JPS59140885A - 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 - Google Patents
植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は組換え分子、その調製法、植物細胞へのその導
入法、およびゲノム中に外米ＤＮＡ配列を含んでいる植
物細胞またはその植物に関する。 更に詳しくは、本発明は適当な宿主植物細胞中で発現さ
れるＤＮ’Ａ配列に関する。本発明に係る組換えＤＮＡ
分子は、植物の成長、栄養物としてのその品質の改良、
または有用な代謝物（例えばアルカロイドあるいはステ
ロイドの前駆体）の生産、に有用なアミノ酸やポリペプ
チドの如ト生産物を暗号化している配列を有することを
その特徴としている。 以下に本明細書で使用する用語について説明する。 ＋）ＯＩＩ＋サイト 特異的にｍｏｂ １９能体が相互
作用して自律的Ｄ Ｎ’ Ａ転移移動を開始させる１）
ＮＡ領域境界配列 Ｔ−ＤＮＡの末端を含むＩ） Ｎ
Ａ配列広範囲宿主レプリコン 多種多様の宿主細胞に転
移（トランスファー）され、保持され得るＤＮＡ分子 カルス組織 有機的でない、分化していない細胞の塊 クローニング 無性生殖により、１個の生物（有機体）
またはＤＮＡ配列から誘導された一群の該生物またはＤ
ＮＡ配列を得る操作過程、または、よりわかり易く言え
ば、特定の有機体またはその一部を分離し、そのサブ７
ラクシヨンを均質な集団（個体群）として増殖させる操
作過程クローニング媒体 宿主細胞中で複製し得るプラ
スミド、７アージＤ Ｎ Ａまたはその池のＤＮＡ配列
であって、そのＩ） ｌ’Ｊ Ａ配列は、例えば複製、
外殻蛋白質の生産などのそのり、ＮＡの必須の生物学的
機能、あるいはプロモーターまたは結合サイト（部位）
をイマ１随的に失なうことなく、その場所で確定的にそ
の配列を切断することのできる１個または少数のエンド
ヌクレアーゼ認識サイト（部位）を持っており、また、
それが導入された細胞（形質転換された細胞）を同定確
認するのに有用なマーカー（例えばテトラサイクリン耐
性あるいはアンピシリン耐性）を持っていることで特徴
づけられるＤ Ｎ Ａ配列。クローニング媒体はベクタ
ーと呼ばれることが多い。 暗号配列 ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するＤＮ
Ａ配列 □ 相互組込み体（相互統合体、コインテグレート）２個の
環状ＤＮＡ分子開の単一乗換え（１回の交叉）の結果得
られる構造体 トランス相補性 他のレプリコンに物理的に結合してい
ないＤＮＡ分子（レプリコン）が、その結合していない
他のレプリコンにとって必要な、欠落している拡散物質
を供給することができる過程 接合（フンジュゲーンジン） 細胞どうしが接触する間
に、１つのタイプの細菌から他のタイプの細菌にＤＮＡ
が転移すること 連狽ス 相同なりＮＡ配列間で遺伝物質が交換するこ
と 欠朱黄泗 １個のＤ Ｎ Ａ配列が除去され、その代り
として異なったＤＮＡ配列で置換されること匁北 ある
細胞の子孫か特殊な構造と機能を確立し、それを維持す
ること ＤＮＡ配列またはＤ Ｎ Ａセグメン）１４接するペン
トースの３゛位と５゛位の炭素間の燐酸ジエステル結合
により互０に連結したヌクレオチド群の一直線の配列 二重氷像 相互組込み（コインテグレート）構造が２
個の環状ＤＮＡ分子に分解する過程。この過程は遺伝情
報を交換するのに利用される。このＤＮ、Ａ環状体の一
方は、それによって組換えが生じ得る標的Ｄ Ｎ Ａと
相同な２つの領域を持っており、この２つの領域は、□
標的Ｄ’ Ｎ ’Ａと交換される非相同Ｄ Ｎ Ａ配列
をはさんでいる。もし１回目の交叉と同じＤＮＡ領域で
２回□目の交叉が起ると、もとのＤＮＡ環状本か生成す
る。この２回目の交叉か第２の相同領域で起ると、２つ
の環状体の間で遺伝子の交換が起ることになる。 発現゛構造遺伝子によりポリペプチドが生産される過程
。これは転写と翻訳の組合せである。 発現調節（コントロール）配列 構造遺伝子に有−効１
こ結合された時、それらの構造遺伝予め発現を調節し、
統制するヌクレオチド配列 ４グアＲ５１ｔ Ｆ因子（Ｆはｆｅｒｔｉｌｉｔｙ（
生殖ブハ）を持ったプラスミドセあって、Ｆ因子を持た
ない宿主に該プラスミドのコピーを移入することのでき
るプラスミド 遺伝子 ２つの部分、即ち（１）遺伝子承産物のための
暗号配列および（２）その遺伝子が発現されるかどうか
を調節しているプロモーター領域内の配列、から構成さ
れているＤＮＡ配列 グアＡ 細胞またはウィルスの全Ｄ Ｎ Ａ。これは５
ｈｉｎｅ−Ｄａ１８ａｒｎｏ配列の様な配列を含む、オ
ペレーター、プロモーター、リボゾームの結合お上び相
互作用配列と共に、就中ポリペプチドを暗号化している
構造遺伝子を含んでいる。 遺伝子型 ある生物に含まれている遺伝情報の全て 相同的（性）組換え 相同配列を含んでいるＤＮＡのシ
つ領域間の組換え Ｉ型ブラスミヒ Ｆとは異なる不和合性グループの一群
の自ら転移し得るプラスミド 不和合性 選択圧（ｓｅｌｅｃ’Ｌｉｖｅ ｐｒｅｓｓ
ｕｒｅ）がないと、同一め細胞に２個のＤＮＡが共存し
得ないこと 挿入 ＤＮＡ配列を、別の分子のＤＮＡ配列内に付加す
ること リーダー配列 ５゛末端から最初の構造遺伝子の先端に
至るまでのｍ ＲＮ Ａの領域。これには構造遺伝子の
暗号配列の翻訳を開始するのに重要なか、生成した４個
の細胞のそれぞれに於いてｉｎ個に減少する２回の連続
した分裂。この過程は有性生殖に於いて重要である。 ＋ｅｏｂ （授動機能体）ｔｒａ機能体との組合せに於
いてのみＤＮＡの移動（転移）を促す一連の生成物。 ｍｏｌｒはｂｏｆＩ＋サイトを含んでいるプラスミドの
移動を促すことができる。 櫃動 別の細胞へ移動することので外ない１）ＮＡＡ
分子、池のＤＮＡ分子の助けを借りて移動する過程 授動ヘルパープラスミド 池のプラスミドが持っていな
い、別の宿主細胞へ移動するための拡散性生成物を供給
することができるプラスミド非接合性組換えプラスミド
細胞どうしが接触している開に、それ自体では、もと
の宿主細胞から他の宿主細胞へ移動することができない
ＤＮＡ分子。移動するには、他のＤＮＡ、例えば（ａ）
ヘルパープラスミドによって供給される機能体が必要と
なる。 ヌクレオチド 糖部分（ペントース）、燐酸エステルお
よび含窒素異項環塩基で構成されているＤＮＡまたはＲ
Ｎ Ａの単量体単位。この塩基は糖部分とグリコシド結
合で連結しており （ペントースの１゛位の炭素）、こ
の塩基と糖と結合したものがヌクレオシドである。ヌク
レオチドの特性はこの塩基によって決まる。ＤＮＡの４
個の塩基はアゾ゛ニン（“Ａ゛）、グアニン（“Ｇ゛）
、シトシン（“’ｃ”）およびチミン（Ｔ゛）である。 ＲＮＡの４個の塩基によって生成する個体の観察し得る
特性プラスミド それ自体が宿主細胞中で複製される、
完全な（無傷の）レプリコンからなる非染色体性の２本
鎖ＤＮＡ配列。このプラスミドを単細胞生物に入れると
、そのプラスミドのＤＮＡによって、その生物の性質が
変わる、即ち形質転換される。例えば、テトラサイクリ
ン耐性（ＴｃＲ）のための遺伝子を持ったプラスミドに
より、本来はテトラサイクリンに感受性のある細胞が耐
性のある細胞に形質転換される。プラスミドによって形
質転換された細胞を形質転換体と呼ぶ・。 ポリペプチド 隣接するアミノ酸どうしがα−７ミノ基
とカルボキシル基とのペプチド結合により互いに連結し
た線状のアミノ酸連鎖 プロモーター領域 遺伝子の転写を統制している、暗号
配列の開始点より上流のＤＮＡ配列７’Ｄ％二！二配列
ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列であり、ポリメラ
ーゼはそれより下流の配列の忠実な転写を促進する。 組換えＤＮＡ分子または雑種（ハイブリッ１つｐＦ３
Ａ 少なくとも２個のヌクレオチド配列からなり、そ
の一方の配列は、自然界では通常第２の配列と一諸に存
在することがない、その様な配列からなる雑種のＤ Ｎ
Ａ配列 ■え Ｄ Ｎ Ａ分子またはＤ Ｎ Ａ分子の一部分の
新しい結合体を創製すること 部劇跡栽 ＤＮＡの別の領域に於ける配列と同じＤＮＡ
配列を持っているＤＮＡ領域 レプリコン ＤＮＡの複製開始サイトおよび複製を支配
するのに必要な機能を指定している遺伝子を持った自己
複製遺伝子単位 制限フラグメント 特定の標的ＤＮＡ配列を認識する酵
素による２本鎖開裂によって生じるＤＮＡ分子 ＲＮＡポリメラーゼ ＤＮＡのＲＮＡへの転写をつかさ
どる酵素 選択可能なマーカー遺伝子 あるＤ Ｎ Ａ配列であっ
て、それがある細胞内で発現された時、その増殖培地に
置くと、この２つのタイプの細胞を区別することができ
る。通常使用される選択可能なマーカー遺伝子は抗生物
質耐性を暗号化している遺伝子である。 単一乗換 ２個の環状Ｄ Ｎ Ａ分子を組換えて、相互
組込みされた大きい環状体を形成させる操作過程 週カ消化子 ポリペプチドを暗号化している遺伝子 一エニ■用へ 植物細胞ゲノムに安定に統合（組込み）
されることが見い出されている′「１プラスミドの部分 子−領域 植物細胞ゲノムへ移動（転移）するＤＮＡ配
列を含んでいるＴｉプラスミドの部分子ｉプラスミド
感受性植物に腫脹（クラウンガル）を誘発させるための
遺伝情報を含んでいるＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ Ｌ
ｕ＋ｎｅｆａｃｉｅ＋＋ｓ株に存在する大きいプラスミ
ド Ｔ Ｌ −Ｄ Ｎ ＡおよびＴＲ−ＤＮＡ オクトピ
ンクラウンガル腫脹細胞は２つのＴ −Ｄ Ｎ Ａ配列
、即ち左Ｔ−１）ＮＡ（ＴＬ−ＤＮＡ）ｔ；よび右Ｔ−
ＤＮＡ（ＴＲ−ＤＮＡ）を含有し相る。ＴＬ−ＤＮＡは
ツバリン腫脹細胞のＴ−ＤＮＡと共通している配列を持
っているがＴＲ−Ｄ、ＮＡは持っていない。 ｔｒａ （転移Ｉ」躯其〃 プラスミドに暗号化され
ている拡散性の生成物、および細胞間のＤＮＡ転移の間
に利用される作用部位の両者を指す。例えば２つの細胞
の開の橋を作るのに必要な生成物およびＤＮＡ転移が開
始する部位。 灯 構造遺伝子から＋ｎＲＮＡが生産される過程、また
は、塩基対（ベースベア）が形成され、ＤＮＡに含まれ
ている遺伝情報に指令されて相補性の塩基配列のＲＮ
Ａ鎖が形成される過程形質転換 細胞のＤ Ｎ Ａ補体
（ｃｏｍｐ ｌ ｅｍｅｎ ｔ ）に外米性ＤＮＡが導
入されることによって生じる遺伝′的１１纂飾 朋夙＋ｎ ＲＮ Ａからポリペプチドが生産される過程
、あるいは、ｍＲＮＡ分子に存在する遺伝情報が、ポリ
ペプチド合成において特定のアミノ酸の順序を指定する
過程 １１分化表現型 いかなる特異な部分もなく、組織中の
細胞の外観が均一であること ベクター 異なった宿主細胞間を移動するように設計さ
れたＤＮＡ分子 組換えＤＮＡ技術の進歩によって、微生物の遺伝子工学
（遺伝手術）に新たな展望が開けた。もし１個の体細胞
から、完全な生物を再生することができたら、これらの
技術は多細胞真植生物にまで広がるであろう。ある種の
高等植物の細胞は、優れた再生能力を有し、従って高等
生物の遺伝子１ニ学にとってかっこうの祠料となる。 ｔＩｂ物の遺伝子工学の主たる問題点は、外米性１）Ｎ
Ａを植物ゲノムに導入する為の系の利用性にある。この
様な系には、ダラム陰性土壌細菌のＡ８ｒｏｂａｃＬｅ
ｒｉｕｍ Ｌｕｍｅｆａｃｉｅｎ、ｓが持っている腫脹
誘起（Ｔｉ）プラスミドがある。この微生物は、広範囲
の双子葉植物の損傷組織に、ラウンガル（ｃｒｏｕｕ＋
８ａｌｌ、冠状コブ）と呼ばれる新生物的形質転換を引
き起す原因となることか′わがっている。この増殖性の
新生物は、オパイン（ｏｐｉｎｅｓ）と呼ばれる１゛１
に特異な新しい代謝物を合成する。この形質転換は、分
子レベルでみると、Ｔｉプラスミドの実体のはっきりわ
かっているＴ−ＤＮＡ（転移１）ＮＡ）７ラグメントが
植物細胞ゲノムに転移して安定に組込まれたことによっ
て起る。換言すれば、クラウンガル腫脹は、その染色体
ＤＮＡに、腫脹セルラインをもたらしたＴ１プラスミド
中のｌ）Ｎノ＼配列と相同のＴ Ｉ） Ｎ Ａと呼ば
れるｌ） Ｎ Ａセグメントを含んでいる。。あらゆる
場合に於いて、このＴ −Ｄ ＮＡは、連続したー・連
の１゛１プラスミドＤ Ｎ Ａに相当しており、また、
これと共ｊＵ線性である。従ってこれはＴ−領域と呼ば
れる。 Ｔｉプラスミドはクラウンガノ目ｌｆｔ胞で合成された
オパインのタイプによって分Ｍ２れる。クラウンガル細
胞で７パリン（Ｎ−ａ−（１，３−ン゛カルボキシプロ
ピル）−Ｌ−アルギニン１の合成を惹起させるＡＢｒｏ
ｂａｃＬｃｒｉｕ＋ｎ株はツバリン株と呼ばれ、オクト
ピンＩＮ−α−（Ｎ−１−カルボキシエチル） −り、
−アルギニン１を合成するものはオクトピン株と呼ばれ
る。これらか最も筐通に用いられるＡ８ｒｏｂａＣ１ｅ
ｒｉｕ＋ｎ、４朱である。 植物の遺伝手術にＴ −１） Ｎ Ａをベクターとして
使用する試みがモデル実験で行なわれた。この実験では
、インビボにおいて、Ａｇｒｏｂａｃｌｅｒｉｕｍ
Ｔａ２株のＴｉプラスミドからのｉ’ −１） Ｎ Ａ
の右側境界部の近くに１・１に１１細菌性トランスポツ
ン（Ｌｒａｎｓｐｏｓｏ＋＋） Ｔｏ ７が挿入された
。すると、このＴ１プラスミドを持っているアゲロバク
チリアによって惹起される腫脹中のツバリン合成が消滅
した。更に、す１ンザン・プロッティング・ハイフ゛リ
ディゼーシａンの結果、その様な挿入を行なわなければ
正常であるＴ−ＤＮＡ配列の一部分として、この腫脹の
染色体１） Ｎ Ａ中に全Ｔ１１７が存在することかわ
かった（１−１ｅｒｎａｌｓＬｅｅｎｓら、Ｎａｔｕｒ
ｅ２８７（１り ８ （１） 、 ６ Ｔｈ４−６５６
； ｔｌｏｌｓｊ、ｅｒｓ呟Ｍｏ１． Ｇｅｎ、
ＧｅｎｅＬ、 ］ ８５ （１９８２） ＋２
８３−２ ｓ ９）。この様に、２３ｋｂＴ ＤＮＡ
に１−Ｓ ｋｂｌ） Ｎ Ａ ７ラグメントを導入して
も、２３ｋｂＴ−Ｄ Ｎ Ａの植物細胞ゲノムへの転移
能力に変化は見られなかった。 ツバリン株、ＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍＴ ３ ？の
