MXPA05000758A - Metodos para utilizar polinucleotidos artificiales y composiciones de los mismos para reducir el silenciamiento de los transgenes. - Google Patents

Abstract

Los materiales y metodos descritos se proveen para moleculas de polinucleotido suficientemente divergentes de polinucleotidos naturalmente contenidos en plantas, o polinucleotidos previamente introducidos en plantas como transgenes para permitir apilamiento por rasgos en metodos de cultivo de planta o metodos de transformacion de plantas; la descripcion tambien provee metodos y composiciones para detectar polinucleotidos de la invencion en plantas.

Description

METODOS PARA USAR POLINUCLEOT1DOS ARTIFICIALES Y COMPOSICIONES DE LOS MISMOS PARA REDUCIR S1LENCIAMIENTQ DE TRANSGENES SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/396,665, presentada el 18 de julio de 2002.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a ingeniería genética de plantas. Muy particularmente, a un método para construir un polinucleótido artificial y métodos de uso para reducir el silenciamiento de transgenes en plantas. La invención también se refiere a células vegetales que contienen el polinucleótido artificial en las cuales una célula vegetal es transformada para expresar el polinucleótido artificial y la planta regenerada a partir del mismo.

DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA Los genes heterólogos se pueden aislar de una fuente distinta a la de la planta en la cual será transformada o se pueden modificar o diseñar para tener diferentes cualidades mejoradas. Los rasgos o cualidades particularmente deseables de interés para la ingeniería genética de plantas incluiría pero no se limitaría a resistencia a insectos, enfermedades de hongos y otras plagas y agentes causantes de enfermedad, tolerancias a herbicidas, estabilidad o vida de anaquel incrementada, rendimiento, tolerancias al estrés ambiental y mejoras nutricionales. Los métodos de biología molecular tradicionales para generar genes y proteínas novedosos generalmente implicaban mutagénesis aleatoria o dirigida. Un ejemplo de mutagénesis aleatoria es una técnica de recombinación conocida como "entremezclado de ADN" como se describe en las patentes de E.U.A. 5,605,793; 5,811 ,238; 5,830,721 ; 5,837,458 y solicitudes internacionales WO 98/31837, WO 99/65927, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia. Un método alternativo de evolución molecular implica el proceso de extensión escalonado (StEP) para mutagénesis in vitro y recombinación de secuencias de molécula de ácido nucleico, como se describe en la patente de E.U.A. 5,965,408, incorporada aquí por referencia. Un ejemplo de mutagénesis dirigida es la introducción de una mutación puntual en un sitio específico en un polipéptido. Un enfoque alternativo, útil cuando el gen heterólogo es de una fuente no vegetal, es diseñar un gen insecticida artificial que utiliza el codón más frecuente usado en el cuadro de uso de codones de plantas de maíz (Koziei et al., 1993, Biotechnology 11 , 194-200). Fischhoff and Perlak (patente de E.U.A. No. 5,500,365, incorporada aquí por referencia) reporta que la expresión más alta de proteína insecticida de Baclllus thuríngiensis (Bt) comparada en plantas de cultivo cuando la secuencia de polinucleótido se modificó para reducir la ocurrencia de secuencias desestabilizadoras. Fue necesario modificar la secuencia de polinucleótido Bt de tipo silvestre debido a que el polinucleótido Bt de longitud completa de tipo silvestre no expresó suficientes niveles de proteína insecticida en plantas para ser agronómicamente útiles. Los genes heterólogos son clonados en vectores adecuados para transformación de plantas. Las técnicas de transformación y regeneración útiles para incorporar genes heterólogos en un genoma de la planta son bien conocidos en la técnica. El gen entonces se puede expresar en la célula vegetal para presentar la característica o rasgo característico añadido. Sin embargo, los genes heterólogos que normalmente se expresan bien como transgenes pueden experimentar silenciamiento de genes cuando más de una copia de los mismos genes son expresados en la misma planta. Esto puede ocurrir cuando el primer gen heterólogo es demasiado similar a una secuencia de ADN de gen endógeno en la planta. Otros ejemplos incluyen cuando una planta transgénica es subsecuentemente cruzada con otras plantas transgénicas que tienen los mismos o similares transgenes o cuando la planta transgénica es retransformada con un cassette de expresión de la planta que contiene el mismo gen o un gen similar. De manera similar, el silenciamiento de genes puede ocurrir si el apilamiento de rasgos emplea los mismos elementos genéticos usados para dirigir la expresión del transgén de interés. A fin de apilar los rasgos, se deben hacer líneas transgénicas estables con diferentes combinaciones de genes y elementos genéticos para evitar silenciamiento de genes. La N-fosfonometilglicina, también conocida como glifosato, es un herbicida bien conocido que tiene actividad en un amplio espectro de especies de plantas. El glifosato es el ingrediente activo de Roundup® (Monsanto Co.), un herbicida que tiene una vida media deseablemente corta en el ambiente. Cuando se aplica a una superficie de la planta, el glifosato se mueve sistémicamente a través de la planta. El glifosato es fitotóxico debido a su inhibición de la vía de ácido shikímico, que provee un precursor de la síntesis de aminoácidos aromáticos. El glifosato inhibe la enzima 5-enolpiruvil-3-fosfoshikimato sintasa (EPSPS). La tolerancia al glifosato se puede lograr mediante la expresión de variantes de EPSPS que tienen afinidad más baja el glifosato y por lo tanto retienen su actividad catalítica en presencia de glifosato (patente de E.U.A. No. 5,633,435, incorporada aquí por referencia). Las enzimas que degradan glifosato en tejidos vegetales (patente de E.U.A. No. 5,463,175) también son capaces de conferir tolerancia celular al glifosato. Dichos genes se usan para la producción de cultivos transgénicos que son tolerantes al glifosato, permitiendo así que el glifosato se use para control efectivo de malezas con una mínima preocupación de daño a los cultivos. Por ejemplo, la tolerancia al glifosato ha sido manipulada genéticamente en maíz (patente de E.U.A. No. 5,554,798), trigo (solicitud de patente de E.U.A. No. 20020062503), soya (solicitud de patente de E.U.A. No. 20020157139) y cañóla (WO 9204449), todas las cuales se incorporan por referencia. Los transgenes para tolerancia al glifosato y los transgenes para tolerancia a otros herbicidas, v.gr., gen bar, (Toki eí al. Plant Physiol., 100: 1503-1507,1992; Thompson et al. EMBO J. 6:2519-2523, 1987, phosphinothricin acetyltransferase, BAR gene isolated from Streptomyces; DeBlock et al. EMBO J., 6:2513-2522, 1987, glufosinate herbicide) también son útiles como marcadores seleccionares o marcadores marcables y pueden proveer un fenotipo útil para la selección de plantas relacionadas con otros rasgos agronómicamente útiles. Lo que se necesita en la técnica son métodos para diseñar genes para expresión en plantas para mejorar rasgos agronómicamente útiles que evitan el silenciamiento de genes cuando se insertan copias múltiples y la recombinación con genes de plantas endógenas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figuras 1A-1 H. Comparación de apilamiento de los cambios de secuencias de polinucleótidos de dos versiones de EPSPS de arroz artificial (OsEPSPS_AT, OsEPSPS_ZM) y un arroz nativo EPSPS (OsEPSPS_Nat), el polipéptido de cada uno modificado para ser resistente al glifosato. Figuras 2A-2F. Comparación de apilamiento de las secuencias de polinucleótidos de un maíz nativo (ZmEPSPS_Nat) y un maíz artificial EPSPS (ZmEPSPS_ZM) el polipéptido de cada uno modificado para ser resistente al glifosato. Figuras 3A-3G. Comparación de apilamiento de las secuencias de polinucleótidos de una versión nativa de EPSPS (GmEPSPS_Nat) y una versión artificial (GmEPSPS_GM) de soya, el polipéptido de cada uno modificado para ser resistente al glifosato. Figuras 4A-4C. Comparación de apilamiento de las secuencias de polinucleótido de un gen BAR nativo (BAR1_Nat) y dos versiones artificiales con derivación de codón de Zea mays (BAR1_ZM) y Arabidopsis thaliana (BAR1_AT). Figuras 5A-5G. Comparación de apilamiento de las secuencias de polinucleótido de versiones nativas CTP2 y CP4EPSPS (CTP2CP4_Nat) y artificial (CTP2CP4_AT, CTP2CP4_ZM, y CTP2CP4_GM). Figura 6. Mapa plasmídico de pMON54949. Figura 7. Mapa plasmídico de pMON54950. Figura 8. Mapa plasmídico de pMON30151. Figura 9. Mapa plasmídico de pMON59302. Figura 10. Mapa plasmídico de pMON59307. Figura 11. Mapa plasmídico de pMON42411. Figura 12. Mapa plasmídico de pMON58400. Figura 13. Mapa plasmídico de pMON58401. Figura 14. Mapa plasmídico de pMON54964. Figura 15. Mapa plasmídico de pMON25455.

Figura 16. Mapa plasmídico de pMON30152. Figura 17. Mapa plasmídico de pMON54992. Figura 18. Mapa plasmídico de pMON54985. Figura 19. Mapa plasmídico de pMON20999. Figura 20. Mapa plasmídico de pMON45313. Figura 21. Mapa plasmídico de pMON59308. Figura 22. Mapa plasmídico de pMON59309. Figura 23. Mapa plasmídico de pMON59313. Figura 24. Mapa plasmídico de pMON59396. Figura 25. Mapa plasmídico de pMON25496.

BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO:1 OsEPSPS TIPS Una secuencia de proteína EPSPS de arroz modificada para ser resistente al glifosato, con péptido transitorio de cloroplasto. SEQ ID NO:2 OsEPSPS Nat Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido EPSPS nativo de arroz modificado para codificar una proteína resistente al glifosato.

SEQ ID NO:3 OsEPSPS AT Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido EPSPS de arroz artificial usando el cuadro de uso de codones de Arabidopsis y los métodos de la presente invención, y además modificado para codificar una proteína resistente al glifosato.

SEQ ID N0:4 OsEPSPS ZM Secuencia de polinucleótido de un polinucieótido EPSPS de arroz artificial usando el cuadro de uso de codón de Zea mays y los métodos de la presente invención, y además modificado para codificar una proteína resistente al glifosato.

SEQ ID O:5 GmEPSPS IKS Una secuencia de proteína EPSPS de soya modificada para ser resistente al glifosato, con péptido transitorio de cloroplasto. SEQ ID O:6 GmEPSPS Nat Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido EPSPS nativo de soya modificado para codificar una proteína resistente al glifosato.

SEQ ID NO:7 GmEPSPS_GM Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido EPSPS de soya artificial usando el cuadro de uso de codones de Glycine max y los métodos de la presente invención, y además modificado para codificar una proteína resistente al glifosato.

SEQ ID NO:8 ZmEPSPS_TIPS Una secuencia de proteína EPSPS de maíz modificada para ser resistente al glifosato, con péptido transitorio de cloroplasto. SEQ 1D N0:9 ZmEPSPS Nat Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido EPSPS nativo de maíz modificado para codificar una proteína resistente al glifosato.

SEQ ID NO:10 ZmEPSPS ZM Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido EPSPS de maíz artificial usando el cuadro de uso de codones de Zea mays y los métodos de la presente invención, y además modificado para codificar una proteína resistente al glifosato.

SEQ ID NO:1 1 CTP2 Secuencia de proteína del péptido transitorio de cloroplasto 2 del gen EPSPS de Arabidopsis. SEQ ID NO:12 CTP2 Nat Secuencia de polinucleótido del péptido transitorio de cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis.

SEQ ID 0:13 CTP2_AT Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido artificial que codifica CTP2 usando el cuadro de uso de codones de Arabidopsis y los métodos de la presente invención. SEQ ID N0:14 CTP2_ZM Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido artificial que codifica CTP2 usando el cuadro de uso de codones de Zea mays y los métodos de la presente invención.

SEQ ID NO:15 CP4EPSPS La secuencia de proteína de la proteína EPSPS resistente al glifosato de la cepa CP4 de Agrobacterium. SEQ 1D 0:16 CP4EPSPS_Nat Secuencias de polinucleótido del polinucleótido nativo que codifica la proteína EPSPS CP4EPSPS (patente de E.U.A. No. 5,633,435). SEQ ID NO:17 CP4EPSPS_AT Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido artificial que codifica la proteína CP4EPSPS usando el cuadro tabla de uso de codones de Arabidopsis y los métodos de la presente invención. SEQ ID NO:18 CP4EPSPS_ZM Secuencia de polinucleótido d un polinucleótido artificial que codifica la proteína CP4EPSPS usando el cuadro de uso de codones de Zea mays y los métodos de la presente invención. SEQ ID NO:19 BAR1 La secuencia de proteína de una fosfinotricina acetiltransferasa. SEQ ID NO:20 BAR1_Nat Secuencia de polinucleótido del polinucleótido nativo aislado de Streptomyces que codifica la fosfinotricina acetiltransferasa SEQ ID NO:21 BAR1 AT Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido artificial que codifica la fosfinotricina acetiltransferasa usando el cuadro de uso de codones de Arabidopsis y los métodos de la presente invención.

SEQ ID NO:22 BAR1 ZM Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido artificial que codifica la fosfinotricina acetiitransferasa usando el cuadro de uso de codones de Zea mays y los métodos de la presente invención.

SEQ ID NO:23 CP4EPSPS_Syn Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido artificial con una derivación de codón de dicotiledóneas. SEQ ID NO:24 CP4EPSPS_AT_p1 Diagnóstico de molécula de iniciador de ADN para el polinucleótido CP4EPSPS_AT.

SEQ ID NO:25 CP4EPSPS_AT_p2 Diagnóstico de molécula de iniciador de ADN para el polinucleótido CP4EPSPS_AT.

SEQ ID NO:26 CP4EPSPS_ZM_p1 Diagnóstico de molécula de iniciador de ADN para el polinucleótido CP4EPSPS_ZM.

SEQ ID NO:27 CP4EPSPS_ZM_p2 Diagnóstico de molécula de iniciador de ADN para el polinucleótido CP4EPSPS_ZM.

SEQ ID NO:28 CP4EPSPS_Nat_p1 Diagnóstico de molécula de iniciador de ADN para el polinucleótido CP4EPSPS_Nat.

SEQ ID NO:29 CP4EPSPS_Nat_p2 Diagnóstico de molécula de iniciador de ADN para el polinucleótido CP4EPSPS_Nat. SEQ ID NO:30 CP4EPSPS_Syn_p1 Diagnóstico de molécula de iniciador de ADN para el polinucleótido CP4EPSPS_Syn. SEQ ID NO:31 ' CP4EPSPS_Syn_p2 Diagnóstico de molécula de iniciador de ADN para el polinucleótido CP4EPSPS_Syn.

SEQ ID NO:32 iniciador! de ZmAdhl Diagnóstico de iniciador de control 1 para gen Adh1 de maíz endógeno. SEQ ID NO:33 lniciador2 de ZmAdhl Diagnóstico de iniciador de control 2 para gen Adh1 de maíz endógeno. SEQ ID NO:34 GNAGIAMKS Motivo que provee resistencia al glifosato a una EPSPS vegetal. SEQ ID NO:35 CTPEPSPSCP4_GM Secuencia de polinucleótido de un polinucleótido artificial que codifica la proteína CP4EPSPS usando el cuadro de uso de codones de Giycine max.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee métodos y composiciones para diseñar una secuencia de polinucleótido artificial que codifica una proteína de interés en donde el polinucleótido artificial es sustancialmente divergente de un polinucleótido que ocurre naturalmente en una planta o un polinucleótido que ha sido introducido como un transgén en una planta y el polinucleótido artificial y polinucleótido que codifica un polipéptido sustancialmente idéntico. Los polinucleótidos artificiales de la presente invención que codifican proteínas que proveen fenotipos agronómicamente útiles a una planta transgénica que contiene construcción de ADN que comprende el polinucleótido artificial. Los fenotipos agronómicamente útiles incluyen, pero no se limitan a: tolerancia a la sequía, rendimiento incrementado, tolerancia al frío, resistencia a enfermedades, resistencia a insectos y tolerancia a herbicidas. Otro aspecto de la presente invención son polinucleótidos artificiales que codifican una proteína EPSPS resistente a herbicidas, una proteína de fosfinotricina acetiltransferasa, una proteína de péptido transitorio de cloroplasto. En modalidades preferidas de la presente invención, la molécula de polinucleótido artificial se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:22, y SEQ ID NO:35.

La presente invención provee construcciones de ADN que comprenden: una molécula de promotor que funciona en plantas, operablemente ligada a una molécula de polinucleótido artificial de la presente invención, en donde la molécula de polinucleótido artificial se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:22, y SEQ ID NO:35, operablemente ligadas a una región de terminación de transcripción. La presente invención provee además construcciones de ADN que comprenden: una molécula de promotor que funciona en plantas, operablemente enlazadas a una molécula de polinucleótido artificial que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto, operablemente ligada a un EPSPS resistente a glifosato heterólogo, operablemente ligada a una región de señal de terminación de transcripción, en donde el polinucleótido artificial es sustancialmente divergente en secuencia de polinucleótido de polinucleótidos conocidos que codifican un péptido de tránsito de cloroplasto idéntico. La presente invención provee construcciones de ADN que comprenden por lo menos dos cassettes de expresión, el primer cassette de expresión comprendiendo una molécula de promotor que funciona en plantas, operablemente ligado a una molécula de polinucleótido artificial de la presente invención, operablemente ligado a una región de señal de terminación de transcripción, y el segundo cassette de expresión comprendiendo una molécula de promotor que funciona en plantas, operablemente ligado a una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido sustancialmente idéntico que el polinucleótido artificial, y es menor que ochenta y cinco por ciento similar en secuencia de polinucleótido al polinucleótido artificial, operablemente ligado a una región de señal de terminación de transcripción. La presente invención provee células vegetales, plantas o progenie de las mismas que comprenden una construcción de ADN de la presente invención. De particular interés son plantas de progenie de la misma seleccionadas del grupo que consiste de trigo, maíz, arroz, soya, algodón, papa, cañóla, pasto de turba, árboles forestales, sorgo de grano, cultivos de hortalizas, plantas de ornato, cultivos de forraje y cultivos de frutas. Un método de la presente invención reduce el silenciamiento de genes durante la reproducción de plantas transgénicas que comprende los pasos de: a) construir un polinucleótido artificial que es sustancialmente divergente de los polinucleótidos conocidos que codifican una proteína sustancialmente idéntica, y b) construir una construcción de ADN que contiene la molécula de polinucleótido artificial; y c) transformar la construcción de ADN en una célula vegetal; y d) regenerar la célula vegetal en una planta transgénica; y e) cruzar la planta transgénica con una planta fértil, en donde la planta fértil contiene una molécula de polinucleótido que codifica una proteína sustancialmente idéntica a una proteína codificada por la molécula de polinucleotido artificial y en donde la molécula de polinucleotido artificial y la molécula de polinucleotido son sustancialmente divergentes. Otro aspecto de la invención es una célula vegetal transgénica que comprende dos polinucleótidos, en donde por lo menos uno de los polinucleótidos es un transgén y los dos polinucleótidos codifican una proteína sustancialmente idéntica y son menores de ochenta y cinco por ciento similares en secuencia de polinucleotido. Otros aspecto de la presente invención en un método para reducir el silenciamiento de genes durante la producción de plantas transgénicas comprende los pasos de: a) construir un polinucleotido artificial que es sustancialmente divergente de los polinucleótidos conocidos que codifican una proteína sustancialmente idéntica, y b) construir una construcción de ADN que contiene la molécula de polinucleotido artificial; y c) transformar la construcción de ADN en una célula vegetal; y d) regenerar la célula vegetal en una planta transgénica; y e) retransformar una célula de la planta transgénica con una segunda construcción de ADN que comprende una molécula de polinucleotido que codifica una proteína sustancialmente idéntica al polinucleotido artificial y dicho polinucleotido y polinucleotido artificial son sustancialmente divergentes en la secuencia de polinucleotido; y f) regenerar la célula del paso d en una planta transgénica que comprende tanto el polinucleótido artificial como el polinucleótido. Además en la presente invención se proveen métodos para la selección de plantas transformadas con una construcción de ADN de la invención que comprende los pasos de: a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN de la presente invención; y b) cultivar dicha célula vegetal en un medio selectivo que contiene un herbicida seleccionado del grupo que consiste de: glifosato y glufosinato, para aniquilar selectivamente células que no han sido transformadas con las construcciones de ADN; y c) regenerar la célula vegetal en una planta fértil. Otro aspecto de la invención es un método para detectar un polinucleótido artificial en una célula vegetal transgénica, planta o progenie de la misma que comprende los pasos de: a) poner en contacto una muestra de ADN aislado de una célula vegetal, planta o progenie del mismo con una molécula de ADN en donde la molécula de ADN comprende por lo menos una molécula de ADN de un par de moléculas de ADN que cuando se usa en una reacción de amplificación de ácido nucleico produce un amplicón que es diagnóstico para la molécula de polinucleótido artificial seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:22, y SEQ ID NO:35. (b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo así el amplicón; y (c) detectar el amplicón. Los reactivos provistos para realizar el método de detección anterior incluyen pero no se limitan a: moléculas de ADN que específicamente hibridan a una molécula de polinucleótido artificial seleccionada del grupo que cosiste de: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 , y SEQ ID NO:22; y moléculas de ADN aisladas seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, y SEQ ID NO:27. La presente invención provee plantas y progenie que comprende una molécula de ADN seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, y SEQ ID NO:27. La presente invención provee pares de moléculas de ADN seleccionadas del grupo que comprende: una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde la primera molécula de ADN es SEQ ID NO:24 o su complemento y la segunda molécula de ADN es SEQ ID NO:25 o su complemento y el par de moléculas de ADN cuando se usan en un método de amplificación de ADN producen un amplicón, y una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde la primera molécula de ADN es SEQ ID NO:26 o su complemento y la segunda molécula de ADN es SEQ ID NO:27 o su complemento y el par de moléculas de ADN cuando se usan en un método de amplificación de ADN producen un amplicón, en donde el amplicón es diagnóstico para la presencia de un polinucleótido artificial de la presente invención en el genoma de una planta transgénica. La presente invención provee una planta y progenie de la misma identificadas por un método de amplificación de ADN para contener en su genoma una molécula de ADN seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, y SEQ ID NO:27. La presente invención provee y contempla equipos de detección de ADN que comprenden: por lo menos una molécula de ADN de longitud suficiente para ser específicamente homologa o complementaria a un polinucleótido artificial seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 , y SEQ ID NO:22, en donde dicha molécula de ADN es útil como una sonda de ADN o un iniciador de ADN; o por lo menos un homólogo de molécula de ADN o complementario a la molécula de iniciador de ADN seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, y SEQ ID NO:27.

La presente invención incluye además un método de detección de la presencia de un polinucleótido artificial que codifica un EPSPS resistente a glifosato en una muestra de ADN, el método comprendiendo: (a) extraer una muestra de ADN de una planta; (b) poner en contacto una muestra de ADN con una molécula de ADN marcada de longitud suficiente para ser específicamente homologa o complementaria a un polinucleótido artificial seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, y SEQ ID NO:18, en donde la molécula de ADN maracada es una sonda de ADN; y (c) someter la muestra y sonda de ADN a condiciones de hibridación astringentes; y (d) detectar la sonda de ADN hibridada a la muestra de ADN. La presente invención provee un polinucleótido aislado que codifica una enzima EPSPS, la enzima EPSPS contiene el motivo de SEQ ID NO:34. La presente invención provee una construcción de ADN que contiene un polinucleótido que codifica para la enzima EPSPS con el motivo de SEQ ID NO:34. Una célula vegetal, planta o progenie de la misma que es tolerante a glifosato como resultado de expresar una enzima EPSPS que contiene el motivo de SEQ ID NO:34 en un aspecto de la invención.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Las siguientes definiciones se proveen para definir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique de otra manera, los términos se deben entender de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la técnica relevante. Definiciones de términos comunes en biología molecular también se pueden encontrar en Rieger et al., Glossary of Genetics: Ciassical and Molecular, 5a edición, Springer-Verlag: New York, (1991 ); y Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, (1994). Se usa la nomenclatura para bases de ADN como se expone en 37 CFR § 1.822. Se usa la nomenclatura de una y tres letras estándar para residuos de aminoácidos. "Sustituciones de aminoácidos", "variantes de aminoácidos", son preferiblemente sustituciones de residuo de aminoácidos individual para otro residuo de aminoácido en cualquier posición dentro de la proteína. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de la misma se pueden combinar para llegar a una construcción final. Un "polinucleótido artificial" como se usa en la presente invención, es una secuencia de ADN diseñada de conformidad con los métodos de la presente invención y creada como una molécula de ADN aislada para usarse en una construcción de ADN que provea expresión de una proteína en células hospedero, y para los propósitos de clonar en construcciones apropiadas u otros usos conocidos por los expertos en la técnica. Los programas de computadora están disponibles para estos propósitos incluyendo pero sin limitarse a programas "BestFit" o "Gap" del paquete de Software de análisis de secuencia, grupo de computadora en genética (GCG), Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wl 53711. El polinucleótido artificial se puede crear por uno o más métodos conocidos en la técnica, que incluyen pero no se limitan a: PCR de traslape. Un polinucleótido artificial de la presente invención es sustancialmente divergente de otros polinucleótidos que codifican para la proteína idéntica o casi idéntica. El término "quimérico" se refiere a una secuencia de aminoácido o proteína de fusión. Una secuencia de codificación de ácido nucleico quimérico está compuesto de dos o más secuencias unidas en marco que codifican una proteína quimérica. Un gen quimérico se refiere a los elementos genéticos múltiples derivados de fuentes heterólogas que comprenden un gen. Las frases "secuencia de codificación", "marco de lectura abierto" y "secuencia estructural" se refiere a la región de tripletes de ácido nucleico secuenciales continuos que codifican una secuencia de proteína, polipéptido o péptido. "Codón" se refiere a una secuencia de tres nucleótidos que especifican un aminoácido particular. "Uso de codón" o "desviación de codón" se refiere a la frecuencia de uso de codones que codifican aminoácidos en secuencias codificadoras de organismos. "Complementariedad" y "complemento" cuando se refiere a secuencias de ácido nucleico, se refiere a la unión específica de adenina a timina (uracilo en ARN) y citosina a guanina en cadenas opuestas de ADN o ARN. "Construcción" se refiere a los elementos genéticos heterólogos operablemente ligados uno a otro formando una molécula de ADN recombinante y pueden comprender elementos que proveen expresión de una molécula de polinucleótido de ADN en una célula hospedero y elementos que proveen mantenimiento de una construcción. "Región C-terminal" se refiere a la región de una cadena de péptido, polipéptido o proteína desde la mitad de la misma hasta el extremo que porta el aminoácido que tiene un grupo carboxilo libre. El término "divergente" como se usa aquí, se refiere a la comparación de moléculas de polinucleótido que codifican la misma o casi la misma proteína o polipéptido. El código genético de cuatro letras (A, G, C y T/U) comprende codones de tres letras que dirigen moléculas de ARNt para ensamblar aminoácidos en un polipéptido a partir de una plantilla de ARNm. Al tener más de un codón que puede codificar para el mismo aminoácido se está refiriendo como degenerado. Los codones regenerados se usan para construir moléculas de polinucleótido sustancialmente divergentes que codifican el mismo polipéptido en donde estas moléculas tienen una secuencia de ácido nucleótidos de su longitud completa en la cual son menores de 85% idénticos y no hay longitudes de secuencia de polinucleótidos mayores que 23 nucleótidos que sean idénticas. El término "ADN codificador" se refiere al ADN cromosomal, ADN de plásmido, ADNc o polinucleótido de ADN artificial que codifica cualquiera de las proteínas aquí descritas. El término "endógeno" se refiere a materiales que se originan desde el interior de un organismo o célula. "Endonucleasa" se refiere a una enzima que hidroliza ADN de doble cadena en sitios internos. "Exógeno" se refiere a materiales que se originan desde el exterior de un organismo o célula. Esto se aplica típicamente a moléculas de ácido nucleico usadas en la producción de células hospedero y plantas transformadas o transgénicas. "Exón" se refiere a la porción de un gen que es realmente traducido a proteína, es decir, una secuencia codificadora. El término "expresión" se refiere a la transcripción o traducción de un polinucleótido para producir un producto de gen correspondiente, un ARN o proteína. "Fragmentos". Un fragmento de un gen es una porción de una molécula de ácido polinucleico de longitud completa que es de por lo menos una longitud mínima capaz de sufrir transcripción a un ARN, traducción a un péptido o útil como una sonda o iniciador en un método de detección de ADN. El término "gen" se refiere a polinucleótido de ADN cromosómico, ADN de plásmido, ADNc, ADN artificial u otro ADN que codifica un péptido, polipéptido, proteína o molécula de ARN, y los elementos genéticos que flanquean la secuencia codificadora que está implicada en la regulación de expresión. El término "genoma" como se aplica a virus abarca toda la secuencia de ácido nucleico contenida dentro de la cápside del virus. El término "genoma" como se aplica a bacterias abarca tanto el cromosoma como los plásmidos dentro de una célula hospedero bacteriana. Los ácidos nucleicos codificadores de la presente invención introducidos en células hospedero bacterianas por lo tanto pueden ser ya sea integrados cromosómicamente o localizados en plásmidos. El término "genoma" como se aplica a células vegetales abarca no sólo ADN cromosómico encontrado dentro del núcleo, sino también a ADN de organelos encontrado dentro de componentes subcelulares de la célula. Los ácidos nucleicos de la presente invención introducidos en células vegetales por lo tanto pueden ser ya sea integrados cromosómicamente o localizados en organelos. "Glifosato" se refiere a N-fosfonometilglicina y sus sales, el glifosato es el ingrediente activo del herbicida Roundup® (Monsanto Co.). Los tratamientos de plantas con "glifosato" se refieren a tratamientos con la formulación de herbicida Roundup® o Roundup Ultra® a menos que se indique otra cosa. El glifosato como N-fosfonometilglicina y sus sales (herbicida Roundup® no formulado) son componentes de medios de cultivo sintéticos usados para la selección de bacterias y tolerancia de plantas a glifosato o usado para determinar resistencia a enzimas en pruebas bioquímicas In vitro. Secuencia de "ADN heterólogos" se refiere a una secuencia de polinucleótido que se origina a partir de una fuente extraña o especie o, si es de la misma fuente, es modificada de su forma original. "ADN homólogo" se refiere a ADN de la misma fuente que la célula receptora. "Hibridación" se refiere a la capacidad de una cadena de ácido nucleico para unirse con una cadena complementaria por medio de apareamiento de bases. La hibridación ocurre cuando secuencias complementarias en las dos cadenas de ácido nucleico se unen una con otra. Las sondas e iniciadores de ácido nucleico de la presente invención hibridan bajo condiciones astringentes a una secuencia de ADN objetivo. Cualquier método de hibridación o amplificación de ácido nucleico convencional se puede usar para identificar la presencia de ADN a partir de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o fragmentos de las mismas son capaces de hibridar específicamente a otras moléculas de ácido nucleico bajo ciertas circunstancias. Como se usa aquí, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente una a otra si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico de doble cadena antiparalela. Una molécula de ácido nucleico se dice que es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si presenta complementariedad completa. Como se usa aquí, se dice que las moléculas presentan "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridar una a otra con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan templadas una a la otra por lo menos bajo condiciones de "baja astringencia" convencional. De manera similar, se dice que las moléculas son "complementarias" si pueden hibridar una a otra con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan templadas una a otra bajo condiciones de "alta astringencia" convencionales. Las condiciones de astringencia convencionales se describen en Sambrook ef al., 1989, y en Haymes ef al., In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), incorporada aquí por referencia en su totalidad. Desviaciones de complementariedad completa por lo tanto son permisibles, siempre que dichas desviaciones no impidan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura de doble cadena. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como un iniciador o sonda es necesario que sea suficientemente complementaria en secuencia para poder formar una estructura de doble cadena estable bajo el solvente particular y las concentraciones utilizadas. Como se usa aquí, una secuencia sustancialmente homologa es una secuencia de ácido nucleico que hibridará específicamente el complemento de la secuencia de ácido nucleico a la cual está siendo comparada bajo condiciones de alta astringencia. El término "condiciones astringentes" se define funcionalmente con respecto a la hibridación de una sonda de ácido nucleico a un ácido nucleico objetivo (es decir, a una secuencia de ácido nucleico particular de interés) por el procedimiento de hibridación específico descrito en Sambrook et al., 1989, en 9.52-9.55. Véase también, Sambrook et al., 1989 en 9.47-9.52, 9.56-9.58 incorporado aquí por referencia en su totalidad; Kanehisa, (Nucí. Acids Res. 12:203-213, 1984, incorporado aquí por referencia en su totalidad); y Wetmur y Davidson, (J. Mol. Biol. 31 : 349-370, 1988, incorporado aquí por referencia en su totalidad). Por consiguiente, las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden usar para su capacidad para formar selectivamente moléculas dobles con extensiones complementarias de fragmentos de ADN. Dependiendo de la aplicación contemplada, se desea utilizar condiciones de hibridación variables para lograr grados variables de selectividad de sonda hacia la secuencia objetivo. Para aplicaciones que requieren alta selectividad, típicamente, se deseará utilizar condiciones relativamente astringentes para formar los híbridos, v.gr., se seleccionará condiciones de sal relativamente baja y/o temperatura alta, tal como se provee por aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.15 M de NaCI a temperatura de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C. Una condición astringente, por ejemplo, es lavar el filtro de hibridación por lo menos dos veces con regulador de pH de lavado de alta astringencia (0.2X SSC, 0.1 % de SDS, 65°C). Condiciones de astringencia apropiadas que promueven hibridación de ADN, por ejemplo, 6.0 x de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por lavado de de 2.0 x SSC a 50°C, son conocidas por los expertos en la técnica o se pueden encontrar en Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en el paso de lavado se puede seleccionar a partir de una astringencia baja de aproximadamente 2.0 x SSC a 50°C a una astringencia alta de aproximadamente 0.2 x SSC a 50°C. Además, la temperatura en el paso de lavado se puede incrementar desde condiciones de astringencia baja a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, a condiciones de astringencia altas a aproximadamente 65°C. Tanto la temperatura como la sal se pueden variar, o ya sea la temperatura o la concentración de sal pueden mantenerse constantes mientras la otra variable se cambia. Dichas condiciones selectivas toleran poco, si acaso lo hay, desacoplamiento entre la sonda y la plantilla o cadena objetivo. La detección de secuencias de ADN mediante hibridación es bien conocida por los expertos en la técnica, y las enseñanzas de las patentes de E.U.A. Nos. 4,965,188 y 5,176,995 son ilustrativas de los métodos de análisis de hibridación. "Identidad" se refiere al grado de similitud entre dos secuencias de ácidos nucleicos o proteínas. Una alineación de las dos secuencias se realiza mediante un programa de computadora adecuado. El programa de computadora ampliamente usado y aceptado para realizar alineaciones de secuencia es CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nucí. Acids Res., 22:4673-4680, 1994). El número de bases o aminoácidos de apareamiento se divide entre el número total de bases o aminoácidos y se multiplica por 100 para obtener un por ciento de identidad. Por ejemplo, si dos secuencias de 580 pares de bases tuvo 145 bases pareadas, serían 25 por ciento idénticas. Si las dos secuencias comparadas son de diferentes longitudes, el número de apareamientos se divide entre la más corta de las dos longitudes. Por ejemplo, si hay 100 aminoácidos pareados entre una proteína de 200 y una de 400 aminoácidos, son 50 por ciento idénticas con respecto a la secuencia más corta. Si la secuencia más corta es menor que 150 bases o 50 aminoácidos de longitud, el número de apareamientos se divide entre 150 (para bases de ácidos nucleicos) o 50 (para aminoácidos), y se multiplica por 100 para obtener un por ciento de identidad. Como se describe aquí, una proteína puede ser "sustancialmente idéntica" a proteínas relacionadas. Estas proteínas con identidad sustancial generalmente comprenden por lo menos una secuencia de polipéptido que tiene por lo menos noventa y ocho por ciento de identidad de secuencia en comparación con su otra secuencia de polipéptido relacionada. El programa WISCONSIN PACKAGE versión 10.0-UNIX de Genetics Computer Group, Inc. se basa en el método de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970) que usa el conjunto de parámetros por omisión para comparación de bases (para comparación de secuencia de aminoácidos: sanción de creación de espacio = 8, sanción de extensión de espacio = 20); o mediante el uso del programa TBLASTN en el software BLAST 2.2.1 (Altschui et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), con el uso de una matriz BLOSUIVI62 (Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89:10915-10919, 1992) y el conjunto de parámetros por omisión para comparación por bases (costo de creación de espacio) = 11 , costo de extensión de espacio = 1). En BLAST, el valor de E, o el valor de expectación representa el número de alineaciones diferentes con puntuaciones equivalentes a o mejores que la puntuación de alineación en bruto, S, que se espera que ocurran en una búsqueda de base de datos por probabilidad. Mientras menor sea el valor de E, más significativo es el apareamiento. Debido a que el tamaño de la base de datos es un elemento en cálculos de valor de E, los valores de E obtenidos por "BLASTing" contra bases de datos públicas, tales como GenBank, generalmente han incrementado con el tiempo para cualquier apareamiento de búsqueda/entrada dada. El por ciento de identidad se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos idénticamente pareados que existe a lo largo de la longitud de aquella porción de las secuencias que está alineada por el algoritmo de BLAST. "Intrón" se refiere una porción de un gen no traducido en proteína, aun cuando sea transcrito a ARN. Una secuencia de ácido nucleico (aislada) es sustancialmente separada o purificada de otras secuencias de ácido nucleico con las cuales el ácido nucleico está normalmente asociado en la célula del organismo en el cual ocurre naturalmente el ácido nucleico, es decir, otro ADN cromosómico o extracromosómico. El término abarca ácidos nucleicos que son bioquímicamente purificados para remover sustancialmente ácidos nucleicos contaminantes y otros componentes celulares. El término también abarca ácidos nucleicos recombinantes y ácidos nucleicos químicamente sintetizados. Polipéptidos "aislados", "purificados, "homogéneos". Un polipéptido es "aislado" si ha sido separado de los componentes celulares (ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos y otros polipéptidos) que naturalmente lo acompañan o que es químicamente sintetizado o un recombinante. Un polipéptido monomérico es aislado cuando por lo menos 60% en peso de una muestra está compuesta del polipéptido, preferiblemente 90% o más, muy preferiblemente 95% o más, y muy preferiblemente aún más de 99%. La pureza u homogeneidad de proteína está indicada, por ejemplo, por electroforesis de gel de poiiacrilamida de una muestra de proteína, seguido por visualización de una sola banda de polipéptido bajo tinción del gel de poiiacrilamida; cromatografía de líquidos de alta presión; u otros métodos convencionales. Las proteínas pueden ser purificadas por cualesquiera medios conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe en Guide to Protein Purification, ed. Deutscher, Meth. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, 1990; y Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer Verlag, New York, 1982. "Mareaje" o "marcado". Existe una variedad de métodos y reactivos convencionales para marcar polinucleótidos y polipéptidos y fragmentos de los mismos. Los marcadores típicos incluyen isótopos radioactivos, ligandos o receptores de ligandos, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes y enzimas. Los métodos para marcar y guiar en la elección de marcadores apropiados para varios propósitos se describen, v.gr., en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989) y Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York, (1992). "Región codificadora de proteína madura", ese término se refiere a la secuencia de un producto de proteína procesado, es decir, una EPSP sintasa madura que queda después de que el péptido de tránsito de cloroplasto ha sido removido. "Nativo". El término "nativo" generalmente se refiere a un ácido nucleico o un polipéptido que ocurre naturalmente ("de tipo silvestre"). Sin embargo, en el contexto de la presente invención, alguna modificación de un poiinucleótido y polipéptido aislado puede haber ocurrido para proveer un polipéptido con un fenotipo particular, v.gr., sustitución de aminoácido en EPSPS sensible al glifosato para proveer un EPSPS resistente al glifosato. Para propósitos comparativos en la presente invención, el poiinucleótido aislado que contiene pocos nucleótidos sustituidos para proveer modificación de aminoácidos para tolerancia a herbicidas se refiere como el poiinucleótido "nativo" cuando se compara con el poiinucleótido sustancialmente divergente creado por los métodos de la presente invención. Sin embargo, el poiinucleótido "nativo" modificado de esta manera es no nativo con respecto a los elementos genéticos normalmente encontrados enlazados a un poiinucleótido no modificado que ocurre naturalmente. Región N-terminal" se refiere a una región de una cadena de péptido, polipéptido o proteína del aminoácido que tiene un grupo amino libre a la mitad de la cadena. "Acido nucleico" se refiere a ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Códigos de ácido nucleico: A = adenosina; C = citosina; G = guanosina; T = timidina. Códigos usados para síntesis de oligonucleótidos: N - equimolar A, C, G, y T; I = desoxiinosina; K = equimolar G y T; R = equimolar A y G; S = equimolar C y G; W = equimolar A y T; Y = equimolar C y T. Un "segmento de ácido nucleico" o un "segmento de molécula de ácido nucleico" es una molécula de ácido nucleico que ha sido aislada libre de ADN genómico total de una especie particular, o que ha sido sintetizada. Incluidos con el término "segmento de ácido nucleico" son segmentos de ADN, vectores recombinantes, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus, etc. "Variantes de secuencia de nucleótidos". Usando métodos bien conocidos, los expertos en la técnica puede producir fácilmente variantes de secuencia de nucleótidos y aminoácidos de genes y proteínas, respectivamente. Por ejemplo, moléculas de ADN "variantes" de la presente invención son moléculas de ADN que contienen cambios en la secuencia de genes de EPSPS, es decir, cambios que incluyen uno o más nucleótidos de la secuencia de genes EPSPS es deletado, añadido y/o sustituido, de tal manera que el gen EPSPS variante codifica una proteína que retiene actividad de EPSPS. Las moléculas de ADN variantes se pueden producir, por ejemplo, mediante técnicas de mutagénesis de ADN estándares o mediante síntesis química de la molécula de ADN variante o una porción de la misma. Los métodos para síntesis química de ácidos nucleicos se describen, por ejemplo, en Beaucage et al., Tetra. Letts. 22:1859-1862 (1981 ), y Matteucci eí al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185- (1981). La síntesis química de ácidos nucleicos se puede realizar, por ejemplo, en sintetizadores de oligonucleótidos automatizados. Dichas variantes preferiblemente no cambian el marco de lectura de la región codificadora de proteína del ácido nucleico y preferiblemente codifican una proteína que no tiene cambio, o sólo una reducción menor. "Marco de lectura abierto (ORF)" se refiere a una región de ADN o ARN que codifica un péptido, polipéptido o proteína. Operablemente ligado". Una primera secuencia de ácido nucleico es "operablemente" ligado con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico es colocada en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor es operablemente ligado a una secuencia codificadora de proteína si el promotor efectúa la transcripción o expresión de la secuencia codificadora. Generalmente, secuencias de ADN operablemente ligadas son continuas y, cuando es necesario se unen dos regiones codificadoras de proteína, en un marco de lectura. "Sobreexpresión" se refiere a la expresión de un ARN o polipéptido o proteína codificada por un ADN introducido en una célula hospedero, en donde el ARN o polipéptido o proteína ya sea no está normalmente presente en la célula hospedero o en donde el ARN o polipéptido o proteína está presente en dicha célula hospedero a un nivel mayor que el normalmente expresado a partir del gen endógeno que codifica el ARN o polipéptido o proteína. El término "planta" abarca cualquier planta superior y progenie de la misma, incluyendo monocotiledóneas (v.gr., maíz, arroz, trigo, cebada, etc.), dicotiledóneas (v.gr., soya, algodón, cañóla, tomate, papa, Arabidopsis, tabaco, etc.), gimnospermas (pinos, abetos, cedros, etc.) e incluye partes de plantas, incluyendo unidades reproductoras de una planta (v.gr., semillas, bulbos, tubérculos, frutos, flores, etc.) u otras partes o tejidos a partir de los cuales se puede reproducir la planta. "Cassette de expresión de la planta" se refiere a segmentos de ADN quiméricos que comprenden elementos reguladores que están operablemente ligados para proveer la expresión de un producto de transgén en plantas. "Plásmido" se refiere a una pieza de ADN auto-replicadora, extracromosómica, circular. "Señal de poliadenilación" o "señal poliA" se refiere a una secuencia de ácido nucleico ubicada 3' a una región codificadora que causa la adición de nucleotidos de adenilato al extremo 3' del ARNm transcrito a partir de la región codificadora. "Reacción de cadena de polimerasa (PCR)" se refiere a un método de amplificación de ADN que usa una técnica enzimática para crear múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico (amplicón). Copias de molécula de ADN se preparan entremezclando una ADN polimerasa entre dos amplímeros. La base de este método de amplificación es ciclos múltiples de cambios de temperatura para desnaturalizar, después re-templar amplímeros (moléculas de iniciador de ADN), seguido por extensión para sintetizar nuevas cadenas de ADN en la región ubicada entre los amplímeros de flanqueo. La amplificación de ácido nucleico se puede lograr por cualquiera de los diversos métodos de amplificación de ácido nucleico conocidos en la técnica, incluyendo la reacción de cadena de polimerasa (PCR). Una variedad de métodos de amplificación son conocidos en la técnica y se describen, entre otros, en las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202 y en PCR Protocois: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis eí al., Academic Press, San Diego, 1990. Los métodos de amplificación de PCR se han desarrollado para amplificar hasta 22 kb de ADN genómico y hasta 42 kb de ADN de bacteriófago (Cheng eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 91 :5695-5699, 1994). Estos métodos así como otros métodos conocidos en la técnica de amplificación de ADN se pueden usar en la práctica de la presente invención. Polinucleótido se refiere a una longitud de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) mayor que dos, que son conectadas para formar una molécula más grande. Fragmentos de polipéptido. La presente invención también abarca fragmentos de una proteína que carece por lo menos de un residuo de una proteína de longitud completa nativa, pero que sustancialmente mantiene la actividad de la proteína. El término "promotor" o "región promotora" se refiere a una molécula de ácido polinucleico que funciona como un elemento regulador, generalmente encontrado hacia el extremo 5' a una secuencia codificadora, que controla la expresión de la secuencia codificadora al controlar la producción de ARN mensajero (ARNm) al proveer el sitio de reconocimiento para ARN polimerasa y/u otros factores necesarios para iniciar la transcripción en el sitio correcto. Como se contempla aquí, un promotor o región promotora incluye una variación de promotores derivados por medio de ligación a varias secuencias reguladoras, mutagénesis aleatoria o controlada y adición o duplicación de secuencias ¡ncrementadoras. La región promotora que aquí se describe y equivalentes biológicamente funcionales de la misma, son responsables de impulsar la transcripción de secuencias codificadoras bajo su control cuando se introducen en un hospedero como parte de un vector recombinante adecuado, como se demuestra por su capacidad para producir ARNm. "Recombinante". Un ácido nucleico "recombinante" se hace mediante una combinación de dos segmentos de otra manera separados de secuencia, v.gr., mediante síntesis química o por la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos por técnicas de ingeniería genética. El término "construcción de ADN recombinante" o "vector recombinante" se refiere a cualquier agente tal como un plásmido, cósmido, virus, secuencias autónomamente replicadora, fago, o secuencia de nucleótido de ADN o ARN de una sola cadena o doble cadena lineal o circular, derivado de cualquier fuente, capaz de integración genómica o replicación autónoma, que comprende una molécula de ADN que una o más secuencias de ADN han sido ligadas de una manera funcionalmente operativa. Dichas construcciones de ADN o vectores recombinantes son capaces de introducir una secuencia reguladora o región promotora 5' y una secuencia de ADN para un producto de gen seleccionado en una célula de tal manera que la secuencia de ADN es transcrita a un ARNm funcional que es traducido y posteriormente expresado. Las construcciones de ADN recombinantes o vectores recombinantes se pueden construir para ser capaces de expresar ARN de antisentido, a fin de inhibir la traducción de un ARN específico de interés. "Regeneración" se refiere al proceso de hacer crecer una planta a partir de una célula vegetal (v.gr., protoplasto o explante vegetal). "Reporteros" se refiere a un gen y producto de gen correspondiente que cuando se expresa en organismos transgénicos produce un producto detectable por métodos químicos o moleculares o produce un fenotipo observable. "Resistencia" se refiere a una enzima que es capaz de funcionar en presencia de una toxina, por ejemplo, EPSP sintasas de clase II resistentes a glifosato. Una enzima que tiene resistencia a una toxina puede tener la función de destoxificar la toxina, v.gr., la fosfinotricina acetiltransferasa, glifosato oxidoreductasa, o puede ser una enzima mutante que tenga actividad catalítica que no sea afectada por un herbicida que altere a misma actividad en la enzima de tipo silvestre, v.gr., acetolactato sintasa, EPSP sintasas de clase 1 mutantes. "Enzima de restricción" se refiere a una enzima que reconoce una secuencia palindrómica específica de nucleótidos en ADN de doble cadena y digiere ambas cadenas; también llamada una endonucleasa de restricción. La digestión típicamente ocurre dentro del sitio de restricción. "Marcador seleccionable" se refiere a una molécula de ácido polinucleico que codifica una proteína, que confiere un fenotipo que facilita la identificación de células que contienen la molécula de ácido polinucleico. Los marcadores seleccionares incluyen aquellos genes que confieren resistencia a antibióticos (v.gr., ampicilina, kanamicina), complemento de una deficiencia nutricional (v.gr., uracilo, histidina, leucina), o imparten una característica visualmente distinguible (v.gr., cambios de color o fluorescencia). Los genes marcadores seleccionabas dominantes incluyen genes que codifican genes de resistencia a antibióticos (v.gr., neoimicina fosfotransferasa, aad); y genes de resistencia a herbicidas (v.gr., fosfonotricina acetiltransferasa, EPSP sintasa de clase II, EPSP sintasa de clase I modificada). Una estrategia útil para la selección de transformantes para resistencia a herbicidas se describe, v.gr., en Vasil, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vols. I— I II, Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, New York (1984). El término "específico para (una secuencia objetivo)" indica que una sonda de ADN o iniciador de ADN híbrida bajo condiciones de hibridación sólo a la secuencia de objetivo en una muestra que comprende la secuencia objetivo. El término "substancialmente purificado", como se usa aquí, se refiere a una molécula separada de otras moléculas normalmente asociadas con la misma en su estado nativo. Muy preferiblemente, una molécula substancialmente purificada es la especie predominante presente en una preparación. Una molécula substancialmente purificada puede ser mayor que 60% libre, preferiblemente 75% libre, muy preferiblemente 90% libre de las otras moléculas (exclusivas de solventes) presentes en la mezcla natural. El término "substancialmente purificadas" no pretende abarcar moléculas presentes en su estado nativo. "Tolerante" o "tolerancia" se refiere a un efecto reducido a un agente biótico o abiótico sobre el crecimiento y desarrollo de organismos y plantas, v.gr., una plaga o un herbicida. "Transcripción" se refiere a un proceso de producir una copia de ARN a partir de una plantilla de ADN. "Transformación" se refiere a un proceso de introducir una molécula de ácido nucleico exógena (v.gr., una construcción de ADN, una molécula de ácido polinucleico recombinante) en una célula o protoplasto y esa molécula de ácido polinucleico exógena es incorporada en un cromosoma o es capaz de replicación autónoma. "Transformada" o "transgénica" se refiere a una célula, tejido, órgano, u organismo en el cual es introducido un ácido polinucleico extraño, tal como un vector de ADN o molécula de ácido nucleico recombinante. Una célula u organismo "transgénico" o "transformado" también incluye una progenie de la célula u organismo y progenie producida a partir de un programa de reproducción que emplea dicha planta "transgénica" como un progenitor en una cruza y que presenta un fenotipo alterado que resulta de la presencia de la molécula de ácido polinucleico extraña. El término "transgén" se refiere a cualquier molécula de ácido polinucleico no nativa a una célula u organismo transformada en la célula u organismo. "Transgen" también abarca las partes componentes de un gen de planta nativo modificado por la inserción de una molécula de ácido polinucleico no nativa mediante recombinación dirigida o mutación específica del sitio. Moléculas de "péptido de tránsito" o "péptido objetivo", estos términos generalmente se refieren a moléculas de péptido que cuando se enlazan a una proteína de interés dirigen la proteína a un tejido, célula, lugar subcelular, u organelo celular particular. Algunos ejemplos incluyen pero no se limitan a péptidos de tránsito de cloropiasto, señales objetivo nucleares y señales vacuolares. El péptido de tránsito de cloropiasto es de particular utilidad en la presente invención para dirigir la expresión de la enzima EPSPS al cloroplasto. El término "traducción" se refiere a la producción del producto de gen correspondiente, es decir, un péptido, polipéptido, o proteína a partir de un ARNm. "Vector" se refiere a un plásmido, cósmido, becteriófago o virus que porta ADN extraño en un organismo hospedero.

Polinucleótidos Los métodos de la presente invención incluyen diseñar genes que confieren un rasgo de interés a la planta en la cual son introducidos. Los transgenes de interés agronómico que proveen rasgos agronómicos benéficos a plantas de cultivo, por ejemplo, incluyendo pero sin limitarse a elementos genéticos que comprende resistencia a herbicidas (Patente de E.U.A. No. 5,633,435; Patente de E.U.A. No. 5,463,175), rendimiento incrementado (Patente de E.U.A. No. 5,716,837), control de insectos (Patente de E.U.A. No. 6,063,597; Patente de E.U.A. No. 6,063,756; Patente de E.U.A. No. 6,093,695; Patente de E.U.A. No. 5,942,664; Patente de E.U.A. No. 6,110,464), resistencia a enfermedades causadas por hongos (Patente de E.U.A. No. 5,516,671 ; Patente de E.U.A. No. 5,773, 696; Patente de E.U.A. No. 6,121 ,436; y Patente de E.U.A. No. 6,316,407, y Patente de E.U.A. No. 6,506,962), resistencia a virus (Patente de E.U.A. No. 5,304,730 y Patente de E.U.A. No. 6,013,864), resistencia a nemátodos (Patente de E.U.A. No. 6,228,992), resistencia a enfermedad bacteriana (Patente de E.U.A. No. 5,516,671), producción de almidón (Patente de E.U.A. No. 5,750,876 y Patente de E.U.A. No. 6,476,295), producción de aceites modificados (Patente de E.U.A. No. 6,444,876), producción de aceite alta (Patente de E.U.A. No. 5,608,149 y patente de E.U.A. No. 6,476,295), contenido de ácidos grasos modificado (Patente de E.U.A. No. 6,537,750), producción de proteína alta (Patente de E.U.A. No. 6,380,466), maduración de frutos (Patente de E.U.A. No. 5,512,466), nutrición animal y humana incrementada (Patente de E.U.A. No. 5,985,605 y Patente de E.U.A. No. 6,171 ,640, biopolímeros (Patente de E.U.A. No. 5,958,745 y Publicación de Patente de E.U.A. No. US20030028917), resistencia a estrés ambiental (Patente de E.U.A. No. 6,072,103), péptidos farmacéuticos (Patente de E.U.A. No. 6,080,560), rasgos de procesamiento mejorados (Patente de E.U.A. No. 6,476,295), capacidad de digestión mejorada (Patente de E.U.A. No. 6,531 ,648), bajo contenido de rafinosa (Patente de E.U.A. No. 6,166,292), producción de enzima industrial (Patente de E.U.A. No. 5,543,576), sabor mejorado (Patente de E.U.A. No. 6,011 ,199), fijación de nitrógeno (Patente de E.U.A. No. 5,229,114), producción de semillas híbridas (Patente de E.U.A. No. 5,689,041), y producción de biocombustible (Patente de E.U.A. No. 5,998,700), los elementos genéticos y trangenes descritos en las patentes listadas anteriormente se incorporan aquí por referencia. Los herbicidas para los cuales se ha demostrado la tolerancia de la planta trangénica y se puede aplicar el método de la presente invención incluyen pero no se limitan a: herbicidas de glifosato, glufosinato, sulfonilureas, ¡midazolínonas, bromoxinil, delapón, ciclohexanodiona, inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa y isoxaflutol. Las moléculas de polinucleótido que codifican proteínas implicadas en tolerancia a herbicidas son conocidas en la técnica e incluyen pero no se limitan a una molécula de polinucleótido que codifica 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS, descrita en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,627,061 , 5,633,435, 6,040,497; Padgette et al. Herbicide Resistant Crops, Lewis Publishers, 53-85, 1996; y Penaloza-Vazquez, et al. Plant Cell Reports 14:482-487, 1995; y aroA (Patente de E.U.A. No. 5,094,945) para tolerancia a glifosato; bromoxinil nitrilasa [Bxn) para toleranacia a bromoxinil (Patente de E.U.A. No. 4,810,648); fitoeno desaturasa (crtl; Misawa et ai, (1993) Plant J. 4:833-840, y (1994) Plant J. 6:481-489; para tolerancia a norflurazon, acetohidroxiácido sintasa (AHAS , aka ALS, Sathasiivan eí al. Nucí. Acids Res. 18:2188-2193, 1990); y el gen bar para tolerancia a glufosinato y bilafos (DeBlock, et al. EMBO J. 6:2513-2519, 1987). La tolerancia a herbicidas es un fenotipo deseable para plantas de cultivo. La N-fosfonometilglicina, también conocida como glifosato, es un herbicida bien conocido que tiene actividad en un amplio espectro de especies de plantas . El glifosato es el ingrediente activo de Roundup® (Monsanto Co.), un herbicida seguro que tiene una vida media deseablemente corta en el ambiente. Cuando se aplica sobre la superficie de una planta, el glifosato se mueve sistémicamente a través de la planta. El glifosato es tóxico para las plantas al inhibir la vía del ácido shikimico, que provee un precursor para la síntesis de amino aromáticos. Específicamente, el glifosato afecta la conversión de fosfoenolpiruvato y ácido 3-fosfoshikímico a ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshikimico al inhibir la enzima 5-enolpiruvil-3-fosfoshikimato sintasa (de aquí en adelante preferida como EPSP sintasa o EPSPS). Para los propósitos de la presente invención, el término glifosato " debe considerarse para incluir cualquier forma herbicidamente efectiva de N-fosfonometilglicina (incluyendo cualquier sal de la misma) y otras formas que den por resultado la producción del anión del glifosato in planta. A través de los métodos de ingeniería genética en plantas, es posible producir plantas tolerantes a glifosato al insertar en el genoma de la planta una molécula de ADN que cause la producción de niveles mayores de EPSPS de tipo silvestre (Shah et al., Science 233:478-481 , 1986). La tolerancia al glifosato también se puede lograr mediante la expresión de variantes de EPSPS que tienen afinidad inferior para glifosato y por lo tanto retienen su capacidad catalítica en presencia de glifosato (Patente de E.U.A. No. 5,633,435). Las enzimas que degradan glifosato en tejidos vegetales (Patente de E.U.A. No. 5,463,175) también son capaces de conferir tolerancia celular al glifosato. Dichos genes, por lo tanto, permiten la producción de cultivos trangénicos que sean tolerantes a glifosato, permitiendo así que el glifosato se use para el control efectivo de malezas con una mínima preocupación de daño al cultivo. Por ejemplo, la tolerancia al glifosato se ha manipulado por ingeniería genética en maíz (Patente de E.U.A. No. 5,554,798, 6, 040,497), trigo (Zhou et al. Plant Cell Rep. 15:159-163, 1995), soya (WO 9200377 ) y cañóla (WO 9204449). Se han aislado variantes de la enzima EPSPS de tipo silvestre que son resistentes al glifosato como resultado de alteraciones en la secuencia de codificación de aminoácidos (Kishore et al., Annu. Rev. Biochem. 57:627-663, 1988; Schulz et al., Arch. Microbiol. 137:121-123, 1984; Sost et al., FEBS Lett. 173:238-241 , 1984; Kishore et al., In "Biotechnology for Crop Protection" ACS Symposium Series No. 379. eds. Hedlin et al., 37-48, 1998). Estas variantes típicamente tienen un K¡ superior para glifosato que la enzima EPSPS de tipo silvestre que confiere el fenotipo tolerante al glifosato, pero estas variantes también se caracterizan por un Km alto para PEP que hace a la enzima eméticamente menos eficiente. Por ejemplo, el Km aparente para PEP y el K¡ aparente para glifosato para la EPSPS nativa de E. Coll son 10 µ y 0.5 µ? mientras que para un aislado resistente al glifosato que tiene una sola sustitución de aminoácido de una alanina para la glicina en la posición 96 estos valores son 220 µ? y 4.0 m , respectivamente. La patente de E.U.A. No. 6,040,497 reporta que la mutación conocida como la mutación TIPS (una substitución de isoleucina para la treonina en la posición de aminoácido 02 y una substitución de serina para la prolina en la posición de aminoácido 206) comprende dos mutaciones cuando se introducen en la secuencia de polipéptido de EPSPS de Zea mays confiere a la enzima resistencia a! glifosato. Las plantas transgénicas que contienen esta enzima muíante son tolerantes al glifosato. Las mutaciones idénticas se pueden hacer en enzimas EPSPS sensibles al glifosato a partir de otras fuentes vegetales para crear enzimas resistentes del glifosato. Una variedad de enzimas EPSPS nativas y variantes se han expresado en plantas trangénicas para conferir tolerancia al glifosato (Singh, et al., en "Byosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants", Amer Soc Plant Phys. Pubs., 1992). Ejemplos de algunas de estas EPSPS incluyen aquellas descritas y/o aisladas en conformidad con Patente de E.U.A. No. 4,940,835, Patente de E.U.A. No. 4,971 ,908, Patente de E.U.A. No. 5,145,783, Patente de E.U.A. No. 5,188,642, Patente de E.U.A. No. 5,310,667, y Patente de E.U.A. No. 5,312,910. También se pueden derivar de una clase estructuralmente distinta de genes de EPSPS no homólogos, tales como los genes de EPSPS de clase II aislados de la cepa CP4 de Agrobacterium como se describe en Patente de E.U.A. No. 5,633,435 y Patente de E.U.A. No. 5,627,061. Los péptidos de tránsito de cloroplastos (CTP) son manipulados por ingeniería genética para ser fusionados al N-terminal de la EPSPS bacteriana para dirigir las enzimas resistentes ai glifosato en el cloroplasto de la planta. En la EPSPS de planta nativa, las regiones de péptido de tránsito de cloroplasto están contenidas en la secuencia de codificación nativa (v. gr., CTP2, Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:47-442, 1987, incorporado aquí por referencia en su totalidad ). La CTP nativa puede ser substituida por una CTP heteróloga durante la construcción de un cassette de expresión en planta transgénica. Muchas proteínas ecualizadas en cloroplasto, incluyendo EPSPS, se expresan a partir de genes nucleares como precursores y son dirigidas al cloroplasto por el péptido de tránsito de cloroplasto (CTP) que es removido durante los pasos de importación. Ejemplos de dichas proteínas de cloroplasto incluyen la subunidad pequeña (SSU) de ribulosa-1 ,5,-bisfosfato carboxiiasa, ferredoxina oxidorreductasa, proteína I y proteína II del complejo de cosecha en la luz, y tiorredoxina F. Se ha demostrado in vivo e in vitro que las proteínas que no son de cloroplasto pueden ser dirigidas al cloroplasto mediante el uso de fusiones de proteína con un CTP y que una secuencia de CTP es suficiente para dirigir una proteína al cloroplasto. Se ha mostrado que la incorporación de un péptido de tránsito de cloroplasto adecuado, tal como el EPSPS CTP de Arabidopsis thaliana (Klee eí al., Mol. Gen. Genet, 210:437-442 (1987), y el EPSPS CTP de Petunia híbrida (della-Cioppa et al., Proc. Nati. Acad-Sci. E.U.A. 83:6873-6877 (1986), dirige secuencias de proteína EPSPS heterólogas a cloroplastos en plantas transgénicas. La producción de plantas tolerantes al glifosato mediante la expresión de una proteína de fusión que comprende un CTP amino-terminal con una enzima EPSPS resistente al glifosato es bien conocida por los expertos en la técnica (Patente de E.U.A. No. 5,627,061 , Patente de E.U.A. No. 5,633,435, Patente de E.U.A. No. 5,312,910, EP 0218571 , EP 189707, EP 508909 y EP 924299). Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden hacer varias construcciones quiméricas que utilicen la funcionalidad de un CTP particular para importar enzimas EPSPS resistentes al glifosato hacía el cloroplasto de la célula de la planta.

Se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de los polinucleótidos de la invención y aún así obtener una molécula que codifique una proteína o péptido funcional con características deseables. El siguiente es un método basado en la substitución del codón(es) de un primer polinucleótido para crear un equivalente, o incluso un polinucleótico artificial de segunda generación mejorado, en donde este nuevo polinucleótico artificial es útil en métodos de apilamiento de genes transgénicos y expresión incrementada. Se contempla que las substituciones de codones en el polinucleótido de segunda generación en algunos casos puede dar por resultado por lo menos un aminoácido diferente que el del primer polinucleótido. La substitución de aminoácido puede proveer una característica mejorada a la proteína, v.gr., una EPSP sintasa resistente a glifosato, o puede ser un cambio conservado que no afecte substancialmente las características de la proteína. El método provee un polinucelótido artificial creado por retrotraducción de una secuencia de polipéptido a un polinucleótido usando un cuadro de uso de codones, seguido por pasos para incrementar características del poplipéptido artificial que lo hacen particularmente útil en plantas trangénicas. En modalidades particulares de la invención, los polipéptidos modificados que codifican proteínas resistentes a herbicidas se contempla que son útiles para por lo menos uno de los siguientes: para conferir tolerancia a herbicidas en una planta transformada o trangénica, para mejorar la expresión de genes resistentes a herbicidas, para usarse como marcadores seleccionares para la introducción de otros rasgos de interés en una planta, para evitar recombinación con un gen de planta endógeno similar o transgén existente permitiendo además el apilamiento de genes sin silenciamiento de genes. Se sabe que el código genético es degenerado. Los aminoácidos y su codón(es) de ARN se listan a continuación en el Cuadro 1.

CUADRO 1 Aminoácidos y los codones de ARN que los codifican Aminoácido Codones Nombre completo, código de 3 letras; código de 1 letra Alanina; Ala; A GCA GCC GCG GCU Cisterna; cys; C UGC UGU Acido aspártico; Asp; D GAC GAU Acido glutámico; Glu; E GAA GAG Fenilalanina; Phe; F UUC UUU Glicina; Cly; G GGA GGC GGG GGU Histidina; His; H CAC CAU Isoleucina; He; I AUA AUC AUU Usina; Lys; K AAA AAG Leucina; Leu; L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina; Met; M AUG Asparagina; Asn; N AAC AAU Prolina; Pro; P CCA CCC CCG CCU Glutamina; Gln; Q CAA CAG Arginina; Arg; R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina; Ser; S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina; Thr; T ACA ACC ACG ACU Valina; Val; V GUA GUC GUG GUU Triptofano; Trp; W UGG Tirosina; Tyr; Y UAG UAU Los codones se describen en términos de bases de ARN v.gr., adenina, uracilo, guanina y citosina; es el ARNm el que es directamente traducido a polipéptidos. Se entiende que cuando se diseña un polinucleótido de ADN para usarse en una construcción, las bases del ADN serían substituidas, v.gr., timina en lugar de uracilo. Es deseable proveer plantas transgénicas que tengan múltiples fenotipos agronómicamente mejorados. Con frecuencia la tolerancia al herbicida se usa como un marcador seleccionable para ayudar en la producción de plantas trangénicas que pueden poseer genes adicionales de importancia agronómica. El apilamiento de los transgenes mediante métodos de reproducción tradicionales o por retransformación de una primera planta transgénica con un cassette de expresión de planta adicional puede incluir la introducción de genes o elementos genéticos que tengan secuencia de polinucleótido idéntica o casi idéntica. La progenie que contiene estos genes apilados puede ser susceptible a pérdida de expresión de genes debido a silenciamiento de genes. El método de la presente invención provee una molécula de polinucleótido modificada que codifica una proteína resistente a herbicidas. Las moléculas de polinucleótido están diseñadas para ser suficientemente divergentes en secuencia de polinucleótido de otras moléculas de polinucleótido que codifican la misma proteína de resistencia a herbicidas. Estas moléculas entonces pueden coexistir en la misma célula vegetal sin la preocupación de silenciamiento de genes. La secuencia de polinucleótido divergente se crea usando un cuadro de uso de codones construido a partir de las secuencias codificadoras conocidas de varias especies de plantas. Por ejemplo, los cuadros de uso de codones para Arabidopsisi thaliana, Zea mays, y Glycine max se pueden usar en el método para diseñar los polinucleótidos de la presente invención. Otros cuadros de uso de codones de otras plantas también pueden ser usados por los expertos en la técnica. El primer paso en el método para diseñar una nueva molécula de polinucleótido artificial que codifica una proteína de tolerancia a herbicida es el uso de un cuadro de uso de codones para determinar el por ciento de uso de codones en una especie vegetal para cada aminoácido de la proteóina de tolerancia a herbicida, seguido por reemplazo de por lo menos uno de cada ocho codones contiguos con un codón diferente seleccionado del cuadro de uso de codones y ajusfando el por ciento de uso de codones para cada aminoácido codificado por el polinucleótido para ser substancialmente el mismo por ciento de uso de codones encontrado en el cuadro de uso de codones. Pasos adicionales pueden incluir introducir un codón de interrupción de traducción en el segundo y tercer marcos de lectura abiertos de la nueva secuencia de polinucleótido; eliminar algunos codones de inicio de traducción en el segundo y tercer marcos de lectura abiertos; ajustar la relación de GC:AT local a aproximadamente 2:1 sobre un intervalo de aproximadamente 50 nucleótidos; alterar las señales de poliadenilación potenciales o sitios de empalme de intrón potenciales; remover por lo menos un sitio de enzima de restricción de seis nucleótidos contiguos o mayor; y comparar la identidad de secuencia del polinucleótido artifical nuevo a un polinucleótido existente que codifica la misma proteína o proteína similar por lo que la identidad de secuencia entre los dos polinucleótidos no es mayor que 85 por ciento.

Una retrotraducción de una secuencia de proteína a una secuencia de nucelótido se puede realizar usando un cuadro de uso de codones, tales como aquellos encontrados en SeqLab del Grupo de Computadora de Genética (GCG) u otros programas de análisis de ADN conocidos por los expertos en la técnica de análisis de ADN o como se provee en los cuadros 2, 3 y 4 de la presente invención. El cuadro de uso de codones para Arabidopsisi thaliana (Cuadro 2), Zea mays (Cuadro 3) y Glycine max (Cuadro 4) son ejemplos de cuadros que se pueden construir para especies de plantas, también se pueden construir cuadros de uso de codones que representen el uso de codones de monocotiledóneas o dicotiledóneas.

CUADRO 2 Cuadro de uso de codones de Arabidopsis thaliana Aminoácido Codón Número /1000 Fracción Gly GGG 188335.00 10.18 0.16 Gly GGA 443469.00 23.98 0.37 Gly GGT 409478.00 22.14 0.34 Gly GGC 167099.00 9.03 0.14 Glu GAG 596506.00 32.25 0.48 Glu GAA 639579.00 34.58 0.52 Asp GAT 683652.00 36.96 0.68 Asp GAC 31821 1.00 17.20 0.32 Val GTG 320636.00 17.34 0.26 Val GTA 185889.00 10.05 0.15 Val GTT 505487.00 27.33 0.41 Val GTC 235004.00 12.71 0.19 Ala GCG 162272.00 8.77 0.14 Ala GCA 323871.00 17.51 0.27 Ala GCT 521181.00 28.18 0.44 Ala GCC 189049.00 10.22 0.16 Arg AGG 202204.00 10.93 0.20 Arg AGA 348508.00 18.84 0.35 Ser AGT 260896.00 14.11 0.16 Ser AGC 206774.00 11.18 0.13 Lys AAG 605882.00 32.76 0.51 Lys AAA 573121.00 30.99 0.49 Asn AAT 418805.00 22.64 0.52 Asn AAC 385650.00 20.85 0.48 Met ATG 452482.00 24.46 1.00 He ATA 235528.00 12.73 0.24 lie ATT 404070.00 21.85 0.41 lie ATC 341584.00 18.47 0.35 Thr ACG 140880.00 7.62 0.15 Thr ACA 291436.00 15.76 0.31 Thr ACT 326366.00 17.65 0.34 Thr ACC 190135.00 10.28 0.20 Trp TGG 231618.00 12.52 1.00 End TGA 19037.00 1.03 0.43 Cys TGT 196601.00 10.63 0.60 Cys TGC 131390.00 7.10 0.40 End TAG 9034.00 0.49 0.20 End TAA 16317.00 0.88 0.37 Tyr TAT 276714.00 14.96 0.52 Tyr TAC 254890.00 13.78 0.48 Leu TTG 389368.00 21.05 0.22 Leu TTA 237547.00 12.84 0.14 Phe TTT 410976.00 22.22 0.52 Phe TTC 380505.00 20.57 0.48 Ser TCG 167804.00 9.07 0.10 Ser TCA 334881.00 18.11 0.20 Ser TCT 461774.00 24.97 0.28 Ser TCC 203174.00 10.99 0.12 Arg CGG 88712.00 4.80 0.09 Arg CGA 115857.00 6.26 0.12 Arg CGT 165276.00 8.94 0.17 Arg CGC 69006.00 3.73 0.07 Gln CAG 280077.00 15.14 0.44 Gln CAA 359922.00 19.46 0.56 His CAT 256758.00 13.88 0.62 His CAC 160485.00 8.68 0.38 Leu CTG 183128.00 9.90 0.11 Leu CTA 184587.00 9.98 0.11 Leu CTT 447606.00 24.20 0.26 Leu CTC 294275.00 15.91 0.17 Pro CCG 155222.00 8.39 0.17 Pro CCA 298880.00 16.16 0.33 Pro CCT 342406.00 18.51 0.38 Pro CCC 97639.00 5.28 0.11 CUADRO 3 Cuadro de uso de codones de Zea mavs Aminoácido Codón Número /1000 Fracción Gly GGG 8069.00 15.19 0.21 Gly GGA 7100.00 13.37 0.18 Gly GGT 7871.00 14.82 0.20 Gly GGC 15904.00 29.94 0.41 Glu GAG 22129.00 41.67 0.68 Glu GAA 10298.00 19.39 0.32 Asp GAT 11996.00 22.59 0.41 Asp GAC 17045.00 32.09 0.59 Val GTG 13873.00 26.12 0.38 Val GTA 3230.00 6.08 0.09 Val GTT 8261.00 15.55 0.23 Val GTC 11330.00 21.33 0.31 Ala GCG 1 1778.00 22.18 0.24 Ala GCA 8640.00 16.27 0.18 Ala GCT 1 1940.00 22.48 0.24 Ala GCC 16768.00 31.57 0.34 Arg AGG 7937.00 14.94 0.27 Arg AGA 4356.00 8.20 0.15 Ser AGT 3877.00 7.30 0.10 Ser AGC 8653.00 16.29 0.23 Lys AAG 22367.00 42.11 0.74 Lys AAA 7708.00 14.51 0.26 Asn AAT 6997.00 13.17 0.36 Asn AAC 12236.00 23.04 0.64 Met ATG 12841.00 24.18 1.00 lie ATA 3997.00 7.53 0.16 lie ATT 7457.00 14.04 0.31 He ATC 12925.00 24.34 0.53 Thr ACG 5665.00 10.67 0.22 Thr ACA 5408.00 10.18 0.21 Thr ACT 5774.00 10.87 0.22 Thr ACC 9256.00 17.43 0.35 Trp TGG 6695.00 12.61 1.00 End TGA 591.00 1.11 0.45 Cys TGT 2762.00 5.20 0.30 Cys TGC 6378.00 12.01 0.70 End TAG 411.00 0.77 0.32 End TAA 299.00 0.56 0.23 Tyr TAT 4822.00 9.08 0.31 Tyr TAC 10546.00 19.86 0.69 Leu TTG 6677.00 12.57 0.14 Leu TTA 2784.00 5.24 0.06 Phe TTT 6316.00 1.89 0.32 Phe TTC 13362.00 25.16 0.68 Ser TCG 5556.00 10.46 0.14 Ser TCA 5569.00 10.49 0.15 Ser TCT 6149.00 1 1.58 0.16 Ser TCC 8589.00 16.17 0.22 Arg CGG 4746.00 8.94 0.16 Arg CGA 2195.00 4.13 0.07 Arg CGT 31 13.00 5.86 0.10 Arg CGC 7374.00 13.88 0.25 Gln CAG 13284.00 25.01 0.64 Gln CAA 7632.00 14.37 0.36 His CAT 5003.00 9.42 0.39 His. CAC 7669.00 14.44 0.61 Leu CTG 13327.00 25.09 0.28 Leu CTA 3785.00 7.13 0.08 Leu CTT 8238.00 15.51 0.17 Leu CTC 12942.00 24.37 0.27 Pro CCG 8274.00 15.58 0.27 Pro CCA 7845.00 14.77 0.26 Pro CCT 7129.00 13.42 0.23 Pro CCC 7364.00 13.87 0.24 CUADRO 4 Cuadro de uso de codones de Glycine max Aminoácido Codón Número /1000 Fracción Gly GGG 3097.00 12.82 0.18 Gly GGA 5434.00 22.49 0.32 Gly GGT 5248.00 21.72 0.31 Gly GGC 3339.00 13.82 0.20 Glu GAG 8296.00 34.33 0.50 Glu GAA 8194.00 33.91 0.50 Asp GAT 7955.00 32.92 0.62 Asp GAC 4931.00 20.40 0.38 Val GTG 5342.00 22.11 0.32 Val GTA 1768.00 7.32 0.11 Val GTT 6455.00 26.71 0.39 Val GTC 2971.00 12.29 0.18 Ala GCG 1470.00 6.08 0.08 Ala GCA 5421.00 22.43 0.31 Ala GCT 6796.00 28.12 0.38 Ala GCC 4042.00 16.73 0.23 Arg AGG 3218.00 13.32 0.28 Arg AGA 3459.00 14.31 0.30 Ser AGT 2935.00 12.15 0.17 Ser AGC 2640.00 10.92 0.15 Lys AAG 9052.00 37.46 0.59 Lys AAA 6370.00 26.36 0.41 Asn AAT 5132.00 21.24 0.48 Asn AAC 5524.00 22.86 0.52 et ATG 5404.00 22.36 1 .00 lie ATA 3086.00 12.77 0.23 lie ATT 6275.00 25.97 0.47 lie ATC 3981.00 16.47 0.30 Thr ACG 1006.00 4.16 0.08 Thr ACA 3601.00 14.90 0.29 Thr ACT 4231.00 17.51 0.34 Thr ACC 3562.00 14.74 0.29 Trp TGG 2866.00 11.86 1 .00 End TGA 221.00 0.91 0.36 Cys TGT 1748.00 7.23 0.49 Cys TGC 1821.00 7.54 0.51 End TAG 143.00 0.59 0.23 End TAA 256.00 1.06 0.41 Tyr TAT 3808.00 15.76 0.51 Tyr TAC 3667.00 15.17 0.49 Leu TTG 5343.00 22.11 0.24 Leu TTA 2030.00 8.40 0.09 Phe TTT 4964.00 20.54 0.49 Los cuadros de uso de codones son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar en bases de datos de genes, v.gr., la base de datos Genbank. La base de datos de uso de codones es una versión www extendida de CUTG (uso de codones tabulado de Genbank). La frecuencia de uso de codones en cada organismo se puede buscar a través de este sitio de la red mundial World Wide Web (www) (Nakamura et al. Nucleic Acids Res. 28:292, 2000). En algunas modalidades de la invención, los pasos se pueden realizar en cualquier orden o en forma simultánea. Cualquiera o todos los pasos se pueden realizar en el diseño de un polinucleótido artificial de la invención. Cada paso se describe con detalle a continuación. Los codones diferentes para un aminoácido particular se deben distribuir en todo el polinucleótido basado en el porcentaje aproximado de uso de codones para especies particulares a partir de un cuadro de uso de codones. Se debe evitar la agregación local de codones idénticos. Por lo menos un codón es substituido para cada ocho codones contiguos a fin de proveer divergencia suficiente de secuencias de polinucleótido que codifican proteínas idénticas o similares. Excepto en donde se desea específicamente, v.gr., para proveer una enzima tolerante a herbicidas, la proteína codificada permanece sin cambiar al substituir un codón por otro codón que es traducido al mismo aminoácido que se lista en cuadro 1. En modalidades de la presente invención, se hace correcciones a la relación de GC:AT locales de un polinucleótido al ajusfar la relación de GC:AT local para que sea aproximadamente la misma relación que el polinucleótido de longitud completa, pero no mayor de 2X sobre un intervalo de aproximadamente 50 nucleótidos contiguos de la molécula de polinucleótido. El intervalo de relaciones de GC:AT de un polinucleótido que usa cuadros de uso de codones de plantas dicotiledóneas debe ser de aproximadamente de 0.9 a aproximadamente 1.3, y para plantas monocotiledóneas de 1.2 a aproximadamente 1.7. La relación de GC:AT local puede ser importante en el mantenimiento de la estructura secundaria apropiada de ARN. Las regiones que comprenden muchas bases de A+B consecutivas o bases de G+C se predice que tienen una mayor probabilidad para formar estructuras de pasador debido a autocomplementariedad. Por lo tanto, el reemplazo con un codón diferente reduciría la probabilidad de formación de estructura secundaria de autocomplementariedad, que se sabe que reduce la transcripción y/o traducción en algunos organismos. En la mayoría de los casos, los efectos adversos se pueden reducir al mínimo usando moléculas de polinucleótido que no contienen mas de cinco A+B o G+C consecutivos. La longitud máxima de trayectoria de GC local (sin ningún nucleótido de AT) no sería mayor de diez nucleótidos. Por lo tanto, los codones que codifican proteínas ricas en Gly, Ala, Arg, Ser y Pro pueden ser substituidos para evitar agregaciones largas de nucleótidos de GC. Los codones ricos en GC listados se pueden usar en combinación con los codones ricos en AT para los aminoácidos Lys, Asn, lie, Tyr, Leu, Phe y viceversa a una relación de GC:AT local correcta. Una verificación de identidad de secuencia que usa herramientas de alineación de secuencia de nucleótidos tal como el programa GAP (GCG, Madison, Wl) se puede hacer inmediatamente después de retrotraducción para asegurar que la secuencia generada tenga un grado apropiado de diversidad de secuencia. La secuencia de polinucleótido contigua mayor que 23 nucleótidos que tiene un cien por ciento de identidad de secuencia se debe eliminar al hacer substituciones de codones en estas longitudes de secuencia. Los codones de inicio de traducción (ATG del ADN, AUG en el ARNm) se presentan en el segundo marco de lectura (marco "b"), el tercer marco de lectura (marco "c"), y los marcos de lectura de reversa (marcos "d", "e", "f"). El segundo y tercer codones de inicio del marco pueden iniciar la traducción, sin embargo mucho menos eficientemente que el primero. Por lo tanto, si uno o dos AUG se encuentran cerca del extremo 5' de una molécula de ARNm en el marco "b" o "c" , sería benéfico eliminarlos en una región de polinucleótico que contiene por lo menos los primeros tres codones de et de un marco "a". También, si la secuencia de proteína no tiene mas de un Met en el marco "a", entonces elimina tantos como sean posibles de los marcos hacia adelante "b" o "c". Para realizar esto, por ejemplo, los codones para los aminoácidos Asp, Asn, Tyr, His en la proteína de interés seguido por cualquiera de los aminoácidos: Gly, Glu. Asp, Val o Ala, pueden ser substituidos para eliminar un codón de inicio en el segundo marco. La secuencia GATGGG codifica los aminoácidos Asp-Gly y forma un ATG en el marco de la lectura "b". Cuando la secuencia es modificada a GACGGG, el inicio de ATG es eliminado y la secuencia aún codifica Aso-Gly. Una estrategia similar se usa para eliminar codones de inicio en el marco de lectura "c". La combinación de un aminoácido seleccionado del grupo de Gly, Glu, Val, Arg, Lys, He, Thr, Cys, Tyr, Leu, Ser, His o Pro seguido por Trp puede dar por resultado la formación en ATG en el tercer marco de lectura del gen. En esta situación, el primer codón se puede cambiar para que tenga un nucleótido distinto de A en la tercera posición. La eliminación del codón ATG en la cadena de ADN complementaria del gen en marcos alternativos ("d", "e" y/o "f") sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína se puede lograr de una manera similar. Esta modificación reduce la probabilidad de traducción aun cuando el transgén es integrado en el genoma de una planta en una orientación que permite la transcripción del ARNm de complemento de reversa de un promotor de planta nativo. La traducción de cualquier marco de lectura de reversa se puede reducir al mínimo mediante la introducción de un codón de interrupción en todos los tres marcos de lectura de reversa como se describe a continuación. La creación de codones de interrupción para todos los tres marcos del ADN complementario se pueden lograr de la siguiente manera. El codón Leu (TTA y CTA) y Ser (TCA) produce tres codones de interrupción diferentes en la cadena de complemento de reversa. Si esos aminoácidos se pueden encontrar en el C-terminal de la proteína de interés, sus codones se pueden usar para generar interrupciones en la cadena complementaria en el marco de lectura "d". Para generar un codón de interrupción en el marco de lectura "e" de la cadena complementaria, se encuentran los aminoácidos Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, His, lie, Leu, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr, o Val seguidos por los aminoácidos Gln, His o Tyr de la proteína de interés. Por ejemplo, la secuencia de polinucleótido de GCCCAC que codifica para los aminoácidos Ala-His se puede modificar a GCTCAC. La secuencia de complementariedad GTGAGC, tendrá ahora un codón de interrupción de TGA mostrado en cursivas. Cuando la proteína de interés tiene un Ala, lie, Leu, Phe, Pro, Ser, Thr o Val seguido por un Arg, Asn, lie, Lys, Met o Ser, el marco de lectura de la cadena complementaria puede ser modificado para tener un codón de interrupción en el marco de lectura "f" de la cadena de complementariedad. La secuencia de polinucleótido ATATCT para lie y Ser puede ser modificada a ATCAGT para generar codón de interrupción en la cadena complementaria como se muestra en cursivas ACTG>4T. La combinación de codones Phe seguida por cualquiera de los codones para los aminoácidos Asn, lie, Lys, Met o Thr siempre genera un codón de interrupción de cadena complementaria "e" o T. Parar crear un codón de interrupción en el marco de lectura hacia adelante "b", el marco de lectura a debe terminar en los nucleótidos TA o TG. Se busca la proteína de interés para los aminoácidos lie, Leu, Met o Val en combinación de cualquiera de los siguientes aminoácidos Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, lie, Lys, Met, Ser, Thr o Val. Por ejemplo, si la secuencia de polinucleótido que codifica los aminoácidos Met-Ser en ATGTCT, puede ser modificada a ATGAGT para producir un codón de interrupción de TGA en el segundo marco de lectura. Para poder crear un codón de interrupción para el marco de lectura "c", el marco de lectura "a" debe tener el nucleótido T en tercera posición y el siguiente codón debe iniciar a partir de AA, AG o GA. Para encontrar codones adecuados para modificar, se busca la proteína de interés para cualquiera de los aminoácidos: Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gly, His, lie, Leu, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr o Val seguido por cualquiera de los aminoácidos Arg, Asn, Asp, Glu, Lys, o Ser. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos para los aminoácidos Gly-Glu es GGAGAG, la secuencia puede ser modificada a GGTGAG, para crear un codón de interrupción TGA en el tercer marco de lectura. Otra modificación útil en métodos de diseño de polinucleótido artificial de la presente invención es eliminar sitios de restricción no deseados y otros patrones de secuencia específicos. Los sitios de restricción pueden interferir con futura clonación y manipulaciones de genes. Por ejemplo, algunos sitios de restricción comúnmente usados en la clonación de genes incluyen pero no se limitan a las enzima de restricción de tipo II con 6 o más bases no nitrogenadas listadas en el Cuadro 5 abajo del cual está un extracto de la base de datos de endonucleasa de restricción de New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA, E.U.A.). La búsqueda para sitios de reconocimiento de enzima de restricción se puede hacer usando la aplicación de función Map encontrada en GCG SeqLab o una aplicación similar contenida en los programas de análisis de ADN conocidos por los expertos en la técnica de análisis de ADN. Las enzimas de restricción también se pueden añadir a la secuencia para facilitar la clonación. Por ejemplo, el sitio de restricción de Clal se coloca en CP4EPSPS versión AT (SEQ ID NO:179 y Z (SEQ ID NO:18) para generar secuencias recombinantes por intercambio de fragmentos y para facilitar síntesis de genes usando fragmentos de nucleótidos que se pueden ensamblar al gen entero. La secuencia de polinucleótido CTP2 de péptido de tránsito (SEQ ID NO: 12) se conecta con CP4EPSPS por el sitio de restricción Sphl para facilitar la substitución de CTP2 con las versiones de nucleótidos diferentes de CTP2 (SEQ ID NO:13, SEQ ID N0:14) o polinucleótidos que codifican diferentes péptidos de tránsito de cloropiasto. Por ejemplo, en EPSPS de arroz, el sitio de restricción NgaMIV es conservado en aproximadamente la posición 205 de polinucleótido en todas las versiones artificiales para facilitar intercambio de región de codificación de péptido de tránsito de cloropiasto. También, para EPSPS de soya, la secuencia de polinucleótido para el péptido de tránsito de cloropiasto se separa del péptido maduro por el sitio de restricción para endocnucleasa de Sacll. Se entiende que la modificación de sitios de restricción no se requiere, pero es útil para manipulación posterior de las moléculas de ADN. El cuadro 5 provee una lista de endonucleasas de restricción, aquellas de particular interés para la presente invención están marcadas con un asterisco. Otros sitios de restricción de endonucleasa deseables para eliminación o adición a un polinucleótido artificial de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica y no se limitan a aquellos listados en el cuadro 5.

CUADRO 5 Secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción Enzimas Secuencias de Enzimas Secuencias de reconocimiento reconocimiento Aatll G_ACGTAC Asull TTACG_AA *Accl GTAMK_AC Aval CAYCGR_G Acc65l GAGTAC_C Aval II ATGCAT Acell G_CTAGAC- Avrll CACTAG_G Acll AAACG_TT Ball TGGACCA Acyl GRACG YC *BamHI GAGATC C oz 01 V s 99 Btrl CACAGTC ??38771 C YCGRAG Btsl GCAGTG NNA *Notl GCAGGCC GC Cfrl YAGGCC R *Nrul TCGACGA CfrlOI RACCGG Y *Nsi'l A TGCAAT *Clal ATACG AT Nspl R R CATGAY Dral TTTAAAA NspBll CMGACKG Drali RGAGNC CY *Pacl TTA ?????? Drdll GAACCA *Pcil AACATG T Dsal CACRYG G Pfl 11081 TCGTAG Eael YAGGCC R *PflMI CCAN NNNANTGG Eagl CAGGCC G PmaCI CACAGTG Ed 13611 GAGACTC Pmel G I I 1 AAAAC Pmll CACAGTG *Vspl ????? AT PpulOl AATGCA T *Xbal TACTAG A *PpuMI RGAGWC CY *Xhol CATCGA G PshAI GACNNANNGTC Xholl RAGATC Y Psil TTAATAA *Xmal CACCGG G *PspOMI GAGGCC C Xmalll CAGGCC G Pssl RG GNCACY Xmnl GAANNANNTTC *Pstl C TGCAAG Zral GACAGTC *Pvul CG ATACG *Pvull CAGACTG Rsrll CGAGWC CG *Sacl G AGCT^C *Sacll CC GCAGG *Sall GATCGA C SanDI GGAGWC CC Sapl G CTCTTC N ?? N N Saul CCATNA GG Sbfl CC TGCAAGG *Scal AGTAACT Scil CTCAGAG Sdul G DGCHAC SexAI AACCWGG T Sfcl CATRYA G Sfel CATRYA G Sfil GGCCN NNNANGGCC Sfol GGCAGCC Sgfl GCG ATACGC SgrAI CRACCGG YG *Smal CCCAGGG Smll CATYRA G Snal GTATAC *SnaBI TACAGTA *Spel AACTAG T *Sphl G CATGAC Spll CAGTAC G Srfl GCCCAGGGC Sse2321 CGACCGG CG Sse8387l CC TGCAAGG Sse8647l AGAGWC CT *Sspl AATAATT *Stul AGGACCT *Styl CACWWG G *Swal ????????? Tatl WAGTAC W UbaMI TCCNGGA UbaPI CGAACG Una búsqueda de patrón se puede realizar para encontrar secuencias desestabilizadoras potenciales y sitios de poliadenilación y después perturbarlas o eliminarlas como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,500,365. Ciertas extensiones de longitud de regiones ricas en AT, v.gr., el motivo de secuencia ATTA (o AUUA, como aparece en RAN) han sido implicadas como una secuencia desestabilizadora en ARNm de células de mamífero (Shaw y Kamen, Cell 46:659-667). Muchos ARNm de vida corta tienen regiones no traducidas 3' ricas en A+T y estas regiones tienen la secuencia ATTTA, algunas veces presentes en múltiples copias o como multímeros (v.gr., ATTTATTTA...). Shaw y Kamen mostraron que la transferencia del extremo 3' de un ARNm inestable a un ARN estable (globina o VA1) redujo en forma drástica la vida media del ARN estable. Además mostraron que un pentámero de ATTTA tuvo un efecto desestabilizador profundo en un mensaje estable, y que esta señal pudo ejercer su efecto ya sea si estaba ubicada en el extremo 3' o dentro de la secuencia codificadora.

Sin embargo, el número de secuencias de ATTTA y/o en el contexto de secuencia en el cual ocurren también parece ser importante para determinar si funcionan como secuencias desestabilizadoras. También mostraron que un trímero de ATTTA tuvo mucho menos efecto que un pentámero sobre la estabilidad de un ARNm y un dímero o un monómero no tuvo efecto sobre la estabilidad. Nótese que multímeros de ATTTA tales como un pentámero automáticamente crean una región rica en A+T. En otros ARNm inestables, la secuencia de ATTTA puede estar presente sólo en una copia, pero con frecuencia está contenido en una región rica en A+T. Una repetición de pentámeros de 11 AUUUA se ha mostrado que dirige transcripciones de reportero para degradación rápida en plantas (Ohme-Takagi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. E.U.A. 90, 1181 1-11815, 1993). La secuencia de ATTTA puede ser formada por la combinación de codones para el aminoácido lie (ATT) y Tyr (TAT) como ATTTAT mostrado. Otro ejemplo podrían ser codones que terminan en AT como en Asn, Asp, His o Tyr, seguido por el codón de TTA para Leu (v.gr., AATTTA). También el codón de Phe (UUU) se coloca entre los codones que terminan en A y empieza en A formarán un motivo de ATTTA. Para eliminar este motivo generalmente es suficiente un solo cambio de nucleótido como en el ejemplo mostrado: GCATTTAGC cambia a GCATTCAGC o GCCTTTAGC. Los tres polinucleótidos mostrados codifican para Ala-Phe-Arg. Las secuencias de acción cis que dirigen la transcripción para el cambio rápido en plantas en otros sistemas han sido identificadas (Abler y Green, Plant Mol. Biol. 32:63-78, 1997). Estas incluyen el elemento DST que consiste de tres subdominios altamente conservados separados por dos regiones variables encontradas corriente abajo del codón de interrupción de transcripciones de SAUR (Newmaan et al., Plant Cell 5: 701-714, 1993). La secuencia conservada de DST consiste de GGAG{N5)CATAGATTG{H7)CATnTGTAT, en donde residuos altamente conservados se muestran en cursivas. El segundo y tercer subdominios de elementos de DST contienen residuos que son invariables entre elementos de DST y se denominan ATAGAT y GTA, respectivamente. Estos dos subdominios son necesarios para la función de DST. Nuevas secuencias de polinucleótido artificiales son seleccionadas para la presencia de motivos conservados de elementos de DST GGAG, ATAGATT, CATTT y CATTTGTAT. Esas secuencias son eliminadas por sustituciones de base de codones que conservan la secuencia de proteína codificada por el polinucleótido. Los motivos de secuencia de DST GGAG, ATAGAT, CATTT y GTAT aparecen en agrupaciones o patrones similares a la secuencia de DST conservado también son eliminados por sustituciones de base. Secuencias de polinucleótido que posiblemente pueden funcionar como sitios de poliadenilación son eliminados en el nuevo diseño de polinucleótido (patente de E.U.A. No. 5,500,365). Las señales de poliadenilación pueden no actuar como sitios de polyA apropiados, sino más bien funcionan como sitios aberrantes que dan origen a ARNm inestables. La adición de una cadena de poliadenilato al extremo 3' del ARNm es común para la mayoría de los ARNm eucarióticas. Contenidas dentro de esta transcripción de ARNm están señales para poliadenilación y formación de extremo 3' apropiada. Este procesamiento en el extremo 3' implica digestión del ARNm y adición de poIyA al extremo 3' maduro. Al buscar secuencias de consenso cerca del tracto de poIyA tanto en ARNm de plantas como de animales, ha sido posible identificar secuencias de consenso de identidad que aparentemente están implicadas en adición de poIyA y digestión de extremo 3'. Las mismas secuencias de consenso parecen ser importantes para estos dos procesos. Esas señales son típicamente una variación sobre la secuencia de AATAAA. En células animales, se han identificado algunas variantes de esta secuencia que son funcionales; en células vegetales parece haber un intervalo extendido de secuencias funcionales (Dean et al., Nucí Acid Res., 14:2229-2240, 1986; Hunt, Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol 45:47-60, 1994; Rrothine, Plant Mol. Biol. 32:43-61 , 1996). Todas estas secuencias de consenso son variaciones sobre AATAAA, por lo tanto, todas son secuencias ricas en A+T. Típicamente, para obtener una expresión suficiente de transgenes modificados en plantas, la secuencia de codificación de polinucleótido estructural ("gen estructural") que codifica para la proteína de interés es modificada por la remoción de secuencias A l I I A y señales de poliadenilación putativas por mutagénesis dirigida al sitio de ADN que comprende el gen estructural. Sustancialmente todas las señales de poliadenilación conocidas y secuencias de ATTTA son removidas en el polinucleótido modificado, aunque con frecuencia se observan niveles de expresión incrementados sólo con la remoción de algunas de las secuencias de señal de poliadenilación identificadas. Alternativamente, sí se prepara un polinucleótido artificial que codifica para la presente proteína, los codones se seleccionan para evitar la secuencia de ATTTA y señales de poliadenilación. Para los propósitos de la presente invención, las señales de poliadenilación putativa, incluyen pero no necesariamente se limitan a AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA y CATAAA. La secuencia de ADN seleccionada es escaneada para identificar regiones con más de cuatro nucleótidos de adenina (A) o timina (T) consecutivos. Las regiones de A+T son escaneadas para señales de poliadenilación de planta potenciales. Aunque la ausencia de cinco o más nucleótidos de A o T consecutivos elimina la mayor parte de las señales de poliadenilación de las plantas, si hay más de una de las señales de poliadenilación menores identificadas dentro de diez nucleótidos uno de otro, entonces la secuencia de nucleótido de esta región es alterada para remover estas señales mientras se mantiene la secuencia de aminoácidos codificada original. El siguiente paso es considerar los aproximadamente 15 a aproximadamente 30, etc., residuos de nucleótidos que rodean la región rica en A+T. Sí el contenido de A+T de la región circundante es menor que 80%, la región se debe examinar para señales de poliadenilación. La alteración de la región basada en señales de poliadenilación depende (1) del número de señales de poliadenilación presentes y (2) de la presencia de señal de poliadenilación de planta mayor. Las señales de poliadenilación son removidas por sustitución de bases de la secuencia de ADN en el contexto de reemplazo de codones. Dos patrones adicionales no identificados en la patente de E.U.A. No. 5,500,365, son buscados y eliminados en modalidades de la presente invención. Las secuencias AGGTAA y GCAGGT son secuencias de consenso para sitios de empalme de intrón 5' y 3', respectivamente, en plantas monocotiledóneas y plantas dicotiledóneas. Sólo GT del sitio de empalme 5' y el AG en el sitio de empalme 3' se requieren para que sea un apareamiento exacto. Sin embargo, cuando se conduce una búsqueda para esas secuencias de consenso, no se permite desapareamiento para cada base. Después de cada paso, se hace mapeo de secuencia usando un programa AP de GCG para determinar la ubicación de los marcos de lectura abierta e identificar patrones de secuencia que necesitan ser modificados. El paso final sería realizar análisis de identidad de secuencia usando por ejemplo el programa GAP del paquete GCG para determinar el grado de divergencia de secuencia y por ciento de identidad. Generalmente, la proteína traducida del polinucleótido artificial tendrá la misma secuencia de aminoácidos que la proteína traducida de la región codificadora no modificada. Sin embargo, la sustitución de codones que codifican para aminoácidos que proveen un homólogo funcional de la proteína es un aspecto de la invención. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos para otros aminoácidos en una estructura de proteína sin pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión con moléculas de substrato. Puesto que es la capacidad interactiva y naturaleza de una proteína lo que define esa actividad funcional biológica de la proteína, ciertas sustituciones de secuencia de aminoácidos se pueden hacer en una secuencia de proteína y, desde luego, su secuencia codificadora de ADN subyacente, y sin embargo se puede obtener una proteína con pocas propiedades. Por lo tanto, los inventores contemplan que se pueden hacer varios cambios en las secuencias del péptido de las composiciones descritas al hacer cambios en las secuencias de ADN correspondientes que codifican los péptidos en los cuales los péptidos no muestran pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Un aspecto adicional de la invención comprende homólogos funcionales, que difieren en uno o más aminoácidos de aquellos de un polipéptido provisto aquí como el resultado de una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Es bien conocido en la técnica que uno o más aminoácidos en una secuencia nativa pueden ser sustituidos con por lo menos otro aminoácido, cuya carga y polaridad son similares a las del aminoácido nativo, dando por resultado un cambio silencioso. Por ejemplo, la valina es un sustituto conservativo para la alanina y la trionina es un sustituto conservativo para la serina. Las sustituciones conservativas para un aminoácido dentro de la secuencia de polilpéptido nativa se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido que ocurre naturalmente. Los aminoácidos se pueden dividir en los siguientes cuatro grupos: (1) aminoácidos ácidos, (2) aminoácidos básicos, (3) aminoácidos polares neutros y (4) aminoácidos no polares neutros. Los aminoácidos representativos dentro de estos diversos grupos incluyen pero no se limitan a: (1 ) aminoácidos ácidos (negativamente cargados) tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (2) aminoácidos básicos (positivamente cargados) tales como arginina, histidina y lisina; (3) aminoácidos polares neutros tales como glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; y (4) aminoácidos no polares neutros (hidrofóbicos) tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los sustitutos conservados para un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos nativa se pueden seleccionar de otros miembros del grupo a los cuales pertenece el aminoácido que ocurre naturalmente. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales de hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos naturalmente conservativos son: valina-leucina, valina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido aspártico, ácido gltuámico y asparagina-glutamina.

Construcciones de ADN El material genético exógeno puede ser transferido a una planta mediante el uso de una construcción de ADN diseñada para dicho propósito por métodos que utilizan Agrobacterium, bombardeo de partículas u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. El diseño de dicha construcción de AND está generalmente dentro del alcance de la técnica (Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, New York (1997). Ejemplos de dichas plantas a las cuales puede ser transferido el material genético exógeno incluyen, sin limitación, alfalfa, Arabidopsis, cebada, Brassica, brócoli, col, cítricos, algodón, ajo, avena, colza de semilla oleaginosa, cebolla, cañóla, lino, maíz, una planta anual de ornato y una planta perenne de ornato, guisante, cacahuate, pimiento, papa, arroz, centeno, sorgo, soya, caña de azúcar, remolacha, tomate, trigo, álamo blanco, pino, abeto, eucalipto, manzana, lechuga, lentejas, uva, plátano, té, pastos de turba, girasol, palma de aceite, Phaseolus, árboles, arbustos, enredaderas, etc. Es bien sabido que las plantas agronómicamente importantes comprenden genotipos, variedades y cultivares, y que los métodos y composiciones de la presente invención pueden ser probadas en estas plantas por un experto en la técnica de biología molecular vegetal y reproducción vegetal. Se ha descrito un gran número de moléculas promotoras de ADN aisladas que son activas como un elemento genético de un transgén en células vegetales. Estas incluyen el promotor de nopalina sintasa (P-nos) (Ebert et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (E.U.A.) 84:5745-5749, 1987), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia), el promotor de octopina sintasa (P-ocs), que son portados en plásmidos inductores de tumores de Agrobacterium tumefaciens, los promotores de caulimovirus, tales como el promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 19S (Lawton et al., Plant Mol. Biol. 9:315-324, 1987), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia) y el promotor CaMV 35S (Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia), el promotor del virus del mosaico de la escrofularia 35S (patente de E.U.A. No. 6,018,100, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia), el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de la ribulosa-1 ,5-bis-fosfato carboxilasa (ssRUBISCO), el promotor de Adh (Walker et al.., Proc. Nati. Acad. Sci. (E.U.A.) 84:6624-6628, 1987), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia), el promotor de sacarosa sintasa (Yang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (E.U.A.) 87:4144-4148, 1990), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia), el promotor del complejo de gen R (Chandler et al., Plant Cell 1 :1175- 183, 1989, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia), y el promotor del gen de proteína de unión de clorofila a/b, etc.

Una variedad de promotores específicamente activos en tejidos vegetales, tales como hojas, tallos, raíces y tubérculos, se pueden usar para expresar las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Ejemplos de promotores específicos de tubérculo incluyen pero no se limitan a los promotores de patatina I y II (Bevan et al., EMBO J. 8: 1899-1906, 1986); Koster-Topfer et al., Mol Gen Genet. 219:390-396, 1989); Mignery et al., Gene 62:27-44, 1988); Jefferson et al., Plant Mol. Biol. 14: 995-1006, 1990), incorporadas aquí por referencia en su totalidad), el promotor de los genes de ADPGPP de tubérculo de papa, tanto las subunidades grandes como pequeñas; el promotor de sacarosa sintasa (Salanoubat y Belliard, Gene 60:47-56, 1987), Salanoubat y Bellliard, Gene 84:181-185, 1989), incorporada aquí por referencia en su totalidad); y el promotor para las proteínas de tubérculo mayor incluyendo los complejos de proteína de 22 kd e inhibidores de proteinasa (Hannapel, Plant Physiol. 101 : 703-704, 1993), incorporada aquí por referencia en su totalidad). Ejemplos de promotores específicos de hoja incluyen pero no se limitan a los promotores de ribulosa bifosfato carboxilasa (RbcS o RuBISCO) (véase, v.gr., Matsuoka et al., Plant J. 6:311-319, 1994), incorporada aquí por referencia en su totalidad); el promotor del gen de proteína de unión de clorofila a/b de cosecha con luz (véase, v.gr., Shiina et al., Plant Physiol. 115:477-483, 1997; Casal et al., Plant Physiol. 116:1533-1538, 1998, incorporada aquí por referencia en su totalidad); y promotor de gen relacionado con myb de Arabidopsis thaliana (Atmyb5) (Li et al., FEBS Lett. 379:117-121 , 1996, incorporada aquí por referencia en su totalidad).

Ejemplos de promotor específico de raíz incluyen pero no se limitan al promotor para el gen de quitinasa ácida (Samac et al., Plant Mol. Biol. 25:587-596, 1994), incorporada aquí por referencia en su totalidad); los subdominios específicos de raíz del promotor CaMV35S que han sido identificados (Lam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (E.U.A.) 86:7890-7894, 1989, incorporada aquí por referencia en su totalidad); el promotor de ORF13 de Agrobacterium rhizogenes que presenta alta actividad en raíces (Hansen et al., Mol. Gen. Genet. 254:337-343, 1997), incorporada aquí por referencia en su totalidad); el promotor para el gen específico de raíz de tabaco RB7 (patente de E.U.A. 5,750,386; Yamamoto et al., Plant Cell 3:371-382, 1991 , incorporada aquí por referencia en su totalidad); y los promotores específicos de células de la raíz reportados por Conkling et al. (Conkling et al., Plant Physiol. 93:1203-1211 , 1990, incorporada aquí por referencia en su totalidad), y el promotor de POX1 (Pox1 , pox ) (Herting, et al. Plant Mol. Biol. 16:171 , 991 ). Otra clase de promotores específicos de tejido vegetativos útiles son promotores meristemáticos (punta de la raíz y vértice de la raíz). Por ejemplo, se pueden usar los promotores "SHOOTMERISTEMLESS" y "SCARECROW" que son activos en el vástago en desarrollo o meristemas apicales de raíz (Di Laurenzio et al., Cell 86:423-433, 1996; Long, Nature 379:66-69, 1996); incorporada aquí por referencia en su totalidad). Otro ejemplo de un promotor útil es aquel que controla la expresión del gen HMG2 de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa, cuya expresión está restringida a tejidos meristemáticos y florales (zona secretora del estigma, granos de polen maduros, tejido vascular ginoecio y óvulos fecundados) (véase, v.gr., Enjuto et al., Plant Cell. 7:517-527, 1995, incorporada aquí por referencia en su totalidad). También, otro ejemplo de un promotor útil es aquel que controla la expresión de genes relacionados con knl de maíz y otras especies que muestran expresión específica de meristema (véase, v.gr., Granger et al., Plant Mol. Biol. 31:373-378, 1996; Kerstetter et al., Plant Cell 6:1877-1887, 1994; Hake et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350:45-51 , 1995, incorporada aquí en su totalidad). Otro ejemplo de promotor meristemático es el promotor KNAT1 de Arabídopsis thaliana. En el vértice del vástago, la transcripción de KNAT1 está ubicada principalmente en el meristema apical del vástago; la expresión de KNAT1 en el meristema del vástago disminuye durante la transición floral y se restringe a la corteza del tallo de la influorescencia (véase, v.gr., Lincoln et al., Plant Cell 6:1859-1876, 1994, incorporada aquí por referencia en su totalidad). Los promotores específicos de semilla y mehorados de semilla adecuados se pueden derivar de los siguientes genes: MAC1 de maíz (Sheridan et al., Genetics 142:1009-1020, 1996, incorporada aquí por referencia en su totalidad); Cat3 de maíz (Genbank No. L05934, Abler et al., Plant Mol. Biol. 22:10131-1038, 1993, incorporada aquí por referencia en su totalidad); vivparous-1 de Arabídopsis (Genbank No. U93215); Atimycl de Arabídopsis (Urao et al., Plant Mol. Biol. 32:571-57, 1996; Conceicao et al., Plant 5:493-505, 1994, incorporada aquí por referencia en su totalidad); napA de Brassica napus (Genbank No. J02798); la familia del gen napin de Brassica napus (Sjodahl et al., Planta 197:264-271 , 1995, incorporada aquí por referencia en su totalidad). El promotor específico de óvulo para el gen BEL1 (Reiser et al. Cell 83:735-742, 1995, Genbank No. U39944; Ray et al, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 91 :5761-5765, 1 94, todos los cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad) también se puede usar. Los promotores MEA (FIS1 ) y FIS2 específicos de óvulo y células centrales también son promotores específicos de tejido reproductor útiles (Luo et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 97:10637-10642, 2000; Vielle-Calzada, et al., Genes Dev. 13:2971-2982, 1999; incorporada aquí por referencia en su totalidad). Un promotor específico de polen de maíz ha sido identificado en maíz (Guerrero et al., Mol. Gen. Genet. 224:161-168, 1990, incorporada aquí por referencia en su totalidad). Se han descritos otros genes específicamente expresados en polen (véase, v.gr., Wakeley et al., Plant Mol. Biol. 37:187-192, 1998; Ficker et al., Mol. Gen. Genet. 257:132-142, 1998; Kulikauskas et al., Plant Mol. Biol. 34:809-814, 1997; Treacy et al., Plant Mol. Biol. 34:603-61 1 , 1997; todos los cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad). Los promotores derivados de genes que codifican proteínas de almacenamiento embrionarias, que incluye el gen que codifica la proteína de almacenamiento 2S de Brassica napus (Dasgupta et al, Gene 133:301-302, 1993, incorporada aquí por referencia en su totalidad); la familia de gen de proteína de almacenamiento de semilla 2s de Arabidopsis; el gen que codifica oleosina 20kD de Brassica napus (GenBank No. M63985); los genes que codifican oleosina A (Genbank No. U09118) y oleosina B (GenBank No. U09119) del frijol de soya; el gen que codifica oleosina de Arabidopsis (GenBank No. Z17657); el gen que codifica oleosina 18kD de maíz (GenBank No. J05212, Lee, Plant Mol. Biol. 26:1981-1987, 1994), incorporada aquí por referencia en su totalidad); y también se pueden usar el gen que codifica proteína rica en azufre de peso molecular bajo de frijol de soya (Choi et al., Mol. Gen. Genet. 246:266-268, 1995, incorporada aquí por referencia en su totalidad). También se pueden usar los promotores derivados de genes que codifican zeína (incluyendo 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD, y genes gama; Pedersen et al., Cell 29:1015-1026, 1982, incorporada aquí por referencia en su totalidad). Las ceínas son un grupo de proteínas de almacenamiento encontradas en el endospermo de maíz. Se sabe que otros promotores que funcionan, por ejemplo, en maíz, incluyen los promotores para los siguientes genes: waxy, Brittle, Shrunken 2, enzimas de ramificación I y II, sintetasas de almidón, enzimas desramificadoras, oleosinas, glutelinas y sacarosa sintasas. Un promotor particularmente preferido para expresión de endospermo de maíz es el promotor para el gen de glutelina de arroz, muy particularmente el promotor Osgt-1 (Zheng et al., Mol. Cell Biol. 13:5829-5842, 1993, incorporada aquí por referencia en su totalidad). Ejemplos de promotores adecuados para expresión en trigo incluyen aquellos promotores para las subunidades de ADP glucosa pirofosforilasa (ADPGPP), las sintasas de unión de gránulos y otras sintasas de almidón, las enzimas ramificadoras y desramificadoras, las proteínas abundantes en embriogénesis, las gliadinas y las gluteninas. Ejemplos de dichos promotores en arroz incluyen aquellos promotores para las subunidades de ADPGPP, las sintasas de unión de granulos y otras sintasas de almidón, las enzimas ramificadoras, las enzimas desramificadoras, las sacarosas sintasas y las glutelinas. Un promotor particularmente preferido es el promotor para gluteina de arroz, Osgt-1. Ejemplos de dichos promotores para cebada incluyen aquellos para las subunidades ADPGPP, las sintasas de unión de gránulos y otras sintasas de almidón, las enzimas ramificadoras, las enzimas desramificadoras, las sacarosas sintasas, las hordeínas, las globulinas de embrión y las proteínas específicas de aleurona. Se puede usar un promotor de tomate activo durante la maduración del fruto, sin esencia y abscisión de las hojas y a un grado menor, de flores (Blume et al., Plant J. 12:731-746, 1997, incorporada aquí por referencia en su totalidad). Otros promotores ilustrativos incluyen el promotor específico de pistilo en el gen SK2 de la papa (Salanum tuberosum L), que codifica una endoquitinasa básica específica del pistilo (Ficker et al., Plant Mol. Biol. 35:425-431 , 1997, incorporada aquí por referencia en su totalidad); el gen Blec4 del guisante (Pisum satívian cv. Alaska), activo en tejido epidérmico en vértices vegetativos de vástago floral de alfalfa transgénica. Esto lo hace una herramienta útil para dirigir la expresión de genes extraños a la capa epidérmica de vástagos que crecen activamente. El promotor específico de tejido E8 del tomate también es útil para dirigir la expresión de genes en frutos (Deikman, et al., Plant Physiology 100:2013-2017, 1992). Además se reconoce que puesto que en la mayoría de los casos los límites exactos de secuencia reguladora no se han definido completamente, fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener actividad promotora idéntica. Promotores que se sabe o que se encuentra que causan transcripción de ADN en células vegetales se pueden usar en la presente invención. Dichos promotores se pueden obtener de una variedad de fuentes tales como plantas y virus de plantas. Además de los promotores que se sabe que causan transcripción de ADN en células vegetales, otras moléculas promotoras se pueden identificar para usarse en la presente invención mediante selección de una genoteca de ADNc en plantas para genes que son selectivamente o preferiblemente expresados en los tejidos o células objetivo y aislando la región genómica 5' de los ADNc identificados. Construcciones o vectores también pueden incluir con la región codificadora de interés un ácido polinucleico que actúa, todo o en parte, para terminar la transcripción de esa región. Por ejemplo, dichas secuencias se han aislado incluyendo la secuencia Tr7 3' y la secuencia nos 3' (Ingelbrecht et al., The Plant Cell 1 :671-680, 1989, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia; Bevan et al., Nucleic Acids Res. 1 :369-385, 1983, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia). Un vector o construcción también puede incluir elementos reguladores. Ejemplos de los mismos incluyen el intrón 1 de Adh (Callis et al., Genes y Develop. 1 :1183-1200, 1987, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia), el intrón de sacarosa sintasa (Vasil et al., Plant Physiol. 91 :1575-1579, 1989, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia) y el elemento omega de TMV (Gallie et al., Plant Cell 1 :301-311 , 1989, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia). Estos y otros elementos reguladores se pueden incluir cuando sea apropiado. Un vector o construcción también puede incluir un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionares también se pueden usar para seleccionar para plantas y células vegetales que contienen el material genético exógeno. Ejemplos de los mismos incluyen pero no se limitan a un gen neo (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:183-188, 1985, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia), que codifica resistencia a la kanamicina y se puede seleccionar usando kanamicina, G418, etc.; un gen bar que provee resistencia a bialafos; un gen de EPSP sintasa muíante (Hinchee et al., Bio/Technology 6:915-922 (1988), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia) que provee resistencia a glifosato; un gen de nitrilasa que provee resistencia a bromoxinil (Stalker et al., J. Biol. Chem. 263/6310-6314 (1988), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia); un gen de acetolactato sintasa muíante (ALS) que confiere imidazolinona o sulfonilurea; y un gen DHFR resistente a metotrexato (Thillet et al., J. Biol. Chem. 263:12500-12508, 1988, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia). Un vector o construcción también puede incluir un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionares se pueden usar para monitorear expresión. Marcadores seleccionabas ilustrativos incluyen un gen de ß-glucuronidasa o ui'dA (GUS) para la cual se conocen varios substratos cromogénicos (Jefferson, Plant Mol. Biol, Rep. 5:387-405 (1987), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia; Jefferson et al., EMBO J. 6:3901-3907 (1987), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia); un gen de locus R, que codifica un producto que regula la producción de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta et al., Stadler Symposium :263-282 (1988), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia); un gen de ß-lactamasa (Sutcliffe et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (E.U.A.) 75:3737-3741 (1978), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia), un gen que codifica una enzima para la cual se conocen varios substratos cromogénicos (v.gr., PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen de luciferasa (Ow et al., Science 234:856-859 (1986), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia); un gen xylE (Zukowsky et al., Proc. Nati. Acad. Sci, (E.U.A.) 80:1101-1105 (1983), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia) que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen de a-amilasa (Ikatu et al., Bio/Technol. 8:241-242, 1990, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia); un gen de tirosinasa (Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714, 1983, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia) que codifica una enzima capaz de oxidar la tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa a melanina; y una a-galactosidasa.

Introducción de polinucleótidos en plantas Existen muchos métodos para introducir moléculas de ácido nucleico transformantes en células vegetales. Se cree que los métodos adecuados virtualmente incluyen cualquier método por el cual las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir a una célula, tal como mediante infección por Agrobacterium o suministro directo de ácido nucleico tal como, por ejemplo, mediante transformación mediada por PEG, por electroporación o por aceleración de partículas revestidas con ADN, etc. (Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:205-225 (1991 ), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia; Vasil, Plant Mol. Biol. 25:925-937 (1994), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia). Por ejemplo, la electroporación se ha usado para transformar protoplastos de Zea mays (Fromm et al., Nature 312:891-793, 986, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia). Otros sistemas de vector adecuados para introducir ADN transformante en una célula vegetal hospedero incluyen pero no se limitan a vectores de cromosoma artificiales binarios (BIBAC) (Hamilton et al., Gene 200:107-1 16, 1997, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia)., y transfección con vectores virales de ARN (Della-Cioppa et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. (1996), 792 pp Engineeríng Plants for Commercial Products and Applications, pp 57-61 , cuya totalidad se incorpora aquí por referencia). La tecnología para introducción de ADN en células es bien conocida por los expertos en la técnica. Cuatro métodos generales para suministrar un gen en células se han descrito: (1 )métodos químicos (Graham y van der Eb, Virology 54:536-539, 1973, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia); (2) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, Cell 22:479-488 (1980), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia), electroporación (Wong y Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:584-587 (1982); Fromm et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (E.U.A.) 82:5824-5828 (1985); patente de E.U.A. No. 5,384s,253, todas las cuales se incorporan aquí en su totalidad); y la pistola de genes (Johnston y Tang, Methods Cell Biol. 43:353-365 (1994), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia); (3) vectores virales (Clapp, Clin. Perinatol. 20:155-168, 1993; Lu et al., J. Exp. Med. 178:2089-2096, 1993; Eglitis y Anderson, Biotechniques 6:608-614, 1988, todas las cuales se incorporan aquí en su totalidad); y (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel et al., Hum. Gen. Ther. 3:147-154, 1992, Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A 89:6099-6103, 1992, todas las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad). Los métodos de aceleración que se pueden usar incluyen, por ejemplo, bombardeo de microproyectiies y similares. Un ejemplo de un método para suministrar moléculas de ácido nucleico transformantes a células vegetales es el bombardeo de microproyectiies. Este método ha sido revisado por Yang y Christou, eds., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, Englandd (1994), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Partículas no biológicas (microproyectiies) que pueden ser revestidas con ácidos nucleicos y suministradas en células por una fuerza propulsora. Partículas ilustrativas incluyen aquellas compuestas de tungsteno, oro, platino y similares. La transferencia mediada por Agrobacteríum es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células vegetales debido a que el ADN puede ser introducido en tejidos vegetales enteros, desviando así la necesidad de regeneración de una planta intacta desde un protoplasto. El uso de vectores integradores de planta mediada por Agrobacteríum para introducir ADN en células vegetales es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo los métodos descritos por Fraley et al., Bi/Technology 3:629-635 (1985) y ogers et al, Methods Enzymol. 153:253-277 (1987), ambas incorporadas aquí por referencia en su totalidad. Además, la integración del Ti-ADN es un proceso relativamente preciso que da por resultado pocos reordenamientos. La región de ADN que ha de ser transferida está definida por las secuencias de límite y el ADN que interviene es generalmente insertado en el genoma de la planta como se describe (Spielmann et al., Mol. Gen. Genet. 205:34 ( 986), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia). Una planta transgénica que resulta de métodos de transformación de Agrobacteríum frecuentemente contiene un solo gen en un cromosoma. Dichas plantas transgénicas se pueden referir como homicigóticas para el gen. Muy preferida es una planta transgénica que es homocigótica para el gen estructural añadido; es decir, una planta transgénica que contiene dos genes añadidos, un gen en el mismo locus en cada cromosoma de un par de cromosomas. Una planta transgénica homocigótica se puede obtener mediante apareamiento (autoapareamiento) sexual de una planta transgénica segregante independiente que contiene un solo gen añadido, germinando algunas de las semillas producidas y analizando las plantas resultantes producidas para el gen de interés. También se debe entender que dos plantas transgénicas diferentes también pueden ser pareadas para producir descendientes que contengan dos genes exógenos añadidos independientemente segregantes. El autoapareamiento de una progenie apropiada puede producir plantas que sean homocigóticas para ambos genes exógenos añadidos que codifican un polipéptido de interés. La retrocruza en una planta progenitora y la cruza externa con una planta no transgénica también son contempladas, como lo es la propagación vegetativa. La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas de transformantes de protoplasto de planta individuales o de varios explantes transformados es bien conocido en la técnica (Weissbach y Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, (eds.), Academic Press, Inc. San Diego, CA, (1988), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia). Esta regeneración y proceso de crecimiento incluye los pasos de selección de células transformadas, cultivo de aquellas células individualizadas a través de las etapas usuales de desarrollo embrionario a través de la etapa de plántula enraizada. Los embriones y semillas transgénicas son regenerados de manera similar. Los vástagos enraizados transgénicos resultantes posteriormente se plantan en un medio de crecimiento vegetal apropiado tal como el suelo.

El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen exógeno, extraño, que codifica una proteína de interés es bien conocido en la técnica. Preferiblemente, las plantas regeneradas son autopolinizadas para proveer plantas transgénicas homocigóticas. De otra manera, el polen obtenido de las plantas regeneradas es cruzado con plantas crecidas de semilla de líneas agronómicamente importantes. Por el contrario, el polen de plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta trangénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado es cultivado usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. La presente invención también provee partes de las plantas de la presente invención. Las partes de las plantas, sin limitación, incluyen semilla, endospermo, óvulo y polen. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la parte de la planta es una semilla. Los métodos para transformar dicotiledóneas, principalmente mediante el uso de Agrobacterium tumefaciens, y obtener plantas transgénicas se ha publicado, v.gr., algodón (patente de E.U.A. No. 5,004,863, patente de E.U.A. No. 5,159,135, patente de E.U.A. No. 5,518,908, todas las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad), frijol de soya (patente de E.U.A. No. 5,569,834, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia) y Brassica (patente de E.U.A. No. 5,463,174, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia). También se ha reportado la transformación de monocotiledóneas usando electroporación, bombardeo de partículas y Agrobacterium. Por ejemplo, la transformación y regeneración de plantas se ha logrado en espárrago, cebada Zea mays (From et al., Bio/Technology 8:833 (1990), Armstrong et al., Crop Science 35:550-557 (1995), todas las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad); avena; arroz, centeno, caña de azúcar; cañuela y trigo (patente de E.U.A. No. 5,631,152, cuya totalidad se incorpora aquí por referencia). Además de los procedimientos anteriormente descritos, los expertos están familiarizados con los materiales de recursos estándares que describen condiciones y procedimientos específicos para la construcción, manipulación y aislamiento de macromoléculas (v.gr., moléculas de ADN, plásmldos, etc.), generación de organismos recombinantes y la selección y aislamiento de clones, (véase por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Press (1989); Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Coid Spring Harbor Press (1995), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia; Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, 1 , Coid Spring Harbor, New York (1998), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia; Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Coid Spring Harbor, New York (1998), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia; Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, New York (1997), cuya totalidad se incorpora aquí por referencia). Habiéndose descrito ahora generalmente la invención, la misma se entenderá más fácilmente a través de referencia a los siguientes ejemplos, que se proveen a manera de ilustración, y no se pretende que sean limitantes de la presente invención, a menos que se especifique.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Cuando un polinucleótido vegetal nativo aislado que comprende una secuencia codificadora es reconstruido como un transgén, después introducido en la plantas por métodos de transformación vegetal existe un riego de que la expresión del gen de la planta homólogo endógeno interactúe negativamente con el transgén. Para evitar estas interacciones negativas, puede ser necesario proveer un polinucleótido de transgén sustancialmente divergente en secuencia del gen nativo de la planta. Una molécula de polinucleótido artificial se puede producir por el método de la presente invención y usar para reducir la aparición de silenciamiento de transgén. Este ejemplo sirve para ilustrar métodos de la presente invención que dan por resultado la producción de un polinucleótido que codifica una EPSP sintasa vegetal modificada. La enzima EPSPS de arroz (Oryzae sativa) nativa y péptido de tránsito de cloroplastos se usa para construir una molécula de polinucleótido artificial que también incluye codones que codifican para aminoácidos sustituidos que no ocurren naturalmente en la enzima EPSPS de arroz. Estos aminoácidos sustituidos proveen una enzima EPSPS de arroz resistente a glifosato (OsEPSPS_TIPS, SEQ ID NO:1 ). Los pasos descritos en el cuadro 6 se usan para construir dicha secuencia de polinucleótido artificial (OsEPSPS_AT, SEQ ID NO:3) usando un cuadro de uso de codones de Arabidopsis y los parámetros para construcción de una molécula de polinucleótido sustancialmente divergente, que cuando se expresa en plantas codifica una enzima EPSPS de arroz modificada resistente a herbicida de glifosato. La comparación de la secuencia de gen de EPSPS de arroz nativo referida como OsEPSPSJMat (SEQ ID NO:2) que ha sido previamente modificada para codificar una enzima resistente a glifosato a la molécula de polinucleótido modificada por el uso de codón de Arabidopsis, OsEPSPS_AT (SEQ ID NO: 3) y a la secuencia modificada para uso de codón de Zea mays, OsEPSPS_ZM (SEQ ID NO: 4) por este método se muestra en las figuras 1A-1 H. Las figuras 1A-1H muestra bases de nucleótido cambiadas en los polinucleótidos modificados en comparación con OsEPSPS_Nat, SEQ ID NO: 2.

CUADRO 6 Diseño de polinucleótido para una EPSP sintasa de arroz modificada (OsEPSPS AT) 1. Sustituir los aminoácidos en las posiciones 173 y 177 para proveer una enzima EPSPS de arroz modificada resistente a herbicida de glifosato mostrada en SEQ ID NO: 1. 2. Retrotraducir SEQ ID NO:1 para generar una secuencia de polinucleótido artificial usando el cuadro de uso de codones de Arabidopsis thaliana (Cuadro 2). 3. Realizar alienación de secuencia con secuencia de polinucleótido de OsEPSPS nativa (SEQ ID NO:2) y secuencia de polinucleótido artificial para determinar el grado de identidad de secuencia, mapear marcos de lectura abiertos, seleccionar patrones para buscar e identificar secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. 4. Hacer correcciones a los codones usados en la secuencia de polinucleótido artificial para lograr el porcentaje deseado de identidad de secuencia y para evitar agrupación de codones idénticos. Esto es especialmente importante para aminoácidos que ocurren a alta frecuencia, es decir, alanina, glicina, histidina, leucina, serina, y valina. La distribución aproximada de uso de codones en la secuencia de polinucleótido de conformidad con el uso de codones de Arabidopsis, cuadro 2. 5. La secuencia de polinucleótido se inspecciona para regiones locales que tienen una relación de GC:AT mayor que aproximadamente 2 sobre un intervalo de aproximadamente 50 nucleótidos contiguos. La secuencia de polinucleótido se ajusta según es necesario, sustituyendo codones en estas regiones de tal manera que la relación de GC:AT es menor que aproximadamente 2 y la composición de polinucleótido completa está en el intervalo de 0.9-1.3. 6. Introducir codones de interrupción a marcos de traducción "b", "c", "d", "e" y "f. Los codones de interrupción de traducción son creados en los marcos de traducción "b", "c", "d", "e" y "f al remplazar uno o más codones dentro de aproximadamente 130 pares de bases (pb) de los extremos del polinucleótido artificial que crea un codón de interrupción sin cambiar la secuencia de codificación de aminoácidos del marco uno. 7. Eliminar codones de ATG de marcos de lectura abiertos hacia adelante (marcos "b" y "c") y de reversa (marcos "d", "e", "f ). Los marcos de lectura hacia adelante y hacia atrás son inspeccionados para la presencia de codones de ATG. Cualesquiera codones de ATG en los marcos "b" y "c" encontrados en la secuencia de polinucleótido antes del tercer Met en el marco "a" del polinucleótido son eliminados al remplazar uno o más codones que traslapan el ATG cambiando uno de los nucleótidos sin cambiar la secuencia de codificación de aminoácidos del marco "a". En los marcos de reversa, la colocación de ATG o introducción de codón de interrupción se puede hacer para interrumpir marcos de lectura potenciales. 8. Eliminar patrones de reconocimiento de enzima de restricción no deseados y otros patrones específicos (poliadenilación, empalme de ARN, patrones de inestabilidad de secuencia). La secuencia de polinucleótido se inspecciona para la presencia de cualesquiera patrones de polinucleótido no deseados y los patrones son perturbados al sustituir codones en estas regiones. 9. Verificar identidad de secuencia entre el primer polinucleótido y el polinucleótido artificial creado por el método de la presente invención.

Eliminar identidad de secuencia en un polinucleótido contiguo que es no mayor que 23 pb. Es deseable eliminar identidad de secuencia mayor que aproximadamente 15 pb. Es útil seleccionar de aminoácidos tales como serina, arginina y leucina que tiene 6 codones o de aminoácidos con 4 codones para eliminar identidad de secuencia. 10. Revisar la secuencia de polinucleótido artificial que resulta de cualquiera de los pasos 1 a 9 para cualquiera de las características de secuencia identificadas en los pasos 4-9, y si la secuencia no cumple con las condiciones se hacen sustituciones de codones adicionales a la secuencia hasta que se cumplen las condiciones de los pasos 4-9. 11. Construir la molécula de polinucleótido artificial por métodos conocidos en la técnica, v.gr., usando PCR con una mezcla de iniciadores de traslape. Los iniciadores en los extremos del gen pueden contener sitios de restricción convenientes para permitir la fácil clonación del gen al vector seleccionado. En el extremo 5' generalmente Alflll, BspHI, Ncol, Ndel, Pcil, o Sphl son más convenientes tanto como su secuencia contenga un codón de inicio de ATG, sin embargo se pueden usar otras enzimas también si un polinucleótido modificado está diseñado para crear una fusión con otro segmento de polinucleótido, v.gr., péptido de tránsito de cloroplasto y secuencia de codificación de EPSPS. 12. Realizar un análisis de secuencia de ADN del polinucleótido artificial para confirmar la construcción sintética que dio como resultado la molécula de polinucleótido deseada. Si se encuentran errores, entonces se eliminan éstos mediante mutagénesis dirigida al sitio para la cual los expertos en la técnica conocen muchos métodos de mutagénesis de ADN. Se hace una versión de uso de codones Zea mays (Zea mays, Cuadro 3) de la secuencia de enzima EPSPS de arroz resistente al glifosato (enzima EPSPS de Oryzae sativa con mutaciones de TIPS, SEQ ID NO:1 ). El poiinucieótido que codifica esta enzima incluye codones que codifican para aminoácidos sustituidos que no ocurren naturalmente en la enzima EPSPS de arroz nativa. Estos aminoácidos sustituidos proveen una enzima EPSPS de arroz resistente al glifosato. Los pasos descritos en el cuadro 7 se usan para construir una secuencia de poiinucieótido artificial modificada (OsEPSPS_ZM, SEQ ID NO:4) basada en un cuadro de uso de codones de Zea mays que codifica una enzima EPSPS de arroz modificada resistente a herbicida de glifosato. La comparación de la secuencia de poiinucieótido de OsEPSPS_Nat (SEQ ID NO:2) con la secuencia de poiinucieótido artificial de OsEPSPS_ZM (SEQ ID NO:4) usando el uso de codones de Zea mays se muestra en las figuras 2A-2F.

CUADRO 7 Construcción de poiinucieótido para EPSP síntasa de arroz modificada (OsEPSPS ZM) 1. Retrotraducir SEQ ID NO:1 para generar una secuencia de poiinucieótido artificial usando el cuadro de uso de codones de Zea mays (Cuadro 3). 2. Realizar alienación de secuencia con secuencia de polinucleótido de OsEPSPS nativa (SEQ ID NO:2) y secuencia de polinucleótido artificial para determinar el grado de identidad de secuencia, mapear marcos de lectura abiertos, seleccionar patrones para buscar e identificar secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. 3. Hacer correcciones a los codones usados en la secuencia de polinucleótido artificial para lograr el porcentaje deseado de identidad de secuencia y para evitar agrupación de codones idénticos. Esto es especialmente importante para aminoácidos que ocurren a alta frecuencia, es decir, alanina, glicina, histidina, leucina, serina, y valina. La distribución aproximada de uso de codones en la secuencia de polinucleótido de conformidad con el uso de codones de Zea mays, cuadro 3. 4. La secuencia de polinucleótido se inspecciona para regiones locales que tienen una relación de GC:AT mayor que aproximadamente 2 sobre un intervalo de aproximadamente 50 nucleótidos contiguos. La secuencia de polinucleótido se ajusta según es necesario, sustituyendo codones en estas regiones de tal manera que la relación de GC:AT es menor que aproximadamente 2 y la composición de polinucleótido completa está en el intervalo de 1.2-1.7. 5. Seguir los pasos 6-12 del cuadro 6.

CUADRO 8 Por ciento de identidad de secuencia entre polinucleótidos de OsEPSPS CUADRO 9 La composición de nucleótido y la relación de GC:AT de las secuencias de polinucleótido modificadas para la secuencias de gen de EPSPS de arroz A C G T GC:AT OsEPSPS AT 377 336 444 391 1.02 OsEPSPS ZM 365 381 470 332 1.22 Las dos secuencias del polinucleótido artificial de EPSPS de arroz (SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4) son modificadas de tal manera que el por ciento de identidad está por abajo de 75 por ciento en comparación con SEQ ID NO:2 o en relación una con otra (cuadro 8). La composición de nucleótido y la relación de GC:AT de las secuencias de polinucleótido para la secuencia de gen de EPSPS de arroz se muestran en el cuadro 9. Estos polinucleótidos se pueden seleccionar para usarse en construcciones de expresión de planta junto con diferentes elementos reguladores o se pueden combinar en una sola planta mediante retransformación con una construcción de ADN o por métodos de reconstrucción vegetal. Las preocupaciones con silenciamiento de genes y recombinación se reducen cuando las construcciones de ADN tienen niveles reducidos de ADN homólogo.

EJEMPLO 2 El maíz (Zea mays) ha sido genéticamente modificado para tener resistencia a herbicida de glifosato (patente de E.U.A. No. 6,040,497). Estas plantas de maíz contienen un transgén con una EPSP sintasa de maíz modificada para tolerancia al glifosato. Los métodos de la presente invención se pueden usar para construir un polinucleótido artificial nuevo que codifica una EPSP sintasa de maíz que es sustancialmente diferente en por ciento de identidad al gen de EPSP sintasa de maíz endógeno. El polinucleótido artificial de EPSP sintasa de maíz recién construido se puede usar como un marcador seleccionare durante la selección de líneas de planta transgénica que pueden contener rasgos agronómicos transgénicos adicionales. Durante la producción de semillas de maíz híbridas, es útil tener ambos progenitores tolerantes a glifosato usando transgenes de no interferencia.

CUADRO 10 Construcción de polinucleótido para EPSP sintasa de maíz modificada (ZmEPSPS ZM, SEQ ID NO: 10) 1. Retrotraducir SEQ ID NO:8 para generar una secuencia de polinucleótido usando el cuadro de uso de codones de Zea mays (Cuadro 3). 2. Realizar alienación de secuencia con secuencia de polinucleótido de ZmEPSPS_Nat (SEQ ID NO:9) y secuencia de polinucleótido artificial para determinar el grado de identidad de secuencia, mapear marcos de lectura abiertos, seleccionar patrones para buscar e identificar secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. 3. Hacer correcciones a los codones usados en la secuencia de polinucleótido artificial para lograr el porcentaje deseado de identidad de secuencia y para evitar agrupación de codones idénticos. Esto es especialmente importante para aminoácidos que ocurren a alta frecuencia, es decir, alanina, glicina, histidina, leucina, serina, y valina. La distribución aproximada de uso de codones en la secuencia de polinucleótido de acuerdo con el uso de codones de Zea mays, cuadro 3. 4. La secuencia de polinucleótido artificial se inspecciona para regiones locales que tienen una relación de GC:AT mayor que aproximadamente 2 sobre un intervalo de aproximadamente 50 nucleótidos contiguos. La secuencia de polinucleótido se ajusta según es necesario, sustituyendo codones en estas regiones de tal manera que la relación de GC:AT es menor que aproximadamente 2 y la composición de polinucleótido completa está en el intervalo de 1 .2-1.7. 5. Seguir los pasos 6-12 del cuadro 6.

CUADR0 11 Por ciento de identidad de secuencia entre poiinucleótidos de ZmEPSPS La secuencia de nucleótido de gen de EPSPS de maíz también se modifica para reducir la identidad entre gen sintético y nativo y mantener la relación de GC:AT global típica para monocotiledóneas. La relación de GC:AT para la secuencia de ZmEPSPS_ZM es de 1.38. La identidad de secuencia se reduce a aproximadamente 75% entre (ZmEPSPS_Nat, SEQ ID NO:9) nativo y (ZmEPSPS_ZM, SEQ ID NO:10) sintético. La comparación de poiinucleótidos nativos que codifican EPSPS indica que el péptido de tránsito de cloroplasto es el fragmento más divergente del gen. La similitud en la secuencia de nucleótido de péptidos maduros es mayor que 88% para enzimas de maíz y arroz, y algunas regiones conservadas tienen identidad de secuencia tan larga como 50 pb. El silenciamiento de gen de post-transcripción se ha observado para secuencias tan pequeñas como de 60 poiinucleótidos (Sijen et al., Plant Cell, 8:2277-2294, 1996; Mains, Plant Mol. Blol. 43:261-273, 2000).

EJEMPLO 3 El frijol de soya (Glycine max) ha sido genéticamente modificado para ser tolerante a glifosato mediante la expresión de EPSPS de clase II asilado de Agrobacteríum (Padgette et al. Crop Sci. 35:1451-1461 , 1995). Una secuencia de gen de EPSPS nativa de frijol de soya se ha identificado y una secuencia de polinucleótido artificial se ha diseñado usando el método de la presente invención. El polinucleótido artificial codifica una secuencia de proteína que se modifica para producir una enzima EPSPS resistente a glifosato (GmEPSPSJKS, SEQ ID NO:5) al remplazar los aminoácidos T a l, R a K y P a S dentro del motivo de GNAGTAMRP, dando por resultado una enzima EPSPS de frijol de soya modificada con el motivo GNAGIAMKS (SEQ ID NO:34), también referido como muíante de IKS. La expresión de una enzima EPSPS modificada en las células de una planta por transformación con un cassette de expresión de planta de transgén, que contiene un polinucleótido que codifica el EPSPS modificado con el motivo GNAGIAMKS conferirá tolerancia al glifosato a las plantas. Las sustituciones de aminoácidos adicionales para la arginina (R) en el motivo también pueden incluir asparagina (N).

CUADRO 12 Construcción de polinucleótido para gen de EPSP sintasa de frijol de sova modificado (GmEPSPS GM, SEQ ID NO:7) 1. Retrotraducir SEQ ID NO:5 para generar una secuencia de polinucleótido artificial usando el cuadro de uso de codones de Glycine max (Cuadro 4). 2. Realizar alienación de secuencia con secuencia de polinucleótido de GmEPSPS_Nat (SEQ ID NO:6) y secuencia de polinucleótido artificial para determinar el grado de identidad de secuencia, mapear marcos de lectura abiertos, seleccionar patrones para buscar e identificar secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. 3. Hacer correcciones a los codones usados en la secuencia de polinucleótido artificial para lograr el porcentaje deseado de identidad de secuencia y para evitar agrupación de codones idénticos. Esto es especialmente importante para aminoácidos que ocurren a alta frecuencia, es decir, alanina, glicina, histidina, leucina, serina, y valina. La distribución aproximada de uso de codones en la secuencia de polinucleótido de conformidad con el uso de codones de Glycine max, cuadro 4. 4. La secuencia de polinucleótido se inspecciona para regiones locales que tienen una relación de GC:AT mayor que aproximadamente 2 sobre un intervalo de aproximadamente 50 nucleótidos contiguos. La secuencia de polinucleótido se ajusta según es necesario, sustituyendo codones en estas regiones de tai manera que la relación de GC:AT es menor que aproximadamente 2 y la composición de polinucleótido completa está en el intervalo de 0.9-1.3. 5. Seguir los pasos 6-12 del cuadro 6.

CUADRO 13 Comparación del por ciento de identidad de secuencia del GmEPSPS modificado a nivel de secuencia de polinucleótido El gen de EPSPS nativo de frijol de soya es modificado usando un cuadro de codones de frijol de soya (cuadro 4) y las condiciones del método de la presente invención. La relación relativa de GC:AT no es cambiada en el gen modificado, sin embargo la identidad de secuencia entre los dos se reduce a 72%.

EJEMPLO 4 El gen de polinucleótido de aroA nativo aislado de la cepa CP4 de Agobacterium (patente de E.U.A. No. 5,633,435, incorporada aquí por referencia en su totalidad) que codifica una EPSP sintasa resistente al glifosato (SEQ ID NO:15) puede ser modificado por el método de la presente invención para proveer un polinucleótido que tiene el uso de codones de Arabidopsis, Zea mays, o Glycine max. Para la expresión apropiada de CP4EPSPS para conferir tolerancia al glifosato en plantas, un péptido de tránsito de cloroplasto es necesariamente fusionado a la secuencia de codificación de CP4EPSPS para dirigir la acumulación de la enzima a los cloroplastos. El péptido de tránsito de cloroplasto CTP2 es comúnmente usado para la expresión de este gen en plantas transgénicas (Nida eí al., J. Agrie, Food Chem. 44:1960-1966, 1996). La secuencia de CP4EPSPS junto con el polinucleótido de CTP2 (SEQ ID NO:11 ) ha sido modificada por el método de la presente invención. Otros péptidos de tránsito de cloroplasto conocidos en la técnica se pueden fusionar al CP4EPSPS para dirigir la enzima a los cloroplastos.

CUADRO 14 Construcción de polinucleótido para EPSP síntasa de aroA:CP4 que codifica la secuencia (CP4EPSPS AT, CP4EPSPS ZM o CP4EPSPS GM 1. Colocar la secuencia de péptido de tránsito de CTP2 (SEQ ID NO:11) enfrente de CP4EPSPS (SEQ ID NO:15) como un polipéptido de fusión. Retrotraducir el polipéptido de fusión para producir una secuencia de polinucleótido artificial usando el cuadro de uso de codones de Arabidopsis thaliana (cuadro 2), o el cuadro de uso de codones de Zea mays (cuadro 3), o el cuadro de uso de codones de Glycine max (cuadro 4). 2. Realizar alineación de secuencia con CTP2 nativo (SEQ ID NO:12) y secuencia de polinucleótido de CP4EPSPS nativo (SEQ ID NO:16) y la secuencia de polinucleótido artificial para determinar el grado de identidad de secuencia, mapear marcos de lectura abiertos, seleccionar patrones para buscar e identificar secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. 3. Hacer correcciones a los codones usados en la secuencia de polinucleótido artificial para lograr el porcentaje deseado de identidad de secuencia y para evitar agrupación de codones idénticos. Esto es especialmente importante para aminoácidos que ocurren a alta frecuencia, es decir, alanina, glicina, histidina, ieucina, serina, y valina. La distribución aproximada de uso de codones en la secuencia de polinucleótido de acuerdo con el uso de codones de Arabidopsis thaliana, cuadro 2, o el cuadro de uso de codones de Zea mays (cuadro 3) dependiendo del cuadro en uso 4. La secuencia de polinucleótido artificial se inspecciona para regiones locales que tienen una relación de GC:AT mayor que aproximadamente 2 sobre un intervalo de aproximadamente 50 nucleótidos contiguos. La secuencia de polinucleótido se ajusta según es necesario, sustituyendo codones en estas regiones de tal manera que la relación de GC:AT es menor que aproximadamente 2 y la composición de polinucleótido completa está en el intervalo de 0.9-1.3 si se usa el cuadro 2 y 1.2-1.7 si se usa el cuadro 3. 5. Seguir los pasos 6-12 del cuadro 6.

CUADRO 15 Comparación del por ciento de identidad de secuencia de los polinucleótidos de CP4EPSPS artificiales * Por ciento de identidad se refiere al CP4EPSPS y no incluye péptido de tránsito.

CUADRO 16 La composición de nucleótido y relación de GC:AT de las secuencias de polinucleótido artificiales para la secuencia de gen de CP4EPSPS A C G T GC:AT CTP2CP4 GM 382 375 442 397 1.05 CTP2CP4 AT 369 408 469 350 1.22 CTP2CP4 ZM 312 487 577 290 1.65 La secuencia de polinucleótido CTP2_Nat (SEQ ID NO:12) más CP4EPSPS_Nat (SEQ ID NO:16) designada como CTP2CP4_Nat se compara en el cuadro 15 con las secuencias de polinucleótido artificial designadas como CTP2CP4_AT (CTP2_AT, SEQ ID NO: 13 fusionada a CP4EPSPS_AT, SEQ ID NO:17) y CTP2CP4_ZM (CTP2_AT, SEQ ID NO:14 fusionada a CP4EPSPS_ZM, SEQ ID NO:18) producidas por el método de la presente invención. La secuencia de polinucleótido que es la más divergente de la secuencia nativa CTP2CP4_NAT y CTP2CP4EPSPS_Syn es CTP2CP4_AT que tiene aproximadamente 73% y 75% de identidad de secuencia, respectivamente. La secuencia de polinucleótido de CTP2CP4_ZM en comparación con CTP2CP4_Nat y CP4EPSPS_Syn tiene aproximadamente 83% y 78% de identidad a estas dos secuencias, respectivamente. Un criterio principal para la selección de transgenes para combinar en una planta es el por ciento de identidad. El cuadro 15 se puede usar para seleccionar una molécula de polinucleótido de CP4EPSPS para la construcción de cassette de expresión de planta cuando se sabe que la planta receptora contendrá más de un polinucleótido de CP4EPSPS. La relación de GC:AT en CP4EPSPS nativo es de aproximadamente 1.7. La versión artificial con la desviación del codón Zea mays se produce para que tenga una relación de GC:AT muy similar. En la versión de codón de Arabidopsis, la relación de GC:AT se reduce a aproximadamente 1.2. La expresión de genes también es un criterio para la selección de transgenes que han de ser expresados. La expresión de un transgén puede variar en diferentes plantas de cultivo, por lo tanto que tienen varias secuencias de codificación de polinucleótido artificiales para probarse en diferentes plantas de cultivo y genotipos, variedades o cultivares es una ventaja y un aspecto de la invención.

EJEMPLO 5 La secuencia de polinucleótido bar (SEQ ID NO:20) que codifica una proteína fosfinotricina acetiltransferasa (SEQ ID NO: 19) se ha usado para modificar genéticamente plantas para resistencia a herbicida de glufosinato. Dos nuevas secuencias de polinucleótido bar han sido diseñadas usando el método de la presente invención. La alineación de BAR1_Nat con los dos nuevos polinucleótidos de BAR1 artificiales se muestra en las figuras 4A-4C.

CUADR0 17 Construcción de gen de polinucleótido para BAR1 AT (SEQ ID NO:21) y BAR1 ZM (SEQ ID NO:22) 1. Retrotraducir SEQ ID NO:19 para generar una secuencia de polinucleótido usando el cuadro de uso de codones de Arabidopsis thaliana (Cuadro 2) o el cuadro de uso de codones de Zea mays (cuadro 3). 2. Realizar alienación de secuencia con secuencia de polinucleótido de BAR1_Nat nativo (SEQ ID NO:20) y secuencia de polinucleótido artificial para determinar el grado de identidad de secuencia, mapear marcos de lectura abiertos, seleccionar patrones para buscar e identificar secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. 3. Hacer correcciones a los codones usados en la secuencia de polinucleótido artificial para lograr el porcentaje deseado de identidad de secuencia y para evitar agrupación de codones idénticos. Esto es especialmente importante para aminoácidos que ocurren a alta frecuencia, es decir, alanina, glicina, histidina, leucina, serina, y valina. La distribución aproximada de uso de codones en la secuencia de polinucleótido de acuerdo con el uso de codones de Arabidopsis thaliana, cuadro 2, o el cuadro de uso de codones de Zea mays (cuadro 3) dependiendo del cuadro en uso. 4. La secuencia de polinucleótido artificial se inspecciona para regiones locales que tienen una relación de GC:AT mayor que aproximadamente 2 sobre un intervalo de aproximadamente 50 nucleótidos contiguos. La secuencia de polinucleótido se ajusta según es necesario, sustituyendo codones en estas regiones de tal manera que la relación de GC:AT es menor que aproximadamente 2 y la composición de polinucleótido completa está en el intervalo de 0.9-1.3 si se usa el cuadro 2 y 1.2-1.7 si se usa el cuadro 3. 5. Seguir los pasos 6-12 del cuadro 6. La identidad de secuencia de polinucleótidos de BAR artificiales es el intervalo de 73-77% (cuadro 18). El polinucleótido nativo es altamente rico en GC. La versión artificial (BAR1_ZM) con la desviación de codón de Zea mays ha reducido la relación de GC:AT a aproximadamente 1.3 y versión artificial (BAR1_AT) con desviación de codón de Arabidopsis la relación es de aproximadamente 1.0 (cuadro 19).

CUADRO 18 Por ciento de identidad de secuencia entre genes bar en el nivel de secuencia de polinucleótido CUADRO 19 La composición de nucleótido y relación de GC:AT de las secuencias de polinucleótido artificial para la secuencia de gen bar BAR AT 139 130 144 139 1.01 BAR ZM 122 156 154 120 1.28 EJEMPLO 6 Este ejemplo sirve para ¡lustrar construcciones de ADN para la expresión de los polinucleótidos artificiales de la presente invención en plantas. Un cassette de expresión en plantas de ADN de transgén comprende elementos reguladores que controlan la transcripción de ARNm del cassette. Un cassette de expresión en planta se construye para incluir un promotor que funciona en plantas que está operablemente ligado a una región anterior 5' que está operablemente ligada a una secuencia de ADN de interés operablemente ligada a una región de terminación 3'. Estos casetes se construyen en vectores de plásmido que después pueden ser transferidos a plantas por métodos de transformación mediados por Agrobacterium u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica de transformación en plantas. Las construcciones de vector de plásmido siguientes se ¡lustran para proveer ejemplos de plásmidos que contienen casetes de expresión en plantas que comprenden las moléculas de polinucleótido artificial de la presente invención y no se limitan a estos ejemplos. Las moléculas de polinucleótido artificial de la presente invención, por ejemplo, CP4EPSPS_AT y CP4EPSPS_ZM se sintetizan usando iniciadores de traslape. El producto de longitud completa es después amplificado con iniciadores específicos de gen que contienen porciones colgantes con Sphl (iniciador hacia adelante) y EcoRI (iniciador de reversa). Los genes se clonan en el vector pCRI l-TOPO (lnvitrogen, CA). Los plásmido resultantes pMON54949 (CP4EPSPS_AT, figura 6) y pMON54950 (CP4EPSPS_ZM, figura 7) contiene el polinucleótido artificial y estos polinucleótidos son secuenciados usando métodos de secuenciación de ADN para confirmar que las modificaciones diseñadas por el método de la presente invención están contenidas en los polinucleótidos artificiales. En el siguiente paso, el polinucleótido artificial que codifica el péptido de tránsito de cloroplasto CTP2 está ligado al extremo 5' de los polinucleótidos CP4EPSPS. El promotor CaMV 35S con un incrementador duplicado (P-CaMVe35S) y un intrón de actina 1 de arroz (l-OsActl) derivado de pMON30151 (figura 8) por digestión con Sphl y Hindlll ligado a los polinucleótidos CTP2CP4EPSPS para crear los plásmidos pMON59302 (CTP2CP4EPSPS_AT, figura 9) y pMON59307 (CTP2CP4EPSPS_ZM, figura 10). Para la expresión de los nuevos polinucleótidos artificiales en plantas monocotiledóneas, los genes se colocan en casetes de expresión de plantas que contienen el extremo 5' del polinucleótido, un promotor y un intrón, una región no traducida 5', y en el extremo 3' del polinucleótido una señal de terminación de transcripción. Para este propósito, pMON42411 (Figura 11) que contiene P-CaMV35S:en, I-HSP70, CTP2CP4_Nat y NOS 3' son digeridos con enzimas de restricción Ncol y EcoRI. Los pMON59302 (figura 9) y pMON59307 (figura 10) son digeridos con las mismas enzimas de restricción. Los fragmentos son purificados en gel usando un equipo de purificación de gel Qiagen y ligados para formar pMON58400 (CP4EPSPS_AT, figura 12) y pMON58401 (CP4EPSPS_ZM, figura 13). El vector adicional pMON54964 (figura 14), que contiene P-OsAct1/ l-OsAct1 se hace reemplazando P-e35S/l-HSP70 de pMON58400 (figura 12) usando el fragmento HindIII /Ncol de p ON25455 (figura 15). Para crear un vector de expresión de monocotiledóneas que contiene el promotor P-FMV, pMON30152 (figura 16) es digerido con Nhel, los extremos son rasurados con T4ADN polimerasa en presencia de 4 dNTP-s (200 µ?) y Ncol. Los fragmentos CPT2CP4_AT o CTP2CP4_ZM ADN son asilados de pMON59302 (figura 9) o pMON59307 (figura 0), respectivamente por digestión con EcoRI, rasurando con T4 ADN polimerasa y digestión con Ncol. Los fragmentos de ADN purificados en gel son ligados y se crean nuevos plásmidos pMON54992 (CTP2CP4_AT, figura 17) y pMON54985 (CTP2CP4_Z , figura 18). En cada caso, la construcción de plásmido exitosa es confirmada por digestión con endonucleasa de restricción, usando entre otros Clal (introducido a ambos polinucleótidos artificiales) y Pst I (introducido a CP4EPSPS_ZM). El CP4EPSPS_Nat presente en vectores progenitores tiene ambos Clal y dos sitios de restricción PstI en la región codificadora en diferente lugar que en los polinucleótidos artificiales. Para la expresión de los polinucleótidos CP4EPSPS artificiales en plantas dicotiledóneas, se usan dos vectores progenitores: pMON20999 (P-FMV/CTP2CP4_Syn/3'E-9, figura 19) y pMON45313 (P-e35S/CTP2CP4_Syn/3'E9, figura 20). En cada plásmido, un fragmento de ADN que contiene el polinucleótido CTP2CP4_Syn es remplazado por CTP2CP4_AT o CTP2CP4_ZM. Para crear p ON59308 (P-CaMVe35S/CTP2CP4_AT, figura 21 ) o pMON59309 (P-CaMVe35S/CTP2CP4_ZM, figura 22), pMON45313 es digerido con Ncol y EcoRI y los fragmentos de restricción de ADN derivados de digestión con Ncol/EcoRI de pMON59302 (CTP2CP4_AT, figura 9) o pMON59307 (CTP2CP4_ZM, figura 10) son ligados, respectivamente. Para crear pMON59313 (P-FMV/CTP2CP4_AT/3'E9, figura 23) y pMON59396 (P-FMV/CTP2CP4_ZM/3'E9, figura 24) el plásmido progenitor pMON20999 es digerido con Ncol y BamHI para remover CTP2CP4_Syn y los fragmentos de restricción Ncol/BamHI derivados de pMON59308 (CTP2CP4_AT, figura 21) o p ON59309 (CTP2CP4_ZM, figura 22) son ligados, respectivamente.

EJEMPLO 7 Los polinucleótidos artificiales se prueban para determinar la eficacia para conferir a plantas transgénicas tolerancia al glifosato. Cinco cassettes de expresión diferentes (cuadro 20) con los nuevos polinucleótidos de CP4EPSPS artificiales son retransformados en maíz y plantas de maíz transgénicas resultantes comparadas con el estándar comercial (Roundup Ready® Corn 603, Monsanto Co.). El plásmido pMON25496 (figura 25) contenido en el estándar comercial tiene dos copias del polinucleótido CP4EPSPS_Nat, la expresión impulsada por los promotores P-CaMVe35S (P-CaMVe35S) y P-OsAct1 , respectivamente. Los plásmidos que contienen los polinucleótidos CP4EPSPS artificiales nuevos contienen únicamente una sola copia del polinucleótido que ha de ser probado. La expresión de estos polinucleótidos es impulsada por el promotor P-Ca Ve35S con el intrón I-Hsp70 de proteína de choque térmico o el promotor P-FMV con un intrón de sacarosa sintasa de arroz (1-GsSS). El plásmido pMON54964 contiene promotor de actina 1 de arroz con el primer intrón nativo (patente de E.U.A. No. 5,641 ,876, incorporada aquí por referencia en su totalidad). Estos plásmidos son transformados en células de maíz por un método mediado por Agrobacteríum y líneas de maíz transgénicas regeneradas sobre selección de glifosato. Las plantas de maíz transgénicas pueden ser producidas por un método de transformación mediado por Agrobacteríum. Una cepa de Agrobacteríum desarmada C58 (ABI) que porta una construcción binaria de la presente invención se usa. Este es transferida a Agrobacteríum por un método de apareamiento triparental (Ditta et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 77:7347-7351 ). Cultivos líquidos de Agrobacteríum se inician a partir de abastecimiento de glicero, o de placa recién estriada y se hacen crecer durante la noche a 26°C-28°C con agitación (aproximadamente 150 rpm) a una fase de crecimiento mid-log en medio LB líquido, pH 7.0 que contiene los antibióticos apropiados. Las células de Agrobacteríum son resuspendidas en el medio de inoculación (CM4C líquido) y la densidad se ajusta a DO660 de 1 . Embriones de maíz HiLLxLH198 y HUI inmaduros de tipo II recién asilados son inoculados con Agrobacteríum que contiene una construcción y se co-cultivan varios días en la oscuridad a 23°C. Los embriones son después transferidos a medio de retraso e incubados a 28°C durante algunos días o más. Todos los cultivos subsecuentes se mantienen a esa temperatura. Los embriones son transferidos al primer medio de selección que contiene carbenicilina 500/0.5 mM (glifosato). Dos semanas más tarde, el tejido sobreviviente es transferido a un segundo medio de selección que contiene carbenicilina 500/1.0 mM (glifosato). Se subcultivan los callos sobrevivientes cada 2 semanas hasta que los eventos pueden ser identificados. Esto puede llevar aproximadamente 3 subcultivos en glifosato 1.0 mM. Una vez que se identifican los eventos, se recoge el tejido para regenerar. Las plántulas son transferidas a un medio MSOD en un recipiente de cultivo y se mantienen durante dos semanas. Después las plantas con raíces son transferidas al suelo. Los expertos en la técnica de transformación de maíz pueden modificar este método para proveer plantas de maíz transgénicas sustancialmente idénticas que contienen composiciones de ADN de la presente invención. Aproximadamente 30 líneas de maíz transgénicas para cada construcción de plásmido se prueban y la eficiencia de transformación y los niveles de expresión de la enzima CP4EPSPS se muestran en el cuadro 20. Las líneas de maíz transgénicas se tratan con glifosato a una tasa de 1814 g/0.4 hectáreas como plantas jóvenes, las plantas sobrevivientes se prueban por CP4EPSPS ELISA (Padgette et al. Crop Sci. 35:1451-1461 , 1995) para determinar los niveles de expresión de proteína CP4 EPSPS (% de exp de CP4) mostrados en el cuadro 20, y el nivel de expresión se compara con la planta de maíz tolerante al glifosato estándar comercial mente disponible (Roundup Ready® maíz 603, Monsanto Co. , St. Louis, MO) como un por ciento de la cantidad de expresión de proteína determinada en el estándar comercial. Generalmente, más de 50% de líneas de maíz sobreviven la aspersión con 1814 g/0.4 hectáreas de glifosato. Se muestra que las plantas sobrevivientes tienen un alto nivel de expresión de CP4EPSPS que varía de aproximadamente 75 a 86% de estándar comercial 603.

CUADRO 20 Eficiencia de transformación (TE), expresión de CP4 (% de promedio) derivada de transformación de diferentes construcciones de CP4-alt * La expresión de CP4EPSPS se calcula como por ciento de control (603) hecho en plantas que sobrevivieron la aspersión de glifosato (1814 g/0.4 hectáreas).

EJEMPLO 8 Tres construcciones de plásmido se evalúan en plantas de algodón transgénicas (cuadro 21). La construcción de control (pMON20999) contiene P-FMV/CP4EPSPS_Syn este cassette de expresión está contenido en la línea de algodón 1445 tolerante al glifosato comercialmente disponible (Roundup Ready® algodón, Monsanto Co., St. Louis, MO). Las construcciones de plásmido, pMON593 3 y pMON59396 que contiene los polinucleótidos CP4EPSPS_AT y CP4EPSPS_ZM, respectivamente, se prueban para eficiencia de transformación y los niveles de enzima de CP4EPSPS relativos al cassette de expresión tolerante al glifosato comercial.

Aproximadamente cincuenta líneas de algodón transgénicas son evaluadas para cada construcción. El polinucleótido artificial CP4EPSPS_AT impulsado por el promotor P-FMV da un porcentaje más alto de plantas con un solo inserto, y un incremento en el nivel de expresión de la enzima CP4EPSPS en relación con el cassette de expresión de p ON20999 como se mide por ELISA.

CUADRO 21 Eficiencia de transformación (TE), expresión de CP4EPSPS promedio en líneas de algodón R0 derivadas de transformación de diferentes construcciones de CP4EPSPS EJEMPLO 9 Las construcciones que contienen los polinucleótidos CP4EPSPS artificiales, CP4EPSPS_AT y CP4EPSPS_ZM son evaluadas en frijol de soya (Cuadro 22). Las construcciones de plásmido contienen todas ellas el promotor P-FMV para impulsar la expresión de nuevos polinucleótidos CP4EPSPS y se comparan con el P-FMV/CP4EPSPS_Syn contenido en pMON20999. Aproximadamente 25 a 30 plantas de soya transgénicas se producen para cada construcción. La eficiencia de transformación y los niveles de enzima de CP4EPSPS se miden. Un nivel de expresión sorprendentemente alto de proteína CP4EPSPS se mide en plantas de frijol de soya que contienen la secuencia codificadora de CP4EPSPS_ZM (cuadro 22).

CUADRO 22 Eficiencia de transformación (TE), expresión de CP4 promedio derivada de transformación de diferentes construcciones de CP4EPSPS EJEMPLO 10 Las células de tabaco son transformadas con tres construcciones de plásmido que contienen diferentes secuencias de poiinucleótido CP4EPSPS y son regeneradas en plantas. Aproximadamente veinte líneas transgénicas son evaluadas de cada construcción. La expresión de cada uno de los polinucleótidos CP4EPSPS es impulsada por el promotor incrementador duplicado P-CaMVe35S (cuadro 23). La eficiencia de transformación y el nivel de expresión de enzima CP4EPSPS se mide. Las diferentes construcciones de poiinucleótido CP4EPSPS se muestran para realizar aproximadamente lo mismo en tabaco transgénico para eficiencia de transformación y expresión.

CUADRO 23 Eficiencia de transformación (TE), expresión de CP4 promedio en líneas de tabaco RO derivadas de transformación de diferentes construcciones de CP4 EPSPS EJEMPLO 11 Arabidopsis thaliana es transformada con cuatro construcciones de plásmido por infiltración bajo vacío (Bechtoid N, et al., CR Acad Sci Paris Sciences di la vie/life sciences 316: 1 194-1199, (1993)) y la progenie V1 se evalúa para comparar la eficacia de las secuencias de polinucleótido CP4EPSPS diferentes y los diferentes promotores para el uso en selección de plantas sobre glifosato (cuadro 24). Aproximadamente 30 plantas transgénicas V1 (+) se producen para cada construcción. Las construcciones impulsadas por P-CaMVe35S con incrementador duplicado (pMON45313, pMON59308, y pMON59309) muestran que no hay diferencia sustancial en el nivel de expresión en las hojas como se determina por ELISA. Las plantas son transformadas con pMON26140 que contiene CP4EPSPS_Syn impulsado por el promotor P-FMV, estas plantas muestran el nivel de expresión más alto, los niveles de expresión detectados de las plantas de las construcciones de prueba se comparan con pMON26140.

CUADRO 24 Evaluación de cassettes de expresión de CP4 diferentes en Arabidopsis EJEMPLO 12 Plantas de trigo transformadas con los nuevos polinucleótidos CP4EPSPS se comparan para eficiencia de transformación y expresión de enzima CP4EPSPS determinado por ELISA (cuadro 25). El CP4EPSPS_ZM provee por lo menos siete veces el nivel de expresión de enzima de CPEPSPS que CP4EPSPS_AT. La expresión promedio de CP4EPSPS en las hojas de plantas de trigo que contienen el polinucleótido CP4EPSPS_ZM es de aproximadamente 64% que el encontrado en trigo de resistente al glifosato que contiene una construcción de doble cassette, pMON30139: P-e35S/l-Hsp70/CP4EPSPS_Nat y P-OsACtl/l-OsActl/CP4EPSPS_Nat (WO/0022704).

CUADRO 25 Rendimiento de diferentes polinucleótidos CP4EPSPS en trigo EJEMPLO 13 Este ejemplo sirve para ilustrar la detección de diferentes polinucleótidos artificiales en plantas transgénicas, especialmente CP4EPSPS_AT y CP4EPSPS_ZM. Los otros polinucleótidos artificiales, OsEPSPS_AT, OsEPSPS_Z , GmEPSPS_GM, ZmEPSPS_ZM, CTP2_AT, CTP2_ZM, Bar1_AT y Bar1_ZM pueden ser todos específicamente detectados en plantas transgénicas por métodos que proveen un amplicón de ADN o por hibridación de una sonda de ADN a una misma planta. Los expertos en la técnica de detección de ADN pueden diseñar fácilmente moléculas iniciadoras de las secuencias de polinucleótido artificiales provistas en la presente invención para permitir un método que detectará específicamente el polinucleótido artificial en una muestra de plantas. El uso de un método o un equipo que provee iniciadores o sondas de ADN homologas o complementarias a los polinucleótidos artificiales que aquí se describen es un aspecto de la presente invención. Un método de detección de ADN (reacción de cadena de polimerasa, PCR) está diseñado para detectar los polinucleótidos CP4EPSPS artificiales en plantas transgénicas. Los conjuntos únicos de iniciadores de ADN mostrados en el cuadro 26 están diseñados para amplificar un polinucleótido CP4EPSPS específico y para proveer amplicones de tamaños distintos. Los amplicones difieren suficientemente en amplitud de polinucleótido entre los diversos polinucleótidos CP4EPSPS para la fácil separación de amplicones por electroforesis de gel de agarosa estándar. La presencia de más de uno de los polinucleótidos artificiales se puede detectar en una planta mediante el uso de un método de PCR multiplex.

CUADRO 26 Secuencia de iniciadores usados para la detección de diferentes genes CP4 en plantas transgénicas Los pares de iniciador de ADN (cuadro 26) se usan para producir un diagnóstico de amplicón para un polinucleótido CP4EPSPS especificado contenido en una planta transgénica. Estos pares de iniciadores incluyen pero no se limitan a SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25 para el polinucleótido CP4EPSPS_AT; SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27 para el CP4EPSPS_ZM; SEQ ID N0.28 y SEQ ID NO:29 para la molécula de polinucleótido CP4EPSPS_Nat y SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31 para el CP4EPSPS_Syn. Además de estos pares de iniciadores, cualquier par de iniciador derivado de SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:18 que cuando se usa en una reacción de amplificación de ADN produce un diagnóstico de amplicón de ADN para el polinucleótido CP4EPSPS respectivo es un aspecto de la presente invención. Las condiciones de amplificación para este análisis se ¡lustran en el cuadro 27 y cuadro 28, sin embargo, cualquier modificación de estas condiciones incluyendo el uso de fragmentos de molécula de ADN de la presente invención o complementos de la misma como moléculas iniciadores, que producen la molécula de ADN de amplicón como diagnóstico para polinucleótidos artificiales que aquí se describen está dentro del alcance de la técnica. Las moléculas de ADN de la presente invención incluyen por lo menos SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:35. Las moléculas de ADN que funcionan como moléculas de iniciador en un método de amplificación de ADN para detectar la presencia de los polinucleótidos artificiales incluyen pero no se limitan a SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31. En un método para determinar la presencia de polinucleótidos de la presente invención, el análisis de la muestra de extracto de ADN de tejido vegetal debe incluir un control positivo conocido que contenga el polinucleótido artificial, y un control de extracto de ADN negativo de una planta que no sea transgénica o que no contenga el polinucleótido artificial, y un control negativo que no contenga plantilla en el extracto de ADN. Moléculas de iniciador de ADN adicionales de suficiente longitud se pueden seleccionar de SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18 y las condiciones optimizadas para la producción de un amplicón que puede diferir de los métodos mostrados en el cuadro 27 y cuadro 28, pero que dé por resultado un diagnóstico de amplicón para los polinucleótidos artificiales. El uso de estas secuencias de iniciador de ADN homologas o complementarias a SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO: 8 usadas con o sin modificaciones de los métodos del cuadro 27 y cuadro 28 están dentro del alcance de la invención. La prueba para el amplicón CP4EPSPS_AT y CP4EPSPS_ZM se puede realizar usando un aparato Stratagene Robocycler, Máquina MJ, Perkin-Elmer 9700, o un termociclador de Gradiente de Ciclador Maestro de Eppendorf como se muestra en el cuadro 28, o por métodos y aparatos conocidos por los expertos en la técnica.

CUADRO 27 Procedimiento de amplificación de ADN y mezcla de reacción para la confirmación de polinucleótido artificial CP4EPSPS AT de EPSPS en plantas de maíz Paso Reactivo Cantidad Comentarios 1 Agua libre de nucleasa Añadir un volumen de 20 µ? - CUADRO 28 Parámetros de PCR sugeridos para diferentes termocicladores Mezclar suavemente y, si es necesario (parte superior no caliente en el termociclador), añadir 1-2 gotas de aceite mineral en la parte superior de cada reacción. Proceder con PCR en un aparato Stratagene Robocycler, máquina MJ, Perkin-Elmer 9700, o termociclador de Gradiente de Ciclador Maestro de Eppendorf usando los siguientes parámetros de ciclado. Nota: La Máquina MJ o el termociclador de Gradiente de Ciclador Maestro de Eppendorf se debe operar en el modo calculado. Operar el termociclador Perkin-Elmer 9700 con la velocidad de rampa fijada al máximo.

No de ciclo Valores fijados: Robociclador Stratagene 1 94°C 3 minutos 38 94°C 1 minuto 60°C 1 minuto 72°C 1 minuto y 30 segundos 1 72°C 10 minutos No de ciclo Valores fijados: Máquina MJ o Perkin-Elmer 9700 1 94°C 3 minutos 38 94°C 10 segundos 60°C 30 segundos 72°C 1 minuto 1 72°C 10 minutos No de ciclo Valores fijados: Gradiente de Ciclador Maestro Eppendorf 1 94°C 3 minutos 38 94°C 15 segundos 60°C 15 segundos 72°C 1 minuto 1 72°C 10 minutos Todas las composiciones y métodos descritos y reivindicados aquí se pueden hacer y ejecutar a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos aquí sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. De manera más específica, será evidente que ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados pueden sustituir a los agentes que aquí se describen mientras se logran los mismos resultados o resultados similares. Todos los sustituyentes similares y modificaciones evidentes para los expertos en la técnica se consideran que están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como lo definen las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas aquí se incorporan por referencia en su totalidad al mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara específicamente e individualmente para incorporarse por referencia.

USTADO DE SECUENCIAS <110> Flasinski, Stanislaw <120> METODOS PARA USAR POLI UCLEOTIDOS ARTIFICIALES Y COMPOSICIONES DE LOS MISMOS PARA REDUCIR SILENCIAMIENTO DE TRANSGENES <130> 11899.0235. OOPCOO <140> US 60/396,655 <141> 18-07-2002 <150> US 06/396,665 <151> 18-07-2002 <160> 35 <170> Patentln versión 3.2 <210> 1 <211> 515 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 1 Met Ala Ala Thr Met Ala Ser Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser 1 5 10 15 Leu Asp Gln Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Phe Ser Ser Arg Lys Gln 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ala Ala Arg Gly Gly Met Arg Val Arg Val Arg 35 40 45 Ala Arg Gly Arg Arg Glu Ala Val Val Val Ala Ser Ala Ser Ser Ser 50 55 60 Ser Val Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Glu Glu lie Val Leu Gln Pro 65 70 75 80 lie Arg Glu lie Ser Gly Ala Val Gln Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu 85 90 95 Ser Asn Arg lie Leu Leu Leu Ser Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val 100 105 110 Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Glu Ala 115 120 125 Leu Lys Ala Leu Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Val Ala Lys Arg 130 135 140 Ala Val Val Val Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Lys Asp Ala 145 150 155 160 Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly lie Ala Met Arg 165 170 175 Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val 180 185 190 Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro lie Gly Asp Leu Val 195 200 205 Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr 210 215 220 Glu Cys Pro Pro Val Arg Val Lys Gly lie Gly Gly Leu Pro Gly Gly 225 230 235 240 Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser lie Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu 245 250 255 Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu lie Glu lie lie 260 265 270 Asp Lys Leu lie Ser lie Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met 275 280 285 Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe 290 295 300 Tyr lie Lys Gly Gly Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Tyr Val 305 310 315 320 Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala lie 325 330 335 Thr Gly Gly Thr Val Thr Val Gln Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln 340 345 350 Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val 355 360 365 Thr Trp Thr Asp Thr Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro 370 375 380 Tyr Gly Lys Lys His Leu Lys Ala Val Asp Val Asn Met Asn Lys Met 385 390 395 400 Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly 405 410 415 Pro Thr Ala lie Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu 420 425 430 Arg Met Val Ala lie Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val 435 440 445 Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys lie lie Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn 450 455 460 lie Thr Ala lie Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe 465 470 475 480 Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp Val Pro Val Thr lie Arg Asp Pro Gly 485 490 495 Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asn Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe 500 505 510 Val Arg Asn 515 <210> 2 <211> 1548 <212> ADN <213> Oryza. sativa <400> 2 atggcggcga ccatggcgtc caacgccgcg gctgcggcgg cggtgtccct ggaccaggcc gtggcggcgt cggcggcgtt ctcgtcgcgg aagcagctgc ggctgcccgc cgcggcgcgc ggggggatgc gggtgcgggt gcgggcgcgg gggcggcggg aggcggtggt ggtggcgtcc 180 gcgtcgtcgt cgtcggtggc agcgccggcg gcgaaggcgg aggagatcgt gctccagccc 240 atcagggaga tctccggggc ggttcagctg ccagggtcca agtcgctctc caacaggatc 300 ctcctcctct ccgccctctc cgagggcaca acagtggtgg acaacttgct gaacagtgag 350 gatgttcact acatgcttga ggccctgaaa gccctcgggc tctctgtgga agcagataaa 420 5 gttgcaaaaa gagctgtagt cgttggctgt ggtggcaagt ttcctgttga gaaggatgcg 480 aaagaggaag tgcaactctt cttggggaac gctggaatcg caatgcgatc cttgacagca 540 gccgtgactg ctgctggtgg aaatgcaact tatgtgcttg atggagtgcc acgaatgagg 600 gagagaccga ttggtgactt ggttgtcggg ttgaaacaac ttggtgcgga tgtcgactgt 660 ttccttggca ctgaatgccc acctgttcgt gtcaagggaa ttggaggact tcctggtggc 720 aaggttaagc tctctggttc catcagcagt cagtacttga gtgccttgct gatggctgct 780 10 cctttggccc ttggggatgt ggagatcgaa atcattgaca aactaatctc cattccttac 840 gttgaaatga cattgagatt gatggagcgt tttggtgtga aggcagagca ttctgatagt 900 tgggacagat tctatattaa gggagggcag aagtacaaat ctcctggaaa tgcctatgtt 960 gaaggtgatg cctcaagcgc gagctatttc ttggctggtg ctgcaatcac tggaggcact 1020 gtgacagttc aaggttgtgg tacgaccagt ttgcagggtg atgtcaaatt tgctgaggta 1080 cttgagatga tgggagcaaa ggttacatgg actgacacca gtgtaaccgt aactggtcca 1140 j5 ccacgtgagc cttatgggaa gaaacacctg aaagctgttg atgtcaacat gaacaaaatg 1200 cctgatgttg ccatgaccct tgccgttgtt gcactcttcg ctgatggtcc aactgctatc 1260 agagatgtgg cttcctggag agtaaaggaa accgaaagga tggttgcaat tcggaccgag 1320 ctaacaaagc tgggagcatc ggttgaagaa ggtcctgact actgcatcat caccccaccg 1380 gagaagctga acatcacggc aatcgacacc tacgatgatc acaggatggc catggccttc 1440 tccctcgctg cctgcgccga cgtgcccgtg acgatcaggg accctggttg cacccgcaag 1500 2Q accttcccca actacttcga cgttctaagc actttcgtca ggaactga 1548 <210> 3 <211> 1548 <212> ADN <213> Oryza sativa <400> 3 atggctgcaa ctatggctag taacgcagcg gctgccgctg ccgtttcctt agaccaagca 60 gtagcagcga gcgctgcatt ctcatcacgt aagcaactac ggctaccagc agccgctaga 120 ggcggcatga gagttagagt gagggctaga ggtaggcggg aggctgtagt cgtagcctcc 180 gcttctagca gttcggtggc tgcgccggct gctaaggcag aggagattgt tttacaacct 240 attagggaaa tatcgggggc cgtacaatta cctggaagca agagcctttc caacaggatt 300 ctgttgcttt cagctctctc ggagggaaca acagttgtgg ataatctgtt gaatagtgag 360 gatgtgcact atatgctaga ggctctcaag gctctagggc tttctgtaga agcggataaa 420 gtagcaaaac gcgcagtggt tgtaggttgt ggtgggaagt tcccagttga aaaggatgct 480 aaggaagaag tacagctctt tctcgggaat gccgggatcg ccatgcggag tttgactgct 540 gcggtcacag ccgctggagg caacgcaaca tacgtcctag atggggtgcc gagaatgcgt 600 gagcgtccta ttggtgatct tgtcgtaggt ctcaagcaac tcggcgctga cgtagattgt 660 ttcctgggta ctgagtgtcc gccagtcaga gttaaaggaa tcggtgggct gccgggcgga 720 aaggtcaagc tgtcgggcag tatttcgagt cagtatcttt ctgctctcct gatggctgcg 780 ccattagctt tgggagatgt tgagatcgag atcattgata aacttatatc tatcccgtat 840 gtcgagatga ctttaagact tatggaacgg tttggggtta aggccgagca tagcgacagt 900 tgggatcgtt tctacataaa gggaggccag aagtataagt ctcctgggaa tgcttatgta 960 gaaggggatg cttcatctgc gtcttacttc cttgcgggag cggctataac tggaggaaca 1020 gtcacagttc agggctgcgg tacaacaagt ttgcaaggtg acgtgaagtt tgccgaggta 1080 cttgaaatga tgggtgccaa agtaacgtgg acagacacat cggtgacagt tactggtcct 1140 ccacgagaac cttacggcaa aaagcatctt aaggccgtgg atgttaatat gaataagatg 1200 cctgacgttg ctatgacact tgccgttgtt gccctttttg cagacggccc aacggcgata 1260 cgcgatgttg catcatggcg cgtcaaggaa acggagagga tggtggctat tcgaactgaa 1320 ctcaccaaac ttggtgcctc tgtagaggag ggccctgatt actgtatcat tacaccccct 1380 gagaaactta acatcactgc tattgataca tacgacgatc atagaatggc tatggctttc 1440 tcactggccg cttgtgcaga tgttcctgtc acaatcagag atcctggctg tactagaaag 1500 acgttcccga actactttga tgttctttca acattcgtcc gcaattga 1548 <210> 4 <211> 1548 <212> ADN <213> Oryza. sativa <400> 4 atggctgcaa ctatggctag taacgcagcg gctgccgctg ccgtttcctt agaccaagca 60 gtagcagcga gcgctgcatt ctcatcacgt aagcaactac ggctaccagc agccgctaga 120 ggcggcatga gagttagagt gagggctaga ggtaggcggg aggctgtagt cgtagcctcc 180 gcttctagca gttcggtggc tgcgccggct gctaaggcag aggagattgt tttacaacct 240 attagggaaa tatcgggggc cgtacaatta cctggaagca agagcctttc caacaggatt 300 ctgttgcttt cagctctctc ggagggaaca acagttgtgg ataatctgtt gaatagtgag 360 gatgtgcact atatgctaga ggctctcaag gctctagggc tttctgtaga agcggataaa 420 gtagcaaaac gcgcagtggt tgtaggttgt ggtgggaagt tcccagttga aaaggatgct 480 aaggaagaag tacagctctt tctcgggaat gccgggatcg ccatgcggag tttgactgct 540 gcggtcacag ccgctggagg caacgcaaca tacgtcctag atggggtgcc gagaatgcgt 600 gagcgtccta ttggtgatct tgtcgtaggt ctcaagcaac tcggcgctga cgtagattgt 660 ttcctgggta ctgagtgtcc gccagtcaga gttaaaggaa tcggtgggct gccgggcgga 720 aaggtcaagc tgtcgggcag tatttcgagt cagtatcttt ctgctctcct gatggctgcg 780 ccattagctt tgggagatgt tgagatcgag atcattgata aacttatatc tatcccgtat 840 gtcgagatga ctttaagact tatggaacgg tttggggtta aggccgagca tagcgacagt 900 tgggatcgtt tctacataaa gggaggccag aagtataagt ctcctgggaa tgcttatgta 960 gaaggggatg cttcatctgc gtcttacttc cttgcgggag cggctataac tggaggaaca 1020 gtcacagttc agggctgcgg tacaacaagt ttgcaaggtg acgtgaagtt tgccgaggta 1080 cttgaaatga tgggtgccaa agtaacgtgg acagacacat cggtgacagt tactggtcct 1140 ccacgagaac cttacggcaa aaagcatctt aaggccgtgg atgttaatat gaataagatg 1200 cctgacgttg ctatgacact tgccgttgtt gccctttttg cagacggccc aacggcgata 1260 cgcgatgttg catcatggcg cgtcaaggaa acggagagga tggtggctat tcgaactgaa 1320 ctcaccaaac ttggtgcctc tgtagaggag ggccctgatt actgtatcat tacaccccct 1380 gagaaactta acatcactgc tattgataca tacgacgatc atagaatggc tatggctttc 1440 tcactggccg cttgtgcaga tgttcctgtc acaatcagag atcctggctg tactagaaag 1500 acgttcccga actactttga tgttctttca acattcgtcc gcaattga 1548 <211> 525 <212> PRT <213> Glycine max <400> 5 Met Ala Gln Val Ser Arg Val Hls Asn Leu Ala Gln Ser Thr Gln lie 1 5 10 15 Phe Gly His Ser Ser Asn Ser Asn Lys Leu Lys Ser Val Asn Ser Val 20 25 30 Ser Leu Arg Pro Arg Leu Trp Gly Ala Ser Lys Ser Arg lie Pro Met 35 40 45 His Lys Asn Gly Ser Phe Met Gly Asn Phe Asn Val Gly Lys Gly Asn 50 55 60 Ser Gly Val Phe Lys Val Ser Ala Ser Val Ala Ala Ala Glu Lys Pro 65 70 75 80 Ser Thr Ser Pro Glu lie Val Leu Glu Pro lie Lys Asp Phe Ser Gly 85 90 95 Thr lie Thr Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg lie Leu Leu 100 105 110 Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Tyr 115 120 125 Ser Glu Asp lie His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu 130 135 140 Arg Val Glu Asp Asp Lys Thr Thr Lys Gln Ala lie Val Glu Gly Cys 145 150 155 160 Gly Gly Leu Phe Pro Thr Ser Lys Glu Ser Lys Asp Glu lie Asn Leu 165 170 175 Phe Leu Gly Asn Ala Gly lie Ala Met Lys Ser Leu Thr Ala Ala Val 180 185 190 Val Ala Ala Gly Gly Asn Ala Ser Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg 195 200 205 Met Arg Glu Arg Pro lie Gly Asp Leu Val Ala Gly Leu Lys Gln Leu 210 215 220 Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asn Cys Pro Pro Val Arg 225 230 235 240 Val Asn Gly Lys Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly 245 250 255 Ser Val Ser Ser Gln Tyr Leu Thr Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu 250 265 270 Ala Leu Gly Asp Val Glu lie Glu lie Val Asp Lys Leu lie Ser Val 275 280 285 Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Lys Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Ser 290 295 300 Val Glu His Ser Gly Asn Trp Asp Arg Phe Leu Val His Gly Gly Gln 305 310 315 320 Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Phe Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser 325 330 335 Ala Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Ala Ala lie Thr Gly Gly Thr lie Thr 340 345 350 Val Asn Gly Cys Gly Thr Ser Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala 355 3S0 3S5 Glu Val Leu Glu Lys Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Ser Glu Asn Ser 370 375 380 Val Thr Val Ser Gly Pro Pro Arg Asp Phe Ser Gly Arg Lys Val Leu 385 390 395 400 Arg Gly lie Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr 405 410 415 Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asn Gly Pro Thr Ala lie Arg Asp 420 425 430 Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thx Gl Arg Met lie Ala lie Cys 435 440 445 Thr Glu Leu Arg lys Leu Gly Ala Thr Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr 450 455 460 Cys Val lie Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala lie Asp Thr 465 470 475 480 Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Gly 485 490 495 Asp Val Pro Val Thr lie Lys Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe 500 505 510 Pro Asp Tyr Phe Glu Val Leu Glu Arg Leu Thr Lys His <210> 6 <211> 1578 <212> ADN <213> Glycine max <400> 6 atggcccaag tgagcagagt gcacaatctt gctcaaagca ctcaaatttt tggccattct 60 tccaactcca acaaactcaa atcggtgaat tcggtttcat tgaggccacg cctttggggg 120 gcctcaaaat ctcgcatccc gatgcataaa aatggaagct ttatgggaaa ttttaatgtg 180 gggaagggaa attccggcgt gtttaaggtt tctgcatcgg tcgccgccgc agagaagccg 240 tcaacgtcgc cggagatcgt gttggaaccc atcaaagact tctcgggtac catcacattg 300 ccagggtcca agtctctgtc caatcgaatt ttgcttcttg ctgctctctc tgagggaaca 360 actgttgtag acaacttgtt gtatagtgag gatattcatt acatgcttgg tgcattaagg 420 acccttggac tgcgtgtgga agatgacaaa acaaccaaac aagcaattgt tgaaggctgt 480 gggggattgt ttcccactag taaggaatct aaagatgaaa tcaatttatt ccttggaaat 540 gctggtatcg caatgaagtc cttgacagca gctgtggttg ctgcaggtgg aaatgcaagc 600 tacgtacttg atggggtgcc ccgaatgaga gagaggccaa ttggggattt ggttgctggt 660 cttaagcaac ttggtgcaga tgttgattgc tttcttggca caaactgtcc acctgttcgt 720 gtaaatggga agggaggact tcctggcgga aaggtgaaac tgtctggatc agttagcagt 780 caatacttga ctgctttgct tatggcagct cctttagctc ttggtgatgt ggaaattgag 840 attgttgata aactgatttc tgttccatat gttgaaatga ctctgaagtt gatggagcgt 900 tttggagttt ctgtggaaca cagtggtaat tgggataggt tcttggtcca tggaggtcaa 960 aagtacaagt ctcctggcaa tgcttttgtt gaaggtgatg cttcaagtgc cagttattta 1020 ctagctggtg cagcaattac tggtgggact atcactgtta atggctgtgg cacaagcagt 1080 ttacagggag atgtaaaatt tgctgaagtt cttgaaaaga tgggagctaa ggttacatgg 1140 tcagagaaca gtgtcactgt ttctggacca ccacgagatt tttctggtcg aaaagtcttg 1200 cgaggcattg atgtcaatat gaacaagatg ccagatgttg ccatgacact tgctgttgtt 1260 gcactatttg ctaatggtcc cactgctata agagatgtgg caagttggag agttaaagag 1320 actgagagga tgatagcaat ctgcacagaa ctcagaaagc taggagcaac agttgaagaa 1380 ggtcctgatt actgtgtgat tactccacct gagaaattga atgtcacagc tatagacaca 1440 tatgatgacc acagaatggc catggcattc tctcttgctg cttgtgggga tgttccagta 1500 accatcaagg atcctggttg caccaggaag acatttcctg actactttga agtccttgag 1560 aggttaacaa agcactaa 1578 210> 7 211> 1578 212> ADN 213> Glycine max 400> 7 atggctcagg tctctcgcgt tcataatctc gctcagagta cccagatatt cggacattcc 60 agtaactcaa acaaactaaa gtctgtgaat agtgtatcac ttcggcctcg gctgtgggga 120 gcaagtaaga gccgtatccc tatgcacaag aacggttcgt tcatggggaa ctttaacgtc 180 ggcaaaggaa 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cggtggcacc ataaccgtga acggctgcgg cacctcatcc 1080 cttcaaggtg atgtaaagtt cgctgaggtc ttggagaaaa tgggcgcaaa ggtcacatgg 1140 tctgagaaca gcgtaaccgt gtccggacct cccagagact ttcgtggtag aaaggtcctt 1200 aggggaatag atgtgaatat gaataagatg ccagatgtgg ctatgacgct cgctgttgtc 1260 gccctgttcg caaacggacc taccgcaata agggatgtcg cttcatggcg tgttaaggaa 1320 accgaacgga tgatcgctat ttgcaccgag ttgcgtaagc tgggtgcaac ggtggaagaa 1380 ggaccagact attgcgtgat aacacctcct gaaaagctca atgtgaccgc tattgacact 1440 tatgacgatc acagaatggc tatggcattc tcacttgctg cttgcggtga cgtgccggtt 1500 acgatcaagg acccagggtg tactaggaag acattcccag attactttga ggtgttggaa 1560 agattgacaa agcactga 1578 <210> 8 <211> 506 <212> PRT <213> Zea mays <400> 8 Met Ala Ala Met Ala Thr Lys Ala Ala Ala Gly T r Val Ser Leu Asp 1 5 10 15 Leu Ala Ala Pro Ser Arg Arg His His Arg Pro Ser Ser Ala Arg Pro 20 25 30 Pro Phe Arg Pro Ala Val Arg Gly Leu Arg Ala Pro Gly Arg Arg Val 35 40 45 lie Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gln Ala Gly 50 55 60 Ala Glu Glu 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Trp Thr Ala Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser Pro Arg 85 90 95 His Gln Arg Thr Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys 100 105 110 Ser Leu Glu Ala Gln Gly Phe Lys Ser Val Val Ala Val lie Gly Leu 115 120 125 Pro Asn Asp Pro Ser Val Arg Met His Glu Ala Leu Gly Tyr Ala Pro 130 135 140 Arg Gly Met Leu Arg Ala Ala Gly Phe Lys His Gly Asn Trp His Asp 145 150 155 160 Val Gly Phe Trp Gln Leu Asp Phe Ser Leu Pro Val Pro Pro Arg Pro 1S5 170 175 Val Leu Pro Val Thr Glu lie 180 21Q> 20 <211> 552 <212> ADN <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 20 atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60 gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120 caggaaccgc aggactggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180 gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240 aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300 ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360 agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420 ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480 gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540 accgagatct ga 552 <210> 21 <211> 552 <212> ??? <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 21 atgagtccag aaaggagacc ggctgatatt cggagagcca ccgaagctga tatgcctgct 60 gtttgtacaa tcgtaaacca ttatatcgag acctcgacag ttaattttcg cactgagccg 120 caggagccac aggattggac ggacgatctg gtacgtttaa gagaacgtta tccgtggcta 180 gttgctgagg ttgacggaga agtcgctggt atagcttacg ctggaccgtg gaaagctcgt 240 aacgcttacg actggacagc agaatccact gtctacgtca gccctcgtca tcaaagaacc 300 ggattaggga gcacgttgta cactcatctt ttaaagtcac tggaggcaca aggcttcaag 360 tctgttgtgg cagttattgg attgccaaac gatccgagtg tcgaatgca cgaagcgctt 420 ggatacgctc cacgaggtat gctccgtgct gccggattca aacatggaaa ttggcacgac 480 gtaggttttt ggcaactgga cttttcactt cccgttcccc ctagacctgt acttccagtt 540 actgaaatct ag 552 <210> 22 <211? 552 <212> ADN <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 22 atgtcgcctg agcgccgtcc tgctgacata agacgcgcta ccgaggcaga catgcctgct 60 gtttgcacca ttgtgaatca ctacatcgag acatctacgg taaacttccg cactgagcct 120 caagaaccgc aggattggac cgacgatctc gtgcgtctca gagagcgtta tccgtggctg 180 gttgcagagg tggacggtga agtggctggg atcgcctacg ctggaccgtg gaaggctaga 240 aacgcatacg attggactgc ggagtccaca gtctacgtct cacccagaca tcaaagaacc 300 gggctcggct cgaccctcta tacgcatctc ctcaagtcct tagaggcgca gggcttcaaa 360 tctgtagtgg cggtgatcgg cttgccaaac gatcccagtg tgagaatgca cgaggcactc 420 ggttacgctc ctagaggaat gctcagggcg gctggattca agcacggtaa ttggcacgac 480 gttggcttct ggcaactgga cttctctttg ccagttccac ctcgtcctgt gctacccgtc 540 accgaaatct ag 552 <210> 23 <211> 1368 <212> ADN <213> Agrobactexium t efaciens <400> 23 atgcttcacg gtgcaagcag ccgtccagca actgctcgta agtcctctgg tctttctgga 60 accgtccgta ttccaggtga caagtctatc tcccacaggt ccttcatgtt tggaggtctc 120 gctagcggtg aaactcgtat caccggtctt ttggaaggtg aagatgttat caacactggt 180 aaggctatgc aagctatggg tgccagaatc cgtaaggaag gtgatacttg gatcattgat 240 ggtgttggta acggtggact ccttgctcct gaggctcctc tcgatttcgg taacgctgca 300 actggttgcc gtttgactat gggtcttgtt ggtgtttacg atttcgatag cactttcatt 360 ggtgacgctt ctctcactaa gcgtccaatg ggtcgtgtgt tgaacccact tcgcgaaatg 420 ggtgtgcagg tgaagtctga agacggtgat cgtcttccag ttaccttgcg tggaccaaag 480 actccaacgc caatcaccta cagggtacct atggcttccg ctcaagtgaa gtccgctgtt 540 ctgcttgctg gtctcaacac cccaggtatc accactgtta tcgagccaat catgactcgt 600 gaccacactg aaaagatgct tcaaggtttt ggtgctaacc ttaccgttga gactgatgct 660 gacggtgtgc gtaccatccg tcttgaaggt cgtggtaagc tcaccggtca agtgattgat 720 gttccaggtg atccatcctc tactgctttc ccattggttg ctgccttgct tgttccaggt 780 tccgacgtca ccatccttaa cgttttgatg aacccaaccc gtactggtct catcttgact 840 ctgcaggaaa tgggtgccga catcgaagtg atcaacccac gtcttgctgg tggagaagac 900 gtggctgact tgcgtgttcg ttcttctact ttgaagggtg ttactgttcc agaagaccgt 960 gctccttcta tgatcgacga gtatccaatt ctcgctgttg cagctgcatt cgctgaaggt 1020 gctaccgtta tgaacggttt ggaagaactc cgtgttaagg aaagcgaccg tctttctgct 1080 gtcgcaaacg gtctcaagct caacggtgtt gattgcgatg aaggtgagac ttctctcgtc 1140 gtgcgtggtc gtcctgacgg taagggtctc ggtaacgctt ctggagcagc tgtcgctacc 1200 cacctcgatc accgtatcgc tatgagcttc ctcgttatgg gtctcgtttc tgaaaaccct 1260 gttactgttg atgatgctac tatgatcgct actagcttcc cagagttcat ggatttgatg 1320 gctggtcttg gagctaagat cgaactctcc gacactaagg ctgcttga 1368 <210> 24 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> molécula de Iniciador de ADN <400> 24 catggagctt catcta <210> 25 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> molécula de iniciador de ADN <400> 25 gcctttgagt gtacta <210> 26 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> molécula de iniciador de ADN <400> 26 gggagcgcgt atccgc <210> 27 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> molécula de iniciador de ADN <400> 27 ggatggtcac gtcact <210> 28 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> molécula de iniciador de ADN <400> 28 cggcatcacg acggtc <210> 29 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> molécula de iniciador de ADN <400> 29 ggcatcgtcc accgtg <210> 30 <211> 1S <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> molécula de iniciador de ADN <400> 30 gcaactggtt gccgtt <210> 31 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> molécula de iniciador de ADN <400> 31 atcacctgga acatca <210> 32 <211> 22 <212> ADN <213> Zea mays <400> 32 cgtcaagatc ctcttcacct <210> 33 <211> 22 <212> ADN <213> Zea mays <400> 33 acaccctctc caacactctc ta <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Motivo que provee a una EPSPS vegetal resistencia al glifosato <400> 34 Gly Asn Ala Gly lie Ala Met Lys Ser <210> 35 <211> 1596 <212> ADW <213> Agrobacteri m tumefaciens <400> 35 atggcccaag ttagccgaat ctgcaacggt gtgcagaatc catcactaat ctccaacctg 60 tccaaatcgt cacaacgtaa gtcgccatta tctgttagct tgaagactca gcaacatcct 120 cgcgcatatc ctatatcaag cagttggggt ttgaagaaat cgggtatgac cttgattggt 180 tcggaactta ggccattgaa ggtgatgtct tcagttagta cagcttgcat gcttcacggt 240 gcttcttcca gacccgcaac ggctagaaag agttctggct tgtctggaac cgtccgtatt 300 ccaggagaca aaagcattag tcaccgctct ttcatgtttg gtgggctggc atctggagag 360 acgcgcatca ctggtcttct ggaaggagag gacgtcatca atacagggaa ggcaatgcag 420 gctatgggtg cccgtattcg caaggaaggt gatacttgga tcatagacgg agttgggaac 480 ggtggcttac ttgcaccgga ggctcctctc gactttggca acgcagccac agggtgtaga 540 cttactatgg gcctcgtggg tgtttacgat ttcgattcaa cctttattgg ggatgcctct 600 ctcactaaac gcccaatggg aagagtcctt aacccgttga gggagatggg cgtacaagtt 660 aagtccgagg acggcgacag attgcccgtc accttgcgcg gccctaagac acccacccct 720 attacttaca gggttccaat ggcatctgct caagtgaagt ccgcagttct gctcgctgga 780 ttgaacacac cgggtattac taccgtgatt gagccgatca tgactcgtga ccacactgag 840 aagatgcttc agggtttcgg tgctaacctc accgttgaaa cagacgcgga cggtgtgagg 900 accattcgcc tggagggaag gggaaaactc actggtcaag tcattgacgt gcccggtgat 960 ccctccagca cggcgttccc actggttgcc gctcttctcg taccaggctc cgatgtgaca 1020 attctaaacg tcctcatgaa tcctactaga accggattga tacttacatt gcaggaaatg 1080 ggtgctgata ttgaagttat caatcctaga ctagccggag gtgaggacgt agctgatttg 1140 cgggtgaggt cttctacatt gaaaggtgtt accgtacctg aagatagggc accttcaatg 1200 attgacgagt atccaattct tgccgtcgcg gctgcctttg ctgagggcgc gaccgtgatg 1260 aatggactag aggagttgag agtgaaggaa tccgacagat tgagcgcagt cgctaacgga 1320 cttaaactca atggcgttga ttgtgatgag ggtgagacta gcttggtagt ccgtgggcga 1380 ccagacggaa agggtttggg caacgcttcg ggtgctgccg ttgcaactca cttggatcat 1440 cggatagcga tgagttttct ggtgatgggt ctcgtaagcg agaatcctgt gacagtcgac 1500 gatgcaacta tgatcgctac ttccttccct gagtttatgg atttaatggc aggactaggt 1560 gcaaagattg aactctctga taccaaagcg gcctaa 1596

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para reducir el silenciamiento de transgenes en plantas transgénicas que comprende los pasos de: a) construir un polinucleótido artificial que es divergente de un polinucleótido conocido que codifica una proteína sustancialmente idéntica, y b) construir una construcción de ADN que contiene la molécula de polinucleótido artificial; y c) transformar la construcción de ADN en una célula vegetal; y d) regenerar la célula vegetal en una planta transgénica fértil, en donde el polinucleótido artificial y el polinucleótido conocido son divergentes si es menor que 85 por ciento idéntico para su longitud completa y no tiene longitudes de secuencia de polinucleótido mayores que 23 nucleótidos que tengan 100 por ciento de identidad. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido conocido ocurre naturalmente en la planta transgénica fértil. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido conocido ocurre como un transgén en la planta transgénica fértil. 4 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido artificial es expresado en la planta transgénica fértil. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el poiinucleótido artificial provee un fenotipo agronómicamente útil seleccionado del grupo que consiste de: tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos, tolerancia a la sequía, rendimiento incrementado, tolerancia al frío, resistencia a enfermedades. 6. - Una molécula de poiinucleótido artificial que es divergente de un poiinucleótido conocido que codifica una proteína sustancialmente idéntica, dicha molécula de poiinucleótido artificial se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:22, y SEQ ID NO:3; en donde el poiinucleótido artificial y el poiinucleótido conocido son divergentes si es menor que 85 por ciento idéntico para su longitud completa y no tiene longitudes de secuencia de poiinucleótido mayores de 23 nucleótidos que tengan 100 por ciento de identidad. 7. - Una construcción de ADN que comprende: una molécula promotora que funciona en plantas, operablemente ligada a la molécula de poiinucleótido artificial de la reivindicación 6. 8. - Una célula vegetal, planta o progenie de la misma que comprende la construcción de ADN de la reivindicación 7. 9. - La planta o progenie de la misma de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dicha planta se selecciona del grupo que consiste de trigo, maíz, arroz, soya, algodón, papa, cañóla, pasto de turba, árboles forestales, sorgo de grano, cultivos de hortalizas, plantas de ornato, cultivos de forraje y cultivos de frutas. 10.- Una célula vegetal que comprende por lo menos dos polinucleótidos, en donde los dos polinucleótidos codifican una proteína sustancialmente idéntica y por lo menos uno de los polinucleótidos es un transgén, y dichos polinucleótidos son menores que 85 por ciento idénticos en secuencia de polinucleótido para su longitud completa y no tienen longitudes de secuencia de polinucleótido mayores que 23 nucleótidos que tienen 100 por ciento de identidad. 1.- La planta o progenie de dicha célula vegetal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque comprende los dos polinucleótidos. 12. - La planta o progenie de la misma de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque los dos polinucleótidos codifican para una proteína de tolerancia a herbicidas. 13. - La planta o progenie de la misma de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque comprende la proteína de tolerancia a herbicidas, en donde dicha proteína de tolerancia a herbicidas se selecciona del grupo que consiste de EPSPS resistente a glifosato y fosfinotricina acetiltransferasa. 14. - Una célula vegetal, planta o progenie de la misma que comprende una molécula de polinucleótido artificial de la reivindicación 6. 15. - Un método para detectar un polinucleótido artificial en dicha célula vegetal, planta o progenie de la misma de la reivindicación 14 que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una muestra de ADN aislada de dicha célula vegetal, planta o progenie de la misma con una molécula de ADN, en donde dicha molécula de ADN comprende por lo menos una molécula de ADN de un par de moléculas de ADN que cuando se usan en una reacción de amplificación de ácido nucleico producen un amplicón que es diagnóstico para dicha molécula de polinucleótido artificial de la reivindicación 6; (b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo así el amplicón; y (c) detectar el amplicón. 16.- Una molécula de ADN que comprende: una molécula de polinucleótido que específicamente híbrida a una molécula de polinucleótido artificial de la reivindicación 6. 17.- Una molécula de ADN seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27. 18.- Una célula vegetal, planta o progenie de la misma que comprende una molécula de ADN seleccionada del grupo que consiste de : SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27. 19.- Un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde la primera molécula de ADN es SEQ ID NO:24 o su complemento y la segunda molécula de ADN es SEQ ID NO: 25 o su complemento y el par de moléculas de ADN cuando se usan en un método de amplificación de ADN producen un diagnóstico de amplicón para un polinucleótido artificial de SEQ ID NO: 17. 20. - Una célula vegetal, planta o progenie de la misma, en donde el amplicón de la reivindicación 19 se produce a partir de ADN genómico extraído de la célula vegetal, planta o progenie de la misma. 21. - Un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde la primera molécula de ADN es SEQ ID NO:26 o su complemento y la segunda molécula de ADN es SEQ ID NO: 27 o su complemento y el par de moléculas de ADN cuando se usan en un método de amplificación de ADN producen un diagnóstico de amplicón para un polinucleótido artificial de SEQ ID NO: 18. 22.- Una célula vegetal, planta o progenie de la misma, en donde el amplicón de la reivindicación 21 se produce a partir de ADN genómico extraído de la célula vegetal, planta o progenie de la misma. 23. - Un equipo de detección de ADN que comprende por lo menos una molécula de ADN de suficiente longitud para ser específicamente homologa o complementaria a un polinucleótido artificial de la reivindicación 6, en donde dicha molécula de ADN es útil como una sonda o iniciador de ADN. 24. - Un equipo de detección de ADN que comprende por lo menos una molécula de ADN homologa o complementaria a una molécula de ADN seleccionada de: SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27. 25. - Un método de detección de la presencia de un polinucleótido artificial que codifica un EPSPS resistente a glifosato en una muestra de ADN, el método comprendiendo: (a) extraer una muestra de ADN de una planta; y (b) poner en contacto una muestra de ADN con una molécula de ADN marcada de longitud suficiente para ser específicamente homologa o complementaria a un polinucleótido artificial seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO: 35, en donde dicho polinucleótido artificial es divergente de un polinucleótido conocido que codifica una proteína de EPSPS resistente a glifosato, en donde el polinucleótido artificial y el polinucleótido conocido son divergentes si es menor que 85 por ciento idéntico para su longitud completa y no tiene longitudes de secuencia de polinucleótido mayores de 23 nucleótidos que tengan 100 por ciento de identidad y en donde la molécula de ADN marcada es una sonda de ADN; y (c) someter la muestra y sonda de ADN a condiciones de hibridación astringentes; y (d) detectar la sonda de ADN hibridada a la muestra de ADN. 26.- Un polinucleótido aislado que codifica una enzima EPSPS, en donde la enzima EPSPS comprende el motivo de SEQ ID NO:34. 27.- Una célula vegetal, planta o progenie de la misma tolerante a glifosato que comprende una enzima EPSPS con motivo de SEQ ID NO:34.