HU218110B - Antimikrobiális hatású fehérjék, ilyen fehérjéket tartalmazó készítmények és eljárás ezek előállítására - Google Patents

Antimikrobiális hatású fehérjék, ilyen fehérjéket tartalmazó készítmények és eljárás ezek előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU218110B
HU218110B HU9400526A HU9400526A HU218110B HU 218110 B HU218110 B HU 218110B HU 9400526 A HU9400526 A HU 9400526A HU 9400526 A HU9400526 A HU 9400526A HU 218110 B HU218110 B HU 218110B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
proteins
protein
seq
cys
gly
Prior art date
Application number
HU9400526A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT68522A (en
HU9400526D0 (en
Inventor
Kirsten Bojsen
Karsten M. Kragh
Jorn Dalgaard Mikkelsen
John E. Nielsen
Klaus K. Nielsen
Original Assignee
Novartis Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag. filed Critical Novartis Ag.
Publication of HU9400526D0 publication Critical patent/HU9400526D0/hu
Publication of HUT68522A publication Critical patent/HUT68522A/hu
Publication of HU218110B publication Critical patent/HU218110B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)

Abstract

A találmány cukorrépából izolált, antimikrobiális hatású fehérjékre,hatóanyagként e fehérjéket tartalmazó készítményekre és ezekelőállítására vonatkozik. A fehérjék a szekvencialista 2., 5. és 8.számú szekvenciájával ábrázolt tiszta termékek, amelyekben a fentiszekvenciákat egy vagy több aminosavval bővítik, vagy egy vagy többaminosavat azokban helyettesítenek vagy azokból eltávolítanak afehérje antimikrobiális hatásának lényeges csökkenése nélkül, valaminta fenti fehérjék és analógjaik keverékei. Legalább egy AX fehérjénekegy WIN fehérjével készített kombinációja szinergetikus hatású. Atalálmány továbbá a találmány szerinti fehérjéket kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-re, az ezen DNS-t magábanfoglaló vektorra, valamint a vektort befogadó, transzformáltnövényekre is kiterjed. Végül a találmány tárgyát képezik az említettfehérjéket tartalmazó készítmények, valamint az az eljárás is,amelynek útján gombák és baktériumok az említett fehérjék vagykészítmények bevetésével leküzdhetők. ŕ