′ｒｉＴｉプラスミド’ −Ｄ Ｎ Ａの境界部は非常
に正確に調べられている。これは全ツバリンＴｉプラス
ミドの極く一部、約２３ｋｂに過ぎない。更に、この′
ｒ−ＤＮＡの境界部は知られている：即ち、この′１゛
−１） Ｎ Ａの境界部を決めているヌクレオチド配列
が調べられ、ツバリン１゛ｉプラスミドの同じ領域と比
較された（ Ｚ ａｍｂｒｙｓｋ ｉら、５ｃｉｅｎｃ
ｅ ２０９ （１９８０）、 １３８５’−１３９１
；Ｚａｒｏｂｒｙｓｋｉら、Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐ
ｐｌ、 ＧｅｎｅＬ、 １ （１９８２）、３
６ １−３７０ ）。このＴ−領域の境界部が、Ｔ−
ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの組込みに最も関係している
様である。 ＤＮＡを植物細胞へ転移させる為のベクターとしてＴｉ
プラスミドを使用するには、転移したＤＮＡの境界部を
決めているＴＤＮＡ配列を知ることが基本的に必要であ
る。そうすれば、外米性Ｄ Ｎ Ａをこの境界内に挿入
し、確実に植物細胞ゲノムヘ転移させることがで外る。 更に、この系を利用しようとすれば、形質帖換された植
物細胞が、その生育特性において腫瘍の性質を持たず、
正常であるということが重要である。ｉ’ −１，）
Ｎ Ａ転移の後、正常細胞を生産するには、Ｔ −Ｄ
Ｎ Ａ自体によって暗号化されている機能を知る必要が
ある。 従って、どの領域が腫瘍表現型に関係しているが調べる
ために、Ｔｉプラスミ、ドのＴ−領域の徹底的な遺伝子
分析が行なわれた。 Ｔ −Ｄ Ｎ Ａは、クラウンガル表現型の原因となる
機能体を暗号化している。その遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡの
特定の領域に局在化している（ Ｌｅｅ＋ｏａｎｓ呟Ｅ
ＭＢＯＪ、 １（１９８２）、１４７−１５２； Ｗｉ
ｌｌ＋ｎ１Ｌｚｅｒ呟ＥＭＢＯＪ、 １（ｉ９ａ２）。 １３９−１４６ ）。一般に、腫瘍カルス組織の非分化
表現型を支配している少なくとも４つの遺伝子が存在し
ている。これらの遺伝子の突然変異体（ミュータント）
は、新芽様のあるいは根の様な外観の形質転換組織を形
成させることができる。 この後者の成果は、腫瘍組織ではなく正常植物組織中で
発現させる為にＤＮＡを植物に転移したいと思う場合に
は特に重要である。 最近、完全な正常植物に再生することができる形質転換
新芽を誘導するＴｉプラスミド変異体がみつかった。こ
れらの植物は繁殖力が旺盛であり、減数分裂によってＴ
−１’） Ｎ Ａ特異配列を伝達することさえした：
即ち、子孫の植物もＴ−ＤＮＡ特異配列を含んでいた（
０ｔｔｅｎ ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ。 Ｇｅｎｅｔ、１８３（１９８１）、２０９−２１３ ）
。 しかし、この形質転換植物組織は、その染色体Ｉ）ＮＡ
中に、腫瘍表現型を支配しているＴ 、−ｌ） Ｎ Ａ
領域が除去される大カフがすな欠落（欠失）が発生した
ことにより、着しく小さくなった’ｆ’ −Ｄ Ｎ Ａ
を含んでいた。この欠落が当初の形質転換時に起ったの
か、新芽の形成をもたらすその後の成り行きで起ったの
かは不明である。 Ｔｉ プラスミドは太きく （２００ｋｂ）、そのＴｉ
プラスミドの種々の場所に存在している多くの遺伝子が
植物の形質転換に関係している。従って、Ｔ−領域内の
適切な場所に特殊なエンドヌクレアーゼ認識サイトを有
し、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させて安定に挿
入するのに必要な全ての機能を持った′１゛ｉプラスミ
ド由来の小型のクローニングベクターを組み立てること
は不ｑ能である。所望のＤ Ｎ ＡフラグメントをＴ１
プラスミドのＴ−領域の特定の制限酵素開裂サイトに導
入する為の既知の方法の１つは、Ｅｓｃｌ＋ｅｒｉｃｌ
＋ｉａ ｃｏｔ ｉ（大腸菌）におけると同様、Ａ ｇ
ｒｏｂａｃ ｔｅｒ ｉ ｕｎ＋においても複製するこ
とができ、Ｔ −Ｄ Ｎ Ａの所望の制限７ラグメント
を含んでいるクローニングプラスミドを組み立てること
である。この様なりローニングベクターは「中間ベクタ
ー」と命名された。 この様な中間ベクターは、Ｔ−領域によって１１Ｒ号化
されている機能を分析するのに使用された（Ｌｅｅｒｐ
ａｎｓ ら、Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ａｐ１山１． Ｇｅｎ
ｅＬ、］ （１９８］）、１４９−１６４）。 本発明は、発現し得る遺伝子を植物細胞ケ゛ツムへ導入
する方法に関するものである。本発明の１つの目的は所
望のあらゆる遺伝子（群）を導入することのできる改良
されたアクセプター１゛ｉプラスミドを提供することに
ある。導入される所望の遺１云子（相−）は、そのアク
セプターＴ１プラスミドの相当する領域と相同の領域を
持った新規な中間クローニングベクター内に含まれてい
る。この中間クローニングベクター・を提供することも
本発明のＬ１的の１つである。 所望の遺伝子（群）のアクセプターＴｉプラスミドへの
導入は、ＡＢｒｏｂａ’ｃＬｅｒ’ｉｕ＋ｏに保持され
ているアクセプターＴｉプラスミドと中間クローニング
ベクターの２つの相同ＤＮＡセグメントの間で起る単一
乗換えによって達成される。この中間クローニングベク
ターは、ヘルパープラスミｒを使って、それが増殖する
Ｅｓｃｂｅｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌ ｉからＡｇｒｏ−
ｂａｃｔｅｒｉｕｍに摂動される。この様なヘルパープ
ラスミドおよび摂動のための機能は知られている（Ｆ
ｉｎｎｅｇａｎ ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｌ
、 ］ ８５ （１９８２）、３４４−３５１）。 Ａｇｒｏｌ＋ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎでの単一乗換えの結果
、ハイブリッドＴｉ プラスミドベクターが得られる。 この様なハイブリッドＴｉプラスミドも本発明の目的の
１つである。 Ａ ｇｒｏｂａｃ Ｌｅｒ ｉ ｕ＋ｏに保持されたこ
のハイブリッドプラスミドベクター（以降、ベクター組
成物という）を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所
望の遺伝子生成物の発現について又クリーニングする。 植物細胞をベクター組成物で感染させて形質転換植物細
胞を調製するこの方法、その形質転換された植物細胞、
およびそれから発生した植物を提供することも本発明の
目的である。こめ技法はＡ８ｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍの
植物転移性のプラスミド全てに適用することか゛でトる
。 以Ｆに添（；Ｉの図面について詳細（三説明する。 第１図は、境界配列（１）および（２）を除き、１゛−
領域の内部部分を除去して得られる本発明の７クセプタ
ー′１゛ｉプラスミ、ドの１態様を示している。 この境界配列は、Ｔ−領域を植物細胞□ゲノムに組込む
のに必須である。境界配列（１）と（２）の開の領域（
３）が、植物に啄移されるであろうＩ）’ＮＡセグメン
トである。このアクセプター１゛ｉプラスミドは、中間
クローニングベクターを単一乗換え（上よって組込ます
ことを可能にしている中間クローニングベクター内のＤ
ＮＡ配列の少なくとも一部と相同のＤＮＡ配列を持った
ＤＮＡセグメント（３）を含んでいる。Ｔｉプラスミド
領域（４）は、λｇ第２図は、単一乗換えによって第１
図の７クセプターＴｉプラスミド（三挿入される本発明
の中Ｉｌｌクローニングベクターを示している。このベ
クターは、所望の単一乗換えを可能にするアクセプター
ＴｉプラスミドのＤ Ｎ Ａセメメン１−＜３）の少な
くとも一部と相同なり Ｎ Ａ配列を持ったクローニン
グ媒体Ｄ Ｎ Ａセグメン）（３’）を含んでいる。 更に、この中間クローニングベクターは、その天然のプ
ロモータ配列を備えた遺伝子あるいは遺伝子群（５）を
含んでいる。この組み立てに於いては、一般に植物の遺
伝子を使用することができる。それは、他のものに比較
して発現され易いと思われるからである。しかし、原理
的には、全ゆる所望の遺伝子を挿入することができる。 この中間クローニングベクターは選択マーカー遺伝子（
６）を含んでいてもよい。この遺伝子は、植物細胞中で
この遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列を含ん
でいなければならない。このマーカー遺伝子を含んでい
る植物細胞は、それを含んでいない細胞より、成長の選
択有利性を持っていなければならない。何故な呟この様
にして、このマーカー遺伝子を含んでいるーＤＮＡによ
って形質転換された植物細胞を、非形質転換細胞と区別
することかできるからで゛ある。 第３図は、第２図の中間クローニングベクターとＭＩｔ
の、第１図のアクセプターＴｉプラスミドに単一乗換え
によって挿入される本発明に係る中間クローニングベク
ターのもう１つの態様を示している。これは、クローニ
ング媒体ＤＮＡセグメン）（３’）、所望の遺伝子の統
制のとれた発現を可能にする外米性プロモーター配列（
８）、および、所望により、マーカー遺伝７−（６）を
含んでいる。 第４図は、第１図の７クセプターＴｉプラスミドおよび
第２゛図並びに第３図の中間クローニングベクターから
の、単一乗換えによる本発明に係るハイブリッド′１゛
ｉプラスミドベクターの調製を示す模式図である。 第５図は、Ｅ、ｃｏｌｉからアクセプター′ｌ″ｉプラ
又ミドを含んでいるＡ８ｒｏｌ＋ａｃＬｅｒｉｕ＋＋＋
への、中間クローニングベクターの遺伝子転移に関する
過程の概略を示したものである。ｖ、１段階は、中間ク
ローニングベクターを含んでいるＥ、 ｃｏｌｉ株（１
）と、その後のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとの接合の
為の２つのヘルパープラスミドを含んでいるもう１つの
Ｅ、ｃ。 １１株との接合である。１方のヘルパープラスミドはプ
ラスミド転移に重要なり Ｎ Ａ配列（Ｌｒａ）を含ん
でおり、他方のヘルパープラスミドは摂動に重要な配列
（＋ｏｏｂ）を含んでいる。接合によってこれらのヘル
パープラスミドかＥ、 ｃｏｌｉ株（１）に導入される
と、そこに含まれている中間クローニングベクターが池
の細菌株へ転移することかでとる様になる。ｌｒａおよ
び＋ｏＯ１１ヘルパープラスミドは、中間クローニング
ベクターが持っている抗生物質耐性ｖ−ｈ−（Ａｂ”）
、！：ハ異ナルｖ ７＞−１Ａ Ｉ３’ ”およびＡ
ｂｒ３をそれぞれ持っている。従って、全れる。この摂
動株（３）を、第１図の７クセプターＴｉプラスミドを
含んでいるＡ、 Ｌｕ＋Ｏｅ「ａｃｉｅｎｓ株（４）と
接合させ、中間クローニングベクターの抗生物質耐性マ
ーカ丁で選択する。中間クローニングベクターはＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎ中で複製でたないので゛、受容
アクセプター′１゛Ｉプラスミドと相！１１組込み体を
形成した場合にのみ、保持されることができる。Ａ８ｒ
ｏｂａｃＬｅｒｉ叩中のこの相互組込み構造１似りが、
Ｉ：） Ｎ Ａを植物細胞ゲノムに転移させるのに使用
される最終的なハイブリッド１゛１プラスミドである。 第６図は、第１図に示したものと同類のモデルアクセプ
ター′１゛ｉプラスミド（タイプｌ＼）の組み立てを示
している。ここでは、′ｌ″ｉブラ又ミドと、このもと
のＴｉプラスミドの一部と置き換わるＤＮＡ配列を含ん
でいる別のプラスミドとの間で、二重乗換えが起る。よ
り具体的に述べると、小さい方のプラスミドはクローニ
ング媒体（；））の中に′「−領域の境界配列（１，２
）を含んでいる。二重乗換えの結果−１Ｔ領域の内部の
１部分が除去され、代ってクローニング媒体で置き換え
られる。得られたアクセプターＴｉプラスミド（Ａ）は
、境界配列（１，２）の間に含まれているＤＮＡを植物
細胞ゲノムに転移させることがでとる。得られた、形質
転換されたＤＮＡは、Ｔｉプラスミド（Ａ）では新生物
の増殖を支配している遺伝子か除去されているので腫瘍
性のクラウンカ゛ル組纒をつくらない。Ｔｉプラスミド
（Ａ）は、クローニング媒体（３）と相同性を有するあ
らゆる中間クローニングベクター用の極めて普遍的なア
クセプター１゛１ プラスミドである。このクローニン
グ媒体（３）は通常第７図は、中間クローニングベクタ
ーをＥ、ｃｏｌｉ宿主細胞中で組みたてる工程を模式的
に示したものである。制限エンドヌクレアーゼサイトＲ
１に囲まれた所望の遺伝子（５）および制限エンドヌク
レアーゼサイトＲ２で囲まれた選択し得るマーカー遺伝
子（６）を、酵素Ｒ１およびＲ２の為のそれぞれ１つの
制限サイトを含んでいるクローニング媒体（３゛）に挿
入する。３つの分子を全て制限酵素Ｒ，および／または
Ｒ２で消化し、Ｄ Ｎ Ａ ’）ガーゼｉ用いてライゲ
ーション（結紮ルで中間クローニングベクターを形成さ
せる。このクローニング媒体（３゛）は、細菌性遺伝子
学の選択マーカーとして使用する抗生物質耐性（Ａｂ”
）を暗号化しているもう１つのＩ） Ｎ Ａ配列を含ん
でいなければならない。所望の遺伝子（５）はその天然
のプロモーターまたは第２図および第３図に概説した外
米性プロモーターの支配下にある。 第８図は本発明に係るアクセプター１゛１プラスミド（
タイプＢ）のもう１つの具体的態様を組み立てるための
模式図である。この態様では、境界配列（１）および（
２）のすぐ外側のＴｉ配列に相同の、それぞれｌ） Ｎ
Ａ配列（９）および（１０）を含んでいるクローニン
グ媒体とＴｉプラスミドとの間で二重乗換えが起る。こ
の二重乗換えによって、境界配列（１）および（２）を
含んでいるＴ−領域′ｌ゛全体が削除され、それがクロ
