（Alternaria alternata）、アルテルナリア・ソラニ（Alternaria solani）およびそれらの組合せからなる群より選択される。
植物病原性細菌は、好ましくはシュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)細菌である。
ウイルスは、好ましくは、トマト斑点萎凋病ウイルスおよびキュウリモザイクウイルスから選択される。
生物的ストレスとしては、限定されないが、例えば、凍結を引き起こす低温、高温、干ばつ、高光強度、低光強度、塩分過剰、水分過剰、およびそれらの組合せが挙げられる。
好ましくは、本発明の組成物はまた、緩衝剤を含む。本発明の生体刺激および生体防御組成物に用いるのに適した緩衝剤のうち、リン酸緩衝剤、さらに好ましくはリン酸緩衝生理食塩水が特に好ましい。しかしながら、本発明では、他の緩衝剤を使用してもよく、その選択は当業者の技術範囲に属することが理解される。
好ましくは、少なくとも１つのペプチドは、０．０２ピコモル（ｐＭ）～１００ｐＭ、より好ましくは０．０２ｐＭ～０．０８ｐＭ、または０．０８５ｐＭ～０．１ｐＭ、または０．０９５～０．２５ｐＭ、または１ｐＭ～１００ｐＭまでの濃度範囲で本発明の生体刺激および生体防御組成物中に存在する。
本発明の好ましい態様によれば、生体刺激および生体防御組成物は、菌根菌、腐生菌、植物成長促進細菌、バチルス・チューリンゲンシスの芽胞、およびそれらの何れかの組合せからなる群より選択される微生物もまた含む。
当技術分野で知られているように、地中の菌根菌は多くの作物の根と共生関係を築き、関係する生物に相互に利益をもたらしている。具体的には、菌根菌は土壌中に存在するミネラル元素が土壌の吸収力に固定されていても代謝でき、植物は光合成で生成した糖を共生菌に与えることができる。
本発明の範囲内において、菌根菌は、ギガスポラ・ファスキオラータス（Gigaspora fasciculatus）、グロムス・カンストリクタム（Glomus constrictum）、グロムス・トルツオスム（Glomus tortuosum）、グロムス・ゲオスポルム（Glomus geosporum）、ギガスポラ・マルガリタ（Gigaspora margarita）、アカウロスポア・スクロビキュラタ（Acaulospora scrobicurata）およびこれらの何れかの組合せからなる群より選択されることが好ましい。
本発明の範囲において、好ましくは、腐生菌はトリコデルマ(Trichoderma)属に属する。
腐生菌は、土壌中の植物および動物の死骸を分解する有益な活動で知られている。
本発明により、上記で定義された少なくとも１種のペプチドとトリコデルマ属に属する腐生菌とを組み合わせて含む生体刺激および生体防御組成物は、図１５に示すように、当該組み合わせが植物病原菌に対して顕著な相乗効果を有するため、とても好ましい。
本発明の範囲において、植物の成長を促進する細菌は、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）およびシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）から選択されることが好ましい。
バチルス・チューリンゲンシスは土壌中に天然に見いだされる胞子菌であり、悪条件下では胞子および殺虫作用を有するエンドトキシンを含む寄生体（通常、クリスタルと称される）を生成することが知られている。これらは、敏感な昆虫により摂取された後、寄生体から放出され、腸管上皮細胞の溶解を引き起こし、結果として昆虫を麻痺させ死亡させる。
より好ましくは、本発明による組成物中の胞子は、細菌バチルス・チューリンゲンシス・アイザワ系統に由来する。
本発明により、生体刺激および生体防御組成物は、凍結乾燥物の形態であってもよい。この態様において、本発明の組成物は、少なくとも３ヶ月間、室温で安定である。
別の態様では、本発明の組成物は、水性液体組成物またはリン酸緩衝生理食塩水の形態であってもよい。この形態では、本発明の組成物は、そのまま、または使用前に希釈して使用できる。
植物、植物の一部、植物繁殖材料、および／または植物生育部位に、上記で定義したような生体刺激および生体防御組成物を適用する工程を含む、植物の生物的ストレスおよび／または非生物的ストレスに対する耐性を高める方法も、本発明の範囲内である。
本発明の方法により、生体刺激および生体防御組成物は、例えば葉、茎、枝、茎、樹皮、花、花芽、果実、根、種子、球根、塊茎および／または新芽などの植物の様々な形態または部分において、様々な植物に適用できる。
本明細書で用いる用語“増殖材料”とは、植物または植物の一部が由来し得る何れかの植物材料を意味する。限定されない例として、種子、苗、挿し木、穂木、台木、摘出物、球根、塊茎およびそれらの組合せが挙げられる。
さらに、または代替的に、本発明の組成物は、植物生育部位に適用できる。
一態様において、植物は土壌中で栽培され、本発明の組成物の適用は、例えば、栽培面全体、１以上の溝および／またはその周囲、播種孔、茎または幹の下の領域、および／または根の間の領域で行われ得る。
別の態様において、植物は、土壌栽培または無土壌栽培される。水耕栽培技術は、限定されない例として、土壌外栽培法または無土壌栽培法に言及され、そこで、土壌は、例えば膨張粘土、ココナッツファイバー、ロックウールまたはゼオライトのような不活性基質で置き換えられ、そして植物は、水、および例えばＭｇ（ＮＯ３）２－６Ｈ２Ｏ、Ｃａ（ＮＯ３）２－４Ｈ２Ｏ、ＫＮＯ３、Ｋ２ＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４などの無機元素からなる溶液によって養分を吸収する。水耕栽培の大きなメリットは、農薬や除草剤、植物保護剤を使用しないため、品質面および衛生面で、年間を通じて一定に管理された生産が可能になることである。
本発明の生体刺激および生体防御組成物は、従来の方法、例えば、噴霧、霧化、散布、散布または灌漑（手動、トラクター、飛行機など）によって植物、植物の一部、植物繁殖材料および／または植物成長部位に適用できる。
好ましい態様により、本発明の組成物は、植物または植物の一部、好ましくは葉に噴霧または霧化することにより適用される。