Description

A találmány cukorrépából izolált, antimikrobiális hatású fehérjékre, e fehérjéket hatóanyagként tartalmazó készítményekre és ezek előállítására vonatkozik.
Antimikrobiális hatású fehérjén olyan fehérjét értünk, amely (önmagában vagy valamely más anyaggal kombinálva) bármilyen körülmények között, bármely mikroorganizmusra - így baktériumokra, vírusokra, különösen gombákra - toxikus vagy szaporodásgátló hatást fejt ki. Az ilyen antimikrobiális fehérjék hatásukat a mikroorganizmussal érintkezve, vagy azok asszimilációjával vagy légzésével kapcsolatosan fejtik ki.
A jelen találmány cukorrépából izolált antimikrobiális fehérjéket biztosít.
Előnyösnek találtuk a cukorrépa fertőzését a Cercospora nemzetséghez tartozó gombával; különösen előnyösen a fehérjéket Cercospora beticolával fertőzött cukorrépa leveleiből különítettük el.
A találmány tárgyát a 2., 5. és 8. számú szekvenciákkal ábrázolt tiszta fehérjék, valamint e fehérjék vagy analógjaik keverékei képezik.
A találmány tárgyát képezik továbbá azok a tiszta fehérjék is, amelyek a 8. számú szekvencia 80-111 helyű maradékaiból vagy a 2. számú vagy az 5. számú szekvencia 29-74 helyű maradékaiból állnak, valamint e fehérjék vagy analógjaik keverékei is. A 2. számú és 5. számú szekvenciák 29-74 helyű maradékaiból álló aminosavszekvenciát tartalmazó fehérjéket az alábbiakban AX1nek, illetve AX2-nek nevezzük; a 8. szekvencia 80-111 helyű maradékaiból álló aminosavszekvenciát tartalmazó fehérjét az alábbiakban AX3. l-gyel jelöljük.
Növények gomba vagy vírus kórokozókkal végzett fertőzése mintegy tíz homológ, kórfejlődéssel kapcsolatos fehérjecsalád („pathogenesis-related” proteins, röviden : PR proteinek) szintézisét váltja ki a vegetatív szövetekben. Ezeket a PR fehérjéket öt csoportra osztották. A PR-2, PR-3 és PR-5 fehérjék béta-l,3-glukanáz, kitinázok, illetve taumatinhoz hasonló fehérjék. A PR-1 és PR-4 fehérjecsoportoknak eddig nem tulajdonítottak specifikus hatást. A PR-4 fehérjék a prohevein és a burgonya vélhetően sebzéssel indukált WIN fehérjéinek C-terminális tartományaihoz hasonlók; a hevein N-terminális tartományát tehát nem tartalmazzák, így a savas, kórfejlődéssel kapcsolatos fehérjék 4. csoportjának bázisos „ellenpárja” a prohevein és a burgonya vélhetően sebzéssel kiváltott WIN fehérjéinek Cterminális tartományaihoz hasonló fehérjék bázisos ellenpárját jelenti.
A fentebb meghatározott, kórfejlődéssel kapcsolatos fehérjék bázisos ellenpárját képviselő fehérje előnyösen egy kitinhez kapcsolódó WIN fehérje; ez legelőnyösebben árpamagból vagy feszített árpalevélből izolálható.
A találmány továbbá a fentebb leírt fehérjékre is vonatkozik, amelyeket aminosavszekvenciáik ismerete alapján in vitro körülmények között szintetizáltunk.
A találmány továbbá olyan szekvenciák - például az 1., 3., 4., 6., 7. vagy 9. számú szekvenciák - egyikét tartalmazó rekombináns DNS-re is vonatkozik, amely egy vagy több, fentebb említett antimikrobiális fehérjét vagy azok analógjait kódolja. Adott esetben a rekombináns DNS-szekvencia olyan fehérjét kódoló szekvenciát is magában foglalhat, amely a fehérjék savas, a kórfejlődéssel kapcsolatos 4. csoportjának bázisos ellenpárja (amint ezt fentebb leírtuk).
A találmány tárgyát képezik továbbá azok a DNSszekvenciák is, amelyek a közvetlenül megelőző bekezdésben leírt, rekombináns DNS-szekvenciával pontosan megszabott körülmények között hibridizálnak. A „pontosan megszabott hibridizálási körülmények” fogalmán azt értjük, hogy a hibridizálást 50 °C és 60 °C közötti hőmérsékleten 0,1% SDS-t tartalmazó 2X konyhasó-citrát-pufferoldatban végezzük, s ezt követően ugyanazon a hőmérsékleten csökkentett koncentrációjú SSC-pufferoldattal öblítjük, amely a már végbement hibridizálást nem befolyásolja. Ilyen csökkentett koncentrációjú pufferoldatok a következők: (a) lxSSC, 0,1% SDS; vagy (b) 0,5xSSC, 0,1% SDS; vagy (c) 0,lxSSC, 0,1% SDS.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentebb leírt rekombináns DNS-szekvenciákat tartalmazó vektor is. Ezek a szekvenciák megfelelő promoter és terminátor kontrollja, például a hősokkfehérjék átírását ellenőrző kontroll alatt állnak.
A találmány arra a biológiai rendszerre, különösen növényre vagy mikroorganizmusra is vonatkozik, amely a fentebb leírt rekombináns DNS-t tartalmazza és annak kifejezését lehetővé teszi.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fentiekben leírt. rekombináns DNS-sel transzformált növények is.
Az ilyen növényeket ismert módszerek alkalmazásával alakítjuk ki, például úgy, hogy a találmány szerinti DNS-sel transzformált növényi sejteket vagy protoplasztokat az ismert, változatosan alkalmazható módszerek valamelyikével transzformáljuk és regeneráljuk (az Agrobacterium Ti és Ri plazmidjai, elektroporáció, mikroinjekció, mikrolövedékes pisztoly). Alkalmas esetekben a transzformált sejtek teljes növényekben regenerálhatok, ahol a rekombináns DNS a genomba stabilan beépül. Ezen az úton egy- és kétszikű növények nyerhetők, az utóbbiak általában könnyebben regenerálhatok.
A jelen találmány szerinti, genetikailag módosított növények példáiként a következőket említjük: gyümölcsök, így - a paradicsomfajtákat is beleértve - mangó, körte, alma, barack, eper, banán és dinnye; továbbá szántóföldi termények, például a napraforgó, dohány, cukorrépa; valamint a szemestermények, így a búza, árpa, rizs, kukorica és gyapot; továbbá főzelékfélék, így a burgonya, répa, saláta, káposzta és hagyma.
Különösen előnyös növény a cukorrépa és a kukorica.
A növények például a következő rekombináns DNS-szekvenciákkal transzformálhatok: az AX1 fehérjét kódoló szakasz (a 2. számú szekvencia 29-74 helyű maradékai); vagy annak funkciós szempontból egyenértékű analógja, amelyben egy vagy több aminosavat hozzáadtunk, helyettesítettünk vagy abból eltávolítottunk az antimikrobiális hatás lényeges csökkenése nélkül; vagy olyan rekombináns DNS-szekvencia, amely az AX2 fehérjét kódoló szakaszt (az 5. számú szekvencia
HU218 110 Β
29-74 helyű maradékai) vagy annak funkciós szempontból egyenértékű analógját tartalmazza, ahol egy vagy több aminosavval bővítettünk, vagy azokban egy vagy több aminosavat helyettesítettünk vagy eltávolítottunk antimikrobiális hatásának lényeges csökkenése nélkül; vagy olyan rekombináns DNS-szekvencia, amely magában foglalja az AX3.1 fehérjét kódoló szakaszt (a 8. számú szekvencia 80-111 helyű maradékai) vagy annak funkciós szempontból egyenértékű analógjait, ahol egy vagy több aminosavvval bővítettünk, vagy egy vagy több aminosavat helyettesítettünk vagy eltávolítottunk az antimikrobiális hatás lényeges csökkenése nélkül; vagy olyan DNS-szekvencia, amely két vagy több előbb említett AX fehérje vagy analógjaik kombinációját kódoló szakaszt tartalmaz.
A transzformált növények olyan ivadékai, amelyek az említett rekombináns DNS-szekvenciákat kifejezik, továbbá az ilyen növények magvai és ivadékai szintén a találmány tárgyát képezik.
A találmány továbbá a fentebb leírt, rekombináns DNS kifejezéséből származó fehérjére, így a rekombináns DNS növényeken belüli kifejezésével termelt antimikrobiális hatású fehérjére is vonatkozik.
A találmány tárgyát képezik továbbá a hatóanyagként egy vagy több antimikrobiális hatású fehérjét tartalmazó, antimikrobiális hatású készítmények is.
A találmány továbbá arra az eljárásra is vonatkozik, amelynek útján gombák és baktériumok leküzdhetők. Ez az eljárás abban áll, hogy a gombákat vagy baktériumokat az antimikrobiális fehérjék vagy e fehérjéket tartalmazó készítmények hatásának tesszük ki.
A találmány tárgya továbbá extrakciós eljárás antimikrobiális fehérjék előállítására az e fehérjéket tartalmazó szerves anyagból, különösen olyan eljárás, amelynek során az anyagot maceráló és oldószeres extrakciós lépésnek vetjük alá. Ezt követően az antimikrobiális fehérjék centrifugálással, valamint hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiás eljárással, anioncserével, kationcserével, gélszűréssel vagy fordított fázisú kromatográfiával tisztíthatok.
A fentebb említett extrakciós eljárást előnyösen olyan szerves anyaggal végezzük, amely Cercospora beticolával fertőzött cukorrépaleveleket tartalmaz, vagy olyan rekombináns DNS-t tartalmazó mikroorganizmussal fertőzött cukorrépalevelekkel hajtjuk végre, amely a találmány szerinti antimikrobiális fehéijét vagy annak analógját kódoló szekvenciát tartalmaz, vagy olyan rekombináns DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kórfejlődéssel kapcsolatos fehérjék 4. savas csoportjának bázisos ellenpárját képviselő fehéijét kódol. Nyilvánvaló, hogy az antimikrobiális fehérje csekély vagy semmiféle antimikrobiális hatást sem fejt ki arra a mikroorganizmusra, amely a fentebb említett szerves anyag forrása.
A találmányt az alábbi konkrét leírással, a szekvenciák azonosításával és az ábrákkal részletesen bemutatjuk.
A csatolt ábrákkal kapcsolatban az alábbiakat közöljük.
Az 1. ábrán látható az AX1, AX2 és AX3 fehérjék eluálása Mono S kationoszlopról, növekvő koncentrációjú konyhasóoldatokkal (szaggatott vonallal jelölve).
A 2. ábra SDS és ditiotreit (DTT) redukálószer jelenlétében elektroforézisnek alávetett, tisztított AX1, AX2, AX3 és WIN fehérjéket tartalmazó, ezüsttel festett poliakrilamid-gélt mutat: a kis molekulatömegű jelző- („marker”) fehéijék a gél jobb oldali szélén és bal oldali szélén helyezkednek el. A WIN fehérjét árpamagból izoláltuk.
A 3A. és 3B. ábrákon bemutatjuk az adott esetben árpamagból izolált WIN fehérjével kombinálható AX1, AX3 és AX2 gombaellenes hatását.
A 4. ábra mutatja a C. beticola morfológiáját 28 pg/ml koncentrációban alkalmazott WIN fehérjével való kezelés után (B. ábra); valamint a 8 pg/ml koncentrációban alkalmazott AX2 fehérjével végzett kezelés hatására (C. ábra); továbbá 8 pg/ml AX2 és 28 pg/ml WIN fehérje kombinációjának a hatására (G. ábra); a 4A. ábrán látható a WIN és AX2 fehérje nélkül tenyésztett C. beticola morfológiája.
Az 5. ábrán látható SDS jelenlétében és ditiotreit (DTT) redukálószer jelenlétében vagy távollétében elektroforézisnek alávetett, tisztított AX1, AX2 és AX3 fehérjéket hordozó, ezüsttel festett poliakrilamidgél. Ellentétben az AX1 és AX2 fehérjékkel, az AX3 két izoformájának elektroforetikus mozgékonyságát a DTT jelenléte erélyesen befolyásolja, s ez azt mutatja, hogy az AX3.1 és AX3.2 valószínűleg dimerek
- ha nem trimerek - alakjában van jelen. A gél viszonylag erős háttérszíneződése