ーニング媒体（３）で置き換えられる。′「ｉプラスミ
ド（Ｂ）は、境界配列（１）および（２）の間にクロー
ンされた所望の遺伝子を含有している中間クローニング
媒体配列のためのアクセプターである（第９図参照）。 第９図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミド（Ｂ）
に単一乗換えによって挿入される本発明の（１）および
（２）を含んでいる。これはまた、２つのプラスミド間
の相同的組換えを可能にするため、アクセプターＴｉプ
ラスミド（Ｂ）中のクローニング媒体配列と少なくとも
一部が相同であるクローニング媒体配列（３゛）をも含
んでいる。 第１０図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミドおよ
び相当する第９図の中間クローニングベクターか呟本発
明のノへイブリ・ンドＴｉプシスミドベクターの組み立
てを示す模式図である。単−乗換えによって第９図の中
間クローニングベクターが第８図のアクセプターＴｉプ
ラスミド（Ｂ）に導入される。 第１１図〜第２′Ｏ図は本発明をより具体的に例示する
ものである。 第１１図は、５．２ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメ
ントＡｃｇＢのｐＢＲ３２２への挿入を示してν）る（
Ｚ ａｍｂｒｙｓｋ ｉ ら、Ｓ、ｃｉｅｎｃｅ ２
０９ （１９８０）。 １３８５−１３９１）。このフラグメント ＡｃｇＢは
ツバリン′ｌ″ｉプラスミドの左右の境界領域を含んで
いる。このクローンＩＩＡｅｇＢは、第６図に示したｌ
−Ａ−タイプ」のアクセプタープラスミド、■＋に＼’
３８５０の組み立てに使用される。野生型Ｔｉプラス
ミドの左右の境界領域を含んでいる、二のクローンされ
た制限７ラグメントを使って、クローンｐＡｃｇＢと類
似のクローンを得ることができることは、当業者には容
易に理解されるはずである。 第１２図はツバリン′Ｉ″ｉプラスミド１＋ Ｇ＼゛３
３３５ｊの′「−領域を示している。Ｉ−ｆｉｎｄ Ｉ
ｌｌ制限エンドヌクレアーゼサイトは（Ｈ）で示しであ
る。変異したＨｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント１９は（
１９゛）で示しである。カナマイシンまたはネオマイシ
ン耐性を（；Ｉ−りするアセチルホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子はａｌ）［で表わし、これは黒くぬりつぶし
た部分に存在している。Ｔ ９ｍ域の境界は矢印で示し
である。ツバリンシンターゼ（ｓｙｎｔｌ＋ａｓｅ）遺
伝子は１１０Ｓで表わした。数値は、Ｄｅｐｉｃｋｅｒ
ら（１市ｓｎ＋１ｄｙ３（Ｌ９８（、））−１９３２１
１）の方法による制限７ラグメントの寸法（大１１を表
わしている。 Ｔｉプラスミミドｃ；Ｖ３８３８は、実施例１およびそ
こに挙げた２つの文献に従って組み立てることができる
。 第１３図は、アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０の組み立てを示している。プラスミド１）Ｂ Ｒ３２
２−ｐＡｃｇＢ（第１１図）は、線状化した形で描いで
ある。Ｉ）ＢＲ３２２の配列は斜線を入れた領域で示し
、１）ＢＲ３２：２の７ンビシリン耐性遺伝子はＡ」で
示した。第１２図に示した１）ＧＶ３８３９のＴ−領域
の一部がここに描かれている： ｐＡｃｇＢ との相同
的組換えに関与するＨｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント（
１０）および（２３）およびａｐｔ遺伝子が含まれてい
る。二重乗換えによってｐＧＶ３８５０および失われた
ａｐｌ遺伝子を含むもう１つのレプリコンが組み立てら
れる。 第１４図は、実施例２に詳細に記載した中間クローニン
グベクターｐＧ Ｖ ７０ （−，１の組み立てを模式
的に示したものである。制限エンドヌクレアーゼサイト
を示すのに以下の略号を用いた： Ｂ＝Ｂａｍ！−１１
、Ｂｇ ＝Ｂｇｌ ＩＩ 、Ｅ＝ＥｃｏＲＬ ）−１＝
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 、５＝Ｓａｌ Ｉ、 Ｓ＋ｎ＝Ｓ＋
＋＋ａＴｏ抗生物質耐性を示すのに以下の略号を用いた
：Ａ１）ニアンヒシリン、Ｃｔｏ＝りＶラムフェニコー
ル、Ｓｉｌ＋＝ストレプトマイシン、Ｔｃ−テトラサイ
クリン。 ｉ’ Ｌ −１） Ｎ Ａで示した図の下部の数値は、
この領域のＲＮＡ［写体を示している（Ｗｉｌｌ＋ｎ１
ｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、］（１９８２）、Ｊ ３９−
１’４Ｇ）。 第１５図は中間クローニングベクター１）に＼・°７５
０の構造を示している。その組み立ては実施例２に記載
した。制限エンドヌクレアーゼサイトは、キロ塩基対（
ｋｂ）の数で表Ｊっしたその相対的位置で示した。Ｐｓ
ｌ、Ｉ サイトは示していないがＫｉｎＲ／Ｎｉｏ”
領域に３つ、ＣｂＲ遺伝子に１つ存在する。 左右の境界領域も示しである。ｐＧ Ｖ ？、 ５ ｔ
’、ｌの組み立てに使用されたＢｓｌ ＩＩ／ＢａｍＨ
ＩサイトおよびＨｐａ Ｉ ／ Ｓ ＋ｎａ Ｉサイト
が示されているが、これはｐＧ Ｖ ７５０ には存在
しない。影をつけりｆｄｌＪｆｆｌｌｊ： ’ｒｌ−−
Ｄ Ｎ Ａ ｉ、：、黒イｆＪ域１．ｔ Ｋｍ ’／
Ｎｕｎ ’領域に、白ぬき部分は隣接するＴｉプラスミ
ド配列、に、そして線はクローニング媒体ｐＢＲ３２ｓ
にそれぞれ相当する。その他の略号は以下の意味を有す
る： ０ｃｓ＝オクトピンシンターゼ、Ｃ１，ＩＲ＝り
ａラムフェニコール耐性、ＣＩ＋ １（＝カルベニシリ
ン（アンピシリン類縁体）耐性、Ｋ ｍ ”／ Ｎ ＋
ｎ Ｒ＝カナマイシン耐性／ネオマイシン耐性。 第１６図は実施例３に詳細に記載した中間ベクターｐＧ
Ｖ７４５の組み立てを示している。ｐＧＶ７４５は、第
８図に示したＦＢタイプ」アクセプタープラスミド、＋
＞に Ｖ ２２６０の組み立てに使用される。制限エン
ド゛ヌクレアーゼサイトは以下の略号で示した：Ｂ＝Ｂ
ａｕ＋Ｉ利、Ｈ＝ Ｈｉｎｄ ｌ Ｉｌ−、トピンＴｉ
プラスミドの’ｆ’ −Ｄ Ｎ Ａ領域の左側と相同の
ＤＮＡを、白ぬき領域はオクトピンＴｉプラスミドのＴ
−Ｄ Ｎ Ａ領域の右側と相同の［）ＮＡを示してい
る。出発物質であるプラスミドＩＩＧＶ９８］）、２４
９−２５３にみられる。 第１７図はアクセプタープラスミドｐＧ Ｖ２２６０の
組み立てを示している。１）ＧＶ２２］７ 中の欠失置
換か゛、ネオマイシンとカナマイシンに対する耐性を伺
与−するアセチルホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａ
ｌ＋Ｌで表わしである）を含んでいる黒色部分で示しで
ある。中間ベクターｐＧＶ７４５（第１６図参照）は線
状化して描いである。これは第１６図参照ＬりｐＧＶ
７４５ノＨｉｎｄ ＩＩＩ ＋シリン耐性遺伝子はＡｐ
Ｒで示しである。二・■乗換えによって、ｐＧＶ ２２
６１）が組み立てられ、ａｌ＋を遺伝子が失われる。制
限エンドヌクレアーゼサイトは以下の略号で示した：
Ｂ ＝ ＢａｒｎＨｌ 、１、ＩＩ＝Ｈｉｏｄ Ｉｌｌ
、Ｒ＝ＥｃｏＲＩ。 第１８図は、ツバリンシンターゼ遺伝子（１１０ｇ）の
プロモーターの下流の遺伝子を発現するためのプラスミ
ド１＋１．、Ｇ Ｖ ２３８１の組み立てを示している
。５゛および３゛はそれぞれ転写開始と転写終了を意味
し、Ａ Ｔ ＧおよびＩ″ＡＡは翻訳開始おド よび翻訳終了に使われるコメ←を表わしている。 太線はｎｏｓプロモーター領域、白ぬき部分は＋１０３
暗 号領域を示している。Ａｐ”はアンピシリン耐性、Ｋｎ
＋Ｒはカナマイシン耐性を示している。 第１９図は、完全なオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）暗
号化配列を含んでいるプラスミドｐＡＧＶ１０の組み立
て、およびプラスミド１）ＬＧＶ２３８１（第１８図参
照）のｌｌＯｓプＶモーター−の後部へのその挿入を示
している。太線はプロモーター領域、白ぬ外部分はｏｃ
ｓ暗号領域を示している。その池の記号は第１８図と同
じである。 第２０図は、ツバリンシンターゼ（ＩＩＯ９）遺伝子の
プロモーター領域の周囲のヌクレオチド配列およびオク
トピンシンターゼ遺伝子暗号化領域と融合した後の同じ
領域の周囲のヌクレオチド配列を示している。融合点は
星印（＊）で示した。いくつかの制限エンドヌクレアー
ゼサイト、即ち、ＢａｒｎＨｌ、Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ 、
および５ａｃｌｌ も示しである。 ５゛および３゛は転写開始および終了を意味する。 Ａ Ｔ Ｇは翻訳に使われる最初のコドン、ＴＡＡは翻
訳に使われる終了コドンを表わしている。白ぬトの大き
い矢印はツバリン遺伝子の暗号化領域、縞の入った矢印
はオクトピン遺伝子を表わしている。 以下に本発明の詳細な説明する。 第１図にアクセプターＴｉプラスミドを筒！ｉｔに図式
化して示した。このアクセプターＴｉプラスミドは、野
生型腫瘍誘起（１” ｉ ）プラスミドの２つの境界配
列（１，２）または領域を含んでいる。この境界配列は
、Ｔｉプラスミドの゛ｌ゛−領域を植物細胞ゲノムヘ組
込むのに絶対に必要である。換言すれば、あらゆるＤ
Ｎ Ａ配列（３）またはＴ−領域を、これらの配列間に
存在、している植物細胞ゲノムに組込むのにこの境界配
列は必須である。 このアクセプターＴｉプラスミドのＤＮＡ配列（３）に
は、第２図および第３図に示した中間クローニングベク
ターのＤＮＡ配列（３゛）の少なくとも１部と相同のＤ
Ｎ Ａセグメントが含まれている。 この相同性は、中間クローニングベクターとアクセプタ
ーＴｉプラスミドが単一乗換え（相同性組領域の長さで
きまる。相同性組換えを高頻度で起すには、通常１−４
ｋｂの領域が使われる（１− （’ｅｌｌｌａｌｌＳ
呟 Ｊ、 Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、１
（１９８１）＋１４９−１６４）。 アクセプター′ｊ″ｊプラスミドは更に、Ａ８ｒｏｌ〕
ａ−ｃＬｅｒｉｕｍによって１゛１プラスミドの′Ｆ−
領域が植物細胞ゲノムへ移動するのに必要な配列（４）
を含んでいる。 この様なアクセプター′Ｉ″ｉプラスミドの組み立てお
よび第２図および第３図に示した中間クローニングベク
ターとのその相互組込みについて、第４図を参照しなが
ら以下に詳述する。 第２図および第３図に、発現しようとする、即ち、植物
細胞中でプロモーターの支配下に転写され、翻訳される
所望の原核性または真核性遺伝子をクローンするための
中間クローニングベクターを簡略化した図で示した。こ
れらの中間クローニングベクタ〜は、アク、セプターＴ
ｉプラスミドのＬ’） Ｎ Ａセグメント（３）の少な
くとも一部と相同であり、従・て単−釆Ｊｆｆｉえを可
能にするＤＮＡ配列を含んでいるクローニング媒体から
のＤＮ４セグメンｌ’）を含んでいる。さらに、この中
間クローニングベクターは、その天然のあるいは外米性
のプロモーター配列を含む少なくとも、１つの所望の遺
伝子（５，７）を含んでいる。このプロモーるために、
外来性のプロモーター配列（仕立て−Ｌげたプロモータ
ー）を使うことが有利であることもある。 調整の各種の例として、以下のものを挙げることができ
る：（１）組織に特異な発現、即ち、葉、根、茎、花な
ど、（ｉｉ）発現レベル、即ち、発現の強弱、（ｉｉｉ
）誘導性発現、即ち、温度、尤または添加された化学的
因子による発現など。 中間クローニングベクター用の所望の遺伝子の例として
は、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成をコントロール
して植物の栄養価や成長度を改良する遺伝情報を持った
ＤＮＡフラグメントまたは配列、外部から病原物質に対
する保護、例えば病原生物またはストレスのかかる環境
因子に対する耐性、を伺与すΣ生産物の合成をコントロ
ールする遺伝情報を持ったＤ Ｎ Ａ ７ラグメントま
たは配列、遺伝子工学によって改良しようとする植物の
基本的な過程に情報を与える生産物の合成をフントロー
ルする遺１云情報を持ったＤ Ｎ Ａフラグメントまた
は配列など。 ＠２図および第３図は、選択可能なマーカー遺伝子（６
）を含んでいることもある中間クローニングベクターを
表わしている。選択可能なマーカー遺伝子としては、例
えば抗生物質または有毒な類似、物質（例えばアミノ酸
類縁体）を１５号化して（する遺伝子、受容宿主細胞の
欠損を補う遺伝子などが挙げられる。 第４図は、ハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組み
立てに関与する構成を示しており、第５図は、そのハイ
ブリッド′１゛ｉプラスミドベクターを保持しているＡ
ｇｒｏｂａｃＬｃｒｉｕ＋ｎの分離に関与する実際の接
合工程を表わしている。この二「程は、中間クローニン
グベクターがｌミ、ｃｏｌｉ中で組み立てられるので、
この中間クローニングベクターをＡＨｒｏｂａｃＬｅｒ
ｉｕ＋１１東のアクセプタープラスミドに転移させるの
に必要である。 ′１゛−領域の一部が変更された配列で置換されている
改良Ｔｉプラスミドを調製するのに用いられる既知の転
移手法は多数の工程からなっている。 通常、大抵のＤＮＡ組換え操作は、特別に設計されたク
ローニング媒体、例えばｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ
、 Ｇｅｎｅ ２ （］ ９７７）、７５−９３）ｒｌ
＞で行なわれる。しかしこのクローニング媒体は、それ
自体Ａ８ｒｏｌ〕ａｃｌｅｒｉｕｍに移動することがで
きない。この問題は、既知の方法では次の様にして解決
されている： ａ） Ａｇｒｏｌ）ａｃｊｅｒｉｕ＋ｏ中でも複製し
得る別の広範囲宿主用クローニング媒体、例えば＋ｏｉ
ｎｉ−３ａプラスミド（Ｌｅｅｒｏａｎｓら、Ｇｅｎｅ
