PL179726B1

PL179726B1 - Bialko przeciwdrobnoustrojowe oraz zrekombinowana sekwencja DNA PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL179726B1
Application number: PL94302321A
Authority: PL
Inventors: Kirsten Bojsen; Karsten M Kragh; Jorn Dalgaard Mikkelsen; Klaus K Nielsen; John E Nielsen
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1993-02-24
Filing date: 1994-02-22
Publication date: 2000-10-31
Also published as: HU218110B; TR27243A; US5608151A; PL302321A1; HUT68522A; IL108727A0; HU9400526D0; GB9303725D0; ZA941282B; CA2116201A1; AU682483B2; US5607919A; UA41278C2; CZ289646B6; JPH06340696A; EP0612847A2; EP0612847A3; KR940019722A; SK20594A3; KR100346928B1

Abstract

1. Bialko przeciwdrobnoustrojowe majace sekwencje aminokwasowa wybrana z tych, które sa okreslone w Sek. Id. Nr 2,5 i 8 lub obejmujaca reszte 80-111 w Sek. Id. Nr 8, lub reszty 29-74 albo w Sek. Id. Nr 2, albo w Sek. Id. Nr 5. 5. Zrekombinowana sekwencja DNA, znamienna tym, ze obejmuje sekwencje nukleoty- dowa wybrana z grupy zawierajacej sekwencje przedstawione w Sek. Id. Nr 1,3,4,6,7 oraz 9. (5 4 ) Bialko przeciwdrobnoustrojowe oraz zrekombinowana sekwencja DNA PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest białko o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych, w szczególności białko wyizolowane z buraków cukrowych oraz zrekombinowana sekwencja DNA kodująca to białko.

Białko o własnościach przeciwdrobnoustroj owych jest to białko, które jest toksyczne wobec mikroorganizmów lub białko, które hamuje wzrost dowolnych mikroorganizmów - bakterii, wirusów, a szczególnie grzybów - w dowolnych warunkach. Te grupy białek obejmują białka, które wykazują aktywność przeciwdrobnoustroj ową poprzez kontakt z mikroorganizmami oraz w konsekwencji ich przyswajania lub metabolizowania przez mikroorganizm. Białka te mogą występować osobno lub w kombinacji z innym materiałem białkowym.

Zgodnie z wynalazkiem białko przeciwdrobnoustrojowe ma sekwencję aminokwasową wybraną z tych, które są określone w Sek. Id. Nr 2, 5 i 8 lub sekwencję aminokwasową obejmującąresztę 80-111 w Sek. Id. Nr 8, lub reszty 29-74 albo w Sek. Id. Nr 2, albo w Sek. Id. Nr 5. Korzystnie jest to białko wyizolowane z buraka cukrowego zainfekowanego grzybami z rodzaju Cercospora, a szczególnie korzystnie białko wyizolowane z liści buraka cukrowego zainfekowanego grzybami Cercospora beticola.

Wyizolowane z buraka cukrowego białka przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku nie posiadają aktywności chitynazy i glukanazy.

179 726

Według wynalazku, białko przeciwdrobnoustrojowe występuje korzystnie w połączeniu z białkiem, które jest zasadowym odpowiednikiem kwaśnych białek grupy 4 związanych z patogenezą, i/lub chitynazą i/lub glukanazą, albo w połączeniu z białkiem WIN wiążącym chitynę, obejmującym sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sek.Id. Nr 11. Funkcjonalnie równoważne analogi wymienionych białek, w których dodano, podstawioną lub usunięto jeden lub więcej aminokwasów nie wykazują zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej i/lub aktywności wiążącej chitynę białka.

Wskazane jest by białko, które jest zasadowym odpowiednikiem wymienionych białek związanych z patogenezą było wiążącym chitynę białkiem WIN, a zwłaszcza wskazane jest by było wyizolowane z ziarna jęczmienia lub z poddanych szokowi liści jęczmienia.

Zarówno oczyszczone białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek. Id. Nr 2, 5 i 8, jak ich funkcjonalnie równoważne analogi, w których dodano, podstawiono lub usunięto jeden lub więcej aminokwasów, jak również mieszanina takich białek lub ich analogów, nie wykazują zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej białka.

Zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej nie wykazuje też oczyszczone białko, o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej resztom 80-111 w Sek. Id. Nr 8, lub resztom 29-74 w albo Sek. Id. Nr 2, albo Sek. Id. Nr 5 lub ich funkcjonalnie równoważne analogi, w których dodano, podstawiono lub usunięto jeden lub więcej aminokwasów lub mieszanina takich białek lub ich analogów.

Białka posiadające sekwencje aminokwasowe odpowiadające resztom 29-74 w Sek. Id. Nr 2 i 5 sąponiżej określane odpowiednio jako ΑΧ1 i ΑΧ2, a białko posiadające sekwencję aminokwasowa odpowiadającą resztom 80-1l1 w Sek. Id. Nr 8 jest określane poniżej jako ΑΧ3.

Infekowanie roślin patogenami grzybowymi lub wirusowymi może indukować powstawanie w tkankach wegetatywnych około 10 rodzin homologicznych białek związanych z patogenezą (pathogenesis-related proteins, PR proteins, białka PR). Wyodrębniono 5 grup białek PR. Białka PR-2,PR-3 iPR-5 są odpowiednio: beta-1,3-glukanazami, chitynazami i białkami taumatynopodobnymi. Białkom z grupy PR-1 i PR-4 nie przypisano specyficznych funkcji. Białka PR-4 podobne są do C-końcowych domen proheweiny i domniemanego białka WIN indukowanego zranieniami roślin ziemniaka, pozbawione wszakże N-końcowej domeny heweiny. Termin „zasadowy odpowiednik kwasowej grupy białek PR-4” oznacza więc zasadowy odpowiednik białek podobnych do C-końcowych domen proheweiny i domniemanego białka WIN indukowanego zranieniami roślin ziemniaka.

Przedstawione powyżej białka, mogą być zsyntezowane in vitro, w oparciu o znajomość ich sekwencji aminokwasowej.

Własności przeciwdrobnoustrojowe wykazują również białka, które mająsekwencje aminokwasowe co najmniej w 55%podobne do sekwencji białek wybranych z tych, które sąprzedstawione w Sek. Id, Nr 2, 5 oraz 8, a także białka posiadające sekwencję aminokwasową co najmniej w 55% podobną do sekwencji jednego z białek AX, a więc białek posiadających sekwencje aminokwasowe odpowiadające resztom 80-111 w Sek. Id. Nr. 8, lub resztom 29-74 albo w Sek. Id. Nr 2 albo w Sek. Id. Nr 5. Wskazane jest by stopień podobieństwa wynosił co najmniej 60%, jeszcze bardziej wskazane jest by wynosił co najmniej 70%, a najbardziej wskazane jest by wynosił on co najmniej 80%.

W kontekście wynalazku, dwie sekwencje aminokwasowe o wzajemnym podobieństwie sekwencyjnym co najmniej 55%, definiuje się jako posiadające co najmniej 70% identycznych lub podobnych reszt aminokwasowych w tych samych pozycjach, gdy obie sekwencje są zestawione w najbardziej odpowiadający sobie sposób, umożliwiając występowanie nie więcej niż 4 delecji albo dodanie nie więcej niż 10 reszt aminokwasowych.

Dla celów wynalazku przyjmuje się, że:

alanina, seryna 1 treonina są podobne;

kwas glutaminowy i kwas asparaginowy są podobne;

asparaglna 1 glutamina są podobne;

arglnina 1 lizyna są podobne;

179 726 izoleucyna, leueyna, metionina i walina są podobne; fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan są podobne.

Zgodnie z wynalazkiem zrekombinowana sekwencja DNA obejmuje sekwencję nukleotydową wybraną z grupy zawierającej sekwencje przedstawione w Sek. Id. Nr 1, 3, 4, 6, 7 oraz 9 i korzystnie obejmuje ponadto sekwencję DNA kodującąbiałko, które jest zasadowym odpowiednikiem kwaśnych białek grupy 4, związanych z patogenezą, i/lub chitynazą, i/lub glukanazą. Korzystnie, wynalazek obejmuje ponadto sekwencję DNA, która stanowi sekwencję hybrydyzującą w warunkach ścisłych z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy zawierającej sekwencje przedstawione w Sek. Id. Nr 1, 3, 4, 6, 7 oraz 9.

Termin „ścisłe warunki hybrydyzacji” oznacza takie warunki hybrydyzacji, w których hybrydyzacja następuje w temperaturze pomiędzy 50 a 60°C w 2X SSC zawierającym 0,1% SDS, po której następuje płukanie w tej samej temperaturze, w buforze zawierającym mniejsze stężenia SSC nie wpływające wszakże na wynik hybrydyzacji. Buforami o mniejszym stężeniu SSC sąodpowiednio: (a) 1xSSC, 0,1 % SDS lub (b) 0,5xSSC, 0,1 % SDS lub (c) 0,1 xSSC, 0,1 % SDS.

Sekwencje DNA według wynalazku, sąkorzystnie zmodyfikowane w tych kodonach, które są preferowane przez organizm, do którego ta zrekombinowana sekwencja DNA jest wprowadzona, przy czym ekspresja takiego zmodyfikowanego DNA w wymienionym organizmie daje białko zasadniczo podobne do białka otrzymywanego w wyniku ekspresji niezmodyfikowanego zrekombinowanego DNA w organizmie, dla którego składniki kodujące białko takiego zrekombinowanego DNA są endogenne.

Zrekombinowane sekwencje DNA według wynalazku mogą być stosowane w wektorach, gdzie znajdują się pod kontrolą odpowiednich promotorów i sekwencji terminacyjnych, włączaj ąc w to elementy kontrolujące transkrypcję białek szoku cieplnego. Wektory umożliwiają wprowadzanie zrekombinowanego DNA do różnego rodzaju systemów biologicznych, szczególnie do roślin lub mikroorganizmów i ułatwiają ekspresję tego DNA.