- ami a fehérjesávok szomszédságában elkenődés formájában mutatkozik - a fehérje spontán oxidációjának tulajdonítható az elektroforézis során, míg a gélek tetején látható háttérszíneződés a DTT mesterséges festődésének tulajdonítható. Az AX1 és AX2 fehérjék látszólagos molekulatömegének csekély eltolódása DTT jelenlétében feltehetően az intramolekuláris diszulfidhidak töredezése következtében fellépő kibomlásnak tulajdonítható, ami az SDS erősebb kötődéséhez vezet összehasonlítva azzal az esettel, amikor DTT távollétében ugyanazokat a fehérjéket SDS denaturálja. Ugyanúgy, mint a 2. ábrán, a csekély molekulatömegű jelző- (marker) fehéijék (az ábrán LMW jelöléssel) is megjelennek a géleken.
A szekvenciák
Az 1. számú szekvencia (SEQ ID No 1) egy PCR által képzett cDNS-szekvencia, amely az AX1 fehérjét annak szignálpeptidjével együtt kódolja. A szignálpeptid indító (start)-kodonját a 40-42 helyű nukleotidok alkotják; az AX1 fehérje befejező (stop)-kodonja a 262-264 helyeken látható.
HU218 110Β
A 2. számú szekvencia mutatja az AX1 fehéije aminosavszekvenciáját szignálpeptidjével együtt. A szignálpeptid az 1-28 aminosavmaradékokból áll, az érett fehérje a 29-74 maradékokból épül fel.
A 3. számú szekvencia PCR által képezett cDNSszekvenciát mutat be, amely magában foglalja az 1. számú szekvenciát azzal az eltéréssel, hogy a transzlációt fokozó fragmentum (mely a 13-79 nukleotidokból áll) a szignálpeptidhez képest a startkodon előtt helyezkedik el (82-84 helyű nukleotidok). A szekvencia az 1-6 helyű nukleotidoknál Pstl restrikciós helyet, valamint a 7-12 helyű nukleotidoknál BamHl hasítóhelyet tartalmaz. A 80-86 helyű nukleotidok Ncol helyet alkotnak. Az AX1 fehérje vonatkozásában a stopkodon a 304-306 helyű nukleotidoknál helyezkedik el. A 338-343 helyű, illetve a 344-349 helyű nukleotidok Sáli, illetve Sphl restrikciós helyeket képviselnek.
A 4. számú szekvencia PCR által képzett cDNSszekvenciát ábrázol, amely az AX2 fehérjét szignálpeptidjével együtt kódolja. A szignálpeptid startkodonja az 53-55 helyű nukleotidoknál, az AX2 fehérje stopkodonja a 275-277 helyeken található.
Az 5. számú szekvencia az AX2 fehérje szekvenciáját ábrázolja szignálpeptidjével együtt. A szignálpeptid az 1-28 helyű maradékokból áll, míg az érett fehérje a 29-74 helyű maradékokat tartalmazza.
A 6. számú frekvencia egy PCR által kialakított cDNS-szekvenciát ábrázol, amely magában foglalja a 4. számú szekvenciát azzal az eltéréssel, hogy a transzlációt erősítő fragmentum (amely a 13-79 helyű nukleotidokból épül fel) a 82-84 helyű nukleotidokból álló startkodon előtt helyezkedik el a szignálpeptidhez képest. A szekvencia az 1-6 helyű nukleotidoknál Pstl restrikciós helyet, a 7 -12 helyű nukleotidoknál BamHl hasítási helyet képvisel. A 80-86 helyű nukleotidok Ncol helyet alkotnak. Az AX2 fehérje esetében a stopkodon a 304-306 helyű nukleotidoknál található. A 352-357 helyű, illetve 358-363 helyű nukleotidok Sáli, illetve Sphl restrikciós helyet alkotnak.
A 7. számú szekvencia PCR által kialakított cDNSszekvenciát ábrázol, mely az AX3.1 fehérjét vélt szignálpeptidjével együtt kódolja. A szignálpeptid startkodonja a 23-25 helyű nukleotidoknál, az AX3.1 fehérje stopkodonja a 356-358 helyű nukleotidoknál van.
A 8. számú szekvencia a 7, számú cDNS által kódolt, fel nem dolgozott transzlációs termékének aminosavszekvenciáját mutatja. Ez a feltételezett előfehérje magában foglalja az érett AX3.1 fehérjét a 80-111 helyű maradékokban.
A 9. számú szekvencia PCR által kialakított cDNSszekvenciát ábrázol, amely magában foglalja a 7. számú szekvenciát azzal az eltéréssel, hogy egy transzlációerősítő fragmentum (amely a 13-79 helyű nukleotidokból áll) helyezkedik el a startkodon (82-84 helyű nukleotidok) előtt a szignálpeptid vonatkozásában. A szekvencia az 1-6 helyű nukleotidoknál Pstl restrikciós helyet, a 7-12 helyű nukleotidoknál BamHl hasítási helyet tartalmaz. A 80-86 helyű nukleotidok Ncol helyet alkotnak. Az AX3.1 fehérje esetében a stopkodon a 415-417 helyű nukleotidoknál foglal helyet.
A 473-478, illetve 479-484 helyű nukleotidoknál Sáli, illetve Sphl restrikciós helyek találhatók.
A 10. számú szekvencia az árpa WIN fehérjéjét kódoló gént tartalmazó cDNS-t ábrázolja.
All. számú szekvencia az árpa WIN fehérjéjének aminosavszekvenciáját ábrázolja szignálpeptidjével együtt. A szignálpeptid az 1-21 helyű maradékokból áll; az érett fehérje a 22-146 helyű maradékokat tartalmazza.
A 12. számú szekvencia PCR által kialakított nukleotidszekvenciát ábrázol, amely az árpa WIN fehérjéjét kódolja. A szekvencia 5’-tartománya magában foglalja a Pstl, BamHl és Ncol restrikciós helyeket. Az eredeti kiónban a 62. helyen inkább C volt jelen, mint a jelenleg feltüntetett G. A C-ről G-re változás a fehérje aminosavszekvenciáját nem módosítja, és azért alakítottuk ki, hogy ezen a helyen egy Ncol helyet megszüntessünk. A WIN fehéije vonatkozásában a startkodon a 12-14 helyű nukleotidoknál, a stopkodon a 450-452 helyű nukleotidoknál helyezkedik el.
A 13. számú szekvencia lényegében a 12. számú szekvenciában megadott nukleotidszekvenciát mutatja azzal a kivétellel, hogy egy transzlációerősítő fragmentum (amely a 13. számú szekvenciában bemutatott, 13-79 helyű nukleotidokból áll) a WIN gén startkodonja előtt (82-84 helyű nukleotidok) helyezkedik el. A stopkodon az 520-522 helyű nukleotidoknál található.
A Cercospora beticolával fertőzött cukorrépalevelekből származó AX1, AX2, és AX3 fehérjék tisztítása
Természetes úton C. beticolával fertőzött Turbo vagy Rhizor fajtájú cukorrépa levélanyagából az AX1, AX2 és AX3 fehérjéket izoláljuk. Az 50 vagy több nekrotikus sérülést hordozó leveleket Olaszországban szabad földön válogattuk, és az extrakció időpontjáig 4 CC hőmérsékleten tartottuk. Az összes lépéseket 4 °C hőmérsékleten hajtottuk végre. A centrifúgálást 20 percig 20 OOOxg-n Centrikon H-401B típusú centrifugán végeztük.
Sejtmentes kivonatok előállítása kg C. beticolával fertőzött cukorrépalevelet 4 liter 5,0 pH-jú, 1 mM DTT-t, 1 mM benzamidint (pufferoldat indításkor) és 200 g Dowex 1x2-t (100 pm szitaméretes) tartalmazó nátrium-citrát-pufferoldatban homogenizálunk. A homogenizátumot centrifugálás előtt kettős rétegű, 31 pm szitaméretű nejlonszövedéken préseljük át.
Lecsapás hő és ammónium-szulfát hatásával
A centrifugálás után kapott felülúszó-frakciót 20 percig 50 °C-on melegítjük, utána 4 °C -ra hűtjük, majd a csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és eltávolítjuk. A felülúszóhoz addig adunk ammóniumszulfátot, amíg 90%-os telítettséget el nem érünk. Centrifugálás után a kicsapódott fehérjéket a kiinduláskor használt pufferoldatban oldjuk; 10 g kiinduló anyagra 1 ml pufferoldatot alkalmazunk.
Az AX1, AX2 és AX3 fehérjéket az ammóniumszulfáttal kicsapott fehérjefrakció tisztításával nyerjük. Oldás után a fehéqeoldatot 1 mM DTT-t és 1 mM benzamidint tartalmazó 10 mM Tris-oldattal (pH 8,0)
HU218 110 Β szemben dializáljuk. A denaturált fehérjéket centrifugálással eltávolítjuk, a felülúszót gyors áramlást biztosító 50 ml Sepharose Q oszlopra visszük, továbbá kitinoszlopon vezetjük át (amelyet a WO 92/17591 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés leírása szerint készítünk); az oszlopokat sorba kapcsoljuk. Az oszlopokat a tisztítandó keverék felvitele előtt Tris-pufferoldattal egyensúlyozzuk.
A nem kötődő fehérjéket Tris-pufferoldattal végzett kimerítő mosással eltávolítjuk. A nem kötődő fehérjék frakcióját (1 kg extrahált levélanyagra vonatkoztatva 200 ml) a H pufferoldat tartalmának megfelelően kiegészítjük; a H pufferoldat komponensei: 1 M ammóniumszulfát, 10 térfogat% glicerin, 1 mM DTT, 0,1 M KH2PO4 (pH=7,5). A fehérjeoldatot 50 ml Phenyl Sepharose-zal (beszerezhető a Pharmacia cégtől) a H pufferoldatban 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A szuszpenziót 50 ml Phenyl Sepharose-zal töltött H pufferoldattal egyensúlyozott oszlop tetejére visszük. Az oszlopról távozó folyadéknak gombaellenes hatása van, míg megfigyelésünk szerint - az oszlopról H pufferoldattal, ammónium-szulfát nélkül eluált fehérjék gombaellenes hatást nem mutatnak. Valamennyi tisztítási lépést 4 °C hőmérsékleten végzünk, kivéve a Phenyl Sepharose-zal végrehajtott lépéseket.
A Phenyl Sepharose oszlopon átáramló, 400 ml térfogatú folyadékot 20 mM nátrium-acetátot és 1 mM DTT-t tartalmazó pufferoldattal (pH = 5,0) szemben kimerítően dializáljuk, majd CM-CL-6B Sepharose (beszerezhető a Pharmacia cégtől) töltetű oszlopra visszük. A kimosást I pufferoldattal végezzük, amelynek összetétele: 50 mM nátrium-acetát, 10 térfogat% glicerin, 1 mM DTT (pH = 5,0); az utolsó eluálást 0,25 M konyhasót tartalmazó I pufferoldattal végezzük. A fehérjét tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és az egyesített frakciók felét G-75 Sephadex oszlopon (beszerezhető a Pharmacia cégtől, mérete 2,5 χ 70 cm) gélszűrő kromatográfiának vetjük alá. Az oszlopot 50 mM MES-vel (pH=6,0) hozzuk egyensúlyba. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk; a 26-30. frakciók erős gombaellenes hatást mutatnak, ezeket 5 tömeg/térfogat% betaintartalomra egészítjük ki.
A G-75 Sephadex oszlopról származó 26-30. frakciókat Mono S kationcserélő oszlopon (H/R 5/5; Pharmacia) ioncserélő FPLC kromatográfiának vetjük alá. Az oszlopot A pufferoldattal hozzuk egyensúlyba, melynek összetétele: 50 mM MES (6,0 pH-jú), 5 tömeg/térfogat% betaint tartalmazó MES-oldat. A megkötött fehérjéket 15 ml, 0-0,3 M nátrium-kloridot tartalmazó A pufferoldattal gradienselúcióval kimossuk. Három erős fehérjecsúcsnak megfelelő frakciót eluálunk, ezek mindegyike gombaellenes hatást mutat (1. ábra). Ezeket a csúcsokat AX1, AX2, illetve AX3 csúcsokként jelöltük.
Árpából származó WINfehérjék tisztítása
A WIN fehérjét (WIN N) árpamagból vagy feszített árpalevélből származó termék tisztításával Kragh és munkatársai módszerével kaptuk [Plánt Sci. 71, 65-68 (1990); valamint Hejgaard és munkatársai: Febs Letters 307, 389-392 (1992)].
A 2. ábra mutatja az árpamagból izolált WIN N fehérjét ezüsttel megfestett SDS-poliakrilamidgélen a Mono S oszlopról eluált AX1, AX2 és AX3 fehérjékkel együtt. Az AX fehérjék mindegyike elektroforézis során egyetlen sávval jelentkező frakcióként eluálható (még akkor is, ha - az AX3 esetében - enyhén el van kenve).
Az AXfehérjék szekvenálása
