JPH06340696A - 抗菌タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 サトウダイコン(sugar beet)から単離された
抗微生物タンパク質を提供する。 【構成】 抗微生物タンパク質がキチナーゼおよびグル
カナーゼを除いたものである、サトウダイコンから単離
された抗微生物タンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はサトウダイコン(sugar b
eet)から単離された抗菌タンパク質に関する。

【０００２】

【発明の構成】抗菌タンパク質は、細菌、ウィルスおよ
び特に真菌を含む任意の微生物に対して任意の環境で有
毒または成長抑制性であるタンパク質(単独または他の
物質と混合)を含む。このような抗菌タンパク質は、抗
菌活性を微生物と接触して発現するもの、および同化ま
たは呼吸作用の結果抗菌になるものを含む。

【０００３】本発明により、サトウダイコンから単離さ
れた抗菌タンパク質(ただしキチナーゼおよびグルカナ
ーゼを除く)が提供される。

【０００４】サトウダイコンはセルコスポラ(Cercospor
a)属真菌に感染しているのが好ましく、特に好ましくは
タンパク質がセルコスポラ・ベティコラ(Cercospora be
ticola)に感染した葉から単離されたものである。

【０００５】本発明はまた配列番号(SEQ ID No.)２、５
および８に記載したものから選択された純粋なタンパク
質、または当該タンパク質の抗菌活性の実質的な減少な
しに１個またはそれ以上のアミノ酸が付加され、置換さ
れまたは除去された機能的に等しいその類似体(analogu
e)；またはそのようなタンパク質または類似体の混合物
を含む。本発明はまた配列番号８の８０−１１１残基ま
たは配列番号２または５のいずれかの２９−７４残基か
らなる純粋なタンパク質、または当該タンパク質の抗菌
活性の実質的な減少なしに１個またはそれ以上のアミノ
酸が付加され、置換されまたは除去された機能的に等し
いその類似体；またはそのようなタンパク質または類似
体の混合物を含む。配列番号２または５の２９−７４残
基をもつタンパク質は以後ＡＸ１、ＡＸ２とそれぞれ略
称し、配列番号８の８０−１１１残基をもつタンパク質
は以後ＡＸ３.１と略称する。

【０００６】真菌またはウィルス性病原体の植物への感
染は、植物組織中で約１０ファミリーの病原性関連タン
パク質（ＰＲタンパク質）類似体の合成を誘導し得る。
このようなＰＲタンパク質は５群に大別される。ＰＲ−
２、ＰＲ−３およびＰＲ−５タンパク質はそれぞれβ−
１,３−グルカナーゼ、キチナーゼおよびタウマチン−
様タンパク質である。ＰＲ−１およびＰＲ−４群のタン
パク質では現在まで特異的機能との関連が明らかにされ
ていない。ＰＲ−４タンパク質はプロヘベイン(proheve
in)およびジャガイモ(potato)の推定創傷感染誘導ＷＩ
Ｎタンパク質のＣ−末端領域に類似であり、従ってＮ−
末端ヘベイン(hevein)領域を欠いている。“酸性病原性
関連４群タンパク質の基本的対応物(basic counterpar
t)”は、従って、プロヘベインおよびジャガイモの推定
創傷誘導ＷＩＮタンパク質のＣ−末端に類似のタンパク
質の基本的対応物を含む。

【０００７】該上記病原性関連タンパク質の基本的対応
物であるタンパク質はキチン結合ＷＩＮタンパク質であ
るのが好ましく、最も好ましいのは大麦粒または加圧大
麦葉から単離され得るものである。

【０００８】本発明の別の好ましい態様は、上記タンパ
ク質またはその類似体と、酸性病原性関連４群のタンパ
ク質の基本的対応物であるタンパク質、特に配列番号１
１に記載したアミノ酸配列、またはタンパク質の抗菌活
性および／またはキチン結合活性の実質的な減少なしに
１個またはそれ以上のアミノ酸が付加され、置換されま
たは除去された機能的に等しいその類似体を含むキチン
−結合ＷＩＮタンパク質との組み合わせである。

【０００９】本発明はさらにアミノ酸配列が知られてい
ることによりイン・ビトロで製造された上記のタンパク
質を含むものである。本発明はさらに、少なくとも５５
％が本発明のＡＸタンパク質のいずれかに少なくとも５
５％類似するアミノ酸配列をもつ純粋なタンパク質を含
むものである。類似性の程度は好ましくは少なくとも６
０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、最も好まし
くは少なくとも８０％である。

【００１０】本発明において、互いに少なくとも５５％
の類似性をもった２つのアミノ酸配列とは、合計１０個
以上のアミノ酸残基が影響されないことを条件とし、最
も望ましくは４個までの間隙を可能として配列されたと
き、同位置で少なくとも５５％の同一または類似のアミ
ノ酸残基であると定義される。本発明の目的で：アラニ
ン、セリンおよびスレオニンは類似；グルタミン酸およ
びアスパルチン酸は類似；アスパラギンおよびグルタミ
ンは類似；アルギニンおよびリジンは類似；イソロイシ
ン、ロイシン、メチオニンおよびバリンは類似；フェニ
ルアラニン、チロシンおよびトリプトファンは類似であ
る。

【００１１】本発明はさらに、１個またはそれ以上の該
抗菌タンパク質またはその類似体をコードする、例えば
配列番号１、３、４、６、７または９のいずれ１つに記
載の配列を含む組換ＤＮＡを含む。組換ＤＮＡ配列は所
望により上記の酸性病原性関連４群のタンパク質の基本
的対応物のタンパク質をコードする配列を含み得る。

【００１２】本発明はさらにまた、直前の段落で述べた
組換ＤＮＡ配列とストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下でハイブリダイズしたＤＮＡ配列を含む。
“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”と
は、ハイブリダイゼーションを５０および６０℃の間で
０.１％ＳＤＳ含有２×食塩クエン酸緩衝液で行い、次
に同じ温度ですすぐだけであるが、行われるハイブリダ
イゼーションに影響を与えないように緩衝液のＳＳＣ濃
度が低い。このような減少濃度緩衝液はそれぞれ、(ａ)
１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ；または(ｂ)０.５×ＳＳ
Ｃ、０.１％ＳＤＳ；または(ｃ)０.１×ＳＳＣ、０.１
％ＳＤＳである。

【００１３】本発明はさらに該組換ＤＮＡ配列を含むベ
クターを含む。このような配列は適当なプロモーターお
よびターミネーターの制御下にあり、これらの熱不活性
タンパク質の制御転写を含む。

【００１４】本発明はさらに、該組換ＤＮＡを含み発現
可能な生物系、特に植物または微生物を含む。本発明は
さらに該組換ＤＮＡで形質転換された植物を含む。

【００１５】このような植物は既知の方法で製造され、
本発明のＤＮＡで既知の種々の方法(アグロバクテリウ
ム(Agrobacterium)ＴｉおよびＲｉプラスミド、エレク
トロポーレーション(electroporation)、微小注射(micr
o-injection)、微小投射銃(micro-projectile gun))等
で形質転換された植物細胞または原形質の再生を含む。
形質転換細胞は、適当な場合、組換ＤＮＡがゲノム中に
安定して取り込まれる全植物中へ再生し得る。単子葉ま
たは双子葉植物のいずれもこの方法に使用し得るが、後
者の方が一般に再生が容易である。

【００１８】本発明で遺伝的に修飾される植物の例は：
トマト、マンゴー、桃、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ
およびメロンを含む果物；キャノーラ(canola)、ヒマワ
リ、タバコ、サトウダイコンのような野生作物、小麦、
大麦および米のような細粒穀類、トウモロコシおよびワ
タ、およびジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツお
よびタマネギのような野菜を含む。特に好ましい植物は
サトウダイコンおよびトウモロコシである。

【００１７】植物は：ＡＸ１タンパク質(配列番号２の
２９−７４残基)、または当該タンパク質の抗菌活性の
実質的な減少なしに１個またはそれ以上のアミノ酸が付
加され、置換されまたは除去された機能的に等しいその
類似体；または、ＡＸ２タンパク質(配列番号５の２９
−７４残基)、または当該タンパク質の抗菌活性の実質
的な減少なしに１個またはそれ以上のアミノ酸が付加さ
れ、置換されまたは除去された機能的に等しいその類似
体；または、ＡＸ３.１タンパク質(配列番号８の８０−
１１残基)、または当該タンパク質の抗菌活性の実質的
な減少なしに１個またはそれ以上のアミノ酸が付加さ
れ、置換されまたは除去された機能的に等しいその類似
体；またはこれらのＡＸタンパク質または類似体の２個
またはそれ以上をコードする部分を含むＤＮＡを含む組
換ＤＮＡ配列で形質転換し得る。

【００１８】本発明はまた該組換ＤＮＡ配列で形質転換
された植物を含み、ＤＮＡ配列はさらに酸性病原性関連
４群のタンパク質、特に大麦粒または加圧大麦葉から単
離し得るキチン結合ＷＩＮタンパク質(配列番号１１の
２２−１４６残基)をコードする。

【００１９】本発明はさらに子孫が該ＤＮＡ配列を発現
できるこのような形質転換植物の子孫およびそのような
植物および子孫の種子を含む。本発明はさらに、該植物
内で組換ＤＮＡの発現により産生された抗菌タンパク質
を含む該組換ＤＮＡ発現由来のタンパク質を含む。本発
明はさらに抗菌タンパク質を１個またはそれ以上含む抗
菌組成物を含む。本発明はさらに抗菌タンパク質または
それらを含む組成物ににさらすことを含む、真菌または
細菌を抑制する方法を含む。

【００２０】本発明はさらに、抗菌タンパク質を、それ
らを含む有機材料から製造するための抽出法、特に浸柔
および溶媒抽出の材料の提供を含む方法を含む。抗菌タ
ンパク質は、遠心および疎水性相互作用；アニオン交
換；カチオン交換；ゲル濾過；および逆層クロマトグラ
フィーからなる群から選択されたクロマトグラフィーに
より連続して精製する。

【００２１】該抽出法が、セルコスポラ・ベティコラに
感染したサトウダイコンの葉、または本発明の抗菌タン
パク質またはその類似体をコードする組換ＤＮＡ配列を
含む微生物、または酸性病原性関連４群のタンパク質の
基本的対応物のＤＮＡ配列をさらにもつこのような組換
ＤＮＡを含む有機物質上で行われるのが好ましい。先の
文で述べた有機物質の材料となる微生物上で、もしあっ
ても、ほとんど抗菌活性がないことは評価されよう。本
発明はさらに下記の配列表および図面を含む詳細な記載
を参考にしてより理解されよう。

【００２２】

【図面の説明】図１はカチオン性モノＳカラムからの塩
化ナトリウム濃度を上昇させながら(点線)のＡＸ１、Ａ
Ｘ２およびＡＸ３タンパク質の溶出を示す。図２は精製
ＡＸ１、ＡＸ２、ＡＸ３およびＷＩＮタンパク質をＳＤ
Ｓおよび還元剤ジチオスレイトール（DTT)存在下に電気
泳動させた銀染色ポリアクリルアミドゲルを示す：低分
子量マーカータンパク質はゲルのラインの右端および左
端に示す。ＷＩＮタンパク質は大麦粒から単離する。図
３および図４はそれぞれ大麦粒から単離されたＷＩＮタ
ンパク質と任意に結合させたＡＸ１、ＡＸ３およびＡＸ
２の抗真菌活性を示す。図５は２８μｇ／mlのＷＩＮタ
ンパク質(図Ｂ)；８μg／mlのＡＸ２タンパク質(図
Ｃ)；および８μg／mlのＡＸ２および２８μg／mlのＷ
ＩＮの組み合わせ(図Ｄ)で処理して得られたセルコスポ
ラ・ベティコラの形態学を示す。図５ＡはＷＩＮおよび
ＡＸ２タンパク質非存在下で成育したセルコスポラ・ベ
ティコラの形態学を示す。

【００２３】図６は精製ＡＸ１、ＡＸ２およびＡＸ３タ
ンパク質をＳＤＳ存在下および還元剤ジチオスレイトー
ル(DTT)存在下または非存在下に電気泳動させた銀染色
ポリアクリルアミドゲルを示す。ＡＸ１およびＡＸ２と
比較して、ＡＸ３の２つの異性体ＡＸ３.１およびＡＸ
３.２の運動性はＤＴＴの存在で大きい影響を受けてお
り、ＡＸ３.１およびＡＸ３.２がおそらく３量体ではな
く２量体で存在することを示唆する。それ自身は明らか
に明白なしみであるタンパク質のバンドの前後であるゲ
ルの比較的高い背景染色は電気泳動中のタンパク質の人
工的な酸化によるものであり、一方ゲルのてっぺんの背
景染色はＤＴＴの人工的な染色による。ＤＴＴ非存在下
でＳＤＳにより同じタンパク質を変成した場合と比較し
て、ＤＴＴ存在下でのＡＸ１とＡＸ２タンパク質間の僅
かな明白な分子量移動は、ＳＤＳの結合を促進する分子
内ジスルフィド結合の分解によって開いたためである。
図２のように、低分子量マーカータンパク質(図中には
ＬＭＷと示す)はゲル内に含まれている。

【００２４】

【配列表の説明】配列番号１はタンパク質ＡＸ１をその
シグナルペプチドと共にコードするｃＤＮＡより発生し
たＰＣＲを示す。シグナルペプチドの開始コドンは４０
−４２のヌクレオチドであり、ＡＸ１タンパク質の停止
コドンは２６２−２６４の位置である。配列番号２はＡ
Ｘ１タンパク質のアミノ酸配列をそのシグナルと共に示
す。シグナルペプチドは残基１−２８を構築し、成熟タ
ンパク質は残基２９−７４を構築する。配列番号３はシ
グナルペプチドに関する限り翻訳促進部位(ヌクレオチ
ド１３−７９を構築)が開始コドン(ヌクレオチド８２−
８４)の前に位置すること以外、配列番号１を含むｃＤ
ＮＡにより発生したＰＣＲを示す。配列はＰｓｔ１制限
部位をヌクレオチド１−６に、ＢａｍＨＩ部位をヌクレ
オチド７−１２に含む。ヌクレオチド８０−８６はＮｃ
ｏｌ部位を構築する。ＡＸ１タンパク質に関する停止コ
ドンはヌクレオチド３０４−３０６である。Ｓａｌｌお
よびＳｐｈ１制限部位はそれぞれヌクレオチド３３８−
３４３および３４４−３４９に存在する。

【００２５】配列番号４はタンパク質ＡＸ２をそのシグ
ナルペプチドと共にコードするｃＤＮＡより発生したＰ
ＣＲを示す。シグナルペプチドの開始コドンは５３−５
５のヌクレオチドであり、ＡＸ２タンパク質の停止コド
ンは２７５−２７７の位置である。配列番号５はＡＸ２
タンパク質のアミノ酸配列をそのシグナルと共に示す。
シグナルペプチドは残基１−２８を構築し、成熟タンパ
ク質は残基２９−７４を構築する。配列番号６はシグナ
ルペプチドに関する限り翻訳促進部位(ヌクレオチド１
３−７９を構築)が開始コドン(ヌクレオチド８２−８
４)の前に位置すること以外、配列番号４を含むｃＤＮ
Ａにより発生したＰＣＲを示す。配列はＰｓｔ１制限部
位をヌクレオチド１−６に、ＢａｍＨＩ部位をヌクレオ
チド７−１２に含む。ヌクレオチド８０−８６はＮｃｏ
ｌ部位を構築する。ＡＸ２タンパク質に関する停止コド
ンはヌクレオチド３０４−３０６である。Ｓａｌｌおよ
びＳｐｈ１制限部位はそれぞれヌクレオチド３５２−３
５７および３５８−３６３に存在する。

【００２６】配列番号７はタンパク質ＡＸ３.１をその
推定シグナルペプチドと共にコードするｃＤＮＡより発
生したＰＣＲを示す。シグナルペプチドの開始コドンは
２３−２５のヌクレオチドであり、ＡＸ３.１タンパク
質の停止コドンは３５６−３５８の位置である。配列番
号８は配列番号７のｃＤＮＡによりコードされた非処理
翻訳産物のアミノ酸配列を示す。この推定タンパク質は
成熟ＡＸ３.１タンパク質を８０−１１１残基に含む。
配列番号９はシグナルペプチドに関する限り翻訳促進部
位(ヌクレオチド１３−７９を構築)が開始コドン(ヌク
レオチド８２−８４)の前に位置すること以外、配列番
号７を含むｃＤＮＡにより発生したＰＣＲを示す。配列
はＰｓｔ１制限部位をヌクレオチド１−６に、ＢａｍＨ
Ｉ部位をヌクレオチド７−１２に含む。ヌクレオチド８
０−８６はＮｃｏｌ部位を構築する。ＡＸ３.１タンパ
ク質に関する停止コドンはヌクレオチド４１５−４１７
である。ＳａｌｌおよびＳｐｈ１制限部位はそれぞれヌ
クレオチド４７３−４７８および４７９−４８４に存在
する。

【００２７】配列番号１０は大麦ＷＩＮタンパク質をコ
ードする遺伝子を含むｃＤＮＡを示す。配列番号１１は
大麦ＷＩＮタンパク質のアミノ酸配列をそのシグナルと
共に示す。シグナルペプチドは残基１−２１を構築し、
成熟タンパク質は残基２２−１４６を構築する。配列番
号１２は大麦ＷＩＮタンパク質をコードするヌクレオチ
ドから発生したＰＣＲを示す。配列の５'部位はＰｓｔ
１、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏｌ制限部位を含む。元々の
クローンの６２の位置は現在示しているＧよりむしろＣ
である。ＣからＧへの変化はタンパク質のアミノ酸配列
を変えず、Ｎｃｏｌ部位をその場所から除くために作ら
れた。ＷＩＮタンパク質に関する開始コドンはヌクレオ
チド１２−１４であり、停止コドンは４５０−４５２で
ある。配列番号１３は翻訳促進部位(配列番号１３のヌ
クレオチド１３−７９を構築)がＷＩＮ遺伝子開始コド
ン(ヌクレオチド８２−８４)の前に位置すること以外、
本質的に配列番号１２のヌクレオチド配列を示す。停止
コドンはヌクレオチド５２０−５２２である。

【００２８】セルコスポラ・ベティコラに感染したサト
ウダイコン葉由来のＡＸ１−３タンパク質の精製 ＡＸ１−３は自然にセルコスポラ・ベティコラに感染し
たサトウダイコン、cvs TurboまたはRhizorから単離す
る。５０個またはそれ以上のヌクレオチド領域をもつ葉
をイタリアの土地から摘み、４℃で抽出するまで保存す
る。すべての工程は４℃で行う。遠心は２０,０００ｇ
で２０分、セントリコン型(Centrikon model)Ｈ−４０
１Ｂ遠心機で精製工程の間行う。

【００２９】無細胞抽出物の精製 ２kgのセルコスポラ・ベティコラ感染サトウダイコン葉
を、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのベンザミジン(開始緩衝
液)および２００ｇのダウエックス(Dowex)１×２(１０
０μmのメッシュサイズ)を含む４リットルのｐＨ５.０
のＮａ−クエン酸緩衝液でホモジナイズする。ホモジネ
ートは２層の３１μmメッシュナイロンガーゼを遠心前
に絞って通す。