別の好ましい態様により、本発明の組成物は、潅水によって、すなわち、例えば潅水液の形態で、または土壌への注入によって、直接土壌に適用される。
水耕栽培の場合、本発明の方法は、生体刺激および生体防御組成物が養液中の植物に投与されることを提供する。
本発明の一態様により、本方法は、組成物を少なくとも２回、好ましくは４回、より好ましくは５回適用することを含む。
この態様において、植物への１回適用、例えば１回目の適用、２回目の適用、３回目の適用、４回目の適用または５回目の適用とその後の適用の間の時間間隔は、約３週間から約４週間の範囲であり得る。
本発明のさらなる目的は、植物の生物的ストレスおよび／または非生物的ストレスに対する耐性を高めるために、上記に定義した単離ペプチド、または上記に定義した生体刺激および生体防御組成物を使用することである。
以下の実験セクションは、説明のためにのみ提供され、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲を限定するものではない。実験セクションにおいて、添付の図面を引用する。
図１は、本発明者らが本発明のペプチドの組換え生産に用いたクローニングベクターｐＥＴＭ１１を模式的に示す。 図２は、ベクターｐＥＴＭ１１にクローニングした後の、ペプチドＰＳ１－７０をコードするヌクレオチド配列を含むインサートの模式図である。（Ａ）サンガー配列決定法で得られた組換えインサートの塩基配列（配列番号１２）を示す。クローニングベクターに正しく挿入されたペプチドＰＳ１－７０をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）は、黒色で下線を引く；ヒスチジンテール（Ｈｉｓ－ｔａｇ）をコードする配列（配列番号１４）を太い大文字で強調している；ヒスチジンテールの下流に配置され、後者の除去を可能にするタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識部位（配列番号１６）は、灰色で下線を付す大文字の斜体で強調されている。ペプチドＰＳ１－７０をコードするヌクレオチド配列の増幅およびクローニングに用いたフォワードプライマーＰ１１Ｆ１（配列番号１７）およびリバースプライマーＰ１１Ｒ１（配列番号１８）の配列は、それぞれ薄い灰色および濃い灰色で強調表示されている。（Ｂ）Ｎ末端位置でヒスチジンテールのＣ末端と結合したペプチドＰＳ１－７０（太字、配列番号１）のアミノ酸配列（下線を付した配列、配列番号１５）。 図３は、ベクターｐＥＴＭ１１にクローニングした後の、ペプチドＰＳ１－１２０をコードするヌクレオチド配列を含むインサートの模式図である。（Ａ）サンガー配列決定法により得られた組換えインサートの塩基配列（配列番号１３）。クローニングベクターに正しく挿入されたペプチドＰＳ１－１２０をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）は、黒色で下線を付す；ヒスチジンテール（Ｈｉｓ－ｔａｇ）をコードする配列（配列番号１４）は、太字で強調されている；後者の除去を可能にするためにヒスチジンテールの下流に配置されたタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識部位（配列番号１６）は、大文字の斜体で灰色の下線を引いて強調されている。ペプチドＰＳ１－１２０をコードするヌクレオチド配列の増幅およびクローニングに使用したフォワードプライマーＰ１１Ｆ１（配列番号１７）およびリバースプライマーＰ１１Ｒ３（配列番号１９）の配列は、それぞれ薄い灰色および濃い灰色で強調されている。（Ｂ）Ｎ末端位置でヒスチジンテールのＣ末端と結合したペプチドＰＳ１－１２０（太字、配列番号２）のアミノ酸配列（下線を付した配列、配列番号１５）。 図４は、ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０をそれぞれコードする塩基配列の増幅およびクローニングに用いたプライマーの塩基配列およびその特徴を示す表である。 図５は、親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動による溶出画分の解析、および精製したＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０ペプチドに対して行ったウェスタンブロット解析の結果である。（Ａ１、Ｂ１）ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０の精製の第１段階のクロマトグラフプロファイル。それぞれ１５０ｍＭおよび５０ｍＭのイミダゾールで溶出する。（Ａ２およびＢ２）溶出画分のポリアクリルアミドゲル分析；Ｍ：分子量マーカー；黒四角：ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０を含む溶出画分。（Ａ３およびＢ３）ウェスタンブロット分析によるペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０の同定；Ｍ：分子量マーカー；黒四角：ＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０ペプチド。 図６に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および溶出画分を１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動で解析した結果を示す。（Ａ１、Ｂ１）ペプチドＰＳ１－７０、ＰＳ１－１２０の精製の第２段階のクロマトグラフプロファイルで、それぞれ溶出量１２．１６ｍｌ、１０．９２ｍｌに溶出ピークを有する。（Ａ２およびＢ２）溶出画分のポリアクリルアミドゲル分析；Ｍ：分子量マーカー；黒四角：ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０を含む溶出画分。（Ａ３、Ｂ３）ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０のデコンボリューション質量(deconvoluted mass)。
