JPH07163358A - 外来性遺伝子を含むシャトルプラスミド - Google Patents
外来性遺伝子を含むシャトルプラスミドInfo
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- JPH07163358A JPH07163358A JP6213930A JP21393094A JPH07163358A JP H07163358 A JPH07163358 A JP H07163358A JP 6213930 A JP6213930 A JP 6213930A JP 21393094 A JP21393094 A JP 21393094A JP H07163358 A JPH07163358 A JP H07163358A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Abstract
(57)【要約】
【構成】 広宿主域部分とTi−プラスミド部分とを含
んで成る相互統合プラスミドであって、エセリヒア・コ
リ(Escherichia coli) 及びアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)中で複製可
能であり、そして前記Ti−プラスミド部分がT−領域
のボーダー間に外来性DNAを含有していることを特徴
とする相互統合プラスミド、並びにこのプラスミドを有
するE.コリ及びA.ツメファシエンス。 【効果】 任意の外来性遺伝子を双子葉植物のゲノムに
組み込むことができる。
んで成る相互統合プラスミドであって、エセリヒア・コ
リ(Escherichia coli) 及びアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)中で複製可
能であり、そして前記Ti−プラスミド部分がT−領域
のボーダー間に外来性DNAを含有していることを特徴
とする相互統合プラスミド、並びにこのプラスミドを有
するE.コリ及びA.ツメファシエンス。 【効果】 任意の外来性遺伝子を双子葉植物のゲノムに
組み込むことができる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、外来性遺伝子を双子葉
植物のゲノムに組込むことができるプラスミド、及び該
プラスミドを担持する細菌に関する。
植物のゲノムに組込むことができるプラスミド、及び該
プラスミドを担持する細菌に関する。
【0002】
【従来の技術】アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)(A.ツメファシエンス
と略す場合がある)のTiプラスミドが、この細菌が双
子葉植物にいわゆる「クラウン・ゴール(Croun gall)
」腫瘍の形成を惹起するのに必須であることが知られ
ている〔Van Larebeke等、Nature (ロンドン)252,169〜
170(1974);Watson等、J.Bacteriol.123, 255〜264(197
5);Zaenen等、J.Mol.86,109〜127(1974) 〕。
(Agrobacterium tumefaciens)(A.ツメファシエンス
と略す場合がある)のTiプラスミドが、この細菌が双
子葉植物にいわゆる「クラウン・ゴール(Croun gall)
」腫瘍の形成を惹起するのに必須であることが知られ
ている〔Van Larebeke等、Nature (ロンドン)252,169〜
170(1974);Watson等、J.Bacteriol.123, 255〜264(197
5);Zaenen等、J.Mol.86,109〜127(1974) 〕。
【0003】このプラスミドのT−領域と称される部分
は、腫瘍誘発の間に、T−DNAとして植物ゲノム(染
色体DNA)に組み込まれ〔Chilton 等、Cell 11, 263
〜261(1977);Chilton 等、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.7
7, 4060〜4064(1980);Thomashow等、Proc.Nat.Acad.Sc
i.U.S.A.77, 6448〜6452(1980);Willmitzer 等、Nature
(ロンドン)287,259〜361(1980) 〕、そして種々のRN
A転写において発現される〔Prummond等、Nature (ロン
ドン)269,535〜536(1977);Ledeboer,Thesis State Univ
ersity of Leyden(1978);Gurley 等、Proc.Nat.Acad.Sc
i.U.S.A.76, 2828〜2832(1979);Willmitzer 等、Mol.Ge
n.Genet.182, 255〜262(1981) 〕。
は、腫瘍誘発の間に、T−DNAとして植物ゲノム(染
色体DNA)に組み込まれ〔Chilton 等、Cell 11, 263
〜261(1977);Chilton 等、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.7
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A転写において発現される〔Prummond等、Nature (ロン
ドン)269,535〜536(1977);Ledeboer,Thesis State Univ
ersity of Leyden(1978);Gurley 等、Proc.Nat.Acad.Sc
i.U.S.A.76, 2828〜2832(1979);Willmitzer 等、Mol.Ge
n.Genet.182, 255〜262(1981) 〕。
【0004】この腫瘍細胞は植物ホルモン非依存性増殖
を示し、そしてオパイン(opine)として知られている1
種類又は複数種類の普通でないアミノ酸誘導体を含有
し、この内オクトピン(octopine) 及びノパリン (nopa
line) が最もよく知られている。オクトピンTiプラス
ミド由来のT−DNAは酵素リソピンデヒドロゲナーゼ
(lysopine dehydrogenas(LpDH) 又はオクトピンシンサ
ーゼ (octopine Synthase)(OCS) についてコードする遺
伝子を担持しており、この酵素は腫瘍細胞がオクトピン
を合成するために必須である〔Schroeder 等、FEBS Let
l.129, 166〜168(1981) 〕。
を示し、そしてオパイン(opine)として知られている1
種類又は複数種類の普通でないアミノ酸誘導体を含有
し、この内オクトピン(octopine) 及びノパリン (nopa
line) が最もよく知られている。オクトピンTiプラス
ミド由来のT−DNAは酵素リソピンデヒドロゲナーゼ
(lysopine dehydrogenas(LpDH) 又はオクトピンシンサ
ーゼ (octopine Synthase)(OCS) についてコードする遺
伝子を担持しており、この酵素は腫瘍細胞がオクトピン
を合成するために必須である〔Schroeder 等、FEBS Let
l.129, 166〜168(1981) 〕。
【0005】さらに、このプラスミドは、細菌によるこ
れらのオパインの分解的代謝のための遺伝子を含有する
〔Bomhoff 等、Mol.Gen.Genet.145, 177〜181(1976);Mo
ntoya 等、J.Bacteriol.129, 101〜107(1977) 〕。プラ
スミドのT−領域が欠失している場合、腫瘍は誘発され
ない〔Koekman 等、Plasmid 2, 347〜357(1979) 〕。T
−領域のほかに、Tiプラスミドの他の領域が細菌の腫
瘍誘発能のために必須のようである〔Garfinkel 等、J.
Bacteriol.144, 732〜743(1980);Ooms等、J.Bacteriol.
144,82〜91(1980)〕が、この部分は植物腫瘍細胞中にま
だ見出されていない。
れらのオパインの分解的代謝のための遺伝子を含有する
〔Bomhoff 等、Mol.Gen.Genet.145, 177〜181(1976);Mo
ntoya 等、J.Bacteriol.129, 101〜107(1977) 〕。プラ
スミドのT−領域が欠失している場合、腫瘍は誘発され
ない〔Koekman 等、Plasmid 2, 347〜357(1979) 〕。T
−領域のほかに、Tiプラスミドの他の領域が細菌の腫
瘍誘発能のために必須のようである〔Garfinkel 等、J.
Bacteriol.144, 732〜743(1980);Ooms等、J.Bacteriol.
144,82〜91(1980)〕が、この部分は植物腫瘍細胞中にま
だ見出されていない。
【0006】約20Mdのサイズを有するこの領域〔ここ
での変異はトランス的に(in trans) 相補的である〕は
vir(virulence)領域と称される〔Hille 等、Plasmi
d 6,151〜154(1981);Hille 等、Plasmid 7, 107〜118(1
982);Klee等、J.Bacteriol.150, 327〜331(1982) 〕。
での変異はトランス的に(in trans) 相補的である〕は
vir(virulence)領域と称される〔Hille 等、Plasmi
d 6,151〜154(1981);Hille 等、Plasmid 7, 107〜118(1
982);Klee等、J.Bacteriol.150, 327〜331(1982) 〕。
【0007】上記のことから、原核性細菌A.ツメファ
シエンスが天然に存在する真核性植物の遺伝的操作のた
めの系を有することが明らかであろう。Tiプラスミド
のT−DNA領域は、外来性DNA、特に特定の望まし
い性質についてコードする遺伝子を植物細胞のゲノムに
組み込むために適当であり、さらに原理的には、新遺伝
子の導入を同時的に遮断することなく腫瘍の原因である
遺伝子を除去することが可能である。第1の可能性は、
T−領域が希望通りに操作されているTiプラスミドを
1又は複数含有するA.ツメファシエンス細菌を植物に
感染せしめることである。
シエンスが天然に存在する真核性植物の遺伝的操作のた
めの系を有することが明らかであろう。Tiプラスミド
のT−DNA領域は、外来性DNA、特に特定の望まし
い性質についてコードする遺伝子を植物細胞のゲノムに
組み込むために適当であり、さらに原理的には、新遺伝
子の導入を同時的に遮断することなく腫瘍の原因である
遺伝子を除去することが可能である。第1の可能性は、
T−領域が希望通りに操作されているTiプラスミドを
1又は複数含有するA.ツメファシエンス細菌を植物に
感染せしめることである。
【0008】植物プロトプラストを前記のA.ツメファ
シエンス細菌と共にインキュベートするのが一層好まし
い。実際的な理由により、組換DNA技法によるT−領
域への新遺伝子の導入はエセリヒア・コリ(Escherichia
coli)(E.コリと略す場合がある)において行うのが
好ましい。しかしながら、Tiプラスミドは通常、E.
コリ中で維持されない(TiプラスミドはE.コリ宿主
中で複製しない)。このため現行の方法においては、
E.コリ及びA.ツメファシエンス中で複製するいわゆ
るシャトルベクターが使用され、これにT−領域が導入
される。そして次にこのT−領域に新遺伝子が導入され
る。
シエンス細菌と共にインキュベートするのが一層好まし
い。実際的な理由により、組換DNA技法によるT−領
域への新遺伝子の導入はエセリヒア・コリ(Escherichia
coli)(E.コリと略す場合がある)において行うのが
好ましい。しかしながら、Tiプラスミドは通常、E.
コリ中で維持されない(TiプラスミドはE.コリ宿主
中で複製しない)。このため現行の方法においては、
E.コリ及びA.ツメファシエンス中で複製するいわゆ
るシャトルベクターが使用され、これにT−領域が導入
される。そして次にこのT−領域に新遺伝子が導入され
る。
【0009】しかしながら、A.ツメファシエンスを介
して細胞を形質転換するためには完全なTiプラスミド
が必要である。この理由は、T−DNAを選択し(おそ
らくT−領域の末端の塩基配列を認識することにより)
そして植物に移入(transfer) する遺伝子を担持してい
る必須のvir−領域をTiプラスミドが含有している
ためである。
して細胞を形質転換するためには完全なTiプラスミド
が必要である。この理由は、T−DNAを選択し(おそ
らくT−領域の末端の塩基配列を認識することにより)
そして植物に移入(transfer) する遺伝子を担持してい
る必須のvir−領域をTiプラスミドが含有している
ためである。
【0010】現行の方法においてはTiプラスミドは
E.コリ中に維持されないので、操作されたT−領域を
有するシャトルベクターが、このシャトルベクターと共
存し得る完全Tiプラスミドを含有するA.ツメファシ
エンスに移入される。シャトルベクターはT−DNA部
分を含有し、この部分はTiプラスミドのT−領域中に
も存在するから、両T−領域の相性部分の間で二重乗換
(double crossing-over) が生ずる。これにより、無傷
の (intact) TiプラスミドのT−領域に新遺伝子が導
入される。
E.コリ中に維持されないので、操作されたT−領域を
有するシャトルベクターが、このシャトルベクターと共
存し得る完全Tiプラスミドを含有するA.ツメファシ
エンスに移入される。シャトルベクターはT−DNA部
分を含有し、この部分はTiプラスミドのT−領域中に
も存在するから、両T−領域の相性部分の間で二重乗換
(double crossing-over) が生ずる。これにより、無傷
の (intact) TiプラスミドのT−領域に新遺伝子が導
入される。
【0011】Tiプラスミドの部位特定変異(site loc
ation directed mutation)の方法がLeemans 等、The Em
bo Journal 1,147〜152(1982);Matzke等、J.Mol.Appl.G
enet.1, 39〜49(1981)に記載されている。これらの技法
の基礎となる一般的原理についてはRuvkun等、Nature
(ロンドン) 、289,85〜88(1981)を参照のこと。Tiプ
ラスミド変異の最終段階は常にアグロバクテリウムそれ
自体において行われる。なぜなら、Tiプラスミドの宿
主範囲はリゾビアセー(Rhizobiaceae) に限られている
からである。
ation directed mutation)の方法がLeemans 等、The Em
bo Journal 1,147〜152(1982);Matzke等、J.Mol.Appl.G
enet.1, 39〜49(1981)に記載されている。これらの技法
の基礎となる一般的原理についてはRuvkun等、Nature
(ロンドン) 、289,85〜88(1981)を参照のこと。Tiプ
ラスミド変異の最終段階は常にアグロバクテリウムそれ
自体において行われる。なぜなら、Tiプラスミドの宿
主範囲はリゾビアセー(Rhizobiaceae) に限られている
からである。
【0012】E.コリ中のTiプラスミドのクローン断
片を、例えばトランスポゾンの挿入によって変異せしめ
た後、この変異を受けた断片を広い宿主範囲を有するベ
クター上でサブクローニングし、そしてTiプラスミド
を含有するアグロバクテリウムの菌株に移入する。ここ
で、挿入されたDNAが、二重乗換を介する相同的組換
によってTiプラスミド中に導入され、この後、広い宿
主範囲を有するプラスミドが不和合プラスミドにより破
壊され、あるいはTiプラスミドが接合により他のアグ
ロバクテリウムに移送される。被接合体(transconjuga
nt) の試験により、Tiプラスミドの正しい変異が生じ
たか否かを点検する。
片を、例えばトランスポゾンの挿入によって変異せしめ
た後、この変異を受けた断片を広い宿主範囲を有するベ
クター上でサブクローニングし、そしてTiプラスミド
を含有するアグロバクテリウムの菌株に移入する。ここ
で、挿入されたDNAが、二重乗換を介する相同的組換
によってTiプラスミド中に導入され、この後、広い宿
主範囲を有するプラスミドが不和合プラスミドにより破
壊され、あるいはTiプラスミドが接合により他のアグ
ロバクテリウムに移送される。被接合体(transconjuga
nt) の試験により、Tiプラスミドの正しい変異が生じ
たか否かを点検する。
【0013】これらの公知の方法は面倒であり、そして
技術的な問題点を有する。これらの問題点は、E.コリ
において直接行いうるTiプラスミド自体の部位特定変
異により回避することができよう。しかしながら、Ti
プラスミドはE.コリ中で機能し得る複製開始点を有し
ない。
技術的な問題点を有する。これらの問題点は、E.コリ
において直接行いうるTiプラスミド自体の部位特定変
異により回避することができよう。しかしながら、Ti
プラスミドはE.コリ中で機能し得る複製開始点を有し
ない。
【0014】この発明においては、Tiプラスミド(p
TiB6)と広い宿主域を有する抗生物質耐性プラスミ
ド(R772)とから得られる安定な相互統合プラスミ
ド(Cointegrate plasmid)を使用する。Hooykaas等、Pl
asmid 4,64〜75(1980)に記載されているように、相互統
合プラスミドは、オクトピンTiプラスミドpTiB6
をInc.P−1型プラスミドR772により可動化
(mobilisation) することにより得られる。
TiB6)と広い宿主域を有する抗生物質耐性プラスミ
ド(R772)とから得られる安定な相互統合プラスミ
ド(Cointegrate plasmid)を使用する。Hooykaas等、Pl
asmid 4,64〜75(1980)に記載されているように、相互統
合プラスミドは、オクトピンTiプラスミドpTiB6
をInc.P−1型プラスミドR772により可動化
(mobilisation) することにより得られる。
【0015】R772成分の広宿主域のために相互統合
プラスミドはA.ツメファシエンス及びE.コリのいず
れにおいても複製することができるが、これらはほとん
どの場合不安定であり、A.ツメファシエンスからE.
コリへの転移の間に分解が生じ、これにより相互統合体
のTi成分が喪失する。しかしながら努力の結果、両タ
イプの細菌について安定なR772::PTiB6相互
統合プラスミドPAL969の分離に成功し、この存在
がHille 等、Plasmid 7, 107〜118(1982) により開示さ
れた。
プラスミドはA.ツメファシエンス及びE.コリのいず
れにおいても複製することができるが、これらはほとん
どの場合不安定であり、A.ツメファシエンスからE.
コリへの転移の間に分解が生じ、これにより相互統合体
のTi成分が喪失する。しかしながら努力の結果、両タ
イプの細菌について安定なR772::PTiB6相互
統合プラスミドPAL969の分離に成功し、この存在
がHille 等、Plasmid 7, 107〜118(1982) により開示さ
れた。
【0016】この安定な相互統合プラスミドは、新遺伝
子を無傷のTiプラスミドのT−領域に導入するのに必
要なすべての段階をE.コリにおいて行い、次に操作さ
れたT−領域を有する相互統合プラスミドを自らのTi
プラスミドを有しないA.ツメファシエンスに移入する
新規な方法の可能性を切り開く。このような相互統合プ
ラスミドを含有するアグロバクテリウム菌株は、種々の
タイプの植物に腫瘍を誘発することができ、さらに一般
的には、外来性DNAを植物、特に双子葉植物、例えば
トマト、タバコ、ペチュニア、バレイショ、甜菜、サン
フラワー、豆科植物、及びこれに類するものの染色体に
組み込むことができる。
子を無傷のTiプラスミドのT−領域に導入するのに必
要なすべての段階をE.コリにおいて行い、次に操作さ
れたT−領域を有する相互統合プラスミドを自らのTi
プラスミドを有しないA.ツメファシエンスに移入する
新規な方法の可能性を切り開く。このような相互統合プ
ラスミドを含有するアグロバクテリウム菌株は、種々の
タイプの植物に腫瘍を誘発することができ、さらに一般
的には、外来性DNAを植物、特に双子葉植物、例えば
トマト、タバコ、ペチュニア、バレイショ、甜菜、サン
フラワー、豆科植物、及びこれに類するものの染色体に
組み込むことができる。
【0017】従ってこの発明は、Tiプラスミドとし
て、例えばプラスミドR772とプラスミドpTiB6
とから誘導された安定な相互統合プラスミドであって、
この相互統合プラスミドのTi成分のT−領域に外来性
DNAが導入されているものを使用することを特徴とす
るプラスミド、並びに該プラスミドを担持するE.コリ
及びA.ツメファシエンスを提供する。
て、例えばプラスミドR772とプラスミドpTiB6
とから誘導された安定な相互統合プラスミドであって、
この相互統合プラスミドのTi成分のT−領域に外来性
DNAが導入されているものを使用することを特徴とす
るプラスミド、並びに該プラスミドを担持するE.コリ
及びA.ツメファシエンスを提供する。
【0018】この発明はさらに、相互統合プラスミドp
AL969、及びこの相互統合プラスミドのTi成分の
T−領域に外来性DNAを導入することにより誘導され
た相互統合プラスミドを提供する。この発明はさらに、
1又は複数のTiプラスミドを含有するアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス細菌の製造方法であって、外来
性DNAが導入されるT−領域を有する、エセリヒア・
コリにおいて使用するためのそれ自体公知のプラスミド
を、宿主としてのE.コリ中で相互統合プラスミドpA
L969又はTi成分のT−領域に外来性DNAを導入
することにより該プラスミドから誘導された相互統合プ
ラスミドと一緒にし、この後、相互統合プラスミドを、
相互統合プラスミドのTi成分のT−領域に2重乗換
(double crossing-over) により導入されたベクター由
来の外来性DNAを伴って、Ris Ti相互統合体の
各々の成分と同じ不和合性群に属するプラスミドを自ら
担持しないA.ツメファシエンスに移入することを特徴
とする方法を提供する。
AL969、及びこの相互統合プラスミドのTi成分の
T−領域に外来性DNAを導入することにより誘導され
た相互統合プラスミドを提供する。この発明はさらに、
1又は複数のTiプラスミドを含有するアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス細菌の製造方法であって、外来
性DNAが導入されるT−領域を有する、エセリヒア・
コリにおいて使用するためのそれ自体公知のプラスミド
を、宿主としてのE.コリ中で相互統合プラスミドpA
L969又はTi成分のT−領域に外来性DNAを導入
することにより該プラスミドから誘導された相互統合プ
ラスミドと一緒にし、この後、相互統合プラスミドを、
相互統合プラスミドのTi成分のT−領域に2重乗換
(double crossing-over) により導入されたベクター由
来の外来性DNAを伴って、Ris Ti相互統合体の
各々の成分と同じ不和合性群に属するプラスミドを自ら
担持しないA.ツメファシエンスに移入することを特徴
とする方法を提供する。
【0019】この発明はさらに、この発明の方法を適用
することによってもとの植物又は植物細胞の遺伝的性質
を変化せしめた後に得られる植物又は植物細胞を提供す
る。変性された遺伝情報を有する植物又は植物細胞を得
るためのこの発明の方法は、植物の改良(例えば農薬に
対する一層高い耐性を有する改良された品種の栽培)、
及び特定の望ましい翻訳生産物、例えば酵素、又は植物
細胞の2次代謝産物を大量に製造するために植物細胞を
発酵に使用するためのバイオリアクター(場合によって
はこれに植物細胞が固定されている)の実用化において
使用することができる。
することによってもとの植物又は植物細胞の遺伝的性質
を変化せしめた後に得られる植物又は植物細胞を提供す
る。変性された遺伝情報を有する植物又は植物細胞を得
るためのこの発明の方法は、植物の改良(例えば農薬に
対する一層高い耐性を有する改良された品種の栽培)、
及び特定の望ましい翻訳生産物、例えば酵素、又は植物
細胞の2次代謝産物を大量に製造するために植物細胞を
発酵に使用するためのバイオリアクター(場合によって
はこれに植物細胞が固定されている)の実用化において
使用することができる。
【0020】従ってこの発明の方法は、他の変化しない
バックグラウンドの中で非常に明確な遺伝的に改良され
た、すなわち変化した性質を有する高等植物の変種の製
造を可能にする。すでに記載したようにこの方法は植物
育種産業において有用であり、この発明の方法を適用し
て得られた組織系(tissue line)から形質転換後の早い
段階において得られる。
バックグラウンドの中で非常に明確な遺伝的に改良され
た、すなわち変化した性質を有する高等植物の変種の製
造を可能にする。すでに記載したようにこの方法は植物
育種産業において有用であり、この発明の方法を適用し
て得られた組織系(tissue line)から形質転換後の早い
段階において得られる。
【0021】さらに、この発明の方法を適用して得られ
た自家栄養増殖性細胞、例えばクラウン・ゴール細胞
は、発酵槽中での良好な増殖のために非常に簡単な合成
培地を必要とするのみであり、この培地には植物ホルモ
ンを加える必要がない。外来性DNAが導入されたこう
して得られた細胞は、外来性DNAによってコードされ
る物質、例えばアルカロイド、アミノ酸、炭化水素、蛋
白質、酵素、ステロイド等の製族のために大規模に培養
することができる〔Impact of Applied Genetics,Micro
-Organisms,Plants and Animals;OTA Report,Congress
of the United States Office of Technology Assessme
nt、ワシントン、1981参照〕。
た自家栄養増殖性細胞、例えばクラウン・ゴール細胞
は、発酵槽中での良好な増殖のために非常に簡単な合成
培地を必要とするのみであり、この培地には植物ホルモ
ンを加える必要がない。外来性DNAが導入されたこう
して得られた細胞は、外来性DNAによってコードされ
る物質、例えばアルカロイド、アミノ酸、炭化水素、蛋
白質、酵素、ステロイド等の製族のために大規模に培養
することができる〔Impact of Applied Genetics,Micro
-Organisms,Plants and Animals;OTA Report,Congress
of the United States Office of Technology Assessme
nt、ワシントン、1981参照〕。
【0022】E.コリはA.ツメファシエンスに比べて
非常に高い増殖速度を有し、他方、多くの変異株並びに
特別なクローニング担体、例えば遺伝子の活性化が生じ
得るコスミド及びベクターが使用し得る。この発明の方
法は広い宿主域を有するシャトルベクターを必要としな
い。このようなシャトルベクターは組換DNA活性のた
めにしばしば大きすぎ、そしてしばしばT−領域の挿入
のための正しい制限酵素部位を有しない。
非常に高い増殖速度を有し、他方、多くの変異株並びに
特別なクローニング担体、例えば遺伝子の活性化が生じ
得るコスミド及びベクターが使用し得る。この発明の方
法は広い宿主域を有するシャトルベクターを必要としな
い。このようなシャトルベクターは組換DNA活性のた
めにしばしば大きすぎ、そしてしばしばT−領域の挿入
のための正しい制限酵素部位を有しない。
【0023】この発明の方法においては、E.コリ中で
良く知られた通常のベクター(E.コリに特異的)を使
用する。親遺伝子が導入されているT−領域を有するこ
のようなベクターを、E.コリ中で安定なR::Ti相
互統合体と一緒にして2重乗換を生じさせ、この結果新
遺伝子が相互統合体のTi成分のT−領域に導入され
る。そしてすでに前記したように、操作されたR::T
i相互統合体を高頻度でA.ツメファシエンスに移入す
る。
良く知られた通常のベクター(E.コリに特異的)を使
用する。親遺伝子が導入されているT−領域を有するこ
のようなベクターを、E.コリ中で安定なR::Ti相
互統合体と一緒にして2重乗換を生じさせ、この結果新
遺伝子が相互統合体のTi成分のT−領域に導入され
る。そしてすでに前記したように、操作されたR::T
i相互統合体を高頻度でA.ツメファシエンスに移入す
る。
【0024】この方法は、polAts株(ts=温度
感受性)を使用することにより単純化することができよ
う。このような株においては、colE1プラスミド由
来のE.コリ用ベクター(プラスミド)のほとんどが3
2℃で複製することができるが42℃においては複製し
ない。他方、他のプラスミド、例えば相互統合プラスミ
ドpAL969は両方の温度において維持される。簡単
な選択、例えば抗生物質耐性マーカーを用いる42℃で
の選択により、相互統合プラスミド中に部位特定変異
(Site directed mutation) 、例えば外来性DNAの挿
入を担持する株を直接得ることができよう。
感受性)を使用することにより単純化することができよ
う。このような株においては、colE1プラスミド由
来のE.コリ用ベクター(プラスミド)のほとんどが3
2℃で複製することができるが42℃においては複製し
ない。他方、他のプラスミド、例えば相互統合プラスミ
ドpAL969は両方の温度において維持される。簡単
な選択、例えば抗生物質耐性マーカーを用いる42℃で
の選択により、相互統合プラスミド中に部位特定変異
(Site directed mutation) 、例えば外来性DNAの挿
入を担持する株を直接得ることができよう。
【0025】安定な相互統合プラスミドpAL969を
含有するE.コリがオランダ、バールン、Centraalbrea
u voor Schimmelcultures に、CBS190.83とし
て1983年2月24日に寄託されており、入手するこ
とができる。説明を2つに分けて行う。すなわち、 A.安定な相互統合プラスミドpAL969の物理的地
図の構成;及び、 B.R772の部位特定変異のモデル実験;である。 最後に、この発明の方法の例を記載する。この例におい
ては、相互統合プラスミドpAL969のTi成分中、
T−領域の部位特定変異を行い、そして変異の表現型を
幾つかの植物種を用いて行った。この発明において使用
した菌株及びプラスミドを次の表1及び表2に挙げる。
含有するE.コリがオランダ、バールン、Centraalbrea
u voor Schimmelcultures に、CBS190.83とし
て1983年2月24日に寄託されており、入手するこ
とができる。説明を2つに分けて行う。すなわち、 A.安定な相互統合プラスミドpAL969の物理的地
図の構成;及び、 B.R772の部位特定変異のモデル実験;である。 最後に、この発明の方法の例を記載する。この例におい
ては、相互統合プラスミドpAL969のTi成分中、
T−領域の部位特定変異を行い、そして変異の表現型を
幾つかの植物種を用いて行った。この発明において使用
した菌株及びプラスミドを次の表1及び表2に挙げる。
【0026】
【表1】
【0027】
【表2】
【0028】接合は、Hille 等、Plasmid 7, 107〜118
(1982) により記載されているのと同様にして実施し
た。E.コリからのプラスミドの分離はBirnboim及びDo
ly,Nucl.Ac.Res.7, 1513〜1523(1979)により記載された
方法により行い、A.ツメファシエンスからのそれはKo
ekman 等、Plasmid 4, 184〜195(1980) により記載され
た方法により行った。 制限酵素の精製、アガロースゲ
ル電気泳動、サザンブロット法、及びDNA−DNA濾
紙ハイブリダイゼーションはPrakash 等、J.Bacteriol.
145,1129〜1136(1981)により記載された方法により実施
した。
(1982) により記載されているのと同様にして実施し
た。E.コリからのプラスミドの分離はBirnboim及びDo
ly,Nucl.Ac.Res.7, 1513〜1523(1979)により記載された
方法により行い、A.ツメファシエンスからのそれはKo
ekman 等、Plasmid 4, 184〜195(1980) により記載され
た方法により行った。 制限酵素の精製、アガロースゲ
ル電気泳動、サザンブロット法、及びDNA−DNA濾
紙ハイブリダイゼーションはPrakash 等、J.Bacteriol.
145,1129〜1136(1981)により記載された方法により実施
した。
【0029】制限断片の連結は、6.5mM MgC
l2 ;60mM Tris HCl,pH6.7;10mMジ
チオスレイトール;0.4mM ATP中、14℃にて2
0時間行った。連結混合物中のDNA濃は通常約100
μg/mlとし、ベクターDNAに対して5倍過剰量のD
NAを用いた。連結の後、混合物を直接使用して形質転
換を行った。E.コリの形質転換は、Cohen 等、Proc.N
at.Acad.Sci.69, 2110〜2114(1972)に記載されているC
aCl2 法により行った。
l2 ;60mM Tris HCl,pH6.7;10mMジ
チオスレイトール;0.4mM ATP中、14℃にて2
0時間行った。連結混合物中のDNA濃は通常約100
μg/mlとし、ベクターDNAに対して5倍過剰量のD
NAを用いた。連結の後、混合物を直接使用して形質転
換を行った。E.コリの形質転換は、Cohen 等、Proc.N
at.Acad.Sci.69, 2110〜2114(1972)に記載されているC
aCl2 法により行った。
【0030】A.安定な相互統合プラスミドpAL96
9の物理的カードの構成 Hooykaas等、Plasmid 4,64〜75(1980)に記載されている
方法において、広宿主域を有するInc.P−1型プラ
スミドR772を用いて相互統合プラスミドpTiB6
を可動化し、特定のR772:Ti相互統合プラスミド
(pAL969)を得た。このプラスミドを含有する菌
株を供与体として用いてさらに交雑を行った場合、R7
72マーカ及びTiプラスミドマーカーの100%同時
転移(cotransfer) が示された。
9の物理的カードの構成 Hooykaas等、Plasmid 4,64〜75(1980)に記載されている
方法において、広宿主域を有するInc.P−1型プラ
スミドR772を用いて相互統合プラスミドpTiB6
を可動化し、特定のR772:Ti相互統合プラスミド
(pAL969)を得た。このプラスミドを含有する菌
株を供与体として用いてさらに交雑を行った場合、R7
72マーカ及びTiプラスミドマーカーの100%同時
転移(cotransfer) が示された。
【0031】すなわち、E.コリからA.ツメファシエ
ンスへの転移及びこの逆の転移の場合、100%の同時
転移が生じ、そしてR::Ti相互統合体はE.コリ及
びA.ツメファシエンスの両者中において安定に維持さ
れ、そして構成プラスミドに分解しなかった。この観察
された相互統合プラスミドの安定性を洞察するために、
このプラスミドの物理的地図を構成した。この目的のた
めにまず、Inc.P−1型プラスミドR772の地図
を構成した(図1)。次に、転移性要素(transpositio
n element)を同定し、そしてR772から分離した(図
2)。
ンスへの転移及びこの逆の転移の場合、100%の同時
転移が生じ、そしてR::Ti相互統合体はE.コリ及
びA.ツメファシエンスの両者中において安定に維持さ
れ、そして構成プラスミドに分解しなかった。この観察
された相互統合プラスミドの安定性を洞察するために、
このプラスミドの物理的地図を構成した。この目的のた
めにまず、Inc.P−1型プラスミドR772の地図
を構成した(図1)。次に、転移性要素(transpositio
n element)を同定し、そしてR772から分離した(図
2)。
【0032】最後に、プラスミドpAL969の物理的
地図を構成した。この中に、転移性要素のほぼ無傷のコ
ピーが示されている(図3)。10種類の制限酵素を用
いてR772DNAを試験した。これらの内の3種類、
すなわちBglII,KpnI及びZbaIはプラスミド
を切開することができなかった。他方、BamHIはこ
のプラスミドを1つの部位で切断した。他の制限酵素、
すなわちHpaI,SalI,SmaI,HindIII
,EcoRI及びPstIはこのプラスミドを種々の
部位で切断した。次に表3に種々の認識部位及び断片の
長さを示す。
地図を構成した。この中に、転移性要素のほぼ無傷のコ
ピーが示されている(図3)。10種類の制限酵素を用
いてR772DNAを試験した。これらの内の3種類、
すなわちBglII,KpnI及びZbaIはプラスミド
を切開することができなかった。他方、BamHIはこ
のプラスミドを1つの部位で切断した。他の制限酵素、
すなわちHpaI,SalI,SmaI,HindIII
,EcoRI及びPstIはこのプラスミドを種々の
部位で切断した。次に表3に種々の認識部位及び断片の
長さを示す。
【0033】
【表3】
【0034】R772DNAのサイズは40.5Mダル
トンであった。唯一のBamHI部位を地図の始点(参
照位置)として選択した。2重消化後の断片の順序は明
確には確定できなかった。このため、個々のHindII
I 及びSalIによるR772の制限断片をゲルから分
離し、試験管内で32pを用いて標識し、そして試験し
たすべての制限酵素を用いて消化したR772DNAを
含有するブロット上でハイブリド形成した。
トンであった。唯一のBamHI部位を地図の始点(参
照位置)として選択した。2重消化後の断片の順序は明
確には確定できなかった。このため、個々のHindII
I 及びSalIによるR772の制限断片をゲルから分
離し、試験管内で32pを用いて標識し、そして試験し
たすべての制限酵素を用いて消化したR772DNAを
含有するブロット上でハイブリド形成した。
【0035】オートラジオグラム上に観察されるハイブ
リド形成断片の位置からR772の暫定的な環状地図を
構成することができた。多数の制限酵素認識部位が相互
に隣接して存在するために順序を明確に確定できない場
合には、R772の特定の制限断片をマルチコピープラ
スミド上でクローニングした。PstI断片6及び3を
pBR325上でクローニングし、そしてHindIII
断片4,3,4+3、及び1+2をベクターpTR26
2上でクローニングした。
リド形成断片の位置からR772の暫定的な環状地図を
構成することができた。多数の制限酵素認識部位が相互
に隣接して存在するために順序を明確に確定できない場
合には、R772の特定の制限断片をマルチコピープラ
スミド上でクローニングした。PstI断片6及び3を
pBR325上でクローニングし、そしてHindIII
断片4,3,4+3、及び1+2をベクターpTR26
2上でクローニングした。
【0036】この場合挿入後遺伝子の活性化が生ずる
〔Roberts 等、Gene 12, 123〜127(1980) により記載さ
れている〕。これらのクローンを制限酵素分析すること
により、ほとんどの認識部位を実際にマップすることが
できた。EcoRI断片5及び6、並びにPstI断片
4及び5のみは隣接しておりそして他の制限酵素の制限
部位を有しないため、配列決定することができなかった
(図1参照)。
〔Roberts 等、Gene 12, 123〜127(1980) により記載さ
れている〕。これらのクローンを制限酵素分析すること
により、ほとんどの認識部位を実際にマップすることが
できた。EcoRI断片5及び6、並びにPstI断片
4及び5のみは隣接しておりそして他の制限酵素の制限
部位を有しないため、配列決定することができなかった
(図1参照)。
【0037】クローニング実験によりさらに、特定の遺
伝的性質の位置に関する、プラスミドR772について
は今まで知られていなかった幾つかの情報が得られた。
pTR262上でのHindIII クローニング実験か
ら、HindIII 断片4及びHindIII 断片3のいず
れも無傷のカナマイシン耐性Kmr −座(プラスミドR
772の抗生物質耐性についての唯一のマーカー)を含
有しておらず、他方、もとの方向が維持されている1つ
のセグメントとしてこれらのHindIII 断片3+4を
一緒にクローニングした場合、カナマイシン耐性が発現
した。
伝的性質の位置に関する、プラスミドR772について
は今まで知られていなかった幾つかの情報が得られた。
pTR262上でのHindIII クローニング実験か
ら、HindIII 断片4及びHindIII 断片3のいず
れも無傷のカナマイシン耐性Kmr −座(プラスミドR
772の抗生物質耐性についての唯一のマーカー)を含
有しておらず、他方、もとの方向が維持されている1つ
のセグメントとしてこれらのHindIII 断片3+4を
一緒にクローニングした場合、カナマイシン耐性が発現
した。
【0038】このことは、Kmr −座が断片3及び4か
らなるこのセグメント中のHindIII 認識部位に重な
っていることを示していると考えられる。このことはR
772及びpBR322のEcoRI断片のクローニン
グにより確認した。EcoRI断片2はKmr −座を含
有する。これらのEcoRIクローニング実験におい
て、Kmr 決定部分のみを含有し、そしてpBR322
マーカーを含有しないプラスミドが見出された。
らなるこのセグメント中のHindIII 認識部位に重な
っていることを示していると考えられる。このことはR
772及びpBR322のEcoRI断片のクローニン
グにより確認した。EcoRI断片2はKmr −座を含
有する。これらのEcoRIクローニング実験におい
て、Kmr 決定部分のみを含有し、そしてpBR322
マーカーを含有しないプラスミドが見出された。
【0039】このプラスミド(pRL236)はR77
2のEcoRI断片1及び2から成り、このことはこれ
ら2つの断片が一緒に自律複製のためのすべての情報を
含有していることを示している。このプラスミドpRL
236は転移できないから、tra機能はEcoRI断
片3,4,5又は6の領域に存在しなければならない。
pTR262と、R772のHindIII 断片1及び2
とから成るクローンpRL238はtra + であり、そ
してアグロバクテリウム中で複製し得る。
2のEcoRI断片1及び2から成り、このことはこれ
ら2つの断片が一緒に自律複製のためのすべての情報を
含有していることを示している。このプラスミドpRL
236は転移できないから、tra機能はEcoRI断
片3,4,5又は6の領域に存在しなければならない。
pTR262と、R772のHindIII 断片1及び2
とから成るクローンpRL238はtra + であり、そ
してアグロバクテリウム中で複製し得る。
【0040】pTR262の複製開始点はアグロバクテ
リウム中で機能しないから、R772のHindIII 断
片1及び2が自律転移及び自律複製のために必要なすべ
ての情報を含有していなければならない。従って、R7
72の複製機能及び不和合性機能はHind断片1中に
存在しなければならない。(略号として、接合による自
律転移に必要な機能をtraで表わし、複製開始点をo
riとし、不和合性機能をincとした。)
リウム中で機能しないから、R772のHindIII 断
片1及び2が自律転移及び自律複製のために必要なすべ
ての情報を含有していなければならない。従って、R7
72の複製機能及び不和合性機能はHind断片1中に
存在しなければならない。(略号として、接合による自
律転移に必要な機能をtraで表わし、複製開始点をo
riとし、不和合性機能をincとした。)
【0041】前記のHooykaas等、Plasmid 4,64〜75(198
0)による論文において、A.ツメファシエンスの可動化
された(mobilised)Tiプラスミドは、可動性プラスミ
ド(mobilising plasmid) に由来する挿入配列又はトラ
ンスポゾンを担持することが示されている。可動化が、
転移の結果としての相互統合体の形成を介して起こると
仮定すれば、不安定な中間生成物中に転移要素の2個の
直接反復コピーが存在することが予想される。不安定性
は、転移要素の2個の無傷のコピーの間の相同性組換の
結果であり、従って相互統合体はその構成要素に分解す
るであろう。相互統合プラスミドpAL969の安定性
を理解するために転移要素のコピーの構造を検討した。
0)による論文において、A.ツメファシエンスの可動化
された(mobilised)Tiプラスミドは、可動性プラスミ
ド(mobilising plasmid) に由来する挿入配列又はトラ
ンスポゾンを担持することが示されている。可動化が、
転移の結果としての相互統合体の形成を介して起こると
仮定すれば、不安定な中間生成物中に転移要素の2個の
直接反復コピーが存在することが予想される。不安定性
は、転移要素の2個の無傷のコピーの間の相同性組換の
結果であり、従って相互統合体はその構成要素に分解す
るであろう。相互統合プラスミドpAL969の安定性
を理解するために転移要素のコピーの構造を検討した。
【0042】R772について同定された転移要素をp
BR322上で分離した。問題のプラスミド(pRL2
46)を分析した。転移要素はR772の抗生物質耐性
マーカー(Kmr )を含有しなかったから、この転移要
素を挿入配列と称することができる(IS70と称す
る)。プラスミドpRL246のホモダプレックス(ho
moduplex) 分析により、IS70はその末端に、約50
塩基対の長さの短い逆位反復を有することが示された。
BR322上で分離した。問題のプラスミド(pRL2
46)を分析した。転移要素はR772の抗生物質耐性
マーカー(Kmr )を含有しなかったから、この転移要
素を挿入配列と称することができる(IS70と称す
る)。プラスミドpRL246のホモダプレックス(ho
moduplex) 分析により、IS70はその末端に、約50
塩基対の長さの短い逆位反復を有することが示された。
【0043】制限酵素により2.5Mダルトンの長さの
IS70をpBR322上でマッピングした。このマッ
ピングによりR772中のIS70の位置を示すことが
できた(図1参照)。 R772::Ti相互統合プラスミドpAL969につ
いて、R772とTiプラスミドとの間の相互統合位置
を、6種類の異る制限酵素により決定した。結果を次の
表4に示す。
IS70をpBR322上でマッピングした。このマッ
ピングによりR772中のIS70の位置を示すことが
できた(図1参照)。 R772::Ti相互統合プラスミドpAL969につ
いて、R772とTiプラスミドとの間の相互統合位置
を、6種類の異る制限酵素により決定した。結果を次の
表4に示す。
【0044】
【表4】
【0045】これらの結果から、R772上の相互統合
の位置は1.5Mダルトンの断片中(この部分はSma
I断片4及びPstI断片3に重なる、図1参照)に存
在し、そしてTiプラスミド上のそれは0.8Mダルト
ンの断片(IcoRI断片16及びHindIII 断片2
8A)中に存在する。R772上の相互統合が起こる
1.5Mダルトン断片とR772の地図とを比較すれ
ば、この断片が挿入配列IS70の部分を担っているこ
とが明らかであり、このことは、相互統合が確かにIS
70を介して起こったことを予想させる。
の位置は1.5Mダルトンの断片中(この部分はSma
I断片4及びPstI断片3に重なる、図1参照)に存
在し、そしてTiプラスミド上のそれは0.8Mダルト
ンの断片(IcoRI断片16及びHindIII 断片2
8A)中に存在する。R772上の相互統合が起こる
1.5Mダルトン断片とR772の地図とを比較すれ
ば、この断片が挿入配列IS70の部分を担っているこ
とが明らかであり、このことは、相互統合が確かにIS
70を介して起こったことを予想させる。
【0046】相互統合プラスミドpAL969をIS7
0中に認識部位を有しない制限酵素でた開裂した場合I
S70に相同な配列を有する2つの断片、すなわち2つ
のR772::Ti融合断片が生ずることが予想でき、
IS70中に1個の認識部位を有する制限酵素により切
断した場合にはIS70と相同の配列を有する4個の断
片が生ずることが予想でき、これらを総合して相互統合
プラスミドがIS70の2個の完全コピーを含有するこ
とが予想できる。
0中に認識部位を有しない制限酵素でた開裂した場合I
S70に相同な配列を有する2つの断片、すなわち2つ
のR772::Ti融合断片が生ずることが予想でき、
IS70中に1個の認識部位を有する制限酵素により切
断した場合にはIS70と相同の配列を有する4個の断
片が生ずることが予想でき、これらを総合して相互統合
プラスミドがIS70の2個の完全コピーを含有するこ
とが予想できる。
【0047】実際にはこれは正しくない。プラスミドp
BR322::IS70(pRL246)を試験管内で
ラベルし、そして種々の制限酵素で消化した別々のpA
L969DNAを含有するブロット上でハイブリド形成
した。IS70中に認識部位を有しない制限酵素(Ec
oRIHpaI)を使用した場合、予想通りオートラジ
オグラム上に2個の異るバンドが観察された。しかしな
がら、IS70中に1個の認識部位を有する制限酵素S
maIを使用した場合、4個ではなく3個のみのバンド
が観察された。
BR322::IS70(pRL246)を試験管内で
ラベルし、そして種々の制限酵素で消化した別々のpA
L969DNAを含有するブロット上でハイブリド形成
した。IS70中に認識部位を有しない制限酵素(Ec
oRIHpaI)を使用した場合、予想通りオートラジ
オグラム上に2個の異るバンドが観察された。しかしな
がら、IS70中に1個の認識部位を有する制限酵素S
maIを使用した場合、4個ではなく3個のみのバンド
が観察された。
【0048】この結果から、R772とTiプラスミド
との相互統合はIS70を介して行われると結論され
る。なぜなら、IS70が2重に存在すると考えられる
からである。明らかに、IS70の唯一の無傷のコピー
が存在し、他方の断片は除去されたIS70である。こ
の除去されたIS70の長さは0.5Mダルトン以下で
あると予想される。さらに、相互統合体の融合断片の長
さの合計から、検討した制限部位は欠失しなかったとし
ても、0.5Mダルトン以下のDNAの小片はpTi構
成部分において除去されたに違いないと結論することが
できる。
との相互統合はIS70を介して行われると結論され
る。なぜなら、IS70が2重に存在すると考えられる
からである。明らかに、IS70の唯一の無傷のコピー
が存在し、他方の断片は除去されたIS70である。こ
の除去されたIS70の長さは0.5Mダルトン以下で
あると予想される。さらに、相互統合体の融合断片の長
さの合計から、検討した制限部位は欠失しなかったとし
ても、0.5Mダルトン以下のDNAの小片はpTi構
成部分において除去されたに違いないと結論することが
できる。
【0049】これらのデータに基いて構成した、IS7
0、除去されたIS70及びKmr座の標示を伴うpA
L969の地図を図3に示す。R772に由来する断片
が星印で示してある。今や、pAL969の顕著な安定
性は次のように説明することができる。すなわち、IS
70の不完全な第2のコピーの長さは、相互統合体をそ
の構成プラスミドに分解する効果的な相同性組換を可能
にするには十分でない。
0、除去されたIS70及びKmr座の標示を伴うpA
L969の地図を図3に示す。R772に由来する断片
が星印で示してある。今や、pAL969の顕著な安定
性は次のように説明することができる。すなわち、IS
70の不完全な第2のコピーの長さは、相互統合体をそ
の構成プラスミドに分解する効果的な相同性組換を可能
にするには十分でない。
【0050】B.R772の部位特定変異のモデル実験 安定な相互統合体pAL969のE.コリ中での部位特
定変異のための使用を試験するためにモデル実験を計画
した。R772は比較的小サイズである(40.5Mダ
ルトン)ため、変異したR772の制限パターンの変化
は、162Mダルトンのサイズを有する相互統合プラス
ミドの場合よりも容易に説明することができる。このた
め、まずR772に部位特定変異を導入し、これを特徴
付け、そして次にプラスミドpAL969に導入した。
定変異のための使用を試験するためにモデル実験を計画
した。R772は比較的小サイズである(40.5Mダ
ルトン)ため、変異したR772の制限パターンの変化
は、162Mダルトンのサイズを有する相互統合プラス
ミドの場合よりも容易に説明することができる。このた
め、まずR772に部位特定変異を導入し、これを特徴
付け、そして次にプラスミドpAL969に導入した。
【0051】R772のHindIII 断片3(長さ6M
ダルトン)を挿入後、遺伝子の活性化が生じ得るベクタ
ーpTR262上でクローニングした。この断片は、R
772の自律転移又は自律複製のために必須である機能
を含有しない。得られたプラスミドpRL232は3個
のEcoRI認識部位を有し、そのすべてがクローン断
片中に存在しベクター部分(pTR262)はEcoR
I部位を有しない。
ダルトン)を挿入後、遺伝子の活性化が生じ得るベクタ
ーpTR262上でクローニングした。この断片は、R
772の自律転移又は自律複製のために必須である機能
を含有しない。得られたプラスミドpRL232は3個
のEcoRI認識部位を有し、そのすべてがクローン断
片中に存在しベクター部分(pTR262)はEcoR
I部位を有しない。
【0052】pRL232の2個の小形の内部のEco
RI断片(1.8及び1.0Mダルトン)を除去し、そ
してアンピシリン耐性決定部位(Ap)及びクロラムフ
ェニコール耐性決定部位(Cm)を含有するプラスミド
pRL220のEcoRI断片(合計長さ5.8Mダル
トン)により置換した。こうしてAp,Cm及びTc
(テトラサイクリン)耐性座を有するプラスミドpR2
34を得た(図4のa参照)。Apr Cmr 断片の両側
に、R772に相同な配列を有する約1.5Mダルトン
の長さを有するセグメントが存在する(図4中太線で示
されている)。
RI断片(1.8及び1.0Mダルトン)を除去し、そ
してアンピシリン耐性決定部位(Ap)及びクロラムフ
ェニコール耐性決定部位(Cm)を含有するプラスミド
pRL220のEcoRI断片(合計長さ5.8Mダル
トン)により置換した。こうしてAp,Cm及びTc
(テトラサイクリン)耐性座を有するプラスミドpR2
34を得た(図4のa参照)。Apr Cmr 断片の両側
に、R772に相同な配列を有する約1.5Mダルトン
の長さを有するセグメントが存在する(図4中太線で示
されている)。
【0053】R772とpRL234とを細菌細胞(K
MBL1164)中で一緒にし、Apr Cmr セグメン
トを相同性組換を介してR772に移転せしめた(図4
のa参照)。次にこの菌株をKMBL100との交雑に
おける供与体として使用した(図4のb)。Inc.P
−1プラスミドR772の転移率は高く、約1%のレシ
ピエント細菌がこのプラスミドを受理した。過去の実験
においては、転移したR772当り10-5の頻度でプラ
スミドpBR322を可動化する(R772のIS70
を介して)ことが明らかにされている。
MBL1164)中で一緒にし、Apr Cmr セグメン
トを相同性組換を介してR772に移転せしめた(図4
のa参照)。次にこの菌株をKMBL100との交雑に
おける供与体として使用した(図4のb)。Inc.P
−1プラスミドR772の転移率は高く、約1%のレシ
ピエント細菌がこのプラスミドを受理した。過去の実験
においては、転移したR772当り10-5の頻度でプラ
スミドpBR322を可動化する(R772のIS70
を介して)ことが明らかにされている。
【0054】従って、R772はプラスミドpRL23
4を、IS70を介して約10-5の頻度で可動化するこ
とが予想された。しかしながら実際には、転移したR7
72当たり10-2のApr 決定部位の転移値が観察さ
れ、転移発生 (transpositionoccurrence) による可動
化について予想される値よりも非常に高かった。この高
い転移頻度はおそらくpRL234とR772との間の
相同性に基くものであろう。
4を、IS70を介して約10-5の頻度で可動化するこ
とが予想された。しかしながら実際には、転移したR7
72当たり10-2のApr 決定部位の転移値が観察さ
れ、転移発生 (transpositionoccurrence) による可動
化について予想される値よりも非常に高かった。この高
い転移頻度はおそらくpRL234とR772との間の
相同性に基くものであろう。
【0055】さらに分析するため、22個のArr コロ
ニーを選択した。その内14個はApr ,Cmr ,Km
r ,Tcr であり、その内8個はApr ,Cmr ,Km
r 及びTcs であった。14個のコロニーはR772及
びpRL234の両者のすべてのマーカーを発現し、こ
のことから完全なpRL234が可動化されたことが明
らかである(可動化頻度は転移したR772当たり6.
5×10-3)。
ニーを選択した。その内14個はApr ,Cmr ,Km
r ,Tcr であり、その内8個はApr ,Cmr ,Km
r 及びTcs であった。14個のコロニーはR772及
びpRL234の両者のすべてのマーカーを発現し、こ
のことから完全なpRL234が可動化されたことが明
らかである(可動化頻度は転移したR772当たり6.
5×10-3)。
【0056】しかしながら8個のコロニーはR772の
マーカー(Kmr )並びにR772の変異したHind
III 断片3のApr 及びCmr マーカーを担持するがベ
クタープラスミドのマーカー(Tcr )を担持しなかっ
た。従ってこれら8個のコロニーはApr Cmr の挿入
を介して部位特定変異を受けたと見られる(転移したR
772当り置換頻度3.5×10-3)。3つの独立コロ
ニーからプラスミドDNAを分離し、そしてアガロース
ゲルによる分析を行った。
マーカー(Kmr )並びにR772の変異したHind
III 断片3のApr 及びCmr マーカーを担持するがベ
クタープラスミドのマーカー(Tcr )を担持しなかっ
た。従ってこれら8個のコロニーはApr Cmr の挿入
を介して部位特定変異を受けたと見られる(転移したR
772当り置換頻度3.5×10-3)。3つの独立コロ
ニーからプラスミドDNAを分離し、そしてアガロース
ゲルによる分析を行った。
【0057】3種類すべてのコロニーについて同一サイ
ズの1種類のプラスミドが観察された。HindIII に
よる消化により得られた断片のパターンはこれらのプラ
スミドについて同じであった。R772のHindIII
消化に典型的な断片4が消失し、2つの新しい断片が観
察された。これらの2つの新断片は、pRL234中の
R772の変異したHindIII 断片3と同一であっ
た。R772由来のプラスミドpRL239(図4のc
参照)中にはベクタープラスミドpTR262のバンド
は観察されなかった。従って、R772は部位特定変異
において確かに変異していた。
ズの1種類のプラスミドが観察された。HindIII に
よる消化により得られた断片のパターンはこれらのプラ
スミドについて同じであった。R772のHindIII
消化に典型的な断片4が消失し、2つの新しい断片が観
察された。これらの2つの新断片は、pRL234中の
R772の変異したHindIII 断片3と同一であっ
た。R772由来のプラスミドpRL239(図4のc
参照)中にはベクタープラスミドpTR262のバンド
は観察されなかった。従って、R772は部位特定変異
において確かに変異していた。
【0058】同じ変異を同じ方法により相互統合プラス
ミドpAL969に導入した。この結果は、R772を
使用した場合に得られた結果に本質上対応し、こうして
得られたR772::Ti相互統合プラスミドのA.ツ
メファシエンス細菌への転移及びこれを用いる植物感染
により正常な腫瘍の形成が明らかに起こった。変異が相
互統合プラスミドのTi成分中に位置しないのであるか
ら、前記の結果は予想通りである。
ミドpAL969に導入した。この結果は、R772を
使用した場合に得られた結果に本質上対応し、こうして
得られたR772::Ti相互統合プラスミドのA.ツ
メファシエンス細菌への転移及びこれを用いる植物感染
により正常な腫瘍の形成が明らかに起こった。変異が相
互統合プラスミドのTi成分中に位置しないのであるか
ら、前記の結果は予想通りである。
【0059】例.相互統合プラスミドpAL969のT
i成分のT−領域の部位特定変異について記載したこの
発明の方法の適切さを、T−領域の断片(EcoRI断
片7、図3参照)をベクターpACYC184上でクロ
ーニングすることにより検討した。受理したプラスミド
pRAL3501は2個のPstI認識部位を含有して
いた。0.5MダルトンのPstI断片をCmr 決定部
位を有する2.7Mダルトンの断片で置換した。この断
片はプラスミドpRL220に由来する。
i成分のT−領域の部位特定変異について記載したこの
発明の方法の適切さを、T−領域の断片(EcoRI断
片7、図3参照)をベクターpACYC184上でクロ
ーニングすることにより検討した。受理したプラスミド
pRAL3501は2個のPstI認識部位を含有して
いた。0.5MダルトンのPstI断片をCmr 決定部
位を有する2.7Mダルトンの断片で置換した。この断
片はプラスミドpRL220に由来する。
【0060】Cmr 決定部位を含有するセグメントの両
側にT−領域に相同の配列を有するそれぞれ2.5Mダ
ルトン及び1.8Mダルトンの長さを有するDNA片が
存在する。次に、この変異を前に記載した方法により相
互統合プラスミドpAL969に転移せしめた。変異は
1〜3Cmr 被接合体の頻度でpAL969に転移し
た。pAL1831と称する1つの変異pAL969プ
ラスミドを分離し、そして種々の制限酵素で消化し、次
に断片のパターンをアガロースゲル電気泳動により確め
た。こうして、pAL1831中にあるpAL969の
0.5MダルトンPstI断片が2.7MダルトンPs
tI断片により置換されていることを確認した。
側にT−領域に相同の配列を有するそれぞれ2.5Mダ
ルトン及び1.8Mダルトンの長さを有するDNA片が
存在する。次に、この変異を前に記載した方法により相
互統合プラスミドpAL969に転移せしめた。変異は
1〜3Cmr 被接合体の頻度でpAL969に転移し
た。pAL1831と称する1つの変異pAL969プ
ラスミドを分離し、そして種々の制限酵素で消化し、次
に断片のパターンをアガロースゲル電気泳動により確め
た。こうして、pAL1831中にあるpAL969の
0.5MダルトンPstI断片が2.7MダルトンPs
tI断片により置換されていることを確認した。
【0061】pAL1831中に存在する置換された外
来性2.7MダルトンPstI断片をT−領域の遺伝子
地図〔Garfinkel 等、Cell 27, 143〜153(1981) 及びOo
ms等、Gene 14,33〜50(1981)〕と比較した場合、変異が
サイクロカイニン様効果を惹起する座に存在することが
明らかである。T−領域の転写地図〔Willmitzer等、Th
e Embo Journal 1,139〜146(1982) 〕と比較した場合転
写体4が変異している。
来性2.7MダルトンPstI断片をT−領域の遺伝子
地図〔Garfinkel 等、Cell 27, 143〜153(1981) 及びOo
ms等、Gene 14,33〜50(1981)〕と比較した場合、変異が
サイクロカイニン様効果を惹起する座に存在することが
明らかである。T−領域の転写地図〔Willmitzer等、Th
e Embo Journal 1,139〜146(1982) 〕と比較した場合転
写体4が変異している。
【0062】相互統合プラスミドpAL1831をE.
コリからA.ツメファシエンスに転移せしめ、その後で
被接合体の1つについて、種々の植物種を用いて腫瘍誘
発能力を試験した。野性型オクトピン株によって誘発さ
れる腫瘍と異なり、pAL1831含有アグロバクテリ
ウムにより誘発される小形腫瘍はタバコにおいて根を発
育せしめた。さらにカランコエにおいては、茎が、正常
な発根のほかに腫瘍を形成することが観察された。トマ
トにおいては、小形腫瘍のみが形成された。これらの観
察は、このような変異の公知の表現型とよく一致した。
この方法の概略を図5に示す。
コリからA.ツメファシエンスに転移せしめ、その後で
被接合体の1つについて、種々の植物種を用いて腫瘍誘
発能力を試験した。野性型オクトピン株によって誘発さ
れる腫瘍と異なり、pAL1831含有アグロバクテリ
ウムにより誘発される小形腫瘍はタバコにおいて根を発
育せしめた。さらにカランコエにおいては、茎が、正常
な発根のほかに腫瘍を形成することが観察された。トマ
トにおいては、小形腫瘍のみが形成された。これらの観
察は、このような変異の公知の表現型とよく一致した。
この方法の概略を図5に示す。
【0063】図6は、腫瘍誘発に寄与する部分と、オク
トピン及びアルギニンの分解代謝に寄与する部分(それ
ぞれ、オクトピン分解代謝遺伝子Occ、及びアルギニ
ン分解代謝遺伝子Arc)とに亜分割されたオクトピン
Tiプラスミドの図を示す。Tra,Inc及びRep
は、それぞれ接合、不和合性及び複製のために機能す
る。Aux,Cyt及びOcsは、それぞれ腫瘍細胞中
でのオーキシン及びサイトカイニン様効果、並びにオク
トピン合成のための座である。
トピン及びアルギニンの分解代謝に寄与する部分(それ
ぞれ、オクトピン分解代謝遺伝子Occ、及びアルギニ
ン分解代謝遺伝子Arc)とに亜分割されたオクトピン
Tiプラスミドの図を示す。Tra,Inc及びRep
は、それぞれ接合、不和合性及び複製のために機能す
る。Aux,Cyt及びOcsは、それぞれ腫瘍細胞中
でのオーキシン及びサイトカイニン様効果、並びにオク
トピン合成のための座である。
【0064】図7は、植物ゲノムに組込まれた後のオク
トピンTiプラスミドのT−領域の構造をさらに詳細に
示す。T−領域の末端に、T−DNAの移入と植物ゲノ
ムへの組込みに関与する約23塩基対(bp)の特別の
塩基配列が存在する。さらに、植物ゲノムに組込まれ
た、1又は複数の目的遺伝子と形質転換体を選択するた
めのマーカー遺伝子とを含有する「人工的」T−DNA
を示す。植物細胞中でのこれらの遺伝子の発現を可能に
するために、RNAの転写のための出発点としての植物
プロモーター(Pp)を含む特別な塩基配列(→)(こ
れらは真核生物における遺伝子発現の制御のために必要
である)が存在する。
トピンTiプラスミドのT−領域の構造をさらに詳細に
示す。T−領域の末端に、T−DNAの移入と植物ゲノ
ムへの組込みに関与する約23塩基対(bp)の特別の
塩基配列が存在する。さらに、植物ゲノムに組込まれ
た、1又は複数の目的遺伝子と形質転換体を選択するた
めのマーカー遺伝子とを含有する「人工的」T−DNA
を示す。植物細胞中でのこれらの遺伝子の発現を可能に
するために、RNAの転写のための出発点としての植物
プロモーター(Pp)を含む特別な塩基配列(→)(こ
れらは真核生物における遺伝子発現の制御のために必要
である)が存在する。
【図1】図1はプラスミドR772の物理的カードを示
す。
す。
【図2】図2はプラスミドpRL246の物理的カード
を示す。
を示す。
【図3】図3は相互統合プラスミドpAL969の物理
的カードを示す。
的カードを示す。
【図4】図4はR772の部位特定変異のモデル実験の
概要を示す。
概要を示す。
【図5】図5は外来性遺伝子をA.ツメファシエンスの
TiプラスミドのT−領域に、及び双子葉植物のゲノム
に組み込むための、この発明の方法概要を示す。
TiプラスミドのT−領域に、及び双子葉植物のゲノム
に組み込むための、この発明の方法概要を示す。
【図6】図6はオクトピンTiプラスミドの概略を示
す。
す。
【図7】図7は植物ゲノムに組み込まれた場合の正常T
−DNA、及び操作された「人工的」T−DNAの構造
の概略を示す。
−DNA、及び操作された「人工的」T−DNAの構造
の概略を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12N 1/21 C12R 1:19) (72)発明者 ロベルト アドリアーン シルペルールト オランダ国,ツェーデー ライデン 2334,アンソニエ デュイックラーン 10 ツェー (72)発明者 ヤッケス ヒル オランダ国,ハーゲー レンクム 8671, レイメルベグ 76
Claims (15)
- 【請求項1】 広宿主域部分とTi−プラスミド部分と
を含んで成る相互統合プラスミドであって、エセリヒア
・コリ(Escherichia coli) 及びアグロバクテリウム・
ツメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)中で複
製可能であり、そして前記Ti−プラスミド部分がT−
領域のボーダー間に外来性DNAを含有していることを
特徴とする相互統合プラスミド。 - 【請求項2】 R772とpTiB6との相互統合プラ
スミドである、請求項1に記載の相互統合プラスミド。 - 【請求項3】 pAL969である、請求項2に記載の
相互統合プラスミド。 - 【請求項4】 前記T−領域ボーダー間に外来性DNA
のみを担持する、請求項1に記載の相互統合プラスミ
ド。 - 【請求項5】 前記外来性DNAが植物で選択可能なマ
ーカー及び植物で発現可能な遺伝子を含んで成る、請求
項1に記載の相互統合プラスミド。 - 【請求項6】 広宿主域部分とTi−プラスミド部分と
を含んで成る相互統合プラスミドであって、エセリヒア
・コリ(Escherichia coli) 及びアグロバクテリウム・
ツメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)中で複
製可能であり、そして前記Ti−プラスミド部分がT−
領域のボーダー間に外来性DNAを含有していることを
特徴とする相互統合プラスミドを有するアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス細菌。 - 【請求項7】 前記相互統合プラスミドが、R772と
pTiB6との相互統合プラスミドである、請求項6に
記載のアグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌。 - 【請求項8】 前記相互統合プラスミドがpAL969
である、請求項7に記載のアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス細菌。 - 【請求項9】 前記相互統合プラスミドが前記T−領域
ボーダー間に外来性DNAのみを担持する、請求項6に
記載のアグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌。 - 【請求項10】 前記外来性DNAが植物で選択可能な
マーカー及び植物で発現可能な遺伝子を含んで成る、請
求項6に記載のアグロバクテリウム・ツメファシエンス
細菌。 - 【請求項11】 広宿主域部分とTi−プラスミド部分
とを含んで成る相互統合プラスミドであって、エセリヒ
ア・コリ(Escherichia coli) 及びアグロバクテリウム
・ツメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)中で
複製可能であり、そして前記Ti−プラスミド部分がT
−領域のボーダー間に外来性DNAを含有していること
を特徴とする相互統合プラスミドを有するエセリヒア.
コリ細菌。 - 【請求項12】 前記相互統合プラスミドがR772と
pTiB6との相互統合プラスミドである、請求項11
に記載のエセリヒア・コリ細菌。 - 【請求項13】 前記相互統合プラスミドがpAL96
9である、請求項12に記載のエセリヒア・コリ細菌。 - 【請求項14】 前記T−領域ボーダー間に外来性DN
Aのみを担持する、請求項11に記載のエセリヒア・コ
リ細菌。 - 【請求項15】 前記外来性DNAが植物で選択可能な
マーカー及び植物で発現可能な遺伝子を含んで成る、請
求項11に記載のエセリヒア.コリ細菌。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL8300699 | 1983-02-24 | ||
NL8300699A NL8300699A (nl) | 1983-02-24 | 1983-02-24 | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07163358A true JPH07163358A (ja) | 1995-06-27 |
JP2528270B2 JP2528270B2 (ja) | 1996-08-28 |
Family
ID=19841472
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59031540A Expired - Lifetime JP2523468B2 (ja) | 1983-02-24 | 1984-02-23 | 双子葉植物の染色体への外来性遺伝子の導入方法 |
JP6213930A Expired - Lifetime JP2528270B2 (ja) | 1983-02-24 | 1994-09-07 | 外来性遺伝子を含むシャトルプラスミド |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59031540A Expired - Lifetime JP2523468B2 (ja) | 1983-02-24 | 1984-02-23 | 双子葉植物の染色体への外来性遺伝子の導入方法 |
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---|---|
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JP (2) | JP2523468B2 (ja) |
AT (1) | ATE58557T1 (ja) |
DE (1) | DE3483621D1 (ja) |
NL (1) | NL8300699A (ja) |
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WO1988003564A1 (en) * | 1986-11-03 | 1988-05-19 | Biotechnica International, Inc. | Plant transformation |
US5128460A (en) * | 1989-04-04 | 1992-07-07 | Genelabs Incorporated | Recombinant trichosanthin and coding sequence |
CA2018884A1 (en) * | 1989-06-22 | 1990-12-22 | Irving Gordon | Plant transformation construct |
US6350934B1 (en) | 1994-09-02 | 2002-02-26 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid encoding delta-9 desaturase |
US5733744A (en) * | 1995-01-13 | 1998-03-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Binary BAC vector |
RU2090613C1 (ru) * | 1995-09-01 | 1997-09-20 | Каньчжэн Юрий Владимирович Цзян | Устройство для передачи натурального информационного питания биологическому объекту "биотрон-цзян" |
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