BRPI0711672A2 - uso de espécies bacterianas não-agrobacterium para transformação de planta - Google Patents

Abstract

USO DE ESPéCIES BACTERIANAS NãO-AGROBACTERIUM PARA TRANSFORMAçãO DE PLANTA. A invenção refere-se a métodos para a transformação genética de células de planta mediada por Rizóbia, incluindo células de soja, canola, milho, e algodão. Estes incluem tanto métodos dependentes de VirD2 quanto independentes de VirD2. Espécies bacterianas utilizadas incluem cepas de Rhizobium sp., Sinorhizobium sp., e Mesorhizobium sp. Vetores para uso em tal transformação também são descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE ES- PÉCIES BACTERIANAS NÃO-AGROBACTERIUM PARA TRANSFOR- MAÇÃO DE PLANTA".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Esse pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provi- sório Americano 60/800,872, depositado em 16 de Maio de 2006, cuja des- crição está incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia de planta. Em particular, a invenção refere-se a métodos para produção de plantas e células de planta transgênicas pelo uso de espécies bacterianas não-Agrobacterium.

2. Descrição da Técnica Relacionada

Agrobacterium spp., membros das Rhizobiales, são bactérias comuns do solo, junto com Rhizobium spp., Mesorhizobium spp., Sinorhizo- bium spp. e espécies e gêneros relacionados. Várias cepas selvagens e ino- fensivas (não-patogênicas) de Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes carregando plasmídeos Ti ou Ri podem ser usadas para transfe- rência de genes para dentro de plantas. Genes de síntese de fitormônios localizados no T-DNA de Agrobactérias selvagens que abrigam um plasmí- deo Ti ou Ri são expressos em células de planta após a transformação e causam a formação de tumor ou um fenótipo de raiz em cabeleira depen- dendo da espécie ou cepa de Agrobacterium. De foram importante, o T-DNA de Agrobactérias pode ser manipulado para substituir muitos de seus deter- minantes de virulência e patogenicidade por "genes de interesse" enquanto retém a habilidade de ser transferido para uma célula de planta e ser inte- grado em um genoma de planta. Cepas contendo tais plasmídeos Ti "de- sarmados" são amplamente usadas para transformação de plantas. O mecanismo de transferência de T-DNA para células de planta por Agro- baeterium tem sido bem documentado. Resumidamente, o T-DNA é delimi- tado por duas regiões de borda, referidas como borda direita (RB) e borda esquerda (LB). As bordas são cortadas pela proteína de virulência VirD2 que produz um DNA transferido de fita simples (a "fita T") com a ligação covalen- te de VirD2 na sua terminação 5'. O complexo proteína-DNA, incluindo tam- bém a proteína VirE2 de Agrobacterium, sai das células de Agrobacterium através do chamado sistema de secreção Tipo 4 (T4SS, transportador de proteína de virulência e de ssDNA) e é transferido para células de plantas e integrado ao genoma da planta com a ajuda das proteínas de virulência de Agrobacterium e dos fatores de plantas. O uso de vetores mediados por A- grobacterium para introduzir DNA em células de planta é bem-conhecido na técnica. Vide, por exemplo, os métodos descritos por Fraley et ai., (1985), Rogers et ai, (1987) e Patente U.S. No. 5.563.055, incorporados especifi- camente neste documento por referência em sua totalidade.

A transformação mediada por Agrobacterium é eficaz em várias plantas dicotiledôneas incluindo Arabidopsis, tabaco e tomate. Métodos para transformação mediada por Agrobacterium de outras espécies também tem sido desenvolvidos (por exemplo, Patente Americana No. 6.384.301, relacio- nada à transformação de soja). Embora a transformação mediada por Agro- bacterium tenha sido usada inicialmente apenas usada com plantas dicotile- dôneas, avanços nas técnicas de transformação mediada por Agrobacterium tornaram a técnica aplicável também às plantas monocotiledôneas. Por e- xemplo, técnicas de transformação mediada por Agrobacterium têm sido a- plicadas ao arroz (Hiei et ai, 1997; Zhang et al., 1997; Patente Americana No. 5.591.616, incorporada especificamente neste documento por referência em sua totalidade), trigo (McCormac et ai., 1998), cevada (Tingay et ai., 1997; McCormac et ai, 1998), e milho (Ishida et ai., 1996). Entretanto, várias espécies de plantas são recalcitrantes à transformação mediada por Agro- bacterium e a eficiência é baixa em outras. Além disso, como A. tumefaciens entra nos tecidos de planta em locais com lesão, e não infecta naturalmente tecidos íntegros, o uso de certos tecidos como alvos de transformação não está disponível.

Além do sistema de liberação de fita-T dependente de T4SS, Agrobacterium tem sistemas de mobilização de plasmídeo adicionais que também podem transferir e integrar plasmídeos, tal como o plasmídeo IncQ pRSF1010, entre células bacterianas e no genoma de planta com freqüência menor através de transferência por conjugação (Buchanan-Wollaston et ai 1987, Shadenkov et ai 1996; Chen et ai, 2002). Por exemplo, a proteína de transferência por conjugação MobA, em conjunto com as proteínas MobB e MobC do plasmídeo RSF1010, cliva o sítio or/T (origem de transferência), liga à terminação 5' e transfere o ssDNA para células independente do sis- tema T4SS (Bravo-Angel et al. 1999 e referências contidas neste documen- to).

Sistemas de transferência por conjugação estão amplamente presentes em bactérias, resultando na troca de informação genética entre células bacterianas. Em fíhizobium, relacionada filogeneticamente, mas dis- tinta de Agrobacterium (Spaink, et al., (ed.), 1998; Farrand et ai, 2003), o sistema de transferência por conjugação foi caracterizado parcialmente em algumas espécies (Freiberg et ai, 1997; Turner et al. 2002, Tun-Garrido et ai 2003, Perez-Mendoza et al. 2004). O sistema de conjugação requer uma or/T como o sítio de corte e TraA ou Mob como enzima de corte, o que é di- ferente dos elementos convencionais usados na mobilização de T-DNA (sí- tios VirD2, RB e LB, respectivamente). Diferente de VirD2, que foi descober- ta tendo NLS (sinal de localização nuclear) em sua terminação-C para drre- cionamento nuclear de planta, TraA ou Mob não tem um NLS óbvio. O me- canismo preciso e o sítio de integração de DNA em plantas por TraA perma- necem desconhecidos.

Membros de Rizóbios diferentes de Agrobacterium sp., tais co- mo Rhizobium spp., são conhecidos por associarem-se simbioticamente com raízes de plantas em nódulos fixadores de nitrogênio especializados (por exemplo, Long, 2001). Além da nodulação hospedeiro-específica de raízes de plantas, especialmente de legumes, alguns efeitos promotores do cresci- mento da planta por membros dos Rizóbios são conhecidos na ausência de nodulação (por exemplo, Noel et ai, 1996). Recentemente, foram publicados relatos descrevendo a transformação de plantas por bactérias diferentes de Agrobacterium sp. (por exemplo, Broothaerts et ai, 2005; Publicações de Pedidos de Patente US 20050289667; 20050289672; Weller et ai, 2004; Weller etal, 2005).

Broothaerts et ai, relataram a transformação por cepas de Rhi- zobium sp., Mesorhizobium Iotil e Sinorhizobium meliloti que era limitada a Arabidopsis, tabaco e arroz. Weller et al. (2004, 2005) relataram que várias bactérias, incluindo cepas de Rhizobium sp. e Ochrobactrum sp. que hospe- davam plasmídeos Ri aparentemente transformavam plantas de pepino e tomate cultivadas hidroponicamente, levando a um fenótipo de raiz em cabe- leira. Entretanto, a presença de Agrobactérias não foi rejeitada como uma possibilidade em algumas plantas inoculadas, complicando a análise. A transferência de DNA para células de plantas de soja, milho, algodão ou ca- nola por cepas bacterianas não-Agrobacterium não foi relatada. Além disso, esforços de transformação em arroz, tabaco e Arabidopsis com cepas bacte- rianas não-Agrobacterium estão atrasados até o momento por baixas efici- ências de transformação. Há, portanto, uma grande necessidade na técnica para o desenvolvimento de métodos aperfeiçoados que permitam a trans- formação de espécies de cultivo importantes usando cepas bacterianas não- Agrobacterium e que melhorem as eficiências de transformação em geral.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Os desenhos a seguir são parte do presente relatório descritivo e estão incluídos para demonstrar adicionalmente certos aspectos da pre- sente invenção. A invenção pode ser mais bem compreendida com referên- cia às figuras em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas neste documento.

FIG. 1: Mapa esquemático de pMON96033.

FIG. 2: Mapa esquemático de pMON96036.

FIG. 3: Mapa esquemático de pMON101316.

FIG. 4: Ensaio GUS transitório de transformação mediada por Rhizobi-' um em soja com Mesorhizobium loti (ML), Rhizobium leguminosarum (RL), Sinorhizobium fredii (SF), Sinorhizobium meliloti (SM) com plasmídeo Ti de- sarmado (pTiBo542G ou pTi4404kan). RL4404: cepa Madison de R. legu- minosarum com pTi4404kan; ML542G: M. loti USDA3471 com pTiBo542G; ML4404: M. Ioti USDA3471 com pTi4404kan; 2370LBA: R. Ieguminosarum USDA2370 com pTi4404kan; 2370G: R. Ieguminosarum USDA2370 com pTiBo542G; SF4404: S. fredii USDA205 com pTi4404kan; SM542C: S. meli- loti USDA1002 com pTiBo542G; ABI: cepa de controle A. tumefaciens ABI. FIG. 5: Transmissão da linhagem germinativa do transgene gus em soja produzida através de transformação mediada por Rhizobium. FIG. 6: Mapa esquemático de pMON96913. FIG. 7: Mapa esquemático de pMON96914. FIG. 8: Mapa esquemático de pMON96026.

FIG. 9: Transformação mediada por Rizóbia de canola com diversas cepas conforme mostrado pelo ensaio GUS transitório. A) ML542C (22,4%); B) RL2370G (33,3%); C) RL2370LBA (20%); D) SF542C (30,5%); E) SF4404 (20,6%); e F) SM542C (13%). O % de explantes com setores positivos para GUS é mostrado entre parênteses.

FIG. 10: Transformação estável de calos de canola transgênica com vá- rias cepas de Rizóbia. A) ML542C (50%); B) RL2370G (21%); C) RL2370LBA (67%); D) SF542C (36%); e E) SM542C (73%). O % de explan- tes com setores positivos para GUS é mostrado entre parênteses. FIG. 11: Detecção por Southern blot de transgene CP4 em plantas de canola derivadas de transformação mediada por Rhizobium. Raia 1: linhagem BN_A22; Raia 2: linhagem BN_A24; Raia 3: linhagem BN_A28; e Raia 4: linhagem BN_A35.

FIG. 12. Transformação de algodão por Rizóbia contendo pMON101316: A) ML542C (47,8%); B) RL2370G (56%); C) RL2370LBA (31,4%); D) SF542C(23,2%); E) SF4404(31,5%); e F) SM542C (44,4%). RL2370 foi u- sado como controle negativo; cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens foi usada como controle positivo. O percentual de explantes com coloração po- sitivo para GUS está escrito entre parênteses acima. FIG. 13: Transformação estável de calos de algodão por várias cepas de Rizóbia: A) ML542C; B) SF542C; C) SM542C; D) SF4404; E) RL2370LBA; e F) RL2370G.

FIG. 14: Detecção do transgene gus por hibridização por Southern em calos de algodão derivados de transformação mediada por Rhizobium. RL2370LBA: R. Ieguminosarum 2370 com plasmídeo auxiliar LBA4404 Ti; SF542: Sinorhizobium fredii 205 com plasmídeo auxiliar pTiBo542 da cepa AGLO; e SF4404: Sinorhizobium fredii 205 com plasmídeo auxiliar LBA4404 Ti.

FIG. 15: Transformação de milho mediada por Rizóbia conforme mostrado pela expressão transitória de um gene gus em embriões imaturos de milho. ABI: A. tumefaciens-, RL2370LBA: Rhizobium Ieguminosarum USDA2370 com plasmídeo LBA4404 Ti; SM542C: Sinorhizobium meliloti USDA1002 com pTiBo542; ML542G: Mesorhizobium Ioti com pTiBo542; SF4404: Sino- rhizobium fredii USDA205 com plasmídeo LBA4404 Ti; SF542C: Sinorhizo- bium fredii USDA205 com pTiBo542. Todas as cepas continham pMON96036 e foram induzidas em meio ATA pH5,4.

FIG. 16: Calos de milho expressando o marcador de gfp após transformação com cepas de Rizóbia.

FIG. 17: Análise de hibridização por Southern de integração de transgene em plantas de milho derivadas de transformação mediada por Rhizòbium. A sonda de gus marcada com DIG foi usada para detectar o transgene. Raia 1 a 2 e 11 a 12: linhagens derivadas após transformação com M. Ioti ML542G/pMON96036; raias 3 a 9: linhagens derivadas após transformação com A. tumefaciens ABI controle; raias 13 a 17: linhagens derivadas após transformação com S. fredii SF4404/pMON96033; raias 18 a 19: linhagens derivadas após transformação com S. fredii SF542C/pMON96036.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção fornece um método para transformar uma célula de planta que compreende: (a) colocar pelo menos uma primeira célula de planta em contato com uma bactéria diferente de Agrobacterium sp. compreendendo: (i) um primeiro ácido nucleico que compreende uma região de gene vir de um plasmídeo Ti em que a região do gene v/r age para introduzir um ácido nucleico que codifica uma seqüência <Je interesse na cé- lula de planta de uma maneira dependente de VirD2; e (ii) um segundo ácido nucleico que compreende uma ou mais seqüências da borda de T-DNA ope- rativamente ligadas a um ácido nucleico de interesse; e (b) selecionar pelo menos uma primeira célula de planta transformada com o ácido nucleico de interesse, na qual a célula de planta é uma célula de planta de soja, canola, milho ou algodão.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para transfor- mar uma célula de planta, que compreende: (a) colocar pelo menos uma primeira célula de planta em contato com uma bactéria diferente de Agrobae- terium sp. compreendendo: (i) um primeiro ácido nucleico necessário para transferência por conjugação de seqüências de DNA independente da fun- ção de VirD2, e (ii) um segundo ácido nucleico que compreende o ácido nu- cleico de interesse; em que a célula de planta é uma célula de planta de so- ja, canola, milho ou algodão e em que os polipeptídeos codificados pelo áci- do nucleico necessários para a transferência por conjugação atuam para transferir o ácido nucleico de interesse para a célula de planta; e (b) selecio- nar pelo menos uma primeira célula de planta transformada com o ácido nu- cleico de interesse. Em tal método, a transferência por conjugação pode ser dependente de traA, trai, ou mobA e o primeiro ácido nucleico compreende oríT. O primeiro ácido nucleico pode não ter as seqüências da borda esquer- da e direita de T-DNA.

Em um método da invenção, a bactéria pode ser uma célula de Rizóbia. Em certas modalidades, a Rizóbia é cultivada sob condições ade- quadas para minimizar a produção de polissacarídeos pelas células de Ri- zóbia. A célula de Rizóbia pode ser cultivada na presença de acetosiringona ou outro composto, tal como um composto fenólico, que induz a função do gene vir antes do contato com a célula. A célula de Rizóbia pode ser sele- cionada do grupo que consiste em: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Me- sorhizobium spp., Phyilobacterium spp. Ochrobactrum spp. e Bradyrhizobium spp. Em modalidades específicas, a célula de Rizóbia é uma célula de Rhi- zobium Ieguminosarum e pode ainda ser uma célula de R. Ieguminosarum bv. trifolii, R. Ieguminosarum bv. phaseoii ou Rhizobium Ieguminosarum. bv. viciae.

Em outro aspecto de um método de transformação fornecido pela invenção, uma célula de planta que está transformada pode estar com- preendida em um explante de uma semente de planta, por exemplo, de uma muda, calo, suspensão celular, cotiledônia, meristema, folha, raiz ou caule. O explante pode compreender um explante de meristema embrionário; calo; suspensão celular; cotiledônia; ou tecido de folhas, raízes ou caules.

Uma bactéria usada para transformação de acordo com a inven- ção pode compreender ácidos nucleicos introduzidos, por exemplo, por ele- troporação. As seqüências podem compreender o ácido nucleico necessário para a transferência por conjugação independente de função de VirD2. Os ácidos nucleicos podem incluir o primeiro e segundo ácidos nucleicos.

Em outro aspecto da invenção, um método de transformação fornecido neste documento pode compreender selecionar uma célula de planta transformada com um ácido nucleico de interesse na ausência de um agente de seleção. Selecionar uma célula de planta transformada com um ácido nucleico de interesse pode compreender cultivar a célula de planta na presença de um agente de seleção, em que o ácido nucleico de interesse confere tolerância ao agente de seleção ou está operativamente ligado a um ácido nucleico adicional que confere tolerância ao agente de seleção. Exem- plos de tais agentes de seleção incluem glifosato, canamicina, bialafos ou dicamba. Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse ou o ácido nu- cleico adicional codifica a EPSP sintase e em outra modalidade ainda codifi- ca a proteína CP4 de EPSP sintase. Em outra modalidade, o agente de se- leção é glifosato. Em outras modalidades, a seqüência de interesse pode ser definida como não fisicamente ligada a um gene marcador selecionável. Por exemplo, o gene marcador e o ácido nucleico de interesse podem se separar geneticamente na progênie de uma planta regenerada a partir de uma célula de planta transformada com o ácido nucleico de interesse.