図７は、ペプチドＰＳ１－７０（Ａ）およびＰＳ１－１２０（Ｂ）のアミノ酸組成のプロフィールを示す。図のグラフから、前記ペプチドのアミノ酸配列は、いずれも、規則的な二次構造を有するアミノ酸（薄い灰色）と比較して、構造的に不規則なアミノ酸（濃い灰色）が有意に多く含まれていることがわかる。 図８において、グラフＡおよびＢは、実施例１および２に記載のペプチドＰＳ１－７０（Ａ）およびＰＳ１－１２０（Ｂ）についてｐＨ８でＳＥＣ－ＭＡＬＳ－ＱＥＬＳにより実施した光散乱実験の結果を示す。曲線のピークは、溶液中の単量体タンパク質を代表するものである。図８（Ｃ,Ｄ）は、精製したＰＳ１－７０（Ｃ）およびＰＳ１－１２０（Ｄ）のペプチドを、１０ｍＭリン酸緩衝液中、それぞれ４．４μＭおよび３．５μＭの濃度で用い、温度２０℃で記録した二色性スペクトルである。横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は平均残留モル楕円率値を示す。 図９は、１００ｐＭおよび１００ｆＭ濃度のペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０を葉面散布した６時間後（Ａ,Ｃ）および２４時間後（Ｂ,Ｄ）のトマト植物における誘導遺伝子発現の相対定量を示す。Ｌｏｘ Ｃ、ＡＯＳ、Ｐｉｎ Ｉ、Ｐｉｎ ＩＩの各遺伝子について解析を行った。ａ、ｂ、ｃの文字はデータの統計的有意性（ＡＮＯＶＡ）を示し、各文字は統計群を表す。 図１０は、S. littoralis 鱗翅類幼虫に対する、ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０によるトマト植物葉の処理の効果を示す。ヒストグラム（Ａ,Ｃ）は、それぞれ１００ｐＭおよび１００ｆＭのペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０で処理した葉を与えた幼虫、および関連する対照について、その後数日間測定した、グラムで表した平均重量の変化を示す。ａ、ｂの文字はデータの統計的有意性（ＡＮＯＶＡ）を示し、各文字は統計群を表す。グラフ（Ｂ,Ｄ）は、本発明のペプチドで処理したトマト植物葉を与えた幼虫、および関連する対照で毎日記録した死虫率を示す（Log-Rank検定；＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 図１１は、S. littoralis 鱗翅類幼虫に対する、ペプチドＰＳ１－７０ならびに配列番号３、５および８によるトマト植物葉の処理の効果を示す。ヒストグラム（Ａ）は、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９日目に測定した、上記ペプチドで処理した葉および関連する対照を与えた幼虫の平均重量の変化をグラムで表した。ａ、ｂの文字はデータの統計的有意性（ＡＮＯＶＡ）を示し、各文字は統計群を表す。グラフ（Ｂ）は、本発明のペプチドで処理したトマト植物葉を与えた幼虫、および関連する対照で記録した１日の死虫率を示す（対数順位検定；＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 図１２は、ＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０ペプチドを処理した後の、トマト植物の葉（Ａ,Ｂ)、ナスの葉（Ｃ）およびつる植物の葉（Ｄ）における、壊死のB. cinerea菌によって生じた壊死面積が、未処理の対照と比較して減少したことを示す。病原体を接種してから１、３、５および８日後に平均壊死面積を測定した。ａ、ｂ、ｃ、ｄの文字はデータの統計的有意性（ＡＮＯＶＡ）を示し、各文字は統計群を表す。
図１３は、ＰＳ１－７０、配列番号３、５および８で処理した後の、トマト植物葉上の壊死性B. cinerea菌によって生じた壊死領域の、未処理対照と比較した減少を示す。病原体を接種してから１、３、５および８日後に平均壊死面積を測定した。ａ、ｂ、ｃ、ｄの文字はデータの統計的有意性（ＡＮＯＶＡ）を示し、各文字は統計群を表す。 図１４は、ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０（Ａ）、ならびにＰＳ１－７０、配列番号３、５および８（Ｂ）で処理した後の、トマト植物葉上の壊血病A. alternata菌によって生じた壊死領域の、未処理の対照と比較した減少を示す。病原体を接種してから１、３、５および８日後に平均壊死面積を測定した。ａ、ｂの文字はデータの統計的有意性（ＡＮＯＶＡ）を示し、各文字は統計群を表す。 図１５は、トリコデルマ・ハルチアナム Ｔ２２株胞子を共培養した種子から生まれた４週間の植物に、ペプチドＰＳ１－７０、ＰＳ１－１２０およびシステミン（Ｓｙｓ）を併用処理した場合の、S. littoralis鱗翅目幼虫（Ａ１、Ａ２およびＡ３）の生存率、ならびに壊死性B. cinerea（Ｂ１）およびA. alternata（Ｂ２）の菌による葉への定着の影響について示す。幼虫の生存率は毎日測定し（Log-Rank検定；＊＊＊ｐ＜０．０００１）、各文字は統計群を表す。平均壊死面積は、病原菌を接種してから１、３、５および８日後に測定した。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆの文字はデータの統計的有意性（ＡＮＯＶＡ）を示し、各文字は統計群を表す。 図１６は、ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０の１００ｆＭ懸濁液で処理した種子から生まれた４週齢のトマト植物の葉、およびそれぞれの対照において、壊死性B. cinerea菌によって生じた壊死面積の減少を示す。病原菌を接種してから１日後、３日後および５日後に平均壊死面積を測定した。ａ、ｂの文字はデータの統計的有意性（ＡＮＯＶＡ）を示し、各文字は統計群を表す。 図１７は、ＰＳ１－７０ペプチドを１００ｐＭの濃度で灌注したトマト植物における、塩の不存在下（Ａ）（０ｍＭ ＮａＣｌ）および塩存在下（Ｂ）（８０ｍＭ ＮａＣｌ）での誘導遺伝子発現の相対定量を示す。ｃａｔ１、ｔｆｔ１、Ｓａｍ、ＨＳＦＡ２、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＭＰＫ１およびＷＲＫＹ４０の各遺伝子に対して解析を行った。