Rośliny transformowane są wyżej wyjmienionymi zrekombinowanymi DNA w znany sposób, np. obejmujący regenerację komórek roślinnych lub protoplastów (plazmidy Ti i Ri z Agrobacterium, elektroporacja, mikroiniekcja, wstrzeliwanie mikrokulek opłaszczonych DNA itd). Stransformowane komórki mogą, w razie konieczności, być regenerowane do całych roślin, w których zrekombinowany DNA jest stabilnie włączony w genom. Można otrzymywać rośliny zarówno jedno-jak dwuliścienne, przy ezym te ostatnie są znacznie łatwiejsze do regenerowania.

Przykłady genetycznie zmienionych roślin obejmują: owoee, włączając w to pomidory, mango, brzoskwinie, jabłka, gruszki, truskawki, banany i melony, rośliny uprawne, takie jak canola, słonecznik, tytoń, buraki cukrowe, zboża o małym ziarnie, takie jak pszenica, jęczmień i ryż, kukurydza i bawełna, warzywa, takie jak ziemniaki, marchew, sałata, kapusta i cebula.

Szczególnie preferowanymi roślinami do stosowania wynalazku sąburaki cukrowe i kukurydza.

Rośliny mogą być transformowane zrekombinowanymi sekwencjami DNA obejmującymi: część kodującąbiałko ΑΧ1 (reszty 29 - 74 w Sek. Id. Nr 2) albo jej funkcjonalnie równoważny analog, w którym jeden lub więcej aminokwasów zostało dodanych, podstawionych lub usuniętych, bez zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej białka, lub zrekombinowaną sekwencję DNA zawierającą ezęść kodującąbiałko ΑΧ2 (reszty 29-74 w Sek. Id. Nr 5) albo jej funkcjonalnie równoważny analog, w którym jeden lub więcej aminokwasów zostało dodanych, podstawionych lub usuniętych, bez zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej białka, lub zrekombinowaną sekwencję DNA zawierającą część kodującąbiałko ΑΧ3.1 (reszty 80-111 w Sek. Id. Nr 8) albo jej funkcjonalnie równoważny analog, w którym jeden lub więcej aminokwasów zostało dodanych, podstawionych lub usuniętych, bez zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwbakteryjnej białka, lub sekweneję DNA zawierającą część kodującą kombinację dwu lub więcej białek Ax lub ich analogów.

Rośliny mogą być transformowane wymienionymi zrekombinowanymi sekwencjami DNA, w których sekwencje DNA kodują ponadto białka będące zasadowymi odpowiednikami

179 726 kwasowych białek grupy 4 związanych z patogenezą, a w szczególności białka WIN wiążącego chitynę (reszty 22-146 w Sek. Id. Nr 11), które może być wyizolowane z ziarna jęczmienia lub z poddanych szokowi liści jęczmienia.

Rośliny potomne pochodzące z roślin tak stransformowanych, nasiona takich roślin i roślin potomnych eksprymują białka, według wynalazku, kodowane przez wymienione zrekombinowane sekwencje DNA.

Wynalazek może być stosowany do wytwarzania mieszanek przeciwdrobnoustrojowych, zawierających jedno lub więcej przeciwdrobnoustrojowych białek. Może być stosowany w procesie zwalczania grzybów lub bakterii, przez wystawianie tych organizmów na działanie białek przeciwdrobnoustrojowych lub kompozycji zawierających te białka.

Białka przeciwdrobnoustroj owe ekstrahuje się z zawierającego je materiału organicznego, a w szczególności materiał ten poddaje się maceracji i ekstrakcji płynami.. Białka przeciwdrobnoustroj owe mogą być następnie oczyszczane poprzez wirowanie i chromatografię na złożach wybranych spośród grup oddziaływujących hydrofobowo; anionowymiennie; kationowymiennie; poprzez filtrację żelową; oraz chromatografię z odwróconą fazą.

Wskazane jest by wymieniona metoda ekstrakcji przeprowadzana była z materiałem organicznym obejmującym liście buraka cukrowego, zainfekowane Cercospora beticola, lub mikroorganizmem zawierającym zrekombinowane DNA obejmujące sekwencje kodujące białka przeciwdrobnoustrojowe według wynalazku lub ich analogi, lub zrekombinowane sekwencje DNA obejmujące sekwencje DNA kodujące zasadowy odpowiednik kwasowych białek grupy 4 związanych z patogenezą. Korzystne jest, że białka przeciwdrobnoustrojowe wykazują niewielki lub żaden efekt przeciwbakteryjny wobec mikroorganizmów będących źródłem materiału organicznego, wymienionego w poprzednim zdaniu.

Wynalazek może być lepiej zrozumiany przez odniesienie do przedstawionych poniżej konkretnych opisów, włączając w to zapis sekwencji i załączony rysunek.

Figura 1 przedstawia profil elucyjny białek ΑΧ 1, ΑΧ2 i ΑΧ3 z kationowego złoża Mono S, ze wzrastającym stężeniem chlorku sodu (linia przerywana).

Figura 2 przedstawia żel poliakrylamidowy barwiony srebrem z rozdzielonymi białkami ΑΧ1, ΑΧ2 i ΑΧ3 oraz białkiem WIN; białka rozdzielano metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS i czynnikiem redukcyjnym (DTT); w skrajnie prawej i lewej ścieżce żelu rozdzielono standard wielkości o niskich masach cząsteczkowych (LMW). Białko WIN wyizolowano z ziarna jęczmienia.

Figury 3A i 3B obrazują przeciwgrzybowe działanie ΑΧ1, ΑΧ2 i ΑΧ3, fakultatywnie połączonych z białkiem WIN wyizolowanym z ziarna jęczmienia.

Figura 4 pokazuje morfologię Cercospora beticola poddanego działaniu białka WIN w stężeniu 28 pg/ml (fig. 4B); białka ΑΧ2 w stężeniu 8 pg/ml (fig. 4C) oraz połączonych białek ΑΧ2 (8 pg/ml) i WIN (28 pg/ml) (fig. 4D). Figura 4A pokazuje morfologię Cercospora beticola rosnącego w środowisku wolnym od białek WIN i ΑΧ2.

Figura 5 pokazuje żel poliakrylamidowy barwiony srebrem z rozdzielonymi białka ΑΧ1, ΑΧ2 i ΑΧ3; białka rozdzielano metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS w lub bez obecności czynnika redukcyjnego (DTT). W przeciwieństwie do ΑΧ1 i ΑΧ2, ruchliwość elektroforetyczna obu izoform ΑΧ3, ΑΧ3.1 i ΑΧ3.2, zależy znacznie od obecności DTT, co wskazuje, że ΑΧ3.1 i ΑΧ3.2 występują prawdopodobnie w postaci dimerów lub trimerów. Stosunkowo wysokie tło w pobliżu prążków białkowych (w postaci widocznego smiru) wynika z oksydacji białek podczas elektroforezy; wysokie tło u góry żelu wynika z wybarwienia DTT. Niewielkie przesunięcie pozornej masy cząsteczkowej (MW) dla ΑΧ1 i ΑΧ2 w obecności DTT wynika prawdopodobnie z rozwinięcia struktury przestrzennej białka, w wyniku rozpadu wewnątrzcząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych, co prowadzi do wzrostu powinowactwa do SDS, w porównaniu z tymi samymi białkami denaturowanymi w SDS przy nieobecności DTT. Takjak na fig. 2 z żelu rozdzielono również standard wielkości o niskich masach cząsteczkowych (na figurze zaznaczony jako LMW).

179 726

Sekwencje:

Sek, Id. Nr 1 obrazuje sekwencję cDNA, otrzymaną techniką PCR, kodującą białko ΑΧ1 wraz z jej peptydem sygnalnym, Kodon startu peptydu sygnalnego obejmuje nukleotydy 40-42, a kodon terminacyjny białka ΑΧ1 nukleotydy w pozycji 262-264,

Sek, Id. Nr 2 obrazuje sekwencję aminokwasową białka ΑΧ1 wraz zjego peptydem sygnalnym, Peptyd sygnalny obejmuje reszty 1-28, a dojrzałe białko reszty 29-74,

Sek, Id, Nr 3 obrazuje sekwencję cDNA, otrzymaną techniką pCr, obejmującą Sek. Id, Nr 1 fragment wzmagający wydajność t^^^sl^c j i (nukleotydy 13-79) umieszczony jest przed kodonem startowym (nukleotydy 82-84) w stosunku do peptydu sygnalnego, Sekwencja obejmuje miejsce restrykcyjne Pstl (nukleotydy 1-6) i miejsce BamHI (nukleotydy 7-12), Nukleotydy w pozycjach 80-86 tworzą miejsce Ncol, Kodon terminacyjny położony jest w pozycji 304-306, w stosunku do białka ΑΧ1, Miejsca restrykcyjne Sali i SphI obejmują odpowiednio nukleotydy 338-343 i 344 -349,

Sek, Id. Nr 4 sekwencję cDNA, otrzymanątechnikąPCR, kodującąbiałko ΑΧ2 wraz zjego peptydem sygnalnym. Kodon startu peptydu sygnalnego obejmuje nukleotydy 53-55, a kodon terminacyjny białka ΑΧ2 - nukleotydy w pozycji 275-277,

Sek, Id, Nr 5 obrazuje sekwencję aminokwasowąbiałka ΑΧ2 wraz z peptydem sygnalnym, Peptyd sygnalny obejmuje reszty 1-28, a dojrzałe białko reszty 29-74,

Sek, Id, Nr 6 obrazuje sekwencję cDNA, otrzymaną techniką PCR, obejmującą Sek. Id. Nr 4; fragment wzmagający wydajność translacji (nukleotydy 13-79) znajduje się przed kodonem startu (nukleotydy 82-84) w stosunku do peptydu sygnalnego, Sekwencja obejmuje miejsce Pstl (nukleotydy 1-6)) i miejsce BamHI (nukleotydy 7-12), Nukleodyty w pozycji 80-86 tworzą miejsce Ncol. Kodon terminacyjny położony jest w pozycji 304-306, w stosunku do białka ΑΧ2. Miejsca restrykcyjne Sali i SphI obejmują odpowiednio nukleotydy 352-357 i 358-339,

Sek, Id, Nr 7 obrazuje sekwencję cDNA, otrzymaną technikąPCR, kodującąbiałko ΑΧ3.1 wraz z przypuszczalnym peptydem sygnalnym, Kodon startu peptydu sygnalnego znajduje się w pozycji 23-25, a kodon terminacyjny białka AX3,1 w pozycji 356-358,

Sek. Id, Nr 8 obrazuje sekwencję aminokwasową nieprocesowanego produktu translacji Sek. Id. Nr 7. Przypuszczalne pre-białko obejmuje (pozycje 80-111) dojrzałe białko ΑΧ 3.1.

