SK20594A3 - Antimicrobial proteins - Google Patents

Description

(57) Izolované z cukrovej repy, s výnimkou chitináz a glukanáz. Medzi takéto proteíny patrí čistý prolcin alebo jeho funkčne ekvivalentný analóg, v ktorom bola Jedna alebo viac aminokyselín pridaných, nahradených alebo odstránených bez toho, aby došlo k podstatnému zníženiu antimikrobiálnej aktivity proteínu, alebo zmesi týchto proteínov či analógov. Pokiaľ je aspoň Jeden z proteínov AX, kombinovaný s proteínom WIN, je pozorovaný synergický antimikrobiálny účinok. Popisuje sa tiež rekonibiuaiitiiá DNA obsahujúca sekvencia, ktorá kóduje proteín podľa vynálezu, vektor obsahujúci túto DNA a transformované rastliny obsahujúce túto DNA. Ďalej sa popisuje antiinikrobiálnv prostriedok, ktorý' obsahuje jeden alebo viac vyššie uvedených proteínov.

PV ΖΟΓAntimikrobiálne proteíny

Oblasť techniky

Vynález sa týka antimikrobiálnych proteínov izolovaných z cukrovej repy.

Doteraiší stav techniky

Medzi antimikrobiálne proteíny patria proteíny (samotné alebo v kombinácii s iným materiálom), ktoré sú toxické alebo spôsobujú inhibíciu rastu ľubovoľného mikroorganizmu, vrátane baktérií, vírusov a najmä húb, pri ľubovoľných podmienkach. Medzi takéto antimikrobiálne proteíny patria proteíny, ktoré vykazujú antimikrobiálnu aktivitu pri kontakte s mikroorganizmom a proteíny, ktoré pôsobia antimikrobiálne v dôsledku ich asimilácie alebo respirácie.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje antimikrobiálne proteíny izolované z cukrovej repy, s výnimkou chitináz a glukanáz.

Je výhodné, aby cukrová repa bola infikovaná hubou rodu Cercospora, a najmä je výhodné, aby proteíny boli izolované z listov cukrovej repy infikovanej Cercospora beticola.

Vynález tiež zahŕňa čisté proteíny vybrané zo skupiny zahrňujúcej proteíny zobrazené v sekvenciách SEQ ID č. 2,5 a S, a ich funkčne ekvivalentné analógy, v ktorých sa jedna alebo niekoľko aminokyselín pridalo, nahradilo alebo odstránilo bez toho, aby došlo k podstatnému zníženiu anti m i k rob i á 1 ne j aktivity proteínu, a zmes týchto proteínov alebo analógov.

Vynález tiež zahŕňa čisté proteiny tvorené zvyškami 80111 v sekvencii SEQ ID č. 8, alebo zvyškami 29-74 buď v sekvencii SEQ ID č. 2 , alebo v sekvencii SEQ ID č. 5, a ich funkčne ekvivalentné analógy, v ktorých sa jedna alebo niekoľko aminokyselín pridalo, nahradilo alebo odstránilo bez toho, aby došlo k podstatnému zníženiu anti m i k rob i á 1 ne j aktivity proteínu, a zmesi týchto prote í nov alebo analógov. Proteiny, ktoré majú sekvencie aminokyselín tvorené zvyškami 29-74 v sekvenciách SEQ ID č. 2 a 5, sú ďalej označené a.ko AX1, respektíve AX2, a proteín, ktorý má sekvenciu aminokyslín tvorenú zvyškami 80-111 v sekvencii SEQ ID č. 8, je ďalej označný ako AX3,1.

Infekcia rastlín hubovými alebo vírusovými patogénmi môže vo vegetatívnych tkanivách indukovať syntézu približne desiatich rodín homológnych proteínov súvisiacich s patogenézou (PR-proteínov) , Tieto PR-proteíny boli rozdelené do piatich skupín. Proteiny PR-2, PR-3 a PR-5 sú beta-1,3-g1ukanáza, chitinázy, respektíve proteiny podobné taumatinu. Pri skupinách proteínov PR-1 a PR-4 neboli určené špecifické funkcie. Proteiny PR-4 sú podobné C-koncovým doménám proheveinu a predpokladaným zraneniam indukovaným proteinom WIN zemiaku, nemajú teda hl-koncovú heveínovú doménu. Medzi zásadité doplnky skupiny 4 kyslých proteínov súvisiacich· s patogenézou (basic counter-part of the acidic pathogenesis-re 1ated 4 group of proteins) teda patria zásadité doplnky proteínov podobných C-koncovým doménám proheveinu a predpokladaným zraneniam indukovaným proteinom WIN zemiaku.

Výhodne je proteinom, ktorý je zásaditým doplnkom týchto proteínov súvisiacich s patogenézou, proteín WIN, ktorý viaže ch i t í n, najvýhodnejšie taký, ktorý možno izolovať zo zrna jačmeňa alebo z listu jačmeňa vystaveného stresu.

Výhodným uskutočnením vynálezu je jeden alebo viac týchto proteínov alebo analógov v kombinácii s proteinom, ktorý je zásaditým doplnkom skupiny 4 kyslých proteínov súvisiacich s patogenézou, a najmä s proteínom WIN, ktorý viaže chitín a ktorý obsahuje sekvenciu aminokyselín znázornenú v sekvencii SEQ ID č. 11, alebo s jeho funkčne ekvivalentným analógom, v ktorom sa jedna alebo niekoľko aminokyselín pridalo, nahradilo alebo odstránilo bez toho, aby došlo k podstatnému zníženiu anti m í k rob i á 1 ne j aktivity alebo/a aktivity pri väzbe chitínu proteínu.

Vynález ďalej zahŕňa vyššie uvedené proteíny, ktoré boli syntetizované in vitro na základe znalosti ich am inokyse1 i nových sekvenc i í.

Vynález ďalej zahŕňa čisté proteíny, ktoré majú sekvenciu aminokyselín, ktorá je aspoň na 55 % podobná sekvencii jedného z proteínov AX podľa vynálezu. Stupeň podobnosti je výhodne aspoň 60 %, výhodnejšie je stupeň podobnosti aspoň 70 % a ešte výhodnejšie je aspoň 80 %.

V kontexte vynálezu sú dve sekvencie aminokyselín, ktoré sú navzájom aspoň na 55 % podobné a sú definované tak, že majú ' pri optimálnom porovnaní aspoň 55 % identických alebo podobných am inokyse1 i nových zvyškov v rovnakej polohe s tým, že sa pripúšťajú až ‘ 4 medzery s podmienkou, zé celkové ' ňf’e je ovplyvnených viac ako 10 aminokyse1 i nových zvyškov.

Pre účely vynálezu platí, že:

alanín, serín a treonín sú navzájom podobné, kyselina glutamová a kyselina asparagová sú navzájom podobné , asparagín a glutamín sú navzájom podobné, arginín a lyzín sú navzájom podobné, izoleucín, leucín, metionín a valín sú navzájom podobné, a fenylalanín, tyrozín a tryptofán sú navzájom podobné.

Vynález ďalej zahrňuje rekombinantnú DNA obsahujúcu sekvenciu, napríklad jednu zo sekvencii vybranú zo skupiny zahr ň u j ú c e j. sekvencie znázornené v S E Q ' ID č. 1,3, 4, 6, 7 a 9, ktorá kóduje jeden alebo niekoľko vyššie uvedených antimikrobiálnych proteínov alebo ich analógov. Rekombinantná sekvencia DNA môže pripadne obsahovať sekvenciu kódujúcu protein, ktorý je zásaditým doplnkom skupiny 4 kyslých proteínov súvisiacich s patogenézou, ako je to popísané vyššie.

Vynález zahrňuje tiež DNA, ktorá hybridizuje pri prísnych hybridizačných podmienkach s rekombinantnou sekvenciou DNA popísanou v bezprostredne predchádzajúcom odstavci. Termín prísne hybridizačné podmienky označuje podmienky, kedy je hybridizácia uskutočňovaná pri teplote od 50 do 60 °C v 2X citrátovom pufre s chloridom sodným (SSC) obsahujúcom 0,1 % dodecylsulfátu sodného (SDS) s následným niekoľkonásobným premytím pri rovnakej teplote, ale v pufre so zníženou koncentráciou SSC, ktorá neovplyvňuje hybridizáciu, ktorá sa uskutočnila. Takouto zníženou koncentráciou pufru je (a) 1 x SSC, O,i % SDS, alebo (b) 0,5 x SSC, 0,1 % SDS, respektíve (c) 0,1 x SSC, 0,1 % SDS.

Vynález ďalej zahrňuje vektor obsahujúci vyššie uvedené rekombinantné sekvencie DNA. Tieto sekvencie sú riadené vhodným promotorom a terminátorom, vrátane takých, ktoré riadia transkripciu proteínov tepelného šoku.

Vynález ďalej zahrňuje biologický systém, najmä rastlinu alebo mikroorganizmus, ktorý obsahuje a umožňuje expresiu vyššie uvedenej rekombinantnej DNA.

Vynález ďalej zahrňuje rastliny transformované pomocou vyššie spomenutej rekombinantnej DNA.

Tieto rastliny možno vytvoriť pomocou známych spôsobov, ktoré zahrňujú regeneráciu rastlinných buniek alebo protoplastov transformovaných DNA podľa vynálezu pomocou radu známych postupov (Ti a Ri plažmidy Agrobacteri a, e 1ektroporáci a, mikvszre’ovanie m ikroprojekti 1 ον (m icro-projecti 1 e :ur:j atď. . ^Trans-:rmované bunky môžu byť vo vhodných prípa:ocn r egener: var· é :o celých rastlín, v ktorých je rekombinant'á ONA stab-’ne začlenená do genómu. Týmto spôsobom možno zís• a ť ta·, jedr: ·: 1 *· čne . ako aj dvojklíčne rastliny, i keď v pošle c n c ~ u . e o e n o m p'·páde je regenerácia celkove ľahšia.

P * í k* ae_: ae ne*, i cky modifikovaných rastlín podľa vynálezu zah'nujú: o\::né p’.diny, vrátane rajčiny, mangovníka, brosky'e. ia:lc-e. nrušk.·. jahody, banánovníka a melónu, poľné plo: i n ;· , ako je rep>a a repica typu canola, slnečnica, tabak, cukp\á -sta. dr::nozrné obilniny ako je pšenica, jačmeň, a r_?ža. k._ki*ica i bavlník, a zeleniny ako je zemiak, mrkva, šalát, k a z u s *. a , k e'. k a r t* i o 1 a cibuľa.

rastlinami sú najmä cukrová repa a kukurica.

Past'ir.· mcžn: transformovať pomocou rekombinantnej sekve n o i e DNA zasahujúcej časť kódujúcu proteín AX1 (zvyšky 2 9‘ sek ··.· e r: - i s E C ID č. 2) alebo jeho funkčne ekvivalentný ana'óc. v kt'.'om sa jedna alebo niekoľko aminokyselín pridalo, r-ahrac'lc alebo ocstránilo bez toho, aby došlo k podstatnému z-nížen'u a nt · ~ i k. r o: · á ľne j aktivity, alebo pomocou rekombinantr.ej se-verc'ž DNA -asanujúcej časť kódujúcu proteín AX2 (zvyšky 29-4 -ekvencii SEQ ID č. 5) alebo jeho funkčne ekvivalentný an a*ó:. v 11or om sa jedna alebo niekoľko aminokyselín orie ale, r. a h * a d i 1 o alebo odstránilo bez toho, aby došlo k p o d staznéru zníženiu a'timikrobiálnej aktivity, alebo pomocou rek.omb inantre j sekveroie DNA obsahujúcej časť kódujúcu proteín A X 3 . 1 ' z v y š k_; 80-1 v s e k. v e n c i i SEQ ID č. 8) alebo jeho funkčne ek.. i va 1 e* tný aralóg, v ktorom sa jedna alebo niekoľko amir.oky se’in p-’dalo. nahradilo alebo odstránilo bez toho, aby to š ‘ o · peds*. atnémt zníženiu antimiktobiálnej aktivity, alebo pomoce·- ssk.enci-e ΣΝΑ obsahujúcej kódujúcu kombináciu dvoch a lečo . i a b e r J: h t ý ·:' t o preteínov A X alebo ich analógov.

Vynález tiež zahŕňa rastliny transformované pomocou vyššie uvedenej rekombinantnej sekvencie DNA, kedy táto sekvencia DNA ďalej kóduje protein, ktorý je zásaditým doplnkom skupiny 4 kyslých proteínov súvisiacich s patogenézou, najmä protein WIN, ktorý viaže chitín (zvyšky 22-146 v sekvencii SEQ ID č. 11), ktorý možno izolovať zo zrna jačmeňa alebo listu jačmeňa vystaveného stresu.

Vynález ďalej zahrňuje potomstvo takto transformovaných rastlín, toto potomstvo exprimuje vyššie uvedené rekombinantné sekvencie DNA, ako aj semená takýchto rastlín a potomstvá.

Vynález ďalej zahrňuje protein získaný expresiou vyššie uvedenej rekombinantnej DNA, vrátane anti m ikrobi á 1 neho proteínu vytvoreného pomocou expresie rekombinantnej DNA vo vyššie uvedených rastlinách.

Vynález ďalej zahrňuje anti mikrobiálny prostriedok obsahujúci jeden alebo viac týchto antimikrobi á 1 nych proteínov.

Vynález tiež zahrňuje spôsob boja proti hubám alebo baktériám, do ktorého patrí ich vystavenie antim ikrobi á 1nym proteínom alebo prostriedkom, ktoré ich obsahujú. -

Vynález ďalej zahrňuje spôsob extrakcie pre získanie antimikrobiálnych proteínov z organického materiálu, ktorý ich obsahuje, a najmä spôsob, ktorý zahrňuje podrobenie materiálu macerácii a extrakcii pomocou rozpúšťadiel. Antimikrobiálne proteíny sa môžu následne vyčistiť pomocou centri fugáci e a chromatografických postupov vybraných zo skupiny zahrňujúcej hydrofóbnu interakciu, výmenu aniónov, výmenu katiónov, gélovú filtráciu a chromatografi u na reverznej fáze.

Výhodne sa tento extrakčný postup uskutočňuje na organickej hmote, ktorá obsahuje listy cukrovej repy infikovanej Cercospora beticola alebo mikroorganizmus, v ktorom je prítomná r ekombi nantná DNA obsahujúca sekvenciu kódujúcu antimikrobiálny proteín alebo jeho a n a 1 ó g podľa vynálezu, alebo taká r e k o m binantná sekvencía DNA, ktorá ďalej obsahuje sekvenciu DNA kódujúcu proteín, ktorý je zásaditým doplnkom skupiny 4 kyslých proteínov súvisiacich s patogenézou. Je vhodné, aby antimikrobiálny proteín vykazoval malý alebo žiadny antimikrobiálny účinok na mikroorganizmus, ktorý je zdrojom organickej hmoty uvedenej v predchádzajúcej vete.

Vynález ďalej ilustruje nasledujúce príklady vrátane znázornených sekvencií a obrázkov.

Popis obrázkov

Obrázok 1 znázorňuje vymývanie proteínov AX1, AX2 a AX3 z katexovej kolóny Mono S so zvyšujúcou sa koncentráciou chloridu sodného (bodkovaná čiara). Symbol t predstavuje čas v minútach a symbol A absorbanciu pri 280 nm.

Obrázok 2 zobrazuje po 1yakry 1 am i dový gél zafarbený striebrom, na ktorom sa uskutočňovala elektroforéza purifi kovaných proteínov AX1, AX2, AX3 a WIN· v prítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS) a redukčného činidla d i t iotre i to 1 u (DTT). Markerové proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou možno vidieť najviac v pravej a ľavej dráhe gélu. Proteín WIN je izolovaný zo zrna jačmeňa. Symbol MW znamená molekulovú hmotnosť, symbol LMW std. predstavuje štandardy proteínov s nízkou molekulovou hmotnosťou.

Obrázky 3A a 3B znázorňujú antifungálnu aktivitu proteínov AX1, AX3 a AX2, pričom je každý z týchto proteínov prípadne v kombinácii s proteínom WIN izolovaným zo zrna jačmeňa. Symbol t predstavuje čas v hodinách, symbol A absorbanciu pri 620 nm a symbol k znamená kontrolu.

Obrázok 4 zobrazuje morfológiu Cercospora beticola, ktorá je následkom ošetrenia proteinom WIN v dávke 28 pg/ml (obrázok B), proteinom AX2 v dávke 8 pg/ml (obrázok C) a kombináciou proteinu AX2 v dávke 8 pg/ml a proteinu WIN v dávke 28 pg/ml (obrázok D). Obrázok 4A znázorňuje morfológiu Cercospora beticola rastúcu v neprítomnosti proteínov WIN a AX2.

Obrázok 5 znázorňuje polyakrylamidový gél zafarbený striebrom, na ktorom sa uskutočňovala elektroforéza p u r í f i k o vaných proteínov AX1, AX2 a AX3 v prítomnosti SDS a v prítomnosti alebo neprítomnosti redukčného činidla ditiotreitolu (DTT). V protiklade k proteinom AX1 a AX2 je elektroforetická pohyblivosť dvoch izoforiem AX3, AX3,1 a AX3,2 silne.ovplyvnená prítomnosťou DTT, čo svedčí o tom, že AX3,1 a AX3,2 pravdepodobne existujú ako diméry, možno aj triméry. Relatívne vysoké zafarbenie pozadia v géle, ktoré možno vidieť v blízkosti proteínových pásov ako zrejmé rozmazanie, je spôsobené oxidáciou proteinu počas elektroforézy, kým zafarbenie na hornej časti gélu je spôsobené zafarbením DTT. Ľahký posun v zreteľnej molekulovej hmotnosti proteínov AX1 a AX2 v prítomností DTT je pravdepodobne spôsobený uvoľnením štruktúry spôsobeným ' rozpadom intramc1eku 1 árnych d ísu1 f i d ických mostíkov, čo vedie k zosílenej väzbe SDS v porovaní s rovnakými proteínmi denaturovanými pomocou SDSv neprítomnosti DTT. Rovnako ako na obrázku 2 sú v géle prítomné markerové proteiny s nízkou molekulovou hmotnosťou (označené na obrázku LMW Std.). Symbol MW znamená molekulovú hmotnosť.

Popis sekvencii

Sekvencia SEQ ID č. 1 zobrazuje sekvenciu cDNA vytvorenej pomocou po 1ymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ktorá kóduje proteín AX1 spolu s jeho signálnym peptidom. Štartovací kodón signálneho peptidu tvoria nukleotidy v polohe 40-42 a térmi načný kodón AX1 sa nachádza v polohe 262-264.

Sekvencia SEQ ID č. 2 znázorňuje aminokyse1 i novú sekven ciu . proteínu AX1 spolu s jeho signálnym peptidom. Signálny peptid pozostáva zo zvyškov 1-28 a maturovaný proteín zo zvyškov 29-74.

Sekvencia SEQ ID č. 3 zobrazuje sekvenciu cDNA vytvorenej pomocou po 1ymerázovej reťazovej reakcie, ktorá obsahuje sekvenciu SEQ ID č. 1, s tým rozdielom, že pred štartovací kodón (nukleotidy 82-84), čo sa týka signálneho peptidu, je umiestnený fragment zosilujúci transláciu (tvorený nukleotidmi 13-79). Sekvencia obsahuje reštrikčné miesto Pst1 tvorené nukleotidmi 1-6 a miesto BamH1 tvorené nukleotidmi 7-12. Nukleotidy 80-86 tvoria miesto Ncol. Terminačný kodón, pokiaľ ide o proteín AX1, je tvorený nukleotidmi 304-306. Reštrikčné miesta Sali a Sphl sú prítomné v polohe 338-343, respektíve 344-349 .

Sekvencia SEQ ID č. 4 zobrazuje sekvenciu cDNA vytvorenej pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ktorá kóduje proteín AX2 spolu s jeho signálnym peptidom. Štartovací kodón signálneho peptidu tvoria nukleotidy v polohe 53-55 a terminačný kodón proteínu AX2 sa nachádza v polohe 275-277.

Sekvencia SEQ ID č. 5 znázorňuje aminokyseli novú sekvenciu proteínu AX2 spolu s jeho signálnym peptidom. Signálny peptid pozostáva zo zvyškov 1-28 a maturovaný proteín zo zvyš kov 29-74.

Sekvencia SEQ ID č. 6 zobrazuje sekvenciu cDNA vytvorenej pomocou po 1ymerázovej reťazovej reakcie, ktorá obsahuje sekvenciu SEQ ID č. 4, s tým rozdielom, že pred štartovací kodón (nukleotidy 82-84), čo sa týka signálneho peptidu, je umiestnený fragment zosilujúci transláciu (tvorený nukleotidmi 1379). Sekvencia obsahuje reštričné miesto Pst1 tvorené nukleotidmi 1-6 a miesto BamHl tvorené nukleotidmi 7-12. Nukleotidy 80-86 tvoria miesto N c o 1. Terminačný kodón, pokiaľ ide o proteín AX2, je tvorený nukleotidmi 304-306. Reštrikčné miesta

Sali a Sph1 sú prítomné v polohe 352-357, respektíve 358-363.

Sekvencía SEQ ID č. 7 zobrazuje sekvencíu cDNA vytvorenej pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ktorá kóduje proteín AX3,1 spolu s jeho predpokladaným signálnym peptidom. Štartovací kodón signálneho peptidu tvoria nukleotidy v polohe 23-25 a terminačný kodón proteínu AX3,1 sa nachádza v polohe 356-358.

Sekvencía SEQ ID č. 8 znázorňuje aminokyse1 i novú sekvenciu nepripraveného translačného produktu kódovaného cDNA uvedenou v sekvencii SEQ ID č. 7. Tento predpokladaný preproteín zahrňuje maturovaný proteín AX3,1 tvorený zvyškami SO-111.

Sekvencía SEQ ID č. 9 zobrazuje sekvencíu cDNA vytvorenej pomocou po 1ymerázovej reťazovej reakcie, ktorá obsahuje sekvenciu SEQ ID č. 7, s tým rozdielom, že pred štartovací kodón (nukleotidy 82-84), pokiaľ ide o signálny peptíd, je umiestnený fragment zosilujúci transláciu (tvorený nukleotídmi 13-79). Sekvencía obsahuje reštrikčné miesto Psti tvorené nukleotídmi 1-6 a miesto BamH1 tvorené nukleotídmi 7-12. Nukleotidy 80-86 tvoria miesto Nco1. Terminačný kodón, pokiaľ ide o proteín AX3,1, je tvorený nukleotídmi 415-417. Reštrikčné miesta Sali a Sph1 sú prítomné v polohe 473-484.

Sekvencía SEQ ID č. 10 znázorňuje cDNA obsahujúcu gén, ktorý kóduje proteín WIN jačmeňa.

Sekvencía SEQ ID č. 11 znázorňuje am inokyse1 i novú sekvenciu proteínu WIN jačmeňa spolu s jeho signálnym peptidom. Signálny peptid pozostáva zo zvyškov 1-21 a maturovaný proteín zo 'zvyškov 22- 146 .

Sekvencía SEQ ID č. 12 zobrazuje nukleotidovú sekvencíu, ktorá kódu je protein WIN jačmeňa, vytvorenú pomocou polymerázovej reťazovej reakcie. 5--oblasť sekvencie obsahuje reštrikčné miesta P s 11 , BamHl a N c o 1. Nukleotidom v polohe 62 bol

I 1 v pôvodnom k 1 oné C namiesto G. ľmena C na G nemení aminokyselinovú sekvenciu proteínu a bola uskutočnená preto, aby sa v tejto polohe odstránilo miesto N c o 1. Štartovací kodón, pokiaľ ide o protein WIN, tvoria nukleotidy 12-14 a terminačný kodón nukleotidy 450-452.

Sekvencia SEQ ID č. 13 znázorňuje v podstate nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID č. 12, s tým rozdielom, že pred štartovací kodón génu WIN (nukleotidy 82-84) je umiestnený fragment zosilujúci transláciu (tvorený v sekvencii SEQ ID č. 13 nukleotidmi 13-79). Terminačný kodón je tvorený nukleotidmi 520-522.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Purifikácia proteínov AX 1-3 z listov cukrovej repy infikovanej Cercospora beticola

P r o t e í n y AX 1-3 sa izolujú z listovej hmoty cukrovej repy, odrody Turbo alebo Rhizor, prirodzene infikovanej Cercospora beticola. Listy, ktoré majú päťdesiat alebo viac nekrotických lézií boli zobrané na poli v Taliansku a skladovali sa až do extrakcie pri teplote 4 °C. Všetky kroky sa uskutočňujú pri 4 °C. Centri fugácie v priebehu purifikácie sa uskutočňujú pri 20 000 g 20 minút na centrifúge Centrikon typ H-401B.

Príprava bezbunečných extraktov kg listov cukrovej repy infikovanej Cercospora beticola sa homogenizuje v 4 litroch nátri ume itrátového pufru s pH 5,0 obsahujúceho ditiotreitol (1 nM), benzamidín (1 nM) (východiskový pufer) a 200 g ionomeniča Dowex 1x2 (100 pm). Homogenát sa pred cent r i fugáciou prelisuje cez dvojitú vrstvu nylonovej gázy s veľkosťou ôk 31 pm.

2

Zrážanie teplom a síranom amónnymi

S u p e r n a t a n t získaný po centrifugácii sa zahrieva 20 minút na teplotu 50 °C a po ochladení na 4 °C sa oddelí centifugáciou a odstráni zrazenina. K supernatäntu sa pridá pevný síran amónny až po dosiahnutie 90 % nasýtenia. Po centrifugácii sa vyzrážané proteíny rozpustia vo východiskovom pufre v množstve 1 ml pufru na 10 g východiskového materiálu.

Proteíny A X1, A X 2 a AX3 sa získajú purifikáciou z proteínovej frakcie vyzrážanej síranom amónnym. Po so 1 u b i 1 i zácí i sa proteínový roztok dialyzuje proti 10 mM Tris-pufru s pH 8,0 obsahujúcemu ditiotreitol (1 mM) a benzamidín (1 mM). Denaturované proteíny sa odstránia pomocou centri fugácie a supernatant sa nanesie na kolónu 50 ml rast Flow Sepharose Q a na chitínovú kolónu (pripravenú podľa popisu v WO92/17591), pričom sú tieto kolóny zapojené v sériách. Kolóny sa pred nanesením supernatantu ekvilibrujú s Tris-pufrom.

Nenaviazané proteíny sa vymyjú pomocou rozsiahleho premývania Tris-pufrom. Frakcia nenaviazaných proteínov (200 ml na kg extrahovaného rastlinného materiálu) sa doplnia tak, že obsahuje pufer H tvorený IM síranom amónnymi s 10 % glycerolu . (objem/objem), 1 mM d i t iotre i to 1om a 0,1M d ihydrogénfosforečnanom draselným, pH 7,5. Proteínový roztok sa inkubuje s 50 ml Phenyl Sepharosy (Pharmacia) v pufre H počas 2 hodín pri izbovej teplote. Suspenzia sa nanesie na vršok kolóny pripravenej s ďalšími 50 ml Phenyl Sepharosy ekvi 1 ibrovanej s pufrom H. Zistilo sa, že eluát z kolóny vykazuje antifungálnu aktivitu, kým, proteíny vymyté z kolóny pufrom H bez síranu amónneho túto antifungálnu aktivitu nevykazujú. Všetky časti purifikácie sa uskutočňujú pri teplote 4 °C, s výnimkou stupňov s Phenyl Sepharosou .

Eluát z kolóny s Phenyl Sepharosou (400 ml) sa intenzívne dialyzuje proti 20nM octanu sodnému s 1mM d i t iotre i t o 1om, pH

3

5,0 a potom sa nanesie na kolónu C-CL6B Sepharosy (Pharmaci a) . Táto kolóna sa premyje pufrom I, ktorý obsahuje 50nM octan sodný s 10 % glycerolu (objem/objem) a 1mM'd i t iotrei to 1om, pH 5,0, a na záver sa vymyje O,25M chloridom sodným v pufre I. Frakcia obsahujúca proteín sa spojí a polovica takto spojenej frakcie sa podrobí gélovej filtrácii na kolóne G-75 Sephadex (Pharmacia, 2,5 x 70 c m) ₃ ekvilibrovanej s 50m M kyselinou m o r f o 1 ínetánsu1 fónovou (MES), pH 6,0. Odoberajú sa frakcie s objemom 10 ml. Frakcie 26-30 vykazujú vysokú antifungálnu aktivitu a doplnia sa tak, že obsahujú 5 % betaínu (hmotnosť/ objem).

Frakcie 26-30 z kolóny G-75 Sephadex sa podrobia vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografi i (FPLC) s výmenou iónov na katexovej kolóne Mono S (H/R 5/5, Pharmacia) ekvilibrovanej s pufrom A tvoreným 50mM MES s pH 6,0 obsahujúcom 5 % betaínu (hmotnosť/objem). Naviazané proteíny sa vymyjú použitím gradientu 0-0,3M chloridu sodného v 15 ml pufru A. Vymyjú sa tri hlavné proteínové piky, pričom každý z nich vykazuje antifungálnu aktivitu (obrázok 1). Tieto piky sú postupne označené AX1, AX2 a AX3 .

Purifikácia proteínov WIN z jačmeňa

Proteín WIN (WIN N) sa získa purifikáciou zo zrna jačmeňa alebo listu jačmeňa vystaveného stresu, ako popísali Kragh a kol. (Plánt Sci. 71, 65-68 (1990)) alebo Heaaard a kol. (Febs Letters, 307, 389-392 (1992)).

Obrázok 2 znázorňuje striebrom zafarbený po 1yakr y 1 am í dový gél s SDS proteínu WIN-N izolovaného zo zrna jačmeňa, spolu s proteínmi AX1, AX2 a AX3 vymytými z kolóny Monos S. Každý z proteínov AX sa vymyje ako frakcia, ktorá pri elektroforéze poskytuje jediný pás (i keď v prípade AX3 je ľahko rozmazaný).

Sekvenovanie proteínov AX

Každý, z' proteinov AX sa karboxy-mety1 uje a podrobí sa kvapalinovej chromatografi i s vysokou rozlišovacou schopnosťou (HPLC) na reverznej fáze na kolóne Progel TSK Octadecy1-4PW (Supelco Inc., 150 x 4,6 mm). Rozpúšťad1ový systém tvoria A: 0,1 % kyselina tri f 1uóroctová vo vode a.B: 0,1 % kyselina trifluóroctová v acetón itri 1 e. AX1 a AX2 sa vymyjú ako jediné symetrické piky, a AX3 sa vymyje ako dva piky, pričom za hlavným pikom'skoro nasleduje menši pík, čo svedči o tom, že existujú dve formy, označené A X 3,1 a AX3,2. P r o t e i n y A X1, A X 2 a AX3,1 sa potom sekvenujú pri použití štandardných známych postupov.

Anti m i k rob i á 1 na aktivita AX1 - AX3

Inhibícia rastu húb sa meria na mikrotitračných doštičkách s 96 jamkami pri 620 nm, v podstate ako je to popísané vo WO 92/17591.

Proteíny AX1, AX2 a AX3 sa buď samotné, alebo v kombinácii s WIN N (ktorý sa získa purifikáciou zo zrna jačmeňa alebo listu jačmeňa vystaveného stresu, ako popísali Hejgaard a kol. (FEBS Letters, 307, 389-392 (1992)) inkubujú so spórami Cercospora beticola. Testovaná· zmes s objemom 240 alebo 260 μΐ obsahuje 100 μΐ zemiakovej dextrózy (potato dextrose broth, Difco), 40 alebo 60 μΐ vzorky proteínu (alebo pufru ako kontroly) v lOOmM Tris-pufre a 20mM chloride sodnom (pH 8,0) a približne 400 spór v 100 μΐ vody. M i k roti t račné doštičky sa uzavrú páskou, aby sa zabránilo odparovaniu a kontaminácii a následne sa inkubujú pri izbovej teplote na trepačke s 200 otáčkami za minútu. Ako je znázornené na obrázku 3B, meria sa každý deň počas ôsmich dní absorbancia pri 620 nm a vytvorí sa graf závislosti absorbancie od času pre každú koncentráciu proteínu. Stanovi sa koncentrácia (v pg proteínu/ml výslednej testovanej zmesi), ktorá má za následok 50 % inhibíciu rastu po 72 hodinách a označí sa Iso. ’

5 najmä stačia

3B, každý z proteínov AX in rast Cercospora beticola. Výrazná je proteínu AX2, v prípade ktorého μΜ) na 50 % inhibíciu rastu Samotný proteín WIN N vykazuje na 50 % inhibíciu beticola po 72 blizne 11 μΜ) má za následok

Ako je vidieť na obrázku 3A a výrazne znižuje antifungálna aktivita μα/m 1 (približne 0.5 (I so) po 7 2 hodinách inkubácie, miernu antífungálnu aktivitu, hodinách je nutná koncentrácia 160 (údaje nie sú uvedené). Kombinácia podstatne zosilené a predĺžené obmedzenie zrejmé z obrázku 3A, je rastovo inhibičný potenCercospora beticola väčší ako potenciál AX1.

Cercospora pg/ml AX2 a (pr i WIN N rastu huby. Ako je c i á 1 AX2 voči e AX2 a WIN N nevykazujú fungicídnu beticcla, ale skôr, v porovnaní s predlžovania hubových zreteľne zmení moraktivitu v okontrolami, hýf. Nás 1edZdá sa, či Cercospora podstatne znižujú rýchlosť kom ošetrenia AX2 alebo/a WIN N sa tiež foTóg i a huby (viď obrázok 4).

nost i WIN ktoré sú

Proteíny AX1, AX2 a AX3 (a ich zmesi), pri aplikácii proti Cercospora beticola, na klíčenie peľu cukrovej toxické pre rastlinné bu-nky.

N, ďalej vykazujú účinné škodí i v ý o tom, že vplyv nie sú prípadne v pritomv koncentráciách, malý alebo žiadny repy, čo svedčí

Antifungálna aktivita proteínov AX proti patogénom kukurice

Pri proteínoch AX podľa vynálezu sa testovala ich antifungálna aktivita proti radu patogénov kukurice. Čo sa týka výsledkov uvedených v tabuľkách 1 a 2, uskutočni sa test proteinov AX, vzhľadom na patogény kukurice, nasledovne. 5 μΐ roztoku obsahujúceho proteíny v uvedených koncentráciách sa asepticky prenesie do jamky sterilnej m i k roti t račnej doštičky so zaobleným dnom. Všetky ošetrenia sa jeden krát opakujú. Ako kontrola sú do pokusu v súlade s bežnou praxou zahrnuté n e i n o kulované a inokulované kultivačné médiá bez testovaného proteínu. Ku každej vzorke sa aseptický pridá 100-150 spór v 5,0 μΐ

6 dvojnásobne koncentrovanej zemiakovej dextrózy (PDB).

Po miernom trepaní za účelom premiešania vzorky proteínu a suspenzie spór sa spojenie veka a doštičky obalí dvojitou vrstvoufólie, aby sa minimalizovalo vysušenie, a takto obalená mikrotitračná doštička sa inkubuje pri teplote 19 ± 0,2 °C s fotoperiódou 16 hodín..

Každých 24 hodín sa v jednotlivých jamkách vyhodnocuje klíčenie spór a rast myce 1 i a. Po 120 hodinách sa stanoví úroveň antifungálnej aktivity. Výsledky sú uvedené v tabuľkách 1 a 2. Tabuľka 1 udáva minimálnu koncentráciu proteínu nutnú na dosiahnutie rastovo inhibičného účinku na huby a tabuľka 2 udáva koncentráciu proteínu. ktorá spôsobuje 50 % inhibíciu rastu v porovnaní s kontrolnými kultúrami, v ktorých sú huby pestované za neprítomnosti testovaných proteinov.

Tabuľka 1

Antifungálna aktivita AX1, AX2 a WIN N proti vybraným patogénom kukurice

Patogén	Minimálna koncentrácia spôsobujúca inhibíciu (pgPml)
WIN N	AX 1	AX2
Bioplaris maydis	n i	20	30
Cercospora zeae maydis
Co11etotr ichum graminicola	n i	50	50
Diplodia maydis	64	1 1	n i
Exserohilum turcicum kmeň 1	n i	1 1	98
txserohilum turcicum kmeň 2	. 193	33	n i
Fusarium graminearum	n i	Λ ·*> 0 O	33

7

Pokračovanie tabuľky

Fusarium moniliforme	n i	h i	n i
G i bbere 11 a zeae	n i	n i	n i

Legenda n i” znamená, že proteiny neinhibujú rast huby

Čo sa týka výsledkov uvedených v tabuľke 3, uskutoční sa test proteínov AX a WIN N voči uvedeným patogénom nasledovne. Mvcelium uvedených húb sa disperguje v kvapke tekutého agaru, ktorý sa potom nechá stuhnúť. Kvapôčky pevného agaru obsahujúce zapuzdrené mycelium sa potom pokryjú testovaným proteínom v špecifikovanom množstve. Po 5 dňoch inkubácie sa za vlhka stanoví rozsah rastu mycelia v porovnaní s kontrolami, v ktorých kvapôčky agaru obsahujúce hubové mycelium nie sú pokryté testovaným proteínom. Výsledky uvedené v tabuľke 3 udávajú množstvo proteínu nutné na dosiahnutie 50 % inhí bicie rastu hubových patogénov.

δ

Tabuľka 2

Množstvo p - o t e í n u nutné na dosiahnutie 50 % i n h i b í c i e rastu hubových patogénov uvedených v tabuľke 1

Patogén		AX1 AX2 WIN N
		(Koncentrácia proteínov v pg/ml spôsobujúca viac ako 50 % inhibíciu rastu)

I

C. o 1' ‘ e t c· g r a m n i c	t r ‘ z h u m o 1 a	50	50	n i
F u s a r i u m	m z n i 1 i f o r m e	n i	n i	n i
F u s a r i u m	graminearum	33	33	n i
G i b b e r e 1	i a z e a e	n i	n i	n i
D i plodia	m a y d i s	1 1	n i	64
5 i p o * a r ·	s maydis	2 0	33	n i
Ξ x s e r c h ·	1 u m t u r c í c u m	33	n i	193

Legenda:

” ίi ” ramená, že ρ r o t e í n y n e i n h i b u j ú rast huby

Percento i nh i b í c í e rastu húb týkajúce sa ďalších patogénov špecifikovanými koncentráciami proteinov

Patogén	Koncentrácia prote inu	( P9 /m 1 )
	AX1	AX2		WIN N
	20	20 40	20	40
		Inhibicia rastu	(%)
Mon ilinia fructigena	80	80	n i
Cochliobolus sativus	30	30	n i
Pseudocercospore 11 a herpotrichoi des	30	30		30
Pyricularia oryzae	n i	2 0	n i
Thizoctonia solani	n i	10	n i
Fusarium culmorum	n i	10	n i
Leptosphaeria nodorum	n i	10	n i
Botrytis cinerea	n i	10	n i

Legenda:

ni znamená, že proteiny v testovaných koncentráci ách neinhibujú rast huby

Ako je zrejmé z obrázkov 3A, 3B a 4 A - D a z tabuliek 1 - 3, pôsobia proteiny AX1, AX2 a AX3, pripadne v kombinácii s WIN N, fungiostaticky. V dôsledku toho sú schopné dodávať rastlinám, najmä cukrovej repe a kukurici, vysoko zlepšenú rezistenciu voči chorobám (najmä hubovým infekciám), vrátane chorôb, ktoré spôsobuje Cercospora b e t í c o 1 a a rad patogénov kukurice.

Sekvencie' proteínov

Sekvencie SEQ ID č. 2, 5 a 8 znázorňujú sekvencíe aminokyselín proteínov AX1, AX2, repsektíve AX3,1. Tieto sekvencíe zahrňujú príslušné signálne peptidy. V prípade AX1 a AX2 sú signálne peptidy tvorené zvyškami 1-28 a maturované proteiny zvyškami 29-74. V prípade AX3,1 sa v predpokladanom preproteíne nachádza maturovaný proteín AX3,1, tvorený zvyškami 80-111. Sekvencia SEQ ID č. 11 zobrazuje sekvenciu aminokyselín proteinu WIN jačmeňa spolu s jeho signálnym peptidom.

Zo sekvencii aminokyselín proteínov AX1 a AX2 je jasné, že ide o príbuzné proteiny, pričom každý z nich obsahuje 46 aminokyselín.

Zo sekvencie SEQ ID č. 2 je sekvencia proteinu AX1 bez jeho signálneho p e p t i d u:

A1 a

I T e

C y s

Lys

Lys

Pro

Ser

Lys

Phe

Phe

Lys

Gly

A1 a

Cys

G1 y

Ar g

A sp

A1 a

Asp

Cys

Glu

Lys

A1 a

Cys

Asp

Gin

Glu

As n

I r P

Pro

G 1 y

Gly

Val

Cys

Val

Pro

Phe

Leu

Ar g

Cys

Glu

Cys

G 1 n

Ar g

Ser

Cys

Zo sekvencie SEQ ID č.

je sekvencia proteinu AX2 bez signálneho peptidu:

A 1 a

Thr

Cys

Ar g

Lys

Pro

Ser

Met

Tyr

Phe

Ser

Gly

A1 a

Cys

Phe

Ser

Asp

Thr

Asn

Cys

Gin

Lys

Ala

Cys

Asn

Ar g

Glu

Asp

Trp

Pro

Asn

Gly

Lys

Cys

Leu

Val

Gly

Phe

Lys

Cys

Glu

Cys

Gin

Ar g

Pro

Cys

Zo

sekvencie SEQ

ID

č.

8 je

sekvencia

proteí n u

AX3 ,

, 1 bez

jeho signálneho

pept i du:

A r g

Cys

íle

Pro

Cys

Gly

G1 n

Asp

Cys

íle

Ser

Ser

A r g

Asn

Cys

Cys

Ser

Pro

Cys

Lys

Cys

Asn

Phe

Gly

Pro

Pro

Val

Pro

A. r g C y s T h r 4 s η .

Prvých 45 zvyškov z N - k o n c a každého p r o t e í n u sa stanovilo pomocou sek veno varia aminokyselín. 46. zvyšok, AX1 aj AX2, sa identifikoval ako cyste í n na základe sekvenovania nukleotidov príslušných cDNA (sekvencia SEQ ID č. 1, respektíve 4) získaných pomocou ρο 1 ymerázovej reťazovej reakcie, pričom sa brala do úvahy aj h o m c 1 ó g i a s .príbuznými p r o t e í n m i z iných rastlín. Proteín AX3,1, ktorý je zásaditým proteínom, obsahuje 32 aminokyselín, ktorých sekvencia je v súlade s cDNA, ktorá sa získala pomocou pol ymeračovej reťazovej reakcie (viď sekvencia SEQ ID č. 7).

Údaje o sekvencií aminokyselín proteínov A X bolí okrem toho potvrdené pomocou analýzy am i nokyse1 i nového zloženia príslušných proteínov (viď tabuľka 4), ako aj pomocou hmotovej spektrometri e čistých proteínov porovnávané s ich molekulovou hmotnosťou odvodenou od génov, ktoré ich kódujú (viď tabuľka 5). Na základe analýzy pomocou hmotovej spektrometri e sa zdá, že AX2 (pravdepodobne v ňom prítomný zvyšok met i on inu) je ox i dovaný, čo je prekvapujúce. Takáto oxidácia môže byť dôsledkom uvedenej hmotovej spektrometrí e.

P r o t e í n y A X' a A X 2 vykazujú určitú podobnosť s e k v e n c i e s gama-tionínmi z pšenice a jačmeňa, s predpokladanými inhibítormi a 1 f a - a m y 1 á z y hmyzu z ciroku a s antífunaálnymi proteínmi izolovanými zo semien reďkvi. Je známe, že proteíny reďkvi sú silnými antifungálnymi proteínmi a predpokladá sa, že ínhibujú rast húb narušovaním signalizácie pomocou iónov vápnika. Proteíny AX1 a AX2 však vykazujú malú podobnosť sek vene i e s týmito proteínmi reďkvi. Tieto proteíny reďkvi sú naviac aktívne prevažne v oligomérnej forme (ako triméry alebo tetraméry), zatiaľ čo gélová filtrácia a elektroforéza pri použití d o d e cylsulfátu sodného pri neprítomnosti d i t iotr e i to 1 u alebo merkaptoetanolu svedčí o tom, že proteíny AX1 a AX2 sú monomérne (viď napríklad obrázok 5). Proteín AX 3,1 nevykazuje podstatnú sekvenčnú h o m o 1 ó g i u s inými proteínmi.