アスタリスクはスチューデントのｔ検定によるデータの統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．０５； ＊＊ｐ＜０．０１； ＊＊＊ｐ＜０．００１）。 図１８は、塩の不存在下（０ｍＭ ＮａＣｌ）、塩存在下（１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、および関連する対照において、ペプチドＰＳ１－７０、ＰＳ１－１２０および配列番号５（１００ｆＭ）を潅注したトマト植物における誘導遺伝子発現の相対定量を示す。ＣＡＴ２（Ａ）、ＳＡＭ（Ｂ）、ＡＰＸ２（Ｃ）遺伝子を対象に解析を行った。アスタリスクはスチューデントのｔ検定によるデータの統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．０５； ＊＊ｐ＜０．０１； ＊＊＊ｐ＜０．００１）。 図１９は、塩の不存在下（０ｍＭ ＮａＣｌ）、塩の存在下（１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、および関連の対照において、ペプチドＰＳ１－７０、ＰＳ１－１２０および配列番号５（１００ｆＭ）を潅注した植物葉における平均プロリン含有量を示す。ａ、ｂ、ｃの文字はデータの統計的有意性（ＡＮＯＶＡ）を示し、各文字は統計群を表す。 図２０は、１００ｆＭの濃度のペプチドＰＳ１－７０、ＰＳ１－１２０および配列番号５による灌注処理が、トマト植物の生体パラメータに及ぼす影響を示す。ヒストグラム（Ａ）は、塩の不存在下（０ｍＭ ＮａＣｌ）および塩の存在下（１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で、本発明のペプチド対象で処理した植物、および関連の対照の、平方センチメートルで表される根面積を示す。ヒストグラム（Ｂ）は、塩の不存在下（０ｍＭ ＮａＣｌ）において、本発明のペプチド対象、および関連する対照で処理した植物における地上部の新鮮重量の変化（グラムで表す）を示す。アスタリスクはスチューデントのｔ検定による統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．０５）。 図２１は、実施例４に示す、S. littoralis幼虫に対して濃度を上げてアッセイした本発明のペプチドの直接毒性作用の評価結果を示す表である。ＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０のペプチドを表皮に注射または塗布した幼虫について、さなぎ期までの生存率を記録した。 図２２は、２つの異なる真菌の生育培地に添加した場合に、濃度を上げてアッセイした本発明のペプチドの直接毒性作用の評価を示す。B. cinerea、（Ａ）ＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０、および（Ｂ）ＰＳ１－７０、配列番号３、５および８、ならびにトリコデルマ Ｔ２２、（Ｃ）ＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０。本発明のペプチドを添加してから２４時間後の菌の増殖を、培地の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）として測定した。ａ、ｂの文字はデータの統計的有意性（ＡＮＯＶＡ）を示し、各文字は統計群を表す。
実施例１．本発明によるペプチドの製造
クローニング、発現および精製
本発明のペプチドをコードする塩基配列を単離するために、図４の表に示す配列を有する増幅プライマー対を用い、全長プロシステミンをコードするｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を設定した。
アンプリコンをＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、その後、予め同じ酵素で消化したｐＥＴＭ１１ベクターにクローニングした。ｐＥＴＭ１１（EMBL, Heidelbergのご厚意による）は、原核生物発現ベクターであり、クローン化したタンパク質のアミノ（Ｎ－）末端部分に６つのヒスチジンテール（Ｈｉｓ－ｔａｇ）を付加でき、かつＨｉｓ－ｔａｇ配列の下流にはＴＥＶ（Tobacco Etch Virus）プロテアーゼ認識部位を有して、後者を除去できる（図１）。
クローン化したフラグメントの完全性および増幅反応中に生じた可能性のある変異がないことは、得られた構築物の配列決定により確認した（図２Ａおよび図３Ａ）。最初のスクリーニング後、本発明のペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０の大規模発現を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用い、ＬＢおよび２－ＹＴ培地中、２ｍＭ ＩＰＴＧ存在下で２２℃にて、１６時間実施した。図２Ｂおよび図３Ｂはそれぞれ、得られたペプチドＰＳ１－７０（配列番号１）およびＰＳ１－１２０（配列番号２）のアミノ酸配列を示し、太字で強調し、それぞれＮ末端でＣ末端に結合した、下線を付したヒスチジンテールを示す。
発現後のペプチド精製を、ＦＰＬＣ－ＡＫＴＡ（GE Healthcare）を用いて室温にて親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）（図５）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（図６）により行い、２ｍｇ／Ｌの細胞培養収量を得た。
ペプチド合成
配列番号３、５および８の配列を有する本発明のペプチドは、標準プロトコルを用いた固相化学合成により製造した（Chandrudu S. et al, “Chemical methods for peptide and protein production”； Molecules.2013 Apr 12;18(4):4373-88）。この手順では樹脂を用いることで、カルボキシ末端をアミド化したペプチドを得た。合成の最後に、ペプチドのアミノ末端もアセチル化によって修飾した。精製は、逆相ＨＰＬＣで行った。
実施例２：本発明のペプチドの構造解析
本発明のペプチドを同定する手順の間、本発明者らは、ＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０ペプチドの特異な特性、主に構造的混乱を助長するアミノ酸残基がその一次配列に著しく存在することによるかなりの困難さに遭遇した（図７）。ＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０の両ペプチドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動にかけると異常な移動を示し、実際の重量に対して２０－２５ｋＤａの見かけの分子量で移動し（ＭＷ ＰＳ１－７０＝１１ｋＤａ；ＭＷ ＰＳ１－１２０＝１７ｋＤａ）、再び質量分析により、２つの組換えペプチドについて正確に分子量を確認した（図６、Ａ３、Ｂ３）。
さらに、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）では、ペプチドＰＳ１－７０は１２．１６ｍｌ、ＰＳ１－１２０は１０．９２ｍｌの保持量を示し（図６）、オリゴマーまたは折り畳み性の低いタンパク質であることが示された。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ－ＱＥＬＳで行った光散乱実験では、保持量にかかわらず、本発明のペプチドは、ＰＳ１－７０では９．３６±０．６ｋＤａ、ＰＳ１－１２０では１９．９８±１．５ｋＤａの分子量を有する単分散単量体タンパク質として溶液中に存在し、理論値と一致した（図８Ａ、図８Ｂ）。
次いで、ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０の二次構造を円二色性（ＣＤ）により解析した。得られたＦａｒ－ＵＶ ＣＤスペクトルを、試験ペプチドともに１９８ｎｍおよび１９０ｎｍに負のモル楕円率の値を示した。しかしながら、２００ｎｍおよび２２２ｎｍで観測された楕円率の値は、何らかの二次構造を示している（図８Ｃ、８Ｄ）。上記の特徴は、大きな非構造部分を有する無秩序なタンパク質の典型である。これはおそらく、本質的な反発を引き起こす酸性残基（生理的ｐＨで負に帯電）が多いことと、一般にタンパク質が正しく折り畳まれるのを助ける疎水性残基が少ないことの両方が関係している。
実施例３：本発明のペプチドによる植物の防御遺伝子発現の誘導
本発明のペプチドの生物活性を試験するために、本発明者らは、トマト植物（ソラナム・リコペルシコン）にペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０を適用し、これらの植物における防御遺伝子の発現を測定する実験を行った。前記ペプチドは、１Ｘ ＰＢＳ緩衝液（０．１４Ｍ ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ ＫＣｌ、０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）中、ピコモル濃度（ｐＭ）およびフェムトモル濃度（ｆＭ）で、４週齢のトマト植物の広がった葉上面の数箇所に２μｌのペプチドを含む水性組成物を適用しアッセイした。
本発明のペプチドを塗布した６時間後および２４時間後に葉のサンプルを採取し、ＲＮＡ抽出およびその後の遺伝子発現解析を行った。特に、ジャスモン酸（ＪＡ）の生成につながるオクタデカノイド生合成経路で活性を示すリポキシゲナーゼＣ遺伝子（Ｌｏｘ Ｃ）およびアレンオキシド合成酵素遺伝子（ＡＯＳ）などの初期発現遺伝子２つと、プロテイナーゼＩ阻害遺伝子（Ｐｉｎ Ｉ）およびプロテイナーゼＩＩ阻害遺伝子（Ｐｉｎ ＩＩ）などの遅延発現遺伝子２つの、植物防御関連遺伝子として知られている遺伝子を選択肢試験した。
すべてのアッセイされた遺伝子は、試験された両濃度において、本発明の両ペプチドの外からの適用後に有意に過剰発現された（図９）。
実施例４.本発明のペプチドは、植物における生物的ストレスに対する耐性を促進する
本発明者らは、本発明のペプチドが植物の病原体に対する耐性を促進できることを示すために、配列番号１（ＰＳ１－７０）、配列番号２（ＰＳ１－１２０）、配列番号３、配列番号５および配列番号８のアミノ酸配列を有するペプチドで植物を処理した結果得られる草食昆虫または植物病原性菌に対する影響を評価する試験を実施した。具体的には、トマトに大きな被害を与える鱗翅目害虫であるスポドプテラ・リットラリスの幼虫の体重増加率および生存率の変化、トマト灰色かび病の原因菌である植物病原性壊死性ボトリチス・シネレア菌および寄生性アルテルナリア・アルタナータ菌による植物のコロニー形成をモニタリングした。
スポドプテラ・リットラリス幼虫での実験
簡単に説明すると、S. littoralis幼虫を、２５℃、相対湿度７０％、１６時間明期および８時間暗期の環境下で、人工飼料を与えて第１回脱皮を完了するまで飼育した。バイオアッセイでは、各試験（thesis）の１５０匹の幼虫をトマトの葉で２齢期の全期間育て、異なる食餌に順応させた。脱皮期までの３齢幼虫に、ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０を含む組成物を１×ＰＢＳ緩衝液中１００ｐＭおよび１００ｆＭの濃度で塗布した植物を与えた。１ＸＰＢＳバッファーのみで処理した植物を与えた幼虫を対照として用いた。バイオアッセイを、トマト葉の細胞内圧力を維持するための湿潤環境作りに有用な１．５％ （ｗ／ｖ）寒天および０．００５％ （ｗ／ｖ）パラヒドロキシ安息香酸メチルを含む３２ウェルプラスチックトレイを用い、同じ環境条件で実施した。各実験群は３２匹の幼虫からなった。幼虫の生存率は毎日、体重は１日おきにモニタリングした。本発明のペプチドを処理した葉を与えた幼虫は、対照の葉を与えた幼虫と比較して、生物検定期間を通じて体重減少が見られ、両濃度とも早くも３日目から有意差が見られた。特に、バイオアッセイ１５日目、１００ｐＭ濃度の場合、対照の葉を与えた幼虫の平均体重は３８ｍｇであったが、ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０で処理した葉を与えた幼虫の平均体重はそれぞれ１５ｍｇおよび２０ｍｇであった（図１０Ａ）。本発明のペプチド１００ｆＭ濃度を用いて実施したバイオアッセイでは、１３日目に、対照の葉を与えた幼虫の平均体重は４４ｍｇであったが、ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０で処理した葉を与えた幼虫はそれぞれ１１ｍｇおよび１２ｍｇの平均体重を有した（図１０Ｃ）。また、本発明のペプチドで処理した植物の葉を与えた幼虫の生存率は、対照植物の葉を与えた幼虫と比較して、両アッセイで有意に減少した（図１０Ｂおよび図１０Ｄ）。実際、バイオアッセイ１５日目には、対照の葉を与えた幼虫で９６．８７％の生存率が観察され、１００ｐＭ濃度の本発明のペプチドで処理した葉を与えた幼虫では、それぞれ３４．３７％および３１．２５％の生存率が確認された（図１０Ｂ）。１００ｆＭの濃度で行ったバイオアッセイでは、１３日目に、対照の葉を与えた幼虫の生存率は１００％であり、本発明のペプチドで処理した葉を与えた幼虫の生存率はそれぞれ０％および２１．８７％であった（図１０Ｄ）。
