EA012336B1 - Белок, выделенный из растений рода lupinus или полученный в рекомбинантной форме, кодирующая его последовательность нуклеотидов и его применение в питании животных, в качестве стимулятора роста растений и при борьбе с патогенными грибами - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к экстракции белка из семян, семядолей или проростков рода Lupinus, а также к способу его получения в рекомбинантной форме и его экспрессии в генетически модифицированных растениях. Благодаря превосходным характеристикам, проявляемым этим белком, в отношении: 1) его сильной противогрибковой и противооомицетной активности, которая наделяет этот белок высоким потенциалом в качестве фунгицида, 2) его высокой активности, стимулирующей рост растений, в частности, известной в отношении нездоровых или естественно ослабленных растений, 3) его исключительной устойчивости к денатурации, которая позволяет применять этот белок в полевых условиях, 4) его высокой чувствительности к протеолизу, что делает его безвредным для окружающей среды и нетоксичным для человека и 5) его хорошо сбалансированного аминокислотного состава. Заявлено его применение или применение любой модификации этого белка, которая сохраняет его биологические свойства, в качестве добавки к пище человека или животных и в качестве фунгицида, инсектицида, стимулятора роста, удобрения или при получении генетически модифицированных организмов.

Description

Область изобретения

Данное изобретение включено в область биологии при его практической применимости в качестве фунгицида, инсектицида, стимулятора роста или удобрения, принадлежащей к областям агрономии и сельского хозяйства, и его применимости в качестве пищевой добавки для животных, принадлежащей к области питания человека и животных.

Предшествующий уровень техники

Данное изобретение относится к белку с противогрибковыми, противооомицетными свойствами и свойствами стимулятора роста растений, экстрагированному из семян, семядолей или проростков рода Ьиртиз, и к его применению при контроле патогенных агентов, которые поражают растения, и в качестве биологического стимулятора растений. Этот белок можно применять непосредственно на растениях, либо растения могут быть генетически модифицированы, чтобы экспрессировать этот белок в своих тканях. Кроме того, благодаря свойственным ему необычным характеристикам, этот белок можно использовать при изготовлении белковых концентратов, пригодных в качестве пищевых добавок для человека и других животных.

В настоящем изобретении также описана нуклеотидная последовательность ДНК, соответствующая фрагменту гена, который кодирует белок Ьиртиз, а также его последовательность аминокислотных остатков, описаны микроорганизмы, трансформированные этим фрагментом гена, который кодирует белок Ьиртиз, и способы его применения в качестве фунгицида, инсектицида, стимулятора роста растений или удобрения, либо в качестве пищевой добавки для человека или животных.

Целью данного изобретения также является белок, характеризующийся вышеупомянутой последовательностью аминокислотных остатков, в которой один или более чем один аминокислотный остаток отсутствует, заменен или добавлен или который сохраняет присущие ему виды биологической активности после химической модификации, такой как, например, гликозилирование.

Контроль патогенных агентов составляет серьезную проблему в мировом масштабе в отношении большинства важных зерновых культур. Патогенные грибы являются особенно важными в отношении хранения сельскохозяйственных продуктов. В настоящее время контроль над грибковым ростом, как правило, достигается путем массового применения химических фунгицидов. Однако фитофармацевтические продукты, доступные в настоящее время на рынке, проявляют несколько серьезных недостатков. С одной стороны, они характеризуются высокой экономической стоимостью и затратами на охрану окружающей среды; с другой стороны, многие виды грибов выработали механизмы устойчивости к некоторым наиболее известным фунгицидам, часто превращая их в устаревшие средства через пару лет после выведения последних на рынок.

Даже несмотря на то, что растения не обладают иммунной системой, напоминающей иммунную систему животных, они выработали собственную устойчивость к поражению патогенными грибами. Однако методы, применяемые для выращивания растений, сбора и хранения урожая в современном сельском хозяйстве, обеспечивают очень часто хорошие или оптимальные условия для развития патогенов.

Кроме того, количество патогенных микроорганизмов, которые могут действовать на сельскохозяйственные культуры и наносить им вред, достаточно велико. В качестве примера можно упомянуть следующие роды: ЛИетиапа, Л^сосНуЮ. Во1гуйз, Сетсозрота, Со11сЮ1пе11ит. Ωίρίοάία. ЕтуЦрйе, Ризалит, Оаеитапотусез, МасгорНотта, №с1па, РНота, РНоторз1з, Рйута1о1йсйит, РНу1орНйога, Р1азторага, Рисшша, Ру1Ыит, ВЫ/осФша, иисти1а и УегйсШшт. Применение фунгицидов, в настоящее время доступных на рынке, ограничено в отношении некоторых из этих родов и не является эффективным решением при контроле инфекций растений.

Альтернативной стратегией в борьбе против патогенных микроорганизмов является идентификация и очистка веществ биологического происхождения с сильной противогрибковой активностью. Идентификация таких соединений включает исследование множества организмов, таких как растения и микроорганизмы, на вещества, которые впоследствии испытывают в анализах на противогрибковую активность и, в конце концов, выделяют и характеризуют.

Таким путем уже были выделены многие классы противогрибковых белков, включая хитиназы, обогащенные цистеином белки, которые активно связывают хитин, в-1,3-глюканазы, пермеатины, тионины и белки-переносчики липидов. Эти белки, как полагают, играют фундаментальную роль в природных механизмах защиты растений от поражения патогенами.