Sek. Id, Nr 9 obrazuje sekwencję cDNA, otrzymaną techniką PCR, obejmującą Sek, Id. Nr 7; fragment wzmagający wydajność translacji (nukleotydy 13-79) znajduje się przed kodonem startu (nukleotydy 82-84) w stosunku do peptydu sygnalnego, Sekwencja obejmuje miejsce Pstl (nukleotydy 1-6) i miejsce BamHI (nukleotydy 7-12), Nukleotydy w pozycji 80-86 tworzą miejsce Ncol, Kodon terminacyjny położony jest w pozycji 415-417, w stosunku do białka ΑΧ3.1. Miejsca restrykcyjne Sali i SphI obejmują odpowiednio nukleotydy 473-478 i 479-484,

Sek, Id. Nr 10 obrazuje sekwencję cDNHA obejmującą gen kodującąbiałko WIN z jęczmienia,

Sek, Id, Nr 11 obrazuje sekwencję aminokwasowąbiałka WIN zjęczmienia wraz zjego peptydem sygnalnym, Peptyd sygnalny obejmuje reszty 1-21, a dojrzałe białko reszty 22-146,

Sek, Id, Nr 12 obrazuje sekwencję kodującą białka WIN z jęczmienia, otrzymaną techniką PCR. Region 5' sekwencji zawiera miejsca restrykcyjne Pstl, BamHI i Ncol. W pozycji 62 pierwotnego klonu znajduje się raczej C niż G (jak to niedawno wykazano). Podstawienie C —> G nie zmienia sekwencji aminokwasowej białka, i zostało zaprojektowane w celu usunięcia miejsca Ncol. Kodon startu dla białka WIN znajduje się w pozycji 12-14, a kodon terminacyjny w pozycji 450-452,

Sek. Id. Nr 13 pokazuje zasadniczo tę samą sekwencję, co Sek. Id, Nr 12, z tym że fragment wzmagający wydajność translacji (nukleotydy 13-79 w Sek, Id, Nr 13) znajduje się przed kodonem startu, białka WIN (nukleotydy 82-84). Kodon terminacyjny znajduje się w pozycji 520-522.

179 726

Oczyszczanie białka AX1-3 z liści roślin buraka cukrowego infekowanych Cercospora beticola. Białka izoluje się z materiału liściowego roślin buraka cukrowego, odmiany Turbo lub Rhizor, zainfekowanych w naturalny sposób C. beticola:·Liście o więcej niż 50 plamkach nekrotycznych zbierano na polach uprawnych we Włoszech i przechowywano w 4°C do czasu ekstrakcji. Wszystkie czynności przeprowadzano w 4°C. Materiał w czasie oczyszczania wirowano przy 20,000 g przez 20 minut, w wirówce Centrikon model H-401B.

Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych.

kg liści roślin buraka cukrowugo zainfekowanych C. beticola homagenizowano w 4 0 trach buforu cytrynianowego (Na) pH, 5,0, zawierającege 1 mM DTT, 1 mM beazamidynę (bufor początkowy) i 200 g żywicy Dowex 1x2 (100 pm nr sita). Hemegenat przed wirowaniem filtrowano przez podwójną warstwę gazy nylonowej o średnicy porów 31 pm.

Wytrącanie ciepłem i siarczanem amonu.

Superaatant otrzymany po wirowaniu ogrzewane do temperatury 50°C przez 20 minut, schładzano do 4°C i usuwano precypitat przez wirowanie. Do supematantu dodawane następnie stały siarczaa amenu, do nasycenia 90%. Po wirowaniu wytrącone białka zawieszano w buforze peczątkewym (1 ml/10 g materiału).

Białka ΑΧ 1, ΑΧ2 i ΑΧ3 oczyszczane z precypitatu otrzymanego przez wysalanie siarczaau amonu. Po upłynnieniu precypitatu, białka dializowano webec buforu zawierającego 10 mM Tris pH 8.0,1 mMDTT i 1 mM beazamidynę. Zdenaturewaae białka usuwane przez wirowanie, · a superaatant nanoszono na kolumnę Fast Flow zawierającą złoże Sepharose Q i aa kolumnę z immebilizowaną chityną (przegotowaną, jak podano w WO92/17591); obie kolumny były ze sebą połączone. Przed naniesieniem próbki kolumny równoważono buforem Tris.

Niezwiązane białka usuwano, przemywając kolumny ekstensywnie buforem Tris. Frakcję aiezwiązanycg białek (200 ml aa kg ekstrahowanego materiału liściowego) uzupełniano do buforu H: IM siarczan amenu, 10% (v/v) glicerol, 1 mM DTT, 0.1 M KH2PO4 (pH 7.5). Roztwór białek inkubowane aastępaie z 50 ml Pheayl Sepharose (Pharmacia) w buforze H przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Zawiesinę nanoszono aa kolumnę z 50 ml Pgenyl Sepharose, zrówaeważenej buforem H. Okazało się, że roztwór zbierany z kolumny miał aktywność przeeiwgrzybową, natomiast białka eluewaae z kolumny buforem H bez siarczanu amoau nie miały tej aktywności. Wszystkie czynności wykonywane w 4°C, za wyjątkiem chromatografii na Pheayl Sepharose.

Roztwór spływający z kolumny zawierającej Pgenyl Sepharose (400 ml) dializowaao ekstensywnie wobec 20 mM octaau sedu, 1 mM DTT (pH 5.0) i nanoszono następnie na kelumaę CM-CL6B Sepharose (Pharmacia). Kolumnę przemywano buforem 1 o składzie: 50 mM ectan sedu, 10% (v/v) glicerol, 1 mM DTT (pH 5.0) i eluewano 0.25 M NaCl w· buforze 1. Frakcje zawierające białke łączone; połowę połączonych frakcji poddano filtracji żelowej aa kolumnie G-75 Sephadex (Pharmacia); 2.5 x 70 cm) zrównoważonej 50 mM MES (pH 6.0). Zbierane frakcje pe lo ml. Frakcje nr 26-30 wykazujące wyseką aktywność prkeciwgrkybewą uzupełniano Betainą do końcowej zawartości 5% (v/v).

Frakcje ar 26-3θ zebrane z kolumny G-75 Sephadex poddano jonowymiennej FPLC aa kolumnie kationowej Monę S (H/R 5/5; Pharmacia) zrównoważonej buforem A: 50 mM MES (pH 6,9), zawierającym 5% (w/v) betainę. Związane białka wymywano gradientem (0-0.3 M) NaCl w 15 ml buforu A. Otrzymane trzy główne białkowe piki elucyjne, wszystkie zawierające aktywność przeciwgrzybewą (fig. 1). Piki te określono następnie jake ΑΧ1, ΑΧ2 i ΑΧ3.

Oczyszczanie białka WIN z jęczmienia.

Białke WIN (WIN N) oczyszczano z ziaren jęczmienia lub poddanych szokowi liśei jęczmienia według Kragg et al. (Plant Sci. 71: 65-68 (l99O) lub według Hejgaard et al. Febs Letters 307: 389-392 (1992)).

Figura 2 przedstawia żel peliakrylamidewy barwiony srebrem z rozdzielonymi białkami: WIN-N izelowanym z ziaren jęczmienia oraz białkami ΑΧί, ΑΧ2 i ΑΧ3 eluowaaymi z kelumay Meae S. Każde z białek ΑΧ eluowaao jako frakcję dającąpejedyacky prążek elektreferetyczny (aawet gdy obserwowano - jak w przypadku ΑΧ3 - niewielki smir).

179 726

Sekwencjonowanie białka AX.

Każde z białek AX było karboksymetylowane i poddawane RP HPLC w kolumnie Progel TSK Octadecyl-4PW (Supelco Inc.; 150 x 4,6 mm). Fazę ruchomą stanowiły A: 0.1 % TFA w wodzie i B: 0.1% TFA w acetonitrylu. Białka ΑΧ1 i ΑΧ2 eluowano jako pojedyncze, symetryczne piki; ΑΧ3 eluowano jako dwa piki, pik główny i następujący po nim mniejszy pik (co wskazuje na istnienie dwu form oznaczonych jako AC3.1 i ΑΧ3.2.). Białka ΑΧ1, ΑΧ2 i ΑΧ3.1 sekwencjonowano metodami dobrze znanymi specjalistom.

Aktywność przeciwdrobnoustrojowa AX1 - AX3.

Hamowanie wzrostu grzybów mierzono w 96 - cio studzienkowych płytkach do rozcieńczeń, przy długości fali 620 nm, zasadniczo według WO 92/17591.

Białka ΑΧ1, ΑΧ2 i ΑΧ3 osobno lub w połączeniu z WINN (oczyszczano z ziaren jęczmienia lub poddanych szokowi liści jęczmienia według Hejgaard et al. FEBS Letters 307: 389-392 (1992)), inkubowano ze sporami C. beticola. Mieszanina testowa (240 lub 260 pl) zawierała 100 pl pożywki z dekstrozy ziemniaczanej (Difco), 40 lub 60 pl próbki badanych białek (lub bufor kontrolny) w 100 mM Tris i 20 mM NaCl (pH 8,θ) jak również około 400 spor w 100 pl wody. Płytki zalepiano taśmą klejącą dla uniknięcia zakażenia i odparowywania wody, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej, w wytrząsarce przy 200 obr./min. Jak pokazano na fig. 3B, absorbancję przy 620 nm mierzono każdego dnia przez dni 8. Wyniki przedstawiono w postaci wykresu, gdzie najednej osi odłożono stężenie białka, a na drugiej czas. Określano stężenie (w pg białka na ml końcowej mieszaniny testowej) powodujące zahamowanie wzrostu o 50% po 72 godzinach I₅₀.

