ES2227730T3 - Proteinas antifungicas, adn que codifica para las mismas y hospedadores que lo incorporan. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UNA PROTEINA AISLABLE, OBTENIBLE A PARTIR DE UNA FUENTE VEGETAL, QUE PRESENTA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA, ESPECIALMENTE ANTI-PHYTOPHORA Y/O ANTI-PYTHIUM, Y UN PESO MOLECULAR DE APROX. 55-65 KDA, DETERMINADO MEDIANTE ELECTROFORESIS SDS PAGE. ASIMISMO, SE PROPORCIONA UNA SECUENCIA DE ADN QUE COMPRENDE UN MARCO DE LECTURA ABIERTO, CAPAZ DE CODIFICAR PARA UNA PROTEINA DESCRITA EN LA INVENCION, CARACTERIZADA PORQUE COMPRENDE UN MARCO DE LECTURA ABIERTO, SUSCEPTIBLE DE CODIFICAR PARA UNA PROTEINA DESCRITA EN LAS SECUENCIAS SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.57, SEQ ID NO.70, SEQ ID NO.72 O SEQ ID NO.74 O MUTEINAS DE LAS MISMAS, Y UN ADN CAPAZ DE CODIFICAR PARA UNA PROTEINA DESCRITA EN LA INVENCION BAJO CONDICIONES RESTRICTIVAS. LA INVENCION COMPRENDE ASIMISMO PLANTAS QUE INCORPORAN UN ADN QUIMERICO, CAPAZ DE CODIFICAR PARA UNA PROTEINA DESCRITA EN LA INVENCION, EXPRESANDOSE ASI DICHA PROTEINA. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LA ACTIVIDAD OXIDANTE DE CARBOHIDRATOS Y PREFERIBLEMENTE DE HEXOSA, DE DICHA PROTEINA. SE PROPORCIONAN TAMBIEN PROCEDIMIENTOS PARA COMBATIR LOS HONGOS, ESPECIALMENTE LAS ESPECIES PHYTOPHTHORA Y PYTHIUM, UTILIZANDO UNA PROTEINA O UNA CELULA HUESPED CAPAZ DE PRODUCIR DICHA PROTEINA.

Description

Proteínas antifúngicas, ADN que codifica para las mismas y hospedadores que lo incorporan.

Campo de la invención.

La presente invención trata de nuevas oxidasas, que pueden actuar como proteínas antifúngicas, del ADN que codifica para las mismas y de hospedadores que incorporan el ADN, así como de métodos para combatir los patógenos fúngicos provocando que dichos patógenos fúngicos entren en contacto con dicha proteína o proteínas.

La invención trata adicionalmente de plantas que incorporan y expresan el ADN que codifica para las proteínas antifúngicas, y de plantas que, como resultado de las mismas, muestran una susceptibilidad reducida ante patógenos fúngicos.

Antecedentes de la técnica

Las enfermedades fúngicas de las plantas de cosecha han sido una de las principales causas de las pérdidas de cosechas a lo largo de la historia del cultivo de cosechas. El crecimiento de cosechas como monocultivos promueve la proliferación de razas virulentas de patógenos fúngicos, y allá donde crezca una nueva variedad de planta de cosecha, aumenta drásticamente una amplia escala de riesgo de que una cepa virulenta de un patógeno en desarrollo ataque esa cosecha. La aparición de la enfermedad está significativamente empeorada por el transporte internacional de materiales vegetales portadores de patógenos, que pueden poner en contacto plantas con patógenos contra los que no han tenido oportunidad de desarrollar resistencia. Así, mediante la intervención del hombre, el equilibrio natural entre el hospedador y el patógeno se ha visto alterado, con un efecto desastroso en numerosas ocasiones. Dichas actividades han dado como resultado pérdidas catastróficas, e incluso hambrunas, como las ocurridas en Irlanda durante el siglo 19, causadas por el hongo mildiu de la patata (Phytophthora infestans). La enfermedad fúngica también puede hacer imposible el crecimiento de ciertas cosechas en zonas extensas, como fue el caso cuando el marchitamiento por Fusarium barrió las plantaciones de tomates en grandes zonas del este de EE.UU., o cuando el hongo mildiu lanudo (Plasmopara vitícola) devastó las cosechas de vid en algunas partes de Europa. Las epidemias de enfermedades fúngicas también pueden tener un grave efecto sobre el medio ambiente, como sucedió cuando prácticamente toda la población de olmo inglés (Ulmus procera) fue destruida por la enfermedad holandesa del olmo (Ceratocystis ulmi). Además, las pérdidas que pueden producirse durante el crecimiento de enfermedades fúngicas de cosechas pueden contribuir a pérdidas adicionales tras la cosecha. Algunas podredumbres leves, tales como Botrytis cinerea, son particularmente problemáticas en la fruta, por ejemplo. El hongo Aspergillus flavus, aunque no es un hongo causante de una verdadera enfermedad, provoca podredumbres tras la cosecha en cacahuetes y maíz almacenados, especialmente en países tropicales, y es el más grave porque produce una toxina, la aflatoxina, que es muy tóxica para el hombre.

Los principales problemas económicos relacionados con las enfermedades fúngicas se encuentran en las regiones húmedas del mundo, principalmente en el este de Europa y en los trópicos húmedos. Se usan diversas técnicas de agricultura en las cosechas, tales como la rotación de cosechas y evitar la dispersión de tierra sobre la maquinaria, etc., para evitar el crecimiento y la dispersión de infestaciones graves de enfermedades fúngicas. Los cruces entre plantas han tenido un significativo impacto en la mejora de la resistencia de muchas cosechas ante importantes enfermedades. Por ejemplo, los agricultores introdujeron con éxito en el tomate los genes de resistencia 1 y 1-2 efectivos frente a Fusarium oxisporum subesp. lycopersici. No obstante, los problemas permanecen, particularmente cuando muchas formas de resistencia específica a una raza se deshabilitan según evolucionan rápidamente nuevas razas del patógeno. En el tomate ha aparecido otra cepa virulenta de F. oxysporum, y los agricultores están buscando un tercer gen de resistencia útil. En los cereales que creen en zonas del este de Europa, una reciente epidemia de una cepa virulenta de la roya amarilla (Puccinia striiformis) ha conducido a un rápido incremento del uso de fungicidas sobre variedades que permanecen resistentes a otros hongos. En estos casos concretos, se usan ampliamente sustancias químicas para controlar la enfermedad fúngica, como en los casos en los que simplemente no hay fuentes naturales de resistencia disponibles para el agricultor.

Los fungicidas químicos suponen una importante inversión en los costes de la producción de cosechas en muchas partes del mundo. En 1990, el 21% de todas las ventas agroquímicas fueron fungicidas (5,54 millones de dólares americanos). Los granjeros y agricultores tienen una fuerte motivación para reducir sus costes en inversiones. Además de la justificación económica, hay un crecientemente fuerte componente medioambiental en la ecuación. Hay una presión creciente en las economías más avanzadas, especialmente en Norteamérica y el este de Europa, por parte de los políticos y los consumidores sobre la agricultura, que se basa menos en inversiones en productos químicos. La justificación de dichas demandas puede carecer de una base racional o científica focalizada, pero el miedo crece con los informes de pesticidas detectados en el agua del subsuelo o en cantidades que exceden los mínimos aceptables como residuos en alimentos. En Holanda, por ejemplo, hay una exigencia obligatoria para reducir el uso total de pesticidas en un 50% antes de 2000.

Phytophthora infestans pertenece al grupo de hongos denominado Oomicetos. Phytophthora infestans infecta a diversos miembros de las Solanáceas, tales como la patata, el tomate y algunas plantas ornamentales. Provoca una podredumbre tardía de las patatas y los tomates que afecta a todas las partes salvo las raíces. Geográficamente, el hongo está ampliamente distribuido, y puede encontrarse en todos los países productores de patatas. Económicamente, la podredumbre tardía de las patatas es de una gran importancia, dado que una infección pronta en la estación puede reducir gravemente el rendimiento de la cosecha. Actualmente, la enfermedad está controlada mediante la pulverización de fungicidas químicos (ditiocarbamatos, tales como mancozeb, manec y zineb) de forma regular. Desde un punto de vista tanto medioambiental como económico, el control biológico de las enfermedades provocadas por Phytophthora infestans podría ser ventajoso sobre el uso de fungicidas químicos.

Phytium también pertenece al grupo de hongos denominado Oomicetos. El género Phytium se diferencia de su género pariente Phytophthora por formar esporangios relativamente indiferenciados. Geográficamente, este hongo está ampliamente distribuido en todos los continentes. El primer tipo principal de enfermedad provocada por las especies de Phytium es la pudrición del tallo, debida a los ataques de súbito y rápido desarrollo sobre brotes jóvenes, en el campo o en semilleros. Las especies de Phytium provocan un segundo tipo de enfermedad, que es la necrosis de la raíz, y provoca un enlentecimiento general del crecimiento de la planta (por ejemplo, trigo y maíz) y una pérdida de rendimiento.

Las principales pérdidas causadas por Phytium en Europa son en cosechas de campo tales como la remolacha azucarera. En principio, las pérdidas tienden a ser de todo o nada. De forma similar, los semilleros de plantas ornamentales y árboles forestales pueden ser completamente destruidos. (Para una revisión completa sobre Oomicetos, véase: European Handbook of Plant Diseases, ed. por I. M. Smith y col., 1988, Blackwell Scientific Publications, cap. 8).

Otro hongo es Botrytis, especialmente B. cynerea, perteneciente al grupo de Hongos Imperfectos, que provoca la podredumbre gris o podredumbre de brotes y flores, que es común en frutas maduras después de la recolección, pero también puede aparecer antes de la recolección. También puede afectar a diversos vegetales tales como la lechuga, las judías y el tomate. Otras especies de Botrytis son comunes en las flores, tales como en lirios, gladiolos y tulipanes.

En el documento WO91/18984 A1 se describió una proteína con actividad antifúngica, aislada a partir de las hojas de tabaco estimuladas por TMV, que es capaz de provocar la lisis de esporas en germinación y puntas de hifas de Phytophthora infestans, y que provoca que las hifas crezcan a una tasa reducida. Esta proteína tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 24 kDa, y se denominó AP24. La comparación de su secuencia completa de aminoácidos, según se deduce a partir de la secuencia de ácidos nucleicos del gen AP24, con proteínas conocidas a partir de bases de datos, reveló que la proteína era una proteína del tipo osmotina.

A pesar del éxito inicial para combatir patógenos fúngicos, tales como Phytophthora infestans, y de la ingeniería genética en plantas capaces de producir estas proteínas antifúngicas con actividad frente a estos patógenos fúngicos, permanece una necesidad de identificar y aislar otras proteínas con actividad antifúngica frente a este hongo.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una proteína aislada, obtenible a partir de una fuente vegetal, que tiene actividad antifúngica, de forma más eficaz dirigida a los Oomicetos, y preferiblemente ante Phytophthora y/o Phytium, y un peso molecular de aproximadamente 55-65 kDa, según indica la electroforesis en SDS-PAGE. Las proteínas preferibles son aquellas que son obtenibles a partir de plantas de girasol o lechuga. Las proteínas aún más preferibles se obtienen a partir de las hojas de girasol o de lechuga estimuladas con salicilato sódico. Una proteína aislada aún más preferible se caracteriza porque se elige del grupo de proteínas con una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que comprende las secuencias de aminoácidos descritas en las SEQ ID N^{OS}: 1, 2 ó 6, 16, 20, 49, 50, 51, 58, 71, 73 ó 75, así como muteínas de las mismas con actividad antifúngica, y especialmente con actividad anti-Phytophthora y/o anti-Pythium. Una proteína todavía más preferible según la invención es la caracterizada porque comprende una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID N^{OS}: 16, 20, 58, 71, 73 ó 75, o por parte de dicha secuencia, como la representada en la SEQ ID Nº 6.

La invención también proporciona una nueva enzima, siendo su actividad enzimática la oxidación de carbohidratos.

La invención también abarca una secuencia de ADN aislada que comprende un marco abierto de lectura capaz de codificar para una proteína según la invención, preferiblemente caracterizado porque el marco abierto de lectura es capaz de codificar para una proteína según la invención, y un ADN capaz de hibridar con el mismo en condiciones estrictas.

La invención también proporciona una secuencia de ADN quimérico según la invención, que comprende adicionalmente una región de inicio de la transcripción y, opcionalmente, una región de terminación de la transcripción, unidas así a dicho marco abierto de lectura de forma que permitan al ADN ser transcrito en una célula hospedadora viva cuando está presente en la misma, produciendo así un ARN que comprende dicho marco abierto de lectura. Una secuencia de ADN quimérico preferible según la invención es aquella en la que el ARN que comprende dicho marco abierto de lectura es capaz de ser traducido a proteína en dicha célula hospedadora, cuando está presente en la misma, produciendo así dicha proteína. Son especialmente preferibles las secuencias de ADN que comprenden una secuencia como la descrita en las SEQ ID N^{OS}: 15, 19, 57, 70, 72 ó 74.

La invención también abarca una secuencia de ADN quimérico que comprende una secuencia de ADN según la invención, que puede elegirse entre replicones, tales como plásmidos y vectores de clonación bacterianos, tales como un vector de expresión bacteriano, un vector vírico vegetal (no integrador), un vector del plásmido Ti de Agrobacterium, tal como un vector binario, y similares, así como una célula hospedadora que comprende un replicón o un vector según la invención, y que es capaz de mantener dicho replicón una vez presente en la misma. Según esta realización, es preferible una célula hospedadora que sea una célula vegetal, siendo dicho vector un vector vírico no integrador.

La invención proporciona adicionalmente una célula hospedadora que incorpora de forma estable en su genoma una secuencia de ADN quimérico según la invención, tal como una célula vegetal, así como hospedadores pluricelulares que comprenden dichas células, o consistentes esencialmente en dichas células, tales como plantas. Son especialmente preferibles las plantas caracterizadas porque el ADN quimérico según la invención es expresado en al menos varias células de la planta, dando como resultado que la proteína antifúngica se produzca en la misma.

Según otra realización más de la invención, se prevé un método para producir una proteína con actividad carbohidrato oxidasa, caracterizada porque se hace crecer una célula hospedadora según la invención en unas condiciones que permitan que dicha proteína sea producida por dicha célula hospedadora, seguido opcionalmente por la etapa de recuperar la proteína desde las células hospedadoras.

Otra parte de la invención está dirigida al uso antifúngico de una proteína que tiene una actividad carbohidrato oxidasa.

La invención también estipula el uso de una proteína según la invención para retrasar el crecimiento de hongos, preferiblemente de Oomicetos, y más preferiblemente de Phytophthora y de Phytium. Según otra realización más, retrasando del crecimiento de los hongos que están en o en las proximidades de la planta mediante la aplicación de un microorganismo capaz de producir la proteína, o recogiendo la proteína desde un hospedador microbiano, y empleando la proteína en una formulación agroquímica.

La invención también proporciona un método para obtener plantas con una susceptibilidad reducida ante los hongos, especialmente ante Phytophthora y/o Phytium, que comprende las etapas de:

(a) introducir en las células progenitoras, que son susceptibles de ser reengendradas como una planta completa,

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una secuencia de ADN quimérico que comprende un marco abierto de lectura capaz de codificar para una proteína según la reivindicación 1, estando dicho marco abierto de lectura unido operativamente a una región de transcripción y de traducción y, opcionalmente, a una región de terminación de la transcripción, permitiendo que dicha proteína sea producida en una célula vegetal que es susceptible de ser infectada por dicho hongo, y

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una secuencia de ADN quimérico capaz de codificar para un marcador vegetal seleccionable que permita la selección de las células progenitoras transformadas cuando dicho marcador seleccionable está presente en las mismas, y

(b) reengendrar dichas células progenitoras en plantas en condiciones que favorezcan a las células progenitoras que tienen dicho marcador seleccionable, y

(c) identificar una planta que produce una proteína según la reivindicación 1, reduciendo así la susceptibilidad de dicha planta ante una infección por dicho hongo.

Según la invención, es preferible un método caracterizado porque la etapa (a) se realiza usando una cepa de Agrobacterium tumefaciens capaz de transferir ADN-T a células vegetales y que porta dicho ADN quimérico clonado en el vector binario pMOG800; otro método preferible es cuando la etapa (b) se realiza en presencia de un antibiótico que favorece a las células que tienen una fosfotransferasa de neomicina.

La invención proporciona adicionalmente una composición antifúngica que comprende una proteína según la invención y un vehículo adecuado.

También se proporciona un anticuerpo capaz de reaccionar con un fragmento N terminal de una proteína según la invención, preferiblemente con el péptido representado por las SEQ ID N^{OS}: 6, 16, 20, 58, 71, 73 ó 75. El anticuerpo se usa adecuadamente para detectar los niveles de expresión del ADN quimérico según la invención en células hospedadoras y hospedadores pluricelulares, preferiblemente plantas, capaces de producir una proteína según la invención.

La invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico obtenible a partir de un gen que codifica para una proteína según la invención, teniendo dicha secuencia de ácido nucleico una actividad reguladora de la transcripción específica para tejidos en una planta. La invención proporciona específicamente una secuencia de ácido nucleico obtenible a partir de la región secuencia arriba del sitio de inicio de la traducción de dicho gen, preferiblemente al menos 500 nucleótidos inmediatamente secuencia arriba del sitio de inicio de la traducción de dicho gen.

Descripción de las figuras

Figura 1: SDS-PAGE (12,5%) de las diferentes etapas de purificación de la proteína de girasol MS59. PM= marcadores de peso molecular; 1= extracto bruto de la proteína de girasol tras la filtración en gel (G25); 2= fracción proteica unida en cromatografía de intercambio catiónico (S-sepharosa); 3= grupo de fracciones activas tras la cromatografía de intercambio catiónico (Mono S); 4= flujo a través en la cromatografía de interacciones hidrófobas (fenilsuperosa); 5= fracciones activas tras la filtración en gel.

Figura 2: SDS-PAGE (12,5%) de las diferentes fracciones (números 6 a 16) de la columna de filtración en gel (SD75). Las fracciones 10 a 15 se ensayaron a 3 diluciones para comprobar la inhibición del crecimiento de Phytophthora infestans (PANEL A) y de Phytium ultimum (PANEL B).

Figura 3: SDS-PAGE (12,5%) de las fracciones eluidas a partir de nueve tiras de gel (carriles 1 a 9) de un PAGE en bruto en el que se separó una MS59 que contenía una fracción SD75 (fracción 13 de SD75). Panel derecho: SDS-PAGE (12,5%) con la fracción 13 de SD75 (L) y dos fracciones del experimento de elución de la fracción 2 (con MS59) y de la fracción 5 (con una proteína de \sim30 kD). Panel inferior: inhibición del crecimiento de Phytophthora infestans ensayada con una fracción de elución de 1 a 6, con 5 \mul y 1 \mul añadidos por pocillo.

Figura 4: análisis microscópico de un ensayo de inhibición fúngica in vitro 24 horas después de la adición de zoosporangios de Phytophthora infestans a medio PDA. Panel izquierdo: incubación de control, sólo se añadió tampón MES. Panel derecho: se añadió a la incubación MS59 producida por E. coli en tampón MES.

Figura 5: análisis microscópico de un ensayo de inhibición fúngica in vitro 24 horas después de la adición de fragmentos de hifas de Phytium ultimum a medio PDA. Panel izquierdo: incubación de control, sólo se añadió tampón MES. Panel derecho: se añadió a la incubación MS59 producida por E. coli en tampón MES.

Figura 6: (A). Perfil de filtración en gel de WL64 de SD75. La WL64 eluye en las fracciones 13, 14 y 15. Los marcadores de peso molecular están indicados encima de las flechas, en la parte superior del gráfico. Eje X: número de fracción. Eje Y: A280.

(B). Gel SDS-PAGE al 12,5% de las fracciones 11-17 teñido con coomassie del perfil de filtración en gel de SD75. Los marcadores de pesos moleculares están indicados a la derecha, y están en kDa. Las bandas de proteína que se correlacionan con la actividad antifúngica están indicadas entre las flechas.

(C). Ensayo antifúngico in vitro. Se usaron diez microlitros de las respectivas fracciones (500 \mul en total) para cribar la inhibición del crecimiento de fragmentos de hifas de Rhizoctonia solani.

Figura 7: gel SDS-PAGE al 12,5% teñido con coomassie de la purificación de la WL64. Carril 1, extracto de lechuga; carril 2, pico HIC; carril 3, pico Source S; carril 4, pico Mono S; carril 5, pico de SD75; carril 6, pico Mono P. Los marcadores de peso molecular están indicados a ambos lados de la figura, y están en kDa.

Figura 8: (A). Representación de Lineweaver-Burk de las actividades oxidasa de MS59 (rombos blancos), de WL64 (círculos negros) y de GOX (cuadrados blancos), con glucosa como sustrato. Las cantidades de proteína por ensayo fueron 17, 29 y 45 ng para MS59, WL64 y GOX, respectivamente.

(B). Representación de Lineweaver-Burk de las actividades oxidasa de MS59 (rombos blancos), de WL64 (círculos negros) y de GOX (cuadrados blancos), con paredes de células fúngicas como sustrato. Las cantidades de proteína por ensayo fueron 17, 29 y 225 ng para MS59, WL64 y GOX, respectivamente.

Figura 9: especificidad de sustrato para las actividades oxidasa de MS59 (barras punteadas), de WL64 (barras rayadas) y de GOX (barras negras).

Figura 10: alineación de las proteínas de la invención MS59, WL64 y de los dos homólogos de A. Thaliana At26 (SEQ ID Nº 71) y At27 (SEQ ID Nº 75) (con las conocidas enzimas berberine bridge (EcBBE y PsBBE). Los cambios conservados están indicados en gris, mientras que las zonas de identidad (3 de los 6 aminoácidos idénticos) se indican en negro.

Descripción detallada de la invención

El efecto antifúngico de la(s) proteína(s) de la invención se ha demostrado en ensayos in vitro para los siguientes hongos: Phytophthora infestans, Phytophthora cactorum, Phytophthora nicotiana, Phytophthora megasperma, Phytium ultimum, Phytium sylvaticum, Phytium violae, Phytium paroecandrum, Rhizoctonia solani, Tanatephorus cucumeris, Helicobasidium purpureum, Sclerotium cepivorum, Pichia pastoris y Botrytis cinerea, a modo de ilustración. Estará claro que el uso de la(s) proteína(s) de la invención, o del ADN que codifica para las mismas, para su uso en un procedimiento para combatir los hongos, no está limitado a los hongos mencionados. No hay razón alguna para creer que la(s) proteína(s) según la invención no posee(n) una actividad antifúngica frente a una intervalo más amplio de hongos que los ensayados aquí, especialmente en la clase Oomicetos.

Aunque la invención está ilustrada detalladamente para plantas transgénicas de tomate, tabaco, zanahoria, patata y Brassica napus, debería entenderse que cualquier especie vegetal que esté sometida a alguna forma de ataque fúngico, especialmente de los hongos mencionados anteriormente, puede ser provista con uno o más de los constructos de genes expresables en plantas, que cuando se expresan sobreproducen la(s) proteína(s) de la invención en dicha planta con objeto de disminuir la tasa de infectividad y/o los efectos de dicho ataque. La invención puede incluso llevarse a la práctica en especies vegetales que actualmente no son susceptibles de transformación, dado que la susceptibilidad de dichas especies es sólo una cuestión de tiempo, y porque la transformación como tal no es relevante para los principios subyacentes de la invención. Por tanto, las plantas objeto de esta descripción deben incluir angiospermas así como gimnospermas, monocotiledóneas y dicotiledóneas, ya sea con propósitos alimenticios de animales o personas, o para su tratamiento industrial; están incluidas las plantas usadas para cualquier propósito agricultural u horticultural, incluyendo la silvicultura y los cultivos florales, así como la jardinería doméstica o de interiores, u otros propósitos decorativos.

La proteína según la presente invención puede obtenerse mediante aislamiento de la misma a partir de cualquier material de origen vegetal adecuado que la contenga. Una fuente particularmente adecuada comprende las hojas de girasol (Helianthus) y las hojas de lechuga (Lactuca sativa cv. Lollo bionda). La presencia de proteínas antifúngicas según la invención en un material de origen vegetal puede determinarse fácilmente para cualquier especie vegetal elaborando extractos vegetales a partir de estas especies y ensayando dichos extractos para comprobar la presencia de actividad antifúngica usando ensayos antifúngicos in vitro según se describe en la presente invención, fraccionando adicionalmente las muestras obtenidas mediante cualquier técnica de fraccionamiento de proteínas adecuada, junto con el ensayo in vitro, hasta que se obtenga la fracción antifúngica, que comprende una proteína de aproximadamente 55-65 kDa, denominada internamente MS59, o su homólogo WL64, que en su forma aislada muestra actividad antifúngica. Especialmente pueden ensayarse las fracciones para comprobar la actividad antifúngica en Oomicetos, por ejemplo, Phytophthora o Phytium ultimum y similares, u otros hongos, tales como Basidiomicetos, Ascomicetos, Zigomicetos, u otras clases o subclases.

Alternativamente, las proteínas antifúngicas según la invención pueden obtenerse mediante la clonación del ADN que comprende un marco abierto de lectura capaz de codificar para dicha proteína, o el precursor del mismo, uniendo dicho marco abierto de lectura a una región de transcripción, y opcionalmente a una región de inicio de la traducción y de terminación de la transcripción, insertando dicho ADN en una célula hospedadora adecuada, y permitiendo que dicha célula hospedadora produzca dicha proteína. Subsiguientemente, la proteína puede ser recuperada a partir de dichas células hospedadoras, preferiblemente tras la secreción de la proteína al medio de cultivo por parte de dichas células hospedadoras. Alternativamente, dichas células hospedadoras pueden usarse directamente en un proceso para combatir los patógenos fúngicos según la invención, en forma de una composición pesticida aceptable.

Las células hospedadores adecuadas para su uso en un procedimiento para obtener una proteína según la invención pueden elegirse entre hospedadores microbianos procariotas tales como bacterias, por ejemplo, Agrobacterium, Bacillus, Cianobacterias, E. coli, Psudomonas y similares, así como hospedadores eucariotas, incluyendo levaduras, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, hongos, por ejemplo, Trichoderma, y células vegetales, incluyendo protoplastos.

En un método para retrasar el crecimiento de hongos en o en los alrededores de las hojas de una planta, las células hospedadoras pueden elegirse adecuadamente entre cualquier especie usada habitualmente como fungicida biológico.

También, las proteínas pueden ser producidas por microorganismos, recogidas y empleadas en una formulación agroquímica.

La palabra proteína significa una secuencia de aminoácidos conectados a través de enlaces peptídicos. Los polipéptidos o los péptidos también se consideran proteínas. Las muteínas de la proteína de la invención son proteínas que se obtienen a partir de las proteínas descritas en la lista de secuencias reemplazando, añadiendo y/o eliminando uno o más aminoácidos, mientras que conservan aún su actividad antifúngica. Dichas muteínas pueden elaborarse fácilmente mediante ingeniería proteica in vivo, por ejemplo, cambiando el marco abierto de lectura capaz de codificar para la proteína antifúngica de una forma tal que la secuencia de aminoácidos se ve así afectada. Siempre que los cambios en las secuencias de aminoácidos no anulen en conjunto la actividad antifúngica, dichas muteínas están contenidas en la presente invención.

La presente invención proporciona una secuencia de ADN quimérico que comprende un marco abierto de lectura capaz de codificar para una proteína según la invención. La expresión secuencia de ADN quimérico debe entenderse que comprende cualquier secuencia de ADN que comprende secuencias de ADN no encontradas de forma natural en la naturaleza. Por ejemplo, ADN quimérico debe entenderse que comprende el ADN que comprende dicho marco abierto de lectura en una localización no natural en el genoma de la planta, a pesar del hecho de que dicho genoma de la planta contiene normalmente una copia de dicho marco abierto de lectura en su localización cromosómica natural. De forma similar, dicho marco abierto de lectura puede ser incorporado en el genoma de la planta donde no se encuentre de forma natural, o en un replicón o en un vector donde no se encuentre de forma natural, tal como un plásmido bacteriano o un vector vírico. El ADN quimérico no debe limitarse a moléculas de ADN que son replicables en un hospedador, sino que también debe entenderse que comprende un ADN capaz de ser unido en un replicón, por ejemplo, en virtud de secuencias de adaptación específicas unidas físicamente al marco abierto de lectura según la invención. El marco abierto de lectura puede estar o no unido a sus elementos de regulación secuencia arriba o secuencia abajo naturales.

El marco abierto de lectura puede proceder de una biblioteca genómica. En este caso, puede contener uno o más intrones separando los exones que constituyen el marco abierto de lectura que codifica para una proteína según la invención. El marco abierto de lectura también puede ser codificado por un exón ininterrumpido, o por un ADNc para el ARNm que codifique para una proteína según la invención. Los marcos abiertos de lectura según la invención también comprenden aquellos en los que se han eliminado o añadido artificialmente uno o más intrones. Cada una de estas variantes está contenida en la presente invención.

También son parte de la invención las secuencias de ADN quimérico que codifican para una proteína antifúngica, que comprenden una o más de las secuencias EST mostradas en las SEQ ID N^{OS} 21 a 48. Como puede deducirse a partir de la lista de secuencias, estas EST para los que hasta ahora no se conocía ninguna función, comparten una considerable homología con la secuencia de ADN que codifica para las proteínas aisladas a partir de Helianthus y Lactuca.

Otra parte de la invención está formada por la actividad intrínseca de las proteínas de la invención. Se ha averiguado que son oxidasas de carbohidratos, capaces de oxidar un gran número de diferentes mono y disacáridos. La especificidad de sustrato se asemeja a la especificidad de la enzima hexosa oxidasa (EC 1.1.3.5), también conocida como D-hexosa oxígeno 1-oxidorreductasa. También se han mostrado capaces de oxidar una mezcla purificada de componentes de paredes celulares de hongos (derivados de Rhizoctonia). Se cree que esta capacidad oxidante confiere las propiedades antifúngicas a las proteínas. En la bibliografía hay un ejemplo de una oxidasa antifúngica, la glucosa oxidasa del hongo Aspergillus (documento WO 95/14784). Sin embargo, las proteínas de esta invención muestran un espectro de sustrato más amplio, como la hexosa oxidasa, y tienen una Km menor para el sustrato.

A partir de las búsquedas de homologías se ha averiguado que algunas partes de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la invención están más conservadas, y están relacionadas con las secuencias encontradas habitualmente en las oxidasas. La mayor homología se ha encontrado con la reticulina oxidasa, una conocida enzima procedente de la familia de las Papaveraceae (Facchini, P. J. y col., Plant Physiol. 112: 1669-1677, 1996).

Con objeto de ser capaz de ser expresado en una célula hospedadora, un ADN quimérico según la invención se proveerá generalmente con los elementos reguladores que permitan que sea reconocido por la maquinaria bioquímica del hospedador y que permitan que el marco abierto de lectura sea transcrito y/o traducido en el hospedador. Generalmente comprenderá una región de inicio de la transcripción, que puede proceder adecuadamente de cualquier gen capaz de ser expresado en la célula hospedadora elegida, así como una región de inicio de la traducción para el reconocimiento y fijación de los ribosomas. En células eucariotas, un casete de expresión comprende generalmente además una región de terminación de la transcripción localizada secuencia debajo de dicho marco abierto de lectura, permitiendo que se produzcan la terminación de la transcripción y la poliadenilación del transcrito primario. Además, el uso del codón puede ser adaptado al uso aceptado del codón del hospedador elegido. Los principios que rigen la expresión de un constructo de ADN quimérico en una célula hospedadora elegida son habitualmente comprendidos por los expertos habituales en la materia, y la construcción de constructos de ADN quimérico expresables es ahora rutinaria para cualquier tipo de célula hospedadora, ya sea procariota o eucariota.

Con objeto de que el marco abierto de lectura se mantenga en una célula hospedadora, se proporcionará generalmente en forma de un replicón que comprende dicho marco abierto de lectura según la invención unido al ADN que es reconocido y replicado por la célula hospedadora elegida. Consecuentemente, la selección del replicón está determinada en gran parte por la célula hospedadora elegida. Dichos principios que rigen la selección de los replicones adecuados para un hospedador elegido en particular están claramente en el dominio del experto habitual en la materia.

Un tipo especial de replicón es aquel capaz de transferirse a sí mismo, o una parte del mismo, a otra célula hospedadora, tal como una célula vegetal, cotransfiriendo así el marco abierto de lectura según la invención a dicha célula vegetal. Los replicones con tal capacidad se denominan en la presente invención vectores. Un ejemplo de dichos vectores es un vector plásmido Ti que, cuando está presente en un hospedador adecuado, tal como Agrobacterium tumefaciens, es capaz de transferir parte de sí mismo, la denominada región T, a una célula vegetal. Actualmente se están usando de forma rutinaria diferentes tipos de vectores plásmidos Ti (véase el documento EP 0 116 718 B1) para transferir secuencias de ADN quimérico a células vegetales, o protoplastos, a partir de los cuales pueden producirse nuevas plantas que incorporen de forma estable dicho ADN quimérico en sus genomas. Una forma particularmente preferible de vectores plásmidos Ti son los denominados vectores binarios, según se reivindica en los documentos EP 0 120 516 B1 y US 4.940.838. Otros vectores adecuados que pueden usarse para introducir en ADN según la invención en un hospedador vegetal pueden elegirse entre vectores víricos, por ejemplo, vectores víricos vegetales no integradores, tales como los que pueden proceder de virus vegetales bicatenarios (por ejemplo, CaMV) y virus monocatenarios, virus géminis y similares. El uso de dichos vectores puede ser ventajoso, particularmente cuando es difícil transformar de forma estable el hospedador vegetal. Tal puede ser el caso con especies leñosas, tales como árboles y viñas.

La expresión "células hospedadoras que incorporan una secuencia de ADN quimérico según la invención en su genoma" debe entenderse que comprende células, así como organismos pluricelulares que comprenden dichas células, o consistentes esencialmente en dichas células, que incorporan de forma estable dicho ADN quimérico en su genoma, manteniendo así el ADN quimérico, y preferiblemente, transmitiendo una copia de dicho ADN quimérico a las células descendientes, ya sea a través de mitosis o de meiosis. Según una realización preferible de la invención, se prevén plantas que consisten esencialmente en células que incorporan una o más copias de dicho ADN quimérico en su genoma, y que son capaces de transmitir una copia o copias a sus descendientes, preferiblemente de una forma mendeliana. En virtud de la transcripción y la traducción del ADN quimérico según la invención en alguna o todas las células de la planta, esas células que producen la proteína antifúngica mostrarán una resistencia incrementada ante infecciones fúngicas, especialmente ante infecciones por Phytophthora. Aunque los principios indicados anteriormente que rigen la transcripción del ADN en células vegetales no son siempre comprendidos, la creación de un ADN quimérico capaz de ser expresado de una forma esencialmente constitutiva, es decir, en esencialmente la mayoría de los tipos celulares de la planta y esencialmente sin graves restricciones temporales y/o de desarrollo, es actualmente rutinaria. Las regiones de inicio de la transcripción rutinariamente en uso para este propósito son promotores obtenibles a partir del virus del mosaico de la coliflor, especialmente los promotores transcritos ARN 35S y ARN 19S, y los denominados promotores de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, a mencionar en particular el promotor de la nopalina sintasa, el promotor de la octopina sintasa (según se describe en el documento EP 0 122 791 B1) y el promotor de la manopina sintasa. Además, pueden usarse promotores vegetales, que pueden ser esencialmente constitutivos, tales como el promotor del gen de la actina del arroz, o, por ejemplo, específicos de órganos, tales como el promotor específico de las raíces. Alternativamente, pueden usarse promotores inducibles por patógenos, tales como el promotor PRP1 (también denominado promotor gst1), obtenible a partir de la patata (Martín, N. y col., (1993), Mol. Gen. Genet. 263: 179-186). La elección del promotor no es esencial, aunque debe decirse que son ligeramente preferibles los promotores constitutivos de alto nivel. Se sabe además que la duplicación de ciertos elementos, denominados incrementadores, puede incrementar considerablemente el nivel de expresión del ADN en su régimen (véase, por ejemplo, Kay, R. y col. (1987), Science 236: 1299-1302: la duplicación de la secuencia entre -343 y -90 del promotor CaMV 35S incrementa la actividad de ese promotor). Además del promotor 35S, incrementado de forma simple o doble, algunos ejemplos de promotores de alto nivel son el promotor de la subunidad menor de la carboxilasa bis-fosfato (rbcSSU) y el promotor de la proteína de unión a la clorofila a/b (Cab) inducibles por la luz. La presente invención también concibe promotores híbridos, que comprenden elementos de diferentes regiones promotoras unidos físicamente. Un ejemplo bien conocido de los mismos es el denominado promotor incrementado de la manopina sintasa CaMV (patente de EE.UU. 5.106.739), que comprende elementos del promotor de la manopina sintasa unidos al incrementador CaMV.

Con respecto a la necesidad de la región de terminación de la transcripción, generalmente se cree que dicha región incrementa la fiabilidad, así como la eficacia de la transcripción, en células vegetales. El uso de la misma es por tanto firmemente preferible en el contexto de la presente invención.

Con respecto a la aplicabilidad de la invención en diferentes especies vegetales, debe mencionarse que una realización particular de la invención es meramente ilustrativa, con plantas de tomate y de tabaco transgénicas como ejemplo, estando de hecho la aplicabilidad real no limitada a estas especies vegetales. Cualquier especie vegetal que esté sometida a alguna forma de ataque fúngico, en particular por Oomicetos tales como Phytophthora infestans, puede ser tratada con las proteínas según la invención, o preferiblemente, provista con una secuencia de ADN quimérico según la invención, permitiendo que la proteína sea producida en algunas o todas las células de la planta.

Aunque algunas realizaciones de la invención pueden no ser aplicables actualmente, por ejemplo, debido a que algunas especies vegetales son todavía reacias a la transformación genética, la práctica de la invención en dichas especies vegetales es meramente una cuestión de tiempo y no una cuestión de principio, ya que la susceptibilidad a la transformación genética como tal no es relevante para la realización subyacente de la invención.

La transformación de especies vegetales es ahora rutinaria en un impresionante número de especies vegetales, incluyendo tanto las Dicotyledoneae como las Monocotyledoneae. En principio, se puede usar cualquier método de transformación para introducir el ADN quimérico según la invención en una célula progenitora adecuada, siempre que las células sean capaces de ser reengendradas como plantas completas. Los métodos pueden elegirse adecuadamente entre el método del calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F. A. y col., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu, I. y col., junio de 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), electroporación de protoplastos (Shillito, R. D. y col., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), microinyección en materiales vegetales (Crossway, A. y col., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), bombardeo de partículas (recubiertas de ADN o ARN) de diversos materiales vegetales (Klein, T. M. y col., 1987, Nature 327, 70), infección con virus (no integradores) y similares. Un método preferible según la invención comprende la transferencia de ADN mediada por Agrobacterium. Es especialmente preferible el uso de la denominada tecnología del vector binario, según se describe en el documento EP A 120 516 y la patente U.S. 4.940.838).

La transformación del tomate se realiza preferiblemente esencialmente según describen Van Roekel y col. (Van Roekel, J. S. C., Damm, B., Melchers, L. S., Hoekema, A. (1993). Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycpersicon esculentum). Plant Cell Reports, 12, 644-647). La transformación de la patata se realiza preferiblemente esencialmente según describen Hoekema y col. (Hoekema, A., Huisman, M. J., Molendijk, L., van den Elzen, P. J. M. y Cornelissen, B. J. C. (1989). The genetic Engineering of two comercial potato cultivars for resistance to potato virus X. Bio/Technology 7, 273-278).

Generalmente, tras la transformación, las células vegetales o los grupos de células se eligen por la presencia de uno o más marcadores que están codificados por los genes expresables de la planta cotransferidos con la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína según la invención, donde a continuación el material transformado es reengendrado como una planta completa.

Aunque son consideradas algo más reacias a la transformación genética, las plantas monocotiledóneas son susceptibles a la transformación, y pueden reengendrarse plantas transgénicas fértiles a partir de células o embriones transformados, u otros materiales vegetales. Actualmente, los métodos de transformación preferibles de monocotiledóneas son el bombardeo con microproyectiles de los embriones, explantes o células en suspensión, y captación directa de ADN o electroporación (Shimamoto y col., 1989, Nature 338, 274-276). Las plantas de maíz transgénicas se han obtenido introduciendo el gen bar de Streptomyces hygroscopicus, que codifica para la fosfinotricina acetiltransferasa (una enzima que inactiva el herbicida fosfinotricina), en células embrionarias de cultivo de maíz en suspensión mediante bombardeo de microproyectiles (Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell, 2, 603-618). Se ha informado de la introducción de material genético en protoplastos de aleurona de otras cosechas de monocotiledóneas tales como trigo y cebada (Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13, 21-30). Las plantas de trigo han sido reengendradas a partir de cultivos embrionarios en suspensión seleccionando únicamente los tejidos callosos compactos envejecidos y embrionarios nodulares para el establecimiento de los cultivos embrionarios en suspensión (Vasil, 1990 Bio/Technol. 8, 429-434). La combinación con sistemas de transformación para estas cosechas permite la aplicación de la presente invención a las monocotiledóneas.

Las plantas monocotiledóneas, incluyendo cosechas comercialmente importantes tales como arroz y maíz también son susceptibles a la transferencia de ADN por cepas de Agrobacterium (véanse los documentos WO 94/00977; EP 0 159 418 B1; Gould, J., Michael, D., Hasegawa, O., Ulian, E. C., Peterson, G., Smith, R. H. (1991) Plant Physiol. 95, 426-434).

Tras la transferencia de ADN y el reengendrado, las plantas supuestamente transformadas pueden ser evaluadas, por ejemplo, usando un análisis Southern, para evaluar la presencia de ADN quimérico según la invención, el número de copias y/o la organización genómica. Además, o alternativamente, pueden acometerse los niveles de expresión del ADN recientemente introducido usando análisis Northern y/o Western, técnicas bien conocidas para las personas expertas habituales en la materia. Tras el análisis inicial, que es opcional, las plantas transformadas que muestran el número de copias y el nivel de expresión deseados del ADN quimérico según la invención recientemente introducido pueden ensayarse para evaluar los niveles de resistencia frente a patógenos susceptibles a la proteína según la invención, tales como Phytophthora infestans. Alternativamente, las plantas elegidas pueden someterse a otro ciclo de transformación, por ejemplo, para introducir genes adicionales, tales como los genes que codifican las chitinasas, las gluconasas, las osmotinas, las magaininas o similares, con objeto de incrementar los niveles de resistencia o de ampliar las resistencia a otros hongos que no son susceptibles a la proteína según la invención en un ensayo in vitro, según se describe en la presente invención.

Otras evaluaciones pueden incluir el ensayo de la resistencia fúngica en condiciones de campo, la comprobación de la fertilidad, el rendimiento y otras características. Tales ensayos son ahora realizados de forma rutinaria por las personas expertas habituales en la materia.

Después de dichas evaluaciones, las plantas transformadas pueden dejarse crecer directamente, pero generalmente pueden ser usadas como líneas parentales en la crianza de nuevas variedades o para la creación de híbridos y similares.

Muchas proteínas vegetales muestran efectos antifúngicos, algunas sin embargo no lo hacen tanto, pero rinden un significativo efecto antifúngico sinérgico si se usan en combinación con otras proteínas vegetales. En la solicitud de patente europea 440 304 A1 se describió que la sobreexpresión relativa simultánea de un gen de la gluconasa expresable vegetal junto con una chitinasa básica del tabaco en plantas transgénicas da como resultado un nivel de resistencia mayor frente a hongos que en las plantas que expresan una chitinasa de clase I expresable vegetal sola.

Ambas chitinasas, gluconasas, osmotinas, magaininas y la nueva proteína antifúngica según la invención se acumulan en tejidos vegetales infectados tras una interacción entre un patógeno incompatible y la planta. De esta observación y del hecho de que muchas proteínas sinergizan entre sí los efectos antifúngicos, hemos visualizado que la proteína antifúngica según la invención puede usarse adecuadamente junto con otras proteínas que están asociadas a la resistencia frente a patógenos.

Algunos ejemplos de proteínas que pueden usarse en combinación con las proteínas según la invención incluyen, pero no se limitan a, \beta-1,3-gluconasas y chitinasas que son obtenibles a partir de la cebada (Swegle, M. y col., 1989, Plant Mol. Biol. 12, 403-412; Balance, G. M. y col., 1976, Can. J. Plant Sci. 56, 459-466; Hoj, P. B. y col., 1988, FEBS Lett. 230, 67-71; Hoj, P. B. y col., 1989, Plant Mol. Biol. 13, 31-42 1989), de la alubia (Boller, T. y col., 1983, Planta 157, 22-31; Broglie, K. E. y col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6820-6824; Vögeli, U. y col., 1988, Planta 174, 364-372; Mauch, F. & Staehelin, L. A., 1989, Plant Cell 1, 447-457), del pepino (Motraux, J. P. & Boller, T. (1986), Physiol. Mol. Plant Pathol. 28, 161-169), del puerro (Spanu, P. y col., 1989, Planta 177, 447-455), del maíz (Nasser, W. y col., 1988, Plant Mol. Biol. 11, 529-538), de la avena (Fink, W. y col., 1988, Plant Physiol. 88, 270-275), del guisante (Mauch, F. y col., 1984, Plant Physiol. 76, 607-611; Mauch, F. y col., 1988, Plant Physiol. 87, 325-333), del tulipán (Parsons, T. J. y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7895-7899), de la patata (Gaynor, J. J., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 5210; Kombrink, E. y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 782-786; Laflamme, D. y Roxby, R., 1989, Plant Mol. Biol. 13, 249-259), del tabaco (por ejemplo, Legrand, M. y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6750-6754; Shinshi, H. y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 89-93), del tomate (Joosten, M. H. A. & De Wit, P. J. G. M., 1989, Plant Physiol. 89, 945-951), del trigo (Molano, J. y col., 1979, J. Biol. Chem. 254, 4901-4907), y similares.

Para obtener plantas transgénicas capaces de expresar constitutivamente más de un gen quimérico están disponibles numerosas alternativas, incluyendo las siguientes:

A. El uso de ADN, por ejemplo, ADN-T, en un plásmido binario, con numerosos genes modificados acoplados físicamente a un gen marcador seleccionable. La ventaja de este método es que los genes quiméricos están físicamente acoplados, y por tanto, migran como un único locus mendeliano.

B. La polinización cruzada de plantas transgénicas, capaces cada una de expresar uno o más genes quiméricos, preferiblemente acoplados a un gen marcador seleccionable, con polen procedente de una planta transgénica que contiene uno o más genes quiméricos acoplados a otro marcador seleccionable. Después la semilla que se obtiene de este cruce puede elegirse en base a la presencia de los dos marcadores seleccionables, o en base a la presencia de los propios genes quiméricos. Las plantas obtenidas a partir de las semillas seleccionadas pueden usarse después para un cruce adicional. En principio, los genes quiméricos no están en un único locus, y los genes pueden por tanto segregarse como loci independientes.

C. El uso de numerosas pluralidades de moléculas de ADN quimérico, por ejemplo, plásmidos, teniendo cada una uno o más genes quiméricos y un marcador seleccionable. Si la frecuencia de la cotransformación es alta, entonces la selección en base a un único marcador es suficiente. En otros casos, es preferible la selección en base a más de un marcador.

D. La transformación consecutiva de plantas transgénicas que ya contienen un primer, segundo, (etc.) gen quimérico con nuevo ADN quimérico, que comprende opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como en el método B, los genes quiméricos no están en principio en un único locus, y por tanto los genes quiméricos pueden segregarse como loci independientes.

E. Combinaciones de las estrategias anteriormente mencionadas.

La estrategia real puede depender de muchas consideraciones, como se determinará fácilmente, tales como el propósito de las líneas parentales (crecimiento directo, uso en un programa de cruce, uso para producir híbridos), pero no es crítico con respecto a la invención descrita.

En este contexto, debería enfatizarse que las plantas que ya contienen un ADN quimérico capaz de codificar para proteínas antifúngicas pueden formar un trasfondo genético adecuado para introducir el ADN quimérico según la invención, por ejemplo, con objeto de incrementar los niveles de resistencia o ampliar la resistencia. La clonación de otros genes correspondientes a proteínas que pueden usarse adecuadamente en combinación con ADN, y la obtención de plantas transgénicas capaces de sobreexpresar relativamente las mismas, así como la evaluación de su efecto sobre la resistencia frente a patógenos in planta, está ahora dentro del alcance del experto habitual en la
materia.

La obtención de plantas transgénicas capaces de expresar, o sobreexpresar relativamente, las proteínas según la invención, es un método preferible para contrarrestar los daños causados por hongos, tales como los Oomicetos como Phytophthora infestans, como se verá claramente a partir de la descripción anterior. Sin embargo, la invención no se limita a los mismos. La invención también vislumbra claramente el uso de las proteínas según la invención como tales, preferiblemente en forma de una composición fungicida. La composición fungicida incluye aquellas en las que la proteína está formulada como tal, pero también en forma de células hospedadoras, tales como células bacterianas, capaces de producir la proteína, causando así que el patógeno entre en contacto con la proteína. Las células hospedadoras adecuadas pueden elegirse, por ejemplo, entre bacterias no y hongos inofensivos, preferiblemente aquellos que son capaces de colonizar las raíces y/u hojas de las plantas. Algunos ejemplos de los hospedadores bacterianos que pueden usarse en un método según la invención son cepas de Agrobacterium, Arthrobacter, Azospyrillum, Pseudomonas, Rhizobacterium y similares, opcionalmente tras haber sido hechas adecuadas para este propósito.

Las composiciones que contienen proteínas antifúngicas según la invención pueden comprender, además de las mismas, proteínas de tipo osmotina, según se define en el documento WO91/18984. Independientemente, la invención proporciona composiciones antifúngicas que comprenden además agentes inhibidores, tales como antibióticos fúngicos clásicos, SAFP y fungicidas químicos, tales como polioxinas, nikomicinas, carboxiimidas, carbohidratos aromáticos, carboxinas, morfolinas, inhibidores de la biosíntesis de esteroles, compuestos organofosforados, enzimas tales como las gluconasas, chitinasas, lisozimas, y similares. Ya sea per se, o en combinación con otros constituyentes activos, la proteína antifúngica de la invención debería aplicarse en concentraciones de entre 1 ng/ml y 1 mg/ml, preferiblemente entre 2 ng/ml y 0,1 mg/ml, dentro de los límites de pH de 3,0 y 9,0. En general, es deseable usar preparaciones tamponadas, por ejemplo, tampones de fosfato entre 1 mM y 1 M, preferiblemente entre 10 mM y 100 mM, en particular entre 15 y 50 mM, mediante lo cual en el caso de bajas concentraciones de tampón, es deseable añadir una sal, para aumentar la fuerza iónica, preferiblemente NaCl en concentraciones de entre 1 Mm y 1 M, preferiblemente entre 10 mM y 100 mM.

Las plantas o partes de las mismas que sobreexpresan relativamente una proteína según la invención, incluyendo variedades vegetales con una resistencia mejorada frente a enfermedades fúngicas, especialmente enfermedades causadas por Oomicetos como Phytophthora y Phytium, pueden hacerse crecer en el campo, en el invernadero, o en casa o en cualquier otro sitio. Las plantas, o las partes comestibles de las mismas, pueden usarse para la alimentación animal o el consumo humano, o pueden ser tratadas para producir alimentos u otros propósitos en cualquier forma de agricultura o industria. Agricultura debe entenderse que incluye horticultura, arboricultura, cultivo de flores y similares. Las industrias que pueden beneficiarse del material vegetal según la invención incluyen, pero no se limitan a, la industria farmacéutica, la industria papelera, la industria azucarera, la industria alimentaria animal y humana, los fabricantes de enzimas y similares.

Las ventajas de las plantas, o las partes de las mismas, según la invención, son la disminuida necesidad de tratamientos fungicidas, disminuyendo así los costes materiales, de trabajo y la contaminación medioambiental, o prolongando la vida de almacenamiento de los productos (por ejemplo, frutas, semillas y similares) de dichas plantas. Las plantas para el propósito de esta invención deben significar organismos pluricelulares capaces de fotosintetizar y sometidos a alguna forma de enfermedad fúngica. Deben incluir al menos las plantas angiospermas y las gimnospermas, las monocotiledóneas y las dicotiledóneas.

La frase "plantas que sobreexpresan relativamente una proteína" debe significar plantas que contienen células que expresan una proteína codificada transgénicamente, que o no está presente de forma natural en dicha planta, o si está presente en virtud de un gen endógeno que codifica para una proteína idéntica, no en la misma cantidad o no en las mismas células, compartimentos celulares, tejidos u órganos de la planta. Se sabe, por ejemplo, que las proteínas que normalmente se acumulan intracelularmente pueden ser dirigidas al espacio apoplástico.

Según otro aspecto de la invención, la región reguladora de un gen vegetal que codifica para la proteína antifúngica de la invención puede usarse para expresar otras secuencias heterólogas bajo el control de la misma. El uso de un elemento regulador de al menos 1.000 pb directamente secuencia arriba de la región que codifica para el gen es suficiente para obtener la expresión de cualquier secuencia heteróloga.

A este respecto, secuencias heterólogas significan regiones del gen que no están asociadas de forma natural a dicha región reguladora, y comprenden ambas regiones diferentes codificantes de los genes, así como las regiones antisentido de los genes. Las secuencias codificantes heterólogas que pueden ser ventajosamente expresadas en el tejido vascular comprenden aquellas que codifican para proteínas antipatógenas, por ejemplo, proteínas insecticidas, bactericidas, fungicidas y nematicidas. En dicha estrategia se puede demostrar que es excepcionalmente ventajoso elegir una proteína con actividad frente a un patógeno o plaga que tenga preferencia por el floema como fuente de nutrientes (por ejemplo, los áfidos) o como entrada para invadir la planta. Algunos ejemplos son la extensina, la lectina o la lipoxidasa frente a áfidos (véase el documento WO93/04177). Asumiendo que la región reguladora según la invención está activa en el xilema, las proteínas antifúngicas pueden ser expresadas bajo el control de dicha región reguladora para combatir especies de Fusarium, Verticillium, Alternaria y Ceratocystis.

El uso de la región reguladora según la invención también puede ser usado ventajosamente para regular o controlar los procesos de transporte de floema. A los expertos en la materia se les ocurrirán fácilmente otras numerosas aplicaciones.

La expresión de parte de (parte de) un gen endógeno en orientación antisentido (tal como se describe en el documento EP 0 233 399 A) puede efectivamente regular descendentemente la expresión de dicho gen endógeno, con interesantes aplicaciones. Además, el propio gen que codifica para la proteína antifúngica según la invención puede ser regulado descendentemente usando la metodología antisentido, que puede ayudar a establecer la naturaleza y la función de la proteína. Las regiones responsables de la expresión específica tisular pueden ser además desenrolladas usando el marcador GUS de una forma análoga a la forma ilustrada en la presente invención.

Debe tenerse en consideración el siguiente estado de la técnica, especialmente para ilustrar el nivel general de experiencia en la materia al que corresponde esta invención.

Documentos EP-A 392 225 A2; EP-A 440 304 A1; EP-A 460 753 A2; WO90/07001 A1; patente de EE.UU. 4.940.840.

Otra parte más de la invención está dirigida a la producción de una nueva enzima oxidante, capaz de oxidar carbohidratos incluso a bajas concentraciones, debido a su baja Km. Más específicamente, el sustrato de la actividad enzimática son las hexosas, aunque también se ven afectados otros azúcares en un grado menor. Las enzimas pueden aislarse a partir de fuentes en las que aparecen de forma natural (según el método descrito en esta invención) o pueden aislarse a partir de plantas u otros organismos transformados con un gen expresable que codifica para la proteína. Estas oxidasas pueden usarse en procesos industriales para la oxidación de carbohidratos, tales como glucosa, manosa, galactosa, celobiosa, maltosa y lactosa.

Evaluación de las plantas transgénicas

Subsecuentemente, las plantas transformadas son evaluadas para comprobar la presencia de las propiedades deseadas y/o el grado hasta el cual se expresan las propiedades deseadas. Una primera evaluación puede incluir el nivel de expresión de los genes recientemente introducidos, el nivel de resistencia fúngica de las plantas transformadas, la heredabilidad estable de las propiedades deseadas, pruebas de campo y similares.

En segundo lugar, si se desea, las plantas transformadas pueden ser cruzadas con otras variedades, por ejemplo, variedades de mayor valor comercial o variedades en las que ya se han introducido otras características deseadas, o usadas para la creación de semillas híbridas, o pueden someterse a otro ciclo de transformación, y similares.

Sinergia

La combinación de una de las proteínas antifúngicas según la presente invención y otras proteínas antifúngicas de origen vegetal o microbiano está previsto que muestre un enérgico efecto antifúngico sinérgico. Se mostraron unos efectos antifúngicos sinérgicos similares si las combinaciones de CBP o Chi-V antifúngicas se combinan con \beta-1,3-gluconasas o con chitinasas procedentes de otros orígenes vegetales.

Aparentemente, el efecto sinergizante de las combinaciones de proteínas inducidas por patógenos es un fenómeno más general que tiene importantes consecuencias para la ingeniería de plantas resistentes a los hongos.

Pueden hacerse crecer plantas o partes de las mismas de interés comercial, con una resistencia mejorada frente a hongos fitopatógenos, en el campo o en invernaderos, y subsiguientemente usarse para la alimentación animal, el consumo humano directo, para un almacenamiento prolongado, en procesos alimentarios u otros tratamientos industriales y similares. Las ventajas de las plantas, o las partes de las mismas, según la invención son la reducida necesidad de tratamientos fungicidas, disminuyendo así los costes materiales, de trabajo y la contaminación medioambiental, o la vida de almacenamiento prolongada de los productos (por ejemplo, frutas, semillas y similares) de dichas plantas.

Parte experimental

Los métodos estándar para el aislamiento, manipulación y amplificación del ADN, así como los vectores adecuados para la replicación del ADN recombinante, las cepas bacterianas adecuadas, los marcadores de selección, los medios y similares se describen, por ejemplo, en Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; en DNA Cloning, volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); y en: From Genes to Clones (E.-L. Winnacker ed. 1987).

Ensayo antifúngico in vitro

Todos los hongos se cultivaron en agar con glucosa de patata (Difco) a 25ºC, excepto Botrytis cinerea y Poma lingam, que se hicieron crecer en agar con harina de avena (Difco) a 25ºC. Phytophthora infestans se hizo crecer en agar de centeno a 18ºC en la oscuridad (Caten y Jinks, 1968). Botrytis cinerea y Poma lingam se cultivaron bajo luz UV. Las esporas de los hongos esporuladores se recogieron inundando las placas de agar con agua. La concentración de esporas se ajustó a 10.000 esp/ml. En el caso de Rhizoctonia solani y Phythium ultimum los cultivos líquidos agitados se hicieron crecer en caldo de glucosa de patata a 25ºC. Para preparar el inóculo a partir de estos cultivos agitados, se recogieron los micelios y se agitaron en vórtice durante 1 minuto. Tras pasar por un tamiz fino la densidad del inóculo se ajustó a 2.500-5.000 fragmentos, de 1 a 3 células cada uno, por ml.

En caso de hongos esporuladores, todos se ensayaron con y sin pregerminación de las esporas antes de la aplicación de las muestras de proteínas. En el caso de los hongos no esporuladores se usaron fragmentos de hifas.

La actividad antifúngica se controló durante la purificación en un ensayo con microplacas usando los hongos Phytophthora infestans y Phythium ultimum según Woloshuk y col., 1991, o usando otros hongos de una forma similar. En cada pocillo de una microplaca de 24 pocillos se pipetearon 250 \mul de agar con glucosa de patata (PDA). Las esporas fúngicas, en el caso de, por ejemplo, Phytophthora infestans, y los fragmentos de hifas, en el caso de, por ejemplo, Phythium ultimum, se suspendieron en agua, y se añadieron a los pocillos 400-600 esporas o 200 fragmentos en 50 \mul. Subsiguientemente, se añadieron 100 \mul de disolución proteica (en MES 50 mM, pH 6,0) esterilizada (filtro de 0,22 \mum). Las microplacas se envolvieron con Parafilm y se incubaron a temperatura ambiente. El hongo se controló microscópicamente a diversos puntos temporales tras el inicio de la incubación para evaluar los efectos de la proteína añadida. Después de 2-3 días, el micelio del hongo en crecimiento de los pocillos se tiñó con azul algodón de lactofenol y se estimó la magnitud del crecimiento.

IC: inhibición del crecimiento, se usa una escala de 0-4, 0 = inhibición no visible, 1 = inhibición débil (del 0 al 30%), 2 = inhibición moderada (del 30 al 60%), 3 = inhibición fuerte (del 60 al 90%), 4 = inhibición muy fuerte (100%).

Ejemplo 1 Purificación de una proteína antifúngica MS59 a partir de girasol estimulado con ácido salicílico

Se pulverizaron diariamente las hojas de plantas de girasol de 7 a 8 semanas de edad (Helianthus annuus cv. zebulon) 5 veces con salicilato sódico 10 mM. Después de 3 horas las plantas se enjuagaron abundantemente con agua para eliminar el salicilato sódico. Tres días después de la última pulverización, las hojas (400 gramos) se recogieron en nitrógeno líquido y se homogeneizaron a 4ºC en 500 ml de NaOAc 0,5 M, pH 5,2, y 4 gramos de carbono activo, usando un mezclador Waring. El homogeneizado se filtró a través de un paño de queso de cuatro capas y subsiguientemente el filtrado se centrífugo durante 50 minutos a 20.000 g a 4ºC, y se desalinizó pasándolo a través de una columna Sephadex G25 (recorrido medio; Pharmacia) de 60 cm de longitud y 11,5 cm de diámetro, equilibrada con NaOAc 40 mM, pH 5,2. La disolución proteica desalinizada se almacenó hasta el día siguiente a 4ºC y subsiguientemente se centrífugo durante 45 minutos a 20.000 g a 4ºC. El sobrenadante se pasó a través de una columna de S-Sephadex (de flujo rápido, Pharmacia) de 5 cm de longitud y 5 cm de diámetro, que se equilibró con NaOAc 40 mM, pH 5,2. La columna se lavó con el tampón anteriormente mencionado (tasa de flujo, de 400 a 500 ml/h) hasta que la DO_{280} cayó a cero. Las proteínas unidas se eluyeron usando NaCl 400 mM en 200 ml del tampón anteriormente mencionado.

Tras una diálisis frente a MES 50 mM, pH 6,0, el eluido se analizó para evaluar la actividad antifúngica. La actividad antifúngica se controló en un ensayo de microplacas usando los hongos Phytophthora infestans y Phythium ultimum. Véase anteriormente para los detalles relativos a los ensayos in vitro. Subsiguientemente, se reaplicó una cromatografía de intercambio catiónico, mediante la cual el eluido se hizo pasar a través de un FPLC mono-S HR 5/5 (Pharmacia) y se eluyó con un gradiente lineal desde 0 hasta 400 mM de NaCl. Todas las fracciones se analizaron mediante electroforesis (Laemli (1970), Nature 227: 680-685) usando un gel de poliacrilamida al 12,5% en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS), usando marcadores de peso molecular preteñidos (15-105 kDa) como referencia. Adicionalmente, se controlaron todas las fracciones con actividad antifúngica frente a Phytophthora infestans y Phythium ultimum. La actividad antifúngica eluyó desde la columna a entre 45-60 mM de NaCl, y en todas las fracciones activas era visible una banda de 59 kDa. Las fracciones que contenían la actividad antifúngica se agruparon y se dializaron a sulfato amónico 1 M en fosfato potásico 50 mM, pH 7. El conjunto se sometió a cromatografía de interacciones hidrófobas, mediante la cual se aplicó la muestra a FPLC Fenil Superosa HR 5/5 (Pharmacia) equilibrada en el mismo tampón y eluida con un gradiente decreciente lineal desde 1 hasta 0 M de sulfato amónico en fosfato potásico 50 mM, pH 7. Como anteriormente, se analizaron de nuevo todas las fracciones en SDS-PAGE y se controlaron para evaluar la actividad antifúngica. También se analizó así el conjunto de proteínas que no era capaz de unirse a esta columna (de flujo a través, FT) en las condiciones elegidas aquí. La actividad antifúngica estaba presente de forma más abundante en la FT, y en segundo lugar, también en las fracciones que eluían a entre 0,76 y 0,45 mM de sulfato amónico. En ambos casos era visible una proteína de 59 kDa en el SDS-PAGE. La FT y las fracciones en gradiente se dializaron por separado en MES 50 mM, NaCl 0,2 M y se cromatografiaron por separado en una columna de FPLC Superdex 75 HR 10/30 (Pharmacia) equilibrada con el mismo tampón. Las proteínas eluyeron de esta columna según su tamaño molecular. De nuevo, en ambos casos la presencia de una proteína de 59 kDa coincidía con actividad antifúngica frente a Phytophthora infestans y Phythium ultimum, según se valoró a partir del SDS-PAGE y de los ensayos antifúngicos in vitro. La proteína de 59 kDa presente en la FT de la columna de interacciones hidrófobas era la más abundante, y se denominó MS59, y su purificación puede visualizarse en la Figura 1. Los resultados de su separación en una columna de filtración en gel y el subsiguiente análisis tanto por SDS-PAGE como en Phytophthora infestans se muestran en la Figura 2. Numerosas características (actividad antifúngica, propiedades cromatográficas, peso molecular) de la proteína de gradiente y de la MS59 indican que las dos proteínas son muy similares.

Para caracterizar adicionalmente la MS59 se determinó parcialmente su secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, la MS59 se separó en presencia de tioglucolato 0,1 mM en el tampón de reserva de más arriba y en SDS con gel de poliacrilamida al 12,5%, que se preensayó durante 2 horas a 50 V con glutatión 0,05 mM en el tampón de reserva de más arriba. El gel se tiñó con Serva Blue G al 5% (p/v) en metanol al 45% (v/v) y ácido acético al 10% durante 30 minutos, y se lavó con ácido acético al 20% (v/v) durante 30 minutos, y la banda de 59 kDa se cortó y se secuenció usando la degradación de Edman en un secuenciador de proteínas Applied Biosystems 477A según el protocolo proporcionado por el fabricante. La secuencia aminoacídica N terminal de la MS59 reveló que el N terminal estaba bloqueado. Para obtener las secuencias internas se digirió la MS59 con tripsina. La tripsina escinde la proteína en residuos de arginina y de lisina. Los productos de la digestión se separaron en una columna en fase inversa y se analizaron mediante una degradación de Edman. Se secuenciaron dos fragmentos tripsínicos: Pep1 y Pep2. Del Pep1 se identificaron 25 residuos de aminoácidos: S-I-N-V-D-I-E-Q-E-T-A-W-V-Q-A-G-A-T-L-G-E-V-Y-Y-R (SEQ ID Nº 1).

La secuencia de aminoácidos se proporciona usando el código de una letra. Del Pep2 se identificaron 25 residuos de aminoácidos adicionales: D-P-S-F-P-I-T-G-E-V-Y-T-P-G-(¿)-S-S-F-P-T-V-L-Q-N-Y (SEQ ID Nº 2).

El residuo de aminoácido entre paréntesis no pudo identificarse con claridad.

Ejemplo 2 Elución de una proteína antifúngica en PAGE en bruto y ensayo subsiguiente

A partir de las Figuras 1 y 2 resulta obvio que la MS59 no es completamente pura. Para asegurar adicionalmente que, de hecho, la proteína de 59 kDa es responsable de la actividad antifúngica observada, la fracción que contenía la cantidad punta de 59 kDa se electroforetizó en gel en bruto, usando el mismo sistema al descrito anteriormente, aunque sin SDS y sin hervir las muestras antes de la carga. El carril del gel se cortó en trozos horizontales de 0,5 cm, y cada trozo se eluyó individualmente durante 48 horas en MES 50 mM, pH 6. Después de la centrifugación, el sobrenadante resultante se analizó tanto en SDS-PAGE como in vitro para evaluar la actividad antifúngica. Los resultados se muestran en la Figura 3. Sólo se observó actividad antifúngica frente a Phytophthora infestans y Phythium ultimum en aquellas fracciones que contenían la MS59.

Ejemplo 3 Ensayos antifúngicos in vitro en no Oomicetos

Se realizaron ensayos fúngicos in vitro según se describe en la parte experimental general. Como control positivo se ensayó Phytophthora infestans. El pico de la MS59 se localiza en la fracción 4. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Efectos antifúngicos de fracciones que contienen la MS59 a partir de mono-S, pH 6

1

IC: inhibición del crecimiento, se usa una escala de 0-4, 0 = inhibición del crecimiento no visible, 1 = inhibición débil (del 0 al 30%), 2 = inhibición moderada (del 30 al 60%), 3 = inhibición fuerte (del 60 al 90%), 4 = inhibición muy fuerte (100%).

Como puede apreciarse, Phytophthora y Phythium sps. resultaron ser muy sensibles a la MS59.

Ejemplo 4 Purificación de una proteína antifúngica WL64 a partir de lechuga estimulada con ácido salicílico

Se pulverizaron diariamente las hojas de plantas de lechuga de 7 a 8 semanas de edad (Lactuca sativa cv. Lollo bionda) con salicilato sódico 10 mM durante 4 días. Después de dos horas, las plantas se enjuagaron abundantemente con agua para eliminar el salicilato sódico. En el día 5 se recogieron las hojas en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su uso posterior.

Las hojas de lechuga se descongelaron y se homogeneizaron a 4ºC en NaOAc 0,5 M, pH 5,2, \beta-mercaptoetanol al 0,1% (lechuga: tampón = 1:1,5 (p/v)) y 10 gramos de carbono activo por kg de hojas, usando un mezclador Waring. El homogeneizado se centrifugó durante 60 minutos a 9.000 g a 4ºC. Subsiguientemente se filtró el sobrenadante con un paño de queso de diez capas. El filtrado se llevó a una saturación del 40% con sulfato amónico y se centrifugó durante 30 minutos a 9.000 g. El sobrenadante resultante, que contenía un 85% de proteína y >95% de actividad antifúngica relativa al homogeneizado bruto, se sometió a una cromatografía de interacciones hidrófobas.

El sobrenadante se filtró en un papel de filtro y se aplicó a una subcolumna 6FF High de fenil-sefarosa (Pharmacia, 100 ml de volumen de lecho en una columna XK 50/20 de Pharmacia) preequilibrada con sulfato amónico al 40% (1,45 M) en tampón de fosfato potásico 50 mM, pH 6,0 (denominado tampón A) a una tasa de flujo de 10 ml/min o menos. La columna se lavó con al menos 10 volúmenes de columna de tampón A, tras lo cual la proteína unida se eluyó con un gradiente salino decreciente de 100% de tampón A al 20% de tampón A (KPi 50 mM, pH 6,0, como tampón B) durante un periodo de 40 min a una tasa de flujo de 10 ml/min, seguido de un gradiente lineal decreciente desde el 20% de A hasta el 0% de A (=100% de B) durante un periodo de 30 min a la misma tasa de flujo. La columna se lavó durante otros 45 min con tampón B, tras lo cual la elución era completa. Se recogieron fracciones de un minuto (10 ml/fracción). Las fracciones 40-75 (denominadas pico HIC) contenían actividad antifúngica.

Las fracciones agrupadas se concentraron (usando una celda de flujo agitada y una membrana YM de 30 kDa (Amicon)) y subsiguientemente se diluyeron 15 veces con acetato sódico 25 mM, pH 4,5. Esta disolución se aplicó a una columna preempaquetada Source S (16/20, Pharmacia) con una tasa de flujo de 10 ml/min. Tras lavar la columna con 5 volúmenes de columna de dicho tampón, la proteína se eluyó desde la columna con un gradiente creciente de NaCl (0-0,4 NaCl en NaOAc 25 mM, pH 4,5) durante un periodo de 60 min, 2,5 ml/min, fracciones de 1 min. Las fracciones se recogieron en 250 \mul de fosfato potásico 1 M, pH 7,0, con objeto de neutralizar el tampón relativamente ácido de NaOAc. Las fracciones que contenían actividad antifúngica (fracciones 25-45 (0,2-0,3 M de NaCl) se agruparon y se denominaron pico Source S.

El pico Source S se concentró, y se cambió el tampón a NaOAc 25 mM, pH 4,5, dando como resultado una fracción de aproximadamente 10 ml, y se sometió a una cromatografía de intercambio catiónico usando una columna Mono S (5/5, Pharmacia). La columna se eluye con los siguientes gradientes de NaCl (NaCl en NaOAc 25 mM, pH 4,5): 0-5 min, NaCl 0-0,1 M; 5-20 min, NaCl 0,1-0,16 M; 20-21 min, NaCl 0,16-0,25 M; 21-31 min, NaCl 0,25 M; 31-32 min, NaCl 0,25-1,0 M, seguido de NaCl 1,0 M durante 10 min, tras lo cual la elución es completa. La actividad antifúngica eluida desde la columna durante la etapa de NaCl 0,25 M (generalmente las fracciones 22-30; el pico Mono-S). Tasa de flujo, 1 ml/min, fracciones de 1 ml, recogidas en 100 \mul de fosfato potásico 1 M, pH 7,0.

El pico Mono-S se concentró hasta aproximadamente 0,5-1,0 ml y se sometió a una cromatografía de filtración en gel (Superdex 75, 10/30, Pharmacia) con NaCl 200 mM en fosfato potásico 50 mM, pH 7,0 como tampón eluyente. El volumen de muestra fue de 200 \mul, la tasa de flujo de 0,5 ml/min, 0,5 ml/fracción. La actividad antifúngica eluye desde la columna en la posición del marcador de 66 kDa. La comparación de las fracciones activas (pico SD 75) con el patrón de la proteína en SDS-PAGE revela una proteína de 64 kDa como la candidata más probable para la proteína antifúngica de lechuga (Figs. 6A-C). Esta proteína se denominó WL64.

Al pico SD 75 se le cambió el tampón hasta pH 9,5 para una cromatofocalización en una columna Mono P (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. Toda la actividad se encontró en el flujo a través de la columna (incluso cuando la columna se equilibró a pH 11), aunque hubo alguna separación (3 picos superpuestos en el flujo a través). La tasa de flujo fue de 0,5 ml/min, 0,5 ml/fracción. Las fracciones que contenían la actividad antifúngica se agruparon y se les cambió el tampón a MES 50 mM, pH 6,0. La tinción de coomassie de la fracción proteica más purificada tras el SDS-PAGE reveló aproximadamente 6 bandas proteicas, de las que dos bandas de 64 kDa y 55 kDa eran las más destacadas (Fig. 7). Las cantidades relativas estimadas de ambas proteínas en la fracción final eran de 1/6-1/8 para la proteína de 64 kDa, y 1/2-1/3 para la proteína de 55 kDa. Aunque sobre el gel se muestra que esta columna contribuye claramente a la purificación de la proteína de 64 kDa, la actividad específica, así como la recuperación de la proteína en las fracciones agrupadas, disminuyó considerablemente (véase la tabla 2).

En la tabla 2 se resume un procedimiento de purificación representativo.

TABLA 2 Purificación de la WL64

2

La actividad está representada como unidades de inhibición del crecimiento (unidades de IC). Cuatro unidades IC representan la cantidad de proteína que da como resultado una inhibición del crecimiento del 100% en el ensayo in vitro según se describió en la parte general de los Ejemplos.

Ejemplo 5 Elución de la WL64 a partir de PAGE en bruto y ensayo subsiguiente

Dado que la WL64 no era completamente pura, se investigó adicionalmente si la proteína de 64 kDa era de hecho responsable o no de la actividad antifúngica observada. La fracción Mono P que contenía la cantidad pico de actividad antifúngica se sometió a una electroforesis en gel de poliacrilamida en bruto al 10% en condiciones ácidas, en ausencia de SDS y de \beta-mercaptoetanol y sin hervir. Se cortaron dos líneas de gel adyacentes en trozos horizontales de 0,3 cm. Una parte se usó directamente en el ensayo antifúngico, la otra parte se sometió a SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes. La inhibición del crecimiento se correlacionaba claramente con la proteína de 64 kDa y no con la proteína de 55 kDa.

Ejemplo 6 Glucosilación de la WL64

La WL64, así como la proteína de 55 kDa, son glucosiladas según se ilustra mediante unión a la concanavalina A y mediante el kit de detección DIG-Glucano (Boehringer). Ambas proteínas eran insensibles al tratamiento con glucopeptidasa F, indicando que la glucosilación está probablemente unida por O.

Ejemplo 7 Secuenciación de los aminoácidos de la WL64

Para la secuenciación de los aminoácidos N terminales se separó una cantidad de 21 \mug de proteína purificada (que representa aproximadamente 4 \mug de WL64) en un gel de poliacrilamida al 7,5% y subsiguientemente se transfirió a una membrana PVDF. La membrana se tiñó con Serva Blue G al 0,1% en metanol al 45%, ácido acético al 10% durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se lavó con metanol al 45% y ácido acético al 10%. La banda de 64 kDa se cortó y se secuenció usando una degradación de Edman en un secuenciador de proteínas Applied Biosystems 477A según el protocolo proporcionado por el fabricante.

Para la secuenciación interna de la proteína se separaron 105 \mug de proteína purificada (que representan aproximadamente 20 \mug de WL64) en un gel de poliacrilamida-SDS al 7,5%. El gel se tiñó con Serva Blue G al 0,2% en metanol al 20%, ácido acético al 0,5% durante 20 min a temperatura ambiente y se lavó con metanol al 30% a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. La banda de 64 kDa se cortó y la proteína se digirió subsiguientemente con tripsina. Los productos de la digestión se separaron en una columna de fase inversa y se analizaron mediante una degradación de Edman.

Aparte de la secuencia N terminal (SEQ ID Nº 49), se secuenciaron dos fragmentos tripsínicos (SEQ ID Nº 50 y SEQ ID Nº 51).

SEQ ID Nº 49: Thr-Ser-Thr-Ser-Ile-Ile-Asp-Arg-Phe-Thr-Gln-(Cys/Ser)-Leu-Asn-Asn-Arg-Ala-Asp-Pro-(Ser)-(Phe)-

SEQ ID Nº 50: (Ser)-Ile-(???)-Val-(Ser)-Ile-Glu-Asp-Glu-Thr-Ala-(Trp)-Val-Gln-Ala-Gly-Ala-Thr-Leu-Gly-Glu-Val-Tyr-(Tyr)-

SEQ ID Nº 51: Ala-Asp-Pro-Ser-Phe-Pro-Leu-Ser-Gly-Gln-Leu-Tyr-Thr-Pro-

Los residuos de aminoácidos entre paréntesis no pudieron identificarse con claridad.

Ejemplo 8 Actividad antifúngica de MS59 y WL64

En base a la homología entre las secuencias de MS59 y WL64, ambas proteínas parecen estar muy relacionadas entre sí. Este también podría ser el caso para su actividad antifúngica, así como para sus actividades específicas hacia los respectivos hongos. Esta hipótesis se ensayó, y los resultados se resumen en la tabla 3.

TABLA 3 Actividad antifúngica de MS59 y WL64 ^{1}

3

Nótese que las cantidades de proteína se estimaron mediante tinción de Coomassie en geles SDS-PAGE, lo que significa que las cantidades de proteína descritas aquí son más bien indicativas que absolutas.

Ejemplo 9 Actividades oxidasa

Un cultivo de 50 ml de Rhizoctonia solani en caldo de glucosa de patata se sometió intensamente a ultrasonidos en hielo y subsiguientemente se centrifugó a 3.000 g durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante resultante se centrífugo entonces a 25.000 g durante 1 hora. El sedimento se lavó dos veces con agua desmineralizada y se resuspendió en 1 ml de agua que contenía Triton X-100 al 1,0%. De este modo se obtuvo una suspensión de paredes celulares fúngicas.

La actividad oxidasa se midió utilizando el reactivo 4-aminoantipirina (4-AAP) según Gallo, 1981 (Gallo, Methods in Enzymology, 71: 665-668, 1981). Un volumen de reacción de 500 \mul contenía tampón de fosfato potásico 50 mM, pH 7,0, FAD 25 \muM, NaN_{3} 10 mM, Triton X-100 al 0,01%, ácido 2,4,6-tribromohidroxibenzoico 6 mM, 4-AAP 2 mM y 10 unidades de peroxidasa de rábano picante. Se midió la producción de peróxido de hidrógeno a 510 nm. Se incluyeron cantidades conocidas de peróxido de hidrógeno para el calibrado.

La WL64, así como la MS59, realizaron actividades peroxidasa usando la suspensión de paredes celulares fúngicas como sustrato. Subsiguientemente se ensayaron diferentes sustancias como posibles sustratos, por ejemplo, algunos carbohidratos y aminoácidos (véase el ejemplo 10). Se encontró que la glucosa y otros carbohidratos servían de sustrato para la actividad oxidasa tanto de MS59 como de WL64.

Dado que MS59 y WL64 mostraron una actividad oxidasa de carbohidratos, y especialmente de glucosa, se investigó si la suspensión de paredes celulares fúngicas podría servir como sustrato para la glucosa oxidasa (GOX) de Aspergillus Níger (Sigma, G 2133). De hecho, éste fue el caso. Los estudios cinéticos mostraron que las MS59, WL64 y GOX mostraban una cinética de Michaelis-Menten cuando se usaba glucosa como sustrato, según se ilustró mediante un representación de Lineweaver-Burk (Fig. 8A). Los valores de K_{m} para la MS59 y la WL64 fueron inferiores en más de un orden de magnitud a los de la GOX: 19,5 \muM y 23,3 \muM para WL64 y MS59, respectivamente, y 359 \muM para GOX. Esto significa que la afinidad por la glucosa es mucho mayor en MS59 y WL64 que en GOX. Los valores de V_{máx} fueron, sin embargo, comparables, siendo de 5,7, 16,8 y 9,7 \mumol H_{2}O_{2}/min/mg de proteína para WL64, MS59 y GOX, respectivamente.

Los estudios cinéticos que usaban la suspensión de paredes celulares fúngicas como sustrato mostraron cinéticas de Michaelis-Menten tanto para MS59 como para WL64, pero no para GOX, según se muestra en la Fig. 8B. Los valores de K_{m} para MS59 y WL64 fueron de 4,7 \mul y 24,3 \mul, respectivamente, usando la suspensión descrita anteriormente. Los valores de V_{máx} fueron de 22,0 y 11,2 \mumol H_{2}O_{2}/min/mg de proteína para MS59 y WL64, respectivamente. Dado que la GOX, con paredes celulares fúngicas como sustrato, no muestra una relación lineal en una representación de Lineweaver-Burk, las K_{m} y V_{máx} no podían ser extrapoladas a partir de la gráfica. Los datos cinéticos se resumen en la tabla 4.

TABLA 4 Parámetros cinéticos de MS59, WL64 y glucosa oxidasa

4

Ejemplo 10 Especificidades de sustrato

Se ensayaron diferentes sustancias como posibles sustratos. Entre ellas, sacarosa, sorbitol, fructosa, c.m. celulosa, \beta-alanina, ácido aspártico, chitina, celulosa, glutamato, glicina-glicina, laminarían y glucosa, pero sólo la última sirvió como sustrato para al menos la WL64. Las concentraciones de los diversos sustratos variaban entre 5 mM y 50 mM. se investigó además si era la glucosa el único sustrato para MS59 y WL64, o si también podrían oxidar otros carbohidratos. Los ensayos enzimáticos se realizaron según se describe en el Ejemplo 9, siendo las concentraciones de sustrato de 50 mM. La GOX demostró oxidar exclusivamente a la glucosa (Fig. 9). La misma figura muestra que MS59 y WL64 muestran una especificidad de sustrato mucho más amplia, variando desde azúcares C_{4} hasta di y polisacáridos. Las mayores (y prácticamente iguales) actividades se obtuvieron con D-glucosa, D-manosa, D-galactosa, celobiosa, maltosa y lactosa (Fig.9). Este intervalo de sustratos se parece al intervalo encontrado convertido por la hexosa oxidasa (EC 1.1.3.5).

Ejemplo 11 Identificación y caracterización de los genes homólogos de la secuencia de nucleótidos deducida para MS59

En base a las secuencias de aminoácidos del pep1 (a.a. 12 a 22 de la SEQ ID Nº 1) y del pep2 (a.a. 2 a 12 de la SEQ ID Nº 2) se diseñaron los cebadores para la PCR. Se aisló ADN genómico de girasol cv. Zebulon y se usaron los cebadores de la PCR 4(5' AAC TTC TCC IAG IGT IGC ICC IGC TTG IAC CCA 3', SEQ ID Nº 3) y 5 (5' GAT CCI TCT TTC CCI ATT ACT GGI GAG GTT TA 3', SEQ ID Nº 4) para amplificar un fragmento de ADN de 354 pb a partir del genoma del girasol mediante PCR. Los productos de la PCR correspondientes a este tamaño de fragmento fueron clonados (SEQ ID Nº 5). El análisis de la secuencia del producto reveló la presencia de un marco abierto de lectura (ORF) ininterrumpido (SEQ ID Nº 6) del que el primer y último tramo de aminoácidos correspondía con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2. Muchos de los clones secuenciados contenían mutaciones puntuales, que variaban desde 1 a 4 en este fragmento de la PCR. Todas excepto una de estas mutaciones eran mutaciones silenciosas (nucleótido nr 57 T por C, nucleótido nr 63 C por A, nucleótido nr 225 A por G) que por lo tanto no alteraron las secuencias de los aminoácidos codificados. Sin embargo, un clon contenía una mutación puntual (nucleótido nr 203 G por A) que alteró la secuencia de aminoácidos en el aminoácido 68, de Arg a Lys.

Una transferencia Southern del ADN genómico del girasol, sondeado con la SEQ ID Nº 5, indicó la existencia de múltiples secuencias homólogas en el genoma. Usando SphI se detectaron 6 bandas, EcoRV 5 bandas, SpeI 3 bandas y NdeI 4 bandas. Con otras enzimas se discernieron previamente 3-4 bandas. Este análisis sugiere la existencia de 3 genes con homología (parcial) con las secuencias de MS59.

Se desarrollaron nuevos cebadores para la PCR en base a las zonas no variables entre las secuencias del cebador de PCR original. Cebadores: para 3' RACE: 5' CAG GCA GCT GTG GTT TGT GGC 3' (SEQ ID Nº 7), para 5' RACE: 5' GTC CAC AAT GAA GAA GGG TTG 3' (SEQ ID Nº 8) y para 3' RACE anidada: 5' ACG TAG ATA TCG AAC AAG AAA CCG C 3' (SEQ ID Nº 9).

El ARN que contenía el poli(A) se aisló del material foliar del girasol, que se estimuló pulverizando 5 veces con una disolución de salicilato sódico 10 mM. Se preparó el ADNc y se realizaron las reacciones de PCR RACE 5' y 3' según se describe en las instrucciones del kit Marathon^{TM} (Clontech laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Los clones de ADNc parcial se aislaron mediante reacciones de PCR RACE 5' y 3'. El análisis de la secuencia confirmó la identidad de los clones de ADNc parcial.

De nuevo, se desarrollaron nuevos cebadores para PCR y PCR anidada en base a la información sobre las secuencias recientemente obtenida a partir de los productos clonados de las PCR RACE 5' y 3'. Cebadores para la RACE 5': 5' CTG GGG AAG CCC GTG TAG TAA AGC 3' (SEQ ID Nº 11), 5' CGG GAA GTT GCA GAA GAT TGG GTT G 3' (SEQ ID Nº 13), para la RACE 5' anidada: 5' GAG CAA GAG AAG AAG GAGA AC 3' (SEQ ID Nº 14), para la RACE 3': 5' GCT TTA CTA CAC GGG CTT CCC CAG 3' (SEQ ID Nº 10), y para la RACE 3' anidada: 5' GGT ACT CCA ACC ACG GCG CTC 3' (SEQ ID Nº 12). Se aislaron cuatro clones de ADNc parcial que en conjunto codificaban para todos los marcos abiertos de lectura, incluyendo un probable péptido de señalización, seguido de una proteína de aproximadamente 59 kDa, y UTR 5' y 3' (regiones no traducidas) (SEQ ID Nº 15). Un clon de ADNc completo, de 1784 pb, cuyo ORF (pos. 21 a pos. 1608) codifica para 529 residuos de aminoácidos (SEQ ID Nº 16), podría ser ensamblado a partir de estos cuatro clones de ADNc parcial y los fragmentos de la PCR mencionados anteriormente (SEQ ID Nº 5).

La secuencia de señalización amino terminal (Von Heijne y col., 1983, y Von Heijne, 1985) no parece estar completamente presente dentro de los primeros 19 residuos de aminoácidos. Se realizó una predicción del sitio probable de escisión.

La secuencia de aminoácidos de este clon de ADNc se usó en una investigación de homologías BLAST. Esta secuencia reveló una alta homología con las enzimas Berberine Bridge (BBE) de la amapola de California (Eschscholtzia californica) (Drittich y Kutchan, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9969-9973) y la amapola del opio (Papaver somniferum) (Facchini y col., 1996, Plant Physiol. 112, 1669-1677).

El cribado BLAST de las bases de datos de las etiquetas de secuencia expresada (dbEST) con la secuencia de aminoácidos según se muestra en la SEQ ID Nº 16 reveló homólogos de la proteína MS59 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID Nº 21 a SEQ ID Nº 47) y del arroz (SEQ ID Nº 48).

Las secuencias EST están enumeradas en orientación sentido considerando la orientación de la homología de la MS59. Las secuencias de los clones de las EST fueron alteradas insertando uno o dos nucleótidos adicionales desconocidos (N o NN) en las posiciones del marco de lectura con objeto de obtener un solo marco de traducción con homología con la MS59.

Ejemplo 12 Aislamiento de los genes que codifican para la WL64 y determinación de la secuencia de nucleótidos

En base a las secuencias de aminoácidos del amino terminal de la proteína WL64 (SEQ ID Nº 49, Thr-Ser-Thr-Ser-Ile-Ile-Asp-Arg-Phe-Thr-Gln-(Cys/Ser)-Leu-Asn-Asn-Arg-Ala-Asp-Pro-(Ser)-(Phe)-) se desarrolló un cebador (a.a. 1 a 11 de la SEQ ID nº 49) para la PCR.

La secuencia de aminoácidos N terminal (SEQ ID Nº 49) reveló una alta homología con la porción correspondiente de la proteína MS59 (residuos de aminoácidos 20 a 39 de la SQ ID Nº 16).

Se preparó ADNc a partir de ARN que contenía Poli(A) que se aisló a partir de hojas de lechuga (Lactuca sativa cv. Lollo bionda) que fueron estimuladas pulverizándolas 5 veces con una disolución de salicilato sódico 10 mM. Para la PCR se usaron los cebadores FR-WL64-142 (5' ACT TCT ACT TCT ATT ATT GAT AGG TTT ACT CA 3', SEQ ID Nº 52) y el cebador 4 de la MS59 (5' AAC TTC TCC IAG IGT IGC ICC IGC TTG IAC CCA 3', SEQ ID Nº 3) para amplificar un fragmento de 405 pb a partir de conjunto de ADNc de lechuga. Los productos de la PCR correspondientes a este fragmento de PCR se clonaron y se secuenciaron (SEQ ID Nº 53), y revelaron un marco abierto de lectura ininterrumpido (SEQ ID Nº 54).

TABLA 5 Secuencias EST que muestran homología con la MS59

Se introdujeron marcos de lectura para una alineación óptima de las EST con la secuencia de la MS59. En las columnas con el marco de lectura 1 y el marco de lectura 2 se enumeran las posiciones de los marcos de lectura y del cambio (marco - - - - -> marco). El signo (-) significa que no hay presente ningún marco de lectura.

5

Se desarrollaron nuevos cebadores para la PCR en base a la secuencia de la SEQ ID Nº 53, que está localizada entre los cebadores de PCR originales. Se sintetizaron los cebadores para 5' RACE: 5' CAC GTT TAT GGA GCG TAA GTT GAA C 3' (SEQ ID Nº 55) y para 3' RACE: 5' CAC CCT TCA CAC ATT CAA GCA GC 3' (SEQ ID Nº 56) y se usaron en reacciones de PCR RACE 5' y 3', realizadas según se describe en las instrucciones del kit de amplificación de ADNc Marathon^{TM} (Clontech laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Se amplificaron dos clones parciales de ADNc mediante reacciones RACE 5' y 3'. El análisis de la secuencia confirmó la identidad de los clones de ADNc parcial que en conjunto codificaban para todos los marcos abiertos de lectura, incluyendo un péptido de señalización probable y UTR 5' y 3' (regiones no traducidas). Se ensambló un clon de ADNc completo, de 1981 pb (SEQ ID Nº 57), cuyo ORF (pos. 7 a pos. 1629) codifica para 540 residuos de aminoácidos (SEQ ID Nº 58). La secuencia de señalización amino terminal está representada por los primeros 27 residuos de aminoácidos.

Ejemplo 13 Caracterización y aislamiento de los genes de las enzimas Berberine Bridge a partir de Papaver somniferum y Eschscholtzia californica

Se preparó ADN genómico a partir de hojas de plantas adultas de la amapola de California (Eschscholtzia californica) y la amapola del opio (Papaver somniferum cv Marianne).

Se diseñaron cebadores para el gen de la amapola de California (EcBBE) en el inicio de la proteína madura (5' GGT AAT GAT CTC CTT TCT TGT TTG ACC 3', SEQ ID Nº 59) y en el codón de terminación, introduciendo un sitio de restricción Not I justo secuencia abajo del codón de terminación TAG (5' AGA GCG GCC GCT ATA TTA CAA CTT CTC CAC CAT CAC TCC TC 3', SEQ ID Nº 60).

Para el gen de la amapola del opio (PsBBE) se diseñaron cebadores de una forma similar, en el inicio de la presumible proteína madura (5' GGT GAT GTT AAT GAT AAT CTC CTC 3', SEQ ID Nº 61) y en el codón de terminación TAG, introduciendo un sitio de restricción Not I (5' AGA GCG GCC GCT ACA ATT CCT TCA ACA TGT AAA TTT CCT C 3', SEQ ID Nº 62).

Estos cebadores se usaron para amplificar la porción madura de ambos genes BBE.

Los productos de la PCR se digirieron con Not I y se unieron al vector pET32a (Novagen, Madison, WI) digerido con EcoR V y Not I. La correcta inserción del fragmento se confirmó usando un análisis con enzimas de restricción y una secuenciación del ADN.

Ejemplo 14 Caracterización y aislamiento de homólogos de la MS59 a partir de Arabidopsis thaliana

En nuestro cribado BLAST identificamos 26 EST con homología con la MS59. Una EST se encontró en el arroz y las otras 25 se encontraron todas en A. thaliana. Las EST homólogas se encontraron a lo largo de toda la secuencia completa de la MS59. El análisis de las etiquetas de secuencia expresadas por Arabidopsis reveló que hay 3 EST con una alta homología en el extremo 5' de la proteína (SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 39 y SEQ ID Nº 40), de las cuales SEQ Nº 39 y SEQ ID Nº 40 son secuencias imbricadas. La parte 3' de la MS59 mostró una homología con las 7 secuencias EST (SEQ ID Nº 24, 27, 32, 34, 41, 43 y 45), de las cuales la SEQ ID Nº 24 está imbricada con la SEQ ID Nº 43, y la SEQ ID Nº 32 está imbricada con la SEQ ID Nº 45.

Se diseñaron los cebadores y se localizaron al inicio de la presumible parte madura (los posibles sitios de escisión se predijeron según las secuencias consenso descritas por Von Heijne y col., 1983, y Von Heijne, 1985) de las dos diferentes EST homólogas con la parte 5' de la MS59 (SEQ ID Nº 16).

La secuencia EST representada por la SEQ ID Nº 21 posiblemente perdió los tres primeros residuos de aminoácidos de la parte madura predicha, comparada con la secuencia de aminoácidos de la MS59 (SEQ ID Nº 16) y, por tanto, los residuos de aminoácidos 20 a 22 de la SEQ ID Nº 16 fueron introducidos incluyendo 9 nucleótidos en el extremo 5' del cebador.

Cebador localizado en 5' de la SEQ ID Nº 21, añadidos los residuos 20 a 22 de la MS59 (SEQ ID Nº 16): 5' ACT TCC CGT AGA AAC TCG GAG ACT TTC ACA CAA TGC 3' (SEQ ID Nº 63).

Cebador localizado detrás del sitio de escisión predicho de la SEQ ID Nº 39 y la SEQ ID Nº 40: 5' TCC ATC CAA GAT CAA TTC ATA AAC TGT GTC (SEQ ID Nº 64).

También se elaboraron cebadores localizados alrededor del codón de terminación de las cinco diferentes secuencias EST homólogas con la parte 3' de la secuencia de aminoácidos de la MS59 (SEQ ID Nº 16), e introduciendo un sitio de restricción Not I para la clonación del vector de expresión pET32a de E. coli.

Cebador localizado en la SEQ ID Nº 24 y la SEQ ID Nº 43, 5' AGA GCG GCC GCT TTC ATG AAC CTA GCT TCT AGT AGG 3' (SEQ ID Nº 65). Cebador en la SEQ ID Nº 27, 5' AGA GCG GCC GCG AAA TGG CCC CCC TTT TAA AAC GGG G 3' (SEQ ID Nº 66). Cebador en la SEQ ID Nº 32 y la SEQ ID Nº 41, 5' AGA GCG GCC GCA AAT GAT ATC TTC AGG TAA CTT TGT TCA C (SEQ ID Nº 67). Cebador en la SEQ ID Nº 34, 5' AGA GCG GCC GCA TAA TCA AAT AAA TAC ACT TAT GGT AAC ACA G (SEQ ID Nº 68) y el cebador en la SEQ ID Nº 45, 5' AGA GCG GCC GCT GGT TTT GTA TTG AGG ACT CAA AAC AG 3' (SEQ ID Nº 69).

Se usaron todas las combinaciones posibles de los cebadores 5' con los cebadores 3' en una PCR sobre el ADN genómico aislado a partir de Arabidopsis thaliana cv Columbia. En una PCR con los cebadores SEQ ID Nº 63 y SEQ ID Nº 68 se amplificó una banda de aproximadamente 1800 pb. Esta banda se clonó y se confirmo la identidad del producto de la PCR mediante secuenciación de ADN. El producto de la PCR clonado de 1757 pb (SEQ ID Nº 70) contenía un intrón desde la posición 570 hasta la posición 801, el marco abierto de lectura de la SEQ ID Nº 70 consiste en 508 residuos de aminoácidos (SEQ ID Nº 71).

Se aisló el ARN total a partir de Arabidopsis thaliana Col-0 a partir de brotes decolorados estériles de 12 días crecidos en la oscuridad en agar Murashige y Skoog, a partir de brotes estériles de 12 días crecidos en medio Murashige y Skoog líquido con un fotoperiodo de 16 horas, y a partir de hojas, tallos, flores y silicuas de plantas adultas (Newman y col., 1994 Plant Physiol. 106: 1241-1255). El ARN procedente de las diferentes etapas de desarrollo se agrupó. Se aisló el ARN Poli(A)^{+} usando el kit de aislamiento de ARNm Quick ® Poli(A) (Stratagene, La Jolla, CA), y el ADNc se preparó usando el kit de amplificación de ADNc Marathon^{TM} (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA).

La reacciones de PCR se realizaron con el conjunto de ADNc, con diferentes combinaciones de cebadores 5' y cebadores 3'. Un producto de la PCR se amplificó con la combinación de cebadores SEQ ID Nº 63 y SEQ ID Nº 68, de aproximadamente 1600 pb. El producto de la PCR se clonó en los sitios de restricción EcoR V y Not I del vector de expresión bacteriano pET32a (Novagen, Madison, WI). Se determinó la secuencia del producto de la PCR, y reveló un marco abierto de lectura ininterrumpido de 1527 pb (SEQ ID Nº 72) que representaba una proteína de 508 residuos de aminoácidos (SEQ ID Nº 73).

Se amplificó un segundo clon de ADNc de aproximadamente 1600 pb con la combinación de cebadores SEQ ID Nº 64 y SEQ ID Nº 65. Este clon de ADNc también se unió a los sitios de restricción EcoR V y Not I de pET32a (Novagen, Madison, WI). Este clon por PCR de ADNc también se caracterizó mediante secuenciación del ADN, y consistía en un marco abierto de lectura ininterrumpido de 1530 pb (SEQ ID Nº 74) que codificaba para 509 residuos de aminoácidos (SEQ ID Nº 75).

Ejemplo 15 Expresión de la MS59, de las enzimas Berberine Bridge a partir de Papaver somniferum y Eschscholtzia californica y dos proteínas homólogas a partir de Arabidopsis thaliana cv Columbia en E. coli

Se introdujo un fragmento de PCR que contenía la presumible porción madura de la MS59 en el vector pET32c (Novagen, Madison WI), y la correcta inserción del fragmento se confirma usando una secuenciación de ADN. Entonces, el plásmido se introdujo en AD494 (DE3) pLysS (Novagen, Madison, WI) de E. coli. Entonces se iniciaron cultivos a pequeña escala (2 ml) de numerosas colonias, la mitad de los cuales es inducida mediante la adición de IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Los extractos totales a partir de E. coli se ensayaron en geles SDS y se analizaron mediante tinción con azul brillante coomassie.

Numerosos clones mostraron una fuerte sobreexpresión de la proteína MS59. Se eligió un clon que tenía una fuerte sobreexpresión para un cultivo a gran escala. Se inocularon quinientos ml de LB complementado con glucosa 0,4 mM con un cultivo de esta E. coli, y se hizo crecer hasta una densidad óptica de 0,5-0,7. Entonces se añadió IPTG hasta una concentración final de 1 mM y se dejó la producción de proteína durante 3 horas a 30ºC. Se encontró una gran proporción de la proteína MS59 en la fracción proteica insoluble, una pequeña cantidad apareció soluble. La preparación de proteína insoluble resultante contenía principalmente proteína MS59. Esta preparación se usa para producir anticuerpos (Ejemplo 17). La fracción soluble se usó en un ensayo in vitro para comprobar si la proteína MS59 todavía mostraba actividad antifúngica.

Los plásmidos pET32a que contenían los marcos abiertos de lectura de los cuatro homólogos MS59/WL64 se introdujeron en AD494 (DE3) pLysS (Novagen, Madison, WI) de E. coli. Se hicieron crecer cultivos a pequeña escala (25 ml) de numerosos clones independientes hasta una densidad óptica de 0,5-0,7. Entonces se añadió IPTG hasta una concentración final de 1 mM y se dejó la producción de proteína durante 3 horas a 30ºC.

Se aislaron las fracciones soluble y de proteína total. Las muestras se analizaron usando SDS-PAGE seguido de una tinción Neuhoff y un análisis Western usando el kit detección S-Tag Western Blotting (Novagen, Madison, WI). Se encontró una gran porción de proteína en la fracción insoluble, sólo una pequeña cantidad parecía ser soluble. Se eligieron los clones que sobreexpresaban fuertemente las proteínas homólogas para la producción de proteínas en cultivos a gran escala de 1,5 litros cada uno.

Ejemplo 16 Ensayos antifúngicos in vitro de MS59, de homólogos de MS59/WL64 a partir de la amapola de California (Eschscholtzia californica) y de la amapola del opio (Papaver somniferum) y dos proteínas homólogas a partir de Arabidopsis thaliana

La proteína MS59 producida en E. coli contenía marcajes trxA-, His- y S-, N terminales. Se usó el marcaje con His para la purificación de la MS59 soluble en una columna de IMAC (cromatografía de afinidad sobre metal inmovilizado) cargada con Ni^{+2}. La proteína unida se eluyó aumentando la concentración de imidazol. La fracción pico de esta purificación contenía algunas proteínas contaminantes de E. coli.

La fracción pico de esta purificación de MS59 se dializó en MES 50 mM, pH 6,0, y se usó en un ensayo in vitro con Phytophthora infestans y Phytium ultimum. Para la preparación estándar de un ensayo antifúngico in vitro con Phytophthora infestans y Phytium ultimum, véase más arriba.

Como tratamiento de control ensayamos una proteína marcada con His no relacionada purificada a partir del mismo hospedador de expresión, con algún trasfondo de proteína de E. coli. También se incluyó una MS59 hervida de control (calentada 10 minutos a 100ºC). Se ensayaron aproximadamente 40 ng de proteína de fusión en el ensayo de Phytophthora infestans, y se usó el doble de esa cantidad para el ensayo de inhibición de Phytium ultimum.

Las microplacas se envolvieron con Parafilm y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de 2-3 días, el micelio del hongo en crecimiento de los pocillos se tiñó con azul algodón de lactofenol y se estimó la magnitud del crecimiento.

Las fracciones IMAC a partir de la fracción soluble de E. coli que contenía la MS59 mostraron una completa inhibición de P. infestans y de P. ultimum a concentraciones de 20-40 ng.

TABLA 6 Efectos antifúngicos de MS59 a partir de E. coli sobre Phytophthora infestans

6

La inhibición del crecimiento (IC) se puntúa visualmente sobre una escala lineal de 0 (sin inhibición) a 4 (inhibición completa del crecimiento).

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TABLA 7 Efectos antifúngicos de MS59 a partir de E. coli sobre Phytium ultimum

7

El análisis microscópico de los pocillos indica la rápida germinación y subsiguiente crecimiento de zoosporas de Phytophthora infestans en cada uno de los controles. La germinación es inhibida casi completamente en las reacciones que contienen la proteína MS59 a partir de E. coli. Algunas esporas germinan, pero el crecimiento del extremo apical de las hifas parece detenerse poco después de su inicio. Después de 48 horas, el crecimiento del micelio de Phytophthora infestans es abundante en los controles, pero prácticamente indetectable en el ensayo que contiene la MS59. Incluso después de 72 horas no se observa ningún crecimiento sustancial. Las hifas fúngicas parecen un poco granulares y engrosadas en las reacciones que contienen la proteína MS59. En la figura 4 se describen algunos ejemplos de los patrones característicos de crecimiento fúngico en incubaciones con y sin MS59 producida a partir de E. coli. Después de 48 y 72 horas, el crecimiento fúngico en las incubaciones de control es tan extenso que no se pudo reunir ningún material fotográfico. Las incubaciones en presencia de MS59 dan lugar a una inhibición completa de cualquier crecimiento adicional, los tubos de germinación observados a las 24 horas no se extendieron adicionalmente de forma apreciable.

Asimismo, en el ensayo de inhibición de Phytium ultimum, donde se usan fragmentos de micelios, no se aprecia crecimiento tras el tratamiento con MS59 (véase la fig. 5). Después de 24 horas, las reacciones de control estaban completamente inundadas de micelio. En esa etapa, sólo son aparentes unos pequeños fragmentos de micelio en la muestra tratada con MS59.

Los homólogos de amapola se expresaron en E. coli (pET32a) y se ensayaron para comprobar la actividad antifúngica in vitro sobre Phytophthora infestans y Phytium ultimum. Las esporas de Phytophthora infestans y los fragmentos de hifas de Phytium ultimum se suspendieron respectivamente en agua estéril o caldo de glucosa de patata (PDB). A cada pocillo se añadieron 400-600 esporas o 200 fragmentos/50 \mul.

Las proteínas expresadas se purificaron parcialmente mediante una columna de cromatografía IMAC. Las fracciones que contenían las proteínas expresadas se cambiaron de tampón a MES 50 mM, pH 6,0, se filtraron de forma estéril y se ensayaron para comprobar su actividad antifúngica, con la pET32a-MS59 de E. coli purificada por IMAC como control positivo.

No se observó actividad antifúngica para los homólogos MS59/WL64 de Eschscholtzia californica y de Papaver somniferum, ni siquiera a concentraciones diez veces mayores a las del control positivo, dando lugar a un 100% de inhibición del crecimiento de ambos hongos. Esto podría significar que estas proteínas expresadas en E. coli no tenían el plegamiento correcto y por tanto no mostraron actividad biológica.

Ejemplo 17 Cultivo de anticuerpos contra MS59 desnaturalizada

Se cultivaron anticuerpos en conejos contra MS59 desnaturalizada (la forma solubilizada a partir de la fracción insoluble de E. coli) en trozos de PAG. Los anticuerpos mostraron una reacción cruzada con una banda de aproximadamente 60 kDa sólo en la FI de plantas de tabaco pMOG1180 (Ejemplos 18 y 19) que contenían actividad antifúngica y glucosa oxidasa. Sorprendentemente, no se encuentra reacción cruzada con la WL64.

Ejemplo 18 Confección de un clon de MS59 para su expresión en plantas transgénicas

Se desarrollaron cebadores para PCR en base a la secuencia alrededor del codón de inicio ATG y del codón de terminación TGA para clonar el marco abierto de lectura (ORF). Se introdujo un sitio de restricción NcoI en el codón de inicio ATG para su fusión con un promotor constitutivo mediante PCR usando el cebador 5' CC GCC ATG GAG ACT TCC ATT CTT ACT C 3' (SEQ ID Nº 16). El segundo codón del ORF cambió de caa (Q) a gag (E) como resultado del sitio de restricción NcoI introducido.

Secuencia abajo del codón de terminación TGA se introdujo un sitio de restricción BamHI mediante PCR usando el cebador 5' GCC GGA TCC TCA AGA TGA CAA AGT TGG GAT GCT 3' (SEQ ID Nº 18).

Usando una reacción de PCR con la ADN polimerasa Pfu amplificamos el ORF completo, usando los cebadores de la PCR para introducir el sitio de restricción NcoI en el codón de inicio ATG, y el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BamHI justo secuencia abajo del codón de terminación. La integridad de la secuencia de ADN se confirmó mediante secuenciación (SEQ ID Nº 19). El ORF completo se unió a un promotor constitutivo que permite un alto nivel de expresión proteica en la mayoría de las partes de la planta. Después del ORF, se introdujo una región 3' no traducida del inhibidor II de la proteinasa de la patata (Thornburg y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 744-748), que contiene las secuencias necesarias para la poliadenilación (An y col., 1989, Plant Cell 1, 115-122). El gen quimérico producido se introdujo en el vector binario pMOG800 (depositado en el Central Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holanda, con el CBS 414.93, el 12 de agosto de 1993). El clon resultante pMOG1180, que porta el constructo MS59 bajo el control del promotor híbrido ocs-mas (documento WO95/14098), se introdujo en la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens, adecuada para la transformación de los cultivos objetivo de tomate y patata, en la cepa MOG101 para la transformación del tabaco, y en Arabidopsis y MOG301 para la transformación de Brassica napus.

Ejemplo 19 Producción y análisis de plantas de tabaco y patata transgénicas que contienen del gen constructo de MS59

Usando una transformación mediada por Agrobacterium se introdujeron constructos de sistema binario que contenían el gen constructo de MS59, según se describe en el Ejemplo 18, en tabaco y patata. Los brotes transgénicos de estas diferentes especies de plantas se reengendraron como plantas completas, y subsiguientemente, se analizaron los transformantes primarios para comprobar la expresión del gen de MS59 recientemente introducido. Para este análisis se hizo uso de técnicas de transferencia Western, usando anticuerpos contra un péptido específico de MS59 unido a BSA. Todos los antisueros se diluyeron a 1:5.000. Se usó una serie de concentraciones de proteínas purificadas (12,5, 25, 50 y 100 ng) para valorar el nivel de expresión de las proteínas introducidas en las plantas transgénicas. Las muestras transgénicas se homogeneizaron en tampón de acetato sódico 50 mM, pH 5,2, y los extractos se clarificaron mediante centrifugación. Los sobrenadantes se analizaron directamente o se dejaron precipitar en hielo hasta el día siguiente. La precipitación de la noche fue siempre seguida de una clarificación (mediante centrifugación). Se determinó la concentración de proteína de los sobrenadantes obtenida mediante cualquiera de las dos formas usando reactivo Bradford (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254) y BSA como proteína estándar. Se cargó toda la proteína posible (pero nunca más de 10 \mug) en un gel SDS-PAA al 12,5% (Laemli, supra) y se inmunotransfirió según se describió previamente (Ponstein y col., supra).

Se elaboraron extractos a partir de hojas de plantas de tabaco y de patata transgénicas de MS59 depositando fragmentos de hojas en un tampón que contenía NaAc 50 mM (pH = 5,2). Después se extrajo la proteína insoluble mediante centrifugación. Se midió el contenido total de proteína soluble, y se cargó el equivalente a 10 \mug en gel SDS. Después de analizar el gel, las proteínas se inmunotransfirieron. El transferido se reveló usando el antisuero cultivado contra MS59 purificada (Ejemplo 17). El antisuero específico contra MS59 se usó en una dilución 1:5.000. La MS59 purificada también se analizó en un lado del gel, y se incluye como referencia.

En ensayos de infecciones fúngicas se ensayarán diversas plantas transformadas elegidas en base a su alto nivel de expresión de la proteína MS59 y plantas descendientes S1.

Ejemplo 20 Purificación de transproteínas de MS59 a partir de tabaco transgénico

Se produjeron plantas de tabaco transgénicas que expresaban constitutivamente la MS59. Los niveles de expresión se determinan usando un análisis Western. Los extractos del material transgénico se ensayan para evaluar su actividad inhibidora del crecimiento in vitro frente a Phytophthora infestans y Phytium ultimum. Se elaboraron extractos totales a pequeña escala a partir de hojas de tabaco in vitro que contenían el constructo pMOG1180 (mas-ocs-promotor-MS59) y líneas de control de tabaco. Los extractos se elaboraron moliendo material foliar en NaAc 50 mM, pH 5,2. El sobrenadante se dializó contra MES 50 mM, pH 6,0, y se ensayó para evaluar la actividad antifúngica in vitro según los métodos descritos en la parte experimental general. Algunas de las líneas de pMOG1180 de tabaco mostraron una alta actividad antifúngica sobre P. infestans y P. ultimum, comparadas con otras líneas o con líneas de control.

Ejemplo 21 Actividad carbohidrato oxidasa / Localización de MS59 en tabaco transgénico

Se ensayaron cantidades iguales de MS59 soluble parcialmente purificada y fracciones homólogas solubles (Papaver, Eschscholtzia, A-11 y B7 de Arabidopsis) para evaluar la actividad carbohidrato oxidasa. La actividad carbohidrato oxidasa de MS59 fue de 0,011 ODu/min, y para los homólogos 0,0003-0,0012 ODu/min, una diferencia con un factor de 10.

A partir de las líneas de tabaco transgénicas pMOG1180 del Ejemplo 20 que mostraron actividad antifúngica in vitro se aisló IF en la última etapa y se ensayó para evaluar la actividad carbohidrato oxidasa. También se ensayó el material que quedó tras el aislamiento de IF (denominado "-IF"). Las mismas líneas que mostraron actividad antifúngica tienen una alta actividad carbohidrato oxidasa. La actividad está localizada en IF.

Ejemplo 22 Introducción de los cuatro genes constructos que contienen Chi-I, Glu-I, AP-24 y MS59 bajo el control de un promotor constitutivo de la planta, en tomate, patata, zanahoria, Brassica napus y Arabidopsis

Usando una transformación mediada por Agrobacterium se introdujeron los constructos de sistema binario
pMOG1145 y pMOG1180 que contenían los genes que codificaban para Chi-I, Glu-I, AP24 y MS59, o pMOG1146 que contenía los genes que codificaban para Chi-I, Glu-I, bPR-1 y MS59, en diferentes especies de cultivos, incluyendo tomate, patata, zanahoria, Brassica napus y Arabidopsis. Las plantas descendientes S1 se ensayan en ensayos de infecciones fúngicas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: MOGEN International nv

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(B)

CALLE: Einsteinweg 97

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(C)

CIUDAD: Leiden

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(E)

PAÍS: Holanda

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2333 CB

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(G)

TELÉFONO: 31-(0)71-5258282

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(H)

FAX: 31-(0)71-5221471

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas antifúngicas, ADN que codifica para las mismas y hospedadores que las incorporan.

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 75

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(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE SOPORTE: Disco floppy

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1.0 Versión #1.25 (EPO)

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(vi)

DATOS PREVIOS A LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: EP 96.202.466.7

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 4 de septiembre de 1996

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(vi)

DATOS PREVIOS A LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: EP 96.200.831.2

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 de marzo de 1997

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Helianthus annuus

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: cv. zebulon

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ile Asn Val Asp Ile Glu Gln Glu Thr Ala Trp Val Gln Ala Gly}

\sac{Ala Thr Leu Gly Glu Val Tyr Try Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Helianthus annuus

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: cv. zebulon

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Ser Phe Pro Ile Thr Gly Glu Val Tyr Thr Pro Gly Xaa Ser}

\sac{Ser Phe Pro Thr Val Leu Gln Asn Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN: /function= "primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACTTCTCCN AGNGTNGCNC CNGCTTGNAC CCA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /function= "primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCCNTCTT TCCCNATTAC TGGNGAGGTT TA

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 354 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Helianthus annuus

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: cv. zebulon

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..354

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRAS CARACTERÍSTICAS: /function= "primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGCAGCTG TGGTTTGTGG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /function= "primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCACAATG AAGAAGGGTT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /function= "primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTAGATAT CGAACAAGAA ACCGC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTTACTAC ACGGGCTTCC CC AG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGGGAAGC CCGTGTAGTA AAGC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTACTCCAA CCACGGCGCTC

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGAAGTTG CAGAAGATTG GGTTG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGCAAGAGA AGAAGGAGAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1784 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Helianthus annuus

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Zebulon

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 21..1608

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 529 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCCATGGA GACTTCCATT CTTACTC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGGATCCT CAAGATGACA AAGTTGGGAT GCT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1590 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Helianthus annuus

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Zebulon

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1590

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 19:

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 529 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 350 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..350

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 21:

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 278 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..278

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 22:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 345 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..345

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 695 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..695

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 24:

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 495 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..495

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 25:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 204 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..204

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 26:

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 491 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..491

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 27:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 407 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3..407

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 28:

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 360 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3..360

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 29:

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 427 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3..427

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 30:

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 437 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..437

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 31:

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 441 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..441

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 32:

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 502 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..502

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 33:

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 400 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..400

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 34:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 383 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..383

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 35:

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 354 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..354

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 36:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 403 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..403

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 37:

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 260 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..260

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 38:

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 605 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..605

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 39:

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 464 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..464

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 40:

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 386 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..386

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 41:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 377 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..377

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 42:

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 377 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..377

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 43:

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 346 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..346

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 44:

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 261 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..261

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 45:

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 478 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..478

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 46:

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 579 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ecotipo Columbia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..579

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 47:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 252 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Nipponbare, subesp. japónica

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ETAPA DE DESARROLLO: brote descolorido (de 8 días de edad)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3..252

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 48:

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Lactuca sativa

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: lollo bionda

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /label= Ambiguous

\vskip0.500000\baselineskip

\hskip0,3cm

/note= "Xaa = Cys or Ser"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /label= ambiguous

\vskip0.500000\baselineskip

\hskip0,3cm

/note= "Xaa-Xaa probably is Ser-Phe"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Thr Ser Ile Ile Asp Arg Phe Thr Gln Xaa Leu Asn Asn Arg}

\sac{Ala Asp Pro Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Lactuca sativa

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: lollo bionda

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /label= ambiguous

\vskip0.500000\baselineskip

\hskip0,3cm

/note= "Xaa = probably Ser"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /label= unknown

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NOMBRE/CLAVE: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /label= ambiguous

\vskip0.500000\baselineskip

\hskip0,3cm

/note= "Xaa = probably Ser"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /label= ambiguous

\vskip0.500000\baselineskip

\hskip0,3cm

/note= "Xaa = probably Trp"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Modified-site

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 24

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /label= ambiguous

\vskip0.500000\baselineskip

\hskip0,3cm

/note= "Xaa = probably Tyr"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ile Xaa Val Xaa Ile Glu Asp Glu Thr Ala Xaa Val Gln Ala Gly}

\sac{Ala Thr Leu Gly Glu Val Tyr Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Lactuca sativa

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: lollo bionda

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asp Pro Ser Phe Pro Leu Ser Gly Gln Leu Tyr Tyr Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTTCTACTT CTATTATTGA TAGGTTTACT CA

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 405 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

ORGANISMO: Lactuca sativa

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CEPA: lollo bionda

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

LOCALIZACIÓN: 1..405

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 53:

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 135 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 54:

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACGTTTATG GAGCGTAAGT TGAAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCCTTCAC ACATTCAAGC AGC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1981 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Lactuca sativa

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: lollo bionda

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 7...1626

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: unsure

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: replace (372, "g")

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: unsure

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: replace (379, "g")

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: unsure

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: replace (786, "t")

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: unsure

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: replace (1105..1106, "ga")

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /note: ``also posible "gg" and "aa"''

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 57:

52

53

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 540 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 58:

56

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTAATGATC TCCTTTCTTG TTTGACC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGCGGCCG CTATATTACA ACTTCTCCAC CATCACTCCT C

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGATGTTA ATGATAATCT CCTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGCGGCCG CTACAATTCC TTCAACATGT AAATTTCCTC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTTCCCGTA GAAACTCGGA GACTTTCACA CAATGC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCATCCAAG ATCAATTCAT AAACTGTGTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGCGGCCG CTTTCATGAA CCTAGCTTCT AGTAGG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGCGGCCG CGAAATGGCC CCCCTTTTAA AACGGGG

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGCGGCCG CAAATGATAT CTTCAGGTAA CTTTGTTCAC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGCGGCCG CATAATCAAA TAAATACACT TATGGTAACA CAG

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNcç

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGCGGCCG CTGGTTTTGT ATTGAGGACT CAAAACAG

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1757 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Colombia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: join (1..570, 801..1754)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 70:

59

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 508 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 71:

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1527 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Colombia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1524

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 72:

65

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 508 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 73:

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1530 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Colombia

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1527

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 74:

72

73

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 509 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 75:

75

76

77

Claims (11)

1. Un método para obtener una planta con una susceptibilidad reducida al hongo Phytophthora y/o al hongo Pythium, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) introducir en células progenitoras, que son susceptibles de ser reengendradas como una planta completa, una secuencia de ADN quimérico que comprende un marco abierto de lectura capaz de codificar para una proteína elegida del grupo descrito como SEQ ID N^{OS} 15; 19; 57; 70; 72; Y 74 o una muteína, la cual difiere de dicha proteína por el remplazo, la adición o la eliminación de un aminoácido, y en la que dicha muteína tiene actividad anti-Phytophthora y/o anti-Pythium, estando dicho marco abierto de lectura unido operativamente a una región de inicio de la transcripción y de la traducción y a una región de terminación de la transcripción, permitiendo que dicha proteína o dicha muteína sea producida en dichas células progenitoras que son susceptibles de ser infectadas por dicho hongo, y

(b) una secuencia de ADN quimérico que codifica para un marcador vegetal seleccionable que permita la selección de las células progenitoras transformadas cuando dicho marcador seleccionable está presente en las mismas, y

(c) reengendrar dichas células progenitoras en una planta en condiciones que favorezcan a las células progenitoras que tienen dicho marcador seleccionable, y

(d) identificar una planta que produce dicha proteína o dicha muteína, reduciendo así la susceptibilidad de dicha planta ante una infección por dicho hongo Phytophthora y/o dicho hongo Pythium.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicha proteína se describe como SEQ ID Nº 15.

3. Un método según la reivindicación 1, en el que dicha proteína se describe como SEQ ID Nº 57.

4. Una proteína antifúngica aislada consistente en la secuencia descrita como SEQ ID Nº 15, o una muteína, la cual difiere de dicha proteína por el remplazo, la adición o la eliminación de un aminoácido, en la que dicha proteína o dicha muteína tiene actividad anti-Phytophthora y/o anti-Pythium.

5. Una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína o para la muteína según la reivindicación 4.

6. Una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 5 que comprende la secuencia que codifica para la proteína descrita como SEQ ID Nº 15.

7. Una secuencia de nucleótidos que hibrida con la secuencia según la reivindicación 6 en condiciones estrictas, en la que dicha secuencia de nucleótidos aún codifica para una proteína que tiene actividad anti-Phytophthora y/o anti-Pythium.

8. Una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que adicionalmente comprende una región de inicio de la transcripción y una región de terminación de la transcripción.

9. Una célula hospedadora que ha incorporado de forma estable en su genoma una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.

10. Una célula hospedadora según la reivindicación 9, que es una célula vegetal.

11. Uso de una proteína elegida del grupo descrito como SEQ ID N^{OS} 15; 19; 57; 70; 72; Y 74 o una muteína, la cual difiere de dicha proteína por el remplazo, la adición o la eliminación de un aminoácido, para retrasar el crecimiento de un hongo Phytophthora y/o un hongo Pythium.