ES2434742T3 - Genes y procedimientos para aumentar la resistencia a enfermedades en plantas - Google Patents

Abstract

Una construcción que comprende (i) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 y (ii) un promotorque funciona en plantas, en las que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente al promotor de modo queeste último expresa una secuencia polipeptídica expuesta en la SEC ID Nº: 14.

Description

Genes y procedimientos para aumentar la resistencia a enfermedades en plantas

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y de la regulación del sistema de defensa natural de las plantas mediante la introducción de genes extraños/naturales en las células vegetales, preferiblemente en sus genomas. De forma más específica, el procedimiento se refiere a aumentar la resistencia a enfermedades de los cítricos mediante la sobreexpresión de los genes implicados en el sistema de defensa innato de las plantas.

Introducción

En la naturaleza, plantas y animales están en permanente contacto con un conjunto muy diverso de microorganismos, aunque raras veces esta asociación da como resultado enfermedades. Esto es debido principalmente a la existencia de sistemas de defensa que, en el caso de las plantas, carecen de la respuesta inmune adaptativa común en el reino animal.

La capacidad de una planta de reconocer un patógeno y de activar una defensa eficaz está controlada a menudo por la interacción (directa o indirecta) entre los productos de un gen de resistencia de la planta y un gen de avirulencia del patógeno. Dangl y Jones, 2001, Nature 411, 826-33. Como consecuencia de esta interacción gen a gen, el tejido recientemente infectado puede presentar flujos de iones, la producción de especies reactivas de oxígeno, ácido salicílico (SA), óxido nítrico, y un aumento en la expresión de los genes asociados a la defensa, incluyendo aquellos que codifican las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR). Durrant y Dong, 2004, Annu. Rev. Phytopathol. 2004. 42: 185-209. Además, las células que rodean el(los) sitio(s) de entrada del patógeno experimentan normalmente la muerte celular de tipo apoptótico, formando por tanto las características lesiones necróticas de la respuesta hipersensible (HR). Heath, 2000, Plant Molecular Biology 44: 321-34.

Hasta la flecha, se han clonado algunos genes de resistencia de plantas (genes R) y, basándose en la estructura de las proteínas que codifican, los genes se han dividido en diversos grupos (Hammond-Kosack y Jones, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 48, 575-607). La mayoría de los genes R codifican proteínas NB-LRR citoplásmicas, que contienen un sitio de unión a nucleótido (NB) y repeticiones ricas en leucina (LRR). Este grupo consiste en genes que codifican proteínas CC-NB-LRR, que contiene un dominio de superhélice y genes que codifican proteínas que tienen un dominio similar a los receptores Toll y de la interleucina (IL) de mamíferos, las denominadas proteínas TIR-NB-LRR (Hammond-Kosack y Jones, 1997, más arriba).

El uso de dichos genes de resistencia específica en programas de reproducción para una resistencia duradera es problemático debido a que los patógenos evitan fácilmente el reconocimiento mediante mutaciones en sus factores de avirulencia, evitando de este modo la inducción de la defensa activa (Westerink y col., 2004, Mol. Microbiol. 54, 533-545). La similitud entre las proteínas de resistencia (proteínas R) sugiere la existencia de rutas de resistencia comunes (Shirasu y Schulze-Lefert, 2000, Plant Mol. Biol. 44, 371-385). Por tanto, la identificación de los genes adicionales requeridos para la resistencia no proporciona solo información sobre cómo funcionan dichas rutas de señalización sino que puede permitir también utilizarla para identificar los genes que juegan un papel más general en la resistencia.

A pesar de la creciente información acerca de las rutas de resistencia a enfermedades, sigue existiendo necesidad de identificar los genes y las proteínas que se pueden utilizar para crear plantas con un amplio rango duradero de resistencia a enfermedades. Es un objetivo de la invención proporcionar dichos ácidos nucleicos, proteínas y procedimientos para crear plantas, especialmente plantas que pertenecen a la familia Rutaceae, con resistencia a enfermedades aumentada.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención proporciona una construcción que comprende (i) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1 y (ii) un promotor que funciona en plantas, en la que la secuencia de nucleótidos está unida de forma operable al promotor de tal manera que el último expresa la secuencia polipeptídica que se muestra en la SEC ID Nº: 14. En una realización, el promotor se selecciona entre un promotor CA/IV de 35S, el promotor de la poliubiquitina, un promotor específico de tejido, y un promotor preferido de tejido. En otro aspecto, la invención proporciona una célula vegetal que comprende la construcción.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para aumentar la resistencia a la enfermedad del chancro de los cítricos en una planta o célula, que comprende sobreexpresar la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para aumentar la resistencia a la enfermedad del chancro de los cítricos en una planta o célula, que comprende (a) transformar una planta o célula con una construcción que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1, unida de manera operable con un promotor activo en células vegetales, (b) regenerar una planta a partir de dicha planta o célula

transformada y (c) seleccionar una planta o célula que tiene una resistencia aumentada a la enfermedad del chancro de los cítricos con respecto a una planta control. En una realización, el promotor se une de manera operable a un potenciador. En otra realización, el promotor es un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido. En una realización adicional, el promotor específico de tejido es un promotor específico de xilema, un promotor específico de floema, o un promotor específico de xilema/floema. En otra realización, la planta es un miembro de la familia Rutaceae. En una realización adicional, la planta se selecciona entre los géneros Citrus, Poncirus, Fortunella, Murraya, Microcitrus, Limonia, y Eremocitrus.

En otro aspecto, la invención proporciona una planta transgénica que tiene incorporado en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de resistencia a enfermedades que se muestra en la SEC ID Nº: 14. En una realización, el polipéptido está codificado por una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1. En una realización adicional, la progenie, el fruto, o la semilla de la planta comprende dicha secuencia de nucleótidos. Materia que ya no constituye aspectos de la invención se mantiene en los siguientes párrafos de la memoria descriptiva como técnica antecedente de utilidad para la comprensión de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Perfiles de expresión en silicio de una muestra seleccionada de genes identificados en bibliotecas de ADNc construidas a partir de tejido de hoja de cítrico previamente estimulada con Xanthomonas axonopodis pv citri (A-12h, A-24h e A-48h) y Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii (C-12h, C-24h y C-48h).

Figura 2. Expresión diferencial de genes deg seleccionados en cítricos estimulados con Xanthomonas axonopodis pv citri (A-12, A-24 e A-48) y Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii (C-12h, C-24h y C-48h).

Figura 3. Representación esquemática de los vectores pr35S(2x)-CaMV::ahas::35SpolyA pr35SCaMV::deg::NOSpolyA.

Figura 4. Diagrama a escala que ilustra el desarrollo de lesiones de chancro de los cítricos en hojas de naranja dulce artificialmente inoculadas con una suspensión bacteriana de Xanthomonas axonopodis pv citri.

Figura 5. Gravedad de la enfermedad en eventos seleccionados pr35S-CaMV::deg::NOSpolyA y variedad de control en Pineapple (C).

Figura 6. Tasa de crecimiento diferencial de la bacteria del chancro de los cítricos en cítricos que contienen las construcciones pr35S-CaMV::deg:: NOSpolyA y la variedad de control Pineapple (C).

Figura 7. Niveles de expresión del transgén en eventos seleccionados que contienen las construcciones pr35SCaMV::deg::NOSpolyA y la variedad de control Pineapple (C).

Breve descripción del listado de secuencias

SEC ID Nº: 1 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con una proteína rica en glicina que pertenece a la familia de la seferina de péptidos antimicrobianos.

SEC ID Nº: 2 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con una enzima de la familia de las peroxidasas.

SEC ID Nº: 3 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con un péptido antimicrobiano de la familia de la esnaquina.

SEC ID Nº: 4 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con una enzima con actividad fosfatasa.

SEC ID Nº: 5 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con una enzima con actividad ligasa E3.

SEC ID Nº: 6 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con una enzima con actividad ligasa E3.

SEC ID Nº: 7 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con una enzima con actividad asparagina sintasa.

SEC ID Nº: 8 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido que puede estar implicado en el sistema natural de defensa de las plantas.

SEC ID Nº: 9 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con un factor de transcripción de la familia de proteínas de unión a elementos sensibles a etileno.

SEC ID Nº: 10 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido que puede estar implicado en el sistema natural de defensa de las plantas.

SEC ID Nº: 11 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con una proteína teórica de función todavía desconocida; sin embargo, tiene dominios similares a los descubiertos en el factor de transcripción de la familia FRIGIDA.

SEC ID Nº: 12 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido que puede estar implicado en el sistema natural de defensa de las plantas.

SEC ID Nº: 13 Secuencia de ADN de Citrus senensis que codifica un polipéptido con similitud con una enzima con actividad transferasa.

SEC ID Nº: 14 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 1.

SEC ID Nº: 15 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 2.

SEC ID Nº: 16 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 3.

SEC ID Nº: 17 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 4.

SEC ID Nº: 18 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 5.

SEC ID Nº: 19 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 6.

SEC ID Nº: 20 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 7.

SEC ID Nº: 21 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 8.

SEC ID Nº: 22 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 9.

SEC ID Nº: 23 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 10.

SEC ID Nº: 24 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 11.

SEC ID Nº: 25 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 12.

SEC ID Nº: 26 secuencia prevista de la proteína según la SEC ID Nº: 13.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para regular el sistema de defensa natural de las plantas mediante la introducción de genes extraños/naturales en las células vegetales, preferiblemente es sus genomas. De forma más específica, los procedimientos se refieres a un aumento en la resistencia a enfermedades de la planta mediante la sobreexpresión de los genes implicados en el sistema de defensa innato de las plantas.

Los presentes inventores han utilizado bibliotecas de etiquetas de secuencias expresadas (EST) en combinación con la estimulación de cítricos con patógenos bacterianos avirulentos y virulentos, para identificar los genes implicados en la reacción hipersensible dependiente de efector (HR) y la resistencia a enfermedades. Se han encontrado un total de 2868 posibles genes que se expresan de forma diferencial en cítricos estimulados con un patógeno avirulento, en comparación con aquellos inoculados con una cepa bacteriana virulenta. Entre aquellos, se seleccionaron 29 genes para ensayar su potencial individual para conferir resistencia a cítricos frente a los patógenos bacterianos más comunes de los cítricos.

Los inventores han encontrado que la sobreexpresión de 13 de estos genes confirió un aumento de la resistencia a los cítricos frente a Xanthomonas axonopodis pv. citri, el agente causal de la enfermedad del chancro de los cítricos. Estos 13 genes, tal como se ha señalado en las SEC ID Nºs: 1-13, están relacionados en que cada uno codifica una proteína implicada en la defensa de la planta.

Todos los términos técnicos utilizados en el presente documento son términos utilizados comúnmente en bioquímica, biología molécula y agricultura y pueden ser entendidos por la persona normalmente experta en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aquellos términos técnicos se pueden encontrar en: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª ed., vol. 1-3, ed. Sambrook y Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel y col., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Nueva York, 1988 (con actualizaciones periódicas); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5ª ed., vol. 1-2, ed. Ausubel y col., John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, vol. 1-2, ed. Green y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997. La metodología que implica técnicas de biología vegetal se describe en el presente documento y se describe en detalle en tratados tales como METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL, ed. Maliga y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995. Diversas técnicas que utilizan la PCR se describen, por ejemplo, en Innis y col., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, San Diego, 1990 y en Dieffenbach y Dveksler, PCR PRIMER: A LABORATORY

MANUAL, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003. Las parejas de cebadores de la PCR se pueden derivar de secuencias conocidas mediante técnicas conocidas tales como las que utilizan programas informáticos previstos para este objetivo, por ejemplo., Primer, Versión 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA. Los procedimientos para la síntesis química de ácidos nucleicos se discuten, por ejemplo, en Beaucage y Caruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-1862 (1981), y Matteucci y Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981).

Se realizaron digestiones con encimas de restricción, fosforilaciones, ligamientos y transformaciones como describen Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Todos los reactivos y materiales utilizados para el cultivo y mantenimiento de las células bacterianas se obtuvieron de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), Invitrogen (Gaithersburg, MD), o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), salvo que se especifique de otra manera.

Los términos “que codifica” y “codificar” se refieren al proceso por el cual un gen, a través de los mecanismos de transcripción y traducción, proporciona información a una célula a partir de una serie de aminoácidos que se pueden ensamblar en una secuencia de aminoácidos específica para producir una enzima activa. Debido a la degeneración del código genético, determinados cambios de bases en la secuencia de ADN no cambian la secuencia de aminoácidos de una proteína. Se entiende por tanto que se contempla que las modificaciones en una secuencia de nucleótidos que codifican cualquiera de las proteínas de esta invención, no afecta sustancialmente sus propiedades funcionales

En esta descripción, “expresión” denota la producción del producto de proteína codificado por un gen. “Sobreexpresión” se refiere a la producción a la producción de un producto génico en un organismo transgénico que excede los niveles de producción en organismos normales o no transformados.

Secuencias expresadas de forma diferencial

Los genes expresados de forma diferencial referidos en esta invención se han identificado en diversas especies de cítricos ejemplificados por plantas de naranjas dulces. En el contexto de la presente invención, “deg” se refiere a genes expresados de forma diferencial cuya sobreexpresión confiere resistencia a las plantas frente a las enfermedades de las mismas. Las secuencias deg a modo de ejemplo se muestran en “Breve descripción de las secuencias”.

Los genes expresados de forma diferencial procedentes de Citrus sinensis se denominarán de ahora en adelante deg 1 (SEC ID Nº: 1), deg 2 (SEC ID Nº: 2), deg 3 (SEC ID Nº: 3), deg 4 (SEC ID Nº: 4), deg 5 (SEC ID Nº: 5), deg 6 (SEC ID Nº: 6), deg 7 (SEC ID Nº: 7), deg 8 (SEC ID Nº: 8), deg 9 (SEC ID Nº: 9), deg 10 (SEC ID Nº: 10), deg 11 (SEC ID Nº: 11), deg 12 (SEC ID Nº: 12), y deg 13 (SEC ID Nº: 13).

Los términos “identidad de la secuencia” y “similitud de secuencias” se pueden determinar mediante la alineación de dos secuencias de péptidos o dos secuencias de nucleótidos utilizando algoritmos de alineación globales o locales. Las secuencias se pueden denominar como “sustancialmente idénticas” o “esencialmente similares” cuando comparten al menos un 70 % de identidad de la secuencia sobre su longitud completa, respectivamente. Las alineaciones y puntuaciones de secuencias para el porcentaje de identidad de la secuencia se pueden determinar utilizando programas informáticas, tales como el GCG Wisconsin Package, Versión 10.3, disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Calif. 92121-3752 EE. UU., o EmbossWin versión 2.10.0 (que utiliza el programa “needle”). De forma alternativa, el porcentaje de similitud o identidad se puede determinar investigando en las bases de datos, utilizando algoritmos tales como FASTA; BLAST, etc.

Tal como se ha señalado anteriormente, se dan a conocer moléculas de ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1-13, que codifica proteínas funcionales, en las que las proteínas tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en la SEC ID Nº: 14-26. Se entiende que las proteínas que abarcan sustituciones, adiciones, y deleciones de aminoácidos no alteran la función de ninguna de las proteínas.

Debido a que muchas proteínas están codificadas por familias de genes, se espera que otros géneros de cítricos podrían tener funciones similares a las de las proteínas codificadas por la SEC ID Nº: 1-13. Estos genes se pueden identificar y acotar funcionalmente para la comparación de la secuencia. Un operario experto en la técnica puede identificar una secuencia de proteínas relacionadas funcionalmente con la ayuda de procedimientos convencionales tales como el cribado de bibliotecas de ADNc o librerías genómicas con sondas de hibridación adecuadas. El técnico experto sabe que las secuencias homólogas se pueden aislar con la ayuda de oligonucleótidos (degenerados) y procedimientos basados en la PCR.

De acuerdo con esto, se pueden identificar las secuencias mediante los procedimientos descritos más arriba, y por tanto acotarse funcionalmente como perteneciendo a cualquiera de las familias DEG incluidas en esta invención (de acuerdo con la utilización común, la letra cursiva denota un gen y la letra mayúscula denota un producto codificado) Por tanto, la frase “secuencia de ADN de deg” se refiere aquí a cualquier molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse en condiciones restrictivas con cualquiera de las secuencias que se muestran en la SEC ID Nº: 1-13, y codificar un polipéptido equivalente con las proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran como la SEC ID Nº: 14-26. El término incluye también las secuencias que se

hibridan en cruzado con la SEC ID Nº: 1-13, que tienen preferiblemente al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad con los genes que se muestran en la SEC ID Nº: 1-13. Las secuencias de nucleótidos de la invención pueden codificar proteínas que son homólogas con los productos génicos previstos dados a conocer en el presente documento como SEC ID Nº: 14-26. La invención incluye también una secuencia de proteína que es preferiblemente al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a cualquiera de la SEC ID Nº: 14-26.

“Condiciones restrictivas” tal como se usa en el presente documento, se refiere a parámetros con los cuales la técnica es familiar, tales como la hibridación en 3,5 x SSC, 1 x disolución de Denhardt, tampón fosfato de sodio 25 mM (pH 7,0), SDS al 0,5 %, y EDTA 2 mM durante 18 horas a 65º C, seguido por 4 lavados del filtro a 65º C durante 20 minutos, en 2 2 x SSC, SDS al 0,1 %, y un lavado final durante hasta 20 minutos en 0,5 x SSC, SDS al 0,1 %, o 3 x SSC y SDS al 0,1 % para una restricción mayor, y 0,1 x SSC, SDS al 0,1 % para una restricción incluso mayor. Se pueden sustituir otras condiciones, siempre que el grado de restricción sea igual al proporcionado en el presente documento, utilizando un lavado final de 0,5 x SSC.

De acuerdo con esto la presente invención comprende cualquier ácido nucleico, gen, polinucleótido, molécula de ADN, ARN, ARNm procedente de especies de cítricos, o producidas de manera sintética, que aumenta la resistencia a enfermedades. El ADN o el ARN puede ser bicatenario o monocatenario. El ADN monocatenario puede ser una hebra de codificación, conocida también como la hebra de sentido directo, o puede ser la hebra no codificante, denominada también la hebra de sentido contrario.

Tal como se usa en el presente documento, “los genes deg que se muestran en la SEC ID Nº: 1-13” se entiende que significa que los genes deg incluyen las secuencias que se muestran en la SEC ID Nº: 1-13, así como las moléculas de ácido nucleico comprendidas por variantes de la SEC ID Nº: 1-13, con una o más bases eliminadas, sustituidas, insertadas, o añadidas, cuya variante codifica un polipéptido con la misma actividad. De acuerdo con esto, las secuencias que tienen “secuencias de bases con una o más bases eliminadas, sustituidas, insertadas, o añadidas” retienen la actividad fisiológica incluso cuando la secuencia de aminoácidos codificada tiene uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados, insertados, o añadidos. Debido a la degeneración del código genético, se pueden utilizar diferentes codones de nucleótidos para codificar un aminoácido concreto. Una célula hospedadora presenta a menudo un modelo de utilización de codón preferido (Campbell y col., 1990). Las secuencias de ácido nucleicos se construyen preferiblemente para utilizar el modelo de utilización del codón de una célula hospedadora concreta. Esta expresión de la secuencia del ácido nucleico mejora generalmente en una célula hospedadora transformada. Las secuencias de ácidos nucleicos dadas a conocer en el presente documento utilizan preferiblemente la utilización óptima del codón para las células hospedadoras bacterianas, fúngicas y vegetales. Adicionalmente, pueden existir múltiples formas de las proteínas de esta invención, que pueden deberse a la modificación posterior a la traducción de un producto génico o a múltiples formas de los genes deg. Las secuencias de nucleótidos que tienen dichas modificaciones están incluidas en el alcance de la presente invención

Por ejemplo, se pueden eliminar la cola de poli A o el extremo 5’ o 3’ de las regiones no traducidas, y se pueden eliminar las bases en la extensión en la que se eliminan los aminoácidos. Se pueden sustituir también las bases, siempre que no den como resultado cambios de marco. Se pueden “añadir” también bases en la extensión en la que se añaden aminoácidos. Es esencial, sin embargo, que cualquiera de dichas modificaciones no dé como resultado la pérdida de actividad de la proteína. Se puede obtener en este contexto un ADN modificado modificando las secuencias de bases del ADN de la invención de tal manera que los aminoácidos en los sitios específicos se sustituyan, eliminen, inserten, o añadan mediante mutagénesis específica del emplazamiento, por ejemplo. Zoller & Smith, Nucleic Acid Res. 10: 6487-500 (1982).

Una secuencia del gen deg se puede sintetizar desde el principio a partir de las bases adecuadas, por ejemplo, utilizando cualquier secuencia de proteína adecuada dada a conocer en el presente documento como una guía para crear una molécula de ADN que, aunque diferente de la secuencia de ADN natural, de como resultado la producción de proteínas con las mismas o similares secuencias de aminoácidos.

Por molécula(s) de ácido nucleico “aislada” se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN, ARN, que se ha eliminado de su entorno natural. Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en la construcción de ADN se consideran aisladas para los fines de la presente invención. Los ejemplos adicionales de moléculas de ADN aisladas incluyen moléculas de ARN recombinante mantenidas en las células hospedadoras heterólogas o moléculas de ADN que se purifican, parcial o sustancialmente, en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas, de acuerdo con la presente invención incluyen, además dichas moléculas producidas de forma sintética.

“Ácido nucleico exógeno” se refiere a un ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha introducido en una célula (o en el antecesor de la célula) a través del esfuerzo de los seres humanos. Dicho ácido nucleico exógeno puede ser una copia de una secuencia que se encuentra de forma natural en la célula en la que se introdujo, o sus fragmentos.

Por el contrario, “ácido nucleico endógeno” se refiere a un ácido nucleico, gen, polinucleótido, molécula de ADN, ARN, ARNm, o ADNc que está presente en el genoma de una planta u organismo que se ha diseñado mediante ingeniería genética. Una secuencia endógena es “natural” para, es decir, indígena para, la planta u organismo que

se va a diseñar mediante ingeniería genética.

“Ácido nucleico heterólogo” se refiere a un ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha introducido en una célula (o en el antecesor de la célula). Dicho ácido nucleico heterólogo puede comprender segmentos que son una copia de una secuencia que se encuentra de forma natural en la célula en la que se ha introducido, o sus fragmentos.

A no ser que se indique otra cosa, todas las secuencias de nucleótidos determinadas mediante secuenciación de una molécula de ADN en el presente documento se han determinado utilizando un secuenciador de ADN automatizado, tal como el Modelo 3730 de Applied Biosystems, Inc. Por tanto, tal como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada mediante esta solución automatizada, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en el presente documento puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas de forma automática son normalmente al menos aproximadamente un 95 % idénticas, más normalmente al menos aproximadamente un 96 % a al menos aproximadamente un 99,9 % idénticas a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real puede determinarse de forma más precisa mediante otras soluciones que incluyen procedimientos de secuenciación manuales bien conocidos en la técnica. Como se conoce también en la técnica una única inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada en comparación con la secuencia real producirá un cambio de marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos de tal manera que la secuencia de aminoácidos prevista codificada por una secuencia de nucleótidos determinada puede ser completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada realmente por la molécula de ADN secuenciada, comenzando en el punto de dicha inserción o deleción.

Una “variante” es una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que se desvía del patrón, o de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de un gen o proteína concreta proporcionado. Los términos “isoforma”, “isotipo”, y “análogo” se refieren también a formas “variantes” de una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. Una secuencia de aminoácidos que está alterada por la adición, eliminación, o sustitución de uno o más aminoácidos, o un cambio en la secuencia de nucleótidos, se puede considerar como una secuencia “variante”. La variante puede tener cambios “conservativos”, en los que un aminoácido sustituido tiene similar estructura o propiedades químicas, por ejemplo, sustitución de leucina con isoleucina. Una variante puede tener cambios “no conservativos”, por ejemplo, sustitución de una glicina con un triptófano. Variaciones análogas menores pueden incluir también deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas: Se pueden encontrar directrices para determinar qué restos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar, o eliminar utilizando programas informáticos bien conocidos en la técnica tales como el software Vector NTI Suite (InforMax, MD) “variante” puede referirse también a una “transposición genética” tal como la descrita en las patentes asignadas a Maxygen. Por ejemplo, una variante de la presente invención puede incluir variantes de las secuencias y polinucleótidos deseados que están modificados de acuerdo con los procedimientos y la lógica dada a conocer en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 6.132.970.

Procedimientos para sobreexpresar genes deg

En un aspecto de la invención, la resistencia a las enfermedades de las plantas se aumenta mediante la sobreexpresión de un gen deg. Son bien conocidos en la técnica varios procedimientos para sobreexpresar un gen concreto y se pueden utilizar en la presente invención.

La presente invención contempla la sobreexpresión de una secuencia que codifica DEG. Los polinucleótidos de sentido directo utilizados para llevar a cabo la presente invención tienen longitud suficiente para expresar una proteína funcional en una célula vegetal. Dichos polinucleótidos pueden ser esencialmente un ácido nucleico genómico completo o complementario que codifica cualquiera de las proteínas DEG incluidas en la presente invención.

La idoneidad de las dianas candidato también se puede evaluar analizando su accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios, usando ensayos de protección de la ribonucleasa tal como es conocido en la técnica. Se puede producir ADN que codifica moléculas de ARN enzimáticas de acuerdo con técnicas conocidas. Por ejemplo, véase Cech y col., Patente de los Estados Unidos con nº 4.987.071; Keene y col., Patente de los Estados Unidos con nº 5.559.021; Donson y col., Patente de los Estados Unidos con nº 5.589.367; Torrence y col., Patente de los Estados Unidos con nº 5.583.032; Joyce, Patente de los Estados Unidos con nº 5.580.967; Gold y col., Patente de los Estados Unidos con nº 5.595.877; Wagner y col., Patente de los Estados Unidos con nº 5.591.601; y la Patente de los Estados Unidos con nº 5.622.854.

Por ejemplo, la expresión de un gen deg se puede aumentar mediante procedimientos de ingeniería genética que son bien conocidos en la técnica. La expresión se puede aumentar uniendo de forma operable la secuencia de un promotor fuerte a cualquier secuencia que codifica DEG incluida en la presente invención. La expresión se puede incrementar adicionalmente añadiendo una secuencia de un potenciador a un promotor fuerte unido de forma operable a cualquier secuencia que codifica DEG incluida en la presente invención.

"Potenciador” o “elemento potenciador” se refiere a un elemento regulador de la transcripción con acción en cis, es decir, un elemento cis, que confiere un aspecto del modelo de expresión global, pero que habitualmente es insuficiente para impulsar la transcripción en solitario de una secuencia de polinucleótido unida de forma operable. A diferencia de los promotores, los elementos potenciadores no suelen incluir un sitio de inicio de la transcripción

(TSS) o secuencia TATA. Un promotor puede comprender de forma natural uno o más elementos potenciadores que afectan la transcripción de una secuencia de polinucleótido unida de forma operable. Un elemento potenciador aislado también se puede fusionar con un promotor para producir un promotor quimérico elemento cis que confiere un aspecto de la modulación global de la expresión génica. Un promotor o fragmento de promotor puede comprender uno o más elementos potenciadores que efectúan la transcripción de genes unidos de forma operable. Se cree que muchos elementos potenciadores del promotor se unen a proteínas que se unen al ADN y/o afectan la topología del ADN, produciendo conformaciones locales que selectivamente permiten o restringen el acceso de la ARN polimerasa al molde de ADN o que facilitan la apertura selectiva de la doble hélice en el sitio de inicio de la transcripción. Un elemento potenciador puede funcionar para unir factores de transcripción que regulan la transcripción. Algunos elementos potenciadores se unen a más de un factor de transcripción, y los factores pueden interactuar con diferentes afinidades con más de una región del potenciador. Los elementos potenciadores se pueden identificar mediante varias técnicas, incluyendo el análisis de deleción, es decir, la eliminación de uno o más nucleótidos desde el extremo 5’ o bien de forma interna con respecto a un promotor; el análisis de la proteínas que se unen al ADN mediante el uso de la huella dactilar de la ADNasa I, interferencia de metilación, ensayos de desplazamiento de motilidad durante la electroforesis, huella dactilar genómica in vivo mediante PCR mediada por ligadura, y otros ensayos convencionales; o mediante análisis de similitudes de secuencias de ADN usando moldes de elementos cis conocidos, o elementos potenciadores como secuencia diana o molde diana con procedimientos convencionales de comparación entre secuencias de ADN, tales como BLAST. La estructura fina de una región potenciadora puede estudiarse adicionalmente mediante mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos o mediante otros procedimientos convencionales. Los elementos potenciadores se pueden obtener por síntesis química o por aislamiento de los elementos reguladores que incluyen tales elementos, y se pueden sintetizar con nucleótidos flanqueantes adicionales que contienen sitios útiles para enzimas de restricción que facilitan la posterior manipulación. Así, el diseño, construcción y uso de elementos potenciadores de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento para modular la expresión de moléculas de polinucleótidos unidas de manera operativa que se pueden transcribir quedan abarcados por la presente invención. Se conocen en la técnica varios potenciadores, entre los que se incluyen los potenciadores CaMV de 35S.

Construcciones de ácido nucleico

De acuerdo con un aspecto de la invención, una o más secuencias que aumentan la resistencia a las enfermedades se incorporan a una construcción de ácido nucleico que es adecuada para la transformación de células o plantas. La invención proporciona moléculas de ácido nucleico que aumentan la resistencia a las enfermedades en una planta transformada.

Las construcciones de ácido nucleico recombinante se pueden fabricar con técnicas normalizadas. Por ejemplo, se puede obtener una secuencia de nucleótidos para su transcripción mediante el tratamiento de un vector que contiene dicha secuencia con enzima de restricción para recortar el segmento adecuado. La secuencia de nucleótidos para su transcripción también se puede generar hibridando y uniendo oligonucleótidos sintéticos o mediante el uso de oligonucleótidos sintéticos en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para proporcionar sitios de restricción adecuados en cada extremo. A continuación, la secuencia de nucleótidos se clona dentro de un vector que contiene elementos de regulación adecuados, tal como una secuencia de promotor en dirección 5’ y una secuencia de terminación en dirección 3’.

Un aspecto importante de la presente invención es el uso de construcciones de ácido nucleico en las que una secuencia que codifica DEG está unida de forma operable a una o más secuencias de regulación, que impulsan la expresión de la secuencia en determinados tipos de células, órganos o tejidos sin afectar negativamente al desarrollo o fisiología normales.

“Promotor" denota una región de ADN en dirección 5’ desde el inicio de la transcripción que está implicada en el reconocimiento y la unión a la ARN polimerasa y a otras proteínas para iniciar la transcripción. Un “promotor constitutivo” es uno que es activo durante la totalidad de la vida de la planta y en la mayor parte de condiciones ambientales. Los promotores específicos de tejidos, preferidos por los tejidos, específicos del tipo de célula e inducibles constituyen la clase “promotores no constitutivos”. “Unido de forma operable” se refiere a un vínculo funcional entre un promotor y una segunda secuencia, donde la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Por lo general, “unido de forma operable” significa que las secuencias de ácido nucleico que se están vinculando son contiguas.

Se ilustran promotores adecuados, aunque no limitados a promotores constitutivos tales como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMv) o el promotor de la poliubiquitina, así como promotores específicos de tejido, preferidos por el tejido, específicos de tipo celular e inducibles. Por ejemplo, en cítricos, varios patógenos importantes se localizan en el sistema vascular, que hace referencia a los vasos del xilema o del floema; puede ser ventajoso usar un promotor específico del xilema/floema para dirigir la expresión de un gen de defensa. En la técnica se conocen promotores específicos del xilema o del floema, por ejemplo los divulgados en la patente de EE.UU. Nº

6.613.960 y las publicaciones de solicitud nº 2004/0253717 y 2007/0266457.

Los vectores de la invención también pueden contener secuencias de terminación, que se localizan cadena debajo de las moléculas de ácido nucleico de la invención, de modo que se termina la transcripción del ARNm y se añaden

secuencias de poliA. Ejemplos de dichos terminadores son el terminador 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el terminador del gen de la nopalina sintasa (Tnos). El vector de expresión también puede contener potenciadores, intrones, codones de iniciación, secuencias señal de corte y empalme y secuencias de dirección a orgánulos celulares tales como las mitocondrias y los cloroplastos.

Los vectores de expresión de la invención también pueden contener un marcador de selección por el cual se pueden identificar las células transformadas en cultivo. El marcador se puede asociar con la molécula de ácido nucleico heteróloga, es decir el hen unido operativamente a un promotor. Como se usa en el presente documento, el término “marcador” hace referencia a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección, o la detección selectiva, de una planta o célula que contiene el marcador. En plantas, por ejemplo, el gen marcador codificará resistencia a antibióticos o a herbicidas. Esto permite la selección de células transformadas de entre las células que no están transformadas o transfectadas.

Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen resistencia a adenosina desaminasa, dihidrofolato reductasa, higromicina B fosfotransferasa, timidina cinasa, xantina-guanina fosforibosiltransferasa, glifosato y glufosinato y resistencia a amino-glucósido-3’-O-fosfotransferasa (resistencia a kanamicina, neomicina y G418). Estos marcadores pueden incluir resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, espectinomicina y gentamicina. La construcción también puede contener el gen del marcador seleccionable ahas que confiere resistencia a herbicidas tales como imazetapir, imazapic, imazapir, imazamox, sulfometuron metilo, imazaquin, clorimuron etilo, metsulfuron metilo, rimsulfuron, tifensulfuron metilo, piritiobac sódico, tribenuron metilo y nicosulfuron [sic: "clase de las imidazolinonas”]. Sun-Mi y col., 2004, Biochemical Journal 383: 53-61. También se conocen otros marcadores de selección adecuados.

Se pueden usar marcadores visibles tales como la proteína verde fluorescente (GFP). También se han descrito procedimientos para identificar o seleccionar plantas transformadas basadas en el control de la división celular. Véanse los documentos WO 2000/052168 y WO 2001/059086.

También se pueden incluir secuencias de replicación de origen bacteriano o viral, para poder clonar el vector en un huésped bacteriano o fago. Preferentemente se usa un origen de replicación procariota del amplio abanico de huéspedes. Se puede incluir un marcador seleccionable para bacterias con el fin de permitir la selección de células bacterianas portadoras de la construcción deseada. Marcadores seleccionables procariotas adecuados también incluyen resistencia a antibióticos tales como kanamicina o tetraciclina.

En el vector también puede haber otras secuencias de ácido nucleico que codifican funciones adicionales, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, cuando el huésped es Agrobacterium, se pueden incluir secuencias de T-ADN para facilitar la posterior transferencia e incorporación en cromosomas de plantas.

Plantas para ingeniería genética

La presente invención comprende la manipulación genética de plantas, especialmente cítricos, para potenciar la resistencia a enfermedades.

En esta descripción, “planta” indica cualquier material vegetal que contiene celulosa que se pueda manipular genéticamente, incluidas, entre otras, células vegetales diferenciadas o indiferenciadas, protoplastos, plantas enteras, tejidos vegetales u órganos vegetales, o cualquier componente de una planta tales como hojas, tallos, raíces, yemas, tubérculos, frutos, rizomas o similares. Como se usa en el presente documento, “propágalo” incluye una estructura con la capacidad para dar lugar a una planta nueva, por ejemplo una semilla, una espora o una parte del cuerpo vegetativo capaz de crecer de forma independiente si se desprende de la parental.

Las plantas que se pueden someter a ingeniería de acuerdo con la invención incluyen, Erne otras, árboles, tales como naranjas dulces, limones, mandarinas etc. Se entiende que “planta cítrica” significa una planta de los géneros Citrus, Poncirus, Fortunella, Murraya, Microcitrus, Limonia,y Eremocitrus, preferentemente la especie Citrus sinensis

En la presente descripción, “planta transgénica” hace referencia a una planta que tiene incorporada una secuencia de ADN, que incluye, entre otros, genes que normalmente no están presentes en el genoma de una planta huésped, secuencias de ADN que normalmente no se transcriben en ARN o se traducen en una proteína (”se expresan”) o cualquier otro gen o secuencia de ADN que se desee introducir en la planta no transformada, tales como los genes que normalmente pueden estar presentes en la planta no transformada pero que se desea someter a ingeniería genética o tener la expresión alterada. La categoría “planta transgénica” incluye tanto un transformante primario como una planta que incluye un transformante en su linaje, por ejemplo mediante introgresión estándar u otro procedimiento de cultivo.

"Modificado genéticamente" (MG) abarca cualquier metodología para introducir un ácido nucleico o una mutación específica en un organismo huésped. Por ejemplo, una planta cítrica está modificada genéticamente cuando se ha transformado con una secuencia polinucleotídica que aumenta la expresión de un gen, tal como cualquier gen deg, y, de este modo, aumenta la resistencia a la enfermedad.

Por el contrario, una planta cítrica que no está transformada con una secuencia polinucleotídica es una planta control

y se denomina planta “no transformada”.

Procedimientos de ingeniería genética

Una secuencia polinucleotídica, como una secuencia deg, se puede integrar de forma estable en un genoma de planta de varias formas conocidas en la técnica. Se pueden transformar células de plantas angiospermas o gimnospermas monocotiledóneas, dicotiledóneas. Véase, por ejemplo, Klein y col., Biotechnology 4: 583-590 (1993); Bechtold y col., C. R. Acad Sci. Paris 316:1194-1199 (1993); Bent y col., Mol. Gen. Genet. 204:383-396 (1986); Paszowski y col., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984); Sagi y col., Plant Cell Rep. 13: 26 15-286 (1994). Se pueden usar especies de Agrobacterium tales como A. tumefaciens y A. rhizogenes, por ejemplo de acuerdo con Nagel y col., Microbiol Lett 67: 325 (1990). Adicionalmente, las plantas se pueden transformar mediante transformación de Rhizobium, Sinorhizobium o Mesorhizobium. Broothaerts y col., Nature 433:629-633 (2005). Véase la publicación de la solicitud de EE.UU. 200702711627.

Procedimientos adicionales para modificar genéticamente una planta o célula incluyen, entre otros, electroporación, bombardeo con pistola de partículas (Klein y col., (1987) Nature. 327:70-73), precipitación en fosfato cálcico y fusión con polietilenglicol, transferencia a granos de polen en germinación, transformación directa (Lorz y col., Mol. Genet.

199: 179-182 (1985)), y otros procedimientos conocidos en la técnica. Si se usa un marcador de selección, tal como de resistencia a kanamicina, facilita determinar qué células se han transformado con éxito. Se pueden incluir genes marcadores dentro de pares de sitios de recombinación reconocidos por recombinasas específicas, tales como cre o flp, para facilitar la eliminación del marcador después de la selección. Véase la solicitud de EE.UU. publicada Nº 2004/0143874.

En el contexto de la presente invención, las plantas transgénicas producidas mediante el procedimiento descrito en lo que antecede se pueden usar como fuente de un transgén en un programa de cultivo convencional. En general se usa polen de una planta transgénica para polinizar una planta no transgénica. Las semillas de la planta madre se pueden usar para producir una nueva planta transgénica diferente de la planta transgénica original producida mediante el procedimiento descrito en lo que antecede.

Se seleccionan plantas modificadas genéticamente que tienen una expresión mayor de los genes deg. Por ejemplo, una planta cítrica transgénica/células de la planta empleada en el procedimiento de acuerdo con la invención se distingue de las plantas cítricas silvestres/células de las plantas por el hecho de que comprenden al menos una copia de la molécula de ácido nucleico expuesta en la SEC ID Nº: 1-13 integrada de forma estable en su genoma, además de copias de dicha molécula de origen natural en las plantas cítricas silvestres/células de las plantas. En este caso, las plantas cítricas/células de las plantas del procedimiento de acuerdo con la invención se pueden distinguir de las plantas cítricas silvestres/células de las plantas en concreto por el hecho de que esta copia adicional, o estas copias adicionales, se localiza/n en ubicaciones en el genoma en las que no está, o donde no están, en plantas cítricas silvestres/células de las plantas.

“Plantas cítricas silvestres” hace referencia a plantas control cuyo genoma no se ha modificado mediante la introducción de una construcción que comprende cualquier secuencia del gen deg, o fragmento de la misma.

Procedimientos para cuantificar un incremento de la resistencia a la enfermedad

Las plantas modificadas genéticamente y las células de la invención se caracterizan por una mayor resistencia a la enfermedad. Esto se consigue mediante la sobreexpresión de los genes deg.

“Resistencia a la enfermedad” o “resistencia a la enfermedad incrementada/potenciada” hace referencia a una capacidad aumentada de los transformantes (frente a los transformantes silvestres o control) para aguantar el ataque de uno o más patógenos vegetales o, en otras palabras, hace referencia a una reducción significativa de los síntomas de la enfermedad en controles transformantes en comparación con los no transformantes (o vector vacío transformado). La resistencia a la enfermedad o la resistencia potenciada a la enfermedad se pueden determinar usando varios procedimientos. A menudo los síntomas de la enfermedad se puntúan visualmente (en bioensayos o en campo) evaluando los síntomas de la enfermedad en uno o más puntos de tiempo tras inoculación o contacto con un patógeno. Procedimientos alternativos incluyen procedimientos mediante los cuales se detecta el patógeno y se cuantifica opcionalmente. Una planta transgénica puede mostrar una resistencia potenciada a la enfermedad si la cantidad de patógeno detectada en/sobre el tejido es significativamente menor que la de los controles o si la diseminación del patógeno es significativamente menor que la de los controles. En última instancia, un incremento significativo del rendimiento promedio de transformantes (p. ej., al menos el 1 %, 2 %, 5 %, 10 % o más) en comparación con los controles, cuando se cultivan a una presión de la enfermedad equivalente (preferentemente en el campo) proporciona una medición indirecta de la resistencia potenciada a la enfermedad.

Por tanto, una pluralidad de plantas transformadas que expresan proteínas DEG (o una proteína DEG constitutivamente activa) muestran una resistencia potenciada a la enfermedad su muestran una reducción significativa de los síntomas de la enfermedad en comparación con los controles transformados con el vector vacío o con los no transformados. El análisis estadístico es necesario para determinar si existen diferencias significativas. Preferentemente, uno o más síntomas de enfermedad están, de media, al menos un 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, o incluso 100 % menor en los transformantes DEG que en las plantas control. Dado que el ensayo

de la enfermedad es diferente para cada combinación huésped-patógeno, no se puede proporcionar un protocolo específico, pero el experto en la técnica sabe cómo determinar si los transformantes muestran una enfermedad significativamente potenciada a uno o más patógenos. Los bioensayos como se conocen en la técnica para cada combinación planta - patógeno se pueden usar para comparar la resistencia de las plantas transgénicas a controles adecuados.

Descripciones detalladas de patógenos de plantas, los síntomas de la enfermedad causada por elos y sus ciclos de vida se pueden encontrar para cada especie de planta. Por ejemplo, los patógenos de los cítricos se describen en COMPENDIUM OF CITRUS DISEASES, Editors L. W. Timmer, Stephen Michael Garnsey, and J. H. Graham (ISBN 0-89054-248-1, APS Press).

Patógenos de cítricos incluyen, por ejemplo, las siguientes especias de hongos y bacterias y virus (no limitantes). Xanthomonas campestris pv. citrumelo (bacteria), Pseudomonas syringae (bacteria), Xanthomonas axonopodis pv. citri (Bacterium), Xylella fastidiosa (bacteria), Candidatus Liberibacter africanus (bacteria), Candidatus Liberibacter americanus (bacteria), Candidatus Liberibacter asiaticus (bacteria), Alternaria alternata (hongo), Aspergillusflavus, Alternaria alternata (hongo), Alternaria citri (hongo), Glomerella cingulata (hongo), Colletotrichum gloeosporioides (hongo), Thanatephorus cucumeris (hongo), Rhizoctonia solani (hongo), As-pergillus niger (hongo), Thielaviopsis basicola (hongo), Chalara elegans (hongo), Guigrrardia citricarpa (hongo), Phyllosticta citricarpa (hongo), Penicillium italicum (hongo), Botrytis cinerea (hongo), Botryotinia fuckeliana (hongo), Sphaeropsis tumefaciens (hongo), Phytophthora citricola, P. citrophthora, P. hibernalis, P. nicotianae, P. parasitica, P. palmivora, P. syringae, Macrophomina phaseolina (hongo), Pythium sp., P. aphanidermatum, P. debaryanum, P. rostratum, P. ultimum, P. vexans, Rhizoctonia solani (hongo), Lasiodiplodia theobromae (hongo), Botryodiplodia theobromae (hongo), Diplodia natalensis (fungous), Botryosphaeria rhodina (hongo), Botryosphaeria ribis (hongo), Nectria haematococca (hongo), Schizothyrium pomi (hongo), Fusarium oxysporum (hongo), Botrytis cinerea (hongo), Mycosphaerella citri (hongo), Penicillium digitatum (hongo), Ganoderma applanatum (hongo), G. brownii (hongo), G. lucidum (hongo), Mycosphaerella horii (hongo), M lageniformis (hongo), Phoma tracheiphila (hongo), Alternaria limicola (hongo), Diaporthe citri (hongo), Phomopsis citri(hongo), Mucor paronychia (hongo), M racemo-sus (hongo), Armillaria mellea (hongo), Phaeoramularia angolensis (hongo), Phymatotrichopsis omnivora (hongo), Phomopsis citri (hongo), Erythricium salmonicolor (hongo), Gliocladium roseum (hongo), Pleospora herbarum (hongo), Oxyporus latemarginatus (hongo), Poria latemarginata (hongo), Colletotrichum acutatum (hongo), Oidium tingitaninurn (hongo), Acrosporium tingitaninum (hongo), Rhizopus stolonifer (hongo), Lasiodiplodia theobromae (hongo), Hendersonula toruloidea (hongo), Elsinoe fawcettii (hongo), Sclerotinia sclerotiorum (hongo), Septoria citri (hongo), Gloeodes pomigena (hongo), Geotrichum citri-aurantii (hongo), Galactomyces citri-auraniii(hongo), G. candidum (hongo), Galactomyces geotrichum (hongo), Elsinoe australis (hongo), Corticium stevensii (hongo), Pellicularia koleroga (hongo), Trichoderma viride (hongo), Rhytidhysteron rufulum (hongo), Ustulina deusta (hongo), Penicillium ulaiense (hongo), Rosellinia necatrix (hongo), R. subiculata (hongo), virus del mosaico de los cítricos, voris relacionado con el enanismo del mandarino Satsuma, virus de la hoja rugosa de los cítricos, virus del mosaico amarillo de los cítricos, virus de la hoja crujiente, virus de la variegación de cítricos (CVV), virus del enanismo del mandarino Satsuma (SDV), virus de la hoja andrajosa de los cítricos, virus de la tristeza de los cítricos (CTV), virus de la muerte súbita de los cítricos (CSDV), viroide de la caquexia de los cítricos, viroide de la mancha amarilla de los cítricos, virus de la mancha anular amarilla de los cítricos, viroide de la exocorteza de los cítricos (CEVd), virus de la lepra de los cítricos (CiLV). Debido a la defensa inespecífica de la planta, cabría esperar que los genes fueran eficaces contra otros patógenos bacterianos.

También es una realización generar plantas transgénicas que expresen varias proteínas DEG, preferentemente bajo el control de diferentes promotores, tales como diferentes promotores específicos de tejido.

El fenotipo de la resistencia a la enfermedad se puede ajustar de forma fina expresando una cantidad adecuada de proteínas DEG en un tiempo y localización adecuados. Dicho ajuste fino se puede realizar determinando el promotor más adecuado para una combinación huésped-patógeno concreta y también seleccionando “eventos” transgénicos que muestren el nivel de expresión deseado. Un nivel demasiado bajo de proteínas DEG o una inducción demasiado lenta de la producción de proteínas DEG tras el ataque de un patógeno puede ser insuficiente para potenciar los niveles de resistencia a la enfermedad. Por otro lado, un nivel o expresión de proteínas demasiado alto en momentos o ubicaciones desprovistos del ataque de patógenos puede tener como resultado fenotipos agronómicamente indeseados, tales como lesiones en las hojas o los frutos en ausencia de patógenos, y producen penalizaciones. No obstante, el experto puede generar fácilmente plantas que tienen una resistencia potenciada a la enfermedad pero que al mismo tiempo son aceptables agronómicamente. Alelos deg óptimos se pueden aislar o identificar como se ha descrito, por ejemplo alelos que proporcionan niveles de resistencia altos y solo un débil fenotipo HR.

Los transformantes que expresan los niveles deseados de proteínas DEG se seleccionan, por ejemplo, analizando el número de copias (análisis de transferencia de tipo Southern), los niveles de transcritos de ARNm (p. ej., RT-PCR usando pares de cebadores deg específicos o cebadores flanqueantes) o analizando la presencia y el nivel de proteínas DEG en varios tejidos (p. ej., SDS-PAGE, ensayos ELISA etc.). Por motivos reguladores, preferentemente los transformantes de una sola copia se seleccionan preferentemente y las secuencias que flanquean el sitio de inserción del gen quimérico se analiza, preferentemente se secuencia, para caracterizar el "evento". Los eventos transgénicos que expresan DEG de forma elevada o moderada se seleccionan para analizar adicionalmente hasta

que se obtiene un evento de élite de alto rendimiento con un transgén deg estable.

Los transformantes que expresan uno o más genes deg de acuerdo con la invención también pueden comprender otros transgenes tales como otros genes que confieren resistencia a la enfermedad o que confieren tolerancia a otras agresiones bióticas y/o abióticas. Para obtener estas plantas con transgenes “apilados”, otros transgenes también se pueden introducir en los transformantes DEG o los transformantes DEG se pueden transformar después con uno o más de otros genes o, como alternativa, se pueden usar varios genes quiméricos para transformar una línea o variedad vegetal. Por ejemplo, varios genes quiméricos pueden estar presentes en un único vector o pueden estar presentes en diferentes vectores que se han co-transformado. Eventos únicos que contienen uno o más genes deg se pueden cultivar con otros eventos que contienen uno o más de otros genes deg para obtener un evento apilado con varios genes deg.

En una realización, los siguientes genes se combinan con uno o más genes deg de acuerdo con la invención: genes conocidos de resistencia a la enfermedad, especialmente genes que confieren una resistencia potenciada a patógenos necrotóficos, genes de resistencia a virus, genes de resistencia a insectos, genes de resistencia a estrés abiótico (p. ej., tolerancia a la sequedad, tolerancia a la sal, tolerancia al calor o al frío etc.), genes de resistencia a herbicidas y similares. Por tanto, los transformantes apilados pueden tener una tolerancia al estrés biótico y/o abiótico todavía más amplia, resistencia a patógenos, resistencia a insectos, resistencia a nematodos, salinidad, estrés por frío, estrés por calor, estrés por agua, etc., Asimismo, los enfoques de silenciación de deg se pueden combinar con enfoques de expresión de deg en una única planta, Por ejemplo, la sobreexpresión de deg en rizomas

o vástagos puede conferir o potenciar la resistencia del rizoma o el vástago a los patógenos del suelo, los patógenos vasculares o los patógenos de las hojas.

También es posible la introducción o introgresión de genes deg en una línea de cultivo de planta que ya tiene un cierto nivel de resistencia a enfermedad. Para la durabilidad de la resistencia a una enfermedad en el campo, puede ser deseable apilar varios mecanismos de resistencia a enfermedad en una planta, preferentemente de modo que las fuentes de resistencia tengan diferentes mecanismos moleculares subyacentes.

El presente documento abarca plantas enteras, semillas, células, tejidos y progenie (tal como híbridos F1, semillas/plantas F2 etc.) de cualquiera de las plantas transformadas descritas en lo que antecede y se pueden identificar mediante la presencia del transgén en el ADN, por ejemplo mediante análisis de PCR usando el ADN genómico total como molde y usando los pares de cebadores para PCR específicos de deg. Asimismo se pueden desarrollar procedimientos diagnósticos de PCR “específicos de evento”, en los que los cebadores para PCR se basan en el ADN de la planta que flanquea al gen quimérico insertado, véase la patente de EE.UU. Nº 6,563,026. De un modo similar, se pueden desarrollar huellas de AFLP o fuellas de RFLP específicas de evento que identifiquen la planta transgénica o cualquier planta, semilla, tejido o célula derivada de las mismas.

Se entiende que las plantas transgénicas de acuerdo con la invención preferentemente no muestran fenotipos no deseados, tales como reducción del rendimiento, mayor susceptibilidad a enfermedades (especialmente a necrrotrofos) o cambios de la arquitectura no deseados (enanismo, deformaciones) etc. y que, si dichos fenotipos se ven en los transformantes primarios, estos se pueden eliminar mediante procedimientos de cultivo y selección normales (cruzamiento/retrocruzamiento/autopolinización etc.). Cualquiera de las plantas transgénicas descritas en el presente documento puede ser homocigota o hemicigota para el transgén.

A continuación se presentan ejemplos específicos de procedimientos para obtener genes deg, así como procedimientos para introducir el gen Diana en un cítrico para producir transformantes de la planta. Ejemplos relacionados con genes deg que ya no están cubiertos por las reivindicaciones se presentan con fines ilustrativos

Ejemplo 1

Identificación de los genes deg de cítricos

En plantas de naranjo dulce se inoculó mediante infiltración una suspensión bacteriana de 108 UFC/ml de Xanthomonas axonopodis pv citri, agente causal del chancro de los cítricos. En un experimento paralelo, se inoculó en hojas de la misma variedad una suspensión bacteriana de 108 UFC/ml de Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii conocida por provocar un HR en plantas de naranjo dulce. Se construyó un total de cuatro bibliotecas de ADNc de tejido de la hoja a las 0, 12, 24 y 48 horas de la exposición a dichas cepas bacterianas. Se produjo un total de 3.000 secuencias para cada biblioteca y los grupos se montaron usando el software CAP3 (Huang, X. and Madan, A. (1999) CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome Res., 9, 868-877). La supuesta identidad de cada secuencia grupo se determinó mediante comparación con bases de datos públicas usando el algoritmo BLAST (Altschul y col., 1997, Nucleic Acid Res. 25:3389-3402).

La expresión diferencial se determinó calculando la abundancia relativa de EST de un grupo concreto en cada una de las bibliotecas construidas (Steckel y Falciani, 2000, Genome Research 10:2055-2061). La probabilidad de que esta expresión diferencial no se deba a un evento aleatorio se confirmó mediante pruebas estadísticas (Steckel y Falciani, 2000, Genome Research 10:2055-2061).

La comparación de los perfiles de expresión de un gran número de genes identificados en este estudio indicó que, en condiciones de resistencia a enfermedad (HR) varios genes exhibían niveles de expresión significativamente más altos en comparación con el tejido enfermo (Figura 1). Entre ellos se escogió un total de 13 genes (SEC ID Nº 1-13) como posibles candidatos para conferir resistencia a la enfermedad en plantas cítricas (Figura 2).

Ejemplo 2

Construcción del vector

El ORF (marco de lectura abierto) de cada gen candidato (SEC ID Nº 1-13) se amplificó mediante PCR usando cebadores específicos para el extremo 5’ y el extremo 3’ de cada gen. La secuencia de cada cebador se modificó de modo que incluyera las secuencias específicas requeridas por el sistema de clonación GATEWAY ™ (Invitrogen). Los productos de la amplificación se clonaron primero en el vector pENTR/TEV/D-TOPO® (Invitrogen) mediante recombinación y su secuencia se confirmó mediante repetición de la secuenciación de todo el inserto. Después de confirmar la secuencia, los genes candidatos se transfirieron al plásmido pAH35GW mediante recombinación, lo que tuvo como resultado la construcción genérica pr35S(2x)-CaMV::ahas::35SpolyA | pr35S-CaMV::deg::NOSpolyA (Figura 3). La secuencia de las construcciones resultantes se confirmó mediante repetición de la secuenciación de toda la región de TADN. Los vectores completamente validados se usaron para transformar los cítricos.

Ejemplo 3

Transformación de cítricos

Semillas de plantas de naranjo dulce cv. Pineapple se germinaron en ausencia de luz durante 30 días. Los epicotiledones de la plántula etiolada se cortaron e infectaron con Agrobacterium tumefasciens portador de cada uno de los genes candidatos (SEC ID Nº 1-13) en una construcción. Aproximadamente 40 días después de la transformación, las plantas regeneradas se individualizaron y se injertaron por arriba en plántulas de rizoma. Las plantas injertadas permanecieron en condiciones de laboratorio durante aproximadamente 2 meses, tras lo cual se transfirieron a condiciones de invernadero. Antes de iniciar el periodo de aclimatación, se volvió a injertar las plantas sobre plantas de rizomas bien desarrolladas cultivadas en condiciones de invernadero. Se dejó que la aclimatación y el desarrollo del vástago durara 70 días, periodo tras el cual se transfirieron a bloques de plantas madre.

Ejemplo 4

Resistencia potenciada a la enfermedad en plantas cítricas portadoras de las construcciones pr35SCaMV::deg::NOSpolyA

Para evaluar el efecto del incremento de la expresión de genes deg en plantas de cítricos transgénicas se desprendió un total de 5 hojas de cada uno de los 25 eventos transgénicos independientes para cada una de las construcciones transformadas en plantas de cítricos y 3 plantas silvestres no transgénicas de la variedad de naranjo dulce "Pineapple". En resumen, cada hoja se perforó 6 veces usando una aguja y cada agujero se puso inmediatamente en contacto con 5 ml de una suspensión bacteriana de 106 UFC/ml. Las hojas inoculadas se incubaron en cámaras de humedad individuales y se evaluaron a diario durante 15 días. Las lesiones de chancro se puntuaron usando una escala de diagrama de propiedad exclusiva (Figura 4). El análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba de Dunnet para la comparación media de todas las determinaciones se realizaron con el paquete de software R versión 2.6.2.

Durante el curso de los experimentos, varios eventos pr35S-CaMV::deg::NOSpoylA exhibieron un menor desarrollo de chancro en comparación con las hojas control. Tras 15 días de incubación, los resultados indicaron que algunos de los eventos transgénicos exhibían una reducción significativa de la gravedad de los síntomas de chancro en comparación con las plantas control (Figura 5). En conjunto, la sobreexpresión de los genes deg parece causar varios grados de cambios en el sistema de defensa de la planta que conducen a un incremento de la resistencia a la enfermedad.

Ejemplo 5

Tasa de crecimiento diferencial de la bacteria del chancro de los cítricos en plantas cítricas portadoras de las construcciones pr35S-CaMV::deg::NospolyA

Con el fin de determinar el efecto directo de la expresión de genes deg en plantas de cítricos transgénicas sobre el crecimiento de poblaciones bacterianas se desprendió un total de 3 hojas de los mejores eventos transgénicos identificados mediante el ensayo in Vitro descrito en lo que antecede y de 3 plantas silvestres no transgénicas de la variedad de naranjo dulce "Pineapple". En resumen, cada hoja se perforó 6 veces usando una aguja y cada agujero se puso inmediatamente en contacto con 5 ml de una suspensión bacteriana de 105 UFC/ml. Las hojas inoculadas se incubaron en cámaras de humedad individuales y se evaluaron a 0 y 5 días tras la inoculación. Para cada evaluación se cortaron 3 discos de hojas de aproximadamente 1 cm2 directamente de 3 sitios de inoculación. Cada disco individual se molió en nitrógeno líquido y se usó para la extracción de ADN total usando el kit Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega). El ADN de cada extracción individual se usó para enumerar las bacterias

usando PCRc (Cubero & Graham, 2005, Phytopathology 95: 1333-1340). La tasa de crecimiento bacteriano se calculó comparando las poblaciones bacterianas a los 0 y 5 fías de la inoculación. El análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba de Dunnet para la comparación media de todas las determinaciones se realizaron con el paquete de software R versión 2.6.2.

Los resultados indicaron una reducción significativa de la tasa de crecimiento de la bacteria del chancro de los cítricos cuando los genes deg se sobreexpresaron en tejido cítrico (Figura 6). Estos resultados también confirmaron las observaciones realizadas para los mismos eventos sobre la reducción significativa de la gravedad de la enfermedad (Figuras 5 y 6).

Ejemplo 6

Niveles de expresión de transgenes en determinados eventos portadores de las construcciones pr35SCaMV::deg::NOSpolyA

Con el fin de examinar la correlación entre el nivel de expresión de los transgenes y la respuesta de diferentes eventos al patógeno del chancro de los cítricos se seleccionó un grupo de eventos transgénicos para cuantificar los niveles de tránscritos usando RT-PCRc. En resumen, se extrajo el ARN total de hojas de cítrico joven usando el SV Total RNA Isolation System (Promega, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc de la primera hebra se generó mediante transcripción inversa de 1 μg de ARN total por muestra con el cebador Oligo-dT usando el sistema ImProm-II™ Reverse Transcriptase System (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un volumen de reacción final de 20 μl. Para la RT-PCR se añadieron 5 μl del ADNc a 12,5 μl de SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para alcanzar un volumen de reacción final de 25 μl. La RT-PCR se realizó usando un sistema ABI PRISM® 7000 System (Applied Biosystems). El protocolo de la PCR consistió en: Inicio en 1 ciclo a 50 ºC durante 2 minutos y 1 ciclo a 95 ºC durante 10 minutos, seguido de amplificación durante 45 ciclos a 95 ºC durante 15 segundos y a 60 ºC durante 1 minuto. Los datos de CT se recogieron mediante ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). En cada muestra de hoja se analizó cada gen un mínimo de dos veces distintas.

Los resultados indicaron una variación significativa del nivel de expresión de los transgenes entre los eventos seleccionados. No obstante, se observó una correlación significativa entre el nivel de expresión de un transgén dado (Figura 7) y la capacidad del correspondiente evento para limitar la tasa de crecimiento de la bacteria (Figura 6) que, en consecuencia, reducía a gravedad de las lesiones de chancro (Figura 5).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110>

<120> Procedimiento para aumentar la resistencia a enfermedades en las plantas

<140>

<141>

<210> 1

<211> 378

<212> ADN

<213> Citrus sinensis

<400> 1

<210> 14

<211> 125

<212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 14

<210> 2

<211> 1008

<212> ADN

<213> Citrus sinensis

10 <400> 2

<210> 15

<211> 335

<212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 15

<210> 3

<211> 267

<212> ADN

<213> Citrus sinensis

<400> 3

<210> 16

<211> 88

<212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 16

<210> 4

<211> 1080

<212>

ADN 15 <213> Citrus sinensis

<400> 4

<210> 5

<211> 1014

<212> ADN

<213> Citrus sinensis

<400> 5

<210> 17

<211> 337

<212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 17

<210> 6

<211> 1029

<212> ADN

<213> Citrus sinensis

<400> 6

<210> 18

<211> 342

<212>

PRT 10 <213> Citrus sinensis

<400> 18

<210> 7

<211> 690

<212> AND

<213> Citrus sinensis

<400> 7

<210> 19

<211> 230

<212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 19

<210> 8

<211> 486

<212> ADN

<213> Citrus sinensis

<400> 8

<210> 20

<211> 161

<212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 20

<210> 21 10 <211> 304

<212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 21

<210> 9

<211> 762

<212> ADN

<213> Citrus sinensis

<400> 9

<210> 22

<211> 253

<212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 22

<210> 12

<211> 253

<212> ADN

<213> Citrus sinensis

<400> 12

<210> 23

<211> 248

<212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 23

<210> 11

<211> 1650

<212> ADN

<213> Citrus sinensis

<400> 11

<210> 24

<211> 549

<212> PRT

<213> Citrus sinensis c

<400> 24

<210> 12

<211> 375

<212> ADN

<213> Citrus sinensis

<400> 12

<210> 25

<211> 124 10 <212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 25

<210> 13

<211>

<212> AND

<213> Citrus sinensis

<400> 13

<210> 26

<211> 433

<212> PRT

<213> Citrus sinensis

<400> 26

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una construcción que comprende (i) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 y (ii) un promotor que funciona en plantas, en las que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente al promotor de modo que este último expresa una secuencia polipeptídica expuesta en la SEC ID Nº: 14.

2. 2.

   La construcción de la reivindicación 1, en la que el promotor se selecciona de un promotor 35S del CaMv, un promotor de la poliubiquitina, un promotor específico de tejido y un promotor preferido de tejido.

3. 3.

   Una célula vegetal que comprende la construcción de la reivindicación 1.

4. 4.

   Un procedimiento para aumentar la resistencia a la enfermedad del chancro de los cítricos en una planta o célula, que comprende sobreexpresar la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 1.

5. 5.

   Un procedimiento para aumentar la resistencia a la enfermedad del chancro de los cítricos en una planta o célula, que comprende

   (a)

   transformar una planta o célula con una construcción que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1, unida operativamente a un promotor activo en células vegetales.

   (b)

   regenerar una planta a partir de dicha célula o planta transformada;

   (c)

   seleccionar una planta o célula que tiene una resistencia incrementada a la enfermedad del chancro de los cítricos respecto a una planta control.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el promotor es un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el promotor específico de tejido es un promotor específico del xilema, un promotor específico del floema o un promotor específico del xilema/floema.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el promotor está unido operativamente a un potenciador.

9. 9.

   El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la planta es un miembro de la familia Rutaceae.

10. 10.

    El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha planta se selecciona de los géneros Citrus, Poncirus, Fortunella, Murraya, Microcitrus, Limonia y Eremocitrus.

11. 11.

    Una planta transgénica o una progenie, fruto o semilla de la misma, teniendo dicha planta, progenie, fruto o semilla incorporada en su genoma

    (i)

    una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de resistencia a la enfermedad expuesto en la SEC ID Nº: 14, y

    (ii)

    un promotor que funciona en plantas y que está operativamente unido a la secuencia de nucleótidos, en el que dicha planta sobreexpresa el polipéptido de resistencia a la enfermedad.

12. 12.

    La planta transgénica de la reivindicación 11, en la que la secuencia de nucleótidos es la expuesta en la SEC ID Nº 1.

13. 13.

    La planta transgénica de la reivindicación 11, que tiene además incorporada en su genoma (iii) una secuencia potenciadora que se condensa con el promotor.

14. 14.

    La planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que el promotor se selecciona de un promotor 35S del CaMv, un promotor de la poliubiquitina, un promotor específico de tejido y un promotor preferido de tejido.