Jak wynika z fig. 3 A i 3B, każde z białek ΑΧ w znaczący sposób redukuje wzrost C. beticola in vitro. Aktywność przeciwgrzybowa białka ΑΧ2 jest zaznaczona szczególnie; już w stężeniu 2 pg/ml ( około 0.5 pPM), po 772 godzinach irNuUacjji hamuje wzrost o 50% (I55). Samo białko ''WIN N wykazuje umiarkowaną aktywność przeciwgrzybowa; 160 pg/ml (około 1 pM) wystarcza do zahamowaaia wzrostu C. beticola o 50% po 72 godzinach inkubacji (dane nie przedstawione). Połączenie białek ΑΧ2 i WIN N powoduje znaczący przyrost aktywności przeciwgrzybowej i przedłużone zahamowanie wzrostu grzybów. Z fig. 3A wynika niezbicie, ze potencjał hamowania wzrostu C. beticola przez ΑΧ2 jest większy niż przez ΑΧ1. ΑΧ2 i WIN N nie wykazują działania grzybobójczego wobec C. beticola, a raczej znacznie spowalniają tempo rozgałęziania się plechy w psrówaaaiu z Kontrolą. Morfologie grzyba jest również zmieaioaa w sposób znaczący, w konsekwencji działania ΑΧ2 i/lub WIN N Opatrz fig. 4).

Ponadto ΑΧ1, ΑΧ2 i ΑΧ3 (i ich Kompozycje) fakultatywnie w obecności WIN N, wykazuj ąaiewielki lub żaden, znacząco szkodliwy wpływ aa dojrzewanie pyłku buraka cukrswe/s, w przypadku stosowania dawek o działaniu efektywnym wobec C. beticola, co wskazuje ac brak toksycznego wpływu na Komórki roślinne.

Aktywność przeciwgrzybowa białek AX skierowana przeciw patogenom kukurydzy.

Białka ΑΧ według wynalazku oceniano względem ich aktywności przeciwgrzybowej wobec wielu pato/enów Kukurydzy. OZaośaie wyników przedstawionych w tabelach li 2, przeprowcZzono następujące bcdcaia białek ΑΧ pod względem ich działania na patogeny Kukurydzy: 5 pl roztworu zawierającego białka we wskazanych stężeniach przenoszono aseptycraie do studzienek o zcsKrąoloaym Zaie sterylnej płytki do rozcieńczeń. Wszystkie próby wykonywano w pojedynczym powtórzeniu. Niezaszczepione i zaszczepione pożywki Hodowlane bez zawartości roztworu Białek stosowano rutynowo jcko roztwory Kontrolne. Do Każdej próbki Dodawano aseptyczaie spory (100-150) w 5,0 pl dwukrotnie stężonej pożywki z dekstrazy ziemniaczanej (PDB).

Próbki mieszano łagodaie do połączenie próbki Badanej i zawiesiny spor, spojenie płytki pokrywano dwiema warstwami parafilmu w celu zmniej szeaia parowania i inkuaswano w 19 ± 0,2°C z okresem naświetlenia 16 godzin.

Co 24 godziny zliczano wyKiełKowaae spory i obserwowano wzrost grzybni we wszystkich studzienkach. Po 120 godzinach oKreślaao stopień aktywności przeciworzybowej. Rezultaty przedstawiono w tabelcch 1 i 2. Dane z tabeli 1 wskazują minimalne stężenie Białke niezbędne do przejawienia się efektu hamowanie wzrostu grzyba, a Zaae z tabeli 2 - stężenie

179 726 białka hamujące wzrost grzyba o 50% w porównaniu z kontrolną hodowlaną, w której grzybnia rośnie przy nieobecności testowanego białka.

Tabela 1

Patogen/Choroba	Minimalne stężenie hamujące (pg/ml)
WINN	ΑΧ1	ΑΧ2
Bioplaris maydis Southern Com Leaf Blight	ni	20	30
Cercospora zeae maydis Gray Leaf Spota
Colletotrichu graminicola Anthracnise Stalk Rot	ni	50	50
Diplodia maydis Diplodia Ear & Stalk Rot	64	11	ni
Exserohilum turcicum race 1 Northern Com Leaf Blight Race 1	ni	11	98
Exserohilum turcicum race 2 Northern Com Leaf Blight Race 2	193	33	ni
Fusarium graminearum Fasarium Ear & Stalk Rot	ni	33	33
Fusarium moniliforme Fusarium Ear & Stalk Rot	ni	ni	ni
Gibberella zeae Gibberella Ear & Stalk Rot	ni	ni	ni

Tabela 1. Aktywność przeciwgrzybowa białek ΑΧ1, ΑΧ2 i WIN N wobec wybranych patogenów kukurydzy, („ni” oznacza, że białka nie hamowały wzrostu grzyba).

Odnośnie wyników przedstawionych w tabeli 3, badania białek AX i WIN N, względem wymienionych patogenów przeprowadzono jak następuje. Grzybnie wymienionych grzybów zostały zawieszone w kropli stopionego agaru i pozostawione do zastygnięcia. Krople zakrzepniętego agaru zawierające grzybnie pokrywano następnie badanym białkiem w określonych stężeniach i inkubowano przez 5 dni, w wilgotnym środowisku. Określano następnie stopień grzybni w porównaniu z kontrolą, którą stanowiły agarowe krople zawierające grzybnie, nie pokryte testowanym białkiem. Wyniki zebrane w tabeli 3 przedstawiają ilości białka niezbędne do zahamowania wzrostu patogenów grzybowych o 50%.

Tabela 2

Patogen/ Choroba	ΑΧ1	ΑΧ2	WINN
(Stężenie białka (pg/ml) powodujące zahamowanie wzrostu o więcej niż 50%)
1	2	3	4
Colletotrichum graminicola Anthracnose stalk rot	50	50	• 1 ni
Fusarium monoliforme	ni	ni	ni
F. graminearum Fusarium ear and stalk rot	33	33	ni

179 726 cd tabeli 2

1	2	3	4
Gibberella zeae Gibberella stalk rot	ni	ni	ni
Diplodia maydis Diplodia stalk rot	11	ni	64
Bipolaris maydis Southern com leaf blight	20	33	ni
Exserohilum turcicum Northern com leaf blight	33	ni	193

Tabela 2. Ilość białka niezbędna do zahamowania wzrostu patogenów grzybowych (zebranych w tabeli 1) o 50%. („ni” oznacza, że białka nie hamowały wzrostu grzyba).

Tabela 3

Patogen/Choroba	Stężenie białka (pg/ml)
ΑΧ1 20	ΑΧ2 20 40	WTNN 20 40
	Zahamowanie wzrostu (%)
Monilinia fructigena Brown rot of fruit	80	80	ni
Cochliobolus sativus Cereal foot rot	30	30	ni
Cereal eye spot Pseudocercosporella herpotrichoides	30	30	30
Pyricularia oryzae	ni	20	ni
Rhizoctonia solani	ni	10	ni
Fusarium culmorum	ni	10	ni
Leptosphaeria nidorum	ni	10	ni
Botrytis cinerea	ni	10	ni

Tabela 3. Procent hamowania wzrostu grzybów dla poszczególnych stężeń badanych białek, dla innych patogenów, („ni” oznacza, że białka nie hamowały wzrostu grzyba).

Jsk wynika z fig. 3A, 3B i 4A-D oraz z tabeli 1 -3, białka ΑΧ1, ΑΧ2 i ΑΧ3, stosowane fakultatywnie w kombinacji z białkiem WIN N, wykazują działanie fungistatyczne. W konsekwencji dostarczają roślinom, a w szczególności burakom cukrowym i kukurydzy, znacząco ulepszonej oporności przeciw chorobom (szczególnie przeciw infekcjom grzybowej) włączając w to choroby powodowane przez C. beticola i liczne patogeny kukurydzy.

Sekwencjonowanie białek.

Sek. Id. 2,5 i 8 pokazują odpowiednio sekwencje aminokwasowe białek AX 1,2 i 3.1. Sekwencie te obejmują odpowiednie peptydy sygnalne. W przypadku ΑΧ1 i ΑΧ2 peptydy sygnalne obejmują reszty 1-28, a dojrzałe białko składa się z reszt 29-74. W przypadku ΑΧ3.1 przypuszczalne pre-białko obejmuje dojrzałe białko ΑΧ3.1 (reszty 80-111). Sek. Id. Nr 11 przedstawia sekwencję aminokwasową białka WIN z roślin jęczmienia wraz z jego peptydem sygnalnym.

Z analizy sekwencji aminokwasowej wynika, że białka ΑΧ1 i ΑΧ2 są białkami spokrewnionymi, obejmującymi każde 46 aminokwasów.

179 726

Z Sek. Id. Nr 2 można odczytać sekwencję białka ΑΧ1 pozbawionego peptydu sygnalnego.

Ala He Cys L yS Lys Pro Ser Lys Phe Phe Lys Gly Ala Cys Gly M~g Asp Ala Asp

Cys Glu Syp Ala Syp Asp Gin Glu Asn Trp hrs Gly Gly Val Syp Val hrs Ohe Seu

Arg Cys Glu Cys Gin Arg Ser Cys

Z Sek. Id. Nr 5 można odczytać sekwencję białka ΑΧ2 pozbawionego peptydu sygnalnego.

Ala . Thr Cys Arg Sys hrs Ser Met Tyr Ohe Ser Gly Ala Cys Ohe Ser Asp Thr Asn Cys Gin Sys Ala Cys Asn Arg Glu Asp Trp hrs Asn Gly Sys Cys Seu Val Gly Ohe Sys Sys Glu Sys Gin Arg hrs Sys

Z Sek. Id. Nr 8 można odczytać sekwencję białka AX 3.1 pozbawionego peptydu sygnalnego.

Arg Cys Ile hrs Sys Gly Gin Asp Sys Ile Ser Ser Arg Asn Cys Sys Ser hrs Sys Sys Cys Asn hhe Gly hrs hrs Val hrs Arg Sys Thr Asn

Pierwszych 45 reszt aminokwasowych z N końca każdego z białek oznaczono metodą sekwencjonowania białka. Reszta 46 ΑΧ1 jak ΑΧ2 została zidentyfikowana jako cysteina na podstawie sekwencji nukleotydowej odpowiadających klonów cDNA (odpowiednio Sek. Id. Nr 1 i 4), otrzymanych techniką PCR, oraz poprzez porównanie z innymi homologicznymi białkami z innych nie wykazuje znaczących homologii sekwencyjnych z innymi białkami

Tabela 4

Reszta	ΑΧ1	ΑΧ2	ΑΧ3
Asp	4,0	5,0	4,1
Thr	0,1	2,0	1,0
Ser	2,1	3,1	3,0
Glx	5,7	4,4	1,1
Pro	3,2	3,2	5,1
Gly	4,3	3,2	2,1
Ala	4,1	3,1	0,0
Cys	6,9	6,9	6,2
Val	2,0	1,1	1,0
Met.	0,0	0,9	0,0
Ile	1,0	0,1	2,0
Leu	1,1	1,1	0,0
Tyr	0,0	0,9	0,0
Phe	3,1	3,0	1,0
His	0,0	0,0	0,0
Lys	5,1.	4,0	1,0
Arg	3,2	3,1	3,2
Trp	n.d.	n.d.	n.d.

Tabela 4. Skład aminokwasowy białek AX

199 926

Tabela 5

Białko	Masa cząsteczkowa (D)
ES-Ms	Otrzymywane z cDNA (-8H+)
ΑΧ1	5078,1	5086 - 8 =5078
ΑΧ2	5193,4	51^5-8+16 = 5193
ΑΧ3.1		3452,5 3460 - 8 = 3452

Tabela 5, Masy cząsteczkowe ΑΧ12 i 3,1 oznaczone metodą spektrometrii masowej (Electro-Spray Mass Spectrometry) oraz wydedukowane z sekwencji nukleotydowej kodujących je genów.

Produkcja stransformowanych roślin.

Do roślin wprowadzono geny kodujące białka ΑΧ, W oparciu o specyficzne względy genów primery, z odpowiadających mRNA zsyntetyzowano techniką PCR regiony genów kodujące białka ΑΧ1, ΑΧ2 i ΑΧ 3.1, tzn, 3' RACE i następujący po nim 5' RACE, Po dodaniu sekwencji stosownych promotorów (takich jak 35S) i terminatorów (takich jak 35S), geny kodujące białka ΑΧ wprowadzono do roślin, w roślinnym wektorze transformacyjnym, Korzystne jest by element wzmagający translację był wprowadzony do vektora w miejscu położonym w kierunku 5' od sekwencji kodującej białko (patrz, np. Sek, Id, Nr 3,6 i 9). Wektor zawiera również stosowne geny markerowe, dobrze znane specjalistom. Wektor zawiera fakultatywnie gen kodujący białko WIN, takie jak otrzymywane z poddanych szokowi liści jęczmienia lub ziarenjęczmienia (wraz z, jeżeli jest to pożądane, sekwencjami wzmagającymi translację; patrz, np, Sek. Id. Nr 13), i/lub genem kodującym chitynazę i/lub glukanazę, Preferowanąchitynaząjcst chitynaza 4, przedstawiona w zgłoszeniu patentowym PCT nr PCT/DK92/00108 (Publikacja nr WO92/17591), Wektorami takimi może być stransformowana, np, bakteria Agrobacterium tumefaciens. Następnie tak przygotowanymi, stransformowanymi komórkami Agrobacterium, traktowane sąkomórki roślinne, i powstające stransformowane komórki roślinne regenerowane są do pełnych roślin, w których nowy materiał jądrowy jest stabilnie włączony do genomu. Uznaje się, że DNA kodujący białko ΑΧ (lub kombinację takich białek), fakultatywnie kodujący ponadto białko WIN i/lub chitynazę i/lub glukanazę (lub kombinację takich białek), może być wprowadzony do komórek roślinnych również innymi znanymi metodami, włączając w to technikę „wstrzeliwania DNA”, elelktroporację, elektrotransformację czy mikroiniekcję itd,, i że regeneracja stransformowanych komórek roślinnych przeprowadzona była metodami znanymi specjalistom, włączając w to poddawanie komórek działaniu cytokinin gdy jest to niezbędne lub pożądane w celu poprawienia wydajności regeneracji.

Tym samym produkowane są rośliny ziemniaka i buraka cukrowego transgeniczne wobec białek ΑΧ. Zrekombinowane sekwencje DNA obejmujące, na przykład, sekwencje wybrane spośród Sek. Id, Nr 3,6 lub 9 wprowadzane są znanymi metodami (włączając kotransformację) do roślin ziemniaka lub buraka cukrowego. Uznaje się również, że może być wykorzystany zrekombinowany DNA obejmujący sekwencje przedstawione w Sek. Id. Nr 1,4 i 7, jakkolwiek sekwencje te nie zawierają elementu wzmagającego translację, położonego w kierunku 5' od kodonu startowego regionu kodującego różne peptydy sygnalne białek ΑΧ, Na przykład ekspresja genu kodującego ΑΧ2, wykrywana jest poprzez identyfikowanie produktu genu ΑΧ2, Obecność tego białka w roślinach jest następnie wykazywana metodami immunochemicznymi z wykorzystaniem przeciwciał skierowanych przeciw wzorcowi tego białka, W celu zwiększenia immunogenności białek, mogą być one związane z nośnikiem w postaci toksoidu błonnicy lub mogą być sprzężone z polilizyną przed mikroiniekcją do organizmów królików,

Produkowane ekstrakty z transgenicznych roślin ziemniaka lub buraka cukrowego są częściowo oczyszczane i testowane, zgodnie z testem mikromianowania przedstawionym powyżej, na ich zdolność hamowania wzrostu Cercospora.

179 726

Ekstrakty uzyskane z roślin transgenicznych wobec białka AX hamują w zasadniczy sposób wzrost grzybów', w porównaniu z podobnymi ekstraktami uzyskanymi z nletransgenlcznych roślin ziemniaka lub buraka cukrowego.

Ponadto stosowne mikroorganizmy (tzn. takie, dla których komórek produkowane białka AX sązasadniczo toksyczne) mogą być transformowane wektorem zawierającym gen (lub geny) kodujące białka AX (lub kombinacje białek AX), tak że organizmy stransformowane produkują takie białko. Ponadto takie mikroorganizmy mogą zawierać gen kodujący inne białka, tj. białko WIN (w rodzaju przedstawionego w Sek. Id. Nr 11) 1/lub różne chitynazy i/lub glukanazy. Szczególnie preferowanym białkiem jest chitynaza 4 przedstawiona w zgłoszeniu patentowym PCT nr PCT/DK92/00108 (publikacja nr WO92/17591).

Mikroorganizmy takie mogą być zastosowane następnie do zwalczania roślinnych patogenów. Na przykład, stransformowany mikroorganizm może być wysuszony 1 rozpylony nad zainfekowanymi roślinami lub roślinami zagrożonymi infekcją.

179 726 wyszczególnienie sekwencji (1)

OGÓLNE INFORMACJE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: SANDOZ LTD (B) ULICA: Lichtstrasse 35 (C) MIASTO: BAZYLEA (D) STAN: BS (E) PAŃSTWO: SZWAJCARIA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): CH-4002 (G) TELEFON: 061-324-2327 (H) TELEFAX: 061-324-7532 (I) TELEX: 965-05055 (A) NAZWA: Sandoz Patent GMBH (B) ULICA: Humboltstrasse 3 (C) MIASTO: Loerach CE) PAŃSTWO: Niemcy (F) KOD POCZTOWY (ZIP): D-7850 (A) NAZWA: Sandoz Erfindungen

Vervaltungsgesellschaft MBH (B) ULICA: Brunner Strasse CC) MIASTO: Wiedeń

CE) PAŃSTWO: Austria (F) KOD POCZTOWY (ZIP): A-1230 (ii) TYUŁs WYNAAZKUU : Białka pr~zeciwdi~obnousŁi~ojowe

Ciii) LICZBA SEKWECJJU : 13 (iv) CZYTELNA DLA KOMPTTERA:

CA) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release # 1.0, wersja #1.25 (EPO) (2) INFORMACJA DLR SEKW. NR ID: 1:

(i ) CURRKiTERYSTYKIA SEKWENCJI:

CA) DŁUGOŚĆ: 437 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy

CC) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: podwójna

CD) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECKJI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNU: EJIE (iii) ΙΕίΤΙ-SENSU: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZMU Beta vulgariss (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) ULOKOWANIE: 40..264

179 726 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. IRI ID: 1:

ATACGCATTT GTTTNAAAGT TNAAANAAAG ANNAAAAAA ATG GAG AAG AAA TTN 54 Met Glu Lys Lys Phe

5

TTT Phe

GGG CTT TTG CTT TTG

TTG TTT TCT TCG TTT GCT TCT GAG ATG AAT

102

Giy

Leu

Leu 10

Leu

Phe

Val 15

Phe

Tla

Ser

Glu Met 20

Tsn

ATT

GTG

ACT

AAG

GTT

GAT

GGT

TGCr

ATA

K^C

GATG

TATA

CCCT

AGT AAG

TTT

150

Ile

Val

Thr

Lys

Val

Asp

Gly

Ala

Ile

Cys

Lys

Pro

Ser Lys

Phe

25

30

35

TTC

AAA

GGT

GCT

TTC

GGT

AGA

GAT

GCC

GAT

ΊΌΤ

GAG

TTAG

GCT TGT

GGT

198

Phe

Lys

Gly

Ala

Cys

Gly

Trg

Asp

Ala

Tsp

Cys

Glu

Lys

Ala Cys

Asp

40

45

50

CAA

GAG

AAT

tgg

GTT

GGC

GGA

GTT

TGT

GTA

CCC

ΤΓΤ

CTC

AGA TGT

GGAT

246

Gin

Glu

Asn

Trp

Pro

Gly Gly

Val

Cys

Val

Pro

Phe

Leu

Arg Cys

Glu

55

60

65

TGT

CAG

AGG

TCT

TGC

TAACCACGCN AACNCACCCA CGATAAAAAG AAGTANTGCT

301

Cys

Gln

Arg

ler

Cys

70

75

AATGAAGNTA TGGGTNAATA TTTTTNAATN CTATAATATT AAATAAATTG TTGTAACTAT 361

TTTAAGTGTG TAATAAATNT ANGTGGGTTT AATCTCCACT ATTGCTTTTG AAATAATGAT 421

TTANATATAA GTTTNA 437 (2) INFORMACJA DLA STKK. ER JD: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 74 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTCCZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. IR. ID: 2:

Met 1

Glu

Lys

Phe 5

Phe

Gly

Leu

Leu 10

Leu

Phe

Val 15

Phe

Ala

Ser

Glu

Met 20

Asn

Ile

Val

Thr

Lys 25

Val

Asp

Gly

Ala

Ile 30

Cys

Lys

Pro

Ser 35

Lys

Phe

Lys

Gly 40

Tla

Cys

Gly

Arg

Asp 45>

Ala

Asp

Cys

Glu

Lys 50

Tla

Cys

Asp

Gln

Glu 55

Asn

Trp

Pro

Gly

Gly 60

Val

Cys

Val

Pro

Phe Leu Arg Cys Glu Nys Gin Arg ler Cys 65 70

179 726 (2) INFORMACJA DLA -EKW. NR ID: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWEENJJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 349 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: podwójna (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTCCZU : cDNA (iii) HIPOTTTYCNNY: NIE (iii) ANTI-ENNE:: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHOCEEJU:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (xi) OPIS SEKWECJH: SEWW. NR H : ::

CTTYATTAAT	YCAAATTTAA	CAACAATTAC	/AY/AY/AY:	aayaayaaa:	ααυ/αταυ/:	60
ATTACTATTT	ACAATTACAC	CATTTATAAT	aattytttt:		11(22/222:	120
TTYATATATT	YTTYTTATAT	GAATATTGTG	ΥΤΑ/ΤΤΑΤΤ:	TTTGTCAAA:	atyaataaa:	180
CCAAGTAAGT	TCTAYAAATT	TTYTTACTTT	tatattyyt:	tttatataa:	tytttatat:	240
CAAGAGAATT	TTYCTTTCTT	AGTTTGTGTA	CYTTTCTC/:	ΑΑΤΤΤΑΑΤΤΆ	yatattayt:	300
TACTA/TYAY	TTYAATYYAY	GGACGATAAA	ATA/TYTAC:	αυτυαττυ:		499

(2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 4:

(i) CHARAKTERNARYKA EEWENYJJ!:

(A) DŁUGOŚĆ: 492 zasadowe pary (B) TRP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: podwójna (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TRP CZĄ-STEYCECI: cDNA (iii) CIPOTETRYC3TY: NIE (iii) ANTI-SENSE: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCRODaNilA:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (ix) CECHA:

(A) NACWA/ELUCZ: CDN (B) ULOKOWANIE: 53..277 (xi) OPIS -EEWENCJJI: -EKWL NR ID: 4:

CYATAYATTA TATACGTATT TTTTTY/AAT TTCAAACAAA GACAAAACAA AA ATT 55

Met

GAG AAA AA/ TTC TTT (TAC CTIT TTC CTT TTGCTA CTC TTC GTA ΓΤΓ GCT 103

Glu Lys Lys Phe Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe Ala

10 11

179 726

TET Ser

GAG CEG AAC ATG GTG

GCT AGG TTT EAA GGG GCC AAT TGT AGA GAA

151.

Glu Leu 20

Tsn Met Val

Ala Glu 25

Val

Gin

Gly Ala

Thr 30

Cys Arg Lys

CEA

AGT

ATT

TTT

TTE

AGC

GGC

CGG

TNG

TGT

TCE

GAT

A(G

AAT

ΤΤΤΓ

CAG

199

Pro

Ser

Met

Tyr

Phe

Ser

Gly

Ala

Cys

Phe

Ser

Asp

Thr

Asn

Cys

Gin

35

40

45

AAA

GCT

TTG

AAT

EGA

GAG

GAT

TGG

CTG

AAT

cgg

GAA

gig:

GGA

GTC

GGGT

247

Lys

Ala

Cys

Asn

Arg

Glu

Asp

Trp

Pro

Asn

Gly

Lys

Cys

Leu

Val

Gly

50

55

60

65

TTE

AAA

TGT

GAA

TGT

CAA

AGG

CCT

TGT

TTAGTGGTGN CGCTCTECTC

294

Phe

Lys

Cys

Glu

Cys

Gin

Arg

Pro

Cys

70

75

AATTACGGCC TANGAGNETG TCAGGTACCT ATGGGGNCGA GTATGGCTAA ATTGGTAATA 354

GTACATAGCA GTGGTAATAT GAATAAACGA TTCACTCTTG TAAGATGTAT TATGTTTTGT 414

TTGTGCTGTG GTTTCCAGTT GCTTTTGAAA ATAATGATTT TCATATAAAT CGGACCTTTT 474

ATTCTGATAA AAAAAAAA 492 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 74 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄTEECKKI: białko

(xi)

OPIG

SEWWENJJ:: EEWW .

NR

ID :

::

Met

GGu

Gys

Lys

Phe

Gly

Leu

Phe

Vil

Phe

5

10

15

Ala

Ser

Glu

Leu

Asn

Met

Vil

Ala

Glu

Val

Gin

Gly

Ali

Thr

Cys

Arg

20

25

30

Lys

Pro

Ser

Met

Tyr

Phe

Ser

Gly

Ala

Cys

Phe

Ser

Asp

Thr

Asn

Eys

35

40

45

Gin

Lys

Ala

Nys

Asn

Arg

Glu

Asp

Trp

Pro

Asn

Gly

Lys

Cys

Leu

Vai

50

55

60

Gly

Phe

Lys

Eys

Glu

Cys

Gin

Arg

Pro

Nys

70 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJII:

(A) DŁUGOŚĆ: 363 zasadowe par (B) TYP: kwas nukleinowy (E) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: podwójna (D) TOPOLOGIA: nieznana

179 726 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii) jMMTI-SINSSE: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (xi) OPIS SEKWENCJE SEKW: NR ID: 6:

CTGCAGGGAT	CCTATTTTTI	CIACAATTIC	CAACAACAAC	AAACAACAAA	CdACATTACA	60
ATTACTATTT	ACIATTACAC	CATGGAGAIA	iaattctttg	ggcttttgct	TOGGATACTC	120
TTCGTATTTG	CTTCTGAGCT	GIACATGGTG	GCTGAGGTTC	AAGGTGCCAC	TTCTAGGAAAI	180
CCACGTATGT	ATTTCAGCGG	CGCTTGCTTT	TCGGATACGA	ATTGTCAGAA	ACGCGTCTGAIT	240
CGAGAGGATT	GGCCTAATGG	GIAATGCTTA	GTCGGTTTCA	AATGTGAATG	TCAAACGGCAAT	300
TGTTAAGTGG	TGCCTGTGTC	CTCAATTICG	GCCTACGAGC	CTTTCAGGTA	(AGTCAGAAGCA	360

TGC 363 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJE (A) DŁUGOŚĆ: 596 zasadowych par (Β) ΤΎΡ: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: podwójna (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTEZKU: cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii) ANTn-SENE:: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENU:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (ix) C^^CIU:

(A) EAZWA/KLUCZ: CDS (B) ULOKOWANIE: 23..358 (xi) OPIS SEKWENCJE SEHOL ER ID: 7:

AGGCAACCCA ATAGAAACAA TC ATG GCA AGG AAC TCA TTC AAC TTC CTC ATT 52

Met Ala Arg Asn Ser Phe Asn Phe Leu Ile

10

ATC ATG GGC ATT

TCA Ser 15

:ca :ag :at crc

CTC Leu 20

<^<^T Pro

(GIA TCA CGT GCA A(GC

100

Ile Met Val

Ile

Ala

Leu

Gly

Ser Arg

Ala 25

Ser

TTT

CAG

GAA

AAG

.ATA

ACT

ATG

AAC

ATA

GAA

GI^T

(GIA

(CGC

GAA

AAG

:gc

148

Phe

Gin

Glu

Lys

Ile

Thr

Met

Asn

Ile

Glu

Asp

Gly

Arg

Glu

Ser

Gly

35 40

179 726

ATA GCA AGA Ile Ala Lys

AAA Glu

AAG GAT GAG GCA GGA AGA AGA AGA AGA. ACTA

ATT ATT Leu Leu

109

Ile

Val Glu

Ala 50

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu 55

Ala

45

ACA GTT

GGA

AGA

AAG

GAT ATG

CTG

GGA

ACA.

ATA

ΑΊΑ

ACA

AGA

CC ATA

224

Arg Val

Gly

Glu

Gin

Ala Met

Leu

Glu

Gin

Val

Met

Thr

Arg

Gly Leu

60

65

70

GCA GAT

ACA

GGA

AAA

GGG TGT

ATA

CA

GAT

CT

CCA.

GAC

TGC

ATT TC

222

Ala Asp

Asn

Leu

lys

Arg Cys

Ile

Pro

Cys

Gly

Gln

Asp

Cys

Ile Ser

75

80

85

90

TCA AGA

AAA

GTG

CGT

AAA AAT

TGC

/AA

GGCC

GAC

ATT.

(CCC

cca

(AAG GIT

340

Ser Arg

Asn

Cys

Ser Pro

Cys

Lys

Cys

Asn

Phe

Gly

Pro

Pro Val

95

100

105

CCA AGG

TGT

AAT

TGAATGATTA GATTGCTGCT TAGTGCTAAA TGATAAGCGC

395

Pro Arg

Cys

Thr

Asn

110

TACGCTTGCT AGTATGTGCA CGATCCGCTC TATCTCTTTA TATGCACCTA AGTCCTTTCA 455

TCTCGACTGT gttgtttgtg tgtaaaataa AGTCTTGGTT TTCCAAGACT ACTAGTTTAG 515

TTACTGGCTT ATGTTTTTCG GAATCTTGAT ATATAAATAA GACAAGGAGA CCTAGTGTCGT 575

GCTTTGCTTA AAAA/AAAAAA A 596 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 8:

(i) OARAKGTERYSTYKAG SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 111 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYPA CZĄSEECZJI: białko

	(xi)	OPIS	SEKWENCH a SEWW.	. NRG ID:	8:
Met 1	Ala ZA-g	Asn Ser 5	Phe Asn Phe Leu	Ile Ile 10	Met Val Ile Ser Ala 15
Leu	Leu Leu	Leu IPo 20	Gly Ser Arg Ala 22	Ser Phe	Gln Glu Lys Ile ΉΤτ 30
Met	Asn Ile 35	Glu Asp	Gly Arg Glu Ser 40	Gly Ile	Ala Lys Glu Ile Val 45
Glu	Ala Glu 50	Ala Glu	Ala Glu Ala Leu 55	Leu Arg	Val Gly Glu Gln Ala 60
Met 65	Leu Glu	Gln Val	Met Thr Arg Gly 70	Leu Ala 77	Asp Asn Leu Lys Arg 80
Ays	Ile Pro	Cys Gly 85	Gln Asp Ays Ile	Ser Ser 90	Arg Asn Ays Cys Ser 95
Pro	Ays Lys	Ays Asn 100	Phe Gly Pro Pro 100	Val Pro	Arg Cys Thr Asn 110

179 726 (2) INFORMACJA DLR SEKW. NR ID: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 484 zasadowe pary (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁRŃCUCHR: podwójna (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) hipotetyczny: NIE (iii) CNTI-SENSE: NIE (vi) ŹRÓDŁO P^OCH^C^I^^^iJIit:

(A) ORGANIZMU Beta vulgaris (xi) OPIS SEKWEECJJI: SIKWi. NR ID: 9:

CTGCRGGGAT CCTHTTTTTA CAACCATTAC RRCRRCRRCC AHACCAARAA CCHCAHCACA 60

ATTRCTRTTT ACRATTACRC CRTGTCHAGT RCTCITTCi: CTTCCTCCTT TATCAHTTTC 120

ATTTCCGCAC TGCTTTTGCT CCCTGTCTCA GTGCCAGCCT TCCGTCRAAA GATAACTATG 180

AACRTAGAAG ATGTACGCTR CRGCGGCATA CCRCGGRCRC CGTTTGTTCC AGAAGCAGGR 240

GCAGRAGCAT TATTACGCGT TGTTGCGCHR CTCTGCTTGG ΚΙΑΤΤΙΑΤ: GACCCATHTTC 300

TTAGCAGRTA ACCTTAAGAT GTGTATACCA ΤΤΤΤΤ^ΑΤ: CTGCATTTrc CC^CCRRGJHH^C 360

TTTTGCTCAC CTTGCCCATG CARCTTCGGT (Α((ΤΤΤΤΚ: CRAC-OTTCC: TCHiTITTHiTG 420

CTTAGCTTGC TGCTTAGTGC TACATGCTAR (Α^^Αί^ ΤΟΟΤΑΟΑΤΤ: TTGGTCGAICG: 480

ATGC 484 (2) JEFORMCCJR DLR SEKW. NR ID: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWEECJJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 504 zasadowe pary (B) TYP*: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: podwójna (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTEYCZEYY: NIE (iii) ANTIsENNEY: NIE (vi) POCHODEEJIY:

(C) ORGANIZMY Hordeum vulgare (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) ULOKOWANIE: 1..441

179 726 ixi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 10:

ATG Met 1

GCG GCA

CGC Arg

CTG ATG

CTG GTG GCG GCG CTG CTG TGC GCG GCG GCG

48

Ala

Leu 5

Met

Leu Val Ala

Ala 10

Leu

Cys

Ala Ala Ala 15

GCC

ATG

GCC

ACG

GCG

CAG

GCG

AAC

GTC

CGG

GCG

ACG

TAC

CAC

96

Ala

Met

Ala

Thr

Ala

Gin

Ala

Asn

Val

Arg

Ala

Thr

Tyr

His

20

25

30

TAC

CGG

CCG

GCG

CAG

AAC

TGG

GAC

CTG

GGC

GCG

CCC

GCC

GTG

144

Tyr

Arg

Pro

Ala

Gin

Asn

Trp

Asp

Leu

Gly

Ala

Pro

Ala

Val

35

40

45

AGC

GCC

TAC

TGC

GCG

ACC

TGG

GAC

GCC

AGC

AAG

CCG

CTG

TCG

TGG

CGG

192

Ser

Ala

Tyr

Cys

Ala

Thr

Trp

Asp

Ala

Ser

Lys

Pro

Leu

Ser

Trp

Arg

50

55

60

TCC

AAG

TAC

GGC

TGG

ACG

GCG

TTC

TGC

GGC

CCC

GCC

GGC

CCC

CGC

GGG

240

Ser

Lys

Tyr

Gly

Trp

Thr

Ala

Phe

Cys

Gly

Pro

Ala

Gly

Pro

Arg

Gly

65

70

75

80

CAG

GCG

GCC

TGC

GGC

AAG

TGC

CTC

CGG

GTG

ACC

AAC

CCG

GCG

ACG

GGG

288

Gin

Ala

Cys

Gly

Lys

Cys

Leu

Arg

Val

Thr

Asn

Pro

Ala

Thr

Gly

85

90

95

GCG

CAG

ATC

ACG

GCG

AGG

ATC

GTG

GAC

CAG

TGC

GCC

AAC

GGC

GGG

CTC

336

Ala

Gin

Ile

Thr

Ala

Arg

Ile

Val

Asp

Gin

Cys

Ala

Asn

Gly

Leu

100

105

110

GAC

CTC

GAC

TGG

GAC

ACC

GTC

TTC

ACC

AAG

ATC

GAC

ACC

AAC

GGG

ATT

384

Asp

Leu

Asp

Trp

Asp

Thr

Val

Phe

Thr

Lys

Ile

Asp

Thr

Asn

Gly

Ile

115

120

125

GGG

TAC

CAG

GGC

CAC

CTC

AAC

GTC

AAC

TAC

CAG

TTC

GTC

GAC

TGC

432

Gly

Tyr

Gin

Gly

His

Leu

Asn

Val

Asn

Tyr

Gin

Phe

Val

Asp

Cys

130

135

140

CGC GAC TAGATTGTCT GTGGATCCAA GGCTAGCTAA GAATAAAAGG CTAGCTAAGC 488

Arg Asp

145

TATGAGTGAG CAGCTG 504 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 146 aminokwasów (Β) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)

TYP CZĄSTECZKI: białko

179 726 (xi) HPIS SEKWENCJI: -EKW. INR ID: U:

Met 0

Ala

Arg

Leu 5

Met

Leu

Val

Ala

Ala 10

Leu

Cys

Ala

Ala 15

Ala

Met

Ala

Thr 20

Ala

Gln

Ala

Asn 25

Asn

Val

Arg

Ala

Thr 30

Tyr

Cis

Tyr

Arg 35

Pro

Ala

Gln

Asn

Asn 40

Trp

Asp

Leu

Gly

Ala 45

Pro

Ala

Val

Ser

Ala 50

Tyr

Yys

Ala

Thr

Trp 55

Asp

Ala

Ser

Lys

Pro 60

Leu

Ser

Trp

Arg

Ser 65

Lys

Tyr

Gly

Trp

Thr 70

Ala

Phe

Cys

Gly

Pro 75

Ala

Gly

Pro

Arg

Gly 80

Tin

Ala

Yys Gly 85

Lys

Yys

Leu

Arg

Val 90

Thr

Asn

Pro

Ala

Thr 95

Gly

Ala

Tin

Ile

Thr 100

Ala

Arg

Ile

Val

Asp 105

Gln

Cys

Ala

Asn

Gly Gly 110

Leu

Asp

Leu

Asp 005

Trp

Asp

Thr

Val

Phe 102

Thr

Lys

Ile

Asp

Thr 125

Asn Gly

Ile

Gly

Tyr 030

Gln

Gly

Cis

Leu 103

Asn

Val

Asn

Tyr

Gln 140

Fhe

Val

Asp

Yys

Arg Asp 145 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 12:

(i) YC/RAETERTSAREA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 515 zasadowych par (B) ATI¹: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: podwójna (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii) ANTI-SENSE: NIE (iv) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Cordeum vulgare (xi) OPIS SEKWENCJII: SEKWL NR ID: 02:

YTTYATAATC CATGGYGTYA CGCCTGATGC TCGICTGYTTC GCTGCTGTCC TYATYGGCGG 60

CTATTAYCAC TAYTYATYAT GtAYAACAACG TCCYTTTYTAC GTT^(3(3>A(^TjMC TACCGGCCGG 120

YTYATAACAA CTTTAAYYTT GGCGCGCCtYC CCYGTGAGAYIC CTACTGCGAYG ACCTGGGACG 180

YCATYAATCC TYTATYTATA CCYGTCCAAGT AICGTCAGGAC (GKYGIAOTGC GGCGCCGCCG 240

TYYCYYTYTA TCATAYTACC TGtTYAGYIGT GCCTCCCAGT GACCAACCCYA GCGACGGGGG 300

179 726

CTCCGATCAC GTCGHGGATC GTGGACCAGT GCTCCAACGT CGGTCTCGCC CTCTACTGGT 360

ACRCCTTCTT CACCCCGRTC GRCCCCCACT GGATTGGGTC CCAGCAGTTC CACCTCRACT 420

TCRCCTRCCA GTTCTTCTAC TGCCTCTRCT AGATTGTCTT TGTATCCARG TCTRGCTAAT 480

RRTCRAHGGC TRGCTHRGCT ATGATTGRGC AGCTG 515 (2) INFORMACJA DLA SEKW. ER ID: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 585 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: podwójna (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄTECZKJI : cDNA (iii) HIPOTCYCZNYY : NIE (iii) ANTIsENNEY: NIE (iv) ŹRÓDŁO POHOOZENJGY:

(A) ORGANIZMU Hordeum vulgare (xi) OPK SEWENCJJI : SKWW . NR ΟΥ : II:

CTGCRGTTAT CCTHTTTTTA CCRCARTTAC CCACCACCRC AAACRRCRAA CCHCCHTTCA 60

ATTCCTRTTT ACCATTACAC CATGTCGTCC CGCCTGATGC TGTTGTCGTC GCCTGTTTTC 120

GCGTCGTCGT CGATGTCCAC GTCTCRGCAG GCGARCRACT TCCGTTCTRC GTCCCAHTTC 180

TACCGTCCGT CGCCGCCCAA CTGGTRCCTG GGCGCGCCCT CCTTTAGCTC CTACTGGCGG 240

ACCTGTTACG CCAGCRCGCC GCTGTCTTGT CGTTCCAAGT ACGTCTGTAC GAACTTrCTTGC 300

GTCCCCGCCT GCCCCCGCGT GCAGGCGTCC TGCGTCAAGT GCCTCCGTTT GACCCGGCCCG 360

GCTCCTGTGT CGCAGATCAC GTCTCGTCTC TTGTACCAGT GCGCCRCCGT CCTGTTCCGC 420

CTCGACTGTT RCACCGTCTT CACCCRTATC GCCCCCAACT GTATTGGTTA CCAGACATGTC 480

CRCCTCARCG TCCCCTRCCR GTTCGTCGCC TGCCGCTACT ATATTTTCTG TTATGTTCCAG 540

GCTAGCTAAG AATACCRGTC TAGCTRRGCT RTGAGTGRGC AGCTG

585

177 726

Przedstawiony wynalazek streszczony jest w zamieszczonych poniżej punktach:

1. Białka przeciwdrobnoustrojowe, wyizolowane z roślin buraka cukrowego, nie sąchitynazami i glukanazami.

2. Białka przeciwdrobnoustrojowe według punktu 1, wyizolowane są z roślin buraka cukrowego zainfekowanych grzybami z rodzaju Cercospora.

3. Białka przeciwdrobnoustrojowe według punktu 1 albo 2, charakteryzują się tym, że zostały wyizolowane z liści roślin buraka cukrowego, zainfekowanych Cercospora beticola.

4. Czyste białka o sekwencji aminokwasowej białek saopisane w dowolnym punkcie od Ido 3,

5. Czyste białko ΑΧ1 lub jego funkcjonalnie równoważny analog, w którym zostało dodanych, podstawionych lub usuniętych jeden lub więcej aminokwasów, bez zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej,

6. Czyste białko ΑΧ2 lub jego funkcjonalnie równoważny analog, w którym zostało dodanych, podstawionych lub usuniętych jeden lub więcej aminokwasów, bez zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej.

7. Czyste białko ΑΧ3.1 lub jego funkcjonalnie równoważny analog, w którym zostało dodanych, podstawionych lub usuniętych jeden lub więcej aminokwasów, bez zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej,

8. Czyste białka lub jego funkcjonalnie równoważne analogi według jednego z przedstawionych powyżej punktów, które zostały zsyntetyzowane chemicznie in vitro, w oparciu o znajomość ich sekwencji aminokwasowej.

9. Czyste białka, które są co najmniej w 55% podobne do białek wymienionych w dowolnym, powyżej wymienionym punkcie 1-8.

10. Czyste białka według dowolnego punktu od 5 do 9, w połączeniu z białkiem, które jest zasadowym odpowiednikiem kwaśnych białek grupy 4 związanych z patogenezą.

11. Czyste białka według punktu 10, charakteryzują się tym, że białko, będące zasadowym odpowiednikiem wymienionych białek związanych z patogenezą, jest białkiem WIN wiążącym chitynę.

12. Czyste białka według punktu 11, charakteryzują się tym, że białko WIN zostało wyizolowane z ziaren jęczmienia lub z poddanych szokowi liści jęczmienia.

13. Zrekombinowany DNA obejmujący sekwencje kodujące białka przedstawione w dowolnym punkcie od 1 do 9.

14. Zrekombinowany DNA według poprzednich punktów, obejmujący sekwencje kodujące białko przedstawione w dowolnym z punktów od 1 do 9, wybrany z grupy składającej się z sekwencji przedstawionych w Sek. Id, Nr 2, 5 i 8.

15. Zrekombinowany DNA według albo punktu 13 albo 14, obejmujący ponadto sekwencje DNA kodujące białko, które jest zasadowym odpowiednikiem kwaśnych białek grupy 4 związanych z patogenezą, jak przedstawiono to w dowolnym punkcie od 10 do 12,

16. Sekwencja DNHA hybrydyzujaca w warunkach ścisłych z sekwencjaDNA według dowolnego punktu od 13 do 15.

17. Wektor zawierający sekwencję DNA, takąjak przedstawiono w dowolnym punkcie od 13 do 16.

18. Wektor, tak jak przedstawiono to w punkcie 17, zawierający sekwencję DNA wyizolowana ^z genomu roślinnego,

19. System biologiczny obejmujący DNA, który przedstawiono w dowolnym punkcie od 13 do 16, umożliwiający ekspresję DNA.

20. System biologiczny według punktu 19, będący mikroorganizmem.

21. System biologiczny według punktu 19, będący rośliną.

22. Rośliny stransformowane zrekombinowanym DNA, który przedstawiono w dowolnym punkcie od 13 do 16,

23. Rośliny stransformowane zrekombinowaną sekwencją DNA, obejmującą część kodująca białka ΑΧ lub jego funkcjonalnie równoważny analog, w którym jeden lub więcej ami179 726 nokwssów zostało dodanych, podstawionych lub usuniętych, bez zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej białka.

24. Rośliny stransformowane zrekombinowaną sekwencją DNA, obejmującą część kodującą białka ΑΧ2 lub jego funkcjonalnie równoważny analog, w którym jeden lub więcej aminokwasów zostało dodanych, podstawionych lub usuniętych, bez zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej białka.

25. Rośliny stransformowane zrekombinowaną sekwencją DNA, obejmującą część koduj ącąbiałka ΑΧ3.1 lub j ego fUnkcj onalnie równoważny analog, w którymjeden lub więcej aminokwasów zostało dodanych, podstawionych lub usuniętych, bez zasadniczego zmniejszenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej białka.

26. Rośliny stransformowane według dowolnego z punktów od 23 do 25, charakteryzują się tym, że kodują białko będące zasadowym odpowiednikiem kwaśnych białek grupy 4 związanych z patogenezą, przedstawionych w dowolnym punkcie do 10 do 12.

27. Rośliny potomne roślin według dowolnego z punktów od 23 do 26, które to rośliny potomne eksprymuje wymienione zrekombinowane sekwencje DNA.

28. Nasiona roślin według dowolnego z punktów od 22 do 26, lub rośliny potomne roślin według punktu 27.

29. Białka pochodzące z ekspresji DNA, które przedstawiono w dowolnym z punktów od 13 do 16.

30. Białko przeciwdrobnoustrojowe, wyprodukowane poprzez ekspresje zrekombinowanego DNA w roślinach, które przedstawiono w dowolnym z punktów od 22 do 27.

31. Dowolna przeciwdrobnoustrojowa kompozycja, zawierająca jedno lub więcej białek, które przedstawiono w dowolnym punkcie od 1 do 12 i od 29 do 30.

32. Proces zwalczania grzybów lub bakterii, obejmujący poddawanie ich działaniu białek lub kompozycji, które przedstawiono w dowolnym punkcie od 1 do 12 i od 29 do 31.

33. Proces ekstrakcji potrzebny do produkcji białka przeciwdrobnoustrojowego, które przedstawiono w dowolnym punkcie od 1 do 12 i od 29 do 31, z materiału organicznego zawierającego takie białka.

34. Proces ekstrakcji według poprzedniego punktu, obejmujący poddanie materiału maceracji i ekstrakcji rozpuszczalnikiem.

35. Proces ekstrakcji według punktu 34, charakteryzuje się tym, że białko jest następnie oczyszczane poprzez wirowanie i chromatografię, w złożach wybranych spośród grup oddziaływujących hydrofobowo; anionowymiennie; kationowymiennie; poprzez filtrację żelową; oraz chromatografię z odwróconą fazą.

36. Proces ekstrakcji, który przedstawiono w dowolnym punkcie od 33 do 35, charakteryzuje się tym, że materiał organiczny obejmuje liście roślin buraka cukrowego zainfekowane Cercospora beticola.

37. Proces ekstrakcji według punktów od 33 do 35, charakteryzuje się tym, że materiał organiczny obejmuje mikroorganizmy, które przedstawiono w punkcie 20.

179 726

Absorbancja (280 nm)

NaCl

Fig. 1

179 726

ΑΧ2

LMW ΑΧ1 ΑΧ2 ΑΧ3 WIN + LMW std. WIN std.

(kD)

Fig. 2

179 726

(uiu 039) VfDMV9HOSaV

(uiu 029) V£DMVaHOSaV

Fig.. 3B

179 726

Fig. 4

179 726

ΑΧ1 ΑΧ2

LMW DU DTT DTT DTT LMW

ΑΧ3.1 ΑΧ3.2

Dn DH LMW DH Dn LMW

Fig. 5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Białko przeciwdrobnoustrojowe mające sekwencję aminokwasową wybraną z tych, które są określone w Sek. Id. Nr 2,5 i 8 lub obejmującąresztę 80-111 w Sek. Id. Nr 8, lub reszty 29-74 albo w Sek. Id. Nr 2, albo w Sek. Id. Nr 5.

2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że jest wyizolowane z buraka cukrowego zainfekowanego grzybami z rodzaju Cercospora.

3. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że występuje w połączeniu z białkiem, które jest zasadowym odpowiednikiem kwaśnych białek grupy 4 związanych z patogenezą i/lub chitynazą i/lub glukanazą.

4. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że występuje w połączeniu z białkiem WIN wiążącym chitynę, obejmującym sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sek. Id. Nr 11.

5. Zrekombinowana sekwencja DNA, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydowąwybranąz grupy zawierającej sekwencje przedstawione w Sek. Id. Nr 13,4,6,7 oraz 9.

6. Sekwencja DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że obejmuje ponadto sekwencję DNA kodującąbiałko, które jest zasadowym odpowiednikiem kwaśnych białek grupy 4, związanych z patogenezą i/lub chitynazą i/lub glukanazą.

7. Sekwencja DNA według zastrz. 5 albo 6, znamienna tym, że jest zmodyfikowana w tych kodonach, które są preferowane przez organizm, do którego wprowadza się tę zrekombinowaną sekwencję DNA, przy czym ekspresja takiego zmodyfikowanego DNA w wymienionym organizmie daje białko zasadniczo podobne do białka otrzymywanego w wyniku ekspresji niezmodyfikowanego zrekombinowanego DNA w organizmie, dla którego składniki kodujące białko takiego zrekombinowanego DNA są endogenne.

8. Sekwencja DNA, według zastrz. 5, znamienna tym, że stanowi sekwencję, która hybrydyzuje w warunkach ścisłych z sekwencjąnukleotydową wybraną z grupy zawierającej sekwencje przedstawione w Sek. Id. Nr 1, 3, 4, 6, 7 oraz 9.