Minden egyes AX fehérjét karboxi-metilezzük, majd fordított fázisú HPLC-vizsgálatnak vetjük alá Progel TSK Octadecyl-4PW oszlopon (beszerzési helye a Supelco Inc. cég; mérete 150x4,6 mm). Oldószerrendszerek: „A”rendszer: 0,1% TFA vízben; „B” rendszer: 0,1% TFA acetonitrilben. Az AX1 és az AX2 fehérjék egyetlen szimmetrikus csúcs alakjában eluálhatók, az AX3 eluálása során két csúcs jelentkezik, az erősebb csúcsot szorosan követi a kisebbik csúcs, ami azt mutatja, hogy az AX3 fehérje két formában jelenik meg, ezeket AX3.1-nek és AX3.2-nek neveztük el. Ezt követően az AX1, AX2 és AX3 fehérjéket a szakmai gyakorlattal rendelkező egyén számára jól ismert, standard módszerekkel szekvenáltuk.
AzAXl, AX2 és AX3 fehérjék antimikrobiális hatása
A gombák szaporodásának gátlását 96 üreges mikrotitrálólemezeken, 620 nm hullámhosszon mért abszorpcióval határoztuk meg lényegében a fentebb idézett WO 92/17591 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés leírása szerint.
Az AX1, AX2 és AX3 fehérjéket - önmagukban vagy WIN N fehérjével kombinálva [amelyet árpamagból származó vagy feszített árpalevélből származó termek tisztításával kaptuk Hejgaard és munkatársai módszerével [FEBS Letters 307, 389-392 (1992)]} - C. beticola spóráival inkubáltunk. A mérőelegy 240 vagy 260 μΐ térfogatban 100 μΐ burgonya-dextróz-levest (Difco), 40 vagy 60 μΐ fehérjemintát (vagy kontrollként alkalmazott pufferoldatot), körülbelül 400 spórát, valamint 100 mM Trist és 20 mM konyhasót tartalmazóit 100 μΐ vízzel készült oldatban (pH = 8,0). A mikrotitrálólemezeket szalaggal zártuk a párolgástól és szennyezéstől való védelem céljából, majd szobahőmérsékleten 200 percenkénti fordulatszámmal keverve inkubáltuk. Amint a 3B. ábrán látható, az abszorbanciát 620 nm hullámhosszon 8 napon át naponta mértük, és a fehérjekoncentrációt az eltelt idő függvényében ábrázoltuk. I50-értéknek tekintettük azt a koncentrációt (pg fehérje/végső mérőelegy ml), amely 72 óra eltelte után a szaporodást 50%-ban gátolta.
Amint a 3A. és 3B. ábrákon látható, mindegyik AX fehérje jelentősen gátolja a C. beticola szaporodását in vitro körülmények között. Különösen kifejezett az AX2 gombaellenes hatása, mert 2 pg/ml koncentrációja (ami megfelel körülbelül 0,5 μΜ koncentrációnak) elegendő a szaporodás 50%-os gátlásához (I50-érték) 72 órás inkubálás után. A WIN N fehérje önmagában csak mérsékelt gombaellenes hatást mutat: a C. beticola 50%-os gátlásához 72 óra után (ezek az adatok nincsenek feltüntetve) 160 pg/ml (körülbelül μΜ) koncentráció szükséges. Az AX2 és WIN N kombinációja a gombák szaporodását jóval erősebben és tartósabban
HU218 110 Β gátolja: amint a 3A. ábrából kitűnik, az AX2 szaporodásgátló hatása C. beticolán erősebb, mint az AX1 fehérjéé.
Úgy látszik, hogy az AX2 és WIN N C. beticolával szemben nem fejtenek ki fungicid hatást, hanem inkább lényegesen lassítják a gomba hypha-állományának kiterjedését a kontrollokhoz képest. Amint a 4. ábrán látható, az AX2 és/vagy WIN N fehérjékkel végzett kezelés következtében a gomba alaktani sajátságai lényegesen megváltoznak.
Ezenfelül az AX1, AX2 és AX3 (valamint keverékeik) - adott esetben WIN N jelenlétében - csekély, legfeljebb jelentéktelen káros hatást fejtenek ki a cukorrépa pollenjének csírázására, ha azokat olyan koncentrációkban alkalmazzuk, amelyek a C. beticola ellen hatásosak; ez mutatja, hogy növényi sejtekkel szemben nem toxikusak.
Az AXfehérjék gombaellenes hatása a kukorica kórokozóira
A találmány szerinti AX fehérjék gombaellenes hatását a kukorica számos kórokozójával szemben kiértékeltük. Az 1. és 2. táblázatokban bemutatott eredményeket az AX fehérjék kukorica-kórokozókra kifejtett hatásának következő mérési módszerével kaptuk. 5 μΐ, a fehérjéket a feltüntetett koncentrációkban tartalmazó oldatot aszeptikus körülmények között steril, kerek aljú mikrotitrálólemez üregébe adagoltunk. (Valamennyi kezelést egyszeres ismétléssel végeztük.) Rutinszerű kontrollt alkalmaztunk egyrészt nem oltott tenyésztőközeggel, másrészt nem oltott, a vizsgálandó fehérjeoldatot nem tartalmazó tenyésztőközeggel. Minden egyes mintához 5,0 μ 1,100-150 spórát tartalmazó, kétszeres erősségű burgonya-dextróz-levest („Potato Dextrose Broth”, PDB) adagoltunk aszeptikus körülmények között.
A fehérjemintát a spóraszuszpenzióval enyhén átkevertük, majd a lemez és fedele érintkezési helyén kettős rétegű parafilmmel vontuk be a beszáradás minimálissá tételére, és az így burkolt mikrotitrálólemezt 19 ±0,2 °C hőmérsékleten 16 órás megvilágítási időszakkal inkubáltuk.
Az egyes üregeket 24 óránként pontoztuk egyrészt a spórák csírázása, másrészt a micélium növekedése szerint. A 120. óra végén meghatároztuk a gombaellenes hatás mértékét; erre vonatkozó eredményeinket az 1. és a 2. táblázatban foglaltuk össze. Az 1. táblázat tünteti fel a fehéqének azt a minimális koncentrációját, amely a gombák szaporodását gátló hatáshoz szükséges; a 2. táblázat mutatja a fehérjének a szaporodást 50%-ban gátló koncentrációját olyan kontrolltenyészetekkel összehasonlítva, ahol a gombát a vizsgált fehérjéket nem tartalmazó közegekben növesztettük.
1. táblázat
Az AX1, AX2 és WIN N fehérjék gombaellenes hatása kiválasztott kukorica-kórokozókra
Minimális gátló koncentráció (pg/ml)
Kórokozó/betegség WINN AX1 AX2
Bioplaris maydis (déli kukoricalevél-penész) n. g. 20 20
Cercospora zeae maydis (szürke levélfoltosodás)
Colletotrichum graminicola n. g. 50 50
Diplodia maydis (szár- és csőrothasztó diplodia) 64 11 n. g.
Exserohilum turcicum race 1 (északi kukoricalevél-penész 1. fajtája) n. g. 11 98
Exserohilum turcicum race 2 (északi kukoricalevél-penész 2. fajtája) 193 33 n. g.
Fusarium graminearum (szár- és kalászrothasztó fusarium) n. g. 33 33
Fusarium moniliforme (szár- és kalászrothasztó fusarium) n. g. n. g. n. g.
Gibberella zeae (szár- és csőrothasztó gibberella) n. g. n. g. n. g.
Megjegyzés: „n. g.” azt jelenti, hogy a fehérje a gomba szaporodását nem gátolta
A 3. táblázatban bemutatott eredményeket az AX és WIN N fehérjék feltüntetett kórokozókkal szemben mutatott hatásának alábbi kiértékelésével kaptuk. A gombából származó micéliumot egy csepp megömlesztett agarban diszpergáltuk, majd megszilárdulni hagytuk. Ezt követően a megszilárdult, a micéliumot mintegy betokoló agarcseppeket a feltüntetett mennyiségű vizs60 gálandó fehérjével vontuk be. Öt napig tartó, nedves kö6
HU 218 110B rülmények között végzett inkubálás után meghatároztuk a micélium növekedését a kontrollokhoz képest, amely utóbbiakban a gomba micéliumát tartalmazó agarcseppeket nem vontuk be vizsgálandó fehérjével. A 3. táblázatban látható eredmények a fehérjéknek azt a mennyiségét tüntetik fel, amely a kórokozó gombák szaporodásának 50%-os gátlásához szükséges.
A 3A., 3B. és 4A-D. ábrákból, valamint az 1-3. táblázatokból világosan kitűnik, hogy az AX1, AX2 és
AX3 fehérjék - adott esetben WIN N fehérjével kombinálva - füngisztatikus hatást fejtenek ki. Ennek következtében képesek növények - különösen a cukorrépa és a kukorica - számára nagymértékben javított rezisz5 tenciát biztosítani növényi betegségekkel (különösen gombás fertőzésekkel), például a C. beticola és számos más kukorica-kórokozó által előidézett betegségekkel szemben.
2. táblázat
h.7. 1. táblázatban feltüntetett gombakórokozók szaporodásának 50%-os gátlásához szükséges fehérjemennyiség
Kórokozó/betegség AX1 AX2 WINN
(az 50%-osnál nagyobb szaporodásgátló hatású fehérjekoncentráció pg/ml-bcn)
Colletotrichum graminicola 50 50 n. g.
Fusarium moniliforme n. g. n. g. n. g.
F. graminearum (kalász- és szárrothasztó fusarium) 33 33 n. g.
Gibberella zeae (szárrothasztó gibberella) n. g. n. g. n. g.
Diplodia maydis (szárrothasztó diplodia) 11 n. g. 64
Bipoláris maydis (déli kukoricalevél-penész) 20 33 n. g.
Exserohilum turcicum (északi kukoricalevél-penész) 33 n. g. 193
Megjegyzés: „n. g.” azt jelenti, hogy a fehcijc a gomba szaporodását nem gátolta.
3. táblázat
A gombák szaporodásának százalékos gátlása meghatározott fehérjekoncentráció jelenlétében, további kórokozókon
Kórokozó/betegscg Fchérjckoncentráció (pg/ml)
AX1 AX2 WINN
20 20 40 20 40
A szaporodás gátlása (%)
Monilinia fructigena (bamulásos gyümölcsrothadás) 80 80 n. g.
Cochliobolus sativus (gabona szárrothadása) 30 30 n. g.
Gabonacsíra rothadása
Pseudocercosporella herpotrichoides 30 30 30
Pyricularia oryzae n. g. 20 n. g.
Rhizoctonia solani n. g. 10 n. g.
Fusarium culmorum n. g. 10 n. g.
Leptosphaeria nodorum n. g. 10 n. g.
Botrytis cinerea n. g. 10 n. g.
Megjegyzés: „n. g.” azt jelenti, hogy a vizsgált koncentrációkban a fehcijc a gomba szaporodását nem gátolta.
HU218 110 Β
A fehérjeszekvenciák
A szekvencialista (SEQ ID) 2., 5., illetve 8. számú szekvenciái mutatják az AX1, AX2, illetve AX3.1 fehérjék aminosavszekvenciáját. E szekvenciák a megfelelő szignálpeptideket is tartalmazzák. Az AX1 és AX2 5 esetében a szignálpeptidek az 1-28 helyű maradékokból állnak, és az érett fehéqék a 29-74 helyű maradékokból állnak. Az AX3.1 esetében a vélhető előfehérje az érett AX3.1 fehéqe 80-111 helyű maradékait tartalmazza. All. számú szekvencia az árpából származó WIN fehérjének az aminoszekvenciáját szemlélteti annak szignálpeptidjével együtt.
Az aminosavszekvenciából világosan kitűnik, hogy az AX1, és AX2 rokon fehérjék, melyek mindegyike 46 aminosavat tartalmaz.
A szekvencialista 2. számú szekvenciája mutatja az AX1 fehérje felépítését szignálpeptidje nélkül:
Alá Ile Cys Lys Lys Pro Ser Lys Phe Phe Lys Gly Alá
Cys Gly Arg Asp Alá Asp Cys Glu Lys Alá Cys Asp Gin Glu Asn Trp Pro Gly Gly Val cys Val Pro Phe Leu Arg Cys Glu Cys Gin Arg Ser Cys
A szekvencialista 5. számú szekvenciája mutatja az AX2 fehérje felépítését szignálpeptidje nélkül:
Alá Thr Cys Arg Lys Pro Ser Met Tyr Phe Ser Gly Alá
Cys Phe Ser Asp Thr Asn Cys Gin Lys Alá Cys Asn Arg
Glu Asp Trp Pro Asn Gly Lys Cys Leu Val Gly Phe Lys
Cys Glu Cys Gin Arg Pro Cys
A szekvenciahsta 8. számú szekvenciája mutatja az AX3.1 fehérje felépítését szignálpeptidje nélkül:
Arg Cys Ile Pro Cys Gly
Asn Cys Cys Ser Pro Cys
Val Pro Arg Cys Thr Asn
Gln Asp Cys Ile Ser Ser Arg Lys Cys Asn Phe Gly Pro Pro
Az egyes fehérjék N-terminálisából származó első 45 maradékot aminosavszekvenálással kaptuk. Az AX1 és AX2 46. maradékát ciszteinnel azonosítottuk a PCR útján kapott megfelelő cDNS-ek (1., illetve 4. számú szekvenciák) nukleotidszekvenciájának az alapján, egybevetve más növényekből származó, rokon fehérjék homológiájával. Az AX3.1 bázisos fehérje, 32 aminosavat tartalmaz, amelyek szekvenciája a PCR útján kapott cDNS-ével összhangban áll (lásd a 7. számú szekvenciát).
Az AX fehérjék aminosavszekvenciájára vonatkozó adatokat a megfelelő fehérjék aminosav-összetételének elemzésével (lásd a 4. táblázatot), valamint a tiszta fehérjék tömegszínképi adataival is megerősítettük; az utóbbi színképi adatokat a fehérjéket kódoló génekből levezetett molekulatömegeikkel vetettük össze (lásd az 5. táblázatot). Különös módon az AX2 fehérje (valószínűleg a benne jelen lévő metionmaradék következtében) a tömegspektrometriás elemzés alapján oxidált állapotúnak látszik. Ez az oxidációs állapot azonban a tömegspektrometriás elemzés műterméke is lehet.
Az AX1 és AX2 fehérjék szekvenciája bizonyos mértékű hasonlóságot mutat a búzából és árpából származó gamma-tioninokkal, amelyek a rovarok alfa-amináz enzimének ciroknövényből eredő, valószínűleg gátló anyagai, valamint a retekmagvakból izolált gombaellenes fehérjékkel. Ismert, hogy a retek fehérjéi hatásos gombaellenes anyagok, és valószínűnek tartják, hogy a gombák szaporodását a kalciumion szignálszerepének gátlásával akadályozzák. Ezzel szemben az AX1 és AX2 szekvenciája a retek fehérjéinek szekvenciájához csak kevéssé hasonlít. Ezenfelül a retekfehérjék főként oligomer (trimer vagy tetramer) alakban vannak, míg a gél szűrés és az SDS-vei, DTT vagy merkapto-etanol nélkül végzett elektroforézis arra utal, hogy az AX1 és AX2 fehérjék monomerek (lásd például az 5. ábrát). Az AX3.1 és más fehérjék között lényegesebb szekvenciahomológra nem áll fenn.
5Q 4. táblázat
Az AX fehéqék aminosav-összetétele
Aminosavmaradék AX1 AX2 AX3
Asp 4,0 5,0 4,1
Thr 0,1 2,0 1,0
Ser 2,1 3,1 3,0
Glx 5,7 4,4 1,1
Pro 3,2 3,2 5,1
HU218 110Β
4. táblázat (folytatás)
Aminosavmaradék AX1 AX2 AX3
Gly 4,3 3,2 2,1
Alá 4,1 3,1 0,0
Cys 6,9 6,9 6,2
Val 2,0 1,1 1,0
Met 0,0 0,9 0,0
lle 1,0 0,1 2,0
Leu 1,1 1,1 0,0
Tyr 0,0 0,9 0,0
Phe 3,1 3,0 1,0
His 0,0 0,0 0,0
Lys 5,1 4,0 1,0
Arg 3,2 3,1 3,2
Trp n. h. n. h. n. h.
Megjegyzés: „n. h.” azt jelenti, hogy nem határoztuk meg.
5. táblázat
Az AX1, AX2 és AX3.1 molekulatömege „Electro-Spray” tömegspektrometriás (ES-MS) és a fehérjéket kódoló génekből levezetett értékek alapján
Fehérje Molekulatömeg (dalton)
ES-MS cDNS-ből származó érték ( 8H +)
AX1 5078,1 5086-8=5078
AX2 5193,4 5185-8+16=5193
AX3.1 3452,5 3460-8=3452
Transzformált növények kialakítása
Az AX fehérjéket kódoló géneket növényekbe építjük be. A génspeficikus primerek alapján az AX1, AX2 és AX3.1 fehérjéket kódoló gének kódolásért felelős régióit a megfelelő mRNS-ből PCR, nevezetesen 3’ RACE és ezt követő 5’ RACE alkalmazásával szintetizáljuk. Megfelelő promoter- (például 35S) és terminátor- (például 35S) szekvencia hozzáadása után az AX fehérjéket kódoló géneket növénytranszformáló vektorba építjük. Előnyösen úgy járunk el, hogy egy transzlációt fokozó szekvenciát vezetünk be a vektorba a fehérjét kódoló szakasz 5’-helyén (lásd például a 3., 6. és 9. számú szekvenciákat). A vektor a területen jártas szakember számára ismert típusú, megfelelő jelző- (marker) géneket is tartalmaz. Adott esetben a vektor egy WIN fehérjét kódoló gént foglal magában, például olyat, amelyet feszített árpalevélből vagy árpamagból nyerünk (kívánt esetben egy transzlációt erősítő szekvenciával együtt, lásd például a 13. számú szekvenciát) és/vagy egy kitinázt és/vagy glukanázt kódoló gént is tartalmaz. Előnyös a WO 92/17591 számon közrebocsátott PCT/DK92/00108 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt kitináz-4. Ezekkel a vektorokkal például az Agrobacterium tumefaciens transzformálható.
Ezután a növényi sejteket transzformált Agrobacteriummal kezeljük, majd az így transzformált növényi sejteket teljes növényekké regeneráljuk, amelyekben az új maganyag stabilisán a genomba épült. Nyilvánvaló azonban, hogy egy AX fehérjét (vagy ilyen fehérjék kombinációját) és adott esetben egy WIN fehérjét és'vagy egy kitinázt és/vagy glukanázt (vagy ilyen fehérjék kombinációját) kódoló DNS növényi sejtekbe más, ismert módszerek - például mikrolövedékes pisztoly, elektroporáció, elektrotranszformáció vagy mikroinjekció - útján is bevezethető, és a transzformált növényi sejtek regenerálása a szakmai gyakorlattal rendelkező egyén számára ismert módszerekkel is végrehajtható, például szükséges vagy kívánt esetben a sejtek citokininekkel végzett kezelésével a regenerálódás gyakoriságának javítása céljából.
Ezen a módon az AX fehérjék szempontjából transzgén burgonyát és cukorrépát alakítunk ki. A rekombináns DNS-szekvenciákat - például a 3., 6. vagy 9. számú szekvenciát - ismert módon (például kotranszformáció útján) burgonyába vagy cukorrépába építjük. Nyilvánvaló, hogy az 1., 4. vagy 7. számú szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS alternatív módon alkalmazható, jóllehet ezekből hiányzik egy bevezetett, 5’-helyzetű transzlációt erősítő elem a különböző AX fehérje-szignálpeptidek kódolószakaszának startkodonjához. így például az AX2 fehérjét kódoló gén kifejezését úgy mutatjuk ki, hogy az AX2 gén transzkripciós termékét azonosítjuk. A fehérje jelenlétét a növényben továbbá immunkémiai úton mutatjuk ki olyan antitestek alkalmazásával, amelyek autentikus fehérjemintákkal szemben keletkeznek. A fehérjék immunogén jellegének növelésére azokat diftériatoxoid hordozóval kapcsolhatjuk, vagy nyulaknak történő befecskendezés előtt polilizinhez köthetjük.
A transzgén burgonyából vagy cukorrépából részben tisztított kivonatokat állítunk elő, és a fentebb leírt mikrotitráló méréssel értékeljük ki Cercospora növekvését gátló képességüket.
Az AX fehérje vonatkozásában transzgén növényekből kapott kivonatok igen hatásosan gátolják a gomba szaporodását, összehasonlítva a burgonya vagy cukorrépa nem transzgén kontrolijából kapott kivonatokkal.
A megfelelő mikroorganizmusok (tehát azok a mikroorganizmusok, amelyekben az AX fehérjék termelődése alapjában véve nem toxikus) egy AX fehérjét (vagy AX fehérjék kombinációját) kódoló gént (vagy géneket) tartalmazó vektorral úgy transzformálhatok, hogy a transzformált mikroorganizmusok e fehérjét termelni fogják. A mikroorganizmusok tartalmazhatnak olyan gént is, amely más fehérjéket - így all. számú szekvenciával ábrázolt WIN fehérjét és/vagy különböző kitinázokat és/vagy glukanázokat - kódol. Az egyéb fehérjék közül különösen előnyös a WO 92/17591 számon közrebocsátott, DK 92/00108 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett kitináz-4.
E mikroorganizmusok növényi kórokozók leküzdésére alkalmazhatók. így például a transzformált mikroorganizmusokat száríthatjuk és fertőzött növényekre vagy fertőzéssel veszélyezetetett növényekre permetezhetjük.
HU218 110Β
SZEKVENCIALISTA (vii) Az elsőbbségi bejelentés adatai:
(1) Általános tájékoztatás: (A) A bejelentés száma: 9303725.7
(i) Bejelentő: (B) A bejelentés napja: 93. 02. 24.
(A) Név: Sandoz A. G. (viii) A képviselő adatai:
(B) Utca: Lichtsrasse 35 5 (A) Név: DANUBIA Szabadalmi és Védjegy
(C) Város: Bázel Iroda Kft., Budapest
(D) Állam: BS (B) Telefon: 118-1111,266-5760
(E) Ország: Svájc (C) Telefax: 138-2304,266-5770
(F) Irányítószám: CH-4002 (D) Aktaszám: 78795-2703-PT
(G) Telefon: 061-324-2327 10 (2) Információk az 1. számú szekvenciához:
(H) Telefax: 061-324-7532 (i) Szekvenciajellemzők:
(I) Telex: 965-05055 (A) Hossz: 437 bázispár
(ii) A bejelentés címe: Antimikrobiális hatású fehér- (B) Típus: nukleinsav
jék, ilyen fehérjéket tartalmazó készítmények és (C) Szálszám: kétszálú
eljárás ezek előállítására 15 (D) Topológia: ismeretlen
(iii) Szekvenciák száma: 13 (ii) A molekula típusa : cDNS
(iv) Komputerrel olvasható forma: (iii) Hipotetikus: nem
(A) Hordozó típusa: hajlékony lemez (iv) Antiszensz: nem
(B) Komputer: IBM PC-vel összeegyeztethető (vi) Eredeti forrás:
(C) Operátorrendszer: PC-DOS/MS-DOS 20 (A) Organizmus: Béta vulgáris
(D) Szoftver: Patent In Release # 1.0, (ix) Jellemző:
(vi) A jelen bejelentés adatai: (A) Név/kulcs: CDS
(A) A bejelentés száma: P 94 00526 (B) Elhelyezkedés: 40...264
(B) A bejelentés napja: 94. 02. 23. (xi) Szekvencia leírása: 1. számú szekvencia:
ATACGCATTT GTTTCAAAGT TCAAACAAAG ACCAAAAAA ATG GAG AAG AAA TTC 54
Met Glu Lys Lys Phe
5
TTT GGG CTT TTG CTT TTG CTA CTC TTC GTA TTT GCT TCT GAG ATG AAT 102
Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe Alá Ser Glu Met Asn
10 15 20
ATT GTG ACT AAG GTT GAT GGT GCA ATA TGC AAG AAA CCA AGT AAG TTC 150
Ile Val Thr Lys Val Asp Gly Alá Ile Cys Lys Lys Pro Ser Lys Phe
25 30 35
TTC AAA GGT GCT TGC GGT AGA GAT GCC GAT TGT GAG AAG GCT TGT GAT 198
Phe Lys Gly Alá Cys Gly Arg Asp Alá Asp Cys Glu Lys Alá Cys Asp
40 45 50
CAA GAG AAT TGG CCT GGC GGA GTT TGT GTA ccc TTT CTC AGA TGT GAA 246
Gin Glu Asn Trp Pro Gly Gly Val Cys Val Pro Phe Leu Arg Cys Glu
55 60 65
TGT CAG AGG TCT TGC TAAGCACTGC AAGCCACGGA CGATAAAAAG AAGTACTTGT 301
Cys Gin Arg Ser Cys
75
AATGAAGCTA TGGGTCAATA TTTTTCAATC CTATAATATT AAATAAATTG TTGTAACTAT 361
TTTAAGTGTG TAATAAATCT ACGTGGGTTT AAACTCCACA ATTGCTTTTG AAATAATGAT 421
TTACATATAA GTTTCA 437
Információk a 2. számú szekvenciához: (D) Topológia: lineáris (i) Szekvenciáiellemzők: (ii) A molekula típusa: fehérje (A) Hossz: 74 aminosav (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia:
(B) Típus: aminosav
Met 1 Glu Lys Lys Phe 5 Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe
10 15
Alá Ser Glu Met Asn Ile Val Thr Lys Val Asp Gly Alá Ile Cys Lys
20 25 30
HU218 110 Β
Lys Pro Ser 35 Lys Phe Phe
Glu Lys 50 Alá Cys Asp Gin
Phe 65 Leu Arg Cys Glu Cys 70
Információk a 3. számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 349 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: kétszálú (D) Topológia: ismeretlen
Lys Gly Alá 40
Glu Asn Trp 55
Gin Arg Ser
Cys Gly Arg Asp Alá Asp Cys 45
Pro Gly Gly Val Cys Val Pro 60
Cys (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:
(A) Organizmus: Béta vulgáris (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia
CTGCAGGGAT CCTATTTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA 60
ATTACTATTT ACAATTACAC CATGGAGAAG AAATTCTTTG GGCTTTTGCT TTTGCTACTC 120
TTCGTATTTG CTTCTGAGAT GAATATTGTG ACTAAGGTTG ATGGTGCAAT ATGCAAGAAA 180
CCAAGTAAGT TCTTCAAAGG TGCTTGCGGT AGAGATGCCG ATTGTGAGAA GGCTTGTGAT 240
CAAGAGAATT GGCCTGGCGG AGTTTGTGTA CCCTTTCTCA GATGTGAATG TCAGAGGTCT 300
TGCTAAGCAC TGCAAGCCAC GGACGATAAA AAGAAGCGTC GACGCATGC 349
Információk a 4. számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 492 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: kétszálú (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:
(A) Organizmus: Béta vulgáris (ix) Jellemző:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 53...277 (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia
CCATACATTA TATACGTATT TGTTTCAAAG TTCAAACAAA GACAAAACAA AA ATG 55
Met
GAG Glu AAA AAA TTC TTT GGG CTT TTG CTT TTG CTA CTC TTC GTA TTT GCT 103
Lys Lys Phe Phe 5 Gly Leu Leu Leu 10 Leu Leu Leu Phe Val 15 Phe Alá
TCT GAG CTG AAC ATG GTG GCT GAG GTT CAA GGT GCC ACT TGT AGA AAA 151
Ser Glu Leu Asn Met Val Alá Glu Val Gin Gly Alá Thr Cys Arg Lys
20 25 30
CCA AGT ATG TAT TTC AGC GGC GCT TGC TTT TCT GAT ACG AAT TGT CAG 199
Pro Ser Met Tyr Phe Ser Gly Alá Cys Phe Ser Asp Thr Asn Cys Gin
35 40 45
AAA GCT TGT AAT CGA GAG GAT TGG CCT AAT GGG AAA TGC TTA GTC GGT 247
Lys Alá Cys Asn Arg Glu Asp Trp Pro Asn Gly Lys Cys Leu Val Gly
50 55 60 65
TTC AAA TGT GAA TGT CAA AGG CCT TGT TAAGTGGTGC CTGTGTCCTC 294
Phe Lys Cys Glu Cys Gin Arg Pro Cys
70 75
AATTACGGCC
GTACATAGCA
TTGTGCTGTG
TACGAGCCTT
GTGGTAATAT
GTTTCCAGTT
TCAGGTACCT
GAATAAACGA
GCTTTTGAAA
ATGTGGCCGA
TTCACTCTTG
ATAATGATTT
GTATGGCTAA
TAAGATGTAT
TCATATAAAT
ATTGGTAATA
TATGTTTTGT
CGGACCTTTT
354
414
474
ATTCTGATAA AAAAAAAA
492
HU 218 110B
Információk az 5. számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 74 bázispár (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia
Met 1 Glu Lys Lys Phe 5 Phe Gly Leu
Alá Ser Glu Leu 20 Asn Met Val Alá
Lys Pro Ser 35 Met Tyr Phe Ser Gly 40
Gin Lys 50 Alá Cys Asn Arg Glu 55 Asp
Gly 65 Phe Lys Cys Glu Cys 70 Gin Arg
Leu Leu 10 Leu Leu Leu Phe Val 15 Phe
Glu 25 Val Gin Gly Alá Thr 30 Cys Arg
Alá Cys Phe Ser Asp 45 Thr Asn Cys
Trp Pro Asn Gly 60 Lys Cys Leu Val
Pro Cys
Információk a 6. számú szekvenciához: (i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 363 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: kétszálú (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Hipotetikus: nem 20 (iii) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:
(A) Organizmus: Béta vulgáris (xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia
CTGCAGGGAT CCTATTTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA 60
ATTACTATTT ACAATTACAC CATGGAGAAA AAATTCTTTG GGCTTTTGCT TTTGCTACTC 120
TTCGTATTTG CTTCTGAGCT GAACATGGTG GCTGAGGTTC AAGGTGCCAC TTGTAGAAAA 180
CCAAGTATGT ATTTCAGCGG CGCTTGCTTT TCTGATACGA ATTGTCAGAA AGCTTGTAAT 240
CGAGAGGATT GGCCTAATGG GAAATGCTTA GTCGGTTTCA AATGTGAATG TCAAAGGCCT 300
TGTTAAGTGG TGCCTGTGTC CTCAATTACG GCCTACGAGC CTTTCAGGTA CGTCGACGCA 360
TGC 363
Információk a 7. számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 596 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: kétszálú (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:
(A) Organizmus: Béta vulgáris (ix) Jellemző:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 23.. .358 (xi) A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia
ATTCAACCCA ATAGAAACAA TC ATG GCA AGG AAC TCA TTC AAC TTC CTC ATT 52
Mer Alá Arg Asn Ser Phe Asn Phe Leu Ile
10
ATC ATG GTC ATT TCA GCA CTG CTT TTG CTC CCT GGA TCA CGT GCA AGC 100
Ile Met Val Ile Ser 15 Alá Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Arg Alá Ser
20 25
TTT CAG GAA AAG ATA ACT ATG AAC ATA GAA GAT GGA CGC GAA AGC GGC 148
Phe Gin Glu Lys Ile Thr Met Asn Ile Glu Asp Gly Arg Glu Ser Gly
30 35 40
ATA GCA AAG GAA ATA GTT GAG GCA GAA GCA GAA GCA GAA GCA TTA TTA 196
Ile Alá Lys Glu Ile Val Glu Alá Glu Alá Glu Alá Glu Alá Leu Leu
45 50 55
CGC GTT GGT GAG CAA GCT ATG CTG GAA CAA GTA ATG ACA AGA GGC TTA 244
Arg Val Gly Glu Gin Alá Met Leu Glu Gin Val Met Thr Arg Gly Leu
60 65 70
HU218 110 Β
GCA GAT AAC CTT AAG AGG TGT ATA CCA TGT GGT CAA GAC TGC ATT TCC 292
Alá Asp Asn Leu Lys Arg Cys Ile Pro cys Gly Gin Asp cys Ile Ser
75 80 85 90
TCA AGA AAC TGT TGC TCA CCT TGC AAA TGC AAC TTC GGG CCA CCG GTT 340
Ser Arg Asn Cys Cys Ser Pro Cys Lys Cys Asn Phe Gly Pro Pro Val
100 105
CCA AGG TGT ACT AAT TGAATGCTTA GCTTGCTGCT TAGTGCTAAA TGCTAAGCGC 395
Pro Arg Cys Thr Asn
110
TACGCTTGCT AGTATGTGCA CGATCCGCTC TATCTCTTTA TATGCACCTA AGTCCTTTCA 455
TCTCGACTGT GTTGTTTGTG TGTAAAATAA AGTCTTGGTT TTCCAAGACT ACTAGTTTAG 515
TTACTGGCTT ATGTTTTTCG GAATCTTGAT ATATAAATAA GACAAGGAGA CCTATTTCTT 575
GCTTTGCTTA AAAAAAAAAA A 596
Információk a 8. számú szekvenciához: (i) Szekvenciajellemzők: (A) Hossz: 111 aminosav 20 (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 8. számú szekvencia
(B) Típus: aminosav
Met 1 Alá Arg Asn Ser 5 Phe Asn Phe Leu Ile 10 Ile Met Val Ile Ser 15 Alá
Leu Leu Leu Leu 20 Pro Gly Ser Arg Alá 25 Ser Phe Gin Glu Lys 30 Ile Thr
Met Asn Ile 35 Glu Asp Gly Arg Glu 40 Ser Gly Ile Alá Lys 45 Glu Ile Val
Glu Alá 50 Glu Alá Glu Alá Glu 55 Alá Leu Leu Arg Val 60 Gly Glu Gin Alá
Met 65 Leu Glu Gin Val Met 70 Thr Arg Gly Leu Alá 75 Asp Asn Leu Lys Arg 80
Cys Ile Pro Cys Gly 85 Gin Asp Cys Ile Ser 90 Ser Arg Asn Cys Cys 95 Ser
Pro Cys Lys Cys 100 Asn Phe Gly Pro Pro 105 Val Pro Arg Cys Thr 110 Asn
Információk a 9. számú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 484 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: kétszálú (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNs (iii) Hipotetikus: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:
(A) Organizmus: Béta vulgáris (xi) A szekvencia leírása: 9. számú szekvencia
CTGCAGGGAT CCTATTTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA 60
ATTACTATTT ACAATTACAC CATGGCAAGG AACTCATTCA ACTTCCTCAT TATCATGGTC 120
ATTTCAGCAC TGCTTTTGCT CCCTGGATCA CGTGCAAGCT TTCAGGAAAA GATAACTATG 180
AACATAGAAG ATGGACGCGA AAGCGGCATA GCAAAGGAAA TAGTTGAGGC AGAAGCAGAA 240
GCAGAAGCAT TATTACCCGT TGCTGAGCAA GCTATGCTGG AACAAGTAAT GACAAGAGGC 300
TTAGCAGATA ACCTTAAGAG GTCTA'i'ACt.'A TGTGGTCAAG ACTGCATTTC CTCAAGAAAC 360
TGTTGCTCAC CTTGCAAATG CAACTTCGGG CCACCGGTTC CAAGGTGTAC TAATTGAATG 420
CTTAGCTTGC TGCTTAGTGC TAAATGCTAA GCGCTACGCT TGCTAGTATG TGGTCGACGC 480
ATGC 484
HU 218 110B
Információk a 10. számú szekvenciához: (iii) Antiszensz: nem
(i) Szekvenciajellemzők: (vi) Eredeti forrás:
(A) Hossz: 504 bázispár (A) Organizmus: Hordeum vulgare
(B) Típus: nukleinsav (ix) Jellemző:
(C) Szálszám: kétszálú 5 (A) Név/kulcs: CDS
(D) Topológia : ismeretlen (B) Elhelyezkedés: 1.. .441
(ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 10. számú szekvencia
(iii) Hipotetikus: nem
ATG GCG GCA CGC CTG ATG CTG GTG GCG GCG CTG CTG TGC GCG GCG GCG 48
Met 1 Alá Alá Arg Leu 5 Met Leu Val Alá Alá 10 Leu Leu Cys Alá Alá 15 Alá
GCC ATG GCC ACG GCG CAG CAG GCG AAC AAC GTC CGG GCG ACG TAC CAC 96
Alá Met Alá Thr 20 Alá Gin Gin Alá Asn 25 Asn Val Arg Alá Thr 30 Tyr His
TAC TAC CGG CCG GCG CAG AAC AAC TGG GAC CTG GGC GCG CCC GCC GTG 144
Tyr Tyr Arg 35 Pro Alá Gin Asn Asn 40 Trp Asp Leu Gly Alá 45 Pro Alá Val
AGC GCC TAC TGC GCG ACC TGG GAC GCC AGC AAG CCG CTG TCG TGG CGG 192
Ser Alá 50 Tyr Cys Alá Thr Trp 55 Asp Alá Ser Lys Pro 60 Leu Ser Trp Arg
TCC AAG TAC GGC TGG ACG GCG TTC TGC GGC CCC GCC GGC CCC CGC GGG 240
Ser 65 Lys Tyr Gly Trp Thr 70 Alá Phe cys Gly Pro 75 Alá Gly Pro Arg Gly 80
CAG GCG GCC TGC GGC AAG TGC CTC CGG GTG ACC AAC CCG GCG ACG GGG 288
Gin Alá Alá Cys Gly 85 Lys Cys Leu Arg Val 90 Thr Asn Pro Alá Thr 95 Gly
GCG CAG ATC ACG GCG AGG ATC GTG GAC CAG TGC GCC AAC GGC GGG CTC 336
Alá Gin Ile Thr 100 Alá Arg Ile Val Asp 105 Gin Cys Alá Asn Gly 110 Gly Leu
GAC CTC GAC TGG GAC ACC GTC TTC ACC AAG ATC GAC ACC AAC GGG ATT 384
Asp Leu Asp 115 Trp Asp Thr Val Phe 120 Thr Lys Ile Asp Thr 125 Asn Gly Ile
GGG TAC CAG CAG GGC CAC CTC AAC GTC AAC TAC CAG TTC GTC GAC TGC 432
Gly Tyr 130 Gin Gin Gly His Leu 135 Asn Val Asn Tyr Gin 140 Phe Val Asp Cys
CGC GAC TAGATTGTCT GTGGATCCAA GGCTAGCTAA GAATAAAAGG CTAGCTAAGC 488
Arg Asp
145
TATGAGTGAG CAGCTG 504
Információk all. számú szekvenciához: (D) Topológia: lineáris (i) Szekvenciajellemzők: (ii) A molekula típusa: fehérje (A) Hossz : 146 aminosav (xi) A szekvencia leírása: 11. számú szekvencia (B) Típus: aminosav 45
Met Alá 1 Alá Arg Leu 5 Met Leu Val Alá Alá Leu Leu Cys Alá Alá Alá
10 15
Alá Met Alá Thr Alá Gin Gin Alá Asn Asn Val Arg Alá Thr Tyr His
20 25 30
Tyr Tyr Arg Pro Alá Gin Asn Asn Trp Asp Leu Gly Alá Pro Alá Val
35 40 45
Ser Alá Tyr Cys Alá Thr Trp Asp Alá Ser Lys Pro Leu Ser Trp Arg
50 55 60
Ser Lys Tyr Gly Trp Thr Alá Phe Cys Gly Pro Alá Gly Pro Arg Gly
65 70 75 80
Gin Alá Alá Cys Gly Lys Cys Leu Arg Val Thr Asn Pro Alá Thr Gly
85 90 95
HU 218 110B
Alá Gin Ile Thr Alá Arg Ile Val Asp Gin Cys Alá Asn Gly Gly Leu
100 105 110
Asp Leu Asp Trp Asp Thr Val Phe Thr Lys Ile Asp Thr Asn Gly Ile
115 120 125
Gly Tyr Gin Gin Gly His Leu Asn Val Asn Tyr Gin Phe Val Asp Cys
130 135 140
Arg Asp 145
Információk a 12. számú szekvenciához: (í) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 515 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: kétszálú (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:
c v 7 1 ° (A) Organizmus: Hordeum vulgare (xi) A szekvencia leírása: 12. számú szekvencia:
CTGCAGGATC CATGGCGGCA CGCCTGATGC TGGTGGCGGC GCTGCTGTGC GCGGCGGCGG 60
CGATGGCCAC GGCGCAGCAG GCGAACAACG TCCGGGCGAC GTACCACTAC TACCGGCCGG 120
CGCAGAACAA CTGGGACCTG GGCGCGCCCG CCGTGAGCGC CTACTGCGCG ACCTGGGACG ISO
CCAGCAAGCC GCTGTCGTGG CGGTCCAAGT ACGGCTGGAC GGCGTTCTGC GGCCCCGCCG 240
GCCCCCGCGG GCAGGCGGCC TGCGGCAAGT GCCTCCGGGT GACCAACCCG GCGACGGGGG 300
CGCAGATCAC GGCGAGGATC GTGGACCAGT GCGCCAACGG CGGGCTCGAC CTCGACTGGG 360
ACACCGTCTT CACCAAGATC GACACCAACG GGATTGGGTA CCAGCAGGGC CACCTCAACG 420
TCAACTACCA GTTCGTCGAC TGCCGCGACT AGATTGTCTG TGGATCCAAG GCTAGCTAAG 480
AATAAAAGGC TAGCTAAGCT ATGAGTGAGC AGCTG 515
Információk a 13. számú szekvenciához: (i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 585 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: kétszálú (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:
(A) Organizmus: Hordeum vulgare (xi) A szekvencia leírása: 13. számú szekvencia:
CTGCAGGGAT CCTATTTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA 60
ATTACTATTT ACAATTACAC CATGGCGGCA CGCCTGATGC TGGTGGCGGC GCTGCTGTGC 120
GCGGCGGCGG CGATGGCCAC GGCGCAGCAG GCGAACAACG TCCGGGCGAC GTACCACTAC 180
TACCGGCCGG CGCAGAACAA CTGGGACCTG GGCGCGCCCG CCGTGAGCGC CTACTGCGCG 240
ACCTGGGACG CCAGCAAGCC GCTGTCGTGG CGGTCCAAGT ACGGCTGGAC GGCGTTCTGC 300
GGCCCCGCCG GCCCCCGCGG GCAGGCGGCC TGCGGCAAGT GCCTCCGGGT GACCAACCCG 360
GCGACGGGGG CGCAGATCAC GGCGAGGATC GTGGACCAGT GCGCCAACGG CGGGCTCGAC 420
CTCGACTGGG ACACCGTCTT CACCAAGATC GACACCAACG GGATTGGGTA CCAGCAGGGC 480
CACCTCAACG TCAACTACCA GTTCGTCGAC TGCCGCGACT AGATTGTCTG TGGATCCAAG 540
GCTAGCTAAG AATAAAAGGC TAGCTAAGCT ATGAGTGAGC AGCTG 585

Claims (12)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. A 2., 5. vagy 8. számú szekvenciával ábrázolt tiszta fehérje, valamint ilyen fehéijék és analógjaik keverékei.
  2. 2. A 8. számú szekvencia 80-111 helyű, vagy a 2. vagy 5. számú szekvencia 29-74 helyű maradékaiból álló tiszta fehérje, valamint ilyen fehérjék és analógjaik keverékei.
  3. 3. Rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypontban leírt fehérjét kódoló szekvenciát tartalmaz.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az 1., 3., 4., 6., 7. vagy 9. számú nukleotidszekvenciát tartalmazza.
  5. 5. DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy a 3. vagy 4. igénypontok szerinti DNS-szekvenciával pontosan megszabott körülmények között hibridizál.
  6. 6. Vektor, azzal jellemezve, hogy a 3-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmazza.
  7. 7. Növények, különösen kukorica vagy cukorrépa, azzal jellemezve, hogy a 3-5. igénypontok bármelyikében leírt rekombináns DNS-sel transzformálunk.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti növények utódai és magvai, valamint ezen utódok magvai, azzal jellemezve, hogy az utódok a 3-5. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-t fejezik ki.
  9. 9. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 7. vagy 8. igénypontban leírt DNS-kifejeződésből származik.
  10. 10. Antimikrobiális hatású fehérjék, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS-nek a 7. vagy 8. igénypontban leírt növényekben végbemenő kifejeződése útján termelődik.
  11. 11. Antimikrobiális hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy vagy több, az 1., 2., valamint a 9. és a 10. igénypontok bármelyikében leírt fehérjét tartalmaz.
  12. 12. Eljárások gombák és baktériumok leküzdésére, azzal jellemezve, hogy azokat az 1., 2., illetve 9-11. igénypontok bármelyike szerinti fehérjék, illetve készítmények hatásának tesszük ki.
HU9400526A 1993-02-24 1994-02-23 Antimikrobiális hatású fehérjék, ilyen fehérjéket tartalmazó készítmények és eljárás ezek előállítására HU218110B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB939303725A GB9303725D0 (en) 1993-02-24 1993-02-24 Improvements in or relating to organic compounds

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9400526D0 HU9400526D0 (en) 1994-05-30
HUT68522A HUT68522A (en) 1995-06-28
HU218110B true HU218110B (hu) 2000-06-28

Family

ID=10730963

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400526A HU218110B (hu) 1993-02-24 1994-02-23 Antimikrobiális hatású fehérjék, ilyen fehérjéket tartalmazó készítmények és eljárás ezek előállítására

Country Status (15)

Country Link
US (2) US5608151A (hu)
EP (1) EP0612847A3 (hu)
JP (1) JPH06340696A (hu)
KR (1) KR100346928B1 (hu)
AU (1) AU682483B2 (hu)
CA (1) CA2116201A1 (hu)
CZ (1) CZ289646B6 (hu)
GB (1) GB9303725D0 (hu)
HU (1) HU218110B (hu)
IL (1) IL108727A0 (hu)
PL (1) PL179726B1 (hu)
SK (1) SK20594A3 (hu)
TR (1) TR27243A (hu)
UA (1) UA41278C2 (hu)
ZA (1) ZA941282B (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5521153A (en) * 1987-10-02 1996-05-28 Ciba-Geigy Corporation Synergistic antifungal protein and compositions containing same
US5530187A (en) * 1993-07-16 1996-06-25 The Salk Institute For Biological Studies Transgenic plants containing multiple disease resistance genes
GB9526238D0 (en) * 1995-12-21 1996-02-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6875903B2 (en) * 1998-06-22 2005-04-05 University Of Vermont Treatment of Staphylococcus infections
US7091332B1 (en) 1998-06-22 2006-08-15 University Of Vermont Treatment of staphylococcus infections
AU4706799A (en) * 1998-06-22 2000-01-10 University Of Vermont And State Agricultural College, The Treatment of (staphylococcus) infections
EP2270188A3 (en) * 2001-06-22 2011-09-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Defensin polynucleotides and methods of use

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK61691D0 (da) * 1991-04-08 1991-04-08 Danisco Genetiske konstruktioner
NZ244091A (en) * 1991-08-29 1994-10-26 Zeneca Ltd Biocidal proteins derived from plants, their manufacture, coding sequences and uses

Also Published As

Publication number Publication date
US5607919A (en) 1997-03-04
GB9303725D0 (en) 1993-04-14
EP0612847A3 (en) 1995-01-11
ZA941282B (en) 1995-08-24
US5608151A (en) 1997-03-04
SK20594A3 (en) 1994-09-07
KR940019722A (ko) 1994-09-14
HUT68522A (en) 1995-06-28
KR100346928B1 (ko) 2002-11-13
JPH06340696A (ja) 1994-12-13
TR27243A (tr) 1994-12-21
UA41278C2 (uk) 2001-09-17
CZ40394A3 (en) 1994-09-14
AU682483B2 (en) 1997-10-09
PL179726B1 (pl) 2000-10-31
PL302321A1 (en) 1994-09-05
AU5635494A (en) 1994-09-01
IL108727A0 (en) 1994-05-30
CZ289646B6 (cs) 2002-03-13
HU9400526D0 (en) 1994-05-30
CA2116201A1 (en) 1994-08-25
EP0612847A2 (en) 1994-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2158762C2 (ru) Антимикробные белки
Memelink et al. Cytokinin stress changes the developmental regulation of several defence‐related genes in tobacco
US5482928A (en) Biocidal proteins
EA012336B1 (ru) Белок, выделенный из растений рода lupinus или полученный в рекомбинантной форме, кодирующая его последовательность нуклеотидов и его применение в питании животных, в качестве стимулятора роста растений и при борьбе с патогенными грибами
HU217789B (hu) Eljárás növényekből patogénellenes hatású fehérjék izolálására, ezek rekombináns úton történő előállítására, valamint ezeket tartalmazó készítmények és transzgén növények előállítására
CZ209293A3 (en) Gene of plant chitinase and use thereof
US5750504A (en) Antimicrobial proteins
JPH06510535A (ja) 殺生物性蛋白質
JP2001502525A (ja) 抗真菌タンパク質、これをコードするこのｄｎａ、およびこのｄｎａを組込む宿主
HU218110B (hu) Antimikrobiális hatású fehérjék, ilyen fehérjéket tartalmazó készítmények és eljárás ezek előállítására
Zhang et al. Cloning, expression analysis and recombinant expression of a gene encoding a polygalacturonase-inhibiting protein from tobacco, Nicotiana tabacum
HU220115B (hu) Antipatogén peptidek, ezeket tartalmazó készítmények, eljárás növények védelmére és a peptideket kódoló szekvenciák
JPH08505048A (ja) 殺生物性のキチン結合性蛋白質
JPH07502976A (ja) 殺生物性蛋白質
US6297360B1 (en) Amphipathic protein-1
WO2006066355A1 (en) Chitin-binding peptides
JP2000502258A (ja) 抗微生物タンパク質
El-Habbak Overexpression/silencing of selected soybean genes alters resistance to pathogens
JP2013039064A (ja) 耐虫性タンパク質及び該耐虫性タンパク質をコードする耐虫性遺伝子
HU219505B (hu) Eljárás növényből származó intracelluláris fehérjék extracelluláris térbe való irányítására és patogénellenes hatásuk fokozására
KR20030042947A (ko) 나팔꽃 씨에서 유래한 신규의 항균성 펩타이드, 이를코딩하는 ｃＤＮＡ 및 이를 도입한 병 저항성 형질전환식물체
DE10104595A1 (de) Photogeschädigtes D1-Protein abbauende DegP2-Protease und diese kodierende DNA-Sequenz

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG., CH

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee