NL8502948A

NL8502948A - Werkwijze voor het inbouwen van "vreemd dna" in het genoom van dicotyle planten.

Info

Publication number: NL8502948A
Application number: NL8502948A
Authority: NL
Original assignee: Rijksuniversiteit Leiden En Pr
Priority date: 1985-10-29
Filing date: 1985-10-29
Publication date: 1987-05-18
Also published as: JPS62181788A; EP0224287A1

Description

.' ! % a* >| 'i

Werkwijze voor het inbouwen van "vreemd DNA" in het genoom van dicotyle planten.

De uitvinding betreft een werkwijze voor het langs kunstmatige weg inbouwen van DNA c.q. genen in het genoom van dicotyle planten. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een overdrachtssysteem dat van nature aanwezig is in de 5 bodembacterie Agrobacterium tumefaciens en Agrobacterium rhizogenes. In deze bacteriën zijn resp. aanwezig een tumor-inducerend of Ti-plasmide en een wortel-inducerend of Ri-plasmide. Via het overdrachts-systeem wordt door de bacteriën een bepaald deel van het Ti- of Ri-plasmide in plantecellen 10 ingebracht waarna vervolgens dit zgn. T-gebied van het plas- mide in het plantegenoom stabiel wordt ingebouwd en tot expressie komt. Uitgaande van dit natuurlijke proces is een twee-componenten systeem ontwikkeld gebaseerd op voor de overdracht en integratie van DNA essentiele delen van dit soort plasmiden.

15 Met dit zgn. "binaire vectorsysteem", indien aanwezig in daartoe geschikte of geschiktgemaakte bacteriën, kan elk soort DNA worden geïncorporeerd in het genoom van plantecellen. Het "binaire vectorsysteem" bestaat uit twee componenten: 1) het virulentiegebied van het Ti plasmide dat genen bevat die 20 betrokken zijn bij de overdracht van het T-gebied naar de plantecel 2) het intacte wild-type T-gebied of een kunstmatig in vitro samengesteld T-gebied, waarin een DNA naar keuze is gelegen tussen zgn. "border-sequenties". Deze border-sequenties zijn essentieel voor de overdracht en daaropvolgende integratie 25 van het T-gebied in het plantengenoom. In het oorspronkelijke systeem zoals dat beschreven staat in de Nederlandse octrooiaanvrage 83.00698 en de Europese octrooiaanvrage 84200239.6 zijn beide componenten aanwezig in Agrobacterium stammen als los van het chromosoom replicerende en naast elkaar voorbe-30 staande (compatibele) eenheden (plasmiden). Het gebruik van dergelijke Agrobacteria voor de genetische manipulatie van ", /, *

v J » ïy -Z

·-» - 2 - eenzaadlobbige planten is beschreven in de Nederlandse octrooiaanvrage nr.84.01048 en de Europes octrooiaanvrage 8400792.4. In een uitbreiding van het "binair vectorsysteem" is vastgelegd dat het voor z’n toepassing niet essentieel 5 is dat beide componenten in de vorm van plasmiden aanwezig zijn in Agrobacterium (Nederlandse octrooiaanvrage 84.01780). Ook wanneer het T-gebied en/of het virulentiegebied aanwezig zijn in het chromosoom van Agrobacterium, worden zulke T-gebieden overgedragen naar de plantecel. In de hier voorlig-10 gende octrooiaanvrage wordt de nieuwe vinding beschreven dat niet alleen Agrobacteriumstammen, die zijn uitgerust met een binair vectorsysteem, in staat zijn tot overdracht van DNA naar de plant. Het systeem functioneert ook indien het wordt gebruikt in andere bacteriesoorten die van nature of kunst-15 matig zijn voorzien van al die genen die nodig zijn voor de interactie met de plantecel en de daarop volgende overdracht van het T-gebied. Dit wordt gedemonstreerd aan de hand van het gebruik van de bacteriesoort Rhizobium.

