SK280613B6

SK280613B6 - Rekombinantná dvojvláknová molekula dna a spôsob p

Info

Publication number: SK280613B6
Application number: SK655-96A
Authority: SK
Inventors: Ellen Briskin Lawrence; Elaine Beatrice Levine; Dilipkumar Maganlal Shah
Original assignee: Monsanto Company
Priority date: 1993-11-24
Filing date: 1994-10-25
Publication date: 2000-05-16
Also published as: WO1995014784A1; CZ131796A3; BG100619A; BG61548B1; PL314590A1; PL178652B1; AU678640B2; HUT74393A; CN1066198C; SK65596A3; AU8120994A; JPH09506249A; EP0733116A1; US5516671A; CN1136329A; BR9408140A; CA2172628A1; HU9601403D0

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka rekombinantnej dvojvláknovej molekuly DNA a spôsobu produkcie geneticky transformovaných rastlín. Ide vlastne o spôsob kontroly rastlinných patogénov proteínom, ktorý sa získa genetickou modifikáciou rastliny, aby produkovala proteín, a génov a rastlín použiteľných pri tomto spôsobe.

Doterajší stav techniky

Je dobre známe, že enzymatický účinok glukózooxidázy je antibakteriálny. Za prítomnosti kyslíka glukózooxidáza katalyzuje oxidáciu glukózy na delta-glukonolaktón a peroxid vodíka. Antibakteriálne pôsobenie je vyvolané tak oxidačným potenciálom vodíka, ako aj prítomnosťou delta-glukonolaktónu, ktorý je známy mhibítor glykozyltransferázy.

Antibakteriálny účinok produktov tohto enzýmu zapríčinil jeho rozšírené použitie v potravinárskom priemysle, kde sa považuje za GRAS zlúčeninu (všeobecne považovanú za bezpečnú). Sama osebe sa glukózooxidáza používa na zamedzenie bakteriálneho znehodnotenia pripravených potravín. V lekárstve sa glukózooxidáza používa ako enzymatický baktericíd, ktorý je súčasťou obväzov na rany, zubných špáradiel, zubných vlákien a miniatúrnych zubných kefiek. Glukózooxidáza bola taktiež spomenutá ako spôsob kontroly zubného kazu.

Najnovšie správy ukázali, že glukózooxidáza je súčasťou biokontrolného mechanizmu používaného Penicillium dangearii na kontrolu rastlinnej patogénnej plesne Verticillium dahliae (Kim a i., 1988, 1990).

Ale použitie glukózooxidázy ako prostriedku pre rastliny, aby sa chránili samotné proti patogénnym organizmom, sa považovalo za málo nádejné kvôli povahe enzymatického účinku. Po prvé, v rastlinách je málo voľnej glukózy. Zdalo by sa, že enzým bude mať nedostatok substrátu, aby produkoval dosť peroxidu vodíka a alebo delta-glukonolaktónu, aby prekonal patogénne napadnutie. Po druhé, prítomnosť takého enzýmu v rastlinnej bunke, spotrebovávajúceho glukózu a produkujúceho aj malé množstvo peroxidu vodíka, by sa považovalo za škodlivé pre vitalitu bunky. Neočakávalo sa, že transgénové rastliny exprimujúce glukózooxidázu by sa vyvíjali normálne, či už ako regenerované rastliny alebo ako nasledujúca generácia.

Predmetom tohto vynálezu je poskytnutie oxidázy glukózy, ktorá by sa mohla bezpečne exprimovať v rastlinných bunkách a zabezpečiť odolnosť týchto buniek. Ďalším predmetom tohto vynálezu je zaistenie spôsobu transformácie rastlín, aby exprimovali glukózooxidázu, ktorá by sa mohla bezpečne exprimovať v rastlinách a zabezpečiť odolnosť týchto rastlín.

Podstata vynálezu

Prekvapujúco sa zistilo, že gén pre glukózooxidázu z Aspergillus niger možno použiť na transformáciu rastlín, ktoré sa vyvíjajú normálne a odolávali napadnutiu patogénom. Predmetom tohto vynálezu je teda zaistenie genetických konštruktov obsahujúcich gén pre Aspergillus glukózooxidázu (AGO) užitočnú na vloženie do rastlinných buniek. Iným predmetom tohto vynálezu je zaistenie transformovaných rastlín odolných proti patogénom, obsahujúcich takýto genetický materiál.

Okrem toho sa rastliny môžu transformovať, aby taktiež exprimovali iné antifungicidné proteíny alebo insekticídne proteíny, napríklad s použitím génov Bacillus thuringiensis (B.t.). Príklady transformovaných rastlín, aby exprimovali gény B.t., sú opísané v Európskej patentovej prihláške číslo 0 385 962, ktorá zodpovedá USA poradovému číslu 07/476,661, podanej 12.februára 1990 (Fishhoffa i.), ktorá je tu zahrnutá touto referenciou. Gén B.t. možno zabudovať do rastliny podľa tohto vynálezu súčasnou transformáciou, postupnou transformáciou, alebo šľachtením.

V súlade s jedným aspektom tohto vynálezu podstata spočíva v rekombinantnej dvojvláknitej molekule DNA obsahujúcej v pracovnej sekvencii:

a) promótor, ktorý vyvoláva v rastlinnej bunke produkciu RNA sekvencie a

b) štruktúrnu kódujúcu sekvenciu, ktorá kóduje produkciu Aspergillus glukózooxidázy,

c) 3' netranslačnú oblasť, ktorá pôsobí v uvedenej rastlinnej bunke tak, že sa polyadenylátové nukleotidy pripoja k 3' koncu RNA sekvencie.

V súlade s iným aspektom tohto vynálezu podstata spočíva aj v spôsobe produkcie geneticky transformovaných rastlín, ktoré exprimujú antipatogénne množstvo Aspergillus glukózooxidázy zahŕňajúci kroky:

a) vloženie do genómu rastlinnej bunky rekombinantnú dvojvláknovú molekulu DNA obsahujúcu:

i) promótor, ktorý vyvoláva v rastlinnej bunke produkciu RNA sekvencie, ii) štruktúrnu kódujúcu sekvenciu, ktorá kóduje produkciu Aspergillus glukózooxidázy, iii) 3' netranslačnú oblasť, ktorá spôsobí v rastlinnej bunke tak, že sa polyadenylátové nukleotidy pripoja k 3' koncu RNA sekvencie,

b) získanie transformovaných rastlinných buniek a

c) regeneráciu geneticky transformovaných rastlín, ktoré exprimujú antipatogénne množstvo Aspergillus glukózooxidázy z transformovaných rastlinných buniek.

Tak, ako sa tu používa výraz .Aspergillus glukózooxidáza“ alebo „AGO“ sa používa na označenie glukózooxidázy prirodzene produkovanej Aspergillus sp. alebo majúcu homológiu aspoň 80 %, výhodne aspoň 90 % s takýmto enzýmom, napríklad enzýmom kódovaným SEKV ID Č. 1.

Tak, ako sa tu používa výraz „kontrola mikrobiálneho poškodenia“ alebo „odolnosť proti patogénom“ sa používa na označenie vplyvu na redukciu poškodenia úrody v dôsledku infekcie bakteriálnymi alebo plesňovými patogénmi.

Tak, ako sa tu používa výraz „štruktúrna kódujúca sekvencia“ znamená DNA sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid, ktorý môže taktiež urobiť bunka po transkripcii DNA na mRNA s nasledujúcou transláciou na žiaduci polypeptid.

Tak, ako sa tu používa výraz „miesto výskytu rastliny“ znamená oblasť bezprostredne obklopujúcu rastlinu vrátane rastliny a oblasti jej koreňov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Jedno uskutočnenie tohto vynálezu zahrnuje proteín izolovaný z Aspergillus niger. Tento proteín, označený AGO, sa čistil do homogenity. Inhibuje rast agronomický dôležitých plesňových patogénov vrátane Verticillium dahliae, jedného z najrozšírenejších a najškodlivejších plesňových patogénov, spôsobujúceho choroby mnohých rastlín, Phytophthora infestans (Pi), patogénu spôsobujúcemu neskoršie hnitie zemiakov a rajčín, Botrytis cinerea (Bc), zdroja šedej plesne mnohých rastlín a zeleniny, Septoria nodorum (Sn), príčiny škvrnitosti pšenice, Pseudocercos porella herpotrichoides (Ph), príčiny očkovitosti pšenice, Gaeumannomyces graminis var tritici (Ggt), príčiny hnitia zelenín, v takom malom množstve, ako je 50 ng, za pokusných podmienok. Taktiež sa zistilo, že inhibuje Erwinia carotovora, príčinu mäkkej hniloby zemiakov, pozberovej choroby zemiakov. Očakáva sa, že je schopný kontrolovať mnohé iné patogénne organizmy rastlín, čo je založené na produktoch jeho enzymatickej aktivity delta-glukonolaktónu a peroxidu vodíka. Obidva tieto koprodukty sú toxické pre takéto organizmy.

Mnoho druhov rastlín sa môže chrániť spôsobmi podľa tohto vynálezu. Napríklad mnohé ovocie a zelenina, ako sú maliny, zemiaky sa môžu chrániť pred rastlinnými patogénmi pomocou týchto spôsobov. Rôzne druhy Phytophora sú patogénne pre mnohé iné rastliny, ako sú ovocné stromy a trávnik, a teda tieto rastliny sa taktiež môžu chrániť pomocou spôsobov podľa tohto vynálezu. Ďalej rastliny pšenice a jačmeňa sa môžu chrániť pred Ggt, Sn a Ph týmto spôsobom.

Ako bolo uvedené, antibakteriálne proteiny podľa tohto vynálezu sa môžu použiť v kombinácii s inými antifúngicídnymi proteínmi, aby sa dosiahlo široké spektrum aktivity, napríklad kontrola ďalších patogénov a alebo aby sa dosiahli mnohonásobné spôsoby akcie na inhibíciu rovnakých plesňových patogénov. Zdroje takých iných antifungicidných proteínov by mohli byť mikrobálne, ako sú proteíny podľa tohto vynálezu, alebo to môžu byť rastliny. Rad takých antifungicídnych génov je uvedený v literatúre.

I keď AGO bude chrániť rastliny proti napadnutiu patogénom i pri prirodzene sa vyskytujúcich hladinách glukózy, môže byť žiaduce zaistiť invertázu, ktorá by spôsobila hydrolýzu sacharózy a tak uvoľňovala ďalšiu glukózu, na ktorú by AGO mohol pôsobiť. Invcrtáza bude výhodne invertáza z bunkových stien, ako z kvasníc (EP O 442 592, Willmitzer a i., 1991, taktiež AU 70898/91) alebo vakuolámy enzým, napr. z rajčín alebo iných rastlín. V týchto prípadoch sa môžu použiť prirodzené signálne sekvencie, ale môže byť lepšie, aby invertáza bola do času potreby viazaná v medzibunkovom priestore, alebo nebola produkovaná pred svojou potrebou. Prvú alternatívu možno dosiahnuť použitím signálnej sekvencie, ktorá zameria enzým do medzibunkového priestoru. Jedným takýmto signálom je signál inhibítora proteázy zemiakov (Keil a i., 1986, Nelson a i., 1980). Promótor, ktorý je aktívny len ako dôsledok patogénnej infekcie, by bol užitočný pri obmedzení expresie invertázy na jej skutočnú potrebu, aby produkovala glukózu ako substrát pre AGO.

Počas skladovania, keď infekcia Erwinia môže spôsobiť stratu celého skladu, hľuzy zemiakov budú prirodzene obsahovať glukózu z rozkladajúceho sa škrobu. Teda vloženie génu pre invertázu nie je žiaduce alebo nutné na ochranu proti mäkkej hnilobe.

Testy biologickej účinnosti in vitro

Protiplesňové testy

Glukózooxidáza z Aspergillus niger sa môže získať od Sigma Chemical Company, St. Louis (katalógové číslo G-7141). Používala sa na testovanie účinnosti in vitro proti rozličným organizmom.

Testy proti Pi a Bc sa uskutočňovali v médiu číslo 303 pripravenom nasledovne: Jeden liter obsahuje 1 g MgSO₄.7H₂O, 2 g KH₂PO₄, 0,5 g NaCl, 1 g CaCO₃, 1 ml ZnSO₄.7H₂O zásobného roztoku 1 mg/ml, 1 ml FeSO₄.7H₂O zásobného roztoku 1 mg/ml, 0,5 ml FeEDTA zásobného roztoku 100 mM, 20 g maltrín M-100, 20 g kazeínu, 5 g výťažku z kvasníc, 5 g glukózy, 3,02 g Pipes 10 mM, pH sa upravilo na 6,5 a sterilizo valo sa filtráciou. Testy proti Ph sa uskutočňovali v CDAA. 1 % médium sa pripravilo nasledovne: 35 g/1 Difco Czapek Dox vývar, 1 g/1 prolín, 500 mg/1 asparagín, 500 mg/1 cysteín a 1 g/1 agar sa autoklávujú 23 minút a pridajú sa vitamíny sterilizované filtráciou (1 ppm tiamín a 1 ppm biotin).

Bc a Pi sa testovali v kvapalnom stave na doskách s 96 jamkami. Bc sa použilo pri 5 x 10² spórach na jamku a nechalo sa inkubovať pri 20 °C 24 - 48 hodín. Pi sa zasialo pri 5 x 10³ sporangií na jamku a nechalo sa inkubovať pri 18 °C 24 až 48 hodín. Rast sa sledoval meraním OD pri 595 nm. Rast Pi bol inhibovaný z 90 % pri koncentráciách tak nízkych ako je 3 x 10'^s IU/mikroliter. Rast Bc bol inhibovaný z 95 % pri koncentrácii ako je 0,001 IU/mikroliter.

Aktivita proti Gaeumannomyces sa hodnotila na doskách pevného agaru. Kúsky agaru asi 0,5 cm², podporujúce silný rast plesne, sa dali do stredu PDA dosky s polovičnou silou a nechali sa rásť niekoľko dní pri 22 °C. 1 cm za vedúcou hranou rastu sa aseptický preniesol 0,5 cm kúsok agaru sterilným korkovrtom. Priamo do týchto jamiek sa dal sterilný zásobný roztok. Zreteľná zóna inhibície sa spozorovala pri množstvách tak nízkych, ako je 0,02 IU/jamku.

Ph sa testoval na doskách s 96 jamkami. 14 dni stará kultúra Pseudocercosporella herpotrichoides var tritici na vodnom agare sa použila na získanie suspenzie spór. Doska sa zavodnila 5-10 ml CDAA 1% médiom a spóry sa zamiešali do kvapalného média jemným zvírením. Koncentrovaná suspenzia spór sa odpipetovala a pridala sa k celkovému objemu CDAA potrebnému na test s úpravou koncentrácie spór na 100 000 spór/ml. Inkubovalo sa pri 24 °C v tme.

Suspenzia spór sa rozdelila po 50 mikrolitroch na jamku na doskách s 96 mikrotitračnými jamkami. Tieto dosky sa dali do inkubátora (10 hodín/denného svetla pri 12 °C) na 24 hodín pred aplikáciou vzorky. 50 mikrolitrová vzorka sa pridala k 50 mikrolitrom inokula (pripraveného 24 hodín vopred) s celkovým objemom jamky 0,100 ml/ošetrená jamka/opakované ošetrenie. Skúšobné dosky sa inkubovali 48 hodín a výsledky sa stanovili odčítaním optickej hustoty (OD) pomocou BioRad čítačom mikrotitračných dosiek model 3550 pri jedinej vlnovej dĺžke 595 nm. OD stanovenie sa uskutočnilo v čase nula (to), ktoré sa robilo bezprostredne po aplikácii vzorky a OD stanovenie sa uskutočnilo v čase 48 hodín po aplikácii vzorky (t₄₈). Rast plesní sa stanovil z rozdielov OD to a t₄₈ násobeného výpočtovou hodnotou pre biomasu plesne. Výpočtová hodnota pre biomasu plesne je vzťah medzi rastom plesní a optickou hustotou a stanovil sa v zvláštnych pokusoch. Vzťah medzi rastom plesní a optickou hustotou sa stanovil počas rastu plesní na doskách s 96 mikrotitračnými jamkami a zberu mycélia pri intervaloch absorbancie asi 0,1 OD. (Výpočtová hodnota vychádza z lineárnej závislosti medzi biomasou plesne a OD pre špecifickú pleseň. Hodnota jej sklonu sa získa z lineárnej závislosti. Výpočtová hodnota pre Ph je 4,91). Potom sa stanovilo % inhibície z rozdielov medzi biomasou ošetrených vzoriek a biomasou kontrol. AGO mal 60 % inhibíciu Ph pri 1,7 x 10^ IU/mikroliter.

Testy proti Sn sa uskutočňovali v podstate podobne ako proti Ph, s výnimkou prípravy suspenzie spór. Sedem dní stará kultúra Septoria nodurum na YMA agare sa použila na získanie suspenzie spór. Malé množstvo (pod 1 ml) CDAA média sa nakvapkalo na plochu kultúry s hmotou ružových spór vychádzajúcich z pyknídia. Spóry sa zmiešali s CDAA médiom opakovaným nasávaním a vypúšťaním z pipety. Koncentrovaná suspenzia spór sa pridala k celkovému objemu CDAA potrebnému pre test s úpravou koncentrácie spór na 50 000 spór/ml. Výpočet hodnoty pre Sn je 0,508. AGO vykazoval 60 % inhibíciu Sn pri 1,7 x x 10‘⁴ IU/mikroliter.

Bakteriálny test

Kultúra baktérií Erwinia carotovora sa pestovala rozočkovanim na PDA dosky a inkubovala sa pri 24 °C v tme. Na prípravu kvapalného inokula sa očko (slučka) aktívne rastúcich baktérií (stará 5 až 9 dní) pridala do 50 ml PD výluhu sily 1/4 v 125 ml Erlenmayerovej banke. Banka sa dala do trepacieho inkubátora (130 otáčok za minútu) pri 24 ’C v tme. Po 24 hodinách sa baktérie peletovali, znovu suspendovali v sterilizovanej deionizovanej vode a tri alebo štyri 0,100 ml podiely sa dali do jamiek na doskách s 96 mikrotitračnými jamkami. Cítač mikrotitračných dosiek sa nastavil na 595 nm a stanovila sa priemerná optická hustota. Číslo tejto absorbancie optickej hustoty (ABS) sa použilo v nasledujúcom vzorci na výpočet jednotiek tvoriacich kolóniu (CFU) obsiahnutých vo výluhu.

CFU = 3 x 10⁶ + 3 x 10⁶ x ABS + 5 x 10⁸ x ABS²

Výluh sa nastavil na použitie na 10 CFU.

AGO úplne kontroloval rast Erwinia carotovora pri koncentráciách tak nízkych, ako je 3 x 10'⁵ IU/mikroliter.

Identifikácia enzýmu

Na zistenie produkcie proteínu možno navrhnúť rad metód v heterológnej sústave, ako sú rastlinné bunky. Možno použiť Westem škvmovú analýzu, aby sa proteín zistil imunologický, alebo možno použiť enzymatické alebo biologické testy, aby sa zistila aktivita proteínu.

Enzymatický test oxidázy glukózy

Aby sa zistila aktivita GO, použil sa kontinuálny spektofotometrický test (Frederick a i., 1990). GO Aspergillus niger (Sigma) sa použil ako pozitívna kontrola. Reakčná zmes sa skladala z 0,020 mg/ml peroxidázy z chrenu (Sigma), 0,32 mM Triton X-100 stabilizovaného o-dianizidínom (Sigma) a 0,1 M glukózy v 75 mM tlmivom roztoku fosforečnanu sodného (pH 5,0). K tomu sa pridalo 0,100 ml rôznych koncentrácií GO Aspergillus niger na kontrolu reakcii 0,100 ml vzorky odobranej z heterológneho zdroja. Test sa uskutočňoval pri izbovej teplote a zvýšenie absorbancie sa sledovalo pri 460 nm.

Iný test na glukózooxidázu používajúci ako činidlo 4-aminoantipyrín (4-AAP) sa optimalizoval na použitie. Je založený na Gallo, 1981. 5X 4-AAP reagent sa pripravil v celkovom objeme 10 ml s 0,68 g KH₂PO₄, 8,3 mg 4-AAP (0,82 mM), 0,025 ml Triton X-100, 65,8 mg kryštalického fenolu a 1000 jednotiek peroxidázy z chrenu, pH sa upravilo na 5,0 s KOH. Test sa uskutočňoval zmiešaním 0,200 ml tohto 4-AAP reagenta s 0,005 ml 1 mM FAD, 0,050 ml 1 M glukózy a skúšanej vzorky (až 0,750 ml). Výsledok sa odčítal pri OD 508.

Test biologickej aktivity glukózooxidázy až 6 dní stará Ggt pleseň sa preniesla na čerstvé dosky (Difco) agaru zemiakovej dextrózy štvrtinovej sily. Pleseň rástla štyri dni pri 22 ’C, dokiaľ rastový kruh nebol asi 2,5 cm. Pomocou sterilizovaného korkovrtu sa urobili v agare jamky 1 cm z vonkajšej strany rastového kruhu a do jamiek sa dalo 0,100 ml tlmivého roztoku alebo vzorky z heterológnej sústavy. Pleseň rástla pri izbovej teplote 24 hodín a potom sa stanovila inhibícia rastu.

Imunologický test oxidázy glukózy

Polyklónové antičastice pre glukózooxidázu produkované Aspergillus niger sú komerčne dostupné z mnohých zdrojov, napríklad Rockland, Inc., Gilbertsville, Pensylvania.

Genetická transformácia

Z Aspergillus niger sa izolovala úplná DNA (ATCC 9029) a použila sa na izoláciu PCR génu pre glukózooxidázu. PCR priméry sa založili na publikovanej sekvencií (Frederick a i., Kriechbaum a i.) a navrhli sa na izoláciu úplnej sekvencie génu vrátane signálnej sekvencie. Okrem toho sa na uľahčenie zabudovania tohto génu do vektorov vhodných na expresiu v heterológnych, bakteriálnych, bakulovírusových alebo rastlinných sústavách, 5 'PCR primér (SEKV ID Č. 3) zaviedol Xbal a BglII miesta obmedzujúce endonukleázu po prúde od ATG začiatku translácie génu. 3' PCR primér (SEKV ID Č. 4) zaviedol BamHI a KpnI miesta obmedzujúce endonukleázu ihneď za končiaci kodón. Vzniknutý PCR fragment sa klonoval do pUCl 18 ako Xbal/KpnI fragment, aby vytvoril pMON22514 a bol úplne sekvencovaný. Sekvencia (SEKV ID Č. 1) je presne prispôsobená publikovanej sekvencií. SEKV ID Č. 2 zodpovedá sekvencií aminokyseliny.

Konštrukcia rastlinného génu

Expresia rastlinného génu existujúceho v dvojvláknovej DNA vyžaduje transkripciu matricovej RNA (mRNA) z jedného reťazca DNA enzýmom RNA polymerázou a nasledujúce spracovanie primárneho mRNA transkriptu do jadra. Toto spracovanie vyžaduje 3' napreloženú oblasť, ktorá aduje polyadenylátové nukleotidy na 3' koniec RNA reťazca. Transkripcia DNA do mRNA sa reguluje oblasťou DNA zvyčajne označovanou ako „promótor“. Táto promótorova oblasť obsahuje sekvenciu báz, ktorá signalizuje RNA polymeráze, aby sa pripojila k DNA a iniciovala transkripciu mRNA pomocou jedného z vlákien DNA ako matrica, aby vytvorila zodpovedajúce vlákno RNA.

V literatúre je opísané množstvo promótorov, ktoré sú aktívne v rastlinných bunkách. Tieto zahrnujú promótory nopalín syntázu (NOS) a oktopín syntázu (OCS) (ktoré sa prenášajú na tumory spôsobujúce plazmidy Agrobacterium tumefaciens), promótory 19S a 35S mozaikového vírusu karfiolu (CaMV), promótor 35S mozaikového Figwort vírusu (FMV) a svetlom budený promótor z malej časti ribulózy 1,5-bis-fosfát karboxylázy (ssRUBISCO, veľmi hojný rastlinný polypeptid). Všetky tieto promótory sa taktiež použili na vytvorenie rôznych typov DNA konštruktov, ktoré sa exprimujú v rastlinách. USA patent číslo 5 034 322 (Fraley a i., 1991), ktorý je tu zahrnutý touto referenciou, opisuje takéto použitie.

Známe sú promótory, ktoré obmedzia expresiu na isté časti rastlín, alebo na odpoveď na zvláštne stimuly. Napríklad promótory špecifické pre hľuzy zemiakov, ako sú patatínové promótory, alebo promótory pre veľké či malé podjednotky ADP pyrofosforylázy glukózy, by sa mohli použiť na dosiahnutie expresie primáme v hľuzách a tak v kombinácii s AGO zaistiť rezistenciu proti napadnutiu hľúz, napríklad Erwiniou. Promótor špecifický pre ovocie by bol žiaduci na zabezpečenie rezistencie proti Botrytis malín alebo hrozna. Promótor špecifický pre korene by bol žiaduci na vyjadrenie AGO v pšenici a jačmeni na zaistenie odolnosti proti Ggt. Odborník bude vedieť o mnohých takýchto promótoroch špecifických pre rastliny, ktoré by boli užitočné podľa tohto vynálezu.

Alternatívne možno promótory použité v dvojvláknovej molekule DNA vybrať tak, aby sa dosiahla špecifická expresia AGO ako odpoveď na infekciu plesňami. Infekcia rastlín patogénmi plesní spúšťa indukciu radu proteínov nazývaných obranných alebo patogén obranných (PR) (Bowles, Bol a i., Linthorst). Takéto obranné alebo PR gény môžu kódovať enzýmy fenylpropanoidového metabolizmu (ako je lyáza fenylalanin amoniaku, chalkónová syntáza,

SK 280613 Β6 coAligáza 4-kumarátu, 4-hydroxyláza kumarovej kyseliny), proteíny modifikujúce steny buniek rastlín (ako sú glykoproteíny bohaté na hydroxyprolín, proteíny bohaté na glycín, peroxidázy), enzýmy (ako sú chitinázy a glukanázy), ktoré degradujú stenu plesne, proteíny podobné taumatínu alebo proteíny s doteraz neznámou funkciou. Obranné alebo PR gény sa izolovali a charakterizovali z radu druhov rastlín. Promótory týchto génov sa môžu použiť na expresiu AGO v transgénnych rastlinách, keď sú napadnuté patogénmi, najmä plesňovým patogénom, ako je Pi. Také promótory možno odvodiť od obranných alebo PR génov izolovaných zo samotných zemiakov (Fritzmeier a i., Cuypers a i., Longeman a i., Matton a Brisson, Taylor a i., Matton a i., Schroder a i.). Aby sa dostal AGO gén pod kontrolu promótora indukovaného infekciou Phytophora infestans, možno dať prednosť promótora opísanému Taylorom a i. (1990).

Vybraný daný promótor by mal byť schopný spôsobiť dostatočnú expresiu sekvencie kódujúcej enzým, aby viedli k produkcii účinného množstva AGO.

Promótory použité v DNA konštraktoch (napríklad chiméme gény rastlín) podľa tohto vynálezu možno modifikovať, pokiaľ sa to žiada, aby sa ovplyvnili ich kontrolné charakteristiky. Napríklad promótor CaMV 35S možno spojiť s časťou génu ssRUBISCO, ktorá potláča expresiu ssRUBISCO za neprítomnosti svetla, aby vznikol promótor, ktorý je aktívny v listoch, ale nie v koreňoch. Vzniknutý chimérny promótor možno použiť, ako je tu opísané.

Kvôli tomuto opisu frázy „CaMV 35S“ promótor teda zahrnuje variácie CaMV 35S promótora, napríklad promótory získané viazaním s operátorovými oblasťami, náhodnou a kontrolovanou mutagenézou, atď. Promótory možno ďalej meniť, aby obsahovali mnohonásobné „zvýrazňovacie sekvencie“, aby podporovali zvýšenú expresiu génu. Príklady takých zvýrazňovacích sekvencii boli uvedené Kayom a i..

Zvýraznený CaMV 35S promótor možno konštruovať nasledovne. Fragment CaMV 35S promótora rozprestierajúci sa medzi polohou - 343 a + 9 sa najprv konštruuje v pUC13 (Odeli a i.). Tento segment obsahuje oblasť, ktorá je identifikovaná ako potrebná na maximálne vyjadrenie CaMV 35S promótora. Vyrezal sa ako Clal-HindlII fragment, otupil sa na konci DNA polymerázou (Clal-fragment) a vložil sa na HincII miesto pUC18. Oblasť po prúde 35S promótora sa vyrezala z tohto plazmidu (rozprestierajúceho sa medzi polohou -343 a -90) a vložila sa do rovnakého plazmidu medzi miesta HindlII a Pstl. Zvýraznený CaMV 35S promótor (ďalej CaMV E35S) teda obsahuje duplikát sekvencie medzi -343 a -90 (Kay a i.).

RNA produkovaná DNA konštruktom, podľa tohto vynálezu taktiež obsahuje 5' nepreloženú hlavnú sekvenciu. Túto sekvenciu možno získať z promótora vybraného na expresiu génu a možno ju špecificky modifikovať, aby sa zvýšila translácia mRNA. 5' nepreložené oblasti možno taktiež získať z vírusových RNA, z vhodných eukaryotických génov, alebo zo syntetických sekvencii génu. Tento vynález sa neobmedzuje na konštrukcie, kde nepreložená oblasť je odvodená z 5’ nepreloženej oblasti, ktorá uskutočňuje sekvenciu promótora. Nepreloženú vedúcu sekvenciu možno skôr odvodiť z nepríbuzného promótora alebo kódujúcej sekvencie. Napríklad proteín tepelného šoku petúnií 70 (Hsp70) obsahuje taký hlavný výhonok (Winter).

Ako je uvedené, 3' nepreložená oblasť chimémych rastlinných génov podľa tohto vynálezu obsahuje polyadenylačný signál, ktorého funkciou v rastlinách je spôsobiť adíciu adenylát nukleotidov na 3' koniec RNA. Príklady preferovaných 3' oblastí sú (1) 3' prepísané, nepreložené ob lasti obsahujúce polyadenylačný signál génov tumor indukovaných plazmidov (Ti) Agrobacterium, ako je gén nopalín syntázy (NOS), a (2) rastlinné gény, ako sú gény zásobných proteínov sóje a fazuľový ssRUBISCO E9 gén (Fischhoff a i.).

Transformácia a expresia v rastline

Chimérny rastlinný gén obsahujúci štruktúrnu kódujúcu sekvenciu podľa tohto vynálezu je možné vložiť do genómu rastliny každým vhodným spôsobom. Vhodné transformačné vektory zahŕňajú tie, ktoré sú odvodené od Ti plazmidu Agrobacterium tumefaciens ako aj tie, ktoré opísali napríklad Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) a EPO publikácie 0 120 512 (Schilperoort aj.). Navyše je možné pri rastlinných transformačných vektoroch odvodených od Ti alebo zavádzajúcich do koreňov (Ri) plazmidov Agrobacterium použiť alternatívne spôsoby pre vloženie DNA štruktúr podľa tohto vynálezu do rastlinných buniek. Takéto spôsoby môžu zahŕňať napríklad použitie lipozómov, elektroporácie, chemikálií, ktoré zvyšujú prijímanie DNA, voľné dodanie DNA bombardovaním mikroprojektilov a transformáciu vírusmi alebo peľom.

Rastliny, ktoré je možné chrániť podľa tohto vynálezu zahŕňajú, ale nie sú na ne obmedzené, zemiaky, paradajky, pšenicu, kukuricu, maliny, hrozná a rôzne okrasné rastliny. Metódy tkanivovej kultúry a regenerácie rastlín sú dostupne pre všetky tieto typy rastlín.

Prechodná expresia glukózooxidázy v bunkách tabaku

Obzvlášť užitočný plazmidový kazetový vektor pre transformáciu dvojklíčnych rastlín je pMON999. Expresia kazety pMON999 sa skladá z CaMV E35S promótora a'3' konca zahŕňajúceho polyadenyláciu signálov z génu NOS. pMON999 obsahuje BglII, KpnI a EcoRI miesta pre vloženie kódujúcej sekvencie a Not-Notl miesta lemujúce kazetu pre expresiu génu.

BglII/KpnI fragment pMON22514 obsahujúci AGO sa vložil do pMON999, aby sa vytvoril pMON22515. pMON22515 sa elektropóroval do protoplastov tabaku. Expresiu glukózooxidázy transformovanými bunkami tabaku potvrdila Westem škvmová analýza, ako aj enzymatické testy.

Stála transformácia dvojklíčnych

Nosný vektor pre AGO sa vytvoril vyrezaním oblasti kódujúcej AGO ako BamHI/BglII fragment pMON22515. Ten sa potom dal do vektora založeného na pUC a vzniknutý plazmid pMON22579 obsahuje FMV promótor, oblasť kódujúcu AGO a 3° koniec vrátane polyadenylátových signálov z génu NOS. Notl/Notl fragment z tohto vektora obsahujúci FMV promótor, oblasť kódujúca AGO a 3' koniec vrátane polyadenylátových signálov sa preniesol do Nôti obmedzujúcej oblasti pMON17227 (WO/0449, Bány aj.), aby sa získal konečný Ti vektor pMON22587.

Ako sa diskutovalo, gén AGO sa môže tiež exprimovať v špecifických častiach rastlín pomocou špecifických tkanivových promótorov. Promótor pre patatín sa exprimuje primáme v hľuzách zemiakov. Fragment KpnI/Xbal obsahujúci oblasť kódujúcu AGO sa vyrezal z pMON22514 dal sa do vektora založeného na pUC obsahujúceho 1,0 promótor patatínu (Bevan aj., 1986) a 3' koniec zahrnujúci polyadenylátové signály z génu NOS, aby sa vytvoril pMON22516. Fragment Nôti pMON22516 obsahujúci promótor patatínu, oblasť kódujúca AGO a 3' koniec NOS vrátane polyadenylátových signálov sa potom preniesol do Notl obmedzujúcej oblasti pMON17227, ako bolo opísané, aby sa získal plazmidový Ti vektor pMON22517.

Tieto vektory je možné vložiť do odnožoného Agrobacterium ABI a použiť na transformáciu zemiakov, paradajok alebo iných častí rastlín v tkanivovej kultúre. Po selekcii na kanamycín alebo glyfosátovú odolnosť a regenerácii rastlín, je možné získať celé rastliny exprimujúce gén glukózooxidázy. Expresiu glukózooxidázy transformovanými bunkami tabaku je možné potvrdiť Westem škvmovou analýzou, enzymatickými testami alebo biotestami.

Expresia AGO v transformovaných rastlinách zemiakov

Z hľúz zemiakov transformovaných plazmidovým Ti vektorom pMON22517 sa extrahoval proteín a skúšal sa na prítomnosť glukózooxidázy Westem škvmovou analýzou. Zistili sa vysoké hladiny expresie glukózooxidázy v niektorých rastlinách. Tieto hladiny expresie sa potvrdili enzymatickými testami pomocou sústavy 4-aminoantipyrínu. Celkový proteín sa extrahoval z rady týchto hľúz rozomletím v 25 mM tlmivého roztoku fosforečnanu sodného pH 7,0 + 5mM EDTA + 100 mM KC1. Proteín sa koncentroval a premyl 12,5 mM tlmivého roztoku fosforečnanu sodného pH 7,0.

Proteín extrahovaný z hľúz sa testoval s Phytophora infestans na stoloch s 96 mikrotitračnými jamkami v 12,5 mM tlmivého roztoku fosforečnanu sodného pH 7,0. Výsledok jc uvedený v tabuľke 1. Pri najvyššej hladine zisteného proteínu, 21,2 mg/ml, Pi spóry buď ostávali neplodné, alebo rast z týchto spór bol silne zmrzačený v porovnaní s prázdnym vektorom (pMON 17227) alebo s kontrolným tlmivým roztokom z rastlinných extraktov.

Tabuľka 1

Ošetrenie__________________________Inhibicia húb*

Kontrolný tlmivý roztok0

Kontrolný prázdny vektor2 pMON22517, línia 93 pMON22517, línia 303 * Stupnica: 0 = bez inhibície, 1 = ľahká inhibicia, 2 = mierna inhibicia, 3 = silná inhibicia.

Listy rastlín zemiakov transformovaných plazmidovým Ti vektorom pMON22587 sa skúšali na prítomnosť AGO enzymatickými testami. Výsledok je uvedený v tabuľke 2. Ako vyššie, rastliny zemiakov transformované pMON17227 sa použili ako kontrolné rastliny s prázdnym vektorom.

Tabuľka 2

	Expresia pluk Úroveň·	ornmnriárv aktivity^	Ekyivilgtf fcc
Línia Sialo	94	(U/lOngX 10-4)	(U/gFW)
Rus. Bur.	O	0	0
22587-2	0,075	72,2	7,22
22587-3	0,150	126,4	12.64
22587-4	0,007	6,0	0,6
22587-12	0,125	88,2	8,82
22587-31	0,350	140,4	14,04
22587-32	0,350	121,0	12,10
22587-33	0,450	181,8	18,18
22587-34	0,003		0,12

^a Úroveň expresie je uvedená ako percento glukózooxidázy v celkovom extrahovateľnom proteíne.

^b Aktivita glukózooxidázy v extrakte sa stanovila testom enzymatickej aktivity a vypočítala sa ako jednotka emzymatickej aktivity v celkovom proteíne.

^c Jednotky glukózooxidázy na gram čerstvej hmotnosti tkaniva listov (U/gFW) sa vypočítali z aktivity v celkovom proteíne pomocou konverzného faktora 0,010 celkového proteínu na gram čerstvej hmotnosti tkaniva listov.

Listy rastlín zemiakov transformovaných plazmidovým Ti vektorom pMON22587 sa skúšali na úroveň H₂O₂ zrážaním oxidu titaničitého. Zistilo sa, že v dvoch líniách mali listy úroveň H₂O₂ dva až štyrikrát vyššiu než listy netransformovaných kontrolných rastlín.

Zemiaky odolné proti chorobám

Hľúzy exprimujúce AGO sa testovali proti Erwinia carotovora v stolovom teste hľúz. Hľúzy z 34 línií transformovaných pMON22517 sa testovali na odolnosť proti mäkkej hnilobe. Línie sa tiež testovali na úrovne expresie Westem škvmovou analýzou. Hľúzy sa povrchovo sterilizovali podľa metódy Yangy aj. (1989). Dve alebo tri hľuzy na línii sa aseptický rozrezali na plátky 7-10 mm hrubé, čo dalo šesť až dvanásť plátkov na líniu. Plátky sa dali na zvlhčený sterilný filtračný papier Whatman číslo 1 v Petriho miske. Stred každého plátku sa očkoval 50000 CFU baktériou v 0,010 ml. Misky sa udržiavali v prostredí vysokej vlhkosti tri dni pri 23 °C. Hodnotenie choroby zahrňovalo meranie dĺžky, polomeru a hĺbky vzniknutých poškodení. Zriedenia macerovaných tkanív z poškodenia sa použili na stanovenie konečného počtu baktérii zúčastnených na poškodení. Výsledky týchto stanovení sú uvedené v tabuľke 3. Pri líniách, ktoré sa zdali najviac chránené, všetky merané parametre boli lepšie než pri prázdnom vektore a kontrolných hľuzách tlmivého roztoku. Hľuzy, pri ktorých sa zistila najvyššia úroveň expresie AGO mali zvyčajne najnižšiu hladinu baktérií v poškodeniach.

Tabuľka 3

r in·· Mdn	iWovaft	CFU* x 10⁹
Kontrolný tlimivý raaok	nulová	16,76
Prázdny vektor	uloví	14,32
22517-10	Bukjvá	20,7
22517-24	nulová	20,09
22517-13	nulová	16.3
22517-12	ulová	19,26
22517-9	nízka	9,34
22$ 17-28	nízka	13,56
22$ 17-33	nízka	9,57
22317-14	nízka	8,22
22517-17	nízke	8,36
22517-19	nízka	8,37
22517-32	nízke	7,17
22517-20	nivka	7,4
22517-21	nfeke	6,25
22517-34	nírire	4.44
22517-11	nídta	3.06
22517-8	nízka	1.5
22517-7	«redni	12,88
22517-31	«redni	12,06
22517-1	«redni	7,54
22517-15	«redni	6,7
22517-2$	«rodní	12,25
22517-35	«rodní	6,81
22517-2	«redni	3,52
22517-3	«rodní	1,25
22517-5	«rodní	1.4
22517-6	vysokí	15,74
22517-18	vysoká	2,675
22517-26	vy«AÍ	4,55
22517-29	vysokí	4.35
22517-4	vysokí	4,2
22517-30	vysoká	3,92
22517-16	vysoká	1.12
22517-23	vysoká	2,67
22517-36	vysokí	0,855

^a CFU = Jednotky tvoriacich kolónii ^b Hladiny expresie sa stanovili Westem škvmovou anylýzou.

Listy rastlín zemiakov transformovaných pMON22587 a exprimujúce AGO sa skúšali na odolnosť proti Pi. Celkom rozvinuté lístky (asi 20 cm²) sa očkovali pridaním kvapiek 0,100 ml suspenzie sporangií Phytophora infestans do stredu lista mino os. Inokulum malo hustotu 10⁵ - 10⁶sporangií na ml, zobraných z 2 - 3 týždňov starých stolov obsahujúcich LB-V8 médium. Očkované lístky sa udržiavali v Nunc Bio-Assay miskách (243 x 243 x 18 cm) s vlhkosťou danou vlhkým filtračným papierom na dne a inkubovali sa v rastových komorách asi pri 19 °C s 16 hodinovou fotoperiódou. Pozoroval sa rozvoj symptómov a napadnuté oblasti lístkov sa merali prekrytím každého lístka transparentnou mriežkou s okom 5x5 mm. Pre každú líniu lístkov sa vypočítala priemerná napadnutá oblasť a štandardná odchýlka.

Transgénne línie exprimujúce AGO ukazovali významnú kontrolu symptómov spôsobených infekciou Phytophora infestans na lístkoch. Výsledky dvoch línii sú uvedené v tabuľke 4. Redukcia symptómov bola 47 a 57 % v porovnaní s kontrolami (tak netransformovaných, ako i transformovaných prázdnym vektorom).

Tabuľka 4

Napadnutí oblasť¹

Línii číslo	3dpo&	4dpo	5dpo	6dpo
RussetBur.	U	2,1	4,2	7,1
17227-1®	1,6	2,7	4,7	8,7
225Í7-3¹*	0,4	0,8	1,1	3,0
225e7-12^d	0,5	1,3	23	3,7

^a Napadnutá oblasť je ukázaná ako priemer piatich listov.

^b Dni po očkovaní.

^c Kontrolná línia transformovaná prázdnym vektorom. ^d Transgénne línie exprimujúce glukózooxidázu.

Stála transformácia jednoklíčnych

Pre transformáciu jednoklíčnych sa vektor konštruoval s AGO a intrónom zvlášť užitočným na zvýšenie frekvencie získania transformovaných rastlín, ktoré exprimujú vysokú hladinu žiadaného proteinu. Použil sa intrón hsp70, opísaný v EP 602 193 (ekvivalent USA poradové číslo 08/181,634, Brown aj., ktorá je sem zahrnutá týmto odkazom). pMON 19477 tam opísaný sa vyrezal a potom sa klonoval 800 bp BglII- BamHI fragment obsahujúci intrón hsp70 do jediného miesta BglII v pMON22515. To dalo pMON22623.

pMON22623 sa dal do buniek pšenice bombardovaním mokroprojektilov podľa známych metód (Vasil aj.).

Keď sa získajú transformované rastliny, ich odolnosť proti plesniam, hlavne proti GgT sa stanoví známymi metódami.

Všetky publikácie a patenty uvedené v tomto opise sú sem zahrnuté odkazom, ako keby každá individuálna publikácia či patent boli špecificky a individuálne uvádzané ako zahrnuté odkazom.

Z predchádzajúceho bude zrejmé, že tento vynález je dobre prispôsobený na dosiahnutie všetkých cieľov a predmetov vytýčených spolu s výhodami, ktoré sú naporúdzi a ktoré sú vynálezu vlastné.

Rozumie sa, že isté znaky a podkombinácie sú užitočné a je možné ich použiť bez odkazu na iné znaky a podkombinácie. To je cieľ vynálezu a je v rozsahu nárokov.

Pretože sú možné mnohé uskutočnenia tohto vynálezu bez toho, aby sa odchýlilo od jeho rozsahu, rozumie sa, že všetko sa má interpretovať v ilustratívnom a v žiadnom prípade nie obmedzujúcom zmysle.

Zoznam reťazcov (1) Všeobecné informácie

i) Prihlasovateľ:

(A) Názov: Monsanto Company (B) Ulica: 800 North Lindbergh Boulevard (C) Mesto: St.Louis (D) Štát: Missouri (E) Krajina: USA (F) PSC: 63198 (G) Telefón: (314) 537-7286 (H) Fax: (314)537-6047 ii) Názov vynálezu: Spôsob kontroly rastlinných patogénov iii) Počet reťazcov:4 iv) Počítačové spracovanie (A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1,0, Verzia #1,25 (EPO) vi) Údaje o pôvodnej prihláške:

(A) Číslo prihlášky: US 08/161041 (B) Dátum podania: 24. november 1993 (2) Informácie o reťazci SEKV ID Č. 1

Charakteristika reťazca:

i) A) Dĺžka: 1848 párov báz

B) Typ: nukleová kyselina

C) Špirálovitosť: dvoj vláknová

D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómická) ix) Znak:

A) Meno/kľúč: CDS

B) Umiestnenie 16..1833 xi) Opis reťazca: SEKV ID Č. 1:

TCTMAAGAT CTATC ATG CM KI CTC CTT GTG MC TCC CTT CTC CTC TCC 51

N*t «In Thr tav Lm Val sar Sar Lm Val Val Hr 15 10 crc cer ccc ccc m ccc cm ne irc mg am ui ccc mi gm ccc 99

Lm Al* Kla Ala Lac Ptd Ila Tyr Zle Arg Ser Am 61y Zle Glu Ala

15

20

25

*ee

CTC

CTG

ACT

GAT

eec

AM

MT

CTC

TCC

CCC

MG

cn

GM

TAB

147

Ser

Lm

Thr

Aap

Pro

Lye

Asp

Val

Sar

Gly

Arg

Thr

Val

Aap

Tyr

30

55

40

ATC

GCT

GGT

GGA

GGT

CTG

ACT

GGA

CTC

ACC

GCT

cot

CTG

195

Ile

Ila

Ala

Gly

ciy

Gly

LM

Thr

Gly

Lm

Thr

Ala

Ma

Arg

tou

4$

so

5S

50

ACC

CAC

MC

CCC

AAC

ATC

AGT

CTC

GTC

ATC

GM

AGT

GCC

TCC

nc

243

Thr

Glu

Aan

Pro

Aan

Ila

Sar

Val

Lm

Val

Ila

Glu

Ser

Gly

Sar

Tyr

«5

70

75

GAG

TCC

GAC

ACA

GGT

CCT

ATC

xn

CM

CAC

CIC

AAC

GCC

nc

GGC

GAC

291

Clu

Sar

Aap

Arg

Gly

Pro

íle

Zle

Clu

Aep

Leu

AM

Ma

eiy

Asp

eo

•5

90

ATC

TTT

GCC

AGC

AGT

en

GAC

CM

CCC

nc

GM

ACC

CTG

GAG

CTC

GCT

339

Zla

?M

Gly

ser

Sar

v*i

*»P

IHi

Ale

Tyr

Glu

Thr

Val

Glu

Leu

Ala

95

100

105

ACC

AAC

MT

CM

ACC

GCC

CTC

ATC

CCC

TCC

GGA

MT

GGT

CTC

GGT

GGC

387

Thr

Aan

Gin

Thr

Ma

Lm

Zle

Are

Ser

Cly

AM

61y

Leu

Gly

61y

110

113

120

TCT

ACT

CTA

GTG

MT

GGT

GCC

ACC

TCG

ACT

CCC

CAC

AM

GCA

CM

435

Sar

Thr

Leu

Val

Aan

Gly

Thr

Trp

Thr

Arg

Pro

Ria

Lye

Ala

Gin

125

X3O

US

140

CTT

GAC

TCT

TCC

GAG

ACT

GTC

TTT

SGA

MT

CM

CCC

TGG

AAC

TGG

GAC

483

v*i

M?

Ser

Trp

Glu

Thr

val

Phe

Gly

Aan

Glu

eiy

Trp

Aan

Trp

Aap

14S

150

153

ΑΛΤ

GTC

GCC

TAC

TCC

CTC

CAG

GCT

GAG

CCT

GCT

CCC

GCA

cca

AAT

531

Aan

val

Ala

Tyr

sar

Leu

Gin

Ala

Cla

Arg

Ala

Arg

Ma

Pro

Asn

150

155

170

GCC

AM

CM

ATC

GCT

GCC

CAC

nc

TTC

AAC

GCA

TCC

TGC

CAT

GGT

$79

Al*

Lys

Gin

íle

Ala

Gly

Hia

Tyr

PM

Aaa

Ma

Sar

cya

ste

Gly

173

150

155

205

CTC

Lau ece coc gac

9ro Arg Asp

ATC

Mat

GGA ciy

GAA au acc

Thr

200

OCC GAT GAC TAT Gly Asp Asp Tyr

GAA

Glu

GAT

81»

TCC «•r

TAT GCC

Tyr Al*

TCC ATC

Sex Mat «27 «75

723

771 «19

867

91$

963

1011

105»

1107

1155

1203

1251

129»

1347

1395

1443

1491

1539

1587

163S

1683

1731

1779

1827

1848 xi) Opis reťazca: SEKV ID Č. 2

Met

Cla

Thr

Leu

Val

Ser

Leu

Val

Ser

Leu

Ma

Ala

1

$

10

1$

Leu

Pro

is

vyr

XU

Arg

Ser

Asn

Gly

Zle

Glu

Ma

Ser

Leu

Lsu

Thr

20

25

30

Asp

Pro

tjrs

Aep

Val

Ber

Gly

Arg

Thr

Val

Aep

Tyr

lis

Zle

Ma

Gly

35

40

45

Gly

cly

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

AU

Ala

Arg

Leu

Thr

Glu

Aan

Pro

$0

$5

«0

Asn

11«

iar

Val

Leu

Val

11«

Glu

ler

oiy

8er

Tyr

Glu

Ser

Alp

Arg

«5

70

75

SO

Gly

Pro

Zle

Glu

Asp

Leu

Asn

hla

Tr*

Gly

Asp

Zle

Phe

Gly

Ser

85

»0

95

Ser

val

Asp

Kla

Ala

Tyr

Glu

Thr

Val

Glu

Leu

Ma

Thr

Aan

Asn

Gin

100

105

110

Thr

Ala

Leu

Zle

Arg

Ser

Gly

Asn

Gly

Leu

Gly

Cly

Ser

Thr

Leu

Val

11$

120

12S

Asn

Gly

cly

Thr

Trp

Thr

Arg

Pro

Hla

Lys

Ma

Gin

Val

Asp

ser

Trp

130

135

140

Glu

Thr

Val

Phe

Gly

Asn

Glu

Cly

Trp

Aan

Trp

A»p

Asn

Val

Ala

Ma

145

150

155

160

Tyr

Ser

Leu

Gin

Ala

Glu

Ara

Ala

Arg

Ala

Pro

Asn

Ala

Lys

Cln

Zla

165

170

175

Ala

Cly

His

Tyr

Phe

Asn

Ala

Sex

Cys

HLs

Gly

VaL

Asn

Gly

Thr

180

185

190

v«X

His

Ala

Cly

Pro

Arg

Asp

Thr

Gly

Asp

Tyr

Ser

Pro

ZU

Val

195

200

205

Lys

Al*

Leu

Met

Ser

Ala

Val

Glu

Kap

Arg

Cly

Val

Pro

Thr

ty·

t-y·

210

215

220

Asp

Pha

Cly

Cys

Gly

Asp

Pro

Hla

ciy

Val

Ser

Met

Phe

Pro

Asn

Thr

225

230

235

240

Leu

His

Glu

Asp

Gin

Val

Ar«

Ser

Aep

ALa

Ma

Arg

Clu

Trp

Leu

24S

250

255

Pro

Asn

Tyr

Gin

Arg

Pro

Asn

Leu

Gin

Val

Leu

Thr

Gly

Gin

Tyr

Val

260

265

270

Gly

Ly.

Val

Leu

Ser

Gin

Aan

Gly

Thr

Pro

Arg

Als

val

Gly

275

280

285

Val

Glu

Phe

Cly

Thr

Is

tys

Gly

Asn

Thr

HLS

Asn

Val

Tyr

Ala

Lys

290

29$

300

18 ¹

Clu

Val ;

Leu :

Leu

Ala

Qly

Ser

Ala

Val

Ser

Pro

Thr

XU

Leu

30$

310

31$

320

Glu

m

ser ¹

Gly

Zle

Gly

Nrt

Lys

Ser

Zle

Leu

GU

Pro

Leu

Gly

Xlo

32$

330

335

Asp

Thr

val

Val

Asp

Leu

Pro

val

Gly

Les

Ann

Leu

Gin

Asp

Gin

Thr

340 34$ 3$0

Thr

Ma

Thr

Val

Arg

Sex

Arg

X U

Thr

Ser

Ma

cly

Ma

Gly

GU

cly

355

360

36$

Gin

Ma

AU

Trp

Phe

AU

Thr

Phe

asn

Glu

Thr

Phe

Gly

Mp

Tyr

Ser

370

375

380

Glu

Lys

Ma

Us

Clu

Leu

Asn

Thr

Lys

Leu

Clu

GU

Trp

Ala

Glu

385

390

395

400

Glu

Ma

val

Ma

Arg 40S

Gly

Phe

RU

Asn 410

Thr

Ma

Leu

Leu 415

Zla

Gin

Ty*

Glu

Asn 420

Tyr

Arg

ASp

Trp

XU 425

Val

Asn

Bis

Asn

Val 430

Ma

Tyr

Ser

Glu

Leu 43S

Pha

Leu

Asp

Thr

Ala 440

Gly

Val

Ala

Ser

Phe 445

Asp

val

Trp

Asp

Leu 490

Leu

Pre

Phe

Thr

Arg 455

Gly

Tyr

Val

HlS

Zle 460

Leu

ASP

Lys

Asp

Pro 465

Tyr

Leu

Bis

His

Phe 470

Ala

Tyr

Asp

Pro

Gin 47$

Tyr

PM

Leu

Asn

Clu 480

Leu

Α·Ρ

Uu

Leu

cly 48$

Gin

Ma

AU

Ala

Thr 490

Gin

Lsu

Ma

Arg

Asn 495

Zle

Ser

Asn

Ser

Gly 500

ALa

Met

Gin

Thr

Tyr SOS

Phe

Ala

ciy

Clu

Thr 510

Íle

Pro

Cly

Asp

Asn 515

Leu

Ala

Tyr

Α·Ρ

Ala 520

Asp

Leu

ser

Ala

Trp 525

Thr

Glu

Tyr

Zle

Pro $30

Tyr

HLs

Phe

Arg

Pro $35

Α8Π

Tyr

Le

Gly

val $40

Gly

Thr

Cys

Ser

Informácie o reťazci SEKV ID Č. 2 Charakteristika reťazca:

i) A) Dĺžka: 605 aminokyselín

B) Typ: aminokyselina

C) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín

Hat Het Pro Lys Clu Krt Oly Gly Val val Asp Asn Als Al* Arg v*l

$4$

550

955

560

Tyr

Gly

Val

Gln

Gly

Leu

Arg

Val

Zle

Asp

Giy

Ser

Zle

Pro

Thr

565

570

575

Gin

Nrt

Ser

HU

val

Met

Thr

val

Phe

Tyr

Ma

Net

Ale

Leu

Lye

580

585

590

XU

ser

Aep

Ma

ZU

Leu

Glu

ASp

Tyr

Ala

ser

Met

GU

59$

600

60$

SK 280613 Β6

Informácie o reťazci SEKV ID Č. 3

Charakteristika reťazca:

i) A) DÍžka:33 párov báz

B) Typ: nukleová kyselina

C) Špirálovitosť: jednoduchá

D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómická) xi) Opis reťazca: SEKV ID Č. 3

CCATCTAGAA GATCTATCAT

GCAGACTCTCTC CTT

Informácie o reťazci SEKV ID Č. 4

Charakteristika reťazca:

i) A) Dĺžka: 36 párov báz

B) Typ: nukleová kyselina

C) Špirálovitosť: jednoduchá

D) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómická) xi) Opis reťazca: SEKV ID Č. 4

TGGGGTACCG GATCCTTATC ACTGCATGGA AGCATA

Odkazy

Barry, G.F., G. Kishore, and S.R. Padgette. „Glyphosate Tolerant 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthases.“ PCT Appl. WO 92/04449,1991.

Bevan, M. et al. Náture, 304:184,1983.

Bevan, M. et al. Nucleic Acid Research. 14:4625. 1986. Bol, J. etal. Ann Rev of Phytopathol.. 28:113-138, 1990.

Bowles, D. Ann Rev of Biochem.. 59:873-907, 1990.

Cuypers: B. et al. Mol Plant-Microbe Interactions.l:157-160,1988.

Fischhoff, D.A. and Perlak, F.J. „Synthetic plánt genes and method for preparation.“ European Patent Application, Publication Number 0 385 962, 1990.

Frederick, K. et al. J. Biol. Chem., 265:3793-3802. Fritzemeier, K et al. Plánt Phvsiol. 85:34-41, 1987.

Gallo. Methods in Enzvmologv. 71:665-668, 1981. Ilerrera-Estrella, L. et al. Náture, 303:20-9,1983.

Kay, R. et al., Science, 236:1299-1302, 1987.

Keil, M. et al. Nucleic Acids Res..l4:5641- 5650,1986.

Klee, H. J. et al. Bio/Technology. 3:63 7-642,1985. 20 Kim, K. et al. PhvtODathology, 78:488-492,1988.

Kim, K. et al. Can. J. Microbiol., 36:199-205,1990.

Kriechbaum M. et al. FEBS Lett., 255:63-66,1989. Linthorst, H. J. M. Crit Rev Plánt Sci.l0:123-150.

Logemann, J. etal. Plánt Celí. 1:151-158.1989.

Matton, D. and Brisson, N. Mol Plant-Microbe Interactions, 2:325-331, 1989.

Matton, D. et al. Plánt Mol Biol.l4:863-865.1990.

Nelson, C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 7 7:19 75 - 1979,1980.

Odeli, J. et al., Náture. 313:810, 1985.

Schroder, M.et al. Plánt J, 2:161-17, 1992.

Taylor, J., et al. Molecular Plant-Microbe Interactions, 3:72-77, 1990.

Vasil et al. Bio/Technology 11:1153-1158, 1993. Winter et al. Mol. Gen. Genet., 221(2):315-19,1988.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Rekombinantná dvoj vláknová molekula DNA obsahujúca v pracovnej sekvencií:

a) promótor, ktorý vyvoláva v rastlinnej bunke produkciu RNA sekvencie,

b) štrukturálnu kódujúcu sekvenciu, ktorá kóduje produkciu Aspergillus glukózooxidázy,

c) 3' netranslačnú oblasť, ktorá spôsobí v uvedenej rastlinnej bunke tak, že sa polyadenylátové nukleotidy pripoja k 3' koncu RNA sekvencie.
2. Molekula DNA podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že uvedená štruktúrna sekvencia je SEKV ID Č. 1.
3. Molekula DNA podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že uvedený promótor je vybraný z FMV35S a CaMV35S promótorov.
4. Molekula DNA podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že uvedený promótor je indukovaný potogénnou infekciou.
5. Spôsob produkcie geneticky transformovaných, proti chorobám odolných rastlín, ktoré zahŕňajú kroky:

a) vloženie do genómu rastlinnej bunky rekombinantnej dvojvláknovej molekuly DNA, ktorá obsahuje:

i) promótor, ktorý vyvoláva v rastlinnej bunke produkciu RNA sekvencie, ii) štrukturálnu kódujúcu sekvenciu, ktorá kóduje produkciu Aspergillus glukózooxidázy, iii) 3' netranslačnú oblasť, ktorá pôsobí v rastlinnej bunke tak, že sa polyadenylátové nukleotidy pripoja k 3' koncu RNA sekvencie,

b) získanie transformovaných rastlinných buniek a

c) regeneráciu geneticky transformovaných rastlín, ktoré exprimujú Aspergillus glukózooxidázu v množstve účinnom na zníženie poškodenia spôsobeného infekciou bakteriálnymi a hubovými patogénmi.
6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že uvedená štrukturálna kódujúca sekvencia je SEKVID Č. 1.
7. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že uvedený promótor je vybraný z FMV35S a CaMV35S promótorov.
8. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa t ý m , že uvedený promótor je indukovaný patogénnou infekciou.
9. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa t ý m , že uvedené rastliny sú zemiaky alebo pšenica.