Uma bactéria de acordo com a invenção pode compreender pelo menos um terceiro ácido nucleico que compreende outro ácido nucleico de interesse, em que a célula de planta é transformada com o terceiro ácido nucleico. Em um método da invenção, uma planta pode ser regenerada de uma célula de planta transgênica, em que a planta compreende a seqüência de interesse. Regenerar uma planta pode compreender induzir a formação de um ou mais brotos de um explante que compreende a célula de planta e cultivar pelo menos um primeiro broto até o estado de uma planta completa fértil. Em certas modalidades, a planta pode ser uma planta de milho ou al- godão. Em modalidades adicionais, a regeneração ocorre por organogêne- se. Em outras modalidades, a planta é uma planta de soja ou canola.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma célula de Rizóbia selecionada do grupo que consiste em: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp. Ochrobactrum spp. e Bradyrhizo- bium spp., a célula compreendendo (i) um primeiro ácido nucleico que com- preende uma região de gene vir de um plasmídeo Ti em que a região do ge- ne vir age para introduzir um ácido nucleico que codifica uma seqüência de interesse em uma planta de célula de uma maneira dependente de VirD2; e (ii) um segundo ácido nucleico que compreende uma ou mais seqüências de borda de T-DNA operativamente ligadas a um ácido nucleico que codifica uma seqüência de interesse. Em uma modalidade, a célula ainda é definida como compreendendo um marcador selecionável. Em outra modalidade, a célula de Rizóbia é selecionada do grupo que consiste em: Rhizobium sp., Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium leguminosarum Madison, R. leguminosa- rum USDA2370, R. leguminosarum USDA2408, R. leguminosarum US- DA2668, R. leguminosarum 2370G, R. leguminosarum 2370LBA, R. legumi- nosarum 2048G, R. leguminosarum 2048LBA, R. leguminosarum bv. phase- oli, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668G, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668LBA, R. leguminosarum RL542C, R. leguminosarum bv. viciae, R. le- guminosarum bv. trifolii, Rhizobium etli USDA 9032, R. etli bv. phaseoli, Rhi- zobium tropici, Mesorhizobium sp., Mesorhizobium loti ML542G, M. loti ML4404, Sinorhizobium sp., Sinorhizobium meliloti SD630, S. meliloti US- DA1002, Sinorhizobium fredii USDA205, S. fredii SF542G, S. fredii SF4404, S. fredii SM542C, Bradyrhizobium sp., Bradyrhizobium japonicum USDA 6, e B. japonicum USDA 110, Em modalidades específicas, a célula é uma célu- la de Rhizobium leguminosarum e podem ser ainda, por exemplo, uma célu- la de R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. phaseoli ou Rhizo- bium leguminosarum. bv. viciae. Em outro aspecto da invenção, é fornecido um construto de DNA competen- te para transferência independente de VirD2 de Rizóbia e que não tem a se- qüência da borda de T-DNA, o construto compreendendo uma seqüência oriTe seqüência traA ou mob operativamente ligada a um ácido nucleico de interesse. A invenção fornece ainda uma célula de Rizóbia transformada com tal construto da reivindicação 35, em que a Rizóbia é selecionada do grupo que consiste em: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp. Ochrobactrum spp. e Bradyrhizobium spp. Em uma modalidade, a célula de Rizóbia é selecionada do grupo que consiste em: Rhizobium sp., Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium Ieguminosarum Ma- dison, R. Ieguminosarum USDA2370, R. Ieguminosarum USDA2408, R. Ie- guminosarum USDA2668, R. Ieguminosarum 2370G, R. Ieguminosarum 2370LBA, R. Ieguminosarum 2048G, R. Ieguminosarum 2048LBA, R. Iegu- minosarum bv. phaseoli, R. Ieguminosarum bv. phaseoli 2668G, R. Iegumi- nosarum bv. phaseoli 2668LBA, R. Ieguminosarum RL542C, R. Ieguminosa- rum bv. viciae, R. Ieguminosarum bv. trifolii, Rhizobium etli USDA 9032, R. etli bv. phaseoli, Rhizobium tropici, Mesorhizobium sp., Mesorhizobium Ioti ML542G, M. Ioti ML4404, Sinorhizobium sp., Sinorhizobium meliloti SD630, S. meliloti USDA1002, Sinorhizobium fredii USDA205, S. fredii SF542G, S. fredii SF4404, S. fredii SM542C, Bradyrhizobium sp., Bradyrhizobiumjaponi- cum USDA 6, e B. japonicum USDA 110, Em modalidades específicas, a célula é uma célula de Rhizobium Ieguminosarum e em outras modalidades ainda pode ser uma célula de R. Ieguminosarum bv. trifolii, R. Ieguminosa- rum bv. phaseoli ou Rhizobium leguminosarum. bv. viciae.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A seguir está uma descrição detalhada da invenção fornecida para auxiliar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. Aqueles versados na técnica podem fazer modificações e variações nas mo- dalidades descritas neste documento sem se afastar do espírito ou escopo da presente invenção.

A presente invenção fornece métodos e composições para a transformação genética eficaz de células de planta de espécies cultiváveis importantes por Rizóbia. A invenção supera limitações substanciais da técni- ca, incluindo a eficiência de transformação limitada e falha na descrição de técnicas receptivas a transformação de plantas de culturas importantes pelo uso de cepas de não-Agrobacterianas. Por exemplo, apesar do uso de bac- térias diferentes de Agrobacterium ter sido discutido para diversas varieda- des de plantas, as freqüências de transformação têm sido baixas. No caso do arroz, freqüências de transformação de 0,6% ou menos têm sido relata- das, com apenas uma planta transformada obtida a partir de 687 calos ino- culados (Broothaerts et ai, 2005). Isso contrasta com freqüências de trans- formação de 50 a 80% usando Agrobacterium. Mesmo usando modelos de organismos facilmente transformados por Agrobacterium, as freqüências de transformação foram apenas uma fração daquelas obtidas pela transforma- ção mediada por Agrobacterium.

Até o momento, pesquisas consideráveis têm sido necessárias em vários casos para aplicar até procedimentos de transformação bem de- senvolvidos tais como a transformação mediada por Agrobacterium de várias espécies de planta. Plantas de espécies diferentes geralmente exibem dife- renças fisiológicas substanciais que afetam a resposta à transformação ge- nética. Métodos para transformação de uma espécie de planta, portanto, freqüentemente não funcionam eficazmente, se funcionarem, com outras plantas e a habilidade de transformar uma planta não é necessariamente preditiva da habilidade para transformar espécies mesmo que relacionadas usando este procedimento. Isso é particularmente verdadeiro para transfor- mação bacteriana, a qual envolve interações bioquímicas complexas entre as cepas de bactérias usadas e as plantas alvo. Rizóbias interagem com plantas no ambiente nativo e portanto pode exibir especificidades do hospe- deiro, cujo impacto é desconhecido para várias espécies de cultivo. Dessa forma, identificar plantas responsivas à transformação mediada por Rizóbia e desenvolver procedimentos que permitam aumentar as eficiências de transformação, é de grande interesse. Em particular, a eficiência de trans- formação é importante porque a proporção na qual qualquer evento de trans- formação dado é expresso pode variar substancialmente dependendo do sítio de integração no genoma da planta. A habilidade para selecionar even- tos de transformação que tem um perfil de expressão adequado é, assim, dependente da habilidade de produzir transformantes de forma eficaz. Con- forme explicado nos exemplos práticos abaixo, freqüências de transforma- ção transitória tão altas quanto 5% foram obtidas pelos inventores para a transformação de feijões de soja (FIG. 4) e freqüências que se aproximam de 56% e 33% foram obtidas no caso de algodão (FIG. 12) e canola (FIG. 9), respectivamente.

A presente invenção supera as limitações da técnica pelo forne- cimento, em uma modalidade, de técnicas para uso de Rizóbia pra transfor- mar plantas de cultivo importantes que não foram previamente conhecidas como sendo transformáveis por Rizóbia, incluindo canola, milho, algodão e soja. A invenção também fornece técnicas para a transformação eficaz de plantas usando Rizóbia, incluindo aquelas já conhecidas por serem respon- sivas a transformação por Rizóbia em freqüência baixa. A invenção também fornece métodos para transformação de alvos teciduais que diferem daque- les de Agrobacterium. Por exemplo, embora Agrobacterium requeira tipica- mente um sítio lesado para infectar plantas, alguns outros membros dos Ri- zobiais, incluindo Rhizobiaceae tal como Rhizobium, infectam naturalmente as raízes das plantas através de filamentos de infecção que penetram os tecidos da planta, permitindo o uso de tecido não-lesado como um alvo de transformação.

As definições a seguir são fornecidas a fim de auxiliar aqueles versados na técnica na compreensão da descrição detalhada da presente invenção.

Como usado neste documento, "regulador do crescimento de planta" ou "hormônio de planta" refere-se a compostos que afetam o cresci- mento da planta. Reguladores do crescimento da planta incluem, mas não estão limitados a auxinas, citocininas, ABA, giberelinas, etileno, brassinoste- róides e poliaminas. Auxinas afetam o alongamento de brotos e raízes em baixa concentração, mas inibem o crescimento em níveis mais elevados. Auxinas comumente usadas incluem picloram (ácido 4-amino-3,5,6- tricloropicolínico), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), IAA (ácido indol-3- acético), NAA (ácido α-naftalenoacético), e dicamba (ácido 3,6- dicloroanísico). Citocininas causam divisão celular, diferenciação celular e diferenciação de brotos. Citocininas comumente usadas incluem cinetina, BA (6-benzilaminopurina), 2-ip (2-isopenteniladenina), BAP (6- benzilaminopurina), tidiazuron (TDZ), ribosídeo de zeatina e zeatina. "Seqüência codificante", "região codificante" ou "fase aberta de leitura" refere-se a uma região de triplas seqüenciais contínuos de ácido nu- cleico que codificam uma proteína, polipeptídeo ou seqüência de peptídeo.

"Dicot" ou "dicotiledôneas" refere-se a plantas que tem dois coti- ledônias. Exemplos incluem, sem limitação, plantas tais como alfafa, feijões, brócolis, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, algodão, pepino, berinje- la, alface, melão, ervilha, pimenta, batata, abóbora, rabanete, colza, espina- fre, soja, abóbora-moranga, tomate e melancia.

"Endógeno" refere-se aos materiais que se originam dentro do organismo ou célula.

"Exógeno" refere-se a materiais que se originam fora do orga- nismo ou célula. Conforme usado neste documento, exógeno pretende se referir a qualquer ácido nucleico de uma fonte diferente da célula ou tecido do receptor, sem levar em consideração se um ácido nucleico similar (mas não idêntico) já está presente na célula ou tecido do receptor.

"Explante" refere-se a uma parte de planta que é capaz de ser transformada e subseqüentemente regenerada em uma planta transgênica. Exemplos incluem embriões, calos, suspensões celulares, cotiledônias, me- ristemas, mudas, sementes, folhas, caules ou raízes.

"Monocot" ou "monocotiledôneas" refere-se a plantas que tem um único cotiledônia. Exemplos incluem, sem limitação, cebola, milho, arroz, sorgo, trigo, centeio, painço, cana de açúcar, aveia, triticale, cevada e grama do tipo turfgrass.

"Ácido nucleico" refere-se a ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA).

"Fenótipo" refere-se a uma característica exibida pelo organismo que resulta da expressão (ou ausência de expressão) de ácidos nucleicos no genoma (incluindo DNA e RNA não-genômicos tais como plasmídeos e cro- mossomos artificiais) e/ou organelas do organismo.

O termo "planta" abrange qualquer planta superior e sua progê- nie, incluindo monocotiledôneas (por exemplo, milho, arroz, trigo, cevada, etc.), dicotiledôneas (por exemplo, soja, algodão, tomate, batata, Arabidop- sis, tabaco, etc.), gimnospermas (pinheiros, abetos, cedros, etc.) e inclui par- tes de planta, incluindo unidades reprodutoras de uma planta (por exemplo, sementes, bulbos, tubérculos, tecidos meristemáticos ou outras partes e te- cidos a partir dos quais a planta pode ser reproduzida), frutos e flores.

"Sinal de poliadenilação" ou "sinal poliA" refere-se a uma se- qüência de ácido nucleico localizada a 3' de uma região codificante que promove a adição de nucleotídeos de adenilato à extremidade 3' de um mRNA transcrito a partir da região codificante.

"Promotor" ou "região promotora" refere-se a uma seqüência de ácido nucleico, geralmente encontrada a 5' de uma seqüência codificante, que altera a expressão da seqüência codificante pelo fornecimento de um sítio de reconhecimento para RNA polimerase e/ou outros sítios de reconhe- cimento para outros fatores relacionados à transcrição utilizados para produ- zir RNA e/ou iniciar a transcrição no sítio correto sobre o DNA.

"Vetor de ácido nucleico recombinante" ou "vetor" ou "constru- to" refere-se a qualquer agente tal como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, seqüência que se replica autonomamente, fago ou segmento de nucleotídeo de RNA ou DNA de fita simples ou dupla linear ou circular, derivado de qual- quer fonte, capaz de integração genômica ou replicação autônoma, que compreende uma molécula de ácido nucleico na qual uma ou mais seqüên- cias de ácido nucleico tenham sido ligadas de uma maneira funcionalmente operativa. Tais construtos ou vetores de ácido nucleico recombinante com- preendem tipicamente uma seqüência regulatória a 5' ou região promotora e uma seqüência codificante que codifica o produto do gene desejado. Os ve- tores são tipicamente desenhados tal que uma vez liberados em uma célula ou tecido, a seqüência codificante é transcrita em mRNA, que é opcional- mente traduzido em um polipeptídeo ou proteína.

"Regeneração" refere-se ao processo de cultivar uma planta a partir de uma célula ou tecido de planta.

"Rizóbia" refere-se sem limitação a gêneros, espécies e cepas bacterianas que podem ser classificadas na ordem dos Rizobiais com exce- ção das cepas bacterianas de Agrobacterium que compreendem as famílias taxonômicas Rhizobiaceae (por exemplo, Rhizobium spp., Sinorhizobium spp.); Phyllobacteriaceae (por exemplo, Mesorhizobium spp., Phyllobacteri- um spp.); Brucellaceae (por exemplo, Ochrobactrum spp.); Bradyrhizobia- ceae (por exemplo, Bradyrhizobium spp.), e Xanthobacteraceae (por exem- plo, Azorhizobium spp.), entre outras. Para os propósitos do presente pedi- do, "Rizóbia" não inclui biovares ou espécies.

A classificação taxonômica pode ser feita como é conhecido na técnica, por exemplo, pela comparação de seqüências 16S de rDNA ou ou- tros métodos de classificação. Cepas selvagens de várias espécies de Rhi- zobium são tipicamente capazes de induzir a formação de nódulos fixadores de nitrogênio em tecidos de raízes de plantas hospedeiras tais como plantas leguminosas (Fabaceae). Entretanto, a habilidade de nodular raízes de uma dada espécie de planta não é necessária para a transferência de DNA medi- ada por Rhizobium em células de espécies de planta.

"Marcador selecionável" ou "marcador rastreável" refere-se a uma seqüência de ácido nucleico cuja expressão confere um fenótipo que facilita a identificação de células, tecidos ou plantas que contêm a seqüência de ácido nucleico.

"Transcrição" refere-se ao processo de produção de uma cópia de RNA a partir de um molde de DNA.

"Transformação" refere-se ao processo de introduzir uma se- qüência de ácido nucleico exógena em uma célula ou tecido. A transforma- ção pode ser transitória ou estável. Em transformações estáveis, parte ou todo o ácido nucleico exógeno é incorporado (por exemplo, integrado ou mantido estavelmente) no DNA genômico nuclear, DNA de plastídeo ou é capaz de replicação autônoma no núcleo ou plastídeo. "Transgênico" refere-se a organismos nos quais uma seqüência de ácido nucleico exógena foi estavelmente transformada.

Ao desenhar um vetor para o processo de transformação, um ou mais componentes genéticos são selecionados, os quais serão introduzidos na célula ou tecido de planta. Componentes genéticos podem incluir qual- quer ácido nucleico que é introduzido em uma célula ou tecido de planta u- sando o método de acordo com a invenção. Componentes genéticos podem incluir DNA não pertencente a plantas, DNA de planta ou DNA sintético.

Em uma modalidade, os componentes genéticos são incorpora- dos em uma composição de DNA tal como uma molécula recombinante, plasmídeo de fita dupla ou vetor que compreende pelo menos um ou mais dos seguintes tipos de componentes genéticos: (a) um promotor que funcio- na em células de planta para causar a produção de uma seqüência de RNA; (b) uma seqüência de DNA estrutural que causa a produção de uma se- qüência de RNA que codifique um produto de utilidade agronômica, e (c) uma seqüência de DNA 3' não-traduzida que funciona em células de planta para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados na terminação 3' da seqüência de RNA.

O vetor pode conter vários dos componentes genéticos para fa- cilitar a transformação da célula ou tecido de planta e para regular a expres- são da seqüência de ácido nucleico estrutural. Em uma modalidade preferi- da, os componentes genéticos estão orientados de forma a expressar um mRNA, que em uma modalidade otimizada pode ser traduzido em uma pro- teína. A expressão de uma seqüência codificante estrutural de planta (um gene, cDNA, DNA sintético ou outro DNA) que existe em uma forma de fita dupla envolve a transcrição de RNA mensageiro (mRNA) de uma fita do DNA pela enzima RNA polimerase e subsequente processamento do trans- crito primário de mRNA dentro do núcleo. Esse processamento envolve uma região 3' não-traduzida que adiciona nucleotídeos poliadenilados às extremi- dades 3' do mRNA.

Meios para preparar plasmídeos ou vetores que contenham os componentes genéticos desejados são bem-conhecidos na técnica. Vetores consistem tipicamente de vários componentes genéticos, incluindo, mas não limitados a elementos regulatórios tais como promotores, líderes, íntrons e seqüências de terminação. Elementos regulatórios também são referidos como elementos eis- ou transregulatórios, dependendo da proximidade do elemento com as seqüências ou gene(s) que eles controlam.

A transcrição de DNA em mRNA é regulada por uma região de DNA geralmente referida como a "promotora". A região promotora contém uma seqüência de bases que sinaliza para a RNA polimerase se associar com o DNA e iniciar a transcrição em mRNA usando uma das fitas de DNA como molde para fazer a fita complementar correspondente de RNA.

Vários promotores que são ativos em células de planta foram descritos na literatura. Tais promotores podem incluir, mas não são limitados aos promotores de nopalina sintase (NOS) e octopina sintase (OCS) que são transportados em plasmídeos Ti de Agrobacterium tumefaciens, os promoto- res de caulimovírus tais como os promotores 19S e 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e o promotor 35S do vírus de mosaico de escrofulária (FMV) e o promotor intensificado CaMV35S (e35S). Vários outros promoto- res de gene de planta que são regulados em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou de desenvolvimento, também podem ser usados para expressão de qualquer construto de DNA em células de planta, incluin- do, por exemplo, promotores regulados pelo (1) calor (Callis et ai, 1988, (2) luz (por exemplo, promotor RbcS-3A de ervilha, Kuhlemeier et al., (1989); promotor RbcS de milho, Schaffner et ai, (1991); (3) hormônios, tal como ácido abscísico (Marcotte et ai, 1989, (4) lesão (por exemplo, Wuni, Siebertz et ai, 1989); ou outros sinais ou reagentes químicos. A expressão específica em tecido também é conhecida. Como descrito abaixo, é preferido que o promotor particular selecionado seja capaz de causar expressão suficiente para resultar na produção de uma quantidade eficaz do produto do gene de interesse. Exemplos que descrevem tais promotores incluem sem limitação Patente U.S. 6.437.217 (promotor RS81 de milho), Patente U.S. 5.641.876 (promotor de actina de arroz, OsActI), Patente US 6.426.446 (promotor de RS324 de milho), Patente US 6.429.362 (promotor de PR-1 de milho), Pa- tente U.S. 6.232.526 (promotor de A3 de milho), Patente U1S. 6.177.611 (promotores constitutivos de milho), Patentes U,S. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530,196 (promotor 35S), Patente U.S. 6.433.252 (promotor L3 de oleosina de milho), Patente U.S. 6.429.357 (promotor de actina 2 de arroz assim como íntron de actina 2 de arroz), Patente U.S. 5.837.848 (promotor específico de raiz), Patente U.S. 6.294.714 (promotores induzíveis pela luz), Patente U.S. 6.140,078 (promotores induzíveis por sal), Patente U.S. 6.252.138 (promotores induzíveis por patógenos), Patente U.S. 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo), Patente U.S. 6.635.806 (promotor de gama-coixina), e Patente U.S. 7.151.204 (promotor de aldolase de cloroplasto de milho). Promotores adicionais que encontram uso são promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert et aí., 1987), o promotor de octo- pina sintase (OCS) (que é transportado sobre plasmídeos que induzem tu- mor de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de caulimovirus tais co- mo o promotor 19S do v.írus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al., 1987), o promotor 35S de CaMV (Odell et al., 1985), o promotor 35S do ví- rus de mosaico de escrofulária (Walker et al., 1987; Patentes U.S. 6.051.753; 5.378.619), o promotor de sacarose sintase (Yang et ai, 1990), o promotor do complexo do gene R (Chandler et al., 1989), e o promotor do gene da proteína que se liga a clorofila a/b, PCISV (Patente US 5.850,019). Na presente invenção, promotores de CaMV35S com seqüências intensifi- cadoras (e35S; Patente U.S. Nos. 5.322.938; 5.352.605; 5.359.142; e 5.530,196), FMV35S (Patente U.S. 6.051.753; 5.378.619), caulimovirus do estriado clorótico do amendoim (PCISV; Patente U.S. 5.850,019), At.Act 7 (Acesso # U27811), At.ANTI (Pedido de Patente U.S. 20060236420), FMV.35S-EF1a (Publicação de Pedido de Patente U.S. 2005/0022261), elF4A10 (Acesso # X79008) e AGRtu.nos (Acesso do GenBank V00087; Depicker et al, 1982; Bevan et al., 1983), fosfato isomerase de triose citosóli- ca de arroz (OsTPI; Patente U.S. No. 7.132.528), e gene de actina 15 de arroz (OsAct15; Publicação de Pedido de Patente U.S. 2006/0162010 po- dem ser de benefício particular. Em alguns exemplos, por exemplo, OsTPI e OsAct 15, um promotor pode incluir uma 5'UTR e/ou um primeiro íntron. Híbridos de promotor também podem ser construídos para in- tensificar a atividade transcricional (Patente U.S. No. 5.106.739) ou para combinar a atividade transcricional desejada, indutibilidade e especificidade de tecido ou especificidade de desenvolvimento. Promotores que funcionam em plantas incluem, mas não são limitados a promotores que são induzíveis, virais, sintéticos, constitutivos conforme descritos, e temporalmente regula- dos, espacialmente regulados e espaço-temporalmente regulados. Outros promotores que são intensificados no tecido, específicos para tecido ou re- gulados pelo desenvolvimento também são conhecidos na técnica e previs- tos para ter utilidade na prática dessa invenção.

Os promotores usados nos construtos de DNA (isto é, genes de planta quiméricos/recombinantes) da presente invenção podem ser modifi- cados, se desejado, para afetar suas características de controle. Promotores podem ser derivados por meios de ligação com regiões operadoras, aleató- rias ou por mutagênese controlada, etc. Além disso, os promotores podem ser alterados para conter múltiplas "seqüências intensificadoras" para auxili- ar na expressão gênica elevada.

O mRNA produzido por um construto de DNA da presente in- venção também pode conter uma seqüência líder 5' não-traduzida. Essa se- qüência pode ser derivada do promotor selecionado para expressar o gene e pode ser especificamente modificada a fim de aumentar ou diminuir a tradu- ção do mRNA. As regiões 5' não-traduzidas também podem ser obtidas de RNAs virais, de genes eucarióticos adequados ou de uma seqüência de ge- ne sintético. Tais seqüências "intensificadoras" podem ser desejáveis para aumentar ou alterar a eficácia traducional do mRNA resultante. A presente invenção não está limitada a construtos em que a região não-traduzida é derivada da seqüência 5' não-traduzida que acompanha a seqüência promo- tora. De preferência, a seqüência líder não-traduzida pode ser derivada de promotores ou genes não- relacionados (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.362.865). Exemplos de seqüências líder não-traduzidas incluem líderes de proteína de choque térmico de milho e petúnia (Patente U.S. No. 5.362.865), líderes de proteína de revestimento de vírus de planta, líderes de planta de rubisco, GmHsp (Patente U.S. 5.659.122), PhDnaK (Patente U.S. No. 5.362.865), AtAntI, TEV (Carrington and Freed, 1990), OsActI (Patente U.S. No. 5.641.876), OsTPi (Patente U.S. No. 7.132.528), e OsAct15 (Publicação U.S. No. 20060162010), e AGRtu.nos (Acesso do GenBank V00087; Bevan et al., 1983). Outros componentes genéticos que servem para intensificar a expressão ou afetar a transcrição ou tradução de um gene também estão previstos como componentes genéticos.

Seqüências de íntron são conhecidas na técnica para auxiliar na expressão de transgenes em células de planta monocotiledônea. Exemplos de íntrons incluem o íntron da actina do milho (Patente U.S. 5.641.876), o íntron de HSP70 de milho (ZmHSP70; Patente U.S. 5.859.347; Patente U.S. 5,424,412), íntron de TPI de arroz (OsTPI; Patente U.S. No. 7.132.528) e são benéficos na prática da invenção.

A terminação da transcrição pode ser obtida por uma seqüência 3' não-traduzida de DNA operativamente ligada a um transgene recombinan- te (por exemplo, o gene de interesse, a seqüência de identificação compre- endendo um gene rastreável ou o gene marcador selecionável de planta). A região 3' não-traduzida de uma molécula de DNA recombinante contém um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos adenilados à terminação 3' do RNA. A região 3' não-traduzida pode ser obtida de vários genes que são expressos em células de planta. A região 3' não- traduzida de nopalina sintase (Fraley etal., 1983) é comumen- te usada nesta função. Moléculas de poliadenilação de um gene de RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al., 1984), AGRtu.nos (Acesso no Genbank E01312), E6 (No. de Acesso U30508), glutelina de arroz (Okita et al., 1989) e TaHspI 7 (gene da proteína de choque térmico de baixo peso molecular de trigo; No. de Acesso no GenBank X13431) em particular, po- dem ser benéficas para uso com a invenção.

Em uma modalidade, o vetor contém um gene marcador sele- cionável, rastreável ou classificável. Esses componentes genéticos também são referidos neste documento como componentes genéticos funcionais, já que eles produzem um produto que apresenta uma função na identificação de uma planta transformada ou um produto de utilidade agronômica. O DNA que se apresenta como um mecanismo de seleção ou rastreamento pode funcionar em um tecido de planta regenerável para produzir um composto que poderia conferir ao tecido de planta resistência a um composto tóxico sob outras circunstâncias. Vários genes marcadores rastreáveis ou selecio- náveis são conhecidos na técnica e podem ser usados na presente inven- ção. Exemplos de marcadores selecionáveis e genes que fornecem resis- tência contra eles estão descritos em Miki e McHugh, 2004. Genes de inte- resse para uso como um marcador selecionável, rastreável ou registrável podem incluir, mas não estão limitados a gus, gfp (proteína verde fluorescen- te), luciferase (LUX)1 genes que conferem tolerância a antibióticos como ca- namicina (Dekeyser et al, 1989), neomicina, canamicina, paromomicina, G418, aminoglicosideos, espectinomicina, estreptomicina, higromicina B, bleomicina, fleomicina, sulfonamidas, estreptotricina, cloranfenicol, metotre- xate, 2-deoxiglicose, aldeído de betaína, S-aminoetil L-cisteina, 4- metiltriptofano, D-xilose, D-manose, benziladenina-N-3-glicuronidase, genes que codificam enzimas que fornecem tolerância a herbicidas como o glifosa- to (por exemplo,5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS): Della- Cioppa et al, 1987; Patente U.S. 5.627.061; Patente U.S. 5.633.435; Paten- te U.S. 6.040,497; Patente U.S. 5.094.945; W004074443, e W004009761; glifosato oxidoredutase (GOX; Patente U.S. 5,463.175); glifosato descarboxi- lase (W005003362 e Pedido de Patente U.S. 20040177399; ou glifosato N- acetiltransferase (GAT): Castle et al, Pedido de Patente U.S. 20030083480), dalapon (por exemplo, dehl que codifica ácido 2,2- dicloropropiônico desalo- genase que confere tolerância ao ácido 2,2-dicloropropiônico (Dalapon; W09927116)), bromoxinil (haloarilnitrilase (Bxn) para conferir tolerância a bromoxinil (WO8704181A1; US 4.810,648; WO8900193A)), herbicidas de sulfonil (por exemplo acetoidroxiácido sintase ou acetolactate sintase que confere tolerância a inibidores de acetolactato sintase tais como sulfoniluréi- а, imidazolinona, triazolopirimidina, pirimidiloxibenzoatos e ftalida; (US 6.225.105; US 5.767.366. US 4.761.373; U.S. 5.633.437; U.S. 6.613.963; US 5.013.659; US 5.141.870; US 5.378.824; US 5.605.011)); que codificam ALS, GST-II), bialafos ou fosfinotricina ou derivados (por exemplo, fosfinotri- cina acetiltransferase (ΰβή que confere tolerância a fosfinotricina ou glifosi- nato (US 5.646.024. US 5.561.236. EP 275.957; US 5.276.268; US 5.637. 489; US 5.273. 894), atrazina (que codifica GST-III), dicamba (dicamba mo- nooxigenase (DMO); Pedidos de Patente US 20030115626, 20030135879), ou setoxidima (acetil-coenzima A carboxilase modificada para conferir tole- rância a - cicloexanodiona (setoxidima) e ariloxifenoxipropionato (haloxifop) (U.S. 6.414.222)), entre outros. Outros procedimentos de seleção também podem ser implementados incluindo mecanismos de seleção positiva (por exemplo, uso do gene manA de E. coli, que permite o crescimento na pre- sença de manose) e ainda estarão dentro do escopo da presente invenção (vide também Miki e McHugh (2004)).

A presente invenção pode usada com qualquer plasmídeo ou vetor de transformação de planta adequado que contem um marcador sele- cionável ou rastreável e elementos regulatórios associados como descrito, junto com um ou mais ácidos nucleicos expressos de uma maneira suficiente para conferir uma característica desejável em particular. Exemplos de genes estruturais adequados de interesse agronômico previstos pela presente in- venção podem incluir, mas não são limitados a genes tolerância à doença, inseto ou praga, tolerância a herbicida, genes para melhoramento de quali- dade tais como rendimento, melhorias nutricionais, tolerâncias ao ambiente ou estresse ou quaisquer alterações desejáveis na fisiologia, crescimento, desenvolvimento, morfologia da planta ou produto(s) de planta incluindo pro- dução de amido (Patentes U.S. 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750,876; 6.476.295), produção de óleos modificados (Patentes U.S. 6.444.876; 6.426.447; 6.380,462), produção elevada de óleo (Patente U.S. 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; 6.476.295), conteúdo de ácido graxo modificado (Pa- tentes U.S. 6.828.475; 6.822.141; 6.770,465; 6.706.950; 6.660,849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; 6.459.018), produção aumenta- da de proteína (Patente U.S. 6.380,466), maturação de fruto (Patente U.S. 5.512.466), nutrição animal e humana melhorada (Patentes U.S. 6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59; 5.985.605; 6.171.640), biopolímeros (Patentes U.S. RE37.543; 6.228.623; 5.958.745 e Publicação de Patente U.S. No. US20030028917). Também, resistência ao estresse ambiental (Patente U.S. 6.072.103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis (Patentes U.S. 6.812.379; 6.774.283; 6.140,075; 6.080,560), características de proces- samento melhoradas (Patente U.S. 6.476.295), digestibilidade melhorada (Patente U.S. 6.531.648) rafinose diminuída (Patente U.S. 6.166.292), pro- dução industrial de enzima (Patente U.S. 5,543,576), sabor melhorado (Pa- tente U.S. 6.011.199), fixação de nitrogênio (Patente U.S. 5,229,114), produ- ção de semente híbrida (Patente U.S. 5.689.041), produção de fibra (Patente U.S. 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; 5.869.720) e produção de biocombus- tível (Patente U.S. 5.998.700). Qualquer um desses ou de outros elementos genéticos, métodos e transgenes podem ser usados com a invenção como será avaliado por aqueles versados na técnica à vistada presente descrição.

Alternativamente, as seqüências de DNA de interesse podem afetar esses fenótipos pela inibição de expressão de um gene endógeno a - través de tecnologias de silenciamento de gene tais como co-supressão, antisenso, RNAi, expressão de miRNAs (natural ou manipulado), expressão de siRNAs trans-atuante e expressão de ribozimas (vide, por exemplo, Pedi- do de Publicação de Patente U.S. 20060200878).

Ácidos nucleicos exemplares que podem ser introduzidos pelos métodos abrangidos pela presente invenção incluem, por exemplo, seqüên- cias de DNA ou genes de outras espécies ou ainda genes ou seqüências que se originam com ou estão presentes na mesma espécie, mas são incor- porados nas células receptoras por métodos de engenharia genética ao in- vés das técnicas de reprodução e cultivo clássicas. Entretanto, a expressão "exógena" também é pretendida se referir a genes que não estão normal- mente presentes na célula a ser transformada ou, talvez, simplesmente au- sentes na forma, estrutura, etc., como encontrados no segmento de DNA ou gene transformantes, ou genes que já estão normalmente presentes onde se deseja, por exemplo, ter superexpressão. Assim, a expressão gene ou DNA "exógeno" é pretendida referir-se a qualquer gene ou segmento de DNA que é introduzido em uma célula receptora, sem levar em consideração que um gene similar possa já estar presente em tal célula. O tipo de DNA incluído no DNA exógeno pode incluir DNA que já está presente na célula de planta, DNA de outra planta, DNA de um organismo diferente ou um DNA gerado externamente, tal como uma seqüência de DNA que contém uma mensagem antisenso de um gene ou uma seqüência de DNA que codifica uma versão sintética ou modificada de um gene.

Tendo em vista esta descrição, vários outros genes marcadores selecionáveis ou rastreáveis possíveis, elementos regulatórios e outras se- qüências de interesse ficarão evidentes para aqueles versados na técnica. Portanto, a discussão precedente é pretendida ser exemplar ao invés de completa.

Para a transformação mediada por Rizóbia, após a construção do vetor ou construto de transformação de planta, a molécula de ácido nu- cleico, preparada como uma composição de DNA in vitro, é introduzida em um hospedeiro adequado tal como E. coli e introduzida em outro hospedeiro adequado tal como Rizóbia, incluindo Rhizobium, ou diretamente transfor- mada (por exemplo, eletroporada) em Rizóbia competente. O plasmídeo Ti ou Ri pode ser transferido naturalmente para Rhizobium que fixa nitrogênio e pode induzir tumores ou raízes em cabeleira, respectivamente (Hooykaas et al. 1977, Weller et al. 2004). Tal plasmídeo Ti ou Ri pode, alternativamente, ser "desarmado" e incapaz de causar proliferação de célula de planta. Como Rhizobium e Agrobacterium têm mecanismos de infecção diferenciados, a infecção profunda por Rhizobium ou outra Rizóbia através de seu filamento de infecção pode aumentar a freqüência de transformação da linhagem ger- minativa de um gene de interesse durante a transformação de soja uma vez que o plasmídeo auxiliar Ti ou Ri é introduzido.

A presente invenção abrange o uso de cepas bacterianas para introduzir um ou mais componentes genéticos em plantas. Em uma modali- dade, os hospedeiros contêm plasmídeos Ti ou Ri desarmados que não con- têm os oncogenes que causam tumorigênese ou rizogênese, cujos deriva- dos são usados como vetores e contêm os genes de interesse que são sub- seqüentemente introduzidos nas plantas. Em outra modalidade, as bactérias transferem DNA para células de planta por meio de um mecanismo depen- dente de T4SS, ou seja, transferência por conjugação mediada por oríT. As funções necessárias para transferir DNA independente de T4SS podem re- sidir no plasmídeo que contem o DNA a ser transferido ou podem residir no cromossomo ou outro plasmídeo, incluindo um plasmídeo Ti ou Ri, também presentes em tal célula bacteriana.

Espécies e cepas bacterianas incluem, mas não são limitadas a Rhizobium sp., Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium Ieguminosarum Madison, R. Ieguminosarum USDA2370, R. Ieguminosarum USDA2408, R. Iegumino- sarum USDA2668, R. Ieguminosarum 2370G, R. Ieguminosarum 2370LBA, R. Ieguminosarum 2048G, R. Ieguminosarum 2048LBA, R. Ieguminosarum bv. phaseoli, R. Ieguminosarum bv. phaseoli 2668G, R. Ieguminosarum bv. phaseoli 2668LBA, R. Ieguminosarum RL542C, R. Ieguminosarum bv, vicia- e, R. Ieguminosarum bv. trifolii, Rhizobium etli USDA 9032, R. etli bv phaseo- li, Rhizobium tropici, Mesorhizobium sp., Mesorhizobium Ioti ML542G, M. Ioti ML4404, Sinorhizobium sp., Sinorhizobium meliloti SD630, S. meliloti US- DA1002, Sinorhizobium fredii USDA205, S. fredii SF542G, S. fredii SF4404, S. fredii SM542C, Bradyrhizobium sp., Bradyrhizobium japonicum USDA 6, B. japonicum USDA 110,

Qualquer meio de cultura de planta adequado pode ser usado para desenvolver ou manter uma cultura de tecido de planta, suplementado como apropriado com reguladores de crescimento de planta adicionais inclu- indo, mas não limitados a auxinas tais como picloram (ácido 4-amino-3,5,6- tricloropicolinico), ácido 2,4-D (2,4-diclorofenoxiacetico) e dicamba (ácido 3,6-dicloroanísico); citocininas tais como BAP (6-benzilaminopurina) e cineti- na; ABA; e geberelinas. Outros aditivos de meio podem incluir mas não são limitados a aminoácidos, macroelementos, ferro, microelementos, inositol, vitaminas e orgânicos, carboidratos, componentes indefinidos de meio tais como hidrolisados de caseína, com ou sem uma agente gelificante apropria- do tal como uma forma de ágar, tal como agarose com ponto de fusão baixo ou Gelrite se desejado. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com a variedade de meios de cultura de tecido, que quando suplementados apropriadamente, suportam o crescimento e desenvolvimento de tecido de planta e são adequados para transformação e regeneração de planta. Esses meios de cultura de tecido podem ser adquiridos como uma preparação co- mercial ou preparados como de costume e modificados. Exemplos de tais meios podem incluir, mas não são limitados a Murashige & Skoog (1962), N6 (Chu et al., 1975), Linsmaier & Skoog (1965), Uchimiya & Murashige (1962), meio de Gamborg (Gamborg et al., 1968), meio D (Duncan et ai, 1985), meios de planta de McCown1S Woody (McCown & Lloyd, 1981), Nitseh & Nitsch (1969), e Schenk & Hildebrandt (1972) ou derivações desses meios consequentemente suplementados. Aqueles versados na técnica estão cien- tes de que meios e suplementos para meios tais como nutrientes e regulado- res de crescimento para uso em transformação e regeneração e outras con- dições de cultura tais como intensidade da luz durante a incubação, pH e temperaturas de incubação podem ser otimizados para a variedade de inte- resse em particular. Após um tecido de planta transformável ser isolado ou desenvolvido em cultura de tecido ou tecido de planta transformável ser i- dentificado e/ou preparado in planta, a próxima etapa do método é introduzir os componentes genéticos no tecido de planta. Esse processo também é referido aqui como "transformação". As células de planta são transformadas e opcionalmente submetidas a uma etapa de seleção. Os transformantes independentes são referidos como eventos transgênicos. Vários métodos que utilizam cepas de Agrobacterium têm sido relatados e podem ser usados para inserir componentes genéticos em tecido de planta transformável. En- tretanto, não Agrobacterium spp. ainda não foram utilizadas para transformar plantas.

Aqueles versados na técnica estão cientes das etapas típicas no processo de transformação de planta. A Rizóbia a ser usada pode ser prepa- rada tanto por inoculação em meio líquido tal como meio TY ou YEM (Berin- ger et al., 1974) diretamente de um estoque de glicerol quanto por semeadu- ra da bactéria sobre um meio solidificado de um estoque de glicerol, que permite as bactérias crescerem sob as condições seletivas apropriadas. A Rizóbia pode ser "pré-induzida" por crescimento sob condições nutricionais e de cultura incluindo a presença de acetosiringona em uma quantidade que facilita a transformação. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com procedimentos para crescimento e condições de cultura adequadas pa- ra bactérias assim como procedimentos de inoculação subsequentes. A densidade da cultura bacteriana usada para inoculação e a proporção do número de células bacterianas para a quantidade de tecido de explante po- dem variar de um sistema para o outro e, portanto, a otimização desses pa- râmetros para qualquer método de transformação é esperada.

O próximo estágio do processo de transformação é a inocula- ção. Nesse estágio as plantas, tecidos de planta ou explantes adequada- mente preparados e a suspensão de célula bacteriana são misturados jun- tos. A duração e a condição da inoculação e a densidade de célula bacteria- na variarão dependendo do sistema de transformação de planta. O cresci- mento ou inoculação de bactérias que transformam pode ocorrer na presen- ça de acetosiringona ou outro indutor conhecido de expressão de genes de virulência localizados sobre os plasmídeos Ti ou Ri. Em certas modalidades, o crescimento de bactéria diferente de Agrobacterium sp. é feito sob condi- ções que minimizam a produção de polissacarídeos durante o crescimento em meio de indução. Em modalidades particulares, a fonte de carbono usa- da para minimizar a produção de polissacarídeos durante o crescimento de Rizóbia em meio de indução é glicose em meio AB-TY ou L-arabinose e gli- conato de potássio em meio ATA.

Após a inoculação, qualquer excesso de suspensão bacteriana pode ser removido e a bactéria e o material de planta-alvo são co-cultivados. A co-cultura refere-se ao período pós-inoculação e antes de transferir para um meio de retardo ou seleção opcionais. Qualquer quantidade de meio de cultura de tecido de planta pode ser usada para a etapa de co-cultura. Teci- dos de planta após a inoculação com bactérias podem ser cultivados em um meio líquido ou semissólido. A co-cultura é tipicamente realizada por cerca de um a quatro dias.

Após a co-cultura com bactérias, os tecidos de planta inoculados ou explantes podem opcionalmente ser colocados diretamente sobre meio seletivo. Alternativamente, após a co-cultura com bactérias, eles podem ser colocados em meio sem o agente seletivo e subseqüentemente colocados em meio seletivo. Aqueles versados na técnica estão cientes das numerosas modificações em regimes, meios e condições de crescimento seletivos que podem variados dependendo do sistema de planta e do agente seletivo. A- gentes seletivos típicos incluem, mas não são limitados a antibióticos tais como geneticina (G418), canamicina e paromomicina, ou aos herbicidas gli- fosato, glifosinato e DICAMBA.Componentes de meio adicionais apropriados podem ser adicionados ao meio de seleção ou retardo para inibir o cresci- mento bacteriano. Tais componentes de meio podem incluir, mas não são limitados a antibióticos tais como carbenicilina ou cefotaxima.

As culturas são subseqüentemente transferidas para um meio adequado para a recuperação das mudas transformadas. Aqueles versados na técnica estão cientes dos vários métodos para recuperar plantas trans- formadas. Uma variedade de meios e necessidades de transferência podem ser implementados e otimizados para cada sistema de planta para transfor- mação de planta e recuperação de plantas transgênicas. Consequentemen- te, tais meios e condições de cultura descritos na presente invenção podem ser modificados ou substituídos com componentes nutricionalmente equiva- lentes ou processos similares para seleção e recuperação de eventos trans- gênicos e ainda estão dentro do escopo da presente invenção.

Uma vez que o tecido de planta transformável é inoculado, as células de planta no tecido podem ser transformadas e células de planta transformada independentemente são selecionadas. Os transformantes in- dependentes são referidos como eventos transgênicos. A transformação mediada por Agrobacterium e sistemas de regeneração para várias espécies de planta monocotiledôneas e dicotiledôneas são conhecidos na técnica (por exemplo, Komari et ai, 1998; Zhou et ai 1995; Hiei et ai, 1994. Plant J.; 6:271-282; Ishida et al. 1996; Rogers et ai, 1987; Schrammeijer et ai, 1990; Patente U.S. 6.384.301), embora o uso de Rizóbia para transformação de célula de planta tenha sido relatado apenas para o tabaco, Arabidopsis, e arroz (Broothaerts et ai, 2005). Seguindo a transformação e regeneração, as plantas transgênicas são identificadas. Finalmente, o versado na técnica re- conhecerá que após o cassete de expressão estar estavelmente incorporado nas plantas transgênicas e confirmado ser operativo, ele pode ser introduzi- do em outras plantas por cruzamento sexuado. Qualquer uma das várias técnicas de reprodução padronizadas pode ser usada dependendo da espé- cie a ser cruzada.

Os transformantes produzidos e sua progênie podem subse- qüentemente ser analisados para determinar a presença ou ausência de um ácido nucleico particular de interesse contido no vetor de transformação. A- nálises moleculares podem incluir mas não são limitadas a Southern blots (Southern, 1975), análise por PCR (reação em cadeia da polimerase), análi- se de atividades enzimáticas, abordagens de imunodiagnóstico e avaliações de campo e similaress (Vide também, por exemplo, Sambrook et ai, 1989). Esses e outros métodos bem-conhecidos podem ser realizados para confir- mar a estabilidade das plantas transformadas produzidas pelos métodos descritos.

As técnicas acima descritas podem ser adequadas para qual- quer planta e são especialmente úteis para plantas tais como alfafa, cevada, feijões, beterraba, brócolis, repolho, cenoura, canola, couve-flor, aipo, repo- lho chinês, milho, algodão, pepino, feijão seco, berinjela, erva doce, feijões (garden beans), abóbora, alho-poró, alface, melão, aveia, quiabo, cebola, ervilha, pimenta, abóbora, amendoim, batata, rabanete, arroz, sorgo, soja, espinafre, abóbora-moranga, milho doce, beterraba, girassol, tomate, melan- cia e trigo.

EXEMPLOS

Aqueles versados na técnica apreciarão as muitas vantagens dos métodos e composições fornecidas pela presente invenção. Os seguin- tes exemplos estão incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser observado por aqueles versados na técnica que as téc- nicas descritas nos exemplos que se seguem representam técnicas desco- bertas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção e assim podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua práti- ca. Entretanto, aqueles versados na técnica poderão, tendo em vista a pre- sente descrição, apreciar que várias modificações podem ser feitas nas mo- dalidades específicas que estão descritas e ainda obter um resultado pareci- do ou similar sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Todas as re- ferências citadas neste documento estão incorporadas por referência à me- dida que elas suplementam, explicam, fornecem um antecedente ou ensi- nam metodologia, técnicas ou composições empregadas neste documento. Exemplo 1

Cepas de Rhizobium e Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens AGLO foi obtida da ATCC (Número ATCC: BAA-100™, Lazo et al., 1991). Rhizobium Ieguminosarum cepa Ma- dison e Sinorhizobium meliloti SD630 foram isoladas de trevo de um jardim doméstico em Madison, Wl, USA, e confirmadas por seqüenciamento do produto de PCR de um rRNA 16S amplificado com os seguintes iniciadores: 5' GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3' (Xd578; SEQ ID NO:1) e 5' AAG- GAGGTGATCCAGCCGCAG 3' (Xd579; SEQ ID NO:2). Outras cepas de Rhizobium foram obtidas do centro de coleção de Rhizobium de USDA (Ta- bela 1). Cepas de Rhizobium foram cultivadas em meio TY ou MAG e Agro- bacterium em meio LB. As cepas são mostradas abaixo e as seqüências de rRNA 16S amplificadas em cepas isoladas são fornecidas como SEQ ID NOs: 24 a 30.Tabela 1: Cepas de Agrobacterium e Rhizobium_

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Exemplo 2

Transformação de Agrobacterium

As células de Agrobacterium competentes foram preparadas pe- la lavagem de uma cultura em fase log em meio LB com água deionizada gelada e glicerol a 10% e armazenadas a -80°C. Cinqüenta microlitros de células competentes degeladas foram misturados com 1 ou 2 μl de DNA so- bre gelo e eletroporadas em uma cuveta de 1 mm de intervalo com resistên- cia de 200 ohm, capacidade de 25pF e 1,8 kv usando um equipamento BIO- RAD Gene Pulser® II (BIO-RAD, Hercules, CA).

Exemplo 3

Construção de plasmídeos Ti com um gene marcador selecionável para antibiótico

Para selecionar plasmídeos Ti em Rhizobium spp., uma seqüên- cia homóloga foi amplificada a partir de um plasmídeo Ti correspondente e inserida em um vetor de resistência a canamicina. A seqüência homóloga foi usada para integrar o gene de resistência a canamicina no plasmídeo Ti por recombinação homóloga.

Para construir o plasmídeo pTiBo542C, o gene virC inteiro (Nú- mero de Acesso do Genbank AB027257) da cepa AGLO de Agrobacterium foi amplificado com PCR usando os seguintes iniciadores 5' ACAATA- ATGTGTGTTGTTAAGTCTTGTTGC 3' (Xd683 SEQ ID NO:3) e 5' CTCAA- ACCTACACTCAATATTTGGTGAG 3' (Xd684 SEQ ID NO:4) e a polimerase Pfu (STRATAGENE, La Jolla, CA) e inserido no vetor de clonagem cego TOPO (Invitrogen Carlsbad, CA) dando origem a um vetor intermediário pMON67402. O vetor intermediário foi ligado posteriormente a um fragmento trfA de pCGN11206 digerido com Pvull/Mscl, que resultou no construto pMON96913 (FIG. 6). O vetor foi então introduzido na cepa AGLO de Agro- bacteríum por eletroporação padronizada como descrito acima e plaqueado em Canamicina 50 mg/l e meio LB para selecionar um único evento de cru- zamento. Como o vetor de integração não é mantido em AGLO, as colônias resistentes foram presumivelmente devidas a integração do vetor em um plasmídeo Ti por recombinação homóloga. A cepa resultante foi designada AGL0C.

Similarmente, para construir o plasmídeo pTi542G, a seqüência inteira de virG (Número de Acesso do Genbank AB027257) da cepa AGLO de Agrobacterium foi amplificada por PCR 5' AGATCTGGCTCGCGGCG- GACGCAC 3' (Xd681; SEQ ID NO:5) e 5' CGCTCGCGTCATTCTTTGCTG- GAG 3' (Xd682; SEQ ID NO:6) com polimerase Pfu e inserido em pMON67402, o que resultou no construto pMON96026 (FIG. 8). Esse vetor foi introduzido na cepa AGLO por eletroporação padronizada e plaqueado sobre canamicina 50 mg/L e meio LB para selecionar um único evento de cruzamento. A cepa resultante foi designada AGLOG.

A fim de construir o plasmídeo auxiliar pTi4404kan, a região trai e trbCE de plasmídeo Ti de octopina pAL4404 (Número de Acesso do Gen- bank NC_002377) de LBA4404 foi amplificada com os iniciadores 5' TCAG- CAGGATGACGCCGTTATCG 3' (Xd695; SEQ ID NO:7) e 5' TCTCGCCC- GACCAATACCAACAC 3' (Xd696; SEQ ID NO:8) (seqüência do Genbank AF242881) com polimerase Pfu, e inserida em pMON67402. O vetor inter- mediário foi ligado posteriormente a um fragmento trfA de pCGN11206 dige- rido com Pvull/Mscl, que resultou no construto pMON96914 (FIG. 7). Esse vetor de plasmídeo foi introduzido em LBA4404 por eletroporação e selecio- nado em meio LB com canamicina 50 mg/L para selecionar um único evento de cruzamento.

Após uma cultura de três dias em meio sólido, as colônias resis- tentes a kanR foram transferidas para 2 ml de meio LB líquido com canami- cina 50 mg/L. Um microlitro da cultura da noite anterior foi diretamente ampli- ficado com a polimerase YieldAce® Taq (Stratagene) seguindo a instrução do fabricante com os seguintes iniciadores: 5' GCTGACGGGCCCGGATGA- ATGTCAGCTACTG 3' (Xd715; SEQ ID NO:9) e 5' GCTCTAGAAATTGTA- AGCGTTAATAATTCAGAAGAACTCGTC 3' (Xd716; SEQ ID NO: 10) e a in- tegração de um gene de resistência à canamicina em plasmídeos Ti foi con- firmada. A cepa resultante foi designada 4404TIK.

Exemplo 4

Extração de plasmídeos Ti de Agrobacterium

Os plasmídeos Ti modificados, pTiBo542C, pTiBo542G, pTi4404kan e pTiC58 (ABI), foram extraídos das cepas modificadas de A- grobacterium AGLOC, AGLOG, 4404TIK e ABI, que contêm os respectivos plasmídeos. Cinco ml de cultura da noite anterior em LB com canamicina 50 mg/L foram centrifugados, ressuspensos em 400 μl de tampão P1, mistura- dos com 400 μl de tampão P2, neutralizados com 400 μl de tampão P3 (tampões do kit QIAGEN maxi-prep). Após 5 min. de incubação em tempera- tura ambiente, a mistura foi centrifugada por 10 min. em 12 g a 4°C. Aproxi- madamente 1200 μl de sobrenadante foram misturados com 800 μl de iso- propanol e centrifugados por 10 min. a 4°C. O pellet foi lavado com etanol 70% uma vez e ressuspenso em 200 μl de TE sem secagem. Os mega plasmídeos foram subseqüentemente armazenados a 4°C.

Exemplo 5

Células competentes de Rizóbia e introdução de plasmídeos Ti modifi- cados em Rizóbia

Células competentes de Rizóbia foram preparadas de acordo com Garg et al. 1999 com modificação. Resumidamente, uma pequena por- ção do crescimento de células de Rizóbia (por exemplo, fíhizobium) de um estoque congelado com glicerol foi cultivada em 10 ml de caldo TY por 24 horas e então transferida para 500 ml de caldo TY a 30°C com agitação vi- gorosa e deixada crescer até a fase médio-logarítmica (OD6oo= 0,4 a 0,6). A cultura foi transferida para dois tubos de centrífuga de 250, resfriados sobre gelo por 15 a 30 min. e centrifugados a 9000 rpm por 10 min. a 4°C para co- letar as células. O pélete de células foi lavado com água deionizada estéril gelada e com glicerol a 10% gelado e ressuspenso em glicerol a 10% gela- do. A suspensão celular foi aliquotada em 50 μΙ/tubo para uso imediato ou congelada em nitrogênio líquido e armazenada a -809C. Eletroporação de plasmídeos Ti modificados em cepas de Rizóbia: Cinqüen- ta microlitros das células competentes foram descongeladas sobre gelo, mis- turados com 1 ou 2 μΙ do plasmídeo Ti preparado e mantidos sobre gelo por 30 min.. A mistura foi transferida para uma cuveta de eletroporação gelada de 1 mm de intervalo. Os parâmetros de eletroporação (BIO-RAD Gene Pul- ser® II) foram fixados como segue: 2 KV/400 Ω de resistência/25 pF de ca- pacidade ou 1,5 KV/400 Ω de resistência/25 pF de capacidade ou 1,5 KV/800 Ω de resistência/10 pF de capacidade. Após a eletroporação, a cu- veta foi mantida sobre gelo por 5 a 10 min. antes de adicionar 1 ml de meio TY ou MAG e transferir para um tubo Falcon de 14 ml. O tubo foi cultivado por 3 horas a 30°C, plaqueado sobre meio TY ou MAG sólido com 50 mg/L de canamicina e cultivado a 30°C por 3 dias para recuperar colônias resis- tentes.

Confirmação de Rizóbia transformada com plasmídeos Ti: As colônias resistentes a canamicina foram transferidas para 3 ml de TY líquido ou meio MAG com 50 mg/l de canamicina e cultivadas durante a noite. Um microlitro de cultura foi diretamente amplificado com polimerase YieldAce® Taq seguindo as instruções do fabricante (Stratagene). Para detectar pTiBo542C ou pTiBo542G em cepas de Rizóbia, os iniciado- res de w/C 5' ACAATAATGTGTGTTGTTAAGTCTTGTTGC 3' (Xd683; SEQ ID NO:3) e 5' CAATTGCATTTGGCTCTTAATTATCTGG 3' (Xd684a; SEQ ID NO:11) ou iniciadores de virG 5' AGATCTGGCTCGCGGCGGACGCAC 3' (Xd681; SEQ ID NO:5) e 5' CGCTCGCGTCATTCTTTGCTGGAG 3' (Xd682; SEQ ID NO:6) foram usados para amplificar um fragmento de 2,35 kb ou um fragmento de 1,2 kb, respectivamente.

Para o plasmídeo pTi4404kan, os seguintes iniciadores foram usados: 5' GCATGCCCGATCGCGCTCAAGTAATC 3' (Xd699; SEQ ID NO: 12) e 5' TCTAGGTCCCCCCGCGCCCATCG 3' (Xd700; SEQ ID NO: 13)) amplifica um fragmento de 1274 bp de w'/02 que codifica a seqüência do plasmídeo Ti de octopina; 5' CCATGGATCTTTCTGGCAATGAGAAATC 3' (Xd701; SEQ ID NO:14) e 5' GTCAAAAGCTGTTGACGCTTTGGCTACG 3' (Xd702: SEQ ID NO:15) amplifica um fragmento de 1602 bp de w'rE2; 5' ACGGGAGAGGCGGTGTTAGTTGC 3' (Xd703; SEQ ID NO:16) e 5' CGA- TAGCGACAATGCCGAGAACG 3' (Xd704; SEQ ID NO:17) amplifica um fragmento de aproximadamente 0,9 kb de virB1.

A fim de identificar o plasmídeo pTiC58 da cepa ABI, três pares de iniciado- res foram usados: 5' ATGCCCGATCGAGCTCAAGTTATC 3' (Xd685; SEQ ID NO:18) e 5' TGAAAGGACACCTCTCCGTTGCTG 3' (Xd686; SEQ ID NO: 19) amplifica um fragmento de 1247 bp de virD2\ 5' CCATGGATCCGA- AGGCCGAAGGCAATG 3' (Xd687; SEQ ID NQ:20) e 5' CTACAGACTGTT- TACGGTTGGGC 3' (Xd688; SEQ ID NO:21) amplifica uma seqüência codifi- cante inteira de 1670bp de virE2; 5' GTGAGCAAAGCCGCTGCCATATC 3' (Xd689; SEQ ID NO:22) e 5' TAGAGCGTCTGCTTGGTTAAACC 3' (Xd690; SEQ ID NO:23) amplifica um fragmento parcial de 1102bp de repA.

Exemplo 6

Meios para crescimento bacteriano

Meios usados para crescimento de Rizóbia no protocolo de transformação mediado por Rizóbia empregado para desenvolver plantas transformadas foram preparados usando métodos padronizados conhecidos pelo versado na técnica. As formulações dos meios são como segue:

Meio TY

por L

Bactotriptona 5g/L

Extrato de levedura 3g/L

CaCl2.2H2O 0,87 g/L

pH 7,0.

Para meio TY sólido, adicionar 15 g/l de Bacto-Agar antes de autoclavar.

Meio MAG Líquido

(Para Rhizobium do centro de coleção da USDA)

HEPES 1,3 g/L

MES 1,1 g/L

Extrato de levedura 1 g/L

L-Arabinose 1 g/L

Gliconato de potássio 1 g/L

KH2PO4 0,22 g/L

Na2SO4 0,25 g/L pH 6,6 com KOH

Autoclavar e adicionar a seguinte solução estoque esterilizada por fil- tração:

NH4Cl (16 g/100 ml) 2 ml/l

FeCl3 (0,67g/100 ml, FS) 1,0 ml/l CaCI2 (1,5 g/100 ml) 1,0 ml/l

MgSO4 (18 g/100 ml) 1,0ml

NaMoO4. 2H2O (1 g/100 ml) 1,0 ml/l NiCI2. 6H20 (2.2 g/100 ml)0,1 ml/l

Para meio MAG sólido, adicionar 15 g/l de Bacto-Agar antes de autoclavar. Meio LB Por litro

Bacto-triptona 10 g

Extrato de bacto-levedura 5 g

NaCI 10 g

Ajustar pH para 7,5 com hidróxido de sódio.

Após autoclavar, distribuir em placa de cultura (25 ml/placa) Para meio LB sólido, adicionar 15 g/l de Bacto-Agar antes de autoclavar. Meio AB Mínimo: 20x Tampão AB:

K2HPO4 60 g/l

NaH2PO4 20 g/l

Autoclavar separadamente

20x Sais AB (Esterilizados por filtração, manter no escuro):

NH4CI 20 g/l

MgSO4.7H2O 6 g/l

KCI 3 g/l

CaCI2 0,2 g/l

FeSO4.7H2O 50 mg/l

pH para 7 antes de autoclavar

Combinar 50 ml de Tampão AB e 50 ml de Sais AB com 900 ml de sacaro- se-água (concentração final de sacarose em um litro é 0,5%).

Meio de Indução 1x AB-TY:

Glicose 5 g

20x tampão AB 50 ml

30 20X estoque de sal AB 50 ml

Meio TY 20 ml

Adicionar água estéril até 1000 ml Ajustar para pH 5,4 com MES 100 mM

Adicionar 100 μΜ de acetosiringona (1 M de estoque em DMSO; adicionar 1 μl estoque/10 ml de meio após suspender bactérias) Meio ATA para indução de vir Rhizobium:

O meio ATA (meio AB mínimo +TY +Arabinose) foi modificado a partir do meio AB-TY usando arabinose e gliconato de potássio para substi- tuir a glicose. A taxa de crescimento de todas as Rhizobia é quase dobrada nesse meio. As bactérias produziram muito menos polissacarídeo nesse meio e os péletes bacterianos foram muito mais espessos.

L-Arabinose 1 g/L

Gliconato de potássio 1 g/L

20x tampão AB 50 ml

20x estoque de sal AB 50 ml

Meio TY 20 ml

Adicionar água estéril até 1000 ml

pH 5,4 com MES IOOmM

Adicionar 200 μΜ de acetosiringona (1 M de estoque em DMSO) após ressuspender bactérias.

Exemplo 7

Vetores de transformação de cultura para uso com cepas modificadas de Rizóbia

Vetores de transformação de Rhizobium foram construídos u- sando técnicas moleculares padronizadas conhecidas por aqueles versados na técnica. Construtos de plasmídeo pMON96033 (FIG. 1; para transforma- ção de soja e canola), pMON96036 (FIG. 2; para transformação de milho), ou pMON101316 (FIG. 3; para transformação de algodão) foram emprega- dos. Todos os três construtos contem uma origem de replicação pVS1, e tanto GUS1 GFP1 quanto ambos os genes repórter. Plasmídeos recombinan- tes foram transferidos para várias cepas de Rizóbia modificada por eletropo- ração e confirmados por restrição da enzima de digestão de miniprep DNA.

O gene CP4 de FMV usado na construção dos plasmídeos tem um promotor do Vírus do Mosaico da Escrofulária (FMV) seguido pelo gene CP4syn, um gene sintético que codifica CP4 EPSP sintase. Vide Patente U.S. No. 5.633.435, que está incorporada por referência neste documento. A EPSP sintase, quando expressa, confere um grau substancial de resistência ao glifosato à célula de planta e plantas geradas a partir dela. O gene e35s GUS é um gene de β-glicuronidase, que é usado tipicamente como um mar- cador histoquímico, atrás do promotor e35S. O gene FMV GUS é o promotor FMV com GUS. O gene NOS NPTII tem um gene de neomicina fosfotransfe- rase, que confere resistência a canamicina, atrás do promotor para o gene de nopalina sintase (NOS). O gene Act 1 GFP tem um promotor de actina do arroz e o gene para a proteína verde fluorescente, que é um marcador rastreável. O gene e35s GFP é o gene para a proteína verde fluorescente atrás do promotor e35S. Culturas da noite anterior de uma cepa de Rizóbia contendo o plasmídeo usado foram cultivadas até a fase log e então diluídas até uma densidade óptica final de 0,3 a 0,6.

Exemplo 8

Transformação de soja mediada por Rizóbia

A transformação foi realizada usando um processo de organo- gênese, como descrito por Martinell et ai. (Patente U.S. 7.002.058), com modificações. pMON96033 contendo os genes GUS e CP4 foi transferido para várias cepas de Rizóbia modificadas (por exemplo, Rhizobium sp., Me- sorhizobium sp., Sinorhizobium sp.) por eletroporação. Colônias únicas fo- ram recuperadas em meio MAG ou TY com 50 mg/l de espectinomicina e 50 mg/l de canamicina e inoculadas em 20 a 50 ml de meio TY líquido com a mesma seleção em um agitador a 30eC a 200 rpm. A presença de plasmídeo na cultura de Rizóbia foi verificada pela restrição da enzima de digestão de mini-preparado de plasmídeo a partir de 10 ml de cultura. A cultura líquida remanescente foi misturada com glicerol até uma concentração final de 20%, aliquotada e armazenada a -809C como culturas de semente.

Para preparar o inóculo de Rizóbia, 0,25 a 1 ml de cultura de semente congelada foi inoculado em 250 ou 500 ml de meio TY com a mesma seleção de antibiótico acima e cultivado durante a noite a 28ÕC com agitação a 200 rpm até a fase de crescimento médio-log. A cultura foi centri- fugada e diretamente suspensa em um meio de inoculação (meio INO) na concentração de OD66o cerca de 0,3.

A cultura de Rizóbia induzida também foi usada na transformação de soja. Para induzir Rizóbia, a cultura da noite anterior foi ressuspensa em meio AB- TY em uma OD660 de cerca de 0,3 e acetosiringona foi adicionada até uma concentração final de 100 μΜ. A cultura foi posteriormente agitada durante a noite a 28°C, centrifugada e ressuspensa no meio de inoculação (meio INO) para uma concentração de OD660 cerca de 0,3.

O cultivar A3525 de soja (Patente U.S. 7.002.058) foi usado para transformação mediada por Rizóbia. O método foi modificado para transfor- mação mediada por Rizóbia como se segue. Sementes de soja foram germi- nadas em temperatura ambiente em meio BMG e explantes de meristema de sementes maduras de soja foram retirados por máquina (Pedido U.S. 20050005321). Explantes de meristema de soja em uma cobertura PLANT- CON foram misturados com a suspensão de Rizóbia em meio INO e sonica- dos em um W-113 Sonicator (Honda Electronics Co., Ltd, Aichi, Japan). A- pós a sonicação, os explantes foram co-cultivados na mesma PLANTCON por 1 a 11 dias a 23°C com período de iluminação claro-escuro de 16/8 ho- ras. Os explantes foram então transferidos para a superfície do meio de se- leção WPM contendo 75 μΜ de glifosato. Após 2 semanas, explantes foram transferidos novamente para meio sólido WPM com 75 μΜ de glifosato. Mu- das com três folhas completamente expandidas foram recuperadas após 6- 10 semanas após a inoculação e fixadas em meio BRM (opcionalmente com fungicida), contendo 0,1 mg/L de IAA e 25 μΜ de glifosato de seleção. As plântulas enraizadas foram transferidas para uma estufa até a maturação. Tabela 2: Componentes dos meios para transformação de soja.

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O vetor binário pMON96033 foi transferido par cepas de Rizóbia e co-cultivado com explantes de meristema de soja e resultados positives para GUS foram observados (Tabela 3 e FIG. 4). S. meliloti, S. fredii, M. Ioti e um R. Ieguminosarum mostraram liberação de T-DNA em explantes de soja, demonstrados pelos pequenos pontos azuis de atividade de GUS. Plantas transgênicas de soja foram obtidas a partir de experimentos de transformação mediada por Rizóbia com várias cepas (Tabela 4). A natureza transgênica dessas plantas de soja foi confirmada pelo ensaio do número de cópias de gene, onde a maioria dos transformantes revelou padrão de inte- gração simples de 1-2 cópias (Tabela 5).

Tabela 3: Expressão transitória de Gene gus com liberação de T-DNA

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* Ensaios transitórios foram realizados após um período de 4 dias de co- cultura. Tabela 4: Resumo da transformação de soja mediada por Rizóbia.

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Tabela 5: Ensaio de Número de Cópias de Plantas Transgênicas a partir de Transformação Mediada por Rizóbia*

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*0 número de cópias foi analisado pelo método INVADER (Third Wave Te- chnologies, Madison1 Wl) usando uma sonda nos e comparado com um con- trole interno de genoma.

Para testar se o transgene gus foi transmitido para a progênie de semente, sementes de duas linhagens de soja transgênica derivadas de transformação mediada por Rizóbia foram coradas em solução de GUS (FIG. 5). A linhagem GM_A9196D foi descoberta tendo uma cópia do gene nos ligado como testado pelo método INVADER. Doze sementes R1 dessa linhagem foram ensaiadas para GUS por coloração histoquímica após a em- bebimento e remoção da cobertura da semente e 9 foram positivas para GUS1 indicando uma taxa de segregação de 3:1 por uma cópia de inserto.

Exemplo 9

Transformação de canola mediada por Rizóbia

A. Preparação de inóculo de Rhizobium:

Cepas de Rizóbia com pMC)N96033 foram usadas para trans- formação de canola. As cepas de Rizóbia com o vetor de uma solução esto- que de glicerol foram inoculadas em 10 ml de meio TY com 50 mg/l de ca- namicina e 50 mg/l de espectinomicina em um tubo Falcon de 50 ml e agita- das a 28ςΟ durante a noite a 200 rpm. A cultura de Rizóbia da noite anterior foi peletizada por centrifugação e ressuspensa em meio líquido MG/L (caldo MG/L: Manitol 5 g/l, ácido L-glutâmico 1 g/l, KH2PO4 250 mg/l, NaCI 100 mg/l, MgS04.7H20 100 mg/l, biotina 1 pg/l, extrato de levedura 2,5 g/l, pH7.0). OD600 estava entre 0,05 a 0,1.

B. Preparação e co-cultivo de explante de canola:

A transformação de canola foi feita de acordo com a Patente U.S. 5.750,871 e Radke et ai, 1992. Cerca de 0,25g de semente de canola, cv. Ebony, foram transferidas para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml e ume- decidas com etanol 95%. Para esterilizar as sementes, 1 ml de solução de hipoclorito de sódio 1% foi adicionado por 30 min.. A solução de branquea- mento foi substituída por água destilada e as sementes foram enxaguadas várias vezes. As sementes foram dispersas sobre meio de germinação 1/10 MS e mantidas em uma incubadora Percival a 24°C com um período de lu- 15 minosidade de 16 horas.

Meio de Germinação de Semente (meio MS 1/10): Meio míni- mo orgânico 1/1OX MS (Gibco BRL; sacarose final 0,3%), piridoxina 50 pg/l, ácido nicotínico 50pg/l, glicina 200 pg/l, PHYTAGAR (Gibco Invitrogen) 6 g/l, pH 5.8; 20). Mudas estioladas de culturas de 7-14 dias de idade foram usa- 20 das como fonte de explante.

Explantes foram inoculados com 1 χ 108 bactérias/ml. Suspen- são de Rhizobium foi removida e os explantes inoculados foram colocados sobre placas de co-cultivo sobre filtro de papel e incubados por cerca de 2 dias a 24eC com luz contínua. Os explantes co-cultivados foram ensaiados 25 para a expressão de gus e encontrados conter manchas azuis indicando transformação de células de canola (FIG. 9).

Meio de Co-cultivo (MS-1): Sais MS (Caisson Laboratories, Lo- gan, UT), mio-inositol 100 mg/l, tiamina-HCI 1,3 mg/l, KH2PO4 200 mg/l, 2,4- D 1 mg/l, sacarose 3%, PHYTAGAR (Gibco Invitrogen) 7 g/l, pH 5,8. 30 C. Indução de Calo:

Explantes co-cultivados foram transferidos para meio de Indução de Calo (B5-1) por 6 dias a 249C com luminosidade contínua em -100 μΕ/ηΊ2/5. Cinco cepas de Μ. Ioti1 R. leguminosarum, S. fredii e S. meliloti mostraram transferência de gene eficiente em explantes de canola com fre- qüência de explantes positiva para pus variando entre 21% a 73% (FIG. 10).

Meio de Indução de Calo (B5-1): Sais B5 de Gamborg (Caisson Labs), vi- taminas B5 (ácido nicotínico 1 mg/l, piridoxina-HCI 1 mg/l, tiamina-HCI 10 mg/l), inositol 100 mg/l, 2,4-D, sacarose 3% 1 mg/l, carbenicilina (PhytoTe- chnology, Shawnee Mission, KS) ajustada para uma potência final de 325 mg/l, 50 mg/l Timentina, 7 g/l PHYTAGAR (Gibco Invitrogen), pH 5,8.

D. Regeneração e Seleção de Muda:

Explantes que possuíam calo foram transferidos para meio de Regeneração de Muda (B5BZ) com AgNO3 e incubados a 24DC em luminosidade contínua de 100 μΕ/η^/ε por 14 dias. Os explantes foram transferidos posteriormente para meio de Regeneração de Muda (B5BZ) sem AgNO3. Mudas regenera- das a partir de calos selecionados para glifosato foram colhidos aproxima- damente a cada duas semanas. Um exemplo de mudas precoces mostrando expressão de gus é mostrado na FIG. 11.

Meio de Regeneração de Muda com Nitrato de Prata (B5BZ + 3Ag):

Sais de B5 de Gamborg (Caisson Labs), vitaminas B5 (ácido nicotínico 1 mg/l, piridoxina-HCI 1 mg/l, tiamina-HCI 10 mg/l), inositol 100 mg/l, BAP 3 mg/l (Sigma), zeatina 1 mg/l (Sigma), AgNO3, 3 mg/l (Sigma), glifosato 45 mg/l (Monsanto, ácido seco 96,5%,), sacarose 1%, carbenicilina (PhytoTe- chnology) com potência ajustada para 325 mg/l, Timentina 50 mg/l, PHYTA- GAR (Gibco Invitrogen) 7 mg/l, pH 5,8.

Meio de Regeneração de Muda (B5BZ): Sais de B5 de Gam- borg (Caisson Labs), vitaminas B5 (ácido nicotínico 1 mg/l, piridoxina-HCI 1 mg/l, tiamina-HCI 10 mg/l), inositol 100 mg/l, BAP 3 mg/l (Sigma), zeatina 1 mg/l (Sigma), glifosato 45 mg/l, sacarose 1%, carbenicilina (PhytoTechno- logy) com potência ajustada para 325 mg/l, Timentina 50 mg/l, PHYTAGAR (Gibco Invitrogen) 7 mg/l, pH 5.8.

E. Colheita de Muda:

Mudas verdes de pelo menos 0,5 cm de comprimento foram a- paradas para isolar o eixo principal. As mudas aparadas foram colocadas sobre Meio de Colheita de Muda (B5-0). As mudas foram transferidas para meio de Enraizamento após 2 semanas.

Meio de Colheita de Muda (B5-0): Sais de B5 de Gamborg (Caisson Labs), vitaminas B5 (ácido nicotínico 1 mg/l, piridoxina-HCI 1 mg/l, tiamina-HCI 10 mg/l), inositol 100 mg/l, carbenicilina (PhytoTechnoIogy) com potência ajustada para 195 mg/l, sacarose 1%, PHYTAGAR (Gibco Invitro- gen) 6 g/l, pH 5,8.

F. Crescimento e Enraizamento de Muda:

Mudas verdes foram transferidas para meio de Enraizamento (B5-0 + 2IBA). Mudas permaneceram no meio de Enraizamento até que elas formassem raízes. Mudas foram mantidas a 24DC, 16 horas de luz/dia, -100 uE/m2/s.

Meio de Enraizamento (B5-0 + 2IBA): Sais de B5 de Gamborg (Caisson Labs), vitaminas B5 (ácido nicotínico 1 mg/l, piridoxina-HCI 1 mg/l, tiamina-HCI 10 mg/l), inositol 100 mg/l, IBA 2 mg/l (ácido indol-3-butírico, Sigma) cefotaxima 150 mg/l (PhytoTechnoIogy), sacarose 1%, PHYTAGAR (Gibco Invitrogen) 6 g/l, pH 5,8.

G. Detecção de transgene e freqüência de transformação:

O DNA genômico total foi extraído de plantas de canola cultiva- das em estufa, digerido com uma única BgIW para corte, e hibridizado com sonda CP4 marcada com DIG. Quatro linhagens foram confirmadas serem transgênicas (FIG. 11). A freqüência de transformação está resumida na Tabela 6.

Tabela 6: Freqüência de transformação de canola (TF) com cepas de Rhizobium

<table>table see original document page 48</column></row><table> Exemplo 10

Transformação de algodão mediada por Rizóbia através da embriogê- nese

A. Preparação de inóculo de Rizóbia:

pMON101316 foi eletroporado em cepas de Rizóbia, verificados por digestão de restrição de DNA mini-preparado e armazenado a -80DC. As cepas de Rizóbia com o vetor do estoque de glicerol foram inoculadas em 10 mL de meio TY com canamicina (50 mg/rnL) e espectinomicina (50 mg/mL) em um tubo Falcon de 50 mL e agitados a 28°C durante a noite a 200 rpm. A cultura de Rizóbia da noite foi peletizada por centrifugação, ressuspensa em 20 mL de meio líquido MSO e centrifugada novamente. O pelete foi ressu- penso em 20 mL de meio MS0, A Rizóbia lavada foi diluída em MSO para uma OD660 de cerca de 1,0 para inoculação.

B. Preparação do explante:

Transformação de algodão foi feita essencialmente de acordo com a Publi- cação U.S. 2004087030, Sete dias após as mudas terem germinado, mudas de algodão etioladas do cultivar Coker foram removidas de uma incubadora Percival escura. Os hipocótilos das PHYTATRAYs foram coletados e colo- cados em uma placa de Petri estéril contendo MSO para evitar que o tecido secasse. Os hipocótilos foram cortados em pequenos explantes.

C. Inoculação e co-cultivo:

Usando um fórceps estéril, os explantes foram transferidos para placas de Petri estéreis, e o inóculo de Rizóbia foi adicionado. Os explantes foram dei- xados em uma capela estéril por 20 minutos, com agitação para garantir bom contato de todos os explantes com o inóculo de Rizóbia. A solução do inóculo de Rizóbia foi então aspirada e os explantes foram gentilmente lim- pos com um papel de filtro estéril. Os pedaços de hipocótilo estéreis foram colocados sobre placas de cultura. O co-cultivo das placas dos explantes, cobertas com um saco plástico, foi realizado em uma incubadora Percival ajustada para cerca de 22 a 24DC, com um fotoperíodo de 10 horas na luz/ 14 horas no escuro por 2 dias. D. Transformação estável através da embriogênese:

Dois dias após a inoculação, pedaços de explantes de algodão foram marcados com X-gluc para testar para a expressão transitória de GUS (FIG. 12). Manchas azuis nos hipocótilos indicam a expressão do gene gus e a transformação das células de algodão. A fim de obter plantas transforma- das estaveus, os explantes de hipocótilo foram transferidos para uma placa contendo meio de seleção UMSEL1629, contendo o agente de seleção a- propriado. As placas foram então cobertas com PARAFILM e cultivadas a 28°C com um fotoperíodo 16/8 h (dia/noite).

Os calos estavelmente transformados foram confirmados por marcação com X-Gluc para expressão de gus após 4 semanas no meio de seleção (FIG. 13). Quatro semanas após a transferência inicial para o meio de seleção, todos os hipocótilos foram transferidos para meio UMSEL 1788, PARAFILMados e cultivados por 7 dias. A seguir os explantes foram trans- feridos de volta para UMSEL1629 por 4 semanas a 28°C com um fotoperío- do de 16/8 h (dia/noite).

Aproximadamente 4 semanas após a segunda transferência em UMSEL1629, dependendo da taxa de crescimento do calo, aglomerados de calos foram recuperados e foram transferidos para placas UMO. As placas individuais foram então marcadas, cobertas com PARAFILM, e cultivadas a 28°C no escuro contínuo.

Seis a oito semanas após o calo estar em UMO, os calos são subcultivados em meio UMO fresco, e cultivado a 28°C no escuro contínuo. Após 6 a 10 semanas em UMO, o calo embriogênico (EC) está pronto para ser colhido das linhagens de calo independentes em UMO e é transferido para meio TRP+. A cada 3 a 5 semanas, por aproximadamente 3 meses, tecido em crescimento ativo e pequenos embriões em placas TRP+ são transferidos para meio TRP+ fresco e cultivados a 28°C no escuro contínuo. Os embriões são transferidos para meio SHSU em placas de Petri e cober- tos com PARAFILM. As placas são cultivadas a 28°C em um Percival com um fotoperíodo de 16/8 h (dia/noite) com iluminação máxima (luz horizontal (shelf) e lateral). Os embriões podem ser subcultivados no mesmo meio mais tempo até a germinação. As plântulas recuperadas são cultivadas em Percival ou em uma sala úmida a 28°C com um fotoperíodo de 16/8 (di- a/noite).

E. Análise molecular da natureza transgênica de calos de al- godão derivados de transformação mediada por Rhizobium:

O DNA genômico foi extraído de tecidos de calo, digerido com uma única BamHl para corte, fracionado em gel de agarose a 1%, e transfe- rido para uma membrana Hybond™ (por exemplo, Appligen-Oncor, lllkirch, França; ou Amersham-Pharmacia Biotech). Uma sonda marcada com DIG foi usada para detectar a presença do transgene como um indicador de transformação. Seis linhagens de calos de algodão, derivadas da transfor- mação de S. meliloti, S. fredii e R. leguminosarum com o plasmídeo Ti auxi- liar, foram descobertas conter o gene gus (FIG. 14).

F. Meios para cultivo de algodão:

Receita para 1 L de UMSEL - 4,33 g de sais MS, 2 ml de vitaminas B5 500X, 0,1 ml de 2,4-D (1 mg/ml), 1 ml de cinetina (0,5 mg/ml), 30 g de glico- se, pH 5,8, 2,5 g de PHYTAGEL, 1,7 ml de carbenicilina (250 mg/ml), 1 ml de cefotaxima (100 mg/ml), mais agente de seleção: canamicina a 40 mg/L de concentração final. Carbenicilina, cefotaxima e agentes seletivos foram adicionados após a autoclavação.

Receita para 1 L de UMSEL1788: - 4,33 g de sais MS, 2 ml de vitaminas B5 500X, 0,1 ml de 2,4-D (1 mg/ml), 1 ml de cinetina (0,5 mg/ml), 30 g de gli- cose, pH 5,8, 2,5 g de PHYTAGEL, 1,7 ml de carbenicilina (250 mg/ml), 1 ml de cefotaxima (100 mg/ml), mais agente de seleção: canamicina a 40 mg/L de concentração final e 0,1 g de sacarose dissolvidos em 100 ml de água. Carbenicilina, cefotaxima e agentes seletivos foram adicionados após a au- toclavação.

Receita para 1 L de UMSEL1629: - 4,33 g de sais MS, 2 ml de vitaminas B5 500X, 0,1 ml de 2,4-D (1 mg/ml), 1 ml de cinetina (0,5 mg/ml), 30 g de gli- cose, pH 5,8, 2,5 g de PHYTAGEL, 1,7 ml de carbenicilina (250 mg/ml), 1 ml de cefotaxima (100 mg/ml), mais agente de seleção: canamicina a 40 mg/L de concentração final. Carbenicilina, cefotaxima e agentes seletivos foram adicionados após a autoclavação.

Receita para 1 L de UMO - 4,33 g de sais MS, 2 ml de vitaminas B5 500X, 30 g de glicose, pH 5,8, 2,5 g de GELRITE, 1,7 ml de carbenicilina (250 mg/ml), 1 ml de cefotaxima (100 mg/ml), 100 mg/l de ácido ascórbico, mais agente de seleção: canamicina a 50 mg/L de concentração final.

Receita para 1 L de TRP+ - 4,33 g de sais MS, 2 ml de vitaminas B5 500X, 1,9 g/l de KNO3, 30 g/l de glicose, 0,1 g/l de caseína hidrolisada, 3,5 g de GELRITE, pH 5,8.

Receita para 1 L de SHSU - 100 ml de Stewart & Hsu Majors (10x), 10 ml de Stewart & Hsu Minors (100x), 1,5 ml de ferro (100x), 10 ml de Stewart & Hsu Organics (100x), 5 g de glicose, 50 mg/l de benlato, 2,2 g de GELRITE, pH 6,8 (Stewart & Hsu, 1977).

Exemplo 11

Transformação de milho mediada por Rizóbia

A. Preparação de inóculo de Rhizobium e composição do mei-

o:

pMON96036 contendo cassetes de expressão de CP4, GUS e gfp foi usado para a transformação de milho. O vetor foi eletroporado em várias cepas de Rizóbia modificadas, verificado e armazenado a -80°C. Ri- zóbias contendo o vetor em um estoque de glicerol foram semeadas em meio TY sólido suplementado com antibióticos (canamicina a 40 mg/L e es- pectinomicina a 31 mg/L), e incubadas a 28°C por 2 dias.

Dois dias antes da inoculação de Rhizobia dos embriões imatu- ros de milho, uma alça de semeadura das células da placa de cultura de Ri- zóbia foi inoculada em 25 mL de meio TY líquido suplementado com 62 mg/L de espectinomicina e 40 mg/L de canamicina em um frasco de 250 mL. O frasco foi colocado em um agitador em aproximadamente 150 a 200 rpm e 27 a 28°C durante a noite. A cultura de Rizóbia foi então diluída (1 a 5) no mesmo meio líquido e colocada de volta no agitador. Várias horas depois, um dia antes da inoculação, as células de Rizóbia foram precipitadas por centrifugação a 3500 rpm por 15 min.. O pélete de células bacterianas foi ressuspenso em caldo de indução AB-TY ou ATA com 200 μΜ de acetosi- ringona de 50 mg/L de espectinomicina e 25 mg/L de canamicina e a densi- dade celular foi ajustada para 0,2 a OD66o, A cultura da célula bacteriana (50 mL em cada frasco de 250 mL) foi então colocada de volta no agitador e cul- tivada durante a noite. Na manhã do dia de inoculação, as células bacteria- nas precipitadas por centrifugação e lavadas com meio Vl MS 1/2 líquido (Publicação U.S. 20040244075) suplementado com 200 μΜ de acetosiringo- na. A cultura bacteriana foi centrifugada e o pélete de células foi ressuspen- so em meio PL MS 1/2 (Publicação U.S. 20040244075) com 200 μΜ de ace- tosiringona e a densidade celular foi ajustada para 1,0 a OD66o para inocula- ção. Os reagentes são disponíveis comercialmente e podem ser adquiridos de vários fornecedores (vide, por exemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis1 Mo.).

B. Isolamento de embrião de milho e co-cultivo de Rhizobium:

Para transformação mediada por Rizóbia, espigas contendo em- briões imaturos de milho (Zea mays) foram isolados e transformados por co- cultura bacteriana conforme descrito de foram geral por Cai et al. (Publica- ção de Pedido de Patente U.S. 20040244075), exceto que os embriões ima- turos foram isolados da espiga com a superfície esterilizada e colocados diretamente na suspensão de célula de Rizóbia preparada. Após a suspen- são celular de Rizóbia ter sido removida, os embriões imaturos foram trans- feridos para o meio de co-cultura (Publicação U.S. 20040244075).

Para investigar a expressão transitória de GFP, os embriões de milho co-cultivados foram colocados diretamente sob um microscópio com luz de fluorescência para observação de GFP. Alternativamente, 10 embri- ões escolhidos aleatoriamente após co-cultivo foram transferidos para dentro de um tubo Eppendorf de 1,5 ml e corados com solução de X-gluc durante a noite a 37°C para expressão transitória de gus. A FIG. 15 representa a ex- pressão transitória de GUS de embriões de milho imaturos transformados com cinco cepas de Rhizobium de R. ieguminosarum, M. loti, S. fredii e S. meliloti comparados à cepa de Agrobacterium tumefaciens ABI usando meio de indução ATA. Foi observado que o meio mínimo AB de rotina usado para culti- vo e indução de Agrobacterium não suporta o crescimento de Rizóbia. Inó- culos de Rizóbia não mostraram crescimento significativo em meio mínimo AB sem nenhuma seleção após uma semana de agitação com 220 rpm a 28°C. A inclusão de 20 ml de meio TY no meio mínimo AB melhora dramati- camente a taxa de crescimento de Rizóbia; enquanto que substituir a glicose no meio AB-TY por L-arabinose e gliconato de potássio no meio ATA diminui a produção de polissacarídeo, resultando em péletes maiores. A mudança da fonte de carbono no meio de indução, melhora significativamente a ex- pressão transitória de gus com cepas de Rizóbia em milho. C. Indução de calo e regeneração de plantas transgênicas:

Após o co-cultivo, a transformação foi continuada essencialmen- te conforme descrito na Publicação U.S. 20040244075, com modificações das condições de seleção conforme apropriado. Os embriões foram transfe- ridos para um meio MS modificado (Publicação U.S. 20040244075) suple- mentado com 250 mg/L de carbenicilina e 0,1 mM de glifosato. Calos esta- velmente transformados com expressão de gfp foram observados a partir das cepas M. loti, S. fredii e S. meliloti usadas no ensaio transitório neste estágio (FIG. 16). As freqüências de transformação representativas são mos- tradas na Tabela 7.

Tabela 7: freqüência de transformação de milho com diferentes cepas de Rizóbia.

<table>table see original document page 54</column></row><table> D. Análise molecular de plantas transgênicas derivadas de transformação mediada por Rizobia:

O DNA genômico total foi isolado de plantas de milho cultivadas em estufa e digerido com uma única SamHI de corte para estimar o número de cópias do transgene. Uma sonda de gus marcada com DIG foi usada para hibridizar com o DNA genômico. A natureza transgênica dos tecidos supostamente transformados foi confirmada para todas as linhagens exceto uma (FIG. 17).

E. Transmissão germinativa de transgenes nas plantas de mi- lho transgênicas:

As plantas de milho transgênicas em florescência sofreram autocruzamento ou cruzamento externo com a linhagem parental do genótipo de milho usado para a transformação (linhagem LH244). Sementes secas foram embebidas em água por 1 dia para coloração para gus ou 2 dias para contagem de gfp. A expressão e segregação de gus ou gfp nas sementes de R1 transgênicas foram confirmadas (Tabela 8).

Tabela 8: Expressão de transgene nas sementes de milho transgênico de R1

<table>table see original document page 55</column></row><table> <table>table see original document page 56</column></row><table> Exemplo 12

Transformação de cultivo mediado por Rizóbia através de sistema de transferência por conjugação

Um sistema de transferência por conjugação de plasmídeo de- pendente de oriT em Rhizobium e espécies relacionadas também pode ser usado para liberar um gene de interesse (GOI) em células de planta e sub- seqüentemente ser integrado ao genoma da planta. Um sistema de transfe- rência por conjugação homogêneo ou heterogêneo poderia ser usado para a transferência do gene. Plantas transgênicas poderiam então ser regenera- das com marcadores selecionáveis através de um sistema de cultura estabe- lecido. As cepas de Rizóbia podem incluir Sinorhizobium spp., Mesorhizobi- um loti, Rhizobium Ieguminosarum e Rhizobium sp. NGR234, entre outras.

REFERÊNCIAS

As referências a seguir, à medida que fornecem detalhes de procedimento exemplares ou outros detalhes suplementares àqueles descritos neste do- cumento, estão especificamente incorporadas por referência neste docu- mento.

Patente U.S. 4.761.373; Patente U.S. 4.810,648 Patente U.S. 5.094.945; Patente U.S. 5.106.739 Patente U.S. 5.141.870; Patente U.S. 5.229.114 Patente U.S. 5.276.268; Patente U.S. 5.322.938 Patente U.S. 5.359.142; Patente U.S. 5.362.865 Patente U.S. 5.378.824; Patente U.S. 5,424.412 Patente U.S. 5.512.466; Patente U.S. 5.530,196 Patente U.S. 5.561.236; Patente U.S. 5.563.055 Patente U.S. 5.605.011; Patente U.S. 5.608.149 Patente U.S. 5.633.435; Patente U.S. 5.633.437 Patente U.S. 5.641.876; Patente U.S. 5.646.024 Patente U.S. 5.689.041; Patente U.S. 5.750,871 Patente U.S. 5.767.366; Patente U.S. 5.837.848 Patente U.S. 5.859.347; Patente U.S. 5.869.720 Patente U.S. 5.981.834; Patente U.S. 5.985.605

Patente U.S. 5.013.659 Patente U.S. 5.107.065 Patente U.S. 5.273.894 Patente U.S. 5.352.605 Patente U.S. 5.378.619 Patente U.S. 5,463.175 Patente U.S. 5.543.576 Patente U.S. 5.591.616 Patente U.S. 5.627.061 Patente U.S. 5.637.489 Patente U.S. 5.659.122 Patente U.S. 5.750,876 Patente U.S. 5.850,019 Patente U.S. 5.958.745 Patente U.S. 5.998.700 Patente U.S. 6.011.199; Patente U.S. 6.040,497; Patente U.S. 6.051.753; Patente U.S. 6.072.103; Patente U.S. 6.080,560; Patente U.S. 6.140,075; Patente U.S. 6.140,078; Patente U.S. 6.166.292; Patente U.S. 6.171.640; Patente U.S. 6.175.060; Patente U.S. 6.177.611; Patente U.S. 6.225.105; Patente U.S. 6.228.623; Patente U.S. 6.232.526; Patente U.S. 6.252.138; Patente U.S. 6.271.443; Patente U.S. 6.294.714; Patente U.S. 6.380,462; Patente U.S. 6.380,466; Patente U.S. 6.384.301; Patente U.S. 6.414.222; Patente U.S. 6.426.446; Patente U.S. 6.426.447; Patente U.S. 6.429.357; Patente U.S. 6.429.362; Patente U.S. 6.433.252; Patente U.S. 6.437.217; Patente U.S. 6.444.876; Patente U.S. 6.459.018; Patente U.S. 6.476.295; Patente U.S. 6.483.008; Patente U.S. 6.489.461; Patente U.S. 6.495.739; Patente U.S. 6.506.559; Patente U.S. 6.531.648; Patente U.S. 6.537.750; Patente U.S. 6.538.178; Patente U.S. 6.538.179; Patente U.S. 6.538.181; Patente U.S. 6.541.259; Patente U.S. 6.576.818; Patente U.S. 6.589.767; Patente U.S. 6.596.538; Patente U.S. 6.635.806; Patente U.S. 6.613.963; Patente U.S. 6.653.530; Patente U.S. 6.660,849; Patente U.S. 6.706.950; Patente U.S. 6.723.837; Patente U.S. 6.770,465; Patente U.S. 6.774.283; Patente U.S. 6.812.379; Patente U.S. 6.822.141; Patente U.S. 6.828.475; Patente U.S. 7.002.058; Patente U.S. 7.132.528; Patente U.S. 7.151.204; Patente U.S. RE37.543

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<110> YE, XUDONG

SHEN, JUNJIANG WILLIAMS, EDWARD

<12 0> USO DE ESPÉCIES BACTERIANAS NÃO-AGROBACTERIUM PAKA TRANSFORMA- ÇÃO DE PIjANTA

<130> MONS:IOOUS

<140> DESCONHECIDO <141> 2007-05-16

<150> 60/800,872 <151> 2006-05-16

<160> 30

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 1

gagagtttga tcctggctca g 21

<210> 2 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 2

aaggaggtga tccagccgca g 21

<210> 3 <211> 30 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 3 acaataatgt gtgttgttaa gtcttgttgc

<210> 4 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 4

ctcaaaccta cactcaatat ttggtgag

<210> 5 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético <400> 5

agatctggct cgcggcggac gcac

<210> 6 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético <400> 6

cgctcgcgtc attctttgct ggag

<210> 7 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 7

tcagcaggat gacgccgtta tcg

<210> 8 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético <400> 8

tctcgcccga ccaataccaa cac

<210> 9 <211> 31 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético <400> 9

gctgacgggc ccggatgaat gtcagctact g

<210> 10 <211> 42 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 10

gctctagaaa ttgtaagcgt taataattca gaagaactcg tc

<210> 11 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 11

caattgcatt tggctcttaa ttatctgg

<210> 12 <211> 26 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 12

gcatgcccga tcgcgctcaa gtaatc <210> 13 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético <400> 13

tctaggtccc cccgcgccca tcg

<210> 14 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético <400> 14

ccatggatct ttctggcaat gagaaatc

<210> 15 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 15

gtcaaaagct gttgacgctt tggctacg

<210> 16 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 16

acgggagagg cggtgttagt tgc

<210> 17 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético <400> 17

cgatagcgac aatgccgaga acg

23

<210> 18 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 18

atgcccgatc gagctcaagt tatc 24

<210> 19 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<210> 20 <211> 27 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 20

ccatggatcc gaaggccgaa ggcaatg 27

<210> 21 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 19

tgaaaggaca cctctccgtt gctg

24

<400> 21

ctacagactg tttacggttg ggc

23

<210> 22 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 22

gtgagcaaag ccgctgccat ate 23

<210> 23 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: iniciador sintético

<400> 23

tagagcgtct gcttggttaa acc 23

<210> 24 <211> 1490 <212> DNA

<213> A. tumefaciens

<400> 24

tagaaaggag gtgatccagc cgcaggttcc cctacggcta ccttgttacg acttcacccc 60 agtcgctgac cctaccgtgg ttagctgcct ccttgcggtt agcgcactac cttcgggtaa 120

aaccaactcc catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcag 180

catgctgatc tgcgattact agcgattcca acttcatgca ctcgagttgc agagtgcaat 240

ccgaactgag atggcttttg gagattagct cgacatcgct gtctcgctgc ccactgtcac 300

caccattgta gcacgtgtgt agcccagccc gtaagggcca tgaggacttg acgtcatccc 360

caccttcctc tcggcttatc accggcagtc cccttagagt gcccaactaa atgctggcaa 420

ctaagggcga gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 480

cgacagccat gcagcacctg ttctggggcc agcctaactg aaggacatcg tctccaatgc 540

ccataccccg aatgtcaaga gctggtaagg ttctgcgcgt tgcttcgaat taaaccacat 600

gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt tttaatcttg cgaccgtact 660

ccccaggcgg aatgtttaat gcgttagctg cgccaccgaa cagtatactg cccgacggct 720

aacattcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct 780

ttcgcacctc agcgtcagta atggaccagt aagccgcctt cgccactggt gttcctccga 840

atatctacga atttcacctc tacactcgga attccactta cctcttccat actcaagata 900 cccagtatca aaggcagttc 960

cgcctacgtg cgctttacgc 1020

cggctgctgg cacgaagtta 1080

gtgaaagagc tttacaaccc 1140

tgcgcccatt gtccaatatt 1200

gtcccaatgt ggctgatcat 1260

taccccacca actagctaat 1320

tagggcgtat gcggtattaa 1380

cccacgcgtt actcacccgt 1440

agcctgccgc cagcgttcgt 1490

cgcagttgag ctgcgggatt ccagtaattc cgaacaacgc gccggggctt cttctccgac taaggccttc atcactcacg ccccactgct gcctcccgta cctctcagac cagçtatgga ccaacgcggg ctcatccatc ttccagtttc ccagagctat ctgccactcc ccttgcgggg tctgagccag gatcaaactc

tcacccctga cttaaatatc tagccccctt cgtattaccg taccgtcatt atcttcatcg cggcatggct ggatcaggct ggagtttggg ccgtgtctca tcgtcgcctt ggtaggcctt cccgataaat ctttcccccg tccgcagaga tgggtagatt cgttcgactt gcatgtgtta tcaagttgag

<210> 25 <211> 1366 <212> DNA

<213> Rhizobium leguminosarum

<400> 25

cttcgcccag tcgctgaccc kascgkggtt tcgggtaaaa ccaactccca tggtgtgacg 120

caccgcggca tgctgatccg cgattactag 180

agtgcaatcc gaactgarat ggcttttgga 240

actgtcacca ccattgtagc acgtgtgtag 300

gtcatcmcca ccttcctctc ggcttatcac 360

gctggcaact aagggcgagg gttgcgctcg 420

cgagctgacg acagccatgc agcacctgtg 480

tgcaagtagc cgggcatgtc aagggctggt 540

acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 600

tactccccag gcggaatgtt taatgcgtta 660

ggctaacatt catcgtttac ggcgtggact 720

cgctttcgca cctcagcgtc agtaatggac 780

ccgaatatct acgaatttca cctctacact 840

gatcgacagt atcaaaggca gttccagggt 900

gatccgccta cgtgcgcttt acgcccagta 960

agctgsctcc kkgcggttag cgcactacct 60 ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt

cgattccaac ttcatgcact cgagttgcag

gattagctca cactcgcgtg ctcgctgccc

cccagcccgt aagggccatg aggacttgac

cggcagtccc cttagagtgc ccaactgaat

ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca

tcccggtccc cgaagggaac cttgcatctc

aaggttctgc gcgttgcttc gaattaaacc

caattccttt gagttttaat cttgcgaccg

gctgcgccac cgaacagtat actgcccgac

accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca

cagtgagccg ccttcgccac tggtgttcct

cggaattcca ctcacctctt ccatactcca

tgagccctgg gatttcaccc ctgactgatc

attccgaaca acgctagccc ccttcgtatt accgcggctg ctggcacgaa 1020

tccggtgaaa gagctttaca 1080

ggcttgcgcc cattgtccaa 1140

ctcagtccca atgtggctga 1200

cctttacccc accaactagc 1260

cccgaaggac acatacggta 1320

gattcccacg cgttactcac 1366

gttagccggg gcttcttctc accctagggc cttcatcact tattccccac tgctgcctcc tcatcctctc agaccagcta taatccaacg cgggctcatc ttagcacaag tttccctgcg ccgtctgccg ctccccttgc

cggataccgt cattatcttc cacgcggcat ggctggatca cgtaggagtt tgggccgtgt tggatcgtcg ccttggtagg cttgaccgat aaatctttct ttattccgta gtcaagggta ggggcg

<210> 26 <211> 1323 <212> DNA

<213> Rhizobium Ieguminosarum <400> 26

agcgcactac ctctcgggta aaaccaactc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat 120

actcgagttg cagagtgcaa tccgaactga 180

gtgctcgctg cccactgtca ccaccattgt 240

atgaggactt gacgtcawca ccaccttcct 300

tgcccaactg aatgctggca actaagggcg 360

acatctcacg acacgagctg acgacagcca 420

accttgcatc tctgcaagta gcgggcatgt 480

cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg 540

cttgcgaccg tactccccag gcggaatgtt 600

actgcccgac ggctaacatt catcgtttac 660

ttgctcccca cgctttcgca cctcagcgtc 720

tggtgttcct ccgaatatct acgaatttca 780

ccatactcca gatcgacagt atcaaaggca 840

ctgactgatc gatccgccta cgtgcgcttt 900

ccttcgtatt accgcggctg ctggcacgaa 960

cattatcttc tccggtgaaa gagctttaca 1020

ggctkgatca ggcttgcgcc cattgtccaa 1080

tgggccgtgt ctcagtccca atgtggctga 1140

ccatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc 60 ccgcgattac tagcgattcc aacttcatgc

gatggctttt ggagattagc tcacactcgc

agcacgtgtg tagcccagcc cgtaagggcc

ctcggcttat caccggcagt ccccttagag

agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca

tgcagcacct gtgtcccggt ccccgaaggg

caagggctgg taaggttctg cgcgttgctt

cgggcccccg tcaattcctt gagttttaat

taatgcgtta gctgcgccac cgaacagtat

ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt

agtaatggac cagtgagccg ccttcgccac

cctctacact cggaattcca ctcacctctt

gttccagggt tgagccctgg gatttcaccc

acgcccagta attccgaaca acgctagccc

gttagccggg gcttcttctc cggataccgt

àccctagggc cttcatcact cacgcggcat

tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtt

tcatcctctc agaccagcta tggatcgtcg ccttggtagg cctttacccc accaactagc taatccaacg cgggctcatc cttgaccgat 1200

aaatctttct cccgaaggac acatacggta ttagcacaag tttccctgcg ttattccgta 1260

gtcaagggta gattcccacg cgttactcac ccgtctgccg cttccccttg cggggcgcat

1320

acg

1323

<210> 27 <211> 1341 <212> DNA

<213> Rhizobium leguminosarum <400> 27

ggttagctgc ctccttgcgg ttagcgcact accttcgggt aaaaccaact cccatggtgt 60 gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta 120

cgaccgattc caacttctag cactcgagtt gcagagtgca atccgaactg agatggcttt 180

tggagattag ctcacactcg cgtgctcgct gcccactgtc accaccattg tagcacgtgt 240

gtagcccagc ccgtaagggc catgaggact tgacgtcatc cccaccttcc tctcggctta 300

tcaccggcag tccccttaga gtgcccaact gaatgctggc aactaagggc gagggttgcg 360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc 420

tgtgtcccgg tccccgaagg gaaccttgca tctctgcaag tagccgggca tgtcaagggc 480

tggtaaggtt ctgcgcgttg cttcraatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc ctttgagttt taatcttgcg accgtactcc ccaggcggaa tgtttaatgc 600

gttagctgcg ccaccgaaca gtatactgcc cgacggctaa cattcatcgt ttacggcgtg 660

gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgcacctcag cgtcagtaat 720

ggaccagtga gccgccttcg ccactggtgt tcctccgaat atctacgaat ttcacctcta 780

cactcggaat tccactcacc tcttccatac tccagatcga cagtatcaaa ggcagttcca 840

gggttgagcc ctgggatttc acccctgact gatcgatccg cctacgtgcg ctttacgccc 900

agtaattccg aacaacgcta gcccccttcg tattaccgcg gctgctggca cgaagttagc 960

cggggcttct tctccggata ccgtcattat cttctccggt gaaagagctt tacaacccta 1020

gggccttcat cactcacgcg gcatggctgg atcaggcttg cgcccattgt ccaatattcc 1080

ccactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc gtgtctcagt cccaatgtgg ctgatcatcc 1140

tctcagacca gctatggatc gtcgccttgg taggccttta ccccaccaac tagctaatcc 1200

aacgcgggcc gatcctttac cgataaatct ttcccccgaa gggcacatac ggtattagca 1260

caagtttccc tgcgttattc cgtagtaaag ggtacgttcc cacgcgttac tcacccgtct 1320 gccgctcccc ttgcgtggcg c 1341

<210> 28 <211> 1341 <212> DNA

<213> Mesorhizobium Ioti <400> 28

ccttgcggtt agcacagcgc cttcgggtaa aaccaactcc catggtgtga cgggcggtgt 60 gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattcca 120

acttcatgca ctcgagttgc agagtgcaat ccgaactgag atggcttttg gagattagct 180

cgacctcgcg gtctcgctgc ccactgtcac caccattgta gcacgtgtgt agcccagccc 240

gtaagggcca tgaggacttg acgtcatccc caccttcctc tcggcttatc accggcagtc 300

cccttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagggcga gggttgcgct cgttgcggga 360

cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat gcagcacctg tcaccggtcc 420

agccgaactg aaggtatcca tctctggaaa ccgcgaccgg gatgtcaagg gctggtaagg 480

ttctgcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat 540

tcctttgagt tttaatcttg cgaccgtact ccccaggcgg gaagcttaat gcgttagctg 600

cgccaccgac aagtaaactt gccaacggct agcttccatc gtttacggcg tggactacca 660

gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctc agcgtcagta ccggaccagt 720

gagccgcctt cgccactggt gttcctccga atatctacga atttcacctc tacactcgga 780

attccactca cctcttccgg actcgagata cccagtatca aaggcagttc cggggttgag 840

ccccgggatt tcacccctga cttaagtatc cgcctacgtg cgctttacgc ccagtaattc 900

cgaacaacgc tagccccctt cgtattaccg cggctgctgg cacgaagtta gccggggctt 960

cttctacggt taccgtcatt atcttcaccg ttgaaagagc tttacaaccc tagggccttc 1020

atcactcacg cggcatggct ggatcaggct tgcgcccatt gtccaatatt ccccactgct 1080

gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggctgatcat cctctcagac 1140

cagctatgga tcgtcgcctt ggtaggccat taccccacca actagctaat ccaacgcggg 1200

ctcatccatc tccgataaat ctttctccaa aaggacgtat acggtattag ctccagtttc 1260

ccggagttgt tccgtagaga tgggtagatt cccacgcgtt actcacccgt ctgccgctcc 1320

ccttgcgggg cacgcgccct t 1341

<210> 29 <211> 1339 <212> DNA <213> S. Fredii <400> 29

agccttgcgg ttagcgcact accttcgggt agaaccaact cccatggtgt gacgggcggt 60 gtgtamaagg cccgggaacg tattcaccgc agcatgctga tctgcgatta ctagcgattc 120

caacttcatg cactcgagtt gcagagtgca atccgaactg agatggcttt tggagattag 180

ctcgacctcg cggtctcgct gcccactgtc accaccattg tascacgtgt gtagcccagc 240

ccgtaagggc catgaggact tgacgtcatc cccaccttcc tctcggctta tcaccggcag 300

tccccttaga gtgaccaact aaatgctggc aactaagggc gagggttgcg ctcgttgcgg 360

gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtctccgat 420

ccagccgaac tgaaggatac gatctctcgt atccgcgatc gggatgtcaa gggctggtaa 480

ggttctgcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540

attcctttga gttttaatct tgcgaccgta ctccccaggc ggaatgttta atgcgttagc 600

tgcgccaccg aacagtaaac tgcccgacgg ctaacattca tcgtttacgg cgtggactac 660

cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc tcagcgtcag taccggacca 720

gtgagccgcc ttcgccactg gtgttcctcc gaatatctac gaatttcacc tctacactcg 780

gaattccact cacctcttcc ggactctaga cacccagtat caaaggcagt tccggggttg 840

agccccggga tttcacccct gacttaaatg tccgcctacg tgcgctttac gcccagtaat 900

tccgaacaac gctagccccc ttcgtattac cgcggctgct ggcacgaagt tagccggggc 960

ttcttctccg gttaccgtca ttatcttcac cggtgaaaga gctttacaac cctagggcct 1020

tcatcactca cgcggcatgg ctggatcagg cttgcgccca ttgtccaata ttccccactg 1080

ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct cagtcccaat gtggctgatc atcctctcag 1140

accagctatg gatcgtcgcc ttggtaggcc tttaccccac caactagcta atccaacgcg 1200

ggctcatcct ttcccgataa atctttcccc cgaagggctc atacggtatt agcacaagtt 1260

tccctgcgtt attccgtaga aaagggtaga ttcccacgcg ttactcaccm atctgccgcy 1320

cccccgcrgc gcgctcccc 1339

<210> 30 <211> 1368 <212> DNA

<213> Bradyrhizobium sp. <400> 30

gaaggtaccg tggccggctg cctacctagc gggttagcgc accgtcttca ggtaaaacca 60 actcccatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgtggcgtgc 120 tgatccacga ttactagcga ttccaacttc 180

ctgagacggc tttttgagat ttgcgaaggg 240

ttgtagcacg tgtgtagccc agcccgtaag 300

tcctcgcggc ttatcaccgg cagtctcctt 360

gacgggggtt gcgctcgttg cgggacttaa 420

gcatgcagca cctgtgctcc aggctccgaa 480

gacatgtcaa gggctggtaa ggttctgcgc 540

gcttgtgcgg gcccccgtca attccttgag 600

gaatgcttaa agcgttagct gcgccactag 660

cgtttacggc gtggactacc agggtatcta 720

cagcgtcagt atcgggccag tgagccgcct 780

aatttcacct ctacactcgc agttccactc 840

aaaggcagtt ctggagttga gctccaggat 900

accctttacg cccagtgatt ccgagcaacg 960

gcacgaagtt agccggggct tattcttgcg 1020

ctttacaacc ctagggcctt catcactcac 1080

tgtccaatat tccccactgc tgcctcccgt 1140

tggctgatca tcctctcaga ccagctactg 1200

aactagctaa tcagacgcgg gccgatcttt 1260

tccggtatta gcacaagttt ccctgtgttg 1320

tactcacccg tctgccgctg acgtatgctw 1368

atgggctcga gttgcagagc ccaatccgaa tcgcccctta gcatcccatt gtcaccgcca ggccatgagg acttgacgtc atccccacct agagtgctca actaaatggt agcaactaag cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gagaaggtca catctctgcg accggtcctg gttgcgtcga attaaaccac atgctccacc ttttaatctt gcgaccgtac tccccaggcg tgagtaaacc cactaacggc tggcattcat atcctgtttg ctccccacgc tttcgtgcct tcgccactgg tgttcttgcg aatatctacg acctctcccg aactcaagat cctcagtatc ttcacccctg acttaaagac ccgcctacgc ctagccccct tcgtattacc gcggctgctg gtaccgtcat tatcttcccg cacaaaagag gcggcatggc tggatcaggg ttgcccccat aggagtttgg gccgtgtctc agtcccaatg atcgtcgcct tggtgagcca ttacctcacc cggcgataaa tctttccccg taagggctta ttccgaacca aaaggtacgt tcccacgcgt cgcccgckcg ccckccct

Claims (40)

1. Método para transformar uma célula de planta, que compre- ende: (a) colocar pelo menos uma primeira célula de planta em contato com uma bactéria com exceção de Agrobacterium sp. compreendendo: (i) um primeiro ácido nucleico que compreende uma região do gene vir de um plasmídeo Ti em que a região do gene vir age para introduzir um ácido nu- cleico de interesse na célula de planta de uma forma dependente de VirD2 e (ii) um segundo ácido nucleico que compreende uma ou mais sequência(s) de borda de T-DNA operativamente ligada(s) a um ácido nucleico de interes- se; e (b) selecionar pelo menos uma primeira célula de planta trans- formada com o ácido nucleico de interesse, em que a célula de planta é uma célula de planta de soja, canola, milho ou algodão.

2. Método para transformar uma célula de planta, que compre- ende: (a) colocar pelo menos uma primeira célula de planta em contato com uma bactéria com exceção de Agrobacterium compreendendo: (i) um primeiro ácido nucleico necessário para a transferência conjugativa de se- qüências de DNA independente da função de VirD2, e (ii) um segundo ácido nucleico que compreende um ácido nucleico de interesse; em que a célula de planta é uma célula de planta de soja, canola, milho ou algodão e em que os polipeptídeos codificados pelo ácido nucleico necessário para a transfe- rência conjugativa agem para transferir o ácido nucleico de interesse para dentro da célula de planta; e (b) selecionar pelo menos uma primeira célula de planta trans- formada com o ácido nucleico de interesse.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a transfe- rência conjugativa é dependente de traA, trai, ou mobA.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o dito pri- meiro ácido nucleico compreende oriT.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o primeiro ácido nucleico não tem as seqüências da borda direita e/ou esquerda de T- DNA.

6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a bactéria é uma célula de Rizóbia.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a célula de Rizóbia é cultivada na presença de acetosiringona ou outro composto que induz a função do gene vir antes de entrar em contato com a célula de plan- ta.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a célula de Rizóbia é selecionada a partir do grupo que consiste em: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp. Oehrobae- trum spp. e Bradyrhizobium spp.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a célula de Rizóbia é Rhizobium leguminosarum.

10, Método da reivindicação 9, em que a célula de Rizóbia é R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. phaseoli ou Rhizobium le- guminosarum. bv. viciae.

11. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a cé- lula de planta está compreendida em um explante de uma semente de plan- ta, muda, calo, suspensão celular, cotiledônia, meristema, folha, raiz, ou cau- le; e o explante é colocado em contato com a bactéria.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o explan- te compreende um meristema embrionário; calo, suspensão celular; cotile- dônia; ou tecido de folhas, raízes ou caules.

13. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o ácido nucleico necessário para a transferência conjugativa independente da fun- ção de VirD2 é introduzido na bactéria por eletroporação.

14. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o primeiro e segundo ácidos nucleicos são introduzidos na bactéria por eletro- poração.

15. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a se- leção de uma célula de planta transformada com o ácido nucleico de interes- se é realizada na ausência de um agente de seleção.

16. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a se- leção de uma célula de planta transformada com o ácido nucleico de interes- se compreende cultivar a célula de planta na presença de um agente de se- leção, em que o ácido nucleico de interesse confere tolerância ao agente de seleção ou é operativamente ligado a um ácido nucleico adicional que confe- re tolerância ao agente de seleção.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o agente de seleção é glifosato, canamicina, bialafos ou dicamba.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o ácido nucleico de interesse ou ácido adicional codifica EPSP sintase.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a proteí- na EPSP sintase é CP4.

20. Método da reivindicação 16, em que o agente de seleção é glifosato.

21. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o áci- do nucleico de interesse não está ligado fisicamente a um gene marcador selecionável.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o gene marcador e o ácido nucleico de interesse segregam geneticamente na pro- gênie de uma planta regenerada a partir da célula de planta transformada com o ácido nucleico de interesse.

23. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a bactéria compreende pelo menos um terceiro ácido nucleico que compreen- de um ácido nucleico adicional de interesse e em que a célula de planta é transformada com o terceiro ácido nucleico.

24. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, compreen- dendo adicionalmente regenerar uma planta a partir da célula de planta, em que a planta compreende o ácido nucleico de interesse.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que regenerar uma planta a partir da célula de planta compreende induzir a formação de um ou mais brotos a partir de um explante que compreende a célula de plan- ta e cultivar pelo menos um primeiro broto em uma planta fértil completa.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a regene- ração ocorre por organogênese.

27. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma planta de milho, uma planta de algodão, uma planta de soja, e uma planta de canola.

28. Célula de Rizóbia selecionada a partir do grupo que consiste em: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacteri- um spp. Ochrobactrum spp. e Bradyrhizobium spp., a célula compreendendo (i) um primeiro ácido nucleico que compreende uma região do gene viróe um plasmídeo Ti em que a região do gene vir age para introduzir um ácido nucleico que codifica uma seqüência de interesse em uma célula de planta de uma maneira dependente de VirD2; e (ii) um segundo ácido nucleico que compreende uma ou mais sequência(s) de borda de T-DNA operativamente ligada(s) a um ácido nucleico que codifica uma seqüência de interesse.

29. Célula de Rizóbia de acordo com a reivindicação 28, ainda definida como compreendendo um marcador selecionável.

30. Célula de Rizóbia de acordo reivindicação 28, em que a cé- lula de Rizóbia é selecionada a partir do grupo que consiste em: Rhizobium sp., Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium Ieguminosarum Madison, R. Iegumi- nosarum USDA2370, R. Ieguminosarum bv. trifolii USDA2408, R. Iegumino- sarum bv. phaseoii USDA2668, R. Ieguminosarum 2370G, R. Ieguminosa- rum 2370LBA, R. Ieguminosarum 2048G, R. Ieguminosarum 2048LBA, R. leguminosarum bv. phaseoii, R. Ieguminosarum bv. phaseoii 2668G, R. Ie- guminosarum bv. phaseoii 2668LBA, R. Ieguminosarum RL542C, R. Iegumi- nosarum bv. viciae, R. Ieguminosarum bv. trifolii, Rhizobium etli USDA 9032, R. etli bv. phaseoii, Rhizobium tropici, Mesorhizobium sp., Mesorhizobium Ioti ML542G, M. Ioti ML4404, Sinorhizobium sp., Sinorhizobium meIiloti SD630, S. meIiloti USDA1002, Sinorhizobium fredii USDA205, S. fredii SF542G, S. fredii SF4404, S. fredii SM542C, Bradyrhizobium sp., Bradyrhizobium japoni- cum USDA 6, e B. japonicum USDA 110.

31. Célula de Rizóbia de acordo com a reivindicação 30, em que a célula é uma célula de Rhizobium leguminosarum.

32. Célula de Rizóbia de acordo com a reivindicação 31, em que a célula é uma célula de R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. phaseoli ou Rhizobium leguminosarum. bv. viciae.

33. Construto de DNA competente para a transferência indepen- dente de virD2 a partir de Rizóbia e que não tem seqüência de borda de T- DNA, o construto compreendendo uma seqüência de oriT operativa mente ligada a um ácido nucleico de interesse.

34. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 33, ainda compreendendo uma seqüência de traA ou mob.

35. Célula de Rizóbia transformada com o Construto de DNAde acordo com a reivindicação 33, em que a Rizóbia é selecionada a partir do grupo que consiste em: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp. Ochrobactrum spp. e Bradyrhizobium spp.

36. Célula de Rizóbia de acordo com a reivindicação 35, em que a célula de Rizóbia é selecionada a partir do grupo que consiste em: Rhizo- bium sp., Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium leguminosarum Madison, R. leguminosarum USDA2370, R. leguminosarum bv. trifolii USDA2408, R. le- guminosarum bv. phaseoli USDA2668, R. leguminosarum 2370G, R. legu- minosarum 2370LBA, R. leguminosarum 2048G, R. leguminosarum -2048LBA, R. leguminosarum bv. phaseoli, R. leguminosarum bv. phaseoli -2668G, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668LBA, R. leguminosarum RL542C, R. leguminosarum bv. viciae, R. leguminosarum bv. trifolii, Rhizobi- um etli USDA 9032, R. etli bv. phaseoli, Rhizobium tropici, Mesorhizobium sp., Mesorhizobium loti ML542G, M. loti ML4404, Sinorhizobium sp., Sinorhi- zobium meliloti SD630, S. meliloti USDA1002, Sinorhizobiumfredii US- DA205, S. fredii SF542G, S. fredii SF4404, S. fredii SM542C, Bradyrhizobium sp., Bradyrhizobium japonicum USDA 6, e B. japonicum USDA 110.37. Célu- la de Rizóbia de acordo com a reivindicação 36, em que a célula é uma célu- la de Rhizobium leguminosarum.

37 [Claim missing on original document]

38. Célula de Rizóbia de acordo com a reivindicação 36, em que a célula é uma célula de R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. phaseoli ou Rhizobium leguminosarum. bv. viciae.

39. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ainda com- preendendo cultivar a bactéria com exceção de Agrobacterium sp. sob con- dições para minimizar a produção de polissacarídeo durante o cultivo em meio de indução.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a(s) fon- te(s) de carbono usada(s) para minimizar a produção de polissacarídeo du- rante o cultivo em meio de indução é glicose em meio AB-TY, ou L-arabinose e gliconato de potássio em meio ATA.