本発明者らは、ペプチドＰＳ１－７０、ならびに配列番号３、５および８の配列を有するペプチドで処理した葉をS. littoralis幼虫にフェムトモル濃度で与えて、同じアッセイ法を実施した。処理葉を与えた幼虫は、対照葉と比較して、３日目から体重が有意に減少した（図１１）。特に、バイオアッセイ１３日目に、対照葉を与えた幼虫の平均体重は５９ｍｇであったのに対し、ペプチドＰＳ１－７０、ならびに配列番号８、３および５の配列で処理したものは、それぞれ２２ｍｇ、１３ｍｇ、２４ｍｇおよび２１ｍｇの平均体重を有した（図１１Ａ）。また、ペプチド処理葉を与えた幼虫の生存率は、対照葉を与えた幼虫と比較して、有意に減少した（図１１Ｂ）。実際、バイオアッセイ１３日目には、対照葉を与えた幼虫では１００％の生存率が観察され、ペプチドＰＳ１－７０、配列番号８、配列番号３および配列番号５で処理した葉を与えたものではそれぞれ３１．２５％、１５．６２％、４３．７５％および１５．６２％の生存率が確認された（図１１Ｂ）。
ボトリチス・シネレアおよびアルテルナリア・アルテルナータの実験
植物病原性ボトリチス・シネレアおよびアルテルナリア・アルテルナータ菌についてアッセイを行うために、本発明者らは、固体ＰＤＡ（ジャガイモデキストロース寒天）胞子形成基質上での培養から得られたこの微生物の胞子を用いた。１ｘ１０６胞子／ｍｌの濃度で分生子懸濁液を２０μｌ接種し、２５℃、拡散光下で１５日間培養し、完全な胞子形成が得られるようにした。その後、胞子を５ｍｌの滅菌水に集め、菌糸を取り除くために、グラスウールで濾過し、滅菌蒸留水で洗浄した後、室温で遠心分離して回収した。接種に適した胞子濃度（１０５～１０７個／ｍｌ）を、胞子計数用のバーカーセルカウントチャンバーを用いた連続希釈法により決定した。
アッセイを、各処理トマト植物および各対照植物について複葉（compound leaf）を取り、分離した葉で行った。複葉の各葉には、その後の胞子散布の目安となるように３つのマーカーを付け、壊死した部分を発生させる病原体を検出した。
本発明のペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０を含む組成物を１００ｐＭ、１００ｆＭの濃度で２μｌ塗布し、または１Ｘ ＰＢＳ ２μｌで対照葉を処理した。ペプチドの認識に必要な時間である６時間後に葉を切り離し、１０μｌの胞子液を前にマーカーをつけた箇所付近およびその間に接種した。モニタリングは、病原菌を接種してから１日後、３日後、５日後、８日後に壊死面積（ｍｍ２単位で表示）を測定することによって行った。対照葉に記録された壊死領域は、本発明のペプチドで処理した植物で検出されたものよりもはるかに大きかった。この差は、接種後の経過時間の関数として増加した。ピコモル処理による耐性誘導効果は、両ペプチドとも１８ｍｍ２を超えない値を記録した処理葉とは異なり、病原体を接種した初日から８日目まで、対照葉では３３ｍｍ２の値に達し、既に統計的に有意であった（図１２Ａ）。
同様の結果は、フェムトモル濃度の本発明のペプチド対象の適用後にも観察された。特に、植物病原菌の接種１日目から、処理葉の壊死部の発生が対照葉に比べて強く抑制されることが観察された。この減少は８日目まで維持され、対照葉では２０ｍｍ２の値に達し、ＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０で処理した葉ではそれぞれ６．６９ｍｍ２および５．１９ｍｍ２の値に達した（図１２Ｂ）。
また、本発明者らは、ソラナム・メロンゲナ（ナス）植物（図１２Ｃ）およびヴィティス・ヴィニフェラ（ブドウ）植物（図１２Ｄ）における壊疽菌の発生に対する、ピコモル濃度およびフェムトモル濃度の本発明のペプチドの外からの適用効果を測定することを目的とした試験を実施した。
図１２Ｃに示すように、実施した実験では、対照植物と比較して処理植物の菌類コロニー形成が有意に減少し、最も顕著な効果は、本発明のペプチドの最低濃度での処理後に観察された。処理による正の効果は、病原体の接種３日目から８日目まで統計的に有意であり、対照葉で１１ｍｍ２の値に達したが、１００ｐＭの濃度のペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０で処理した葉で８．４ｍｍ２および６．０ｍｍ２の値を記録し、１００ｆＭの濃度の該ペプチドで処理した葉で６．２ｍｍ２および４．１０ｍｍ２の値を記録した処理葉と違っていた（図１２Ｃ）。つる性植物でも同様の結果が得られた（図１２Ｄ）。処理による正の効果は、病原体の接種１日目から８日目までで既に統計的に有意であり、対照葉では４３ｍｍ２の値に達し、１００ｐＭの濃度のペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０で処理した葉ではそれぞれ１６.７ｍｍ２および１３．６ｍｍ２の値に達し、１００ｆＭの濃度の該ペプチドで処理した葉では１２ｍｍ２および１１．８ｍｍ２の値に達した（図１２Ｄ）。オリーブの木でも同様の結果が得られた。
また、配列番号３、５および８の配列を有するペプチドのフェムトモル濃度のトマト葉への適用の効果を、B. cinerea菌の発病に対して評価した。
図１３に示すように、対照葉に記録された壊死領域は、本発明のペプチドで処理された植物で検出されたものよりもはるかに大きかった。処理による正の効果は、病原体の接種１日目から既に統計的に有意であり、８日目まで継続し、対照葉で１１．７２ｍｍ２の値に達し、１００ｆＭの濃度でペプチドＰＳ１－７０、配列番号８、配列番号３、配列番号５で処理した葉でそれぞれ７．６９ｍｍ２、７．６７ｍｍ２、８．８９ｍｍ２および６．８１ｍｍ２の値に達した（図１３）。
また、本発明者らは、本発明のペプチドをトマト植物に外から適用した場合の、壊死性アルテルナリア・アルテルナータ菌の発育に対する効果を測定することを目的としたアッセイを実施した（図１４）。
図１４Ａおよび図１４Ｂに示すように、実施したアッセイでは、処理した植物の真菌のコロニー形成が対照植物と比較して有意に減少していることが示された。処理による正の効果は、病原体の接種１日目から８日目まで統計的に有意であり、ここで対照葉で２４ｍｍ２の値に達し、１００ｆＭの濃度でペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０で処理した葉上で記録された８．４ｍｍ２および８．０ｍｍ２の値の処理葉とは異なった（図１４Ａ）。１７ｍｍ２の値が、対照葉上で記録され、８．３ｍｍ２、７．９ｍｍ２、８．９ｍｍ２および７．８ｍｍ２の値が、ペプチドＰＳ１－７０、配列番号８、配列番号３および配列番号５でそれぞれ１００ｆＭの濃度で処理した葉上において記録された（図１４Ｂ）。
本発明のペプチドとトリコデルマＴ２２胞子との組合せによる活性
さらに本発明者らは、S. littoralis幼虫（Ａ１、Ａ２、Ａ３）の生存率ならびに壊死性B. cinerea（Ｂ１）菌およびA. alternata（Ｂ２）菌の発生を減らすことにおいて、本発明のペプチドとTrichoderma T22芽胞とを組み合わせてフェムトモル濃度で処理した場合のトマト植物への影響を明らかにするために研究を実施した（図１５）。
トマト種子をTrichoderma harzianum T22株の胞子懸濁液（１Ｘ１０７ 胞子／ｍｌ）または水で処理し、乾燥させた後、２４℃にて滅菌吸着紙上で暗所発芽させた。４週齢の植物の葉を、１００ｆＭ濃度のペプチド、システミン（Ｓｙｓ）、ＰＳ１－７０、ＰＳ１－１２０を含む組成物または１Ｘ ＰＢＳを２μｌ、対照葉に塗布して処理した。ペプチドを認識するのに必要な時間である６時間後、植物から葉を切り離し、S. littoralis幼虫を用いたアッセイならびに２つの壊死性菌B. cinereaおよびA. alternataを用いたアッセイの両方を実施した。
S. littoralis幼虫を用いたアッセイでは、幼虫の生存を毎日モニタリングした。一方、２つの植物病原性菌の発育を観察するために、予め処理したトマト葉に胞子液（１Ｘ １０６ 胞子／ｍｌ）を１０μｌ接種した１日後、３日後、５日後、８日後に壊死面積を測定した（ｍｍ２で表示）。
図１５は、試験したペプチドをトリコデルマＴ２２と組み合わせて処理することにより、トリコデルマＴ２２単独またはペプチド単独での処理と比較して、幼虫の発生および生存を低減させる驚くべき相乗効果が得られ、２つの植物病原性菌によるコロニー形成に対して著しく高い保護効果が得られることを示す。これらの効果の証拠は、時間と関連して増加する。さらに、トリコデルマＴ２２胞子を単独または組み合わせて用いた本発明のペプチドがもたらす効果は、システミンペプチドと比較して優れていることが示された。
本発明のペプチドの種子保護効果
本発明者らはまた、本発明のペプチドを直接種子に処理することによって付与される保護効果についても評価した。トマトの種子を１００ｆＭ濃度でペプチドを含む組成物、または対照として１Ｘ ＰＢＳで処理し、乾燥させた後、滅菌吸着紙上で２４℃にて暗所で発芽させた。４週齢の植物葉を切り離し、胞子液１０μｌを葉の間および先に印をつけた点付近に接種した。図１６に示すように、ＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０で処理した種子から生じた植物の葉における真菌コロニー形成は、対照植物と比較して有意に減少していることがアッセイで示された。
処理による正の効果は、病原菌の接種１日目から８日目まで統計的に有意であり、対照葉では１１ｍｍ２の値に達したが、１００ｆＭ濃度でペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０で処理した種子から生じた植物葉ではそれぞれ７．１ｍｍ２および７．４ｍｍ２の値に達した（図１６）。本発明者らは、試験した病原性生物に対するペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０の直接的な毒性作用の有無を調べるために、さらなる試験を行った。図２１の表に報告されたデータから分かるように、本発明のペプチドをS. littoralis幼虫の表皮に経口または注射で投与しても、その生存および発育に影響を及ぼさなかった。
さらに、図２２Ａおよび図２２Ｂに示すように、本発明のペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０を生育培地に添加したとき、B. cinerea菌の増殖が阻害されることはなかった。さらに、トリコデルマ・ハルジアナム Ｔ２２株を用いた試験を行ったところ、やはり図２２Ｃに示すように、ペプチドＰＳ１－７０およびＰＳ１－１２０を１００ｐＭおよび１００ｆＭの両濃度で添加しても菌の増殖には影響がなかった。その代わりに、ペプチドＰＳ１－７０を生育培地に添加したとき、Ｔ２２菌の増殖が増加することが確認され、菌がこのタンパク質をアミノ酸源として利用している可能性が示唆された。
以上の実験結果から、本発明のペプチド対象は生物活性を有し、その外からの適用により植物の有害昆虫および菌類に対する耐性を促進することが明らかとなった。
実施例５．本発明のペプチドは、植物の非生物的ストレスに対する耐性を促進する
本発明者らはまた、本発明のペプチドが植物の様々な非生物的ストレスに対する耐性を促進する効果を検証することを目的とした実験も行っている。
本発明者らは、この実験により、本発明のペプチドをトマト植物に適用すると、そのバイオマスが増加し、より多くの種子を有するより大きな実の生産に有利であることを初めて見出した。その後の実験の結果、図１７に示すように、ペプチドＰＳ１－７０の適用により、トマト植物が塩ストレスから保護されることが確認された。簡単に説明すると、１００ｐＭ濃度のＰＳ１－７０ペプチドを潅注した４８時間後、処理した植物は、対照植物と異なり、塩ストレスに応答する一連の遺伝子および転写因子を活性化することができ、それによって、本発明のペプチドがプライミングとして知られる植物における警戒状態を刺激できることが実証された。さらに、中程度の塩ストレス（８０ｍＭ ＮａＣｌ）の存在下では、本発明のペプチドで処理したトマト植物は、未処理の対照植物よりも塩に対する耐性が高く、特にこのストレスに応答する遺伝子の誘導が大きいことが示された（図１７Ｂ）。また、ペプチドＰＳ１－７０、ＰＳ１－１２０および配列番号５をフェムトモル濃度で投与したときの高塩ストレス条件に対する耐性の促進効果を検証するための実験も設定された。図１８に示すように、ＰＳ１－７０、ＰＳ１－１２０および配列番号５のペプチドを潅注してから８日後、処理植物は、対照植物と異なり、一連の塩ストレス応答性遺伝子を活性化することができ、故に、本発明のペプチドはフェムトモル濃度であってもプライミング防御状態を刺激できることが確認できた（図１８Ａ１、１８Ｂ１および１８Ｃ１参照）。さらに、上記ペプチドで処理し、２４時間後に高塩ストレスレベル（１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で７日間灌漑したトマト植物は、未処理の対照植物よりも耐塩性が高く、特にこのストレスに応答する同じ遺伝子の顕著な誘導を示した（図１８Ａ２、１８Ｂ２および１８Ｃ２）。
これらの植物における平均プロリン含量もまた評価した。プロリンは、塩ストレスおよび水不足に反応して植物細胞内で遊離型に生成される浸透保護物質である。塩ストレスに曝された植物では、このアミノ酸が浸透圧の調節、フリーラジカルからの膜の保護、細胞質ｐＨの調節および酵素の変性からの保護に関与していることが確認されている。
図１９に示すように、高塩ストレス（１５０ｍＭ ＮａＣｌ）存在下で本発明のペプチドで処理した植物は、生理食塩水処理の対照植物よりも低い平均プロリン含量を示し、したがって、塩による浸透圧ストレスの知覚が低いことが示された。
連続塩ストレス（１５０ｍＭ）の１４日後、および１００ｆＭ濃度のＰＳ１－７０、ＰＳ１－１２０および配列番号５のペプチド、およびそれぞれの対照で潅水の１５日後に測定した、いくつかの生体パラメータを図２０に示す。図２０Ａは、ペプチド処理した植物が、未処理の対照植物に比べてストレスに対する耐性が高く、特に根の表面が大きくなっていることを示す（図２０Ａ）。さらに、塩が不存在のとき、本発明のペプチド対象で処理した植物は、対照植物と異なり、植物の地上部の成長を促進できるため、本発明のペプチドは、フェムトモル濃度でも生体刺激作用を有することが確認された（図２０Ｂ）。

Claims (16)

  1. 配列番号１、２、２３～２６および少なくとも８アミノ酸長の配列番号２のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、かつ植物の非生物的ストレスおよび生物的ストレスに対して生体刺激および生体防御活性を有する単離ペプチドであって、該ペプチドがアミノ末端またはカルボキシ末端にヒスチジンテールを連結していてもよい、単離ペプチド。
  2. 該フラグメントが、配列番号３～９のアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項１に記載の単離ペプチド。
  3. アミノ末端がアセチル化により修飾されている、および／またはカルボキシ末端がアミド化により修飾されている、請求項１または２に記載の単離ペプチド。
  4. 請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドをコードする単離核酸配列。
  5. 請求項４に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
  6. 請求項５に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  7. 請求項６に記載の宿主細胞を、適当な条件下でペプチドの発現に十分な時間培養する工程を含み、要すれば培養物からペプチドを回収する工程を含んでいてもよい、請求項１または２に記載のペプチドの製造方法。
  8. 請求項１から３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチド、またはそれらの組合せ、および少なくとも１つのアジュバント、安定剤および／または防腐剤を含む、植物の非生物的ストレスおよび生物的ストレスに対する生体刺激および生体防御用組成物。
  9. 少なくとも１つのペプチドが０．０１ピコモル(ｐＭ)～１００ｐＭの範囲の濃度で存在する、請求項８に記載の生体刺激および生体防御用組成物。
  10. 菌根菌、腐生菌、植物成長促進菌、バチルス・チューリンゲンシス芽胞、およびそれらの何れかの組合せからなる群より選択される微生物をさらに含む、請求項８または９に記載の生体刺激および生体防御用組成物。
  11. 水性液体組成物である請求項８から１０のいずれか一項に記載の生体刺激および生体防御用組成物。
  12. 凍結乾燥形態である、請求項８から１０のいずれか一項に記載の生体刺激および生体防御用組成物。
  13. 請求項８から１２のいずれか一項に記載の生体刺激および生体防御用組成物を、植物、植物の一部、植物繁殖材および／または植物生育部位に適用する工程を含む、植物における生物的ストレスおよび／または非生物的ストレスに対する耐性を増加させる方法。
  14. 生体刺激および生物保護用組成物が、噴霧により、灌漑により、または水耕栽培溶液中で適用される、請求項１３に記載の方法。
  15. 植物が、ナス科、ブドウ科、バラ科またはキョウチクトウ科に属する植物である、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 請求項１から３のいずれか一項に記載の単離ペプチド、および／または請求項８から１２のいずれか一項に記載の生体刺激および生体防御用組成物の、植物における非生物的ストレスおよび／または生物的ストレスに対する耐性を高めるための使用。
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