【００３０】熱および硫酸アンモニウムによる沈殿 遠心後得られた上清を５０℃で２０分間暖め、その後４
℃に冷却し、沈殿を遠心により回収して除く。固体硫酸
アンモニウムを９０％飽和になるまで上清に加える。遠
心後、沈殿タンパク質を開始緩衝液に再び溶解する；１
mlの緩衝液に１０ｇの出発物質。

【００３１】ＡＸ１、ＡＸ２およびＡＸ３は硫酸アンモ
ニウム沈殿タンパク質画分から精製する。溶解させた
後、タンパク質溶液を１mMＤＴＴおよび１mMベンザミジ
ン含有１０mMトリスｐＨ８.０に対して透析する。変成
タンパク質を遠心で除去し、上清をファースト・フロー
(Fast Flow)５０mlセファロースＱカラムおよびキチン
カラム(ＷＯ９２／１７５９１に記載のように調製)にか
け、そのカラムは連続して接続している。カラムは使用
前にトリス緩衝液で平衡化する。

【００３２】非結合タンパク質をトリス緩衝液で大量に
洗浄して回収する。非結合タンパク質画分(葉材料抽出
物１kg当たり２００ml)を１Ｍの硫酸アンモニウム、１
０％グリセロール、１mMのＤＴＴ、０.１ＭのＫＨ₂ＰＯ
₄(pH７.５)含有緩衝液Ｈに注ぐ。タンパク質溶液を５０
mｌのフェニル・セファロース(ファルマシア)と緩衝液
Ｈ溶液中で２時間室温でインキュベーションする。スラ
リーをさらに５０mlの緩衝液Ｈ中で平衡化したフェニル
・セファロースと共にカラムにかける。カラムからの流
出物に抗真菌活性が含まれていることが発見され、一
方、硫酸アンモニウムなしの緩衝液Ｈでカラムから流出
させたタンパク質は異なる。フェニル・セファロース工
程以外のすべての精製工程は４℃で行う。

【００３３】フェニル・セファロースカラム(４００ml)
からの流出物は２０mMの酢酸ナトリウム、１mMのＤＴＴ
(pH５.０)に対して広く透析し、続いてＣＭ−ＣＬ６Ｂ
セファロース(ファルマシア)カラムにかける。このカラ
ムを緩衝液Ｉ：５０mMの酢酸ナトリウム、１０％(v/v)
のグリセロール、１mMのＤＴＴ(pH５.０)で洗浄し、最
後に０.２５ＭのＮａＣｌ含有緩衝液Ｉで溶出する。タ
ンパク質を含む画分を集め、集めた半分の画分を５０mM
のＭＥＳ(pH６.０)で平衡化したＧ−７５セファデック
スカラム(ファルマシア；２.５×７０cm)であるゲル濾
過クロマトグラフィーにかける。１０mlの画分を回収す
る。画分２６−３０に高い抗真菌活性が存在し、５％
（w/v)ベタイン含有に注ぐ。

【００３４】Ｇ−７５セファデックスカラムからの画分
２６−３０は緩衝液Ａ：５％ベタイン(w/v)を含む５０m
MのＭＥＳでpH６.０で平衡化したモノＳカチオン交換カ
ラム(Ｈ／Ｒ ５／５；ファルマシア)であるイオン交換
ＦＰＬＣにかける。結合タンパク質は０−０.３ＭのＮ
ａＣｌ含有１５ml緩衝液Ａの勾配で溶出する。３つの主
要なタンパク質のピークが溶出し、すべて抗真菌活性を
含む(図１)。該ピークは続いてＡＸ１、ＡＸ２、ＡＸ３
と呼ぶ。

【００３５】大麦からのＷＩＮタンパク質の精製 ＷＩＮタンパク質(ＷＩＮ Ｎ)は大麦粒または加圧大麦
葉からクラーグら(プラント・サイエンス(Plant Sci.)
７１巻６５−６８頁(１９９０)またはヘッジャードら、
フェッブス・レターズ(FEBS Letters)３０７巻３８９−
３９２頁(１９９２))が記載しているように抽出する。

【００３６】図２は大麦から単離されたＷＩＮ−Ｎタン
パク質の銀染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルをモノＳ
カラムから抽出されたＡＸ１、ＡＸ２およびＡＸ３タン
パク質と共に示す。それぞれのＡＸタンパク質は電気泳
動で(ＡＸ３の場合はわずかににじんでいるが)単一なバ
ンドを作る画分として溶出される。

【００３７】ＡＸタンパク質配列決定 それぞれのＡＸタンパク質をカルボキシ−メチル化し、
プロゲルＴＳＫオクタデシル−４ＰＷカラム(スペルコ
・インコーポレイション(Supelco Inc.)；１５０×４.
６mm)である逆層ＨＰＬＣにかける。溶媒系はＡ：０.１
％ＴＦＡ水溶液およびＢ：０.１％ＴＦＡアセトニトリ
ル溶液である。ＡＸ１およびＡＸ２は単一の相対的なピ
ークとして溶出し、ＡＸ３は２つのピーク、主要なピー
クは小さなピークの直後に溶出し、これはＡＸ３.１お
よびＡＸ３.２と呼ぶ２つの形があることを示唆する。
ＡＸ１、ＡＸ２およびＡＸ３.１タンパク質は次に当分
野の技術者に既知の標準法で配列決定をする。

【００３８】ＡＸ１−ＡＸ３の抗菌活性 真菌の成長阻害は、実質的にＷＯ／１７５９１に記載さ
れている、９６穴マイクロタイタープレートで６２０nm
で測定する。タンパク質ＡＸ１、ＡＸ２およびＡＸ３は
単独またはＷＩＮ Ｎ(大麦粒または加圧大麦葉からヘ
ッジャードら、フェッブス・レターズ、３０７巻３８９
−３９２頁(１９９２)に記載のようにして精製した)と
の組み合わせのいずれかでセルコスポラ・ベティコラの
種子と共にインキュベーションする。測定混合物(２４
０または２６０μl)は１００μlのジャガイモデキスト
ロースブロス(ディフコ(Difco))、４０または６０μlタ
ンパク質サンプル(または緩衝液対照)の１００mMのＮａ
Ｃｌ(pH８.０)の溶液および約４００種子の１００μl水
溶液を含む。マイクロタイタープレートは蒸発および汚
染を避けるためテープで封をし、続いて室温で２００rp
mで作動する撹拌機上でインキュベーションする。図４
に示してあるように、６２０nmの吸光度を８日までそれ
ぞれ測り、タンパク質濃度対時間でプロットする。７２
時間成育後に得られた５０％阻害の濃度(μgタンパク質
／最終測定混合物ml)を計算し、Ｉ₅₀と呼ぶ。

【００３９】図３および図４み見られるように、それぞ
れのＡＸタンパク質は顕著にセルコスポラ・ベティコラ
の成長を減少させる。ＡＸ２の抗真菌活性は特に明白で
あり、２μg／ml(約０.５μM)で７２時間のインキュベ
ーションの後充分５０％成長阻害(Ｉ₅₀)する。ＷＩＮ
Ｎ単独では、弱い抗真菌活性を示し、７２時間後セルコ
スポラ・ベティコラを５０％阻害するのに１６０μg／m
l(約１１μM)必要である(データは示していない)。ＡＸ
２とＷＩＮ Ｎの組み合わせは、顕著に促進され真菌の
明白な成長減少を生じる。図３から明らかなように、Ａ
Ｘ２のセルコスポラ・ベティコラの成長阻害能力はＡＸ
１より大きい。

【００４０】ＡＸ２およびＷＩＮ Ｎはセルコスポラ・
ベティコラに対する殺菌活性を示さないが、むしろ対照
と比べて菌糸伸長速度を非常に遅くする。真菌の形態学
では、ＡＸ２および／またはＷＩＮ Ｎで処理した結果
また著しく変化する(図５)。

【００４１】さらに、ＡＸ１、ＡＸ２およびＡＸ３(お
よびそれらの混合物)は、所望によりＷＩＮ Ｎの存在
下で、セルコスポラ・ベティコラに対して有効な濃度
で、もしあっても、ほとんど明白でない有害な効果をサ
トウダイコンの花粉の発生において示すことは、植物細
胞に対する毒性がないことを示唆する。

【００４２】トウモロコシ病原体に対するＡＸタンパク
質の抗真菌活性 本発明のＡＸタンパク質は種々のトウモロコシ病原体に
対するその抗真菌活性を測定する。表１および２に示す
結果について、トウモロコシ病原体に関するＡＸタンパ
ク質の測定は下記の通り行う。指示する濃度でタンパク
質を含む５μlの溶液を無菌で滅菌丸底マイクロタイタ
ープレートのウェルに移す。すべての処理をもう１回行
う。試験タンパク質溶液を除いた接種しないまたはした
培養培地を機械的に対照として含む。種子(１００−１
５０)を無菌的に、５.０μlのアリコートの２倍濃度の
ジャガイモデキストロースブロス(ＰＤＢ)のそれぞれの
サンプルに加える。

【００４３】混合物にタンパク質サンプルおよび種子懸
濁液を緩やかに加えた後、乾燥を最小にするためパラフ
ィルムの２重層でふた／プレート接合部を包み、このよ
うに包んだマイクロタイタープレートを１９±０.２℃
で１６時間の照射時間の間インキュベーションする。

【００４４】個々のウェルで種子発芽および菌の成長を
２４時間毎に測定する。最後の１２０時間に、抗真菌活
性を測定する。結果は表１および２に示す。表１は真菌
の成長阻害を示すのに必要なタンパク質の最小濃度を示
し、表２は真菌が試験タンパク質なしで成育している対
照培養と比較した５０％阻害タンパク質の濃度を示す。

【００４５】

【表１】 ＡＸ１、ＡＸ２およびＷＩＮ Ｎの選択トウモロコシ病原体に対する活性 最小阻害濃度(μg/ml) 病原体／病気 WIN N ＡＸ１ ＡＸ２ヒ゛オフ゜ラリス・マイテ゛ィス (Bioplaris Maydis) ｎｉ ２０ ３０ 南部トウモロコシ白葉枯病(Southern corn Leaf Blight)セルコスホ゜ラ・セ゛アエ・マイテ゛ィス (Cercospora zeae maydis) 黒斑病(Gray Leaf Spot)コレトトリクム・ク゛ラミニコラ (Colletotrichum graminicola) ｎｉ ５０ ５０ 炭疽性茎腐敗病(Anthracnose Stalk Rot)テ゛ィフ゜ロテ゛ィア・マイテ゛ィス (Diplodia maydis) ６４ １１ ｎｉテ゛ィフ゜ロテ゛ィア 瘤および茎腐敗病(Diplodia Ear&Stalk Rot)エクセロヒリム・トルチクム 1種(Exserohilum trucicum race1) ｎｉ １１ ９８ 北部トウモロコシ白葉枯病１種(Nothern corn Leaf Blight Race1)エクセロヒリム・トルチクム ２種(Exserohilum trucicum race2) １９３ ３３ ｎｉ 北部トウモロコシ白葉枯病２種(Nothern corn Leaf Blight Race2)フサリウム・ク゛ラミネアルム (Fusarium Graminearum) ｎｉ ３３ ３３フサリウム 瘤および茎腐敗病(Fusarium Ear&Stalk Rot)フサリウム・モニリフォルメ (Fusarium moniliforme) ｎｉ ｎｉ ｎｉフサリウム 瘤および茎腐敗病(Fusarium Ear&Stalk Rot)シ゛ヘ゛レラ・セ゛アエ (Gibberella zeae) ｎｉ ｎｉ ｎｉシ゛ヘ゛レラ 瘤および茎腐敗病(Gibberella Ear&Stalk Rot) (“ｎｉ”はタンパク質が真菌成長を阻害しなかったことを示す。)

【００４６】表３の結果から、ＡＸおよびＷＩＮ Ｎタ
ンパク質の記載する病原体に関する測定は、下記の通り
行う。記載の真菌の菌糸は、融解寒天滴中に分散させ、
それを次に固化する。カプセルに包まれた菌糸を含む固
体寒天滴を次に記載の量の試験タンパク質で覆う。５日
間の加湿条件下でのインキュベーションの後、菌糸の成
長は、菌糸を含む寒天滴を試験タンパク質で覆っていな
い対照と比較して測定する。表３の結果は病原菌の成長
を５０％阻害するために必要な量を示す。

【００４７】

【表２】 表１に示した病原菌の５０％阻害を得るのために必要なタンパク質の量 病原体／病気 ＡＸ１ ＡＸ２ WIN N (50％以上の阻害を得るために必 要なタンパク質の濃度(μg/ml))コレトトリウム・ク゛ラミニコラ (Colletotrichum graminicola) ５０ ５０ ｎｉ 炭疽性茎腐敗病(Anthracnose Stalk Rot)フサリウム・ク゛ラミネアルム (Fusarium Graminearum) ｎｉ ｎｉ ｎｉフサリウム・モニリフォルメ (Fusarium moniliforme) ３３ ３３ ｎｉフサリウム 瘤および茎腐敗病(Fusarium Ear&Stalk Rot)シ゛ヘ゛レラ・セ゛アエ (Gibberella zeae) ｎｉ ｎｉ ｎｉシ゛ヘ゛レラ 茎腐敗病(Gibberella Stalk Rot)テ゛ィフ゜ロテ゛ィア・マイテ゛ィス (Diplodia maydis) １１ ｎｉ ６４テ゛ィフ゜ロテ゛ィア 茎腐敗病(Diplodia Stalk Rot)ヒ゛オフ゜ラリス・マイテ゛ィス (Bioplaris Maydis) ２０ ３３ ｎｉ 南部トウモロコシ白葉枯病(Southern corn Leaf Blight)エクセロヒリム・トルチクム (Exserohilum trucicum race) ３３ ｎｉ １９３ 北部トウモロコシ白葉枯病(Nothern corn Leaf Blight) (“ｎｉ”はタンパク質が真菌成長を阻害しなかったことを示す。)

【００４８】

【表３】 さらなる病原体に関する記載した濃度における真菌成長阻害の割合 病原体／病気 ＡＸ１ ＡＸ２ WIN N ２０ ２０ ４０ ２０ ４０ 成長阻害(％)モニリニア・フルクティケ゛ナ (Monilinia fructigena) ８０ ８０ ｎｉ 果物褐色腐敗病(Broun rot of fruit)コチロホ゛ラス・サティヒ゛ス (Cochiliobolus sativus) ３０ ３０ ｎｉ 穀物足部腐敗病(Cereal foot rot) 穀物斑点病(Cereal eye spot)シュート゛セルコス ポレラ・ヘルホ゜トリコイテ゛ス ３０ ３０ ３０ (Pseudocercosporella herpotrichoides)ヒ゜リクラリア・アリサ゛エ (Pyricularia oryzae) ｎｉ ２０ ｎｉリソ゛クトニア・ソラニ (Rhizoctonia solani) ｎｉ １０ ｎｉフサリウム・クロモラム (Fusarium culmorum) ｎｉ １０ ｎｉレフ゜トスフェリア・ノト゛ラム (Leptosphaeria nodorum) ｎｉ １０ ｎｉホ゛トリティス・シネレア (Botrytis cinerea) ｎｉ １０ ｎｉ (“ｎｉ”は、試験した濃度でタンパク質が真菌成長を阻害しなかったことを示 す。)

【００４９】図３、４および５Ａ〜Ｄおよび表１〜３か
ら明らかなように、所望によりＷＩＮ Ｎと組み合わせ
たＡＸ１、ＡＸ２およびＡＸ３タンパク質は、静真菌剤
である。それらは、したがって、非常に改善された、セ
ルコスポラ・ベティコラおよび種々のトウモロコシ病原
体によるものを含む病気(特に真菌感染)に対する耐性と
ともに植物、とくにサトウダイコンおよびトウモロコシ
に与えることができる。

【００５０】タンパク質配列 配列番号２、５および８はＡＸタンパク質１、２および
３.１のアミノ酸配列をそれぞれ示す。これらの配列は
それぞれシグナルペプチドを含む。ＡＸ１およびＡＸ２
の場合、シグナルペプチドは１−２８残基からなり、成
熟タンパク質は２９−７４残基からなる。ＡＸ３.１の
場合、成熟タンパク質３.１を含む推定タンパク質は８
０−１１１残基からなる。配列番号１１は大麦ＷＩＮタ
ンパク質とそのシグナルペプチドのアミノ酸配列を示
す。

【００５１】アミノ酸配列から、ＡＸ１およびＡＸ２が
それぞれ４６アミノ酸を含む類似タンパク質であること
が明白である。 配列番号２より、そのシグナルペプチドを除いたＡＸ１
タンパク質の配列は： Ala Ile Cys Lys Lys Pro Ser Lys Phe Phe Lys Gly Ala Cys Gly Arg Asp Ala Asp Cys Glu Lys Ala Cys Asp Gln Glu Asn Trp Pro Gly Gly Val Cys Val Pro Phe Leu Arg Cys Glu Cys Gln Arg Ser Cys である。配列番号５より、そのシグナルペプチドを除い
たＡＸ２タンパク質の配列は： Ala Thr Cys Arg Lys Pro Ser Met Tyr Phe Ser Gly Ala Cys Phe Ser Asp Thr Asn Cys Gln Lys Ala Cys Asn Arg Glu Asp Trp Pro Asn Gly Lys Cys Leu Val Gly Phe Lys Cys Glu Cys Gln Arg Pro Cys である。配列番号８より、そのシグナルペプチドを除い
たＡＸ３.１タンパク質の配列は： Arg Cys Ile Pro Cys Gly Gln Asp Cys Ile Ser Ser Arg Asn Cys Cys Ser Pro Cys Lys Cys Asn Phe Gly Pro Pro Val Pro Arg Cys Thr Asn である。

【００５２】それぞれのＮ−末端の４５残基はアミノ酸
配列決定により得られる。ＡＸ１およびＡＸ２の両方の
４６番目の残基は、他の植物由来の関連するタンパク質
との類似性と共に、ＰＣＲにより得られた対応するｃＤ
ＮＡ(それぞれ配列番号１および４)のヌクレオチド配列
を基にして、システインと同定される。塩基性タンパク
質であるＡＸ３.１は、３２アミノ酸配列を含み、その
配列はＰＣＲで得られたｃＤＮＡ(配列番号７)と一致す
る。

【００５３】さらに、ＡＸタンパク質のアミノ酸配列デ
ータは、対応するタンパク質のアミノ酸組成の分析(表
４参照)およびそれらをコードする遺伝子から推定した
分子量と比較した純粋なタンパク質のマススペクトル
(表５参照)により実証された。奇妙なことにも、ＡＸ２
(おそらくその中のメチオニン残基)は、マススペクトル
分析から、酸化されていると思われる。このような酸化
は、該質量分析の技術的な結果であり得る。

【００５４】ＡＸ１およびＡＸ２は、小麦および大麦由
来のガンマ−チオニン類、モロコシ由来の昆虫のアルフ
ァアミラーゼの推定阻害剤および大根(radish)種子から
単離された抗真菌タンパク質と幾つかの配列類似性を示
す。大根タンパク質は有効な抗真菌剤として知られ、カ
ルシウムイオン信号を妨げることにより真菌成長阻害す
ることが示唆される。しかしながら、ＡＸ１およびＡＸ
２はこのような大根タンパク質とほとんど類似性を示さ
ない。さらに、このような大根タンパク質はオリゴマー
形(３量体または４量体)で主として活性であり、一方、
ＤＴＴまたはメルカプトエタノール非存在下でのＳＤＳ
電気泳動によるゲル濾過では、ＡＸ１およびＡＸ２は単
量体であることが示唆される(例えば、図６参照)。ＡＸ
３.１と他のタンパク質の間に実質的な配列類似性は存
在しない。

【００５５】

【表４】 ＡＸタンパク質のアミノ酸配列 残基 ＡＸ１ ＡＸ２ ＡＸ３ Ａｓｐ ４.０ ５.０ ４.１ Ｔｈｒ ０.１ ２.０ １.０ Ｓｅｒ ２.１ ３.１ ３.０ Ｇｌｘ ５.７ ４.４ １.１ Ｐｒｏ ３.２ ３.２ ５.１ Ｇｌｙ ４.３ ３.２ ２.１ Ａｌａ ４.１ ３.１ ０.０ Ｃｙｓ ６.９ ６.９ ６.２ Ｖａｌ ２.０ １.１ １.０ Ｍｅｔ ０.０ ０.９ ０.０ Ｉｌｅ １.０ ０.１ ２.０ Ｌｅｕ １.１ １.１ ０.０ Ｔｙｒ ０.０ ０.９ ０.０ Ｐｈｅ ３.１ ３.０ １.０ Ｈｉｓ ０.０ ０.０ ０.０ Ｌｙｓ ５.１ ４.０ １.０ Ａｒｇ ３.２ ３.１ ３.２ Ｔｒｐ ｎ.ｄ. ｎ.ｄ. ｎ.ｄ.

【００５６】

【表５】 エレクトロ−スプレー(Electro-Spray)マススペクトル(ＥＳ−ＭＳ)で測定した およびそれらをコードする遺伝子から計算したＡＸ１、２および３.１の分子量 分子量(Ｄａ) タンパク質 ＥＳ−ＭＳ ｃＤＮＡ由来(−８Ｈ⁺) ＡＸ１ ５０７８.１ ５０７６−８＝５０７８ ＡＸ２ ５１９３.４ ５１８５−８＋１６＝５１９３ ＡＸ３.１ ３４５２.５ ３４６０−８＝３４５２

【００５７】形質転換植物の製造法 ＡＸタンパク質をコードするタンパク質を植物内に導入
する。特異的プライマー遺伝子を基にして、ＡＸ１、Ａ
Ｘ２およびＡＸ３.１をコードする遺伝子コード領域は
ＰＣＲを用いて対応するｍＲＮＡ、すなわち３'ＲＡＣ
Ｅに続いて５'ＲＡＣＥから合成する。適当なプロモー
タ(例えば３５Ｓ)およびターミネーター(例えば３５Ｓ)
配列を付加した後、ＡＸタンパク質をコードする遺伝子
を植物形質転換ベクターへ導入する。翻訳促進配列がベ
クターのタンパク質コード領域の５'部位に導入される
のが好ましい(例えば配列番号３、６および９参照)。ベ
クターはまた技術者には既知の適当なマーカー遺伝子を
含む。ベクターは、所望により、加圧大麦葉または大麦
粒から得られたようなＷＩＮタンパク質(所望により、
翻訳促進部位を伴って、例えば配列番号１３参照)およ
び／またはキチナーゼおよび／またはグルカナーゼをコ
ードする遺伝子を含む。好ましいキチナーゼは、ＰＣＴ
特許出願番号ＰＣＴ／ＤＫ９２／００１０８(公開番号
ＷＯ９２／１７５９１)に記載のキチナーゼ４である。
例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrob
acterium tumefaciens)がこれらのベクターにより形質
転換される。次に植物細胞を形質転換されたアグロバク
テリウムで処理し、およびこのように形質転換された植
物細胞は全植物へ再生され、その中で、新しい核材料は
ゲノム中へ安定して包含される。しかしながら、ＡＸタ
ンパク質(またはこのようなタンパク質の組み合わせ)を
コードする、さらに所望によりＷＩＮタンパク質および
／またはキチナーゼおよび／またはグルカナーゼをコー
ドするＤＮＡは、微小投射銃、エレクトロポーレーショ
ン、微小注射等の使用を含む他の既知の方法で植物内へ
導入し得、形質転換植物細胞の再生は、再生率を改善す
るために必要または望ましい場合、細胞をサイトキニン
で処理することを含む技術者が既知の方法で行い得るこ
とは認められよう。

【００５８】ＡＸタンパク質のためにトランスジェニッ
クにしたジャガイモおよびサトウダイコンはこのように
産生する。例えば、配列番号３、６または９から選択さ
れた配列を含むＤＮＡ配列は、ジャガイモまたはサトウ
ダイコン中へ既知の手段(共形質転換を含む)で導入され
る。配列番号１、４または７に記載した配列を含む組換
ＤＮＡが、導入された翻訳促進部位５'から種々のＡＸ
タンパク質シグナルペプチドをコードする領域の開始コ
ドンを欠くが別法として使用されることは認められよ
う。ＡＸ２をコードする遺伝子の発現は、例えばＡＸ２
転写産物の同定により測定される。植物中のタンパク質
の存在は、さらに標準試料タンパク質の抗体上昇を使用
して免疫化学的に測定される。タンパク質の免疫源性を
上昇させるために、ジフテリア毒素担体と架橋し得、ま
たはウサギに注射する前にポリリジンと組み合わせ得
る。

【００５９】トランスジェニックジャガイモおよびサト
ウダイコン抽出物は、産生され、部分的に生成され、上
記のようなマイクロタイター測定で、それらのセルコス
ポラ成長阻害能力により測定される。

【００６０】ＡＸタンパク質に対するトランスジェニッ
ク植物から得られた抽出物は、非トランスジェニック対
照ジャガイモまたはサトウダイコンから得られた同様な
抽出物と比較して、本質的に真菌の成長を阻害する。

【００６１】さらに、適当な微生物(すなわちその中の
ＡＸタンパク質の産物は実質的に有毒でない)は、形質
転換微生物がこのようなタンパク質を発現するように、
ＡＸタンパク質(またはＡＸタンパク質の組み合わせ)を
コードする遺伝子(または遺伝子群)を含むベクターによ
り形質転換し得る。微生物はさらに他のタンパク質、例
えば配列番号１１に記載のようなＷＩＮタンパク質およ
び／または種々のキチナーゼおよび／またはグルクナー
ゼをコードする遺伝子を含み得る。特に好ましいこのよ
うな他のタンパク質はＰＣＴ特許番号ＰＣＴ／ＤＫ９２
／００１０８(公開番号ＷＯ９２／１７５９１)に記載の
キチナーゼ４である。

【００６２】微生物は、次に植物病原体を抑制するため
に使用し得る。例えば、形質転換微生物を、乾燥し、感
染植物または感染の危険のある植物にスプレーし得る。

【００６３】本発明は、したがって、１−２０まである
特許請求の範囲により定義され、１−３７まで番号付し
た下記条項により要約される。 １．抗菌タンパク質がキチナーゼおよびグルカナーゼを
除いたものである、サトウダイコンから単離された抗菌
タンパク質。 ２．セルコスポラ種の真菌に感染されているサトウダイ
コンから単離した、１記載の抗菌タンパク質。 ３．セルコスポラ・ベティコラに感染しているサトウダ
イコン葉から単離した、１または２記載のタンパク質。 ４．１〜３のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配
列をもつ、純粋なタンパク質。 ５．純粋なタンパク質ＡＸ１、または抗菌活性の実質的
な減少なしに１個またはそれ以上のアミノ酸が付加さ
れ、置換されまたは除去された機能的に等しいその類似
体。 ６．純粋なタンパク質ＡＸ２、または抗菌活性の実質的
な減少なしに１個またはそれ以上のアミノ酸が付加さ
れ、置換されまたは除去された機能的に等しいその類似
体。 ７．純粋なタンパク質ＡＸ３.１、または抗菌活性の実
質的な減少なしに１個またはそれ以上のアミノ酸が付加
され、置換されまたは除去された機能的に等しいその類
似体。 ８．アミノ酸配列が既知であることよりイン・ビトロで
化学的に合成された、１〜７記載の純粋なタンパク質ま
たはその類似体。 ９．少なくとも５５％が１〜８記載のタンパク質と類似
である、純粋なタンパク質。

【００６４】１０．タンパク質の酸性病原関連４群の基
本的対応物と結合した５〜９のいずれかに記載の純粋な
タンパク質。 １１．該酸性病原関連タンパク質の基本的対応物がキチ
ン結合ＷＩＮタンパク質である、１０記載の純粋なタン
パク質。 １２．ＷＩＮタンパク質が大麦粒または加圧大麦葉から
単離された、１１記載の純粋なタンパク質。 １３．１〜９のいずれかに記載のタンパク質をコードす
る配列を含む、組換ＤＮＡ。 １４．１〜９のいずれかに記載のタンパク質をコード
し、配列番号２、５および８からなる群から選択された
配列を含む、１３記載の組換ＤＮＡ。 １５．１０〜１２のいずれかに記載の蛋白の酸性病原関
連４群の基本的対応物をコードするＤＮＡ配列をさらに
含む、１３または１４記載の組換ＤＮＡ。 １６．１３〜１５のいずれかに記載のＤＮＡ配列と厳格
な条件下でハイブリダイズする、ＤＮＡ配列。 １７．１３〜１６のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含
む、ベクター。 １８．植物ゲノムから単離されたＤＮＡ配列を含む、１
７記載のベクター。 １９．１３〜１６のいずれかに記載のＤＮＡを含み、系
がそのＤＮＡを発現できる、生物系。

【００６５】２０．微生物である、１９記載の生物系。 ２１．植物である、１９記載の生物系。 ２２．１３〜１６のいずれかに記載の組換ＤＮＡで形質
転換した植物。 ２３．ＡＸ１タンパク質、または抗菌活性の実質的な減
少なしに１個またはそれ以上のアミノ酸が付加され、置
換されまたは除去された機能的に等しいその類似体をコ
ードする部分を含む組換ＤＮＡ配列により形質転換され
た植物。 ２４．ＡＸ２タンパク質、または抗菌活性の実質的な減
少なしに１個またはそれ以上のアミノ酸が付加され、置
換されまたは除去された機能的に等しいその類似体をコ
ードする部分を含む組換ＤＮＡ配列により形質転換され
た植物。 ２５．ＡＸ３.１タンパク質、または抗菌活性の実質的
な減少なしに１個またはそれ以上のアミノ酸が付加さ
れ、置換されまたは除去された機能的に等しいその類似
体をコードする部分を含む組換ＤＮＡ配列により形質転
換された植物。 ２６．ＤＮＡ配列が１０〜１２のいずれかに記載の蛋白
の酸性病原関連４群の基本的対応物をコードするＤＮＡ
配列をさらに含む、２３〜２５のいずれか記載の形質転
換された植物。 ２７．子孫が該組換ＤＮＡ配列を発現する、２３〜２６
のいずれかに記載の植物の子孫。 ２８．２２〜２６のいずれかに記載の植物、または２７
に記載の子孫の種子。 ２９．１３〜１６の何れかに記載ＤＮＡの発現由来のタ
ンパク質。

【００６６】３０．２２〜２７に記載の植物内で組換Ｄ
ＮＡが発現することにより産生される、抗菌活性タンパ
ク質。 ３１．１〜１２および２９〜３０のいずれかに記載のタ
ンパク質を１個またはそれ以上含む、抗菌組成物。 ３２．１〜１２および２９〜３１のいずれかに記載のタ
ンパク質または組成物にさらすことを含む、真菌または
細菌を抑制する方法。 ３３．１〜１２または２９〜３１のいずれかに記載の抗
菌タンパク質を製造するための、それらを含む有機物質
からの抽出法。 ３４．浸柔および溶媒抽出の材料の提供を含む、３３に
記載の抽出法。 ３５．タンパク質を遠心および疎水性相互作用；アニオ
ン交換；カチオン交換；ゲル濾過；および逆層クロマト
グラフィーからなる群から選択されたクロマトグラフィ
ーで連続して精製する、３４記載の抽出法。 ３６．有機物質がセルコスポラ・ベティコラに感染した
サトウダイコンの葉を含む、３３〜３５のいずれかに記
載の抽出法。 ３７．有機物質が２０記載の微生物を含む、３３〜３５
のいずれかに記載の抽出法。

【００６７】

【配列表】

配列番号１ 配列の長さ：４３７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris) 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：40..264 配列 ATACGCATTT GTTTCAAAGT TCAAACAAAG ACCAAAAAA ATG GAG AAG AAA TTC 54 Met Glu Lys Lys Phe 1 5 TTT GGG CTT TTG CTT TTG CTA CTC TTC GTA TTT GCT TCT GAG ATG AAT 102 Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe Ala Ser Glu Met Asn 10 15 20 ATT GTG ACT AAG GTT GAT GGT GCA ATA TGC AAG AAA CCA AGT AAG TTC 150 Ile Val Thr Lys Val Asp Gly Ala Ile Cys Lys Lys Pro Ser Lys Phe 25 30 35 TTC AAA GGT GCT TGC GGT AGA GAT GCC GAT TGT GAG AAG GCT TGT GAT 198 Phe Lys Gly Ala Cys Gly Arg Asp Ala Asp Cys Glu Lys Ala Cys Asp 40 45 50 CAA GAG AAT TGG CCT GGC GGA GTT TGT GTA CCC TTT CTC AGA TGT GAA 246 Gln Glu Asn Trp Pro Gly Gly Val Cys Val Pro Phe Leu Arg Cys Glu 55 60 65 TGT CAG AGG TCT TGC TAAGCACTGC AAGCCACGGA CGATAAAAAG AAGTACTTGT 301 Cys Gln Arg Ser Cys 70 75 AATGAAGCTA TGGGTCAATA TTTTTCAATC CTATAATATT AAATAAATTG TTGTAACTAT 361 TTTAAGTGTG TAATAAATCT ACGTGGGTTT AAACTCCACA ATTGCTTTTG AAATAATGAT 421 TTACATATAA GTTTCA 437

【００６８】配列番号：２ 配列の長さ：74アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Lys Lys Phe Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe 1 5 10 15 Ala Ser Glu Met Asn Ile Val Thr Lys Val Asp Gly Ala Ile Cys Lys 20 25 30 Lys Pro Ser Lys Phe Phe Lys Gly Ala Cys Gly Arg Asp Ala Asp Cys 35 40 45 Glu Lys Ala Cys Asp Gln Glu Asn Trp Pro Gly Gly Val Cys Val Pro 50 55 60 Phe Leu Arg Cys Glu Cys Gln Arg Ser Cys 65 70

【００６９】配列番号：３ 配列の長さ：349塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris) 配列 CTGCAGGGAT CCTATTTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA 60 ATTACTATTT ACAATTACAC CATGGAGAAG AAATTCTTTG GGCTTTTGCT TTTGCTACTC 120 TTCGTATTTG CTTCTGAGAT GAATATTGTG ACTAAGGTTG ATGGTGCAAT ATGCAAGAAA 180 CCAAGTAAGT TCTTCAAAGG TGCTTGCGGT AGAGATGCCG ATTGTGAGAA GGCTTGTGAT 240 CAAGAGAATT GGCCTGGCGG AGTTTGTGTA CCCTTTCTCA GATGTGAATG TCAGAGGTCT 300 TGCTAAGCAC TGCAAGCCAC GGACGATAAA AAGAAGCGTC GACGCATGC 349

【００７０】配列番号：４ 配列の長さ：492塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris) 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：53..277 配列 CCATACATTA TATACGTATT TGTTTCAAAG TTCAAACAAA GACAAAACAA AA ATG 55 Met 1 GAG AAA AAA TTC TTT GGG CTT TTG CTT TTG CTA CTC TTC GTA TTT GCT 103 Glu Lys Lys Phe Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe Ala 5 10 15 TCT GAG CTG AAC ATG GTG GCT GAG GTT CAA GGT GCC ACT TGT AGA AAA 151 Ser Glu Leu Asn Met Val Ala Glu Val Gln Gly Ala Thr Cys Arg Lys 20 25 30 CCA AGT ATG TAT TTC AGC GGC GCT TGC TTT TCT GAT ACG AAT TGT CAG 199 Pro Ser Met Tyr Phe Ser Gly Ala Cys Phe Ser Asp Thr Asn Cys Gln 35 40 45 AAA GCT TGT AAT CGA GAG GAT TGG CCT AAT GGG AAA TGC TTA GTC GGT 247 Lys Ala Cys Asn Arg Glu Asp Trp Pro Asn Gly Lys Cys Leu Val Gly 50 55 60 65 TTC AAA TGT GAA TGT CAA AGG CCT TGT TAAGTGGTGC CTGTGTCCTC 294 Phe Lys Cys Glu Cys Gln Arg Pro Cys 70 75 AATTACGGCC TACGAGCCTT TCAGGTACCT ATGTGGCCGA GTATGGCTAA ATTGGTAATA 354 GTACATAGCA GTGGTAATAT GAATAAACGA TTCACTCTTG TAAGATGTAT TATGTTTTGT 414 TTGTGCTGTG GTTTCCAGTT GCTTTTGAAA ATAATGATTT TCATATAAAT CGGACCTTTT 474 ATTCTGATAA AAAAAAAA 492

【００７１】配列番号：５ 配列の長さ：74アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Lys Lys Phe Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe 1 5 10 15 Ala Ser Glu Leu Asn Met Val Ala Glu Val Gln Gly Ala Thr Cys Arg 20 25 30 Lys Pro Ser Met Tyr Phe Ser Gly Ala Cys Phe Ser Asp Thr Asn Cys 35 40 45 Gln Lys Ala Cys Asn Arg Glu Asp Trp Pro Asn Gly Lys Cys Leu Val 50 55 60 Gly Phe Lys Cys Glu Cys Gln Arg Pro Cys 65 70

【００７２】配列番号：６ 配列の長さ：363塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris) 配列 ＣＴＧＣＡＧＧＧＡＴ ＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡ ＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣ ＣＡＡ
ＣＡＡＣＡＡＣ ＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡ ＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡ ６０ ＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴ ＡＣＡＡＴＴＡＣＡＣ ＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡ ＡＡＡ
ＴＴＣＴＴＴＧ ＧＧＣＴＴＴＴＧＣＴ ＴＴＴＧＣＴＡＣＴＣ １２０ ＴＴＣＧＴＡＴＴＴＧ ＣＴＴＣＴＧＡＧＣＴ ＧＡＡＣＡＴＧＧＴＧ ＧＣＴ
ＧＡＧＧＴＴＣ ＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣ ＴＴＧＴＡＧＡＡＡＡ １８０ ＣＣＡＡＧＴＡＴＧＴ ＡＴＴＴＣＡＧＣＧＧ ＣＧＣＴＴＧＣＴＴＴ ＴＣＴ
ＧＡＴＡＣＧＡ ＡＴＴＧＴＣＡＧＡＡ ＡＧＣＴＴＧＴＡＡＴ ２４０ ＣＧＡＧＡＧＧＡＴＴ ＧＧＣＣＴＡＡＴＧＧ ＧＡＡＡＴＧＣＴＴＡ ＧＴＣ
ＧＧＴＴＴＣＡ ＡＡＴＧＴＧＡＡＴＧ ＴＣＡＡＡＧＧＣＣＴ ３００ ＴＧＴＴＡＡＧＴＧＧ ＴＧＣＣＴＧＴＧＴＣ ＣＴＣＡＡＴＴＡＣＧ ＧＣＣ
ＴＡＣＧＡＧＣ ＣＴＴＴＣＡＧＧＴＡ ＣＧＴＣＧＡＣＧＣＡ ３６０ ＴＧＣ
３６３

【００７３】配列番号：７ 配列の長さ：５９６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris) 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：23..358 配列 ATTCAACCCA ATAGAAACAA TC ATG GCA AGG AAC TCA TTC AAC TTC CTC ATT 52 Met Ala Arg Asn Ser Phe Asn Phe Leu Ile 1 5 10 ATC ATG GTC ATT TCA GCA CTG CTT TTG CTC CCT GGA TCA CGT GCA AGC 100 Ile Met Val Ile Ser Ala Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Arg Ala Ser 15 20 25 TTT CAG GAA AAG ATA ACT ATG AAC ATA GAA GAT GGA CGC GAA AGC GGC 148 Phe Gln Glu Lys Ile Thr Met Asn Ile Glu Asp Gly Arg Glu Ser Gly 30 35 40 ATA GCA AAG GAA ATA GTT GAG GCA GAA GCA GAA GCA GAA GCA TTA TTA 196 Ile Ala Lys Glu Ile Val Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Leu Leu 45 50 55 CGC GTT GGT GAG CAA GCT ATG CTG GAA CAA GTA ATG ACA AGA GGC TTA 244 Arg Val Gly Glu Gln Ala Met Leu Glu Gln Val Met Thr Arg Gly Leu 60 65 70 GCA GAT AAC CTT AAG AGG TGT ATA CCA TGT GGT CAA GAC TGC ATT TCC 292 Ala Asp Asn Leu Lys Arg Cys Ile Pro Cys Gly Gln Asp Cys Ile Ser 75 80 85 90 TCA AGA AAC TGT TGC TCA CCT TGC AAA TGC AAC TTC GGG CCA CCG GTT 340 Ser Arg Asn Cys Cys Ser Pro Cys Lys Cys Asn Phe Gly Pro Pro Val 95 100 105 CCA AGG TGT ACT AAT TGAATGCTTA GCTTGCTGCT TAGTGCTAAA TGCTAAGCGC 395 Pro Arg Cys Thr Asn 110 TACGCTTGCT AGTATGTGCA CGATCCGCTC TATCTCTTTA TATGCACCTA AGTCCTTTCA 455 TCTCGACTGT GTTGTTTGTG TGTAAAATAA AGTCTTGGTT TTCCAAGACT ACTAGTTTAG 515 TTACTGGCTT ATGTTTTTCG GAATCTTGAT ATATAAATAA GACAAGGAGA CCTATTTCTT 575 GCTTTGCTTA AAAAAAAAAA A 596

【００７５】配列番号：８ 配列の長さ：111アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Arg Asn Ser Phe Asn Phe Leu Ile Ile Met Val Ile Ser Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Arg Ala Ser Phe Gln Glu Lys Ile Thr 20 25 30 Met Asn Ile Glu Asp Gly Arg Glu Ser Gly Ile Ala Lys Glu Ile Val 35 40 45 Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Leu Leu Arg Val Gly Glu Gln Ala 50 55 60 Met Leu Glu Gln Val Met Thr Arg Gly Leu Ala Asp Asn Leu Lys Arg 65 70 75 80 Cys Ile Pro Cys Gly Gln Asp Cys Ile Ser Ser Arg Asn Cys Cys Ser 85 90 95 Pro Cys Lys Cys Asn Phe Gly Pro Pro Val Pro Arg Cys Thr Asn 100 105 110

【００７６】配列番号：９ 配列の長さ：484塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris) 配列 CTGCAGGGAT CCTATTTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA 60 ATTACTATTT ACAATTACAC CATGGCAAGG AACTCATTCA ACTTCCTCAT TATCATGGTC 120 ATTTCAGCAC TGCTTTTGCT CCCTGGATCA CGTGCAAGCT TTCAGGAAAA GATAACTATG 180 AACATAGAAG ATGGACGCGA AAGCGGCATA GCAAAGGAAA TAGTTGAGGC AGAAGCAGAA 240 GCAGAAGCAT TATTACGCGT TGGTGAGCAA GCTATGCTGG AACAAGTAAT GACAAGAGGC 300 TTAGCAGATA ACCTTAAGAG GTGTATACCA TGTGGTCAAG ACTGCATTTC CTCAAGAAAC 360 TGTTGCTCAC CTTGCAAATG CAACTTCGGG CCACCGGTTC CAAGGTGTAC TAATTGAATG 420 CTTAGCTTGC TGCTTAGTGC TAAATGCTAA GCGCTACGCT TGCTAGTATG TGGTCGACGC 480 ATGC 484

【００７７】配列番号：１０ 配列の長さ：504塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ホルデウム・ブルガレ(Hordeum vulgare) 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..441 配列 ATG GCG GCA CGC CTG ATG CTG GTG GCG GCG CTG CTG TGC GCG GCG GCG 48 Met Ala Ala Arg Leu Met Leu Val Ala Ala Leu Leu Cys Ala Ala Ala 1 5 10 15 GCC ATG GCC ACG GCG CAG CAG GCG AAC AAC GTC CGG GCG ACG TAC CAC 96 Ala Met Ala Thr Ala Gln Gln Ala Asn Asn Val Arg Ala Thr Tyr His 20 25 30 TAC TAC CGG CCG GCG CAG AAC AAC TGG GAC CTG GGC GCG CCC GCC GTG 144 Tyr Tyr Arg Pro Ala Gln Asn Asn Trp Asp Leu Gly Ala Pro Ala Val 35 40 45 AGC GCC TAC TGC GCG ACC TGG GAC GCC AGC AAG CCG CTG TCG TGG CGG 192 Ser Ala Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ala Ser Lys Pro Leu Ser Trp Arg 50 55 60 TCC AAG TAC GGC TGG ACG GCG TTC TGC GGC CCC GCC GGC CCC CGC GGG 240 Ser Lys Tyr Gly Trp Thr Ala Phe Cys Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly 65 70 75 80 CAG GCG GCC TGC GGC AAG TGC CTC CGG GTG ACC AAC CCG GCG ACG GGG 288 Gln Ala Ala Cys Gly Lys Cys Leu Arg Val Thr Asn Pro Ala Thr Gly 85 90 95 GCG CAG ATC ACG GCG AGG ATC GTG GAC CAG TGC GCC AAC GGC GGG CTC 336 Ala Gln Ile Thr Ala Arg Ile Val Asp Gln Cys Ala Asn Gly Gly Leu 100 105 110 GAC CTC GAC TGG GAC ACC GTC TTC ACC AAG ATC GAC ACC AAC GGG ATT 384 Asp Leu Asp Trp Asp Thr Val Phe Thr Lys Ile Asp Thr Asn Gly Ile 115 120 125 GGG TAC CAG CAG GGC CAC CTC AAC GTC AAC TAC CAG TTC GTC GAC TGC 432 Gly Tyr Gln Gln Gly His Leu Asn Val Asn Tyr Gln Phe Val Asp Cys 130 135 140 CGC GAC TAGATTGTCT GTGGATCCAA GGCTAGCTAA GAATAAAAGG CTAGCTAAGC 488 Arg Asp 145 TATGAGTGAG CAGCTG 504

【００７８】配列番号：１１ 配列の長さ：146アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Ala Arg Leu Met Leu Val Ala Ala Leu Leu Cys Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Met Ala Thr Ala Gln Gln Ala Asn Asn Val Arg Ala Thr Tyr His 20 25 30 Tyr Tyr Arg Pro Ala Gln Asn Asn Trp Asp Leu Gly Ala Pro Ala Val 35 40 45 Ser Ala Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ala Ser Lys Pro Leu Ser Trp Arg 50 55 60 Ser Lys Tyr Gly Trp Thr Ala Phe Cys Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly 65 70 75 80 Gln Ala Ala Cys Gly Lys Cys Leu Arg Val Thr Asn Pro Ala Thr Gly 85 90 95 Ala Gln Ile Thr Ala Arg Ile Val Asp Gln Cys Ala Asn Gly Gly Leu 100 105 110 Asp Leu Asp Trp Asp Thr Val Phe Thr Lys Ile Asp Thr Asn Gly Ile 115 120 125 Gly Tyr Gln Gln Gly His Leu Asn Val Asn Tyr Gln Phe Val Asp Cys 130 135 140 Arg Asp 145

【００７９】配列番号：１２ 配列の長さ：515塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ホルデウム・ブルガレ(Hordeum vulgare) 配列 CTGCAGGATC CATGGCGGCA CGCCTGATGC TGGTGGCGGC GCTGCTGTGC GCGGCGGCGG 60 CGATGGCCAC GGCGCAGCAG GCGAACAACG TCCGGGCGAC GTACCACTAC TACCGGCCGG 120 CGCAGAACAA CTGGGACCTG GGCGCGCCCG CCGTGAGCGC CTACTGCGCG ACCTGGGACG 180 CCAGCAAGCC GCTGTCGTGG CGGTCCAAGT ACGGCTGGAC GGCGTTCTGC GGCCCCGCCG 240 GCCCCCGCGG GCAGGCGGCC TGCGGCAAGT GCCTCCGGGT GACCAACCCG GCGACGGGGG 300 CGCAGATCAC GGCGAGGATC GTGGACCAGT GCGCCAACGG CGGGCTCGAC CTCGACTGGG 360 ACACCGTCTT CACCAAGATC GACACCAACG GGATTGGGTA CCAGCAGGGC CACCTCAACG 420 TCAACTACCA GTTCGTCGAC TGCCGCGACT AGATTGTCTG TGGATCCAAG GCTAGCTAAG 480 AATAAAAGGC TAGCTAAGCT ATGAGTGAGC AGCTG 515

【００８０】配列番号：１３ 配列の長さ：585塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ホルデウム・ブルガレ(Hordeum vulgare) 配列 ＣＴＧＣＡＧＧＧＡＴ ＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡ ＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣ ＣＡＡ
ＣＡＡＣＡＡＣ ＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡ ＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡ ６０ ＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴ ＡＣＡＡＴＴＡＣＡＣ ＣＡＴＧＧＣＧＧＣＡ ＣＧＣ
ＣＴＧＡＴＧＣ ＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣ ＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣ １２０ ＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧ ＣＧＡＴＧＧＣＣＡＣ ＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧ ＧＣＧ
ＡＡＣＡＡＣＧ ＴＣＣＧＧＧＣＧＡＣ ＧＴＡＣＣＡＣＴＡＣ １８０ ＴＡＣＣＧＧＣＣＧＧ ＣＧＣＡＧＡＡＣＡＡ ＣＴＧＧＧＡＣＣＴＧ ＧＧＣ
ＧＣＧＣＣＣＧ ＣＣＧＴＧＡＧＣＧＣ ＣＴＡＣＴＧＣＧＣＧ ２４０ ＡＣＣＴＧＧＧＡＣＧ ＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣ ＧＣＴＧＴＣＧＴＧＧ ＣＧＧ
ＴＣＣＡＡＧＴ ＡＣＧＧＣＴＧＧＡＣ ＧＧＣＧＴＴＣＴＧＣ ３００ ＧＧＣＣＣＣＧＣＣＧ ＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧ ＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣ ＴＧＣ
ＧＧＣＡＡＧＴ ＧＣＣＴＣＣＧＧＧＴ ＧＡＣＣＡＡＣＣＣＧ ３６０ ＧＣＧＡＣＧＧＧＧＧ ＣＧＣＡＧＡＴＣＡＣ ＧＧＣＧＡＧＧＡＴＣ ＧＴＧ
ＧＡＣＣＡＧＴ ＧＣＧＣＣＡＡＣＧＧ ＣＧＧＧＣＴＣＧＡＣ ４２０ ＣＴＣＧＡＣＴＧＧＧ ＡＣＡＣＣＧＴＣＴＴ ＣＡＣＣＡＡＧＡＴＣ ＧＡＣ
ＡＣＣＡＡＣＧ ＧＧＡＴＴＧＧＧＴＡ ＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣ ４８０ ＣＡＣＣＴＣＡＡＣＧ ＴＣＡＡＣＴＡＣＣＡ ＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣ ＴＧＣ
ＣＧＣＧＡＣＴ ＡＧＡＴＴＧＴＣＴＧ ＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧ ５４０ ＧＣＴＡＧＣＴＡＡＧ ＡＡＴＡＡＡＡＧＧＣ ＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴ ＡＴＧ
ＡＧＴＧＡＧＣ ＡＧＣＴＧ ５８５

【図面の簡単な説明】

【図１】 カチオン性モノＳカラムからのＡＸ１、ＡＸ
２およびＡＸ３タンパク質の溶出を示すグラフである。

【図２】 精製ＡＸ１、ＡＸ２、ＡＸ３およびＷＩＮタ
ンパク質の電気泳動の結果を示す。

【図３】 大麦粒から単離されたＷＩＮタンパク質と任
意に結合させたＡＸ１、ＡＸ３およびＡＸ２の抗真菌活
性を示すグラフである。

【図４】 大麦粒から単離されたＷＩＮタンパク質と任
意に結合させたＡＸ１、ＡＸ３およびＡＸ２の抗真菌活
性を示すグラフである。

【図５】 ＷＩＮタンパク質（図Ｂ)；ＡＸ２タンパク
質(図Ｃ)；およびＡＸ２およびＷＩＮの組み合わせ(図
Ｄ)で処理したセルコスポラ・ベティコラである生物の
形態を示す。図５ＡはＷＩＮおよびＡＸ２タンパク質非
存在下で成育したセルコスポラ・ベティコラである生物
の形態を示す。

【図６】 精製ＡＸ１、ＡＸ２およびＡＸ３タンパク質
をＳＤＳ存在下および還元剤ジチオスレイトール(DTT)
存在下および非存在下の電気泳動の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/10 8318−4Ｈ 15/10 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/29 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 イェーアン・ダルゴー・ミケルセン デンマーク、デーコー−2650ヴィズオウ レ、エンケアー38番 (72)発明者 クラウス・コー・ニールセン デンマーク、デーコー−2000フレデリクス ベアウ、ロランズヴァイ34番 (72)発明者 ヨーン・エー・ニールセン デンマーク、デーコー−2300ゲベンハウ ン・エス、コンゲディブスアレー１番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サトウダイコンから単離された抗菌タン
   パク質(ただし、キチナーゼ類およびグルカナーゼ類を
   除く)。
2. 【請求項２】 セルコスポラ属の真菌に感染しているサ
   トウダイコンから単離した、請求項１記載の抗菌タンパ
   ク質。
3. 【請求項３】 配列番号２、５および８に記載したもの
   から選択された純粋なタンパク質、または当該タンパク
   質の抗菌活性の実質的な減少なしに１個またはそれ以上
   のアミノ酸が付加され、置換されまたは除去された機能
   的に等しいその類似体、もしくはそのようなタンパク質
   または類似体の混合物。
4. 【請求項４】 配列番号８の８０−１１１残基または配
   列番号２または５のいずれかの２９−７４残基からなる
   純粋なタンパク質、または当該タンパク質の抗菌活性の
   実質的な減少なしに１個またはそれ以上のアミノ酸が付
   加され、置換されまたは除去された機能的に等しいその
   類似体、もしくはそのようなタンパク質または類似体の
   混合物。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のタ
   ンパク質の配列と少なくとも５５％の類似性があるアミ
   ノ酸配列を含む純粋なタンパク質。
6. 【請求項６】 酸性病原性関連４群タンパク質の基本的
   対応物であるタンパク質および／またはキチナーゼおよ
   び／またはグルカナーゼと組み合わせた請求項１〜５の
   いずれかに記載の純粋なタンパク質。
7. 【請求項７】 上記病原性関連タンパク質の基本的対応
   物であるタンパク質が、配列番号１１に記載したアミノ
   酸配列を含むキチン結合ＷＩＮタンパク質、または当該
   タンパク質の抗菌活性および／またはキチン結合活性の
   実質的な減少なしに１個またはそれ以上のアミノ酸が付
   加され、置換されまたは除去された機能的に等しいその
   類似体である、請求項６記載の純粋タンパク質。
8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれかに記載のタンパ
   ク質をコードする配列を含む組換ＤＮＡ。
9. 【請求項９】 配列番号１、３、４、６、７および９か
   らなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求
   項８記載の組換ＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 請求項６または７に記載の酸性病原性
    関連タンパク質の基本的対応物であるタンパク質および
    ／またはキチナーゼおよび／またはグルカナーゼをコー
    ドするＤＮＡ配列をさらに含む、請求項８または９記載
    記載の組換ＤＮＡ配列。
11. 【請求項１１】 組換ＤＮＡが挿入されるべき生物に好
    ましいコドンが、上記生物中で修飾ＤＮＡの発現が、組
    換ＤＮＡのタンパク質コード化成分が内因性である上記
    生物中での非修飾組換ＤＮＡの発現により得られるタン
    パク質と実質的に類似するタンパク質が産生されるよう
    に用いられるように修飾されている、請求項８〜１０の
    いずれかに記載の組換ＤＮＡ配列。
12. 【請求項１２】 請求項８〜１１のいずれかに記載のＤ
    ＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
    するＤＮＡ配列。
13. 【請求項１３】 請求項８〜１２のいずれかに記載のＤ
    ＮＡ配列を含むベクター。
14. 【請求項１４】 系が請求項８〜１２のいずれかに記載
    のＤＮＡを含み、当該ＤＮＡを発現することができる、
    植物および微生物からなる群から選択された生物系。
15. 【請求項１５】 請求項８〜１２のいずれかに記載の組
    換ＤＮＡにより形質転換された植物、特にトウモロコシ
    (corn)またはサトウダイコン。
16. 【請求項１６】 請求項１５記載の植物の子孫および種
    子ならびにこのような子孫の種子(ただし該種子は組換
    ＤＮＡを発現し得るものである)。
17. 【請求項１７】 請求項８〜１２のいずれかに記載のＤ
    ＮＡの発現に由来するタンパク質。
18. 【請求項１８】 請求項１５または１６に記載の植物内
    で組換ＤＮＡが発現することにより製造された抗菌タン
    パク質。
19. 【請求項１９】 請求項１〜７および１６および１８の
    いずれかに記載のタンパク質を１種またはそれ以上含む
    抗菌用組成物。
20. 【請求項２０】 真菌または細菌を請求項１〜７および
    １６〜１９のいずれかに記載のタンパク質または組成物
    にさらすことを含む、抑制方法。