В доступной литературе описано несколько методов по использованию противогрибковых белков, экстрагированных из растений или микроорганизмов, либо для непосредственного применения против патогенных агентов, либо в трансгенных растениях, экспрессирующих данные белки. Противогрибковые белки, чаще всего используемые в этих методах, включают хитиназы, глюканазы, белки осмотинового типа и лизоцимы. Различными исследованиями продемонстрировано, что генетически модифицированные растения с гиперэкспрессией данных белков проявляют повышенную устойчивость в отношении многих патогенов (Европейский патент № 0392225).

Современные методики молекулярной биологии дали возможность разработки технологии рекомбинантных ДНК и, соответственно, трансформации растений генами, кодирующими противогрибковые белки. Эта методика обычно включает встраивание гена, кодирующего представляющий интерес белок, в

- 1 012336 ткань растения с последующей регенерацией целого растения из генетически модифицированной ткани растения.

Однако активность некоторых из этих белков снижена вследствие наличия ионов, в частности, калия, натрия или кальция. По этой причине, хотя белки могут проявлять сильную противогрибковую активность в анализах ίη νίίτο, они могут быть неэффективны ίη νίνο благодаря высоким физиологическим концентрациям ионов, которые могут естественно присутствовать в трансформированных растительных тканях.

В заключение, идентификация и очистка новых соединений биологического происхождения, проявляющих антипатогенные свойства в борьбе с патогенами, которые поражают растения, становится императивом. Особую важность следует придавать тем соединениям, которые эффективны против широкого ряда патогенов и которые сохраняют биологическую активность в условиях ίη νίνο.

В течение длительного периода времени сельскохозяйственную практику оптимизировали в целях стимуляции роста и развития растений и в целях повышения продуктивности сельскохозяйственных культур. С другой стороны, предсказуемо, что в среднесрочной или долгосрочной перспективе нехватка пищи может произойти во многих областях земного шара. Современные методы регуляции роста растений в экологически контролируемых условиях являются дорогостоящими и требуют применения сложного оборудования. По данным причинам многие исследователи провели поиск и опубликовали данные о физиологически активных веществах, природных или синтетических, которые проявляют усиливающий эффект на рост и развитие сельскохозяйственных культур. Однако только немногие из этих веществ нашли практическое применение в реальных условиях сельского хозяйства. Следовательно, также все возрастающую важность имеет открытие или разработка стимуляторов роста растений, которые экологически благоприятны и которые не проявляют токсичности по отношению к человеку, животным и окружающей среде.

Растения семейства бобовых или, более конкретно, их семена рассматривают как основной источник белка во всем мире для питания животных и человека. В этой связи соя играет выдающуюся роль не только благодаря высокому содержанию белка и качеству ее семян, но также ее богатства маслом. Однако, исходя из сельскохозяйственной точки зрения, соя требует плодородных почв и обильного водоснабжения. Растения, принадлежащие к роду Ьиртик, за последние несколько десятилетий завоевали значимую, сильную и многообещающую позицию по сравнению с соей. Если, с одной стороны, их семена обладают уровнями белка и масла, сравнимыми с таковыми для сои, то, с другой стороны, их виды хорошо адаптированы к истощенным почвам и к условиям низкой доступности воды. По этим причинам люпины иногда считали «бедными родственниками» сои.

Высокий уровень алкалоидов, которые токсичны для животных и которые естественно присутствуют в семенах обыкновенного люпина дикого типа, в течение долгого времени затруднял универсальное культивирование видов Ьиршик и использование их семян для потребления животными и человеком.

Это является основной причиной того, что культивирование люпина далеко отстало от культивирования сои. В Португалии, например, традиционное потребление семян люпина долгое время ассоциировали с употреблением пива. Эти семена сначала кипятят в воде (нагревание при 100°С разрушает способность семян к прорастанию, но не препятствует процессу набухания), а затем погружают в проточную воду на несколько дней для удаления токсичных алкалоидов. Однако недавнее применение методов селекции позволило вывести так называемые сорта сладкого люпина, которые характеризуются низким содержанием алкалоидов в семенах (менее 0,004% мас./мас.) в отличие от традиционных горьких культиваров (содержание алкалоидов более 0,004% мас./мас.). По этой причине семена сортов сладкого люпина можно безопасно употреблять в пищу человеком и животными.

Вследствие этого все возрастающая разработка пищевых продуктов на основе люпина для питания человека, а также животных является предсказуемой, как это произошло несколько десятков лет назад в отношении сои. Это особенно важно в случае белков семян люпина, альбуминов или глобулинов.

Краткое изложение сущности изобретения

Как ожидается, в настоящем изобретении решена техническая проблема, связанная с идентификацией и очисткой соединений биологического происхождения, которые способны контролировать широкий ряд патогенных агентов, поражающих сельскохозяйственные культуры, и которые действуют в качестве стимуляторов роста, сохраняя свои биологические активности в условиях ίη νίνο.

Это решение основано на открытии и идентификации авторами настоящего изобретения белка, присутствующего в растениях, принадлежащих к роду Ьиртик, который проявляет следующие необычные характеристики: 1) сильную противогрибковую и противооомицетную активность, которая дает высокий потенциал в качестве фунгицида; 2) высокую активность в качестве стимулятора роста растений, в частности, известную в отношении нездоровых или естественно ослабленных растений; 3) исключительную устойчивость к денатурации, позволяющую применять его в полевых условиях; 4) очень высокую чувствительность к протеолизу, что делает его безвредным для окружающей среды и нетоксичным для человека и животных; и 5) хорошо сбалансированный аминокислотный состав.

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к белку, определенному в п.1 формулы изобретения. Второй аспект настоящего изобретения относится к фрагменту ДНК, который

- 2 012336 кодирует этот белок (п.3 формулы изобретения). Изобретение также относится к применению белка или любого препарата, содержащего его, в качестве фунгицида, инсектицида, стимулятора роста или удобрения, либо путем непосредственного применения, в рекомбинантной форме или путем экспрессии в генетически модифицированных организмах. Наконец, в изобретении рассмотрено применение белка или любого препарата, содержащего его, в качестве пищевой добавки для человека или животных.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 - листья виноградной лозы, сильно инфицированные возбудителем настоящей мучнистой росы, опрыскивали водой (лист справа) или белком, экстрагированным из Ьиртиз (лист слева). (А) 24 ч после опрыскивания; (В) 2 месяца после опрыскивания.

Фиг. 2 - наблюдения прорастания спор гриба, вызывающего инфекцию настоящей мучнистой росы у листьев виноградной лозы, под оптическим микроскопом. Споры гриба тщательно удалили с поверхности молодых инфицированных листьев виноградной лозы и инокулировали в водный раствор агара 0,6% мас./об. (А), (В) и (С) - контроль; (Ό) и (Е) - добавление 200 мкг общей белковой фракции из зрелых ягод винограда, содержащих белки, связанные с патогенезом (РК); (Е) и (С) - добавление 200 мкг белка, экстрагированного из Еиртиз. Каждый анализ наблюдали после 24 и 48 ч. Применяли фазовоконтрастную микроскопию, и использованное увеличение составляло 125Х.

Фиг. 3 - наблюдения листьев виноградной лозы под промышленным микроскопом. (А) - здоровые листья; (В) - листья, инфицированные настоящей мучнистой росой; (С) - листья, инфицированные настоящей мучнистой росой, через 12 ч после опрыскивания белком, экстрагированным из Еиртиз. Использованное увеличение указано на каждой фотографии.

Фиг. 4 - действие белка из Еиртиз, полученного в рекомбинантной форме в ЕзсЕепсЫа сой, на прорастание и развитие спор ипсти1а песа!ог, возбудителя настоящей мучнистой росы.

Фиг. 5 - розовые кусты на одинаковой стадии развития опрыскивали водой (розовый куст справа) или раствором, содержащим белок, экстрагированный из Еирпиш (200 мкг белка/мл; розовый куст слева). На фотографии показана стадия развития обоих растений через три недели после опрыскивания.

Фиг. 6 - растения арбуза, полученные в теплице. Через шесть недель после начала прорастания растения опрыскивали водой (контроль; А), неочищенным экстрактом Еиртиз, содержащим 100 мкг белка/мл (В), стимулятором роста растений, имеющимся в продаже (концентрация рекомендована изготовителем) (С), и неочищенным экстрактом Еиртиз, содержащим 200 мкг белка/мл (Ό). За экспериментом следили в течение двух недель и фотографировали растения.

Фиг. 7 - типичный профиль нерастворимости глобулинов из растений рода Еирпиш как функция концентраций кальция и магния. Этот профиль представлен в качестве примера влияния данных катионов на аутоагрегацию белка, экстрагированного из Биртиз (), и β-конглютина из Биртиз (о). βКонглютин (0,5 мг/мл; о) и белок, экстрагированный из Биртиз (0,5 мг/мл; ), очищали из высушенных семян или семядолей, отделенных от проростков, которые проросли и были культивированы в течение восьми суток, соответственно.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новому белку с сильными противогрибковыми свойствами, который проявляет высокую активность в отношении прорастания и развития спор из грибковых и оомицетных патогенов растений, а также с активностью стимулятора роста растений, в частности, известной в отношении нездоровых или естественно ослабленных растений. В изобретении также рассмотрено применение белка или любого препарата, содержащего его, в качестве пищевой добавки для человека или животных. Нуклеотидная последовательность ДНК фрагмента гена, который кодирует белок из Биртиз, не обладает какой-либо значительной гомологией ни с каким другим противогрибковым белком, который был выделен из растений. Белок из Биртиз составляет новый тип белка среди противогрибковых белков, описанных у растений.

Белок, описанный в настоящем изобретении, очищают из семядолей, выделенных из пророщенной рассады рода Биртиз. Настоящее изобретение включает описание методологии, примененной для выделения белка из тканей растений, нуклеотидную последовательность ДНК фрагмента гена (А), который его кодирует, и соответствующую последовательность аминокислотных остатков (В).

(А) б’СЭТАСАСАААССААСССТТАТСАСТТСАЭСТСТСАААбАТТССАААСТС

ТТТАСАААААТАССААТСССААААТСС6ТСТ6СТССАСАССТТТ6АССАААСАА

ССААТАСАСТТСАСААТСТССААААСТАССССАТТбТТСАСТТССААТСААААСС

ТААСАСТСТСАТТСТСССТАААСАСТСТСАТССТЭАСТАСЭТССТСЭТТСТАСТС

ААТССТАСАСССАСААТСАССАТАСТАААСССТеАТАСААСАСААССАТАТААС

СТТСАСТАТССССАТССТСТСАСААТСССАССТ66СТСААСТТСАТАТАТССТТ ААССССЭАТ6АСААССАСААССТТАСА6ТАСТСАА6СТСССААТАСССАТСААС ААТССТ66СТАСТТТТАТСАТТТСТАТССАТССАСТАСТААА0АССААСААТССТ АСТТСАСТСССТТСА6СА6СААСАСТТТА6АССССАССТТСААТАСТСЭТТАТС ААОАСАТАСАААСбАТТАТТТТАСССААТСАССАТЗ’

- 3 012336 (В)

5’ΚΙΚνΐ_ΕΚ ΕΟΩΚΤΝΚΙΕΝ ΙΩΝΥΡίνΕΕΩ 8ΚΡΝΤΙ_ΙΙ_ΡΚ ΗδΩΑΩΥνίΛΛ/

Ι-ΝΟΡΑΤΙΊΊν ΝΡΩΚΚΩΑΥΝί. ΕΥ6ΩΑΙ_ΡΙΡΑ ΩδΤδΥΙΙΝΡΩ ΩΝΩΚΙ_ΡννΚΙ_ ΑΙΡΙΝΝΡΩΥΕ ΥΩΕΥΡ88ΤΚΩ ΩΩ8ΥΕ8ΩΕ8Ρ ΝΤΙ_ΕΑΤΕΝΤΡ ΥΕΕΙΩΚΙΙΙ_Ω ΝΕΩ3’

По-видимому, этот белок существует в природе в течение только очень короткого промежутка жизни проростков из рода Ьиртиз. Авторами настоящего изобретения продемонстрировано, что βконглютин, основной запасной белок семян из рода Ьиртиз, является биосинтетическим предшественником белка из Ьиртиз. Действительно, белок Ьиртиз представляет собой высоко процессированный белок, который претерпел несколько уровней химической модификации. Это в высшей степени затруднило его изучение, включая секвенирование аминокислотных остатков и соответствующих нуклеотидов. Во время формирования семени ген, кодирующий β-конглютин, транскрибируется в соответствующую информационную РНК (мРНК), результатом трансляции которой является синтез биосинтетического предшественника β-конглютина. Затем этот предшественник подвергается интенсивному процессингу, включая гликозилирование, в результате которого получается несколько десятков различных типов субъединиц, которые составляют β-конглютин. В последующем цикле вегетативного роста через несколько суток после начала прорастания в начальные стадии катаболизма β-конглютина вовлечено протеолитическое расщепление всех или большинства его составляющих субъединиц, что приводит в результате к накоплению белка, описанного в данном изобретении. Благодаря присущим ему противогрибковым свойствам, которые естественно использует растение-хозяин, этот белок поддерживается в очень высоких концентрациях в семядолях развивающихся растений во время стадии жизни, на которой растение является наиболее чувствительным к поражению грибками и насекомыми. Несколько суток спустя белок разрушается, а его аминокислоты используются для роста молодого растения.

Белок Ьиршиз, описанный в настоящем изобретении, проявляет некоторые свойства, которые отличают его от других противогрибковых белков, описанных в литературе. Это делает его перспективной мишенью с высоким потенциалом для разработки эффективного способа контроля грибков, которые поражают растения и/или животных:

(1) сильная противогрибковая и противооомицетная активность, которая наделяет белок высоким потенциалом в качестве фунгицида, (2) высокая активность в качестве стимулятора роста растений, в частности, известная в отношении нездоровых или естественно ослабленных растений, (3) исключительная устойчивость к денатурации, которая позволяет применять белок в полевых условиях, (4) высокая чувствительность к протеолизу, что делает его безвредным для окружающей среды и нетоксичным для человека, и (5) хорошо сбалансированный аминокислотный состав.

Белок можно также использовать в качестве инсектицида, стимулятора роста или удобрения, а также в качестве добавки к пище человека или животных.

Двумя практическими проблемами в современном сельском хозяйстве являются уменьшение или ингибирование роста, наблюдаемое у нездоровых или естественно ослабленных растений, и токсичность, обычно ассоциированная с доступными биологическими стимуляторами. Белок, экстрагированный из тканей растений Ьиртиз, проявляет высокую активность стимулятора роста в отношении роста и развития растения. Действительно, препараты Ьиртиз или экстракты, содержащие белок, обладают высокой биостимулирующей активностью в отношении всех испытанных растений, включая, например, виноградную лозу, розу, арбуз и томат. Этот эффект является подтвержденным для концентраций белка, равных или больших чем 200 мкг/мл. Другие компоненты, присутствующие в неочищенных экстрактах белка Ьиртиз, приумножают ценность препаратов, поскольку они действуют в качестве некорневого (листового) удобрения. Отсутствие токсичности белка Ьиртиз для человека, животных и окружающей среды показывает, что его применение в сельском хозяйстве не оказывает никакого вредного воздействия на окружающую среду.

Другой аспект настоящего изобретения касается методологии, использованной для рекомбинантного продуцирования белка Ьиртиз в бактериях с целью его конститутивной экспрессии в генетически модифицированных растениях. В конечном итоге, данные растения будут проявлять высокий уровень устойчивости к патогенным грибам, а именно в отношении грибов, трудно поддающихся контролю (как в случае грибов, вызывающих так называемые болезни древесины), против которых традиционные фунгициды экзогенного применения совсем неэффективны.

Белок экстрагировали из восьмидневных ростков Ьиршиз а1Ьи§ сорта ЬеБ1апс. Семена помещали в комнату с постоянно поддерживаемой температурой (25°С днем, 20°С ночью) со световым периодом, равным 16 ч свет/8 ч темнота.

После сбора семядоли замораживали в жидком азоте. Экстракцию белка осуществляли в буфере 100 мМ Трис-НС1, рН 7,5, содержащем 10% мас./об. №С1, 10 мМ ΕΌΤΆ (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 10 мМ ΕΘΤΆ (этиленгликоль-бис-(в-аминоэтиловый эфир)-№^,№,№-тетрауксусной кисло

- 4 012336 ты). После периода инкубации 30 мин при 4°С экстракт центрифугировали при 30000 д в течение 1 ч при 4°С. Надосадочную жидкость обессоливали, и белок, экстрагированный из Ьиртик, последовательно очищали при помощи ЕРЬС (жидкостной экспресс-хроматографии белков и пептидов) - анионообменной хроматографии.

Ν-концевое секвенирование белка, экстрагированного из Ьиртик, выполняли путем расщепления белков по Эдману. Полученную последовательность аминокислотных остатков использовали для конструирования вырожденных праймеров. Суммарную мРНК экстрагировали из развивающихся семян Ьцр1ии8 а1Ьиз на стадии, где происходит максимальный синтез предшественника β-конглютина. Экстракцию мРНК проводили с использованием протоколов/наборов для очистки мРНК из растительного материала. Комплементарную ДНК (кДНК), соответствующую фрагменту гена, кодирующего белок, экстрагированный из Ьиртик, амплифицировали при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакции) с использованием предварительно сконструированных вырожденных праймеров. С использованием нуклеотидной последовательности, полученной в качестве матрицы, были сконструированы новые праймеры, и полноразмерная нуклеотидная последовательность фрагмента гена, кодирующего белок, экстрагированный из Ьцршик, была получена при помощи методики 3' и 5' ВАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК).

Белок из Ьиршик продуцировали в рекомбинантной форме в бактериях ЕксйепсЫа со11. Фрагмент гена, кодирующий белок из Ьиртик, клонировали в подходящем векторе, который дает возможность ассоциации представляющего интерес гена с промотором Т7/ас. Этот промотор является индуктивным, следовательно, экспрессия генов, ассоциированных с ним, происходит исключительно в присутствии сахара изопропилтио-в-галактозида. В конце концов, были трансформированы компетентные клетки ЕкскспсЫа сой.

Как описано выше, белок из Ьиртик был получен в рекомбинантной форме из бактерий. Однако для его тестирования на противогрибковую активность рекомбинантный белок из Ьиртик следовало отделить от всех других бактериальных белков. С этой целью белок из Ьиртик предварительно продуцировали в рекомбинантной форме с меткой из остатков гистидина (Н1к-метка). Методология, примененная для его очистки, была основана на высоком сродстве ионов никеля к Н1к-метке. Таким образом, связав ионы никеля с агарозным матриксом, осуществили очистку рекомбинантного белка, зная, что среди всех белков, присутствующих в общем бактериальном экстракте, только белок из Ьиртик связывается с агарозным матриксом. Затем белок из Ьиртик выделили после соответствующей серии промывок и элюирования, и Н1к-метку удалили после обработки подходящим протеолитическим ферментом.

Тщательный выбор подходящего промотора является необходимым условием для генетических модификаций растений. В литературе описано несколько типов промоторов, которые дают возможность экспрессии ассоциированных генов. Для экспрессии фрагмента гена, кодирующего белок, описанный в настоящем изобретении, выбранный промотор может быть индуктивным или конститутивным в зависимости от типа требуемой экспрессии. Выбор промотора также важен для направления синтезированного белка в выбранную ткань или клеточный компартмент (посттранскрипционных модификаций).

Трансформация растения может быть достигнута при помощи различных методик, таких как, например, трансформация растения посредством АдтоЬас1егшт, трансформация протопластов, перенос генов на пыльцевое зерно, прямая инъекция в репродуктивные органы или несформированные эмбрионы, а также бомбардировка частицами. Каждый из этих методов представляет специфические достоинства и недостатки. Тем не менее, все они уже были использованы на различных типах растений.

Для трансформации растений фрагментом гена, кодирующего белок из Ьиртик, выбранный метод представлял собой трансформацию посредством АдтоЬас1егшт (Ега1еу е1 а1., 1983) с использованием подходящего экспрессионного вектора, содержащего кодирующую область представляющего интерес гена, ассоциированную с подходящим маркерным геном. Регенерация растения, развитие растения и перенос растения в культуральную среду из единичного протопласта могут быть достигнуты, следуя нескольким методикам, доступным в литературе. Этот процесс включает несколько стадий по отбору трансформированных клеток и последующему культивированию данных клеток обычными способами, применяемыми при разработке эмбриогенных культур. Регенерированные проростки, в конце концов, выращивают в подходящей среде для культивирования, обычно в почве.

Целью настоящего изобретения также является любой сельскохозяйственный препарат, который в качестве активного ингредиента включает белок по пп.1, 2 или рекомбинантную форму этого белка, полученную по п.9, характеризующийся применением при предотвращении, контроле и борьбе с патогенными грибами или оомицетами или болезнями, вызванными насекомыми, либо в качестве стимулятора роста или удобрения.

Другой аспект настоящего изобретения относится к часто пониженным уровням растительных белков в пище человека и животных и, в некоторых случаях, плохого переваривания белков и несбалансированного аминокислотного состава. Действительно, неочищенные препараты, содержащие белок Ьиртик, обладают не только основным глобулином (белок Ьиртик, цель настоящего изобретения), но также и множеством альбуминов, которые присутствуют в природном растительном материале, используемом при экстракции белка. Вследствие этого данные неочищенные препараты белка Ьиртик особенно богаты

- 5 012336 белками, и их можно использовать в качестве белковой добавки к пище животных или человека в виде тофу, соевого творога (после осаждения глобулина кальцием и магнием) или в виде псоНа (после термической денатурации и осаждения альбуминов).

Анализ аминокислотного состава белка Ьиршик и его высокая чувствительность ко всем протестированным протеазам (включая трипсин, химотрипсин, субтилизин, протеиназу К и проназу) указывают на то, что этот белок имеет высокую питательную ценность для животных. Однако белок, рассматриваемый в настоящем изобретении, представляет собой глобулин. По этой причине белок Ьиршик нерастворим в воде и разбавленных солевых растворах, но легко растворим в растворах с высокой ионной силой. Тем не менее, глобулины бобовых растений нерастворимы только в присутствии кальция, магния и других щелочно-земельных катионов (Ретгепа с1 а1., 1999). Эти дивалентные катионы, положительно заряженные при нейтральных значениях рН, действуют в качестве электростатических мостиков между отрицательно заряженными молекулами глобулинов, стимулируя или индуцируя их аутоагрегацию с образованием комплексов, которые имеют настолько большой размер, что становятся нерастворимыми (Еетгета е1 а1., 1999; Ретгепа е1 а1., 2003). Тофу, например, представляет собой творог, похожий на сыр или прессованный творог, получаемый добавлением ионов кальция и магния к нагретому экстракту соевых бобов. Оба вида катионов обычно используют при изготовлении тофу, и они имеются в продаже в форме №дап®. Таким образом, неочищенный препарат белка Ьиршик, содержащий как глобулины, так и альбумины, можно использовать при изготовлении концентратов глобулинов из Ьиршик после их осаждения кальцием и/или магнием. На фиг. 7, например, показан паттерн осаждения белка Ьиршик () как функция добавленных концентраций кальция и магния. В целях сравнения также представлен профиль осаждения его белка-предшественника, β-конглютина (основной запасной белок, присутствующий в семенах Ьиршик; о). Альбумины, которые остаются в полученной в результате сыворотке, также можно выделить, например, путем термической денатурации и осаждения, в ходе процесса, подобного используемому при изготовлении псоНа (термическая денатурация и осаждение молочных альбуминов, которые остаются в сыворотке после удаления казеина во время изготовления сыра). Таким образом, препараты, содержащие белок Ьиршик, можно использовать в качестве белковой добавки к пище человека или животных.

Чтобы понять потенциал настоящего изобретения, ниже представлено несколько практических примеров. Однако данные примеры не являются ограничительными в том смысле, что можно применять альтернативные методы при использовании белка из Ьиршик в качестве агента противогрибкового и оомицетного контроля, в качестве инсектицида, в качестве стимулятора роста, в качестве удобрения или в качестве белковой добавки к пище человека или животных.

Примеры

Примеры 1 и 2. Эффект опрыскивания белком из Ьиршик поверхности листьев виноградной лозы, инфицированной грибом иисти1а песаЮг (возбудителем настоящей мучнистой росы у виноградной лозы).

Противогрибковую активность белка из Ьиршик оценивали после опрыскивания поверхности листа виноградной лозы раствором, содержащим 200 мг очищенного белка/мл. В качестве контроля подобный лист опрыскивали водой при идентичных условиях. Полученные результаты представлены на фиг. 1 и показывают, что лист виноградной лозы остается здоровым в течение двух месяцев после опрыскивания листьев белком без следов присутствия гриба, даже если опрысканные листья всегда и постоянно поддерживали в тесном контакте с сильно инфицированными листьями.

Другое испытание проводили, следуя идентичному методу, но наблюдения поверхностей обработанных листьев виноградной лозы проводили с использованием промышленного микроскопа (фиг. 3).

Пример 3. Эффект белка из Ьиршик на прорастание и развитие спор ипсши1а песаЮг.

Споры гриба ипсши1а пееаЮг удалили с поверхности инфицированных листьев виноградной лозы и инокулировали в водный раствор агара 0,6% мас./об., содержащий 200 мг/мл очищенного белка из Ьиршик или 200 мг/мл общей белковой фракции из зрелых ягод винограда (содержащих РК белки). Прорастание спор и развитие ростковых трубочек наблюдали при помощи оптической микроскопии, используя фазово-контрастную оптическую систему, в течение 24 и 48 ч. Полученные результаты, представленные на фиг. 2, показывают, что в присутствии среды, содержащей белок из Ьиршик, произошло заметное уменьшение не только количества проросших спор, но также и длины ростковых трубочек. Этот эффект является заметным по сравнению с результатом, наблюдаемым в присутствии РК белков.

Пример 4. Эффект белка из Ьиршик на прорастание и развитие спор гриба Рйошорщк \'Шсо1а (возбудителя экскориоза виноградной лозы).

Споры гриба Рйошоркщ \'Шсо1а инокулировали в среду ΡΌΑ (картофельный агар с декстрозой). Через 15 мин споры удалили и смешали с раствором, содержащим белок из Ьиршик, в конечном объеме, равном 25 мл. Эти капельки поместили в чашки Петри и накрыли предметными стеклами, которые затем герметично закрыли, создав влажную камеру. Наблюдали развитие спор при помощи оптической микроскопии. Было очевидно явное ингибирование прорастания спор. После 24 ч развития произошел лизис гифы.

- 6 012336

Пример 5. Эффект рекомбинантного белка из Ьиршик на прорастание спор грибка иисши1а иеса1от.

Рекомбинантный белок из Ьиртиь, экспрессированный в бактериях, очищали и тестировали его противогрибковую активность. Данные анализы проводили, как описано выше в примерах 2 и 3. Полученные результаты, представленные на фиг. 4, показывают, что рекомбинантный белок проявляет противогрибковые свойства, идентичные тем, которые наблюдали для белка, экстрагированного из растений Ьиршик. После 48 ч периода инкубации в присутствии рекомбинантного белка из Ьиршик наблюдали разрушение клеточных стенок спор.

Пример 6. Эффект рекомбинантного белка из Ьиршик на прорастание спор оомицета Р1акторага У11йсо1а (возбудителя ложной мучнистой росы).

Споры оомицета Р1акторага уййсо1а удалили с поверхности инфицированных листьев виноградной лозы и поместили в водный раствор агара 0,6% мас./об., содержащий 200 мг/мл рекомбинантного очищенного белка из Ьиршик. Прорастание спор наблюдали в течение 48 ч при помощи оптической микроскопии. Прорастание спор в водном растворе агара использовали в качестве контроля. После 24 ч клеточные стенки спор были разрушены с сопутствующим высвобождением клеточного содержимого.

Пример 7. Эффект опрыскивания розовых кустов белком, экстрагированным из Ьиршик.

Биостимулирующую активность белка Ьиршик оценивали после опрыскивания поверхностей листьев розового куста неочищенным экстрактом Ьиршик, содержащим 200 мкг белка/мл. В качестве контроля розовый куст, находящийся на идентичной стадии развития и инкубированный при тех же условиях окружающей среды, опрыскивали водой. Полученный результат, сфотографированный через три недели после опрыскивания, представлен на фиг. 5 и показывает превосходный рост растения, опрысканного белком Ьиршик, о чем свидетельствует преждевременное появление первых цветочных бутонов.

Пример 8. Эффект опрыскивания саженцев арбуза белком, экстрагированным из Ьиршик.

Биостимулирующую активность белка Ьиршик оценивали после опрыскивания поверхностей листьев шестинедельных саженцев арбуза неочищенным экстрактом Ьиршик, содержащим 200 мкг белка/мл. Исследование осуществляли в условиях теплицы, и растения опрыскивали водой (контроль; А), неочищенным экстрактом Ьиршик, содержащим 100 мкг белка/мл (В), стимулятором роста растений, имеющимся в продаже (концентрация рекомендована изготовителем) (С), и неочищенным экстрактом Ьиршик, содержащим 200 мкг белка/мл (И). В каждом анализе использовали двадцать четыре растения. За экспериментом следили в течение последующих двух недель, и полученные результаты представлены на фиг. 6. Растения, опрысканные самой высокой концентрацией белка Ьиршик (200 мкг белка/мл; И), показывают самое высокое развитие и превосходный рост листьев по сравнению с растениями, обработанными водой или стимулятором роста растений, имеющимся в продаже. Растения, опрысканные наименьшей концентрацией белка Ьиршик (100 мкг белка/мл; В), показывают более низкий уровень развития, но все же более высокий, чем наблюдаемый для растений, опрысканных только водой. Таким образом, рекомендуемый уровень применения представляет собой опрыскивание растений неочищенным препаратом белка Ьиршик, содержащим 200 мкг белка/мл.

Пример 9. Эффект опрыскивания белком, экстрагированным из Ьиршик, растений виноградной лозы, инфицированных иисши1а иеса1от (грибковым возбудителем настоящей мучнистой росы, экономически наиболее важного заболевания виноградной лозы в мировом масштабе).

Готовили неочищенный экстракт Ьиршик, содержащий 200 мкг белка Ьиршик на мл. Растения виноградной лозы, инфицированные иисши1а иеса!от и содержащиеся в условиях теплицы, опрыскивали экстрактом или водой (контроль). Через 24 ч после применения наблюдали опрысканные растения - по сравнению с контролем растения, опрысканные белком Ьиршик, проявили большую жизненную силу и обнаружили появление новых побегов. Эта ситуация сохранялась в течение по меньшей мере одной недели, после чего растения, предварительно ослабленные присутствием грибов, были пышно растущими и имели много новых листьев при полном отсутствии симптомов заболевания.

Пример 10. Определение оптимальных концентраций кальция и магния, требуемых для изготовления концентрата белка Ьиршик типа тофу.

Хорошо сбалансированный аминокислотный состав белка Ьиршик, а также его отличная перевариваемость (белок легко гидролизуется на составляющие его аминокислоты под действием протеаз пищеварительного тракта человека) подчеркивают высокий питательный потенциал концентрата белка Ьиршик, полученного после осаждения 5 мМ кальцием + магнием глобулинов, присутствующих в неочищенном препарате белка Ьиршик (см. фиг. 7).

Ссылки

Рта1еу, КТ., Кодегк, 8.О., Нотксй, КВ., 8аибегк, Р.К, Рйск, 1.8., Абатк, 8.Р., Вййиет, М.Ь., Втаиб, Ь.А., Ршк, С.Ь., Ргу, 1.8., Оайиррй, О.К, Оо1бЬетд, 8.В., Ноййтаи, Ы.Ь. & Аоо. 8.С. (1983). Ехртеккюи ой Ьас1епа1 деиек ш р1аи! се11к. Ртосеебшдк ой 1йе Ыа1юиа1 Асабету ой 8с1еисек И8А, 80, 4801-4807.

Реттета, К.В., Ргаисо, Е. & Те1хепа, А.К (1999). Са1сшт- аиб тадиекшт-береибеи! аддгедабои ой 1едите кеебк к!огаде рго!ешк. 1оита1 ой Адг1сиЙига1 аиб Рооб Сйет1к1ту, 47, 3009-3015.

Реттета, К.В., Ртейак, К.Ь. & Те1хепа, А.К. (2003). 8е1й-аддтеда1юи ой 1едите кееб к!огаде рто1ешк шк1бе 1йе рто1еш к!огаде уасио1ек 1к е1ес!ток1а11с ш иа1ите, га1йег Πιηιτ 1ес1ш-теб1а1еб. РЕВ8 Ьейетк, 534, 106110.

- 7 012336

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Полипептид, экстрагированный из растений рода Еиршиз, с Ν-концевой последовательностью [5'ΚΚ^ΚΝΡΥΗΕ8 δρΚΤρΤΕΥΚΝ ΚΝΟ3’], характеризующийся:

   (а) последовательностью аминокислотных остатков, представленной в (В);

   (В)

   5’ΚΙΚνΣΕΚ ΓΙ)ωΐ<Τ\Ί<Ι.Ε\ ^^NΥΚIVΕΕ^ δΚΡΝΤΜΕΡΚ 1181 )ΑΙ )Υ\Ί ΛΎ С Ν6 ΚΑΤΙΤΙ V ΝΡΙ)Ι<Ι<ΟΑΥΝΙ. ΕΥΟΌΑΕΚΙΡΑ Ο8Τ8ΥΙΕΝΡΌ ОУОКГЕУУКГ ΑΙΡΙΝΝΡΟΥΕ ΥΌΕΥΡ88ΤΚΌ ^^8ΥΕ8ΟΕ8Β ΝΤΕΕΑΤΕΝΤΒ ΥΕΕ^ΚΙΙΕΟ ΝΕΌ3' и

   (б) последовательностью аминокислотных остатков, представленной в (В), в которой один или более чем один аминокислотный остаток отсутствует, заменен, добавлен или модифицирован, и полипептид проявляет противогрибковую и противооомицетную активность, активность стимулятора роста растений и/или сохраняет его биологические свойства.
2. 2. Полипептид, экстрагированный из растений рода Еиршиз, по п.1, характеризующийся тем, что он гликозилирован, фосфорилирован, алкилирован и/или пренилирован.
3. 3. Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид по п.1, характеризующийся:

   (а) нуклеотидной последовательностью, представленной в (А);

   (А)

   5’ССТАСАСАААССААСССТТАТСАСТТСАССТСТСАААСАТТССАААСТС

   ТТТАС/МкАААТАССААТСбСААААТСССТСТССТСбАСАССТТТСАССАААСАА

   ССААТА6АСТТСАСААТСТССААААСТАССССАТТ6ТТ6А6ТТССААТСААААСС

   ТААСАСТСТСАТТСТСССТАААСАСТСТСАТ6СТСАСТАССТССТССТТСТАСТС ААТ6СТАСАСССАСААТСАС6АТА6ТАААСССТСАТАСААСАСААССАТАТААС СТТСАСТАТССССАТССТСТСАСААТСССАССТСССТСААСТТСАТАТАТССТТА АССС6САТ(ЗАСААССА(ЗААССТТАСА6ТА6ТСАА6СТС(ЗСААТАСССАТСААСА АТССТСОСТАСТТТТАТСАТТТСТАТССАТССАСТАСТАААСАССААСААТССТА СТТСАбТСОСТТСАССАСОААСАСТТТАСАССССАССТТСААТАСТССТТАТСА АСА6АТАСААА6САТТАТТТТАСССААТСАС6АТЗ’ (б) последовательностью нуклеотидов, представленной в (А), в которой один или более чем один нуклеотид отсутствует, заменен, добавлен или модифицирован, и кодирующей полипептид с противогрибковой и противооомицетной активностью, активностью стимулятора роста растений и/или сохраняющей его биологические свойства.
4. 4. Рекомбинантный вектор, характеризующийся тем, что он содержит фрагмент ДНК по п.3.
5. 5. Трансформированная клетка, характеризующаяся тем, что она трансформирована рекомбинантным вектором по п.4.
6. 6. Клетка, трансформированная по п.5, характеризующаяся тем, что она имеет происхождение от ΕδοΗβηοΗία сой.
7. 7. Клетка, трансформированная по п.5, характеризующаяся тем, что она имеет происхождение от растения, животного или микроорганизма.
8. 8. Трансгенное растение, характеризующееся тем, что оно содержит трансформированную клетку по п.5 и проявляет устойчивость к патогенным грибам, оомицетам или болезням, вызванным насекомыми, которое получают путем регенерации указанной трансформированной клетки.
9. 9. Способ получения полипептида по п.1, характеризующийся тем, что он включает культивирование трансформированных клеток по пп.5, 6 и 7 и выделение полипептида с противогрибковой активностью из культуры клеток или клеточного экстракта.
10. 10. Препарат или неочищенный препарат полипептида, характеризующийся тем, что он включает в качестве активного ингредиента полипептид по п.1 или 2, или его рекомбинантную форму, полученную по п.9.
11. 11. Препарат или неочищенный препарат полипептида по п.10, характеризующийся тем, что его применяют для предотвращения, контроля или борьбы против патогенных или непатогенных грибов и оомицетов, болезней, вызванных насекомыми, в качестве стимулятора роста растений и удобрения.
12. 12. Применение полипептида по п.1 или 2 или его рекомбинантной формы, полученной по п.9, для изготовления препарата, характеризующееся тем, что его целью является предотвращение, контроль или борьба против патогенных или непатогенных грибов и оомицетов, насекомых, в качестве стимулятора роста растений и удобрения.
13. 13. Применение полипептида по п.1 или 2 или его рекомбинантной формы, полученной по п.9, для предотвращения, контроля или борьбы против патогенных или непатогенных грибов и оомицетов, болезней, вызванных насекомыми, в качестве стимулятора роста растений и удобрения, характеризующееся тем, что на растение наносят полный или частичный экстракт I Λίρίηιιχ, содержащий полипептид по п.1 или 2 или его рекомбинантную форму, полученную по п.9.

    - 8 012336
14. 14. Применение полипептида по п.1 или 2 или его рекомбинантной формы, полученной по п.9, либо неочищенного препарата, содержащего его, характеризующееся тем, что его наносят в качестве биостимулятора или в качестве стимулятора роста и развития растений, где такая биостимулирующая активность, в частности, наблюдается после опрыскивания листвы растений, естественно ослабленных или инфицированных патогенными агентами.
15. 15. Применение полипептида по п.1 или 2 или его рекомбинантной формы, полученной по п.9, либо неочищенного препарата, содержащего его, характеризующееся тем, что его применяют для изготовления белковых концентратов высокой питательной ценности для питания человека или животных либо после осаждения глобулина солями кальция и магния, либо при помощи или без помощи физической обработки, такой как нагревание для осаждения альбумина.