１９（１９８２）’。 ３６ｉ−３６，１でｐＢＲクローニング媒体配列を置換
する。この繰作はＥ、ｃｏｌｉ中で行ない、中間クロー
ニングベクターが得られる。 ｂ）所望のＤ Ｎ Ａを含有している中間クローニング
ベクターを保持したＥ、ｃｏｌｉ株と、ＡＢｒｏｂａ−
ｃＬｅｒｉｕｎ＋中では複製できないがそれ自体および
飢のＤＮＡのＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋ｎへの転移を
仲介することのでとるヘルパープラスミドを保持しｔこ
別のＥ。 ００１株との接合。 Ｃ）工程（１））で得られるＥ、ｃｏｌｉと′１゛１プ
ラスミドを含んでいるＡ８ｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋の接
合。ヘルパープラスミドは失われる。 ｄ）中間クローニングベクターは、独立したレプリコン
としてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製し、存在す
ることがでトるので、工程（Ｃ）で得られた接合体は、
中間クローニングベクターとＴｉプラスミドとの相互組
込み体を含んでいる細胞、または中間クローニングベク
ターおよび相互組込みが起らなかったＴｉプラスミドを
含んでいる別の細胞の混合物である。相互組込み体だけ
を特異的に分離する為に、゛１゛ｉプラスミドのない別
のＡｇｒｏｂａｃＬ−ｅｒｉｕｎ＋株との接合をもう一
度行なわなければならない。この転移は、Ｔｉプラスミ
ド自体によってｌｌδ号化されている機能によって仲介
される。この第２のＡ ｇｒｏｂａｃ ｌｅｒ ｉ ｕ
ｍ株への申開クローニングベクターの転移は、Ｔｉプラ
スミドとの相互組込み体の形でのみ行なわれる。 ｅ）所望の置換を行なった最終的な改良Ｔｉプラスミド
を得るために、第２回目の乗換えが行なわれる （Ｌｅ
ｅｎ＋ａｎｓ ら、ＪンＭｏｌ、 Ａｌ）Ｉｌｌ、
ＧｃｎｅＬ。 １ （１９８１）、１．４９−１６４）。 僅かにもう１つの既知の方法は、上記工程（ｄ）におい
て、中間クローニングベクターと適合しない別のプラス
ミドをＡｇｒｏｌ）ａｃＬｅｒ’ｉｕ＋ｎ’ｌこ導入す
ることを除けば、上の方法と基本的に同じである。この
場合、独立したレプリコンのままでいる申開クローニン
グベクターは全て失われるので、相互組込み（単一乗換
え）を選択することがで外る（Ｍａｌｚｋｅら、Ｊ、
Ｍｏｌ、Ａｐｐｌ、 Ｇｅｏｅｔ、 １（［８１）、
３９−４９ ）。 ここに本発明者らは、ＡＨｒｏ１３ａｅｔｅｒｉｕｍの
アクセプターＴｉプラスミドに中間クローニングベクタ
ー門導入する為の、新規な非常に簡素化された方法を提
供するものである。簡単に言えば、この方法は、多くの
通常使用されているクローニングプラスミド（例えばｐ
ＢＲ３２２）を血孤Ａ８ｒｏｂａｃ−Ｌａ（ｉｕｍに転
移させるのに、ＩＥ、ｃｏ日のヘルツ（−プラスミドが
役立つということを見０出した事実に基づいている。こ
れらのプラスミドは、（１づれもＡ ｇｒｏｌ）ａｃ
Ｌｅｒ’ｉ ｕ＋＋＋中では複製でたなり）ので１、ア
クセプターＴｉプラスミドと相互組込みし得るものだけ
が保持されることになる。さらに、本発明者らは、ＡＢ
ｒｏｌ）ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎ中のこの相互組込み体を、
植物細胞への感染の為の直接のベクター組成物として使
用するのである。この様にして、本発明者らは前記の工
程（ｄ）および（ｅ）を省略した。これによって、改良
ノ司ブリッド′ｒｉプラスミドを組み立てるのに要する
時間が減少し、可能な組み立てに柔軟性が増加し、かく
して、植物細胞ゲノムへＤＮＡを転移させる為のベクタ
ーとしてこのアクセプター′１゛１プラスミドを使用で
とる可能性が著しく高まったのである。 即ち、第５図に概略を示した様に、アクセプター ｉ”
ｉプラスミドへの中間クローニングベクターの導入は
２工程で行なわれる。先づ、中間クローニングベクター
を持ったＥ、ｃｏｌｉ株（１）を、この中間クローニン
グベクターのＡｇｒｏｌ〕ａｃｔｅｒｉｔｕ＋＋への摂
動を促す２つのプラスミドを持った別のＥ。 ｃｏｌｉａ（２）と接合させる。これらのヘルパープラ
スミドの代表的な、そして好ましい例は、１１１０１１
機能を含んだ１で６４ｄｒｄｌｌおよびＬｒａｌ幾能
を２んだｌ）Ｇ Ｊ ２．８である（Ｆ” ｉ ｎｎｅ
ｇａｎら、Ｍｏ１．Ｇｅｎ。 （’；ｅｎｅＬ、 ｌ ８５（１９８２）＋３４４−３
５１）。中間クローニングベクターのクローニング媒体
−１：の１３０＋１１サイト（Ｗａｒｒｅｎら、Ｎａｔ
ｕｒｅ２７４（］ ！Ｊ°ｊ８）。 ２５９−２６１）が池の２つのプラスミドによって暗号
化されている機能体によって認識され、転移できる様に
なる。全てのプラスミドは、その存在を検出するために
抗生物質耐性マーカーを含んで゛いるのが好ましい。次
いで、得られたＥ、 ｃ、ｏｌｉ株、即ち３つのプラス
ミド全てを保持している摂動株（３）を、中間クローニ
ングベクターと相同の領域を持ったアクセプターＴｉプ
ラスミドを保持しているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと
接合させる。中間クローニングベクターとアクセプター
Ｔｉプラスミドとの単一乗換えが行なわれたがどうかは
、中間クローニングベクターの抗生物質耐性マーカーに
ついての選択によって検出でとる。 第６図は、第１図の７クセブターＴｉプラスミドの組み
立てに用いられたＤ Ｎ Ａ分子を模式的に示したもの
である。本明細書では、このプラスミドをアクセプター
′ｌ゛１ プラスミド（タイプＡ）と呼び、池の７クセ
プター′ｒｌプラスミド（タイプＢ）と区別することに
する（第８図参照）。この組み立てには、Ｔｉプラスミ
ドと、りｏ−ニング媒体（３）中に境界配列（１）およ
び（２）を持っているもう１つのプラスミドとの間に二
重乗換えが起ることが必要である。図に示した様に、ク
ローニング媒体配列（３）は左側の境界配列（１）と右
側の境界配列（２）との間にある。このＤＮＡ鎖の正し
い極性を示すために、これを環上に描くことができる。 しｈ化、二重乗換えに使用される相同領域を示すために
は、この環を開裂させて図示した。これは理解を助ける
為のやり方として重要であり、第８図に於けるアクセプ
ター１゛１プラスミド、（Ｂ）の組み立てに於いても用
いられている。即ち、もし境界配列（１）および（２）
が、単にクローニング媒体配列（３）内に挿入されたの
なら、二重乗換えによって、′ｌ゛−領域が削除されて
はいるがこの境界配列（１）および（２）の間のクロー
ニング媒体配列のない′１゛ニブラスミドが得られるこ
とになる。第（ｉ図に示した様に、二重乗換えによって
、境界配列（１）および（２）の間にもとのＴ−領域を
持ったべ１状１） Ｎ Ａ分子か゛生成する。これはレ
プリコンではないので消失する運命にある。この二重乗
換えか起ったかどうかは、例えば′１゛ｉプラスミドの
１゛−領域内に含まれる抗生物質マーカーの欠落に一つ
いて選択したり、りＵ−ニング媒体配列（，３）内の抗
生物質耐性マーカーについて選択したりして、°遺伝子
学的に選択することがでとる。 第７図１．！：、ｐｔＳ２図および第３図の中間クロー
ニングベクターの組み立てを示す模式図である。制限エ
ンドヌクレアーゼサイトＲ２またはＲ２で゛それぞれ囲
まれた所望の遺伝子（５）および選択可能なマーカー遺
伝子（６）が、酵素Ｒ１およびＲ２の為の特異な卯１限
サイトを含んでいるクローニング媒体配列（３゛）に、
これら全ての分子の消化およびライゲーションによって
挿入される。得られた組換えＤＮＡ分子は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ宿主細胞を形質転換するのに使用され、その形質転換
本は、クローニング媒体配列（３゛）の抗生物質耐性マ
ーカー（）＼ｌ、 ｌ）で選択される。 第８図は本発明のもう１つの態様、即ちアクセプター１
゛１プラスミド（１３）を組み立てるのに使用７される
Ｄ Ｎ Ａ分子の模式図である。この場合は、境界配列
（１）および、（２）のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列
（９）および（１０）の開にクローニング８体配列（３
）を含んでいるプラスミドとＴ１プラスミドｌとの間で
二重乗換えが起る。乗換えに使用される相同領域を示す
為に、小さい方のプラスミドは開裂しである（第６図と
同様）。二重乗換えによる生成物は、アクセプターＴｉ
プラスミド（Ｂ）と、もとのＴｉプラスミドからのＴ−
領域およびＩ）Ｎノル配列（２）、（１０）、（９）お
よび（１）を含んでいる、消失するもう１つの環状Ｄ
Ｎ Ａ分子である。 遺伝子学的選択は第６図について記載したものと同様に
して行なうことができる。 第９図は、第８図の７クセプター１゛； プラスミドＢ
と組み合せて使用される中間クローニングベクターの模
式図である。ここでは、所望の遺伝子（５）は、クロー
ニング媒体配列（３゛）中に含まれ−がどの様にしてア
クセプター１゛１プラスミド（Ｄ）に挿入されるかを模
式的に示している。この場合、中間クローニングベクタ
ーのクローニング媒体配列（３゛）の抗生物質耐性マー
カーで選択すると、２つのプラスミドの間の相互組込み
の結果としてのハイブリッド゛ＦＩプラスミドを確実に
見つけることができる。境界配列（１）および（２）内
に含まプラスミドが得られる。この様にして組み立てら
れたハイブリッドプラスミドは、その１゛−領域に、例
えば第４図のハイブリッドＴｉプラスミド中の配列（３
）および（３゛）の様な直接反復の配列を含有しておら
ず、従って、分子内組換えの結果として、ハイブリッド
ベクターまたは植物細胞ゲノム中に導入されたＤＮＡが
不安定になる可能性が避けられる。 本発明者らの研究室で行なった実験結果から、第９図の
中間ベクターの組み立てには、境界配列１および２の両
者を所有する必要はないことがわかった（未発表）。し
かし、所望のＤＮＡ配列を植物ゲノムに組込むには、少
なくとも右側の境界配列（２）（第１図および第９図参
照）を有することが必要十分条件である。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｌｌのＴｉ プラスミド゛
、例えばノ／＜リンまたはオクトビンＴｉプラスミドの
制限エンドヌクレアーゼ地図についての知見（Ｄｅｐｉ
ｃｋｅｒら、Ｐｌａｓｍｉｄ ３（１９８０）、１９３
−２１１Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓ＋＋＋ｉｄ ６（，
１９８１）、２４９−５２３）およびｉ” −Ｄ’Ｎ
Ａ境界配列を含んでいる制限フラグメントしついての知
見（Ｚ ａ＋ｌ１ｌ）ｒｙｓｋ ｉら、Ｊ、Ｍｏｌ。 Ａｐｐｌ、 ＧｅｎｅＬ、 １（１９８２）＋３６
１−３７０；Ｄｅ Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒら、Ｍｏｌ、
Ｇｅｎ、 ＧｅｎｅＬ、１８３（１９１）、２８３−
２８８）から、当業者であれば誰れでも、本発明方法に
従ってアクセプターＴｉプラスミドを組み立てることが
で鰺る。この池、通常の組換えＤ Ｎ Ａ技術および基
礎的な細菌の遺伝子繰作を実施できる能力が要求される
に過ぎない。本発明は、ハイブリ・ノドＴｉプラスミド
ベクターを組み立てるのに有効であることがわかった本
明細書に記載したアクセプターＴｉプラスミドを具体的
に提案している点でユニークなものである。更に、これ
らの７クセプターＴ：プラスミｌ”は′、遺伝子を植物
細胞ゲノムヘ導入するための方法の一部を構成する様に
設計されたものである。 既述したアクセプターＴｉプラスミド、中間クローニン
グベクター、ハイブリッドＴｉプラスミ１々゛ベクター
およびベクター組成物を更１こ例示し、植物細胞ゲノム
へ組込まれた外来性遺伝子の発現を示す彩質転換植物細
胞および植物を提供するのにこのベクター組成物が有効
であることを％ｇ証するために、以下に実施例を挙ける
。 実施例１ アクセプター１゛１プラスミド３８５０（Ａ
タイプ）の組み立て 出発株およびプラ又ミＶ： Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ＋ｎｅｆａｃｉｅｏ
ｓ （ｌ）外型Ａｇｒｏｂａ−ｃ１．ｅｒｉｕｎ＋由来
のりファンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１おｈｔ１９０ラムフ
エニコール−エＱスロマイシン耐性株Ｃ５８ＣＬ） Ｔｉ プラスミド−１１ＧＶ ３８３９第１１図のプラ
スミドニｐＡｃｇＢ Ｔｉ プラスミドｐＧＶ ３８３９１まノ、＜１）ン７
゛ラスミド ｐＴｉ Ｃ５８Ｌｒａｃ（ｐＧ＼７３１
０（１；１−１ｏｌｓｔｅｒｓら、 Ｐｌａｓ＋ｎｉ
ｄ ３（１９８°）、２１２−、 ２３０）から
組み立てる。これ（土Ｔ−１１戊のＬＩＪ央近く
入法、およびゲノム中に外米ＤＮＡ配列を含んでいる植
物細胞またはその植物に関する。 更に詳しくは、本発明は適当な宿主植物細胞中で発現さ
れるＤＮ’Ａ配列に関する。本発明に係る組換えＤＮＡ
分子は、植物の成長、栄養物としてのその品質の改良、
または有用な代謝物（例えばアルカロイドあるいはステ
ロイドの前駆体）の生産、に有用なアミノ酸やポリペプ
チドの如ト生産物を暗号化している配列を有することを
その特徴としている。 以下に本明細書で使用する用語について説明する。 ＋）ＯＩＩ＋サイト 特異的にｍｏｂ １９能体が相互
作用して自律的Ｄ Ｎ’ Ａ転移移動を開始させる１）
ＮＡ領域境界配列 Ｔ−ＤＮＡの末端を含むＩ） Ｎ
Ａ配列広範囲宿主レプリコン 多種多様の宿主細胞に転
移（トランスファー）され、保持され得るＤＮＡ分子 カルス組織 有機的でない、分化していない細胞の塊 クローニング 無性生殖により、１個の生物（有機体）
またはＤＮＡ配列から誘導された一群の該生物またはＤ
ＮＡ配列を得る操作過程、または、よりわかり易く言え
ば、特定の有機体またはその一部を分離し、そのサブ７
ラクシヨンを均質な集団（個体群）として増殖させる操
作過程クローニング媒体 宿主細胞中で複製し得るプラ
スミド、７アージＤ Ｎ Ａまたはその池のＤＮＡ配列
であって、そのＩ） ｌ’Ｊ Ａ配列は、例えば複製、
外殻蛋白質の生産などのそのり、ＮＡの必須の生物学的
機能、あるいはプロモーターまたは結合サイト（部位）
をイマ１随的に失なうことなく、その場所で確定的にそ
の配列を切断することのできる１個または少数のエンド
ヌクレアーゼ認識サイト（部位）を持っており、また、
それが導入された細胞（形質転換された細胞）を同定確
認するのに有用なマーカー（例えばテトラサイクリン耐
性あるいはアンピシリン耐性）を持っていることで特徴
づけられるＤ Ｎ Ａ配列。クローニング媒体はベクタ
ーと呼ばれることが多い。 暗号配列 ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するＤＮ
Ａ配列 □ 相互組込み体（相互統合体、コインテグレート）２個の
環状ＤＮＡ分子開の単一乗換え（１回の交叉）の結果得
られる構造体 トランス相補性 他のレプリコンに物理的に結合してい
ないＤＮＡ分子（レプリコン）が、その結合していない
他のレプリコンにとって必要な、欠落している拡散物質
を供給することができる過程 接合（フンジュゲーンジン） 細胞どうしが接触する間
に、１つのタイプの細菌から他のタイプの細菌にＤＮＡ
が転移すること 連狽ス 相同なりＮＡ配列間で遺伝物質が交換するこ
と 欠朱黄泗 １個のＤ Ｎ Ａ配列が除去され、その代り
として異なったＤＮＡ配列で置換されること匁北 ある
細胞の子孫か特殊な構造と機能を確立し、それを維持す
ること ＤＮＡ配列またはＤ Ｎ Ａセグメン）１４接するペン
トースの３゛位と５゛位の炭素間の燐酸ジエステル結合
により互０に連結したヌクレオチド群の一直線の配列 二重氷像 相互組込み（コインテグレート）構造が２
個の環状ＤＮＡ分子に分解する過程。この過程は遺伝情
報を交換するのに利用される。このＤＮ、Ａ環状体の一
方は、それによって組換えが生じ得る標的Ｄ Ｎ Ａと
相同な２つの領域を持っており、この２つの領域は、□
標的Ｄ’ Ｎ ’Ａと交換される非相同Ｄ Ｎ Ａ配列
をはさんでいる。もし１回目の交叉と同じＤＮＡ領域で
２回□目の交叉が起ると、もとのＤＮＡ環状本か生成す
る。この２回目の交叉か第２の相同領域で起ると、２つ
の環状体の間で遺伝子の交換が起ることになる。 発現゛構造遺伝子によりポリペプチドが生産される過程
。これは転写と翻訳の組合せである。 発現調節（コントロール）配列 構造遺伝子に有−効１
こ結合された時、それらの構造遺伝予め発現を調節し、
統制するヌクレオチド配列 ４グアＲ５１ｔ Ｆ因子（Ｆはｆｅｒｔｉｌｉｔｙ（
生殖ブハ）を持ったプラスミドセあって、Ｆ因子を持た
ない宿主に該プラスミドのコピーを移入することのでき
るプラスミド 遺伝子 ２つの部分、即ち（１）遺伝子承産物のための
暗号配列および（２）その遺伝子が発現されるかどうか
を調節しているプロモーター領域内の配列、から構成さ
れているＤＮＡ配列 グアＡ 細胞またはウィルスの全Ｄ Ｎ Ａ。これは５
ｈｉｎｅ−Ｄａ１８ａｒｎｏ配列の様な配列を含む、オ
ペレーター、プロモーター、リボゾームの結合お上び相
互作用配列と共に、就中ポリペプチドを暗号化している
構造遺伝子を含んでいる。 遺伝子型 ある生物に含まれている遺伝情報の全て 相同的（性）組換え 相同配列を含んでいるＤＮＡのシ
つ領域間の組換え Ｉ型ブラスミヒ Ｆとは異なる不和合性グループの一群
の自ら転移し得るプラスミド 不和合性 選択圧（ｓｅｌｅｃ’Ｌｉｖｅ ｐｒｅｓｓ
ｕｒｅ）がないと、同一め細胞に２個のＤＮＡが共存し
得ないこと 挿入 ＤＮＡ配列を、別の分子のＤＮＡ配列内に付加す
ること リーダー配列 ５゛末端から最初の構造遺伝子の先端に
至るまでのｍ ＲＮ Ａの領域。これには構造遺伝子の
暗号配列の翻訳を開始するのに重要なか、生成した４個
の細胞のそれぞれに於いてｉｎ個に減少する２回の連続
した分裂。この過程は有性生殖に於いて重要である。 ＋ｅｏｂ （授動機能体）ｔｒａ機能体との組合せに於
いてのみＤＮＡの移動（転移）を促す一連の生成物。 ｍｏｌｒはｂｏｆＩ＋サイトを含んでいるプラスミドの
移動を促すことができる。 櫃動 別の細胞へ移動することので外ない１）ＮＡＡ
分子、池のＤＮＡ分子の助けを借りて移動する過程 授動ヘルパープラスミド 池のプラスミドが持っていな
い、別の宿主細胞へ移動するための拡散性生成物を供給
することができるプラスミド非接合性組換えプラスミド
細胞どうしが接触している開に、それ自体では、もと
の宿主細胞から他の宿主細胞へ移動することができない
ＤＮＡ分子。移動するには、他のＤＮＡ、例えば（ａ）
ヘルパープラスミドによって供給される機能体が必要と
なる。 ヌクレオチド 糖部分（ペントース）、燐酸エステルお
よび含窒素異項環塩基で構成されているＤＮＡまたはＲ
Ｎ Ａの単量体単位。この塩基は糖部分とグリコシド結
合で連結しており （ペントースの１゛位の炭素）、こ
の塩基と糖と結合したものがヌクレオシドである。ヌク
レオチドの特性はこの塩基によって決まる。ＤＮＡの４
個の塩基はアゾ゛ニン（“Ａ゛）、グアニン（“Ｇ゛）
、シトシン（“’ｃ”）およびチミン（Ｔ゛）である。 ＲＮＡの４個の塩基によって生成する個体の観察し得る
特性プラスミド それ自体が宿主細胞中で複製される、
完全な（無傷の）レプリコンからなる非染色体性の２本
鎖ＤＮＡ配列。このプラスミドを単細胞生物に入れると
、そのプラスミドのＤＮＡによって、その生物の性質が
変わる、即ち形質転換される。例えば、テトラサイクリ
ン耐性（ＴｃＲ）のための遺伝子を持ったプラスミドに
より、本来はテトラサイクリンに感受性のある細胞が耐
性のある細胞に形質転換される。プラスミドによって形
質転換された細胞を形質転換体と呼ぶ・。 ポリペプチド 隣接するアミノ酸どうしがα−７ミノ基
とカルボキシル基とのペプチド結合により互いに連結し
た線状のアミノ酸連鎖 プロモーター領域 遺伝子の転写を統制している、暗号
配列の開始点より上流のＤＮＡ配列７’Ｄ％二！二配列
ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列であり、ポリメラ
ーゼはそれより下流の配列の忠実な転写を促進する。 組換えＤＮＡ分子または雑種（ハイブリッ１つｐＦ３
Ａ 少なくとも２個のヌクレオチド配列からなり、そ
の一方の配列は、自然界では通常第２の配列と一諸に存
在することがない、その様な配列からなる雑種のＤ Ｎ
Ａ配列 ■え Ｄ Ｎ Ａ分子またはＤ Ｎ Ａ分子の一部分の
新しい結合体を創製すること 部劇跡栽 ＤＮＡの別の領域に於ける配列と同じＤＮＡ
配列を持っているＤＮＡ領域 レプリコン ＤＮＡの複製開始サイトおよび複製を支配
するのに必要な機能を指定している遺伝子を持った自己
複製遺伝子単位 制限フラグメント 特定の標的ＤＮＡ配列を認識する酵
素による２本鎖開裂によって生じるＤＮＡ分子 ＲＮＡポリメラーゼ ＤＮＡのＲＮＡへの転写をつかさ
どる酵素 選択可能なマーカー遺伝子 あるＤ Ｎ Ａ配列であっ
て、それがある細胞内で発現された時、その増殖培地に
置くと、この２つのタイプの細胞を区別することができ
る。通常使用される選択可能なマーカー遺伝子は抗生物
質耐性を暗号化している遺伝子である。 単一乗換 ２個の環状Ｄ Ｎ Ａ分子を組換えて、相互
組込みされた大きい環状体を形成させる操作過程 週カ消化子 ポリペプチドを暗号化している遺伝子 一エニ■用へ 植物細胞ゲノムに安定に統合（組込み）
されることが見い出されている′「１プラスミドの部分 子−領域 植物細胞ゲノムへ移動（転移）するＤＮＡ配
列を含んでいるＴｉプラスミドの部分子ｉプラスミド
感受性植物に腫脹（クラウンガル）を誘発させるための
遺伝情報を含んでいるＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ Ｌ
ｕ＋ｎｅｆａｃｉｅ＋＋ｓ株に存在する大きいプラスミ
ド Ｔ Ｌ −Ｄ Ｎ ＡおよびＴＲ−ＤＮＡ オクトピ
ンクラウンガル腫脹細胞は２つのＴ −Ｄ Ｎ Ａ配列
、即ち左Ｔ−１）ＮＡ（ＴＬ−ＤＮＡ）ｔ；よび右Ｔ−
ＤＮＡ（ＴＲ−ＤＮＡ）を含有し相る。ＴＬ−ＤＮＡは
ツバリン腫脹細胞のＴ−ＤＮＡと共通している配列を持
っているがＴＲ−Ｄ、ＮＡは持っていない。 ｔｒａ （転移Ｉ」躯其〃 プラスミドに暗号化され
ている拡散性の生成物、および細胞間のＤＮＡ転移の間
に利用される作用部位の両者を指す。例えば２つの細胞
の開の橋を作るのに必要な生成物およびＤＮＡ転移が開
始する部位。 灯 構造遺伝子から＋ｎＲＮＡが生産される過程、また
は、塩基対（ベースベア）が形成され、ＤＮＡに含まれ
ている遺伝情報に指令されて相補性の塩基配列のＲＮ
Ａ鎖が形成される過程形質転換 細胞のＤ Ｎ Ａ補体
（ｃｏｍｐ ｌ ｅｍｅｎ ｔ ）に外米性ＤＮＡが導
入されることによって生じる遺伝′的１１纂飾 朋夙＋ｎ ＲＮ Ａからポリペプチドが生産される過程
、あるいは、ｍＲＮＡ分子に存在する遺伝情報が、ポリ
ペプチド合成において特定のアミノ酸の順序を指定する
過程 １１分化表現型 いかなる特異な部分もなく、組織中の
細胞の外観が均一であること ベクター 異なった宿主細胞間を移動するように設計さ
れたＤＮＡ分子 組換えＤＮＡ技術の進歩によって、微生物の遺伝子工学
（遺伝手術）に新たな展望が開けた。もし１個の体細胞
から、完全な生物を再生することができたら、これらの
技術は多細胞真植生物にまで広がるであろう。ある種の
高等植物の細胞は、優れた再生能力を有し、従って高等
生物の遺伝子１ニ学にとってかっこうの祠料となる。 ｔＩｂ物の遺伝子工学の主たる問題点は、外米性１）Ｎ
Ａを植物ゲノムに導入する為の系の利用性にある。この
様な系には、ダラム陰性土壌細菌のＡ８ｒｏｂａｃＬｅ
ｒｉｕｍ Ｌｕｍｅｆａｃｉｅｎ、ｓが持っている腫脹
誘起（Ｔｉ）プラスミドがある。この微生物は、広範囲
の双子葉植物の損傷組織に、ラウンガル（ｃｒｏｕｕ＋
８ａｌｌ、冠状コブ）と呼ばれる新生物的形質転換を引
き起す原因となることか′わがっている。この増殖性の
新生物は、オパイン（ｏｐｉｎｅｓ）と呼ばれる１゛１
に特異な新しい代謝物を合成する。この形質転換は、分
子レベルでみると、Ｔｉプラスミドの実体のはっきりわ
かっているＴ−ＤＮＡ（転移１）ＮＡ）７ラグメントが
植物細胞ゲノムに転移して安定に組込まれたことによっ
て起る。換言すれば、クラウンガル腫脹は、その染色体
ＤＮＡに、腫脹セルラインをもたらしたＴ１プラスミド
中のｌ）Ｎノ＼配列と相同のＴ Ｉ） Ｎ Ａと呼ば
れるｌ） Ｎ Ａセグメントを含んでいる。。あらゆる
場合に於いて、このＴ −Ｄ ＮＡは、連続したー・連
の１゛１プラスミドＤ Ｎ Ａに相当しており、また、
これと共ｊＵ線性である。従ってこれはＴ−領域と呼ば
れる。 Ｔｉプラスミドはクラウンガノ目ｌｆｔ胞で合成された
オパインのタイプによって分Ｍ２れる。クラウンガル細
胞で７パリン（Ｎ−ａ−（１，３−ン゛カルボキシプロ
ピル）−Ｌ−アルギニン１の合成を惹起させるＡＢｒｏ
ｂａｃＬｃｒｉｕ＋ｎ株はツバリン株と呼ばれ、オクト
ピンＩＮ−α−（Ｎ−１−カルボキシエチル） −り、
−アルギニン１を合成するものはオクトピン株と呼ばれ
る。これらか最も筐通に用いられるＡ８ｒｏｂａＣ１ｅ
ｒｉｕ＋ｎ、４朱である。 植物の遺伝手術にＴ −１） Ｎ Ａをベクターとして
使用する試みがモデル実験で行なわれた。この実験では
、インビボにおいて、Ａｇｒｏｂａｃｌｅｒｉｕｍ
Ｔａ２株のＴｉプラスミドからのｉ’ −１） Ｎ Ａ
の右側境界部の近くに１・１に１１細菌性トランスポツ
ン（Ｌｒａｎｓｐｏｓｏ＋＋） Ｔｏ ７が挿入された
。すると、このＴ１プラスミドを持っているアゲロバク
チリアによって惹起される腫脹中のツバリン合成が消滅
した。更に、す１ンザン・プロッティング・ハイフ゛リ
ディゼーシａンの結果、その様な挿入を行なわなければ
正常であるＴ−ＤＮＡ配列の一部分として、この腫脹の
染色体１） Ｎ Ａ中に全Ｔ１１７が存在することかわ
かった（１−１ｅｒｎａｌｓＬｅｅｎｓら、Ｎａｔｕｒ
ｅ２８７（１り ８ （１） 、 ６ Ｔｈ４−６５６
； ｔｌｏｌｓｊ、ｅｒｓ呟Ｍｏ１． Ｇｅｎ、
ＧｅｎｅＬ、 ］ ８５ （１９８２） ＋２
８３−２ ｓ ９）。この様に、２３ｋｂＴ ＤＮＡ
に１−Ｓ ｋｂｌ） Ｎ Ａ ７ラグメントを導入して
も、２３ｋｂＴ−Ｄ Ｎ Ａの植物細胞ゲノムへの転移
能力に変化は見られなかった。 ツバリン株、ＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍＴ ３ ？の
′ｒｉＴｉプラスミド’ −Ｄ Ｎ Ａの境界部は非常
に正確に調べられている。これは全ツバリンＴｉプラス
ミドの極く一部、約２３ｋｂに過ぎない。更に、この′
ｒ−ＤＮＡの境界部は知られている：即ち、この′１゛
−１） Ｎ Ａの境界部を決めているヌクレオチド配列
が調べられ、ツバリン１゛ｉプラスミドの同じ領域と比
較された（ Ｚ ａｍｂｒｙｓｋ ｉら、５ｃｉｅｎｃ
ｅ ２０９ （１９８０）、 １３８５’−１３９１
；Ｚａｒｏｂｒｙｓｋｉら、Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐ
ｐｌ、 ＧｅｎｅＬ、 １ （１９８２）、３
６ １−３７０ ）。このＴ−領域の境界部が、Ｔ−
ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの組込みに最も関係している
様である。 ＤＮＡを植物細胞へ転移させる為のベクターとしてＴｉ
プラスミドを使用するには、転移したＤＮＡの境界部を
決めているＴＤＮＡ配列を知ることが基本的に必要であ
る。そうすれば、外米性Ｄ Ｎ Ａをこの境界内に挿入
し、確実に植物細胞ゲノムヘ転移させることがで外る。 更に、この系を利用しようとすれば、形質帖換された植
物細胞が、その生育特性において腫瘍の性質を持たず、
正常であるということが重要である。ｉ’ −１，）
Ｎ Ａ転移の後、正常細胞を生産するには、Ｔ −Ｄ
Ｎ Ａ自体によって暗号化されている機能を知る必要が
ある。 従って、どの領域が腫瘍表現型に関係しているが調べる
ために、Ｔｉプラスミ、ドのＴ−領域の徹底的な遺伝子
分析が行なわれた。 Ｔ −Ｄ Ｎ Ａは、クラウンガル表現型の原因となる
機能体を暗号化している。その遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡの
特定の領域に局在化している（ Ｌｅｅ＋ｏａｎｓ呟Ｅ
ＭＢＯＪ、 １（１９８２）、１４７−１５２； Ｗｉ
ｌｌ＋ｎ１Ｌｚｅｒ呟ＥＭＢＯＪ、 １（ｉ９ａ２）。 １３９−１４６ ）。一般に、腫瘍カルス組織の非分化
表現型を支配している少なくとも４つの遺伝子が存在し
ている。これらの遺伝子の突然変異体（ミュータント）
は、新芽様のあるいは根の様な外観の形質転換組織を形
成させることができる。 この後者の成果は、腫瘍組織ではなく正常植物組織中で
発現させる為にＤＮＡを植物に転移したいと思う場合に
は特に重要である。 最近、完全な正常植物に再生することができる形質転換
新芽を誘導するＴｉプラスミド変異体がみつかった。こ
れらの植物は繁殖力が旺盛であり、減数分裂によってＴ
−１’） Ｎ Ａ特異配列を伝達することさえした：
即ち、子孫の植物もＴ−ＤＮＡ特異配列を含んでいた（
０ｔｔｅｎ ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ。 Ｇｅｎｅｔ、１８３（１９８１）、２０９−２１３ ）
。 しかし、この形質転換植物組織は、その染色体Ｉ）ＮＡ
中に、腫瘍表現型を支配しているＴ 、−ｌ） Ｎ Ａ
領域が除去される大カフがすな欠落（欠失）が発生した
ことにより、着しく小さくなった’ｆ’ −Ｄ Ｎ Ａ
を含んでいた。この欠落が当初の形質転換時に起ったの
か、新芽の形成をもたらすその後の成り行きで起ったの
かは不明である。 Ｔｉ プラスミドは太きく （２００ｋｂ）、そのＴｉ
プラスミドの種々の場所に存在している多くの遺伝子が
植物の形質転換に関係している。従って、Ｔ−領域内の
適切な場所に特殊なエンドヌクレアーゼ認識サイトを有
し、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させて安定に挿
入するのに必要な全ての機能を持った′１゛ｉプラスミ
ド由来の小型のクローニングベクターを組み立てること
は不ｑ能である。所望のＤ Ｎ ＡフラグメントをＴ１
プラスミドのＴ−領域の特定の制限酵素開裂サイトに導
入する為の既知の方法の１つは、Ｅｓｃｌ＋ｅｒｉｃｌ
＋ｉａ ｃｏｔ ｉ（大腸菌）におけると同様、Ａ ｇ
ｒｏｂａｃ ｔｅｒ ｉ ｕｎ＋においても複製するこ
とができ、Ｔ −Ｄ Ｎ Ａの所望の制限７ラグメント
を含んでいるクローニングプラスミドを組み立てること
である。この様なりローニングベクターは「中間ベクタ
ー」と命名された。 この様な中間ベクターは、Ｔ−領域によって１１Ｒ号化
されている機能を分析するのに使用された（Ｌｅｅｒｐ
ａｎｓ ら、Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ａｐ１山１． Ｇｅｎ
ｅＬ、］ （１９８］）、１４９−１６４）。 本発明は、発現し得る遺伝子を植物細胞ケ゛ツムへ導入
する方法に関するものである。本発明の１つの目的は所
望のあらゆる遺伝子（群）を導入することのできる改良
されたアクセプター１゛ｉプラスミドを提供することに
ある。導入される所望の遺１云子（相−）は、そのアク
セプターＴ１プラスミドの相当する領域と相同の領域を
持った新規な中間クローニングベクター内に含まれてい
る。この中間クローニングベクター・を提供することも
本発明のＬ１的の１つである。 所望の遺伝子（群）のアクセプターＴｉプラスミドへの
導入は、ＡＢｒｏｂａ’ｃＬｅｒ’ｉｕ＋ｏに保持され
ているアクセプターＴｉプラスミドと中間クローニング
ベクターの２つの相同ＤＮＡセグメントの間で起る単一
乗換えによって達成される。この中間クローニングベク
ターは、ヘルパープラスミｒを使って、それが増殖する
Ｅｓｃｂｅｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌ ｉからＡｇｒｏ−
ｂａｃｔｅｒｉｕｍに摂動される。この様なヘルパープ
ラスミドおよび摂動のための機能は知られている（Ｆ
ｉｎｎｅｇａｎ ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｌ
、 ］ ８５ （１９８２）、３４４−３５１）。 Ａｇｒｏｌ＋ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎでの単一乗換えの結果
、ハイブリッドＴｉ プラスミドベクターが得られる。 この様なハイブリッドＴｉプラスミドも本発明の目的の
１つである。 Ａ ｇｒｏｂａｃ Ｌｅｒ ｉ ｕ＋ｏに保持されたこ
のハイブリッドプラスミドベクター（以降、ベクター組
成物という）を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所
望の遺伝子生成物の発現について又クリーニングする。 植物細胞をベクター組成物で感染させて形質転換植物細
胞を調製するこの方法、その形質転換された植物細胞、
およびそれから発生した植物を提供することも本発明の
目的である。こめ技法はＡ８ｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍの
植物転移性のプラスミド全てに適用することか゛でトる
。 以Ｆに添（；Ｉの図面について詳細（三説明する。 第１図は、境界配列（１）および（２）を除き、１゛−
領域の内部部分を除去して得られる本発明の７クセプタ
ー′１゛ｉプラスミ、ドの１態様を示している。 この境界配列は、Ｔ−領域を植物細胞□ゲノムに組込む
のに必須である。境界配列（１）と（２）の開の領域（
３）が、植物に啄移されるであろうＩ）’ＮＡセグメン
トである。このアクセプター１゛ｉプラスミドは、中間
クローニングベクターを単一乗換え（上よって組込ます
ことを可能にしている中間クローニングベクター内のＤ
ＮＡ配列の少なくとも一部と相同のＤＮＡ配列を持った
ＤＮＡセグメント（３）を含んでいる。Ｔｉプラスミド
領域（４）は、λｇ第２図は、単一乗換えによって第１
図の７クセプターＴｉプラスミド（三挿入される本発明
の中Ｉｌｌクローニングベクターを示している。このベ
クターは、所望の単一乗換えを可能にするアクセプター
ＴｉプラスミドのＤ Ｎ Ａセメメン１−＜３）の少な
くとも一部と相同なり Ｎ Ａ配列を持ったクローニン
グ媒体Ｄ Ｎ Ａセグメン）（３’）を含んでいる。 更に、この中間クローニングベクターは、その天然のプ
ロモータ配列を備えた遺伝子あるいは遺伝子群（５）を
含んでいる。この組み立てに於いては、一般に植物の遺
伝子を使用することができる。それは、他のものに比較
して発現され易いと思われるからである。しかし、原理
的には、全ゆる所望の遺伝子を挿入することができる。 この中間クローニングベクターは選択マーカー遺伝子（
６）を含んでいてもよい。この遺伝子は、植物細胞中で
この遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列を含ん
でいなければならない。このマーカー遺伝子を含んでい
る植物細胞は、それを含んでいない細胞より、成長の選
択有利性を持っていなければならない。何故な呟この様
にして、このマーカー遺伝子を含んでいるーＤＮＡによ
って形質転換された植物細胞を、非形質転換細胞と区別
することかできるからで゛ある。 第３図は、第２図の中間クローニングベクターとＭＩｔ
の、第１図のアクセプターＴｉプラスミドに単一乗換え
によって挿入される本発明に係る中間クローニングベク
ターのもう１つの態様を示している。これは、クローニ
ング媒体ＤＮＡセグメン）（３’）、所望の遺伝子の統
制のとれた発現を可能にする外米性プロモーター配列（
８）、および、所望により、マーカー遺伝７−（６）を
含んでいる。 第４図は、第１図の７クセプターＴｉプラスミドおよび
第２゛図並びに第３図の中間クローニングベクターから
の、単一乗換えによる本発明に係るハイブリッド′１゛
ｉプラスミドベクターの調製を示す模式図である。 第５図は、Ｅ、ｃｏｌｉからアクセプター′ｌ″ｉプラ
又ミドを含んでいるＡ８ｒｏｌ＋ａｃＬｅｒｉｕ＋＋＋
への、中間クローニングベクターの遺伝子転移に関する
過程の概略を示したものである。ｖ、１段階は、中間ク
ローニングベクターを含んでいるＥ、 ｃｏｌｉ株（１
）と、その後のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとの接合の
為の２つのヘルパープラスミドを含んでいるもう１つの
Ｅ、ｃ。 １１株との接合である。１方のヘルパープラスミドはプ
ラスミド転移に重要なり Ｎ Ａ配列（Ｌｒａ）を含ん
でおり、他方のヘルパープラスミドは摂動に重要な配列
（＋ｏｏｂ）を含んでいる。接合によってこれらのヘル
パープラスミドかＥ、 ｃｏｌｉ株（１）に導入される
と、そこに含まれている中間クローニングベクターが池
の細菌株へ転移することかでとる様になる。ｌｒａおよ
び＋ｏＯ１１ヘルパープラスミドは、中間クローニング
ベクターが持っている抗生物質耐性ｖ−ｈ−（Ａｂ”）
、！：ハ異ナルｖ ７＞−１Ａ Ｉ３’ ”およびＡ
ｂｒ３をそれぞれ持っている。従って、全れる。この摂
動株（３）を、第１図の７クセプターＴｉプラスミドを
含んでいるＡ、 Ｌｕ＋Ｏｅ「ａｃｉｅｎｓ株（４）と
接合させ、中間クローニングベクターの抗生物質耐性マ
ーカ丁で選択する。中間クローニングベクターはＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎ中で複製でたないので゛、受容
アクセプター′１゛Ｉプラスミドと相！１１組込み体を
形成した場合にのみ、保持されることができる。Ａ８ｒ
ｏｂａｃＬｅｒｉ叩中のこの相互組込み構造１似りが、
Ｉ：） Ｎ Ａを植物細胞ゲノムに転移させるのに使用
される最終的なハイブリッド１゛１プラスミドである。 第６図は、第１図に示したものと同類のモデルアクセプ
ター′１゛ｉプラスミド（タイプｌ＼）の組み立てを示
している。ここでは、′ｌ″ｉブラ又ミドと、このもと
のＴｉプラスミドの一部と置き換わるＤＮＡ配列を含ん
でいる別のプラスミドとの間で、二重乗換えが起る。よ
り具体的に述べると、小さい方のプラスミドはクローニ
ング媒体（；））の中に′「−領域の境界配列（１，２
）を含んでいる。二重乗換えの結果−１Ｔ領域の内部の
１部分が除去され、代ってクローニング媒体で置き換え
られる。得られたアクセプターＴｉプラスミド（Ａ）は
、境界配列（１，２）の間に含まれているＤＮＡを植物
細胞ゲノムに転移させることがでとる。得られた、形質
転換されたＤＮＡは、Ｔｉプラスミド（Ａ）では新生物
の増殖を支配している遺伝子か除去されているので腫瘍
性のクラウンカ゛ル組纒をつくらない。Ｔｉプラスミド
（Ａ）は、クローニング媒体（３）と相同性を有するあ
らゆる中間クローニングベクター用の極めて普遍的なア
クセプター１゛１ プラスミドである。このクローニン
グ媒体（３）は通常第７図は、中間クローニングベクタ
ーをＥ、ｃｏｌｉ宿主細胞中で組みたてる工程を模式的
に示したものである。制限エンドヌクレアーゼサイトＲ
１に囲まれた所望の遺伝子（５）および制限エンドヌク
レアーゼサイトＲ２で囲まれた選択し得るマーカー遺伝
子（６）を、酵素Ｒ１およびＲ２の為のそれぞれ１つの
制限サイトを含んでいるクローニング媒体（３゛）に挿
入する。３つの分子を全て制限酵素Ｒ，および／または
Ｒ２で消化し、Ｄ Ｎ Ａ ’）ガーゼｉ用いてライゲ
ーション（結紮ルで中間クローニングベクターを形成さ
せる。このクローニング媒体（３゛）は、細菌性遺伝子
学の選択マーカーとして使用する抗生物質耐性（Ａｂ”
）を暗号化しているもう１つのＩ） Ｎ Ａ配列を含ん
でいなければならない。所望の遺伝子（５）はその天然
のプロモーターまたは第２図および第３図に概説した外
米性プロモーターの支配下にある。 第８図は本発明に係るアクセプター１゛１プラスミド（
タイプＢ）のもう１つの具体的態様を組み立てるための
模式図である。この態様では、境界配列（１）および（
２）のすぐ外側のＴｉ配列に相同の、それぞれｌ） Ｎ
Ａ配列（９）および（１０）を含んでいるクローニン
グ媒体とＴｉプラスミドとの間で二重乗換えが起る。こ
の二重乗換えによって、境界配列（１）および（２）を
含んでいるＴ−領域′ｌ゛全体が削除され、それがクロ
ーニング媒体（３）で置き換えられる。′「ｉプラスミ
ド（Ｂ）は、境界配列（１）および（２）の間にクロー
ンされた所望の遺伝子を含有している中間クローニング
媒体配列のためのアクセプターである（第９図参照）。 第９図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミド（Ｂ）
に単一乗換えによって挿入される本発明の（１）および
（２）を含んでいる。これはまた、２つのプラスミド間
の相同的組換えを可能にするため、アクセプターＴｉプ
ラスミド（Ｂ）中のクローニング媒体配列と少なくとも
一部が相同であるクローニング媒体配列（３゛）をも含
んでいる。 第１０図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミドおよ
び相当する第９図の中間クローニングベクターか呟本発
明のノへイブリ・ンドＴｉプシスミドベクターの組み立
てを示す模式図である。単−乗換えによって第９図の中
間クローニングベクターが第８図のアクセプターＴｉプ
ラスミド（Ｂ）に導入される。 第１１図〜第２′Ｏ図は本発明をより具体的に例示する
ものである。 第１１図は、５．２ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメ
ントＡｃｇＢのｐＢＲ３２２への挿入を示してν）る（
Ｚ ａｍｂｒｙｓｋ ｉ ら、Ｓ、ｃｉｅｎｃｅ ２
０９ （１９８０）。 １３８５−１３９１）。このフラグメント ＡｃｇＢは
ツバリン′ｌ″ｉプラスミドの左右の境界領域を含んで
いる。このクローンＩＩＡｅｇＢは、第６図に示したｌ
−Ａ−タイプ」のアクセプタープラスミド、■＋に＼’
３８５０の組み立てに使用される。野生型Ｔｉプラス
ミドの左右の境界領域を含んでいる、二のクローンされ
た制限７ラグメントを使って、クローンｐＡｃｇＢと類
似のクローンを得ることができることは、当業者には容
易に理解されるはずである。 第１２図はツバリン′Ｉ″ｉプラスミド１＋ Ｇ＼゛３
３３５ｊの′「−領域を示している。Ｉ−ｆｉｎｄ Ｉ
ｌｌ制限エンドヌクレアーゼサイトは（Ｈ）で示しであ
る。変異したＨｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント１９は（
１９゛）で示しである。カナマイシンまたはネオマイシ
ン耐性を（；Ｉ−りするアセチルホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子はａｌ）［で表わし、これは黒くぬりつぶし
た部分に存在している。Ｔ ９ｍ域の境界は矢印で示し
である。ツバリンシンターゼ（ｓｙｎｔｌ＋ａｓｅ）遺
伝子は１１０Ｓで表わした。数値は、Ｄｅｐｉｃｋｅｒ
ら（１市ｓｎ＋１ｄｙ３（Ｌ９８（、））−１９３２１
１）の方法による制限７ラグメントの寸法（大１１を表
わしている。 Ｔｉプラスミミドｃ；Ｖ３８３８は、実施例１およびそ
こに挙げた２つの文献に従って組み立てることができる
。 第１３図は、アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０の組み立てを示している。プラスミド１）Ｂ Ｒ３２
２−ｐＡｃｇＢ（第１１図）は、線状化した形で描いで
ある。Ｉ）ＢＲ３２２の配列は斜線を入れた領域で示し
、１）ＢＲ３２：２の７ンビシリン耐性遺伝子はＡ」で
示した。第１２図に示した１）ＧＶ３８３９のＴ−領域
の一部がここに描かれている： ｐＡｃｇＢ との相同
的組換えに関与するＨｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント（
１０）および（２３）およびａｐｔ遺伝子が含まれてい
る。二重乗換えによってｐＧＶ３８５０および失われた
ａｐｌ遺伝子を含むもう１つのレプリコンが組み立てら
れる。 第１４図は、実施例２に詳細に記載した中間クローニン
グベクターｐＧ Ｖ ７０ （−，１の組み立てを模式
的に示したものである。制限エンドヌクレアーゼサイト
を示すのに以下の略号を用いた： Ｂ＝Ｂａｍ！−１１
、Ｂｇ ＝Ｂｇｌ ＩＩ 、Ｅ＝ＥｃｏＲＬ ）−１＝
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 、５＝Ｓａｌ Ｉ、 Ｓ＋ｎ＝Ｓ＋
＋＋ａＴｏ抗生物質耐性を示すのに以下の略号を用いた
：Ａ１）ニアンヒシリン、Ｃｔｏ＝りＶラムフェニコー
ル、Ｓｉｌ＋＝ストレプトマイシン、Ｔｃ−テトラサイ
クリン。 ｉ’ Ｌ −１） Ｎ Ａで示した図の下部の数値は、
この領域のＲＮＡ［写体を示している（Ｗｉｌｌ＋ｎ１
ｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、］（１９８２）、Ｊ ３９−
１’４Ｇ）。 第１５図は中間クローニングベクター１）に＼・°７５
０の構造を示している。その組み立ては実施例２に記載
した。制限エンドヌクレアーゼサイトは、キロ塩基対（
ｋｂ）の数で表Ｊっしたその相対的位置で示した。Ｐｓ
ｌ、Ｉ サイトは示していないがＫｉｎＲ／Ｎｉｏ”
領域に３つ、ＣｂＲ遺伝子に１つ存在する。 左右の境界領域も示しである。ｐＧ Ｖ ？、 ５ ｔ
’、ｌの組み立てに使用されたＢｓｌ ＩＩ／ＢａｍＨ
ＩサイトおよびＨｐａ Ｉ ／ Ｓ ＋ｎａ Ｉサイト
が示されているが、これはｐＧ Ｖ ７５０ には存在
しない。影をつけりｆｄｌＪｆｆｌｌｊ： ’ｒｌ−−
Ｄ Ｎ Ａ ｉ、：、黒イｆＪ域１．ｔ Ｋｍ ’／
Ｎｕｎ ’領域に、白ぬき部分は隣接するＴｉプラスミ
ド配列、に、そして線はクローニング媒体ｐＢＲ３２ｓ
にそれぞれ相当する。その他の略号は以下の意味を有す
る： ０ｃｓ＝オクトピンシンターゼ、Ｃ１，ＩＲ＝り
ａラムフェニコール耐性、ＣＩ＋ １（＝カルベニシリ
ン（アンピシリン類縁体）耐性、Ｋ ｍ ”／ Ｎ ＋
ｎ Ｒ＝カナマイシン耐性／ネオマイシン耐性。 第１６図は実施例３に詳細に記載した中間ベクターｐＧ
Ｖ７４５の組み立てを示している。ｐＧＶ７４５は、第
８図に示したＦＢタイプ」アクセプタープラスミド、＋
＞に Ｖ ２２６０の組み立てに使用される。制限エン
ド゛ヌクレアーゼサイトは以下の略号で示した：Ｂ＝Ｂ
ａｕ＋Ｉ利、Ｈ＝ Ｈｉｎｄ ｌ Ｉｌ−、トピンＴｉ
プラスミドの’ｆ’ −Ｄ Ｎ Ａ領域の左側と相同の
ＤＮＡを、白ぬき領域はオクトピンＴｉプラスミドのＴ
−Ｄ Ｎ Ａ領域の右側と相同の［）ＮＡを示してい
る。出発物質であるプラスミドＩＩＧＶ９８］）、２４
９−２５３にみられる。 第１７図はアクセプタープラスミドｐＧ Ｖ２２６０の
組み立てを示している。１）ＧＶ２２］７ 中の欠失置
換か゛、ネオマイシンとカナマイシンに対する耐性を伺
与−するアセチルホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａ
ｌ＋Ｌで表わしである）を含んでいる黒色部分で示しで
ある。中間ベクターｐＧＶ７４５（第１６図参照）は線
状化して描いである。これは第１６図参照ＬりｐＧＶ
７４５ノＨｉｎｄ ＩＩＩ ＋シリン耐性遺伝子はＡｐ
Ｒで示しである。二・■乗換えによって、ｐＧＶ ２２
６１）が組み立てられ、ａｌ＋を遺伝子が失われる。制
限エンドヌクレアーゼサイトは以下の略号で示した：
Ｂ ＝ ＢａｒｎＨｌ 、１、ＩＩ＝Ｈｉｏｄ Ｉｌｌ
、Ｒ＝ＥｃｏＲＩ。 第１８図は、ツバリンシンターゼ遺伝子（１１０ｇ）の
プロモーターの下流の遺伝子を発現するためのプラスミ
ド１＋１．、Ｇ Ｖ ２３８１の組み立てを示している
。５゛および３゛はそれぞれ転写開始と転写終了を意味
し、Ａ Ｔ ＧおよびＩ″ＡＡは翻訳開始おド よび翻訳終了に使われるコメ←を表わしている。 太線はｎｏｓプロモーター領域、白ぬき部分は＋１０３
暗 号領域を示している。Ａｐ”はアンピシリン耐性、Ｋｎ
＋Ｒはカナマイシン耐性を示している。 第１９図は、完全なオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）暗
号化配列を含んでいるプラスミドｐＡＧＶ１０の組み立
て、およびプラスミド１）ＬＧＶ２３８１（第１８図参
照）のｌｌＯｓプＶモーター−の後部へのその挿入を示
している。太線はプロモーター領域、白ぬ外部分はｏｃ
ｓ暗号領域を示している。その池の記号は第１８図と同
じである。 第２０図は、ツバリンシンターゼ（ＩＩＯ９）遺伝子の
プロモーター領域の周囲のヌクレオチド配列およびオク
トピンシンターゼ遺伝子暗号化領域と融合した後の同じ
領域の周囲のヌクレオチド配列を示している。融合点は
星印（＊）で示した。いくつかの制限エンドヌクレアー
ゼサイト、即ち、ＢａｒｎＨｌ、Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ 、
および５ａｃｌｌ も示しである。 ５゛および３゛は転写開始および終了を意味する。 Ａ Ｔ Ｇは翻訳に使われる最初のコドン、ＴＡＡは翻
訳に使われる終了コドンを表わしている。白ぬトの大き
い矢印はツバリン遺伝子の暗号化領域、縞の入った矢印
はオクトピン遺伝子を表わしている。 以下に本発明の詳細な説明する。 第１図にアクセプターＴｉプラスミドを筒！ｉｔに図式
化して示した。このアクセプターＴｉプラスミドは、野
生型腫瘍誘起（１” ｉ ）プラスミドの２つの境界配
列（１，２）または領域を含んでいる。この境界配列は
、Ｔｉプラスミドの゛ｌ゛−領域を植物細胞ゲノムヘ組
込むのに絶対に必要である。換言すれば、あらゆるＤ
Ｎ Ａ配列（３）またはＴ−領域を、これらの配列間に
存在、している植物細胞ゲノムに組込むのにこの境界配
列は必須である。 このアクセプターＴｉプラスミドのＤＮＡ配列（３）に
は、第２図および第３図に示した中間クローニングベク
ターのＤＮＡ配列（３゛）の少なくとも１部と相同のＤ
Ｎ Ａセグメントが含まれている。 この相同性は、中間クローニングベクターとアクセプタ
ーＴｉプラスミドが単一乗換え（相同性組領域の長さで
きまる。相同性組換えを高頻度で起すには、通常１−４
ｋｂの領域が使われる（１− （’ｅｌｌｌａｌｌＳ
呟 Ｊ、 Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、１
（１９８１）＋１４９−１６４）。 アクセプター′ｊ″ｊプラスミドは更に、Ａ８ｒｏｌ〕
ａ−ｃＬｅｒｉｕｍによって１゛１プラスミドの′Ｆ−
領域が植物細胞ゲノムへ移動するのに必要な配列（４）
を含んでいる。 この様なアクセプター′Ｉ″ｉプラスミドの組み立てお
よび第２図および第３図に示した中間クローニングベク
ターとのその相互組込みについて、第４図を参照しなが
ら以下に詳述する。 第２図および第３図に、発現しようとする、即ち、植物
細胞中でプロモーターの支配下に転写され、翻訳される
所望の原核性または真核性遺伝子をクローンするための
中間クローニングベクターを簡略化した図で示した。こ
れらの中間クローニングベクタ〜は、アク、セプターＴ
ｉプラスミドのＬ’） Ｎ Ａセグメント（３）の少な
くとも一部と相同であり、従・て単−釆Ｊｆｆｉえを可
能にするＤＮＡ配列を含んでいるクローニング媒体から
のＤＮ４セグメンｌ’）を含んでいる。さらに、この中
間クローニングベクターは、その天然のあるいは外米性
のプロモーター配列を含む少なくとも、１つの所望の遺
伝子（５，７）を含んでいる。このプロモーるために、
外来性のプロモーター配列（仕立て−Ｌげたプロモータ
ー）を使うことが有利であることもある。 調整の各種の例として、以下のものを挙げることができ
る：（１）組織に特異な発現、即ち、葉、根、茎、花な
ど、（ｉｉ）発現レベル、即ち、発現の強弱、（ｉｉｉ
）誘導性発現、即ち、温度、尤または添加された化学的
因子による発現など。 中間クローニングベクター用の所望の遺伝子の例として
は、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成をコントロール
して植物の栄養価や成長度を改良する遺伝情報を持った
ＤＮＡフラグメントまたは配列、外部から病原物質に対
する保護、例えば病原生物またはストレスのかかる環境
因子に対する耐性、を伺与すΣ生産物の合成をコントロ
ールする遺伝情報を持ったＤ Ｎ Ａ ７ラグメントま
たは配列、遺伝子工学によって改良しようとする植物の
基本的な過程に情報を与える生産物の合成をフントロー
ルする遺１云情報を持ったＤ Ｎ Ａフラグメントまた
は配列など。 ＠２図および第３図は、選択可能なマーカー遺伝子（６
）を含んでいることもある中間クローニングベクターを
表わしている。選択可能なマーカー遺伝子としては、例
えば抗生物質または有毒な類似、物質（例えばアミノ酸
類縁体）を１５号化して（する遺伝子、受容宿主細胞の
欠損を補う遺伝子などが挙げられる。 第４図は、ハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組み
立てに関与する構成を示しており、第５図は、そのハイ
ブリッド′１゛ｉプラスミドベクターを保持しているＡ
ｇｒｏｂａｃＬｃｒｉｕ＋ｎの分離に関与する実際の接
合工程を表わしている。この二「程は、中間クローニン
グベクターがｌミ、ｃｏｌｉ中で組み立てられるので、
この中間クローニングベクターをＡＨｒｏｂａｃＬｅｒ
ｉｕ＋１１東のアクセプタープラスミドに転移させるの
に必要である。 ′１゛−領域の一部が変更された配列で置換されている
改良Ｔｉプラスミドを調製するのに用いられる既知の転
移手法は多数の工程からなっている。 通常、大抵のＤＮＡ組換え操作は、特別に設計されたク
ローニング媒体、例えばｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ
、 Ｇｅｎｅ ２ （］ ９７７）、７５−９３）ｒｌ
＞で行なわれる。しかしこのクローニング媒体は、それ
自体Ａ８ｒｏｌ〕ａｃｌｅｒｉｕｍに移動することがで
きない。この問題は、既知の方法では次の様にして解決
されている： ａ） Ａｇｒｏｌ）ａｃｊｅｒｉｕ＋ｏ中でも複製し
得る別の広範囲宿主用クローニング媒体、例えば＋ｏｉ
ｎｉ−３ａプラスミド（Ｌｅｅｒｏａｎｓら、Ｇｅｎｅ
１９（１９８２）’。 ３６ｉ−３６，１でｐＢＲクローニング媒体配列を置換
する。この繰作はＥ、ｃｏｌｉ中で行ない、中間クロー
ニングベクターが得られる。 ｂ）所望のＤ Ｎ Ａを含有している中間クローニング
ベクターを保持したＥ、ｃｏｌｉ株と、ＡＢｒｏｂａ−
ｃＬｅｒｉｕｎ＋中では複製できないがそれ自体および
飢のＤＮＡのＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋ｎへの転移を
仲介することのでとるヘルパープラスミドを保持しｔこ
別のＥ。 ００１株との接合。 Ｃ）工程（１））で得られるＥ、ｃｏｌｉと′１゛１プ
ラスミドを含んでいるＡ８ｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋の接
合。ヘルパープラスミドは失われる。 ｄ）中間クローニングベクターは、独立したレプリコン
としてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製し、存在す
ることがでトるので、工程（Ｃ）で得られた接合体は、
中間クローニングベクターとＴｉプラスミドとの相互組
込み体を含んでいる細胞、または中間クローニングベク
ターおよび相互組込みが起らなかったＴｉプラスミドを
含んでいる別の細胞の混合物である。相互組込み体だけ
を特異的に分離する為に、゛１゛ｉプラスミドのない別
のＡｇｒｏｂａｃＬ−ｅｒｉｕｎ＋株との接合をもう一
度行なわなければならない。この転移は、Ｔｉプラスミ
ド自体によってｌｌδ号化されている機能によって仲介
される。この第２のＡ ｇｒｏｂａｃ ｌｅｒ ｉ ｕ
ｍ株への申開クローニングベクターの転移は、Ｔｉプラ
スミドとの相互組込み体の形でのみ行なわれる。 ｅ）所望の置換を行なった最終的な改良Ｔｉプラスミド
を得るために、第２回目の乗換えが行なわれる （Ｌｅ
ｅｎ＋ａｎｓ ら、ＪンＭｏｌ、 Ａｌ）Ｉｌｌ、
ＧｃｎｅＬ。 １ （１９８１）、１．４９−１６４）。 僅かにもう１つの既知の方法は、上記工程（ｄ）におい
て、中間クローニングベクターと適合しない別のプラス
ミドをＡｇｒｏｌ）ａｃＬｅｒ’ｉｕ＋ｎ’ｌこ導入す
ることを除けば、上の方法と基本的に同じである。この
場合、独立したレプリコンのままでいる申開クローニン
グベクターは全て失われるので、相互組込み（単一乗換
え）を選択することがで外る（Ｍａｌｚｋｅら、Ｊ、
Ｍｏｌ、Ａｐｐｌ、 Ｇｅｏｅｔ、 １（［８１）、
３９−４９ ）。 ここに本発明者らは、ＡＨｒｏ１３ａｅｔｅｒｉｕｍの
アクセプターＴｉプラスミドに中間クローニングベクタ
ー門導入する為の、新規な非常に簡素化された方法を提
供するものである。簡単に言えば、この方法は、多くの
通常使用されているクローニングプラスミド（例えばｐ
ＢＲ３２２）を血孤Ａ８ｒｏｂａｃ−Ｌａ（ｉｕｍに転
移させるのに、ＩＥ、ｃｏ日のヘルツ（−プラスミドが
役立つということを見０出した事実に基づいている。こ
れらのプラスミドは、（１づれもＡ ｇｒｏｌ）ａｃ
Ｌｅｒ’ｉ ｕ＋＋＋中では複製でたなり）ので１、ア
クセプターＴｉプラスミドと相互組込みし得るものだけ
が保持されることになる。さらに、本発明者らは、ＡＢ
ｒｏｌ）ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎ中のこの相互組込み体を、
植物細胞への感染の為の直接のベクター組成物として使
用するのである。この様にして、本発明者らは前記の工
程（ｄ）および（ｅ）を省略した。これによって、改良
ノ司ブリッド′ｒｉプラスミドを組み立てるのに要する
時間が減少し、可能な組み立てに柔軟性が増加し、かく
して、植物細胞ゲノムへＤＮＡを転移させる為のベクタ
ーとしてこのアクセプター′１゛１プラスミドを使用で
とる可能性が著しく高まったのである。 即ち、第５図に概略を示した様に、アクセプター ｉ”
ｉプラスミドへの中間クローニングベクターの導入は
２工程で行なわれる。先づ、中間クローニングベクター
を持ったＥ、ｃｏｌｉ株（１）を、この中間クローニン
グベクターのＡｇｒｏｌ〕ａｃｔｅｒｉｔｕ＋＋への摂
動を促す２つのプラスミドを持った別のＥ。 ｃｏｌｉａ（２）と接合させる。これらのヘルパープラ
スミドの代表的な、そして好ましい例は、１１１０１１
機能を含んだ１で６４ｄｒｄｌｌおよびＬｒａｌ幾能
を２んだｌ）Ｇ Ｊ ２．８である（Ｆ” ｉ ｎｎｅ
ｇａｎら、Ｍｏ１．Ｇｅｎ。 （’；ｅｎｅＬ、 ｌ ８５（１９８２）＋３４４−３
５１）。中間クローニングベクターのクローニング媒体
−１：の１３０＋１１サイト（Ｗａｒｒｅｎら、Ｎａｔ
ｕｒｅ２７４（］ ！Ｊ°ｊ８）。 ２５９−２６１）が池の２つのプラスミドによって暗号
化されている機能体によって認識され、転移できる様に
なる。全てのプラスミドは、その存在を検出するために
抗生物質耐性マーカーを含んで゛いるのが好ましい。次
いで、得られたＥ、 ｃ、ｏｌｉ株、即ち３つのプラス
ミド全てを保持している摂動株（３）を、中間クローニ
ングベクターと相同の領域を持ったアクセプターＴｉプ
ラスミドを保持しているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと
接合させる。中間クローニングベクターとアクセプター
Ｔｉプラスミドとの単一乗換えが行なわれたがどうかは
、中間クローニングベクターの抗生物質耐性マーカーに
ついての選択によって検出でとる。 第６図は、第１図の７クセブターＴｉプラスミドの組み
立てに用いられたＤ Ｎ Ａ分子を模式的に示したもの
である。本明細書では、このプラスミドをアクセプター
′ｌ゛１ プラスミド（タイプＡ）と呼び、池の７クセ
プター′ｒｌプラスミド（タイプＢ）と区別することに
する（第８図参照）。この組み立てには、Ｔｉプラスミ
ドと、りｏ−ニング媒体（３）中に境界配列（１）およ
び（２）を持っているもう１つのプラスミドとの間に二
重乗換えが起ることが必要である。図に示した様に、ク
ローニング媒体配列（３）は左側の境界配列（１）と右
側の境界配列（２）との間にある。このＤＮＡ鎖の正し
い極性を示すために、これを環上に描くことができる。 しｈ化、二重乗換えに使用される相同領域を示すために
は、この環を開裂させて図示した。これは理解を助ける
為のやり方として重要であり、第８図に於けるアクセプ
ター１゛１プラスミド、（Ｂ）の組み立てに於いても用
いられている。即ち、もし境界配列（１）および（２）
が、単にクローニング媒体配列（３）内に挿入されたの
なら、二重乗換えによって、′ｌ゛−領域が削除されて
はいるがこの境界配列（１）および（２）の間のクロー
ニング媒体配列のない′１゛ニブラスミドが得られるこ
とになる。第（ｉ図に示した様に、二重乗換えによって
、境界配列（１）および（２）の間にもとのＴ−領域を
持ったべ１状１） Ｎ Ａ分子か゛生成する。これはレ
プリコンではないので消失する運命にある。この二重乗
換えか起ったかどうかは、例えば′１゛ｉプラスミドの
１゛−領域内に含まれる抗生物質マーカーの欠落に一つ
いて選択したり、りＵ−ニング媒体配列（，３）内の抗
生物質耐性マーカーについて選択したりして、°遺伝子
学的に選択することがでとる。 第７図１．！：、ｐｔＳ２図および第３図の中間クロー
ニングベクターの組み立てを示す模式図である。制限エ
ンドヌクレアーゼサイトＲ２またはＲ２で゛それぞれ囲
まれた所望の遺伝子（５）および選択可能なマーカー遺
伝子（６）が、酵素Ｒ１およびＲ２の為の特異な卯１限
サイトを含んでいるクローニング媒体配列（３゛）に、
これら全ての分子の消化およびライゲーションによって
挿入される。得られた組換えＤＮＡ分子は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ宿主細胞を形質転換するのに使用され、その形質転換
本は、クローニング媒体配列（３゛）の抗生物質耐性マ
ーカー（）＼ｌ、 ｌ）で選択される。 第８図は本発明のもう１つの態様、即ちアクセプター１
゛１プラスミド（１３）を組み立てるのに使用７される
Ｄ Ｎ Ａ分子の模式図である。この場合は、境界配列
（１）および、（２）のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列
（９）および（１０）の開にクローニング８体配列（３
）を含んでいるプラスミドとＴ１プラスミドｌとの間で
二重乗換えが起る。乗換えに使用される相同領域を示す
為に、小さい方のプラスミドは開裂しである（第６図と
同様）。二重乗換えによる生成物は、アクセプターＴｉ
プラスミド（Ｂ）と、もとのＴｉプラスミドからのＴ−
領域およびＩ）Ｎノル配列（２）、（１０）、（９）お
よび（１）を含んでいる、消失するもう１つの環状Ｄ
Ｎ Ａ分子である。 遺伝子学的選択は第６図について記載したものと同様に
して行なうことができる。 第９図は、第８図の７クセプター１゛； プラスミドＢ
と組み合せて使用される中間クローニングベクターの模
式図である。ここでは、所望の遺伝子（５）は、クロー
ニング媒体配列（３゛）中に含まれ−がどの様にしてア
クセプター１゛１プラスミド（Ｄ）に挿入されるかを模
式的に示している。この場合、中間クローニングベクタ
ーのクローニング媒体配列（３゛）の抗生物質耐性マー
カーで選択すると、２つのプラスミドの間の相互組込み
の結果としてのハイブリッド゛ＦＩプラスミドを確実に
見つけることができる。境界配列（１）および（２）内
に含まプラスミドが得られる。この様にして組み立てら
れたハイブリッドプラスミドは、その１゛−領域に、例
えば第４図のハイブリッドＴｉプラスミド中の配列（３
）および（３゛）の様な直接反復の配列を含有しておら
ず、従って、分子内組換えの結果として、ハイブリッド
ベクターまたは植物細胞ゲノム中に導入されたＤＮＡが
不安定になる可能性が避けられる。 本発明者らの研究室で行なった実験結果から、第９図の
中間ベクターの組み立てには、境界配列１および２の両
者を所有する必要はないことがわかった（未発表）。し
かし、所望のＤＮＡ配列を植物ゲノムに組込むには、少
なくとも右側の境界配列（２）（第１図および第９図参
照）を有することが必要十分条件である。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｌｌのＴｉ プラスミド゛
、例えばノ／＜リンまたはオクトビンＴｉプラスミドの
制限エンドヌクレアーゼ地図についての知見（Ｄｅｐｉ
ｃｋｅｒら、Ｐｌａｓｍｉｄ ３（１９８０）、１９３
−２１１Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓ＋＋＋ｉｄ ６（，
１９８１）、２４９−５２３）およびｉ” −Ｄ’Ｎ
Ａ境界配列を含んでいる制限フラグメントしついての知
見（Ｚ ａ＋ｌ１ｌ）ｒｙｓｋ ｉら、Ｊ、Ｍｏｌ。 Ａｐｐｌ、 ＧｅｎｅＬ、 １（１９８２）＋３６
１−３７０；Ｄｅ Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒら、Ｍｏｌ、
Ｇｅｎ、 ＧｅｎｅＬ、１８３（１９１）、２８３−
２８８）から、当業者であれば誰れでも、本発明方法に
従ってアクセプターＴｉプラスミドを組み立てることが
で鰺る。この池、通常の組換えＤ Ｎ Ａ技術および基
礎的な細菌の遺伝子繰作を実施できる能力が要求される
に過ぎない。本発明は、ハイブリ・ノドＴｉプラスミド
ベクターを組み立てるのに有効であることがわかった本
明細書に記載したアクセプターＴｉプラスミドを具体的
に提案している点でユニークなものである。更に、これ
らの７クセプターＴ：プラスミｌ”は′、遺伝子を植物
細胞ゲノムヘ導入するための方法の一部を構成する様に
設計されたものである。 既述したアクセプターＴｉプラスミド、中間クローニン
グベクター、ハイブリッドＴｉプラスミ１々゛ベクター
およびベクター組成物を更１こ例示し、植物細胞ゲノム
へ組込まれた外来性遺伝子の発現を示す彩質転換植物細
胞および植物を提供するのにこのベクター組成物が有効
であることを％ｇ証するために、以下に実施例を挙ける
。 実施例１ アクセプター１゛１プラスミド３８５０（Ａ
タイプ）の組み立て 出発株およびプラ又ミＶ： Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ＋ｎｅｆａｃｉｅｏ
ｓ （ｌ）外型Ａｇｒｏｂａ−ｃ１．ｅｒｉｕｎ＋由来
のりファンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１おｈｔ１９０ラムフ
エニコール−エＱスロマイシン耐性株Ｃ５８ＣＬ） Ｔｉ プラスミド−１１ＧＶ ３８３９第１１図のプラ
スミドニｐＡｃｇＢ Ｔｉ プラスミドｐＧＶ ３８３９１まノ、＜１）ン７
゛ラスミド ｐＴｉ Ｃ５８Ｌｒａｃ（ｐＧ＼７３１
０（１；１−１ｏｌｓｔｅｒｓら、 Ｐｌａｓ＋ｎｉ
ｄ ３（１９８°）、２１２−、 ２３０）から
組み立てる。これ（土Ｔ−１１戊のＬＩＪ央近く
【こ欠
失置換突然変異体（ミュータント）を含んでいる：即ち
、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント１９の内部のＳｍａ
Ｉフラグメント２４ （Ｄｅｌ〕１ｃｋｅｒら、ｌ？
ｌａ５ｍ１ｄ ３ （１９８０）； １９３−２１１
）は、Ｔｎ５のａ ｐ １．（アセチルホスホトランス
フェラーゼ）遺伝子を含んでいる１）ＫＣ？のＨｉｎｄ
ＩＩ ７ラグメント （Ｒａｏら、 Ｇｅｎｅ ７（
１９７９，７９−８２）で置換されている。この遺伝子
はアミノグリコシドネオマイシンおよびカナマイシンに
月する耐性を暗号化している。ｐＧＶ３８３９の゛１゛
−領域の制限地図を第１２図に示す。 プラスミドｐＡｃｇＢは、Ｔ −Ｄ Ｎ Ａの境界部だ
けを含んでいるｐＢＲ３２２中のＡｃｇＢの挿入体であ
る（第１１図参照）。この境界部はＴ −１’） Ｎ
Ａの末端部として定義され、これらの領域は、′Ｆ−Ｄ
Ｎ Ａの植物細胞デ７ムへの安定な組込みに役割を果
たす。このクローンの起源および分析については詳しく
記載されている（ Ｚ ａ＋ｏｂｒｙｓｋ ｉ 呟５ｃ
ｉｐｕｃｅ２０ ’、）（１９８０）、１３８５−１３
’月）。 このクローンは、形質転換されたタバコＤ Ｎ Ａ ｈ
・らＩ”−１） Ｎ Ａの部分を再分離することにより
得られた。ｐＡｃＢＩ３は、Ｔ −１）、Ｎ Ａの左右
の境界を含む様に縦列に並んだ２つのｒ’ −Ｄ Ｎ
Ａコピーめ接合点を含んでいる。更に、ｐＡｃｇＢは、
その遺伝情報が右側Ｔ−ＤＮＡ境界のすぐ近くに位置し
ているという理由で７パリンシンターゼ遺伝子を含んで
いる。このプラスミドｐＡｃｇＢは、「タイプＡ」アク
セプターＴｉ プラスミド、 ｌ］ＧＶ３８５０の組み
立てに使用される。第６図は関与する構造の概略を、第
１３図はｐＧＶ３８５０が得られることになる二重乗換
えに関与するＤＮＡ領域をより正確に示したものである
。 上記のプラスミドｐＡｃＢＢは、その＋＋ＢＲ３２２部
分にＣｏ１Ｅ１−特異ｂｏｒｏサイトを持っており、ヘ
ルパープラスミドＲ６４ｄｒｄｌｌおよび１）（ｘＪ２
８を使ってＥ、 ｃｏｌｉからＡ８ｒｏｂａｃｔ、ｅｒ
ｉｕ＋ｎへ摂動することができる。Ｅ、ｃｏｌｉに含ま
れているプラスミドＲ’６４ｄｒｄ １１およびｐｃ；
Ｊ ２８は、接合により、ｐＡｃｇＢを持ったＥ、
ｃｏｌｉ株に導入される。トランス接合体は、アンピシ
リン耐性（ｐＡｃｇＢのｌ］ＢＲ３２２配列から）、ス
トレプトマイシン耐性（Ｒ６４ｄｒｃｌ １１から）、
およびカナマイシン耐性（ｐＧＪ２８から）コロニーと
して選択される。 ；）つのプラスミドの全てを保持している ＩＥ。 ｃｏｌｉ株を、す７７ンピシン耐性て゛ありＴＩプラス
ミミドＧＶ ３８３９を含んