JPS6070081A - 双子葉植物の染色体への外来性遺伝子の導入方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） この発明は、１又は複数のＴｉ　（腫瘍誘発）ゲラ植物
に感染せしめることによシ、又は植物細胞を該細菌と共
にインキ−ベートすることにより、外来性ＤＮＡを双子
葉植物のケソムに組み込む方法に関する。

（発明の背景） 細菌が双子葉植物にいわゆる「クラウン・コゝ−ル（Ｃ
ｒｏｕｎ　ｇａｌｌ　）　Ｊ腫瘍の形成を惹起するのに
必須であることが知られている（　Ｖａｎ　Ｌａｒｅｂ
ｅｋｅ等＼Ｎａｔｕｒｅ（０ンドｙ）２５２．１６９〜
１７０　（１９７４）ｉＷａｔｓｏｎ等、Ｊ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ　、　１２３．２５５＝：２６．４（１９
７５）　；　Ｚａｅｎｅｎ等、Ｊ　、　Ｍｏｌ　、８６
．１０！１ｌ−１２７（１９７４））。このプラスミド
のＴ−領域と称される部分は、腫瘍誘発の間に、Ｔ　−
ＤＮＡとして植物ｒツム（染色体ＤＮＡ　）に組み込ま
れ（Ｃｈｉｌｔｏｎ等、Ｃｅ１ｌｌｌ、２６３〜２６１
　（１９７７）；Ｃｈｉｌｔｏｎ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、７７．４０
６０〜４０６４　（１９８，０）　；　Ｔｈｏｍａｓｈ
ｏｗ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ　、Ｓｃ１．
　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７７．６４４８〜６４５２（１９８０
）　；　Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ（ロン
ドン）２８７．２５９〜３６１（１９８０））、そして
種々のＲＮＡ転写において発現される（　Ｐｒｕｒｒｍ
ｏｎｄ等、Ｎａｔｕｒｅ　（ｏンドン）２６９．５３５
〜５３６（１９７７）　；Ｌｅｄｅｂｏｅｒ、　Ｔｈｅ
ｓｉｓＳｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｅ
ｙｄｅｎ　（１９７８）　；Ｇｕｒｌｅｙ等、Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ、　Ａｃｏｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　
７６．２８２８〜２８３２　（１９７９）　；Ｗｉｌｌ
ｍｉｔｚｅｒ等、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　
１８２．２５５〜２６２（１９８１））。この腫瘍細胞
は植物ホルモン非依存性増殖を示し、そしてオパイン（
ｏｐｉｎｅ　）として知られている１種類又は複数棟類
の普通でないアミノ酸誘導体を含有し、この内オクトビ
ン（ｏｃｔｏｐｉｎｅ　）及びツノやリン（ｎｏｐａｌ
ｉｎｅ　）が最もよく知られている。オクトビンＴｉプ
ラスミド由来のＴ　−ＤＮＡは酵素リンビンデヒドロデ
ナーゼ（１ｙｓｏｐｌｎｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓ
　（ＬｐＤＨ）又はオクトビンシンサーゼ（ｏｃｔｏｐ
ｉｎｅ　５ｙｕｔｈａｓｅ）（ＯＣ８）についてコード
する遺伝子を担持しており、この酵素は腫瘍細胞がオク
トビンを合成するために必須である（　５ｃｈｒｏｅｄ
ｅｒ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｌ、　１２９．１６６〜１６
８（１９８１）〕。さらに、このプゲラミドは、細菌に
よるこれらのオパインの分解的代謝のための遺伝子を含
有する（　Ｂｏｍｈｏｆｆ等、Ｍｏ　１　。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１４５．１７７〜１８１（１
９７６）；Ｍｏｎｔｏｙａ等、Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、　１２９．１０１〜１０７（１９７７））。シラ
スミドのＴ−領域が欠失している場合、腫瘍は誘発され
ない［Ｋｏｅｋｍａｎ等、Ｐｌａｓｍｉｄ　２．３４７
〜３５７（１９７′９）］。Ｔ−領域のほかに、Ｔｌシ
ラスミドの他の領域が細菌の腫瘍誘発能のために必須の
ようでおる ［　Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ等、Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、　１４４．７３２〜７４３　（１９８０）　；　Ｏ
ｏｍｓ等、Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１４４．８２〜９１（１９８０））が、この部分は植物
腫瘍細胞中にまだ見出されていない。約２０Ｍｄのサイ
ズを有するこの領域〔ここでの変異はトランス的に（ｉ
ｎ　ｔｒａｎｓ　）相補的である〕はｖｉｒ（ｖｉｒｕ
ｌｅｎｃｅ　）領域と称される［Ｈｉｌｌｅ等、Ｐｌａ
ｓｍｌｄ　６．１５１〜１５４（１９８１）；１Ｈｉｌ
ｌｅ寺、Ｐｌａｓｍｉｄ　７．１０７〜１１８（１９８
２）ｉＫｌｅｅ等、Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１
５０．３２７〜３３１　（１９８２）〕。

上記のことから、原核性細菌尤、ツメファシエイ乙が天
然に存在する真核性植物の遺伝的操作のための系を有す
ることが明らかであろう。ＴＩ７’ラスミドのＴ　−Ｄ
ＮＡ領域は、外来性ＤＮＡ、特に特定の望ましい性質に
ついてコードする遺伝子を植物細胞のゲノムに組み込む
ために適当であり、さらに原理的には、新遺伝子の導入
を同時的に遮断することなく腫瘍の原因である遺伝子を
除去することが可能である。第１の可能性は、Ｔ−領域
が希望通ｐに操作されているＴ１プラスミドを１又は複
数含有するＡ、ツメファシェンス細菌を植物に感染せし
めることである。植物プロトゲラストを前記のＡ、ツメ
ファシェンス細菌と共にインキュベートするのが一層好
ましい。実際的な理由によ広組換ＤＮＡ技法によるＴ−
領域への新遺伝子の導入はエセリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　）において行うのが好まし
い。しかしながら、Ｔｉシラスミドは通常Ｎ””’１中
で維持されない（ＴｉプラスミドはＥ、コリ宿主中で複
製しない）。このたファシェンス中で複製するいわゆる
シャトルベクターが使用され、これにＴ−領域が導入さ
れる。

そして次にこのＴ−領域に新遺伝子が導入される。

しかしながら、Ａ、ツメファシェンスを介して細胞を形
質転換するためには完全なＴｉシラスミドが必要である
。この理由は、Ｔ　−ＤＮＡを選択しくおそらくＴ−領
域の末端の塩基配列を認識することによ、０）そして植
物に移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ　）する遺伝子を担持して
いる必須のｖｉｒ−領域をＴｉプラスミドが含有してい
るためである。

現行の方法においてはＴｉプラスミドはＥ、コリ中に維
持されないので、操作されたＴ−領域を有するシャトル
ベクターが、このシャトルベクターと共存し得る完全Ｔ
Ｉ７’ラスミドを含有する人、ツメファシェンスに移入
される。シャトルベクターはＴ　−ＤＮＡ部分を含有し
、この部分はＴｉシラスミドのＴ−領域中にも存在する
から、両Ｔ−領域の相性部分の間で二重乗換（ｄｏｕｂ
ｌｅｃｒｏｓｓｉｎｇ　−ｏｖｅｒ　）が生ずる。これ
により、無傷の（１ｎｔａｃｔ　）　Ｔｉ　プラスミド
のＴ−領域に新遺伝子が導入される。

Ｔｉシラスミドの部位特定変異（５ｉｔｅ　１ｏｃａ−
ｔｉｏｎ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　）の
方法がＬｅ　ｅｍａ　ｎ　ａ等、Ｔｈｅ　Ｅｍｂｏ　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　１．１４７〜１５２（１９８２）　ｉＭ
ａｔｚｋｅ等、Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ
ｅｔ。

１．３９〜４９（１９８１）に記載されている。これら
の技法の基礎となる一般的原理についてはＲｕｖｋｕｎ
等、Ｎａｔｕｒｅ　（ｏンドン）、２８９．８５〜８８
（１９８１）を参照のこと。Ｔｉプラスミド変異の最終
段階は常にアグロバクテリウムそれ自体において行われ
る。なぜなら、Ｔｉシラスミドの宿主範囲はりゾビアセ
−（Ｒｈ１ｚｏｂｉａｃｅａｅ）に限られているからで
ある。Ｅ、コリ中のＴｉシラスミドのクローン断片を、
例えばトランスポゾンの挿入によって変異せしめた後、
この変異を受けた断片を広い宿主範囲を有するベクター
上でサブクローニングし、そしてＴｉプラスミドを含有
するアグロバクテリウムの菌株に移入する。ここで、挿
入されたＤＮＡが、二重乗換を介する相同的組換によっ
てＴｉシラスミド中に導入され、この後、広い宿主範囲
を有するプラスミドが不和合シラスミドによｐ破壊され
、あるいはＴｉプラスミドが接合によシ他のアグロバク
テリウムに移送される。被接合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊ
ｕｇａｎｔ　）の試験により、Ｔｌプラスミドの正しい
変異が生じたか否かを点検する。

これらの公知の方法は面倒であシ、そして技術的な問題
点を有する。これらの問題点は、且、豆りにおいて直接
性いうるＴｉシラスミド自体の部位特定変異により回避
することができょう。しかしながら、ＴＩ７’ラスミド
はＥ、コリ中で機能し得る複製開始点を有しない。

この発明においては、Ｔｉシラスミド（ｐＴｉＢ６）と
広い宿主域を有する抗生物質耐性プラスミド（Ｒ７７２
）とから得られる安定な相互統合プラスミド（Ｃｏｉｎ
ｔｅｇｒａｔｅ　ｐｌａｓｍｌｄ　）を使用する。

Ｈｏｏｙｋａａｓ等、Ｐｌａｓｍｉｄ　４．６４〜７５
（１９８０）に記載されているように、相互統合プラス
ミドは、オクトピンＴ１プラスミドｐＴｉＢ６をＩｎｃ
、Ｐ−１型プラスミドＲ７７２により可動化（ｍｏｂｉ
ｌｉｓａｔｌｏｎ）することにより得られる。Ｒ７７２
成分の広宿主ことができるが、これらはほとんどの場合
不安定であシ、人、ツメファシェンスから見、　ｒ　Ｉ
Ｊ−への転移の間に分解が生じ、これにより相互統合体
のＴＩ酸成分喪失する。しかしながら努力の結果、両タ
イプの細菌について安定なＲ７７２：：　ＰＴｉＢ６相
互統合ノラスミドＰＡＬ　９６９の分離に成功し、この
存在がＨｌ　１１ｅ等、Ｐｔａｓｍｉｄ　７．１０７〜
１１８（１９８２）によシ開示された。

この安定な相互統合プラスミドは、新遺伝子を無傷のＴ
ｌプラスミドのＴ−領域に導入するのに必要なすべての
段階をＥ、コリにおいて行い、次に操作されたＴ−領域
を有する相互統合プラスミドを自らのＴｉプラスミドを
有しない人、ツメファシェンスに移入する新規な方法の
可能性を切り開く。このような相互統合シラスミドを含
有するアグロバクテリウム菌株は、種々のタイプの植物
に腫瘍を誘発することができ、さらに一般的には、外来
性ＤＮＡを植物、特に双子葉植物、例えばトマト、タバ
コ、ペチーニア、バレイショ、甜菜、サンフラワー、豆
科植物、及びこれに類するものの染色体に組み込むこと
ができる。

従ってこの発明は、Ｔ１プラスミドとして、プラスミド
Ｒ７７２とプラスミドｐＴｉＢ　６とから誘導された安
定な相互統合プラスミドであって、この相互統合シラス
ミドのＴｉ成分のＴ−領域に外来性ＤＮＡが導入されて
いるものを使用することを特徴とする前記のタイプの方
法を提供する。

この発明はさらに、相互統合シラスミドｐＡＬ９６９、
及びこの相互統合シラスミドのＴｉ成分のＴ−領域に外
来性ＤＮＡを導入することにより誘導された相互統合シ
ラスミドを提供する。

この発明はさらに、１又は複数のＴｉプラスミドを含有
するアグロバクテリウム・ツメファシェンス細菌の製造
方法であって、外来性ＤＮＡが導入されるＴ−領域を有
する、エセリヒア・已ユにおいて使用するためのそれ自
体公知のプラスミドを、宿主としてのＥ、コリ中で相互
統合グラスミドｐＡＬ６９６又はＴｉ成分のＴ−領域に
外来性ＤＮＡを導入することによシ該プラスミドから誘
導された相互統合シラスミドと一緒にし、この後、相互
統合プラスミドを、相互統合プラスミドのＴｉ成分のＴ
−領域に２重乗換（ｄｏｕｂｌｅ　ｃｒｏｓｓｉｎｇ　
−（Ｉｖｅｒ　）により導入されたベクター由来の外来
性ＤＮＡを伴って、Ｒ１＠Ｔ１相互統合体の各々の成分
と同じ不和合性群に属するプラスミドを自ら担持しない
Ａ、ツメファシェンスに移入することを特徴とする方法
を提供する。この発明はさらに、この発明の方法を適用
することによってもとの植物又は植物細胞の遺伝的性質
を変化せしめた後に得られる植物又は植物細胞を提供す
る。

変性された遺伝情報を有する植物又は植物細胞を得るた
めのこの発明の方法は、植物の改良（例えば農薬に対す
る一層高い耐性を有する改良された品種の栽培）、及び
特定の望ましい翻訳生産物、例えば酵素、又は植物細胞
の２次代謝産物を大量に製造するために植物細胞を発酵
に使用するためのバイオリアクター（場合によってはこ
れに植物細胞が固定されている）の実用化において使用
することができる。

従ってこの発明の方法は、他の変化しないパックグラウ
ンドの中で非常に明確な遺伝的に改良された、すなわち
変化した性質を有する高等植物の変種の製造を可能にす
る。すでに記載したようにこの方法は植物育種産業にお
いて有用であり、この発明の方法を適用して得られた組
織系（ｔｉｓｓｕｅｌｉｎｅ　）から形質転換後の早い
段階において得られる。さらに、この発明の方法を適用
して得られた自家栄養増殖性細胞、例えばクラウン・ゴ
ール細胞は、発酵槽中での良好な増殖のために非常に簡
単な合成培地を必要とするのみであｐｌこの培地には植
物ホルモンを加える必要がない。外来性ＤＮＡが導入さ
れたこうして得られた細胞は）外来性ＤＮＡによってコ
ードされる物質、例えばアルカロイド、アミノ酸、炭化
水素、蛋白質、酵素、ステロイド等の製放のために大規
模に培養することができる（　Ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｇ　。

Ｍｉｃｒｏ　−Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　＋　Ｐｌａｎｔｓ
　ａｎｄ　Ａｎｉｍａｌｓ　；ＯＴＡ　Ｒｅｐａｒｔ　
＋　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＵｎｉｔｅｄＳ
ｔａｔｅｓ　０ｆｆｉ’ｅｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　＋ワシントン、１９８１
参照〕。

Ｅ、コ１ＪｌｄＡ、ツメファシェンスに比べて非常に高
い増殖速度を有し、他方、多くの変異株並びに特別なり
ローニング担体、例えば遺伝子の活性化が生じ得るコス
ミド及びベクターが使用し得る。

この発明の方法は広い宿主域を有するシャトルベクター
を必要としない。このようなシャトルベクターは組換Ｄ
ＮＡ活性のためにしばしば太きすぎ、そしてしばしばＴ
−領域の挿入のための正しい制限酵素部位を有しない。

この発明の方法においては、互、三辺中で良く知られた
通常のベクター（Ｅ、コリに特異的）を使用する。親遺
伝子が導入されているＴ−領域を有するこのようなベク
ク−を、Ｅ　’　”　’）中で安定なＲ：：　Ｔｉ相互
統合体と一緒にして２重乗換を生じさせ、この結果性遺
伝子が相互統合体のＴｉ成分のＴ−領域に導入される。

そしてすでに前記したように、操作されたＲ　二：　Ｔ
ｉ相互統合体を高頻度でＡ、ツメファシェンスに移入す
る。

この方法は、ｐｏｌＡｔｓ株（ｔｓ一温度感受性）を使
用することにより単純化することができよう。このよう
な株においては、ｃｏｌＥ１プラスミド由来のＥ　、ｒ
　ＩＪ用ベクター（プラスミド）のほとんどが３２℃で
複製することができるが４２℃においては複製しない。

他方、他のプラスミド、例えば相互統合シラスミドｐＡ
Ｌ　９６９は両方の温度において維持される。簡単な選
択、例えば抗生物質耐性マーカーを用いる４２℃での選
択により、相互統合プラスミド中に部位特定変異（５ｉ
ｔｅ　ｄｉｒｅ−ｃｔｅｄ　ｍｕｔａｔｊｏｎ　）、例
えば外来性ＤＮＡの挿入を担持する株を直接得ることが
できよう。

安定な相互統合プラスミドｐＡＬ　９６９含有する」、
三ユがオランダ、パールン、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｒｅａ
ｕｖｏｏｒ　５ｃｈｉｒｒｒｎｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに
、ＣＢＳ　１９０．８３として１９８３年２月２４日に
寄託されており、入手することができる。

説明を２つに分けて行う。すなわち、 Ａ、安定な相互統合プラスミドｐＡＬ　９６９の物理的
地図の構成；及び、 Ｂ、Ｆｔ７７２の部位特定変異のモデル実験；である。

最後に、この発明の方法の例を記載する。この例におい
ては、相互統合プラスミドｐＡＬ　９６９のＴｉ成分中
、Ｔ−領域の部位特定変異を行い、そして変異の表現型
を幾つかの植物種を用いて行った。

この発明において使用し危菌株及びプラスミドＲ７７２
由来のクローン プラスミド　制限断片　ベクター 世：ｔＬ＋ヌー甲し千目升１ノ　人　＝−個ｐＲＬ２３
１　Ｈｉｎｄｎｌ−４ｐＴＲ２６２ｐＲＬ２３２　Ｈｔ
ｎｄｌＩＩ−３ｐＴＲ２６２ｐＲＬ２３３　Ｈｉｎｄｌ
Ｉ［−３＋４　ｐＴＲ２６２ｐＲＬ２３６　ＥｃｏＲＩ
　１＋２　−ｐＲＬ２３７　ＥｃｏＲＩ　２　ｐＢＲ３
２２ｐＲＬ２３８　ＨｉｎｄＩ［［−１＋２　ｐＴＲ２
６２ｐＲＬ２４７　Ｐｓｔｌ　−６ｐＢＲ３２５ｐＲＬ
２４８　ＰｓｔＩ−３ｐＢＲ３２５ｐＲＬ２４６　ｐＢ
Ｒ３２２：：ｌ５７０　−ｐＲＬ２３９　−　− （Ｉ７） ６０６− 阿七Ω次仇主　へ丁坏 Ｔｃｒ　この明細書に記載 ＴＣｒ　この明細書に記載 Ｔｃｒ、ＫｒｒＩｒ　この明細書に記載段♂、　Ｉｎｃ
＋　この明細書に記載 Ａｐ’ｙＴｃ’、冷ｌ　この明細書に記載Ｔｃ’＋Ｉｎ
ｃ−Ｐ　この明細書に記載Ｃｍ’、Ｔｃ’　この明細書
に記載 Ｃｍ−ｔ　Ｔ　ｅ　’　この明細書に記載Ａｐｒ・Ｔｃ
’　この明細書に記載 Ｋｍ’　、Ａｐ’　、Ｃｍ’　＋　この明細書に記載ｎ
ｃ−Ｐ 接合は、Ｈｌｌｌｅ等、　Ｐｌａｓｍｌｄ　７．１０７
〜１１８（１９８２）により記載されているのと同様に
して実施した。

Ｅ１コリからのプラスミドの分離は旧ｒｎｂｏ　１ｍ及
びＤｏｌｙ＋Ｎｕｃｌ、Ａｃ、　Ｒｅｓ、　７．１５１
３〜１５２３（１９７９）により記載された方法によシ
行い、Ａ１ツメファシェンスからのそれはＫｏｅｋｍａ
ｎ等、　Ｐｌａｓｍｉｄ　４　、１８４〜１９５（１９
８０）によシ記載された方法によシ行った。

制限酵素の精製、アガロースゲル電気泳動、サザンプロ
ット法、及びＤＮＡ−ＤＮＡ　ｆ紙ハイブリダイゼーシ
目ンはＰｒａｋａｓｈ等、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
　−１４５，１１２９〜１１３６（１９８１）によシ記
載された方法によシ実施した。

制限断片の連結は、６．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２：　６０
　ｍＭＴｒ　Ｉ　ｓ　ＨＣｔ、ｐＨ６，７；　１０　ｍ
Ｍジチオスレイトール；０、４　ｍＭ　ＡＴＰ中、１４
℃にて２０時間行った。連結混合物中のＤＮＡ濃は通常
的ｌｏ　ｏ　ｐ９／ｍｌとし、ベクターＤＮＡに対して
５倍過剰量のＤＮＡを用いた。

連結の後、混合物を直接使用して形質転換を行りたＯ Ｅ１コリの形質転換は、Ｃｏｈｅｎ等＋　Ｐ　ｒ　ｏ　
ｃ　、Ｎａ　ｔ　１Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　６９．２１
１０〜２１１４　（１９７２）に記載されているＣ　ａ
　ＣｔＺ法により行った。

Ｈｏｏｙｋａａｓ等、　Ｐｌａｓｍｉｄ　４．６４〜７
５（１９８０）に記載されている方法において、広宿主
域を有するＩｎｃ、Ｐ−１型シラスミドＲ７７２用いて
相互統合プラスミドｐＴＩＢ６を可動化し、特定のＲ７
７２：Ｔｉ相互統合プラスミド（ｐＡＬ　９６９　）を
得た。このプラスミドを含有する菌株を供与体として用
いてさらに交雑を行りた場合、Ｒ７７２マーカ及びＴ１
プラスミドマーカーの１００％同時転移（ｃｏｔｒａｎ
ｓｆｅｒ）が示された。すなわち、ム已ｙからＡ、７７
！乙ＬＺ三Ｚｚへの転移及びこの逆の転移の場合、１０
０％の同時転移が生じ、そしてＲ：　：　Ｔｉ相互統合
体は見ミＡ及びム乙ｌＺユｚ玉Ｚｌの両者中において安
定に維持され、そして構成プラスミドに分解しなかった
。この観察された相互統合プラスミドの安定性を洞察す
るために１このプラスミドの物理的地図を構成した。こ
の目的のためにまず、Ｉｎｃ、Ｐ−１型プラスミドＲ７
７２の地図を構成した（第１図）。次に、転移性要素（
ｔｒａｎｓｐｏｇｉｔｉｏｎ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を同定
し１そしてＲ７７２から分離した（第２図）。最後に、
プラスミドＰＡＬ９６９の物理的地図を構成した。この
中に、転移性要素のほぼ無傷のコピーが示されている（
第３図）。

１０種類の制限酵素を用いてＲ７７２ＤＮＡを試験した
。これらの内の３種類、すなわちＢｇｌｌｌ、Ｋｐｎｌ
及びＺｂａ　Ｉはプラスミドを切開することができなか
った。他方、ＢａｍＨＩはこのプラスミドを１つの部位
で切断した。他の制限酵素、すなわち几凹■、影す■、
ジ凹工、用ｎｄｌｌｌ、４乏Ｒ１及びＰｓｔ　■はこの
シラスミドを種々の部位で切断した。次の第２表に種々
の認識部位及び断片の長さを示す。　以下余白 Ｒ７７２ＤＮＡのサイズは４０．５Ｍダルトンであった
。唯一のシニＨ１部位を地図の始点（参照位置）として
選択した。２重消化後の断片の順序は明確には確定でき
なかった。このため、個々のＨｉｎｄｌｌｌ及びシリ■
によるＲ７７２の制限断片をダルから分離し、試験管内
で３１２４ｋを用いて標識し、そして試験したすべての
制限酵素を用いて消化したＲ　７７２　ＤＮＡを含有す
るプロット上でバイブリド形成した。オートラジオグラ
ム上に観察されるバイブリド形成片断の位置からＲ７７
２の暫定的な環状地図を構成することができた。多数の
制限酵素認識部位が相互に隣接して存在するために順序
を明確に確定でき々い場合には、Ｒ７７２の特定の制限
断片をマルチコピープラスミド上でクローニングした。

Ｐｓｔ（断片６及び３をｐＢＲ３２５上でクローニング
し、そしてＨｌｎｄ　ｍ断片４．３．４＋３、及び１＋
２をベクターｐＴＲ２６２上でクローニングした。この
場合挿入後遺伝子の活性化が生ずる［Ｒｏｂｅｒｔｓ等
、　Ｇｅｎｅ　１２　、１２３〜１２７（１９８０）に
よシ記載されている〕。これらのクローンを制限酵素分
析することにより、はとんどの８識部位を実際にマツプ
することができた。

ＥｃｏＲＩ断片５及び６、並びに均已Ｉ断片４及び５の
みは隣接しておりそして他の制限酵素の制限部位を有し
ないため、配列決定することができなかった（第１図参
照）。

クローニング実験によシさらに、特定の遺伝的性質の位
置に関する、シラスミドＲ７７２については今まで知ら
れていなかりた幾つかの情報が得られた。ｐＴＲ２６２
上でのＨｉｎｄｌｎクローニング実験から、」す＋ｄ■
断片４及びＨｉｎｄｌｌｌ断片３のいずれも無傷のカナ
マイシン耐性Ｋｍｒ−座（シラスミドＲ７７２の抗生物
質耐性についての唯一のマーカー）を含有しておらず、
他方、もとの方向が維持されている１つのセグメントと
してこれらのＨｉｎｄ■断片３＋４を一緒にクローニン
グした場合、カナマイシン耐性が発現した。このことは
、Ｋｒｎｒ−座が断片３及び４からなるこのセグメント
中のＨｌｎｄ　Ｉ［ｌ認識部位に重なっていることを示
していると考えられる。このことはＲ７７２及びｐＢＲ
３２２のＥｃｏＲＩ断片のクローニングによ〕確認した
。ＥｃｏＲＩ断片２はＫｍｒ−座を含有する。これらの
ＥｃｏＲＩクローニング実験において、Ｋｍｒ決定部分
のみを含有し、そしてｐＢＲ３２２マーカーを含有しな
いプラスミドが見出された。このプラスミド（ｐＲＬ２
３６　）ＵＲ７７２Ｃ１ｇｃｏＲｒ断片１及び２から成
り、このことはこれら２つの断片が一緒に自律複製のだ
めのすべての情報を含有していることを示している。と
のシラスミドｐＲＬ２３６は転移できないから、ｔｒａ
機能はＥｃｏＲＩ断片３，４．５又は６の領域に存在し
なければならない。ｐＴＲ２６２と、Ｒ７７２の世上ｄ
ｌｌｌ断片１及び２とから成るクローンｐＲＬ　２３８
はｔｒａ＋１及び２が自律転移及び自律複製のために必
要なすべての情報を含有していなければならない。従−
り％、１７７２の複製機能及び不和合性機能はＨ１ｎｄ
断片１中に存在しなければならない。（略号として、接
合による自律転移に必要な機能をり１で表わし、複製開
始点をと１とし、不和合性機能をすびとした。） 前記のＨｏｏｙｋａａｓ等ｒ　Ｐｌａｓｍｉｄ　４　＋
　６４〜７５（１９８０）による論文において、Ａユ乙
ムＺ工２五７２の可動化された（ｍｏｂｉｌｉａｅｄ）
Ｔｉシラスミドは、可動性プラスミド（ｍｏｂｉｌｉｓ
ｉｎｇ　ｐｌａｓｍｉｄ）に由来する挿入配列又はトラ
ンスポゾンを担持することが示されている。可動化が、
転移の結果としての相互統合体の形成を介して起こると
仮定すれば、不安定な中間生成物中に転移要素の２個の
直接反復コピーが存在することが予想される。不安定性
は、転移要素の２個の無傷のコピーの間の相同性組換の
結果であシ、従って相互統合体はその構成要素に分解す
るであろう。相互統合プラスミドｐＡＬ９６９０安定性
を理解するために転移要素のコピーの構造を検討した。

Ｒ７７２について同定された転移要素をｐＢＲ３２２上
で分離した。問題のプラスミド（ｐＲＬ２４６）を分析
した・転移要素はＲ７７２の抗生物質耐性マーカー（Ｋ
ｍりを含有しなかったから、この転移要素を挿入配列と
称することができる（ＩＳ７０と称する）。プラスミド
ｐＲＬ　２４６のホモダブレックス（ｈｏｍｏｄｕｐｌ
ｅｘ）分析により、ｌ５７０はその末端に、約５０塩基
対の長さの短い逆位反復を有することが示された。制限
酵素によｆｉ２．５Ｍダルトンの長さのｌ５７０をＩ）
ＢＲ３２２上でマツピングした。このマツピングによｊ
９Ｒ７７２中のｌ５７０の位置を示すことができた（第
１図参照）。

Ｒ７７２：：Ｔｉ相互統合プラスミドｐＡＬ９６９につ
いて、Ｒ７７２とＴＩプラスミドとの間の相互統合位置
を、６種類の異る制限酵素によシ決定した。結果を次の
第３表に示す。

以下余白 第３表 酵　素　Ｒ７７２断片　ｐ’ｒｔ　Ｂ６６重ＢａｍＨＩ
　１　１５ 呻１■　４　５ 見竺ｌ　１　１０ 町がＩＩＩ　４　２８Ａ 彫すＲ１２１６ り杏１　３　＊ ＊未決定 これらの結果から、Ｒ７７２上の相互統合の位置は１．
５Ｍダルトンの断片中（この部分はＳｍａ　Ｔ断片４及
びＰｓｔ　Ｉ断片３に重なる、第１図参照）に存在し、
そしてＴＩラプラスミド上それは０．８Ｍダルトンの断
片（ＩｃｏＲ１断片１６及びＨｌｎｄ　［１断片２８Ａ
）中に存在する。Ｒ７７２上の相互統合が起こる１、５
Ｍダルトン断片とＲ７７２の地図とを比較すれば、この
断片が挿入配列ｌ５７０の部分を担っていることが明ら
かであシ、このことは、相互統合が確かにｌ５７０を介
して起こったことを予想させる。

相互統合プラスミドｐＡＬ　９６９をｌ５７０中に認識
部位を有しない制限酵素で開裂した場合ｌ５７０に相同
な配列を有する２つの断片、すなわち２つのＲ７７２：
：Ｔｉ融合断片が生ずることが予想でき、ｌ５７０中に
１個の認識部位を有する制限酵素によ多切断した場合に
は１８７０と相同の配列を有する４個の断片が生ずるこ
とが予想でき、これらを総合して相互統合シラスミドが
ｌ５７０の２個の完全コピーを含有することが予想でき
る。

実際にはこれは正しくない。シラスミドｐＢＲ３２２：
：ｌ５７０（ｐＲＬ２４６）を試験管内でラベルし、そ
して種々の制限酵素で消化した別々のｐＡＬ　９６９　
ＤＮＡを含有するプロット上でバイブリド形成した。ｌ
５７０中に認識部位を有しない制限酵素（Ｅｃｏ　ＲＩ
　町ｖＩ　）を使用した場合、予想通シオートラジオダ
ラム上に２個の異るバンドが観察された。しかしながら
、工Ｓ７０中に１個の認識部位金有する制限酵素斗凹■
を使用した場合、４個では力く３個のみのバンドが観察
された。

この結果から、Ｒ７７２とＴＩシラスミドとの相互統合
はｌ５７０を介して行われると結論される。

なぜ々ら、■Ｓ７０が２重に存在すると考えられるから
である。明らかに、ｌ５７０の唯１の無傷のコ２−が存
在し、他方の断片は除去されたｌ５７０である。この除
去されたｌ５７０の長さは０．５Ｍダルトン以下である
と予想される。さらに、相互統合体の融合断片の長さの
合計から、検討した制限部位は欠失し々かったとしても
、０．５Ｍダルトン以下のＤＮＡの小片はｐ’ｒｉ構成
部分において除去されたに違い表いと結論することがで
きる。

これらのデータに基いて構成した、工Ｓ７０、除去され
たｌ５７０及びＫｍｒ座の標示を伴うｐＡＬ９６９の地
図を第３図に示す。Ｒ７７２に由来する断片が星印で示
しである。

今や、ｐＡＬ９６９の顕著な安定性は次のように説明す
ることができる。すなわち、■Ｓ７０の不完全な第２の
コピーの長さは、相互統合体をその構成プラスミドに分
解する効果的な相同性組換金可能にするには十分でない
。

安定な相互統合体ｐＡＩ、　９６９のも巴ｙ中での部位
特定変異のための使用を試験するためにモデル実験を計
画した。Ｒ７７２は比較的小サイズである（４０．５Ｍ
ダルトン）ため、変異したＲ７７２の制限ノ４ターンの
変化は、１６２Ｍダルトンのサイズを有する相互統合プ
ラスミドの場合よシも容易に説明することができる。こ
のため、まずＲ７７２に部位特定変異を導入し、これを
特徴付け、そして次にプラスミドｐＡＬ　９６９に導入
した。

Ｒ７７２ノＨｉｎｄ　ｍ断片３（長さ６Ｍダルトン）を
挿入後、遺伝子の活性化が生じ得るベクターｐＴＲ２６
２上でクローニングした。この断片は、Ｒ７７２の自律
転移又は自律複製のために必須である機能を含有しない
。得られたプラスミドｐＲＬ２３２は３個のＥｅｏＲ）
認識部位を有し、そのすべてがクローン断片中に存在し
ベクタ一部分（Ｔ）ＴＲ２６２）はＫｃｏＲ７部位を有
し々い。ｐＲＬ２３２０２個の小形の内部のＥｃｏＲＩ
断片（１，８及び１．０Ｍダルトン）を除去し、そして
アンピシリン耐性決定部位（Ａｐ）及びクロラムフェニ
コール耐性決定部位（Ｃｍ　）を含有するプラスミドｐ
ＲＬ２２００４把Ｒ１断片（合計長さ５，８Ｍダルトン
）により置換した。こうしてＡｐ％　Ｃｍ及びＴｃ（テ
トラサイクリン）耐性塵を有するシラスミドｐＲ２３４
を得た（第４ａ図参照）。ＡｐｒＣｍ’断片の両側に、
Ｒ７７２に相同な配列を有する約１．５Ｍダルトンの長
さを有するセグメントが存在する（第４図中太線で示さ
れている）。

Ｒ７７２とｐＲＬ　２３４とを細菌細胞（ＫＭＢＬ１１
６４）中で一緒にし、ＡｐｒＣｍｒセグメントを相同性
組換を介してＲ７７２に移転せしめた（第４ａ図参照）
。

次にこの菌株をＫＭＢＬ　１００との交雑における供与
体として使用した（第４図ｂ）。Ｉｎｃ、　Ｐ　−１プ
ラスミドＲ７７２の転移率は高く、約１％のレシピエン
ド細菌がこのプラスミドを受理した。過去の実験におい
ては、転移したＲ７７２当、９１０−５の頻度でプラス
ミドｐＢＲ３２２を可動化する（Ｒ７７２のｌ５７Ｑを
介して）ことが明らかにされている。従って、Ｒ７７２
はプラスミドｐＲＬ２３４を、ｌ５７０を介して約１０
　の頻度で可能可することが予想された。しかしながら
実際には、転移したＲ７７２当たシ１０−２のＡｐ　ｒ
決定部位の転移値が観察され、転移発生（ｔｒａｎｓｐ
ｏｓｉｔｌｏｎＯｅ’ｅｕｒｒｅｎｅｅ）による可動化
について予想される値よシも非常に高かつ九。この高い
転移頻度はおそら（ｐＲＬ２３４とＲ７７２との間の相
同性に基くものであろう。

さらに分析するため、２２個のＡｒｒコロニーを選択し
た。ソｏ内１４　個ハＡｐｒ＋　Ｃｍｒ、　Ｋｒｎ”　
＋Ｔｃｒであシ、その内８個はＡｐｒ、　Ｃｍｒ、　Ｋ
ｍｒ及びＴｃ’であった。１４個のコロニーはＲ７７２
及びｐＲＬ２３４の両者のすべてのマーカーを発現し、
このことから完全なｐＲＬ　２３４が可動化されたこと
が明らかである（可動化頻度は転移したＲ７７２当たｊ
ｌ　６．５　Ｘ　１０　’）。しかしながら８個のコロ
ニーはＲ７７２のマーカー（ｂつ並びにＲ７７２の変異
した弘ｎｄｌｌ［断片３のＡｐ　ｒ及びＣｍｒマーカー
を担持するがベクタープラスミドのマーカー（Ｔｃｒ）
を担持しなかった。従ってこれら８個のコロニーはＡｐ
ｒＣｍｒの挿入を介して部位特定変異を受けたと見られ
る（転移したＲ７７２当り置換頻度３．５Ｘｔｏ　）。

３つの独立コロニーからプラスミ）’　ＤＮＡを分離し
、そしてアガロースゲルによル分析を行った。３種類す
べてのコロニーについて同一サイズの１種類のシラスミ
ドが観察された。

ＨｌｎｄｌｌｌｌＣよる消化にょシ得られた断片の・母
ターンはこれらのプラスミドについて同じであった。

Ｒ７７２のＨ１ｎｄ０１消化に典型的な断片４が消失し
、２つの新しい断片が観察された。これらの２つの折断
片は、ｐＲＬ２３４中のＲ７７２の変異したＨｉｎｄＩ
［［断片３と同一であった。Ｒ７７２由来のシラスミド
ｐＲＬ２３９（第４図Ｃ参照）中にはベクタープラスミ
ドｐＴＲ２６２のバンドは観察されなかりた。従りて、
Ｒ７７２は部位特定変異において確かに変異していた。

同じ変異を同じ方法にょシ相互統合プラスミドｐＡＬ９
６９に導入した。この結果は、Ｒ７７２を使用した場合
に得られた結果に本質上対応し、こうして得られたＲ７
７２：：Ｔｉ相互統合プラスミドのＡＳ７．＋１乙ＬＺ
玉／ｌ細菌への転移及びこれを用いる植物感染によシ正
常な腫瘍の形成が明らかに起こった。変異が相互統合プ
ラスミドのＴＩ成分中に位置しないのであるから、前記
の結果は予想通シである。

！・ 相互統合プラスミドｐＡＬ９６９のＴ１成分のＴ−領域
の部位特定変異について記載したこの発明の方法の適切
さを、Ｔ−領域の断片（μ正Ｒ■断片７、第３図参照）
をベクターｐＡ　ＣＹＣ１８４上でクローニングするこ
とによυ検討した。受理したプラスミドｐＲＡＩ、　３
５０１は２個のＰｓｔｌ認識部位を含有していた。０．
５ＭダルトンのＰ＋ｔ　Ｉ断片をＣｍｒ決定部位を有す
る２、７Ｍダルトンの断片で置換した。この断片はプラ
スミドｐＲＬ　２２０に由来する。Ｃｍｒ決定部位を含
有するセグメントの両側にＴ−領域に相同の配列を有す
るそれぞれ２．５Ｍダルトン及び１．８Ｍグルトンの長
さを有するＤＮＡ片が存在する。次に、この変異を前に
記載した方法により相互統合プラスミドｐＡＬ９６９に
転移せしめた。変異は１〜３Ｃｍ？被接合体の頻度でｐ
ＡＬ９６９に転移した。ｐＡＬ１８３１と称する１つの
変異ｐＡＬ　９６９プラスミドを分離し、そして種々の
制限酵素で消化し、次に断片のパターンをアガロースデ
ル電気泳動によυ石室めた。こうして、ｐＡＬ１８３１
中にあるｐＡＬ９６９の０．５Ｍダルトン旦ｓｔ（断片
が２．７ＭダルトンＰａｔ　Ｉ断片により置換されてい
ることを確認した。

ｐＡＬ　１８３１中に存在する置換された外来性２．７
ＭダルトンＰｓｔｉ断片をＴ−領域の遺伝子地図［：Ｇ
ａｒｆｌｎｋｓｌ等、　Ｃｅ１ｌ　２７　、１４３〜１
５３（１９８１）及び０ｏｒｒＩｓ等、　Ｇｅｎｅ１４
　＋　３３〜５０（１９８１）］と比較した場合、変異
がサイトカイニン様効果を惹起する座に存在することが
明らかである。Ｔ−領域の転写地図［ＷＩ　Ｉ　１ｍｊ
　ｔｚｅｒ等ｐ　Ｔｈｅ　Ｅｍｂｏ　Ｊｏｕｒｎａｌ　
Ｌ　１３９〜１４６（１９８２）］と比較した場合転写
体４が変異している。

相互統合プラスミドｐＡＬ１８３１をモリからＡ、ツメ
ファシェンスに転移せしめ、その後で被接合体の１つに
ついて、種々の植物種を用いて腫瘍誘発能力を試験した
。野性型オクトピン株によって誘発される腫瘍と異なシ
、ｐＡＬ１８３１含有ヱグロパクテリウムによυ誘発さ
れる小形腫瘍はダパコにおいて根を発育せしめた。さら
にカランコニにおいては、茎が、正常な発根のほかに腫
瘍を形成することが観察された。トマトにおいては、小
形腫瘍のみが形成された。これらの観察は、このような
変異の公知の表現型とよく一致した。

この方法の機略を第５図に示す。

第６図は、腫瘍誘発に寄与する部分と、オクトピン及び
アルギニンの分解代謝に寄与する部分（それぞれ、オク
トピン分解代謝遺伝子Ｏｃａ、及びアルギニン分解代謝
遺伝子Ａｒｃ）とに亜分割されたオクトビンＴＩプラス
ミドの図を示す。Ｔｒａ。

Ｉｎｃ及びＲｅｐは、それぞれ接合、不和合性及び複製
のために機能する。Ａ１１Ｘｑ　Ｃ）’を及び０ｃＩＩ
は、それぞれ腫瘍細胞中でのオーキシン及びサイトカイ
ニン様効果、並びにオクトピン合成のための座である。

第７図は、植物ゲノムに組込まれた後のオクトピンＴｊ
プラスミドのＴ−領域の構造をさらに詳細に示す。Ｔ−
領域の末端に、Ｔ−ＤＮＡの移入と植物ゲノムへの組込
みに関与する約２３塩基対（ｂｐ）の特別の塩基配列が
存在する。さらに、植物ゲノムに組込まれた、■又は複
数の目的遺伝子と形質転換体を選択するだめのマーカー
遺伝子とを含有する「人工的ｊ　Ｔ　−ＤＮＡを示す。

植物細胞中でのこれらの遺伝子の発現を可能にするため
に、ＲＮＡの転写のだめの出発点としての植物プロモー
ター（Ｐｐ）を含む特別ガ塩基配列（→）（これらは真
核生物における遺伝子発現の制御のために必要である）
が存在する。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドＲ７７２の物理的カードを足踵 第２図はプラスミドｐＲＬ　２４．６の物理的カードを
示し、 第３図は相互統合シラスミドｐＡＬ９６９の物理的カー
ドを示し、第４図はＲ７７２０部位特定変異のモデル実
験の概要を示し、第５図は外来性遺伝子−ｋ　Ａ、ツメ
ファシェンスのＴｉシラスミドのＴ−領域に、及び双子
葉植物のｒツムに組み込むだめの、この発明の方法概要
を示し、第６図はオクトピンＴｉシラスミドの概略を示
し、そして第７図は植物ゲノムに組み込まれた場合の正
常Ｔ　−ＤＮＡ。 及び操作された「人工的Ｊ　Ｔ　−ＤＮＡの構造の概略
を示す。 特許出願人 レイクスニペルシテイト　ライデン　（外１名）特許出
願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士西舘和之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士西山雅也 （３８） にＭＨＬＩ（Ｉｌｌ −ＥｃｏＲＩ俳泣 −Ｈ：ｎｄ　ＩＩＩ　６　ｋ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ　５ オクＬビンＬプラス三μ゛

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１又は複数のＴｉ（腫瘍誘発）プラスミドを感染せ
   しめることにより又は植物プロトプラストを該細菌と共
   にインキ−ベートすることにより外来性ＤＮＡを双子葉
   植物のゲノムに組込む方法であって、Ｔｌプラスミドと
   して、グラスミドＲ７７２とプラスミドｐＴｉＢ６とか
   ら成る安定な相互統合プラスミドであって該相互統合プ
   ラスミドのＴｉ成分のＴ−領域に導入された外来性ＤＮ
   Ａを有するものを用いることを特徴とする方法。 ２、相互統合グラスミドｐＡＬ９６９、及びＴｉ成分の
   Ｔ−領域に外来性ＤＮＡを導入することによって該相互
   統合グラスミドから誘導された相互統合プラスミド。 ３．１又は複数のＴｉプラスミドを含有するア外来性Ｄ
   ＮＡが導入されているＴ　−ＤＮＡ領域を有するそれ自
   体公知のエセリヒア・コリ（Ｅａｃｈｅｒ−ｉｃｈｉａ
   　ｃｏｌｔ　）において使用するためのベクターを、見
   、已諧中で特許請求の範囲第２項記載の相互統合プラス
   ミドと一緒にし、そして相互統合シラスミドのＴｉ成分
   のＴ−領域中に２重乗換によシ導入された外来性ＤＮＡ
   を有する相互統合プラスミドをＡ、ツメファシェンスに
   移入することを特徴とする方法。 ４、特許請求の範囲第１１記載の方法を適用することに
   よりもとの植物又は植物細胞の遺伝的性質を変化せしめ
   た後に得られる植物及び植物細胞。 ５、特許請求の範囲第１項記載の方法を適用することに
   より得られた細胞を培養し、そして目的物質を分離する
   ことを特徴とする化合物及び／又は医薬の製造方法。 ６、培養を発酵及び場合によってはそれに続く固定化に
   より行うことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の
   方法。