Het Ti-plasmide van Agrobacterium tumefaciens 20 is verantwoordelijk voor het vermogen van deze bacteriën om tumoren te veroorzaken op dicotyle planten. (Van Larebeke et al., Nature (Londen) 252, 169-170 (1974); Zaenen et al., J.Mol Biol. 86, 109-1-27 (1974). De tumoren ontstaan door de overdracht van een specifiek deel van het Ti plasmide (het T-25 gebied) naar de plantecel, de integratie van dit T-gebied in het kern-DNA van de cel en het aldaar tot expressie komen van op dit T-gebied gelegen genen, (Ghilton et al., Cell II, 263-271 (1977); Willmitzer et al. Mol. Gen. Genet. 182, 255-261 (1981)). De one genen die gelegen zijn op het T-DNA 30 coderen voor enzymen die betrokken zijn bij de biosynthese van de plantenhormonen auxine en cytokinine (Schroder et al., Eur. J. Biochem. 138, 387-391 (1984) Akijoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81, 5994-5998 (1984), waardoor de getransformeerde cellen, dit in tegenstelling tot normale cellen, -r: · . '· ·> ! 'W -j/ .. _= 'j ζ) if-1......Iljwiie - 3 - gekweekt kunnen worden op synthetische groeimedia zonder toevoeging van deze hormonen (Braun et al., Proc.Natl. Acad.

Sci USA 44, 344-349 (1958) en zich gedragen als tumorcellen.

Naast . het T-gebied dat in de plantecel wordt teruggevonden 5 is nog een tweede gebied essentieel voor de virulente eigenschappen van de bacterie(Ooms et al., J. Bacteriol.144, 82-91 (1980 Garfinkel et al., J. Bacterial 144, 732-743 (1980)).

Mutatie van het virulentiegebied leverde een zevental vir-loci op, genaamd vir A, B, C, D, E, F en O (Klee et al., J.Bacte-10 riol 153, 878-883 (1983); Hille et al., Plasmid 7, 107-118 (1982); Hooykaas et al., Plasmid 11, 195-205 (1984)). Mutaties in deze loei kunnen allen in trans gecomplementeerd worden door wild-type genetische informatie (Hille et al.. Plasmid 7, 107-118 (1982); Hille et al., J. Bacteriol. 158, 754-756 15 (1984); Klee et al., J Bacteriol. 150, 327-331 (1982)).

Sommige van de vir genen lijken voor uitscheidbare producten te coderen (Otten et al.. Mol. Gen. Genet., 195, 159-163 (1984) ). Behalve plasmide genen zijn er ook genen op het chromosoom van Agrobacterium aanwezig die nodig zijn voor de 20 virulentie van de bacteriën (Douglas et al., J. Bacteriol.

152, 1265-1275 (1982)).

Al vroeg is onderkend dat dit natuurlijke systeem van genetische manipulatie van plantecellen door Agrobacterium gebruikt kan worden can vreemd DNA met het 25 T-gebied mee de plant binnen te krijgen waardoor planten met geheel nieuwe eigenschappen verkregen zouden kunnen worden (o.a. Schilperoort in Genetic Manipulations with plant material " Ed. L. Ledouse, Plenum Publishing Corporation, 141-162 (1975). De volgende recente gegevens over het mole-30 culaire mechanisme waarmee het natuurlijk proces van tumor-indüctié verloopt hebben ertoe bijgedragen dat het Agrobacterium systeem nu inderdaad praktisch toepasbaar is voor de genetische manipulatie van plantecellen en het regenereren van volwassen, gezonde planten met nieuwe eigenschappen.

v , -L .J ' ö - 4 - 1.DNA naar keuze dat in het T-gebied wordt geinsereerd wordt met het T-gebied mee overgedragen naar de plantecel en kan intact worden teruggevonden in het genoom (Hernalsteens et al./ Nature (Londen) 287/ 654-656 (1980)).

5 2 Verwijdering van in het T-gebied aanwezige genen (waaronder de one genen) hebben geen effect op de overdracht van het T-gebied zodat nu bij afwezigheid van de onc-genen in het T-gëbied intacte, fertiele planten uit getransformeerde plantecellen kunnen worden geregenereerd 10 Leemans et al./ EMBO. J. 1, 147-152 (1982); Hille et al.,

Plant mol. Biol, 2, 155-163 (1983)).

3, Het virulentiegebied en een T-gebied kunnen tijdelijk of permanent fysisch van elkaar worden gescheiden zonder dat daardoor het vermogen tot tumorinductie 15 of overdracht van een artificieel T-gebied wordt aangetast. (Hoekema et al.. Nature (London) 303, 179-180 (1983); de Framond et al.. Biotechnology 1, 262-260 (1983); Nederlandse octrooiaanvrage 83.00698; Europese octrooiaanvrage 84200239.6).

4. Zowel het virulentiegebied als het wild-20 type T-gebied of artificieel T-gebied kunnen afzonderlijk of gezamenlijk geïntegreerd in het chromosoom van Agrobacterium worden aangebracht zonder dat het vermogen tot overdracht van zulke T-gebieden naar de plantecel wordt aangetast (Hoekema et al., EMBO J. 3, 2485-2490 (1984); Nederlandse 25 octrooiaanvrage nr.:84.01780).

Tot nu toe zijn de systemen voor overdracht van DNA naar keuze gebruikt met Agrobacterium als gastheer Om verschillende redenen, waaronder bijvoorbeeld uitbreiding van selectie mogelijkheden en of gastheerbereik, is het van 30 praktisch nut ook andere bacteriele gastheren te kunnen gebruiken voor het overdragen van DNA naar de plantecel.

Bacteriën van het geslacht Rhizobium verkrijgen na introductie van het Ti plasmide het vermogen om tumoren te induceren op tweezaadlobbige planten (Hooykaas et al., J. Gen. Microbiol.

"* ’ -** f\ Λ ’ ï '} - 8 - 5 - 98. 477-484 (1977)). Zij bevatten derhalve evenals Agrobac-terium, die chromosomale genen die nodig zijn voor de virulentie van de bacteriën. In de onderhavige octrooiaanvrage worden experimenten beschreven die aantonen dat van het .Ti plasmide 5 afgeleide systemen voor de introductie van vreemd DNA in de plantecel van dicotylen(met name het binaire vectorsysteem) die werkzaam zijn in Agrobacterium ook kunnen worden gebruikt in Rhizobium. Van de diverse door ons eerder beschreven mogelijkheden voor het gebruik van een binair vector systeem worden hier de resultaten gegeven voor een systeem waarbij T gebied in het Rhizobium chromosoom is aangebracht en het Vir-gebied op een plasmide aanwezig is.

Experimenten.

25 Om aan te tonen dat het binaire vectorsysteem ook in Rhizobium functioneert is het wild-type T-gebied van het Ti-plasmide in z'n geheel geinsereerd in het chromosomale DNA van Rhizobium trifolii (LPR5045). De gevolgde benadering is schematisch weergegeven in fig. 1. Als eerste stap werden 2o m.b.v. een zgn. "shot-gun" clonering EcoRI restrictiefragmen-ten afkomstig uit het chromosoom van LPR5045 gedoneerd in de E.coli vector pACYC184. Van de verkregen clonen werd een isolaat met een insertie van 5,4 kbp chromosomaal DNA geselecteerd voor verdere experimenten. Dit plasmide werd pRAL3307 25 genoemd. Op dit plasmide werd het T-gebied van het Ti plasmid geïntroduceerd door tanspositie van Tnl882, een van Tn3 afgeleid transposon waarin het gehele T-gebied is gedoneerd Zie figuur IA, B. Voor de constructie van Tnl882 zij verwezen naar Hoekema et al., EMBO J. 3, 2485-2490 (1984). Het aldus 30 verkregen plasmide pRAL3947 bevatte Tnl882 geinsereerd in het Rhizobium chromosomale DNA van pRAL3307. Met behulp van een helper plasmide pRK2013 (Figurski et al., Proc. Natl. Acad.

Sci . USA, 76,1648-1652 (1979)) werd pRAL3947 geïntroduceerd in Rhizobium trifolii (stam LPR5045)(fig.1 D).Plasmide pRAL3947 w » _* ym —* y * •j *v - 6 - kan zich niet handhaven in Rhizobium en gaat verloren tenzij homologe recombinatie optreedt via het 5,4 kbp EcoRI fragment aanwezig op de vector en het chromosoom van LPR5045 waar dit fragment uit afkomstig is. De resulterende Rhizobium trifolii 5 stam is LPR5086 genoemd. DNA hybridisatie studies toonden aan dat in deze stam het T-gebied intact aanwezig is en stabiel gehandhaafd blijft. Deze stam bevat nog niet de virulentie genen van het Ti plasmide en is derhalve nog avirulent. Dit virulentiegebied werd ingebracht door het plasmide pALl818, 10 waarop de vir genen A t/m E en 0 aanwezig zijn (Hille et al. Plasmid 7, 107-118 (1982) via conjugatie uit LBA1818 over te brengen naar LPR5086. (Fig. 1D) De aldus verkregen stam LPR5087 bevat beide componenten van het binaire vectorsysteem en werd getest op zijn vermogen om tumoren te induceren. LPR5087 is 15 getest op een aantal plantesoorten (zoals erwt, tomaat, tabak) en bleek op al deze planten virulent. Hiermee is aangetoond dat het binaire vectorsysteem (als beschreven in de Nederlandse octrooiaanvragen 83.00698 en 84.01780) ook in Rhizobiumbacterien kan worden gebruikt. LPR5Ö87 is gedeponeerd bij het Centraal 20:_ bureau voor Schimmelcultures (CBS) in Baarn, Holland onder no. op 25 oktober 1985.

'Vifi

>ƒ r» V

Claims

4S-' CQHcloSIES
1. Werkwijze voor het inbouwen van vreemd DNA in het genoom van planten, door deze planten te infecteren, of de planteprotoplasten te incuberen met daartoe geschikte of geschikt gemaakte bacteriën, met het kenmerk, dat men 5 dicotyle planten infecteert of dicotyle planteprotoplasten incubeert met daartoe geschikte of geschikt gemaakte bacteriën, die voorzien zijn van één of meer tumor-inducerende plasmiden of afgeleiden daarvan, oorspronkelijk afkomstig uit Agrobacterium, of uit bacteriën die het T-DNA, afkomstig uit 10 bovenbedoelde plasmides, en/of de virulentiegenen, afkomstig uit bovengenoemde plasmides, elders in het bacterieel DNA ingebouwd bezitten.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men voor de infektie of incubatie gebruik maakt 15 van Rhizobium bacteriën.
3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men bacteriën toepast die voorzien zijn van één of meer Ti- of Ri-plasmiden of afgeleiden daarvan.
4. Werkwijze volgens conclusie 3 met het 20 kenmerk, dat men de gebruikte bacteriën heeft voorzien van een stabiel cointegraat plasmide, opgebouwd uit een plasmide R772 en een plasmide pTiBö met vreemd DNA ingebouwd in het T-gebied vanhet laatste.
5. Werkwijze volgens een der voorgaande 25 conclusies, met het kenmerk, dat men bacteriën gebruikt, welke tenminste één plasmide, dat het Vir-gebied van een tumor-inducerend plasmide maar geen T-gebied heeft, en tenminste één ander plasmide, dat een T-gebied met daarin ingebouwd vreemd DNA maar geen Vir-gebied heeft, bevatten.
6. Dicotyle planten en plantecellen verkregen nadat onder toepassing van de werkwijze volgens een der voorgaande conclusies de genetische eigenschappen van de oorspronkelijke planten c.q. plantecellen zijn gewijzigd. -8 -
7. Werkwijze voor de bereiding van chemische en/of farmaceutische produkten, met het kenmerk, dat onder toepassing van de werkwijze volgens een der conclusies 1-5 verkregen cellen worden gekweekt en de gewenste stof wordt 5 geïsoleerd.
8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het kweken door middel van fermentatie en eventueel daarop volgens immobilisatie wordt uitgevoerd.
9. Werkwijze volgens een der conclusies 1 t/m 10 5, of 8 met het kenmerk, dat de regulatorgebieden gelegen vóór en achter de eiwitcoderende gebieden van T-DNA-genen in het bijzonder de genen voor octopine synthese en nopaline synthese voor het tot expressie brengen van vreemde genen in dicotyle plantecellen gebruikt worden. 15 10" Dicotyl DNA met een gedeelte dat kunstmatig erin geinseerd is met de werkwijze volgens een der voorgaande conclusies.
11. Cellijnen en geregenereerde planten, die zijn verkregen na toepassing van de werkwijze volgens één 20 der conclusies 1-9.
12. Rhizobium trifolii LPR 5087 en mutanten daarvan. ·. λ -λ a ; ^ j t~» k'J Q