Aminokyselinové zloženie proteínov A X

Zvyšok	AX'	AX2	AX3
A s p	• 4,0	5,0	4, 1
Thr	0, 1	2,0	1,0
Ser	2 , 1	3, 1	3,0
G1 x	5,7	4,4	1, 1
Pro	3,2	3,2	5 , 1
G1 y	4,3	.....3,2	7, i
Ala	4,1	3,1	0,0
Cys	6,9	6,9	6,2
Val	2 , C	1 , 1	1,0
Met	0,0	0,9	0,0
íle	1,0	0,1	2,0
L e u	1, 1	1 , 1	0,0
Ty r	0,0	0,9	0,0
Phe	A « J , I	3,0	1,0
H i s	0,0	0,0	0,0
Lys	5 , 1	4,0	1,0
Ar g	3,2	3 , 1	3,2
Trp	nestanovené	nestanovené	nestanovené

Tabuľka 5

Molekulové hmotnosti AX1, AX2 a.AX3,1 stanovené hmotovou spektrometriou (ES-MS) a odvodené z génov, ktoré ich kódujú

Proteín Molekulová hmotnosť (Da)

ES-MS Odvodené z cDNA (-8H*)

AX 1	5 078,1	5086 -	8	= 5078
AX2	5 193,4	5185 -	8 + 16	= 5 193
AX3 , 1	3 452,5	3460 -	8	= 3452

Tvorba transformovaných rastlín

Gény kódujúce proteíny AX sa introdukujú do rastlín. Na základe génovo špecifických primérov sú z príslušnej mRNA pri použití po 1ymerázovej reťazovej reakcie, konkrétne pomocou rýchlej amplifikácie 3'-koncov cDNA (3'-RACE) nasledované rýchlou amp1 i f i káciou 5'-koncov cDNA (5'-RACE), syntetizované kódujúcou oblasťou génov kódujúcich AX1, AX2 a AX3, 1 . Po pridaní vhodnej promotorovej sekvencie (ako je 35S) a terminátorovej sekvencie (ako je 35S), sa gény kódujúce proteíny AX introdukujú do vektora pre ransformáciu rastlín. Je výhodné introdukovať sekvencíu zosilujúcu transláciu do vektora do polohy 5' od oblasti kódujúcej proteín (viď napríklad sekvencía SEQ ID č. 3, 6 a 9). Vektor tiež obsahuje vhodné známe markerové gény. Vektor prípadne obsahuje gén kódujúci proteín WIN, ktorý sa získal z listu jačmeňa vystaveného stresu alebo zo zrna jačmeňa (ak je to žiadúce spolu so sekvenciou zosilujúcou transláciu, viď napríklad sekvencía SEQ ID č. 13), alebo/a gén kódujúci chitinázu alebo/a glukanázu. Výhodnou chitinázou je chitináza 4 popísaná v prihláške vynálezu PCT(DK92/00108 (zverejnenej pod číslom WO/92/1 759 1 ) . Týmito vektormi možno transformovať napríklad Agrobacterium tumefaciens. Takto transformované Agrobacteri um sa potom nechá pôsobiť na rastlinné bun4 ky, a 2 rastlinných buniek transformovaných týmto spôsobom sa regeneráciou získajú celé rastliny, v v jadre stabilne začlenený do genómu. hy, že DNA kódujúca proteín AX (alebo ktorých je Treba však kombináciu nový materiál vziať do úvatýchto proteínov), a prípadne ďalej kódujúca proteín WIN alebo/a chitinázu alebo/a glukanázu (alebo kombináciu takýchto proteínov), možno introdu kovať do.rastlinných buniek pomocou iných známych postupov, vrátane vstréľovania mikroprojektilov (micro-projectile g u n 1 , elektroporácie, elektrotransformácie, mikroinjektáže a t ď., a že regenerácia transformovaných rastlinných buniek sa uskutočňuje použitím známych postupov, vrátane ošetrenia buniek cvtokinínmi v prípade, že je nutné alebo žiadúce z dôvo dov zlepšenia regeneračnej frekvencie.

Takto bol vytvorený transgenický zemiak a cukrová repa, čo sa týka proteínu AX. Rekombinantná sekvencia DNA obsahujúca napríklad sekvenciu vybranú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie SEQ ID č. 3,6a 9, sa introdukujú použitím známych postupov (vrátane kontransformácie) do zemiaku alebo cukrovej repy. Treba vziať do úvahy, že alternatívne možno použiť r e k o m b i nantnú DNA obsahujúcu sekvencie znázornené v SEQ ID č. 1, 4 alebo 7, i keď tieto sekvencie neobsahujú prvok zosilujúci transláciu v polohe 5' voči štartovaciemu kodónu, kódujúcu oblasti signálnych p e p t i d o v rôznych proteínov AX. Expres i a génu kódujúceho napríklad AX2 sa zistí pomocou identifikácie transkripčného produktu génu AX2. Prítomnosť proteínu v rastline sa ďalej preukáže imunochemicky použitím protilátok vytvorených proti autentickej vzorke proteínu. Z dôvodov zvýšenia imunogenicity proteínov možno tieto proteíny pred injekciou do králikov naviazať na toxoid záškrtu ako na nosič alebo spojiť s poly - 1 y z í n o m .

Vytvoria sa extrakty transgenického zemiaku a cukrovej repy, čiastočne sa p u r i f i k u j ú a v súlade s vyššie popísaným mikrotitračným testom sa testuje ich schopnosť inhibovať rast Cercospory.

Extrakty získané z transgeniekých rastlín, vzhľadom na proteín A X, podstatne í n h i b u j ú rast huby v porovnaní s podobnými extraktmi získanými z kontrolných netransgeníckých zemiakov a cukrovej repy.

Okrem toho možno vhodné mikroorganizmy (t.j. také, v ktorých m i e je produkcia pfoteinov AX podstatne toxická) transformovať vektorom obsahujúcim gén (alebo gény) kódujúci proteín AX (a 1 ebo. kombináci u proteinov AX) tak, že transformovaný mikroorganizmus produkuje tento proteín. Mikroorganizmy môžu ďalej obsahovať gén kódujúci iné proteiny, ako je proteín WIN podobný proteínu znázornenému v sekvencií SEQ ID č. 11 alebo /a rôzne chitinázy alebo/a glukanázy. Výhodné je najmä, ak takýmto iným proteínom je chitináza 4, ktorá je popísaná v prihláške vynálezu PCT/DK92/00108 (zverejnenej pod číslom WO92/17591).

Tieto mikroorganizmy možno potom použiť na ničenie rastlinných patogénov. Transformované mikroorganizmy napríklad možno vysušiť a aplikovať vo forme spraya na infikované rastliny alebo na rastliny ohrozené infekciou.

Zobrazenie sekvencií

Informácie o sek venci i SEQ ID č. 1:

(i) charaktér istiky sekvencie:

(A) dĺžka: 437 párov zásad (B) typ: kyselina nukleová (C) počet reťazcov: dvojreťazcová (D) topológia: neznáma (i i ) typ molekuly: c D N A (i i i) nie je hypotetická

(iii)	nie je anti-senza
(vi )	pôvodný zdroj:
	(A) organizmus:	Beta vulgaris
(i x )	v 1astnost i:
	(A) názov/kľúč:	CDS
	(B) lokácia: 40,	, . 264
(x i)	znázornenie sekvencie	SEQ ID é. 1:

ATACGCÄTTT GTTTCAAAGT TCÄAACAAAG ACCAAAAAA ATG GAG AAG AAA TTC Mec Glu Lvs Lvs ?he 1 *5

GGG

JT'T'Q

CTT

TTG

CTA

CTC

TTC

GTA

TTT

GCT

TCT

GAG

ATG

AAT

102

Phe

c-ly

Leu Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Phe

Val

Phe

Ad. Ä

'Šer

Glu

Met

Asn

10

15

2 Ô

GTG

ACT AAG

GTT

GAT

GGT

C-CA

ATA

TGC

AAG

AAA

CCA

AGT

AAG

TTC

150

íle

Val

Thr Lvs

Val

Asp

Gly

Ala

íle

Cys

Lys

Lys

Pro

Ser

Lys

Phe

25

30

35

AAA

GGT GCT

TGC

GGT

AGA

GAT

GCC

GAT

TGT

GAG

AAG

GCT

TGT

GAT

1SS

Prie

Lys

Gly Ala

Cys

Gly

Arg

Asp

Ala

Asp

Cys

Glu

Lys

Ala

Cys

Asp

45 50

AA GAG AAT TGG CCT C-GC GGA GTT TGT GTA CCC TTT CTC AGA TGT GAA245

Ír. Giu Asr. Trp Pro Gly Gly Val Cys Val Pro Phe Leu Arg Cys Glu oô 6065

TGT CAG AGG TCT TGC TAAGCACTGC AAGCCACGGA CC-ATAAAAAG AAGTACTTGT3 01

Cys Gin Arg Ser Cys

7075

AATGAAGCTA.TGGGTCAATA

TTTTTCAATC CTATAATATT AAATAÄATTG

361

TTTAAGTGTG TAATAAÄTCT ACGTGGC-TTT AÄACTCCACA ATTGCTTTTC- ÄÄÄTÄATGAT

421

TTACATATAA GTTTCA

Informácia o sekvencii SEQ ID č.

charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka:

aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) znázornenie sekvencie SEQ ID č. 2:

Mec

Glu

Lys

Lys

Phe

Phe

r* *· . . v

Leu

Leu

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Phe

Val 15

Phe

Ala

Ser

Glu

Mar

Asn

Zle

Val

Thr

Lys

Val

.Asp

Gly

Ala

Zle

Cys

Lys

20

25

30

*

Lvs

Pro

Ser

Lys

Phe

Phe

Lys

Glv

.Ala

Cys

Gly

.Arg

Asp

Ala

Asp

Cys

3 5

40

45

•

C-lu

Lvs

.Ala

Cys

Asp

C-ln

Glu

Asn

Trp

Pro

C-lv

Glv

Val

Cys

Val

Pro

50

55

50

Phe

Leu

Cys

Glu

Cys

Gin

Ar~

Ser

Cys

“0

	Informácie	0 s e k v
	(i)	charak (A)
		(B) (C) (D)
*	(ii)	typ mo
•	(iii)	nie je
	(iii)	nie je
	(Vi)	pôvodn (A)
	(x i)	znázor

enc i i SEQ ID č. 3:

t e r i s t i k y sekvencie:

dĺžka: 349 párov zásad typ: kyselina nukleová počet reťazcov: dvojreťazcová topológia: neznáma e k u 1 y : c D N A hypotetická anti-senza ý zdroj:

organizmus: Beta vulgaris nenie sekvencie SEQ ID č. 3:

AAGAAGCGTC GACGC.ATGC

Informácia o sekvenci i

SEQ ID č.

(i) charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka: 492 párov zásad (B) typ: kyselina nukleová (C) počet reťazcov: dvojreťazcová (D) topológia: neznáma

(i i)	typ molekuly: cDNA
( i i i )	nie je hypotetická
( i i i )	nie je anti-senza
(vi )	pôvodný zdroj;
	(A) organizmus:	Beta vu 1 gar i s
( ix )	vlastnosti:
	(A) názov/kľúč:	CDS
	(B) 1 o k á c i a: 53.	.277
(Xi)	znázornenie sekven	cie SEQ ID č.

GAG Glu

AAA Lys

AAA Lys

T'T'Q 5

φφφ Phe

C-GG C-ly

0ΦΦ Leu

ΦΦ^ Leu

CTT Leu 10

Leu

CTA Leu

CTC Leu

Phe

Val

TTT Phe

C-CT

103

TCT

GAG

CTG

AAC

ATG

GTG

GCT

GAG

QTT

CAA

GGT

GCC

ACT

AGA

Z X Z

*i ζ “

Ser

Glu

Leu

Asn

Met

Val

Ala

C-lu

Val

C-ln

c-ly

Ala

Cys

-•ul. £

Lys

20

25

*3*Ô

CCA

AC-T

ATG

TAT

TTC

AGC

/**-·**·

GCT

TGC

ΦΦΦ

<T»Q*T>

GAT

ACG

• > m

TQ’P

CAG

199

Pro

Ser

Met

Tyx

Phe

Ser

Gly

Ala

Cys

Piie

Ser

Aso

mu y.

Asn

Cys

Gin

35

40

45

AAA.

GCT

TC-T

AAT

CGA

GAG

GAT

TC-G

CCT

AAT

C-GG

AAA

TGC

iT«rn ··.

GTC

GGT

247

Lvs

Ala

Cys

Asn

Arg

Glu

Asp

Tro

Pro

Asn

Gly

Lys

Cys

Leu

Val

C-ly

50

55

50

= 5

TTC

AAA

TGT

GAA

TGT

CAA

AGG

CCT

TGT

TÄAC-TGGTGC C

TCCľ

'C

294

Pľis

Lys

Cys

GÍu

cys

Gin.

Arg

Pro

Cys

	70		75
AATTACGGCC	TACGAGCCTT	TCAGGTACCT	ATC-TGGCCGA
GTACATAGCA	/-«iT*/-· **m n λ m * m C ; w 4 ÄAI Λ ·	C-AÄTAAACC-A		TAAGATGTAT TATGTTTTGT	414
TTGTGCTGTG	q rp ς q Q ΦΦ	gcttttgaaa			474
attctgätaa	aaääaäaa				492

Informácie o sekvenc

SEQ ID č. 5:

(i)	charakteristiky sekvencie: (A) dĺžka: 74 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (D) topológia: lineárna
í Ί i )	typ·molsku1 y: pr oteí n
(xi)	znázornenie sekvencie SEQ ID č. 5:

* --

lys

Lys

Phe

?he

Glv

Leu

Leu

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Phe

Val 15

Phe

Ala

Ο6Γ

Glu

Leu 20

r.SľX

Mez

Val

Ala

Glu 25.

Val

C-ln

Gly

Ala

Thr 3 0

Cys

i_r~

□VS

Pro

Ser

va-

Tyr

Phe

Ser

Gly 40

Ala

Cys

Phe

Ser

.Asp 4*5

Tlir

Asn

Cys

Lys Ξ 0

* ’ a

Cys

Asn

Are

íl

Asp

Trp

Pro

.Asn

Gly 50

Lys

Cys

Leu

Val

Gly

Lys

Cys

C-lu

Cys

C-ln

Arg

Pro

Cys

Informácia o sekvencii SEQ ID č. 6:

(i) charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka: 363 párov zásad (B) typ: kyselina nukleová (C) počet reťazcov: dvojreťazcová (D) topológia: neznáma

( i i)	typ molekuly: cDNA
( i i i )	nie je hypotetická
( i i i )	nie je anti-senza
(vi)	pôvodný zdroj: (A) organizmus: Beta vulgaris

(xί) znázornenie sekvencie SEQ ID č. 6:

	0*·*τι ^'ρ'Τ'ίρΓηΓρ	CAACAATľAC	CAACAACAAC	AAACAACAAA	CAACATTACA	60
ÄTTACTATTT	ACAATTACAC	CATGGAGAAA	AAAZTCTTTG	GGCTTTTGCT	TTTGCTACTC	120
TTCGTA.TTTG	CT'ľCTGAGCT	GAACATGGTG	GCTGAGGTTC	AAGGTGCCAC	TTGTAGAAAA	130
CCAAGTA.TGT	AGTTCAGCGG	CGCTTGC?T7	TČTGATACGA	ATTGTCAGAA	agcttgtaat	240
/**<·*<“*<*·<·* mm (_ A1 .	GGCCTAÄTGG	GAAATGCTTA	GTCGGTTTCA	AATGTGAATG	TCAAAGGCCT	3 00
TGTTAÄGTGG	TGCCTGTGTC	QTQT’T i	GCCTACGAGC	CTTTCAGGTA	CGTCGACGCA	3 60
TC-C '						3 5 3

Informácie o sekvenc i i SEQ

ID č.

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 596 párov zásad (B) typ: kyselina nukleová (C) počet reťazcov: dvojreťazcová (D) topolósia:' neznáma

	(íl)	typ molekuly: c D N A
«	(iiil	nie je hypotetická
	(i i i )	nie je anti-senza
•	( V Ί )	pôvodný zdroj:
		(A) organizmus: Beta vulgaris
	( Ί X )	vlastnost i:
		(A) názov/kľúč: CDS
		(B) lokácia: 23..358
	(xi)	znázornenie sekvencie SEQ ID č.

ATTCAACCCA ATAGAÄACAA TC ATG GCA AGG AAC Met Ala Arg Asn

TCÄ TTC AAC TTC CTC A.T T Ser Phe Asn Phe Leu íle

10

ATC íle

ATG Met

GTC Val

ATT íle

TCA Ser

GCA Ala

CTG Leu

Γ-'Τ Leu

TTQ Leu

CTC Leu 20

CCT Pro

GGA Gly

TCA Ser

CGT •--rg

GCA Ala 25

AGC Ser

100

TTT

CAC·

GAA

AAG

ATA

ACT

ATG

AAC

ATA

GAA

Qi φ

GGA

CGC

GAA

AGC

GGC

148

Phe

C-ln

Glu

Lvs

íle

—

Met

Asn

íle

Glu

Asp

Glv

Arg

Glu

Ser

Gly

30

35

40

ATA

GCA

AAG

GAA

* m*

GAG

GCA

GAA

C-CA

GAA

GCA

C-AA

GCA

TTA

TTA

196

Zle

Ala

Lvs

Glu

Zle

Val

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

L*eu

Leu

45

50

CGC

GGT

GAG

CAA

GCT

ÄTC-

CTG

C-AA

CAA

Qm *

ATG

AC.A

AGA

GGC

TTA

244

Val

Gly

Glu

C-ln

Ala

Met

Leu

C-lu

Gin

Val

Met

π —,

Arg

Gly

Leu

50

55

70

C-CA

C-AT

AAC

AAG

AGG

<T'Q*T'

m —

CCA

TGT

GGT

CAA

GA.C

TC-C

<T^

TCC

292

Ala

Asp

Asn

Leu

Lys

* —— n— —

Cys

Zle

Pro

Cys

G v

C-ln

Asp

Cys

Zle

Ser

75

30

ΕΞ

90

TCA

AGA

AAC

TGT

TC-C

CCT

TC-C

AAA

TC-C

AAC

GGC·

CC-

CCG

340

Ser

Arg

Asn

cys

cys

Ser

Pro

cys

Lys

Cvs

Asr.

Phe

C-ly

Pro

Pro

Val

25

1Ó0

105

CCA AGG TGT ACT AAT TGAATC-CTTA GCTTGCTGCT TAGTGCTAAA TGCTAAGCGC Pro Are Cys Thr Asn

110

TACGCTTGCT	AGTATGTGCA	CGATCCGCTC	Φ J/f Q T Q 'Τ' 1	TATGCACCTA	AGTCCTTTCA	455
TCTCC-ACTGT	GTTGTTTGTG	TGTAAAÄTAÄ	AGTCTTGGTT	TTCCAAC-ACT	ACTAGTTTAG	515
		cr-r..	ä 1 m * 2^	GACAAGGAGA	CCTÄTTTCTT	575
	ÄAAAAAAAAA	A				595

Informácia	o sek vene i i SEQ ID č. δ :
(i)	charakteristika sekvencie: (A) dĺžka: 111 aminokyselín (B) typ: am inokyse1 i nová (D) topológia: neznáma
(11)	typ molekuly: proteín
(i i i)	nie je hypotetická
(xi)	znázornenie sekvencie SEQ ID č. 8:

Met Ala 1

Arg A.sn

Ser 5

Phe Asn

Phe

Leu

Zle 10

Zle

Mec

Val

Zle

Ser 15

Ala

Leu

Leu

Leu

Leu

Pro

Gly

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

Glu

Lys

Zle

Thr

20

25

30

Mez

Asn

Zle

Glu

Asp

Gly

Arg

Glu

Ser

Gly

Zle

Ala

Lvs

Glu

Zle

Val

35

40

45

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Leu

Leu

Arg

Val

Gly

Glu

Gin

Ala

*

50

55

60

Me:

Leu

Glu

Gin

Val

Met

Thr

Arg

Gly

Leu

Ala

Asp

Asn

Leu

Lys

Are

·.

65

70

75

80

Cys

Zle

Pro

Cys

Glv

Gin

Asp

Cys

Zle

Ser

Ser

Arg

Asn

Cys

cys

Ssr

85

90

a* * ~

Pro

cys

Lys

Cvs

Asn

Phe

Gly

Pro

Pro

Val

Pro

•Arg

Cys

Thr

Asn

1Ô0

105

110

Informácia o s e k vencii

SEQ ID č.

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 484 párov zásad (δ) typ: kyselina nukleová (C) počet reťazcov: dvojreťazcová (D) topológia: neznáma typ molekuly: cDNA ( i ii) nie je hypotetická (iii) nie je anti-senza (vi) pôvodný zdroj:

(A) organizmus: Beta vulgaris (xi) znázornenie sekvencie SEQ ID č. 9:

CTGCAGGGAT CCTATTTTTA CAACAATTAC

ATTACTATTT ACAATTACAC CATGC-CÄAC-G

ATTTCAGCAC TGCTTTTGCT CCCTGC-ATCA

CÄACAACÄAC AAACAACAAA CAACA7TACA 60

ÄACTCATTCÄ ACTTCCTCAT TATCATGGTC 120

CGTGCAAC-CT TTCAGGAAAA GATAACTATG

130

AACATAGAAC-	ATGGACGCGA	AAGCGGCATA GCAÄAGGÄÄA	TAGTTGAGGC	AGAAGCAGAA	240
GCAGAAGCAT	TATTACGCGT	TC-GTGA.GC.-_-. C-CTAT GCTGC-	A-ACAÄGT.AAT	GACAÄGAGC-C	300
TTAGCAGA.TA	ACCTTAAGAG	GTGTA.TACCA. TGTGGTCAA.G	ACTGCATTTC	CTCAAC-AÄAC	360
TGTTGCTCAC	CTTGCAAATG	CAA.CTTCGGC- CCACCGGTTC	CÄAGGTGTAC	m m T Q	420
CTTAGCTTGC		TA--A.TGCTAA. GCGCTA.CGCT	TGCTAGTA.TG	TC-GTCGACGC	480
ATGC					434

·.

Informácia

ID č. 10:

í. A) dĺžka

504 párov., zásad (3) nuk 1eová (C) počet (D) óg i a: ne

( i í )	typ
( 1 Ί 1 )	n i e
í i i i )	n i e
(vi)	p ô vo (A
( i x)	vlas

u je molekúl y: cDNA hypotet i oká anti-senza dny zdroj:

) organizmus: Hordeum vu 1 gare (A) názov/ki’úč:

i) znázornenie sekvencie S E Q

ATG GCG Mec Ala

CTG Leu . J

VäGCC ATG Ala ^M“~

GCG

Ala

C.-.G C-Ír.

C.-.G

r.·.

TG n

C-TG	C-CG	GCG	CTG	CTG	TGC	GCG	GCG	GCG
‘val	Ala	Ala	Leu	Leu	Cys	Ala	Ala	Ala
		10					15
GCG	AAC	AAC	GTC	CGG	GCG	ACG	TAC	CAC
Ala	A.sn	Asr.	Val	Arg	Ala	Thr	Tyr	His
	25					30·

TAC ITL, i V *

TAC CGG CCC- GCG CAG AAC

AAC TGG

GAC Asp

CTG GGC GCG

CCC Pro

GCC Ala

GTG . Val

144

Tvt

ATO 35

Pro

Ala

Gin

Asn

Asn 40

Trp

Leu

Glv

Ala 45

AGC

GCC

TAC

TGC

GCG

ACC

TGG

GAC

GCC

AGC

AAG

CCG

CTG

TCG

TGG

CGG

192

Ser

ÄXä

Tvr

Cys

Ala

Thr

Trp

Asp

Ala

Ser

Lys

Pro

Leu

Ser

Trp

Arg

X L·

55

ÓO

TCC

AAG

TGG

ACG

GCG

fTUTif^

TGC

GGC

CCC

GCC

GGC

CCC

CGC

GGG

240

Ser

Lys

Tyr

C-ly

Tm

Thr

Ala

Phe

Cys

Gly

Pro

Ala

C-ly

Pro

Arg

C-lv

C w

*70

75

80

CAG

GCG

C-CC

TGC

GGC

AAG-

TGC

CTC

CGG

GTG

ACC

AAC

CCG

GCG

ACG

GGG

2S3

Gin

Ala

Ala

Cys

Gly

Lys

Cys

L· S-L·

•Arg

Val

Thr

Asn

Pro

Ala

Thr

Gly

85

90

95

CAG

ATC

ACC-

GCG

s r*·/*

ATC

GTG

C-ÄC

CAG

TGC

GCC

AAC

GGG

CTC

33 6

Ala

Gin

Zlô

Ala

Arg

Zle

Val

Aso

Gin

Cys

Ala

Asn

Glv

Glv

Leu

100

105

11Ô

GAC

CTC

C-AC

TGG

GAC

ACC

GTC

.-PVp/“

ACC

AAG

ATC

GAC

ACC

AAC

GGG

A.TT

3S4

Asp

Leu

Aso

Trp

Asp

Thr

Val

Phe

^h^r

Lys

Zle

Asp

Thr

Asn

C-lv

Zle

115

120

125

GGG

TAC

CAG

CAG

GGC

CAC

CTC

AAC

C-TC

AAC

TAC

CAG

C-TC

C-AC

TGC

432

Gly

Tvr

Gin

Gin

Gly

His

Leu

Asn

Val

Asn

Tyr

C-ln

Phe

Val

Asp

Cys

13 0

135

140

CGC GAC TAGATTGTCT GTGGÄTCCAA GGCTAGCTAA C-AATAAAAGG CTAGCTAAGC 488

Arg Asn

145

TATGAC-TGAG CAC-CTG 504

	Informácia	o sek
	(i)	char a
-		(A)
		(B)
♦		(D)
	(ii)	typ m
	(xi)	znázo

enci i SEQ ID č. 11:

t e r i s t i k y sekvencie:

dĺžka: 146 aminokyselín typ: a m i n o k y s e 1 i n o v á topo1óg i a: 1 i neárna e k u 1 y: proteín nenie sekvencie SEQ Dl č. 11:

Met 1

Ala

Ala

Arg

Leu 5

Met

Leu Val

Ala

10

Leu Leu Cys

Ala

··. * ä 15

Ala

Ala

Met

Ala

Thr

Ala

Gin

Gin Ala

Asn

Asn

Val Arg Ala

Thr

Tyr

His

20

25

3 0

Tyr

Ty x*

Arg

Pro

Ala

C-ln

Asn Asn

Trp

Asp

Leu Gly .-.la

Pro

* a

Val

35

40

45

Ser

Ala 50

Tyr

Cys

Ala

Tro 55

Asp

Ala

Ser Lys

Pro 60

Leu

Ser

Trp Arg

Ser

Lys

Tyr

Gly

Trp

Thr

Ala

Cvs

Gly Pro

Al a

Gly

Pro

Aro C-lv

65

*7*0

75

30

Gin

Ala

Ala

Cys

C-lv

Lys

Cys

Leu

Arr

Val Thr

Asn

Pro·

Ala

Thr Gly

85

90

95

Ala

Gin

Zls

A.la

*

Zl-

Val

Asn

G Ír. Cys

Ala

.Asn

Glv

Gly Leu

100

105

11Ô

Asp

Leu

Asp

Trp

Asp

Va 1

Phe

Thr

Lys Zle

Asp

m'» λ XX»

Asn

Gly Zle

115

120

125

Gly

Tvr

Gin

Gin

Gly

His

Leu

.Asn

Val

Asn Tyr

C-ln

Phe

Val

Asp Cys

130

X i ·

140

Arg Asn

145

Informácia o sekvencií SEQ ID č. 12:

(i) charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka: 515 párov zásad (B) typ: kyselina nukleová (C) počet reťazcov: dvojreťazcová (D) topológia: neznáma

(i i)	typ molekuly: c D N A
(iii)	nie je hypotetická
(í i i)	nie je anti-senza
(vi)	pôvodný zdroj:
	(A) organizmus: Hordeum vulgare
( x i )	znázornenie sekvencie SEQ ID č. 12

CTGC.AGGA.TC	C.ATGGCGGC.A	CGCCTGATC-C	TGGTC-GCGGC	C-CTGCTC-TGC	GCGGCGGCGG	60
CC-ATGC-CCAC	GC-CGCAGC.AG	GCGA.AC.AACG	TCCGGGCGAC	GTACCACTAC	TACCGGCCGG	120
CGCAGÄACAA	CTC-GGACCTG	GGCGCGCCCG	CCGTC-AGCGC	CT.ACTGCGCG	ACCTGGGACG	180
CC.AC-C.AÄGCC	C-CTGTCGTGG	CGGTCCÄAGT	ACC-GCTGGAC	GGCGTTCTGC	GGCCCCGCČG	240
GCCCCCGCGG	GCAC-GCGGCC	TGCGGC.AÄGT	GCCTCCGGGT	GACC.AACCCG	GCGACGGGGG	300

CGCAGA.TCAC	GGCGäGGATC	GT^saCCA^ -	GCG- CAACGG	CGGGCTCGAC	ČTCGACTGGG	360
•--CACCG7CTT		- ---- --	'•~--- -------i--.	ZCA.GCAGGGC	CACCTCAACG	420
τ·Γ*χ íqti CCA	. --s 4. ν.·ώΓΛ	TGC2GCGACT	AGATGGTCGG	TGGATCCAÄG	C-CTAGCTAAG	480
ϋ T1 i i -	γγτ £-*1 —	ÄTGAGTGA.GZ	*··“*··			515

•	Informácia	o sekvencii SEQ I č č. 13:
•	(i)	charakteristiky sekvencie:
«		(A) dĺžka: 585 párov zásad (B) typ: kyselina nukleová (C) počet -eťazcov: dvojreťazcová (D) tepe·légia: neznámi
	(ii)	typ molekuly: c D N A
	(i i i;	nie je hypotetická
	(i i i)	nie je anti-senza
	(vi)	pôvodný zdroj: (A) organizmus: fordeum vulgare
	(x i)	znázornenie sekvencie SEQ ID č. 13:

CTGCAGGGAT	* Τ'Φ'Τ’Φ^	CAACAATTAC	CAACÄACAAC	AAACAACAAA	CAACATTACA	60
ATTACTATTT	ACAATTACAC	CATGGCGGCA	CGCCTGATGC	TGGTGGCGGC	GCTGCTGTGC	120
GCGGCGGCGG	CGÄTGGCCAC	GGCGCAGCAG	GCGAACAACG	TCCGGGCGAC	GTACCACTAC	180
TACCGGCCGG	CGCAGAACAA	CTGGGACCTG	GGCGCGCCCG	CCGTGAGCGC	CTACTGCC-CG	240
ACCTGGGACG	CCAGCAAGCC	GCTGTCGTGG	CGGTCCAAGT	ACGGCTGGAC	GGCGTTCTGC	300
GGCCCCGCCG	GCCCCCGCGG	wv-.ntAyx. sjvjk- v.	TC-CGGCAAGT	GCCTCCGGGT	GACCAACCCG	360
GCGACGGGGG	CGCAGATCAC	GGCGÄGGATC	GTGGACCAGT	GCGCCAACC-G	CGGGCTCGAC	42 0
CTCGACTGGG	ACACCGTCTT	>**/·*»* rp/* \»λΙ*λλ\γλ 1 L	'C-ACACCAACG	GGATTGGGTA	CCAGCAGGGC	430
CACCTCAACG	TCAACTACCA	GTTCGTCGAC	TGCCC-CGACT	1	TGGATCCAAG	540
GCTAGCTAAG	AATAAAAGGC	TAGCTÄAGCT	ÄTGAGTGAGC	AGCTC-		X 2 C

pv Zor-75

Vyššie popísaný vynález je zhrnutý v nasledujúcich bodoch označených číslami 1 - 37 a definovaný ďalej uvedenými patentovými nárokmi 1 - 20.

1. Antimikrobiá 1 ne proteíny izolované z cukrovej repy, s výnimkou chitináz a glukanáz.

2. Antimikrobiálne proteíny podľa bodu 1, izolované z cukrovej repy, ktorá bola infikovaná hubou z rodu Cercospor a.

3. Antimikrobiálne proteíny podľa ľubovoľného z bodov i alebo 2, izolované z listov cukrovej repy infikovanej Cercospora beticola.

4. Čisté proteíny, ktoré majú aminokyselinové sekvencie proteínov popísané v ľubovoľnom z bodov 1 až 3.

5. Čistý proteín AX1, alebo jeho funkčne ekvivalentný analóg, v ktorom bola iedna alebo viac aminokyselín pridané, nahradené alebo odstránené bez toho, aby došlo k podstatnému zníženiu antimikrobiálnej aktivity proteínu.

ô. Čistý proteín AX2, alebo jeho funkčne ekvivalentný analóg, v ktorom boli jedna alebo viac am inokyse1 í n.pri dané, nahradené alebo odstránené bez toho, aby došlo k podstatnému zníženiu anti mikrobiálnej aktivity proteínu.

7. Čistý proteín AX3,1, alebo jeho funkčne ekvivalentný analóg, v ktorom boli jedna alebo viac aminokyselín pridané, nahradené alebo odstránené bez toho, aby došlo k podstatnému zníženiu antim i k rob i á 1 ne j aktivity proteínu.

3. Čisté proteíny alebo ich funkčné analógy podľa ľúbovoľného z bodov 1 až 7, chemicky syntetizované in vitro na základe znalosti ich am inokvse1 i nových sekvencií.

9. ' Čisté proteíny, ktoré sú aspoň na 55 % podobné preteín o m podľa ľubovoľného z bodov 1 až 8.

10. Čisté proteíny podľa ľubovoľného z bodov 5 až 9, v kombinácii s proteínom, ktorý je zásaditým doplnkom skupiny 4 kyslých proteínov súvisiacich s patogenézou.

11. Čisté proteíny podľa bodu 10, kde proteínom, ktorý je zásaditým doplnkom uvedených proteínov súvisiacich s patogenézou, je proteín WIN, ktorý viaže ch í tí n.

12. Čisté proteíny podľa bodu 11, kde bol proteín WIN i zolovaný zo zrna jačmeňa alebo z listu jačmeňa vystaveného stresu.

13. Rekombinantná DNA obsahujúca sekvenciu, ktorá kóduje proteín ako je popísaný v ľubovoľnom z bodov 1 až 9.

14. Rekombínantná DNA podľa bodu 13 obsahujúca sekvenciu, ktorá kóduje proteín ako je popísaný v ľubovoľnom z bodov 1 až 9, vybraná zo skupiny zahrňujúcej sekvencie znázornené v SEQ ID č. 2, 5 a 8.

15. Rekombinantná sekvencia DNA podľa ľubovoľného z bodov 13 alebo 14, ktorá ďalej obsahuje sekvenciu DNA kódujúcu proteín, ktorý je zásaditým doplnkom skupiny 4 kyslých proteínov súvisiacich s patogenézou, ako je popísaný v ľubovoľnom z bodov 10 až 12:

16. Sekvencia DNA, ktorá hybridizuje pri prísnych hybridizačných podmienkach so sekvencíou DNA podľa ľubovoľného z bodov 13 až 15.

17. Vektor obsahujúci sekvenciu DNA, ' ako je popísaná v ľubovoľnom z bodov 13 až'16.

18. Vektor, ktorý je popísaný v bode 17, ktorý obsahuje sekvenciu DNA izolovanú z rastlinného genómu.

19. Biologický systém obsahujúci DNA, ako je popísaná v ľubovoľnom z bodov 13 až 16 a umožňujúci expresiu tejto DNA.

20. Biologický n i zmus.

systém podľa bodu 19, ktorým je míkroorga21. Biologický systém podľa bodu 19, ktorým je rastlina.

Rastliny transformované rekombinantnou DNA, ako je popísaná v ľubovoľnom z bodov 13 až 16.

23. Rastliny transformované rekombinantnou sekvenciou DNA obsahujúcou časť, ktorá kóduje protein AX1, alebo jeho funkčne ekvivalentný analóg, v ktorom boli jedna alebo viac aminokyselín pridané, nahradené alebo odstránené bez toho, aby došlo k podstatnému zníženiu antimikrobiálnej aktivity proteínu.

24. Rastliny transformované rekombinantnou sekvenciou DNA obsahujúcou časť, ktorá kóduje protein AX2, alebo jeho funkčne e ekvivalentný analóg, v ktorom; boli jedna alebo viac aminokyselín pridané, nahradené alebo odstránené bez toho, aby došlo • k podstatnému znáženiu antimikrobiálnej aktivity proteínu.

25. Rastliny transformované rekombinantnou sekvenciou DNA obsahujúcou časť, ktorá kóduje protein AX3,1 alebo jeho funkčne ekvivalentný analóg, v ktorom boli jedna alebo viac aminokyselín pridané, nahradené alebo odstránené bez toho, aby došlo k podstatnému znáženiu antimikrobiálnej aktivity proteínu.

26. Rastliny transformované podľa ľubovoľného z bodov 23 až 25, kde sekvencia DNA ďalej kóduje protein, ktorý je zásaditým doplnkom skupiny í kyslých proteínov súvisiacich s patogenézou, ako je popísaný v ľupovoľňom z bodov 10 až 12.

27. Potomstvo rastlín podľa ľubovoľného z bodov 23 až 26, ktoré e x prímu j e. vyššie uvedené rekombinantné sekvencie DNA.

28. Semená rastlín podľa ľubovoľného z bodov 22 až 26 alebo potomstvá podľa bodu 27.

29. Proteín získaný _ e x p r e siou DNA, ako je popísaná v ľubovoľnom z bodov 13 až 16.

30. Antimikrobiálny proteín produkovaný expresiou rekombinantnej DNA v rastlinách, ako sú popísané v ľubovoľnom z bodov 22 až 27.

31. Antimikrobiálny prostriedok obsahujúci jeden alebo viac proteínov, ako sú popísané v ľubovoľnom z bodov 1 až 12 a 29 až 30.

32. Spôsob boja proti hubám alebo baktériám, ktorý zahrňuje ich vystavenie proteínom alebo prostriedkom, ako sú popísané v ľubovoľnom z bodov 1 až 12 a 2 9 a Ž 31.

33. Postup extrakcie na získanie antimikrobiálnych proteínov, ako sú popísané v ľubovoľnom z bodov 1 až 12 alebo 29 až 31, z organického materiálu, ktorý ich obsahuje.

34. Postup extrakcie podľa bodu 33, ktorý zahrňuje podrobenie materiálu macerácii a extrakcii rozpúšťadlom.

35. Postup extrakcie, ako je popísaný v bode 34, kedy je proteín následne purifi kovaný pomocou centrifugácie a chromatograf ie, vybranej zo skupiny zahrňujúcej hydrofóbnu interakciu, výmenu iónov, výmenu katiónov, gélovú filtráciu a chromatografiu na reverznej fáze.

36. Postup extrakcie, a k o j e popísaný v ľubovoľnom z bodov 33 až 35, kde organická hmota obsahuje listy cukrovej r e py, ktorá je infikovaná Cercospora beticola.

37. Postup extrakcie podľa ľubovoľného z bodov 33 až 35, kde organická hmota obsahuje mikroorganizmus, ako je popísaný v bode 20.

Claims (16)

1. Antimikrobiálne proteíny, vyznačené tým, že sú izolované z cukrovej repy, s výnimkou chitináz a glukanáz.

2. Antimikrobiálne proteíny podľa nároku 1, v y z n a čené tým, že sú izolované z cukrovej repy, ktorá bola infikovaná hubou z rodu Cercospora.

3. Čistý proteín vybraný zo skupiny zahrňujúcej proteíny znázornené v sekvenciách SEQ ID č, 2, 5 a 8, alebo jeho funkčne ekvivalentný analóg, v ktorom boli jedna alebo viac aminokyselín pridané, nahradené alebo odstránené bez toho, aby došlo k podstatnému zníženiu antimikrobiálnej aktivity proteínu, a zmesi týchto proteínov alebo analógov.

4. Čistý protein tvorený zvyškami 80 - 111 v sekvencii č.

8, alebo zvyškami 29 - 74 v sekvencii SEQ ID č. 2 alebo v sekvencii SEQ ID č. 5, alebo jeho funkčne ekvivalentný analóg, v ktorom boli jedna alebo viac aminokyselín pridané, nahradené alebo odstránené bez toho, aby došlo k podstatnému znáženiu antimikrobiálnej aktivity proteínu, a zmesi týchto proteínov alebo analógov.

5. Čisté proteíny, vyznačené tým, že majú sekvencie aminokyselín, ktoré sú aspoň na 55 % podobné sekvenciám proteínov podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 4.

5. Čisté proteíny podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 5, v kombinácii s proteinom, ktorý je zásaditým doplnkom skupiny 4 kyslých proteínov súvisiacich s patogenézou alebo/a chitinázou alebo/a glukanázou.

7. Čisté proteíny podľa nároku 6, kde je proteinom, ktorý je zásaditým doplnkom vyššie uvedených proteínov súvisiacich s patogenézou, proteín WIN, ktorý viaže chitín obsahujúci sekvenčnú aminokyselín znázornenú v sekvencií SEQ ID č. 11, alebo jeho funkčne ekvivalentný analóg, v ktorom bolí jedna alebo viac aminokyselín pridané, nahradené alebo odstránené bez toho, aby došlo k podstatnému zníženiu antímikrobiálnej aktivity proteínu alebo aktivity proteínu pri väzbe na chitín.

S. Rekombinantná DNA, vyznačená tým, že obsahuje sekvencíu kódujúcu proteín, ako je popísaný v ľubovoľnom z nárokov 1 až 5.

9. Rekombinantná DNA podľa nároku 8, v y z n a Č e n á tým .že obsahuje nukleotídovú sekvencíu vybranú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie znázornené v SEQ ID č. 1, 3, 4, 6, 7, a 9 .

10. Rekombinantná sekvencia DNA podľa ľubovoľného z nárokov Sa 9, vyznačená tým, že ďalej obsahuje sekvencíu DNA kódujúcu proteín, ktorý je zásaditým doplnkom skupiny 4 kyslých proteínov súvisiacich s patogenézou, ako je popísaný v ľubovoľnom z nárokov 6 alebo 7, alebo/a chĺtinázu alebo/a glukanázu.

11. Rekombinantná sekvencia DNA podľa ľubovoľného z ná- tak , ktorého má . s i o u takto v y z n a č e n á t ý m , že je modifikovaná ktoré sú preferované organizmom, do rekombinantná DNA inzertovaná tak, že sa exprevyššie uvedenom organizme zísako expresiou nemodifi kovanéj v ktorom sú komponenty rekomktoré kódujú proteín, ka v podstate rekombinantnej binantnej DNA, použité k o d ó n y, byť modifikovanej DNA vo podobný proteín

DNA v organizme, endogénne.

12. Sekvencia DNA, v y z n a č ridizuje pri prísnych podmienkach so Povoľného z nárokov 8 až 11.

13. Vektor, v y z n a č e n ý e n á t ý m , že hybsekvenciou DNA podľa ľ ut ý m že obsahuje sekvenciu DNA podľa ľubovoľného z nárokov 8 až 12.

14. Biologický systém vybraný zo skupiny zahrňujúcej rastliny a mikroorganizmy, ktorý obsahuje a umožňuje expresiu DNA, ako je popísaná v ľubovoľnom z nárokov 8 až 12.

15. Rastliny, najmä kukurica alebo cukrová repa, transformované rekombinantnou DNA, ako je popísaná v ľubovoľnom z nárokov 8 až 12.

16. Potomstvo a semená rastlín podľa nároku 15, a semená takéhoto potomstva, ktoré exprimuje vyššie uvedenú rekombinantnú DNA.

17. Proteín získaný expresiou DNA, ako je popísaná v ľubovôľ no m z nárokov 8 až 12.

13. A n z i m i k r o b i á 1 n y proteín vytvorený pomocou e x p r e s i e rekombinantnej DNA v rastlinách, ako sú popísané v ľubovoľnom z nárokov 15 alebo 16.

19. Anti m ikrobi á 1ny prostriedok, vyznačený tým, že obsahuje jeden alebo y i a c proteínov, ak.o sú popísané v ľúbo voľ nc· m z nárokoví až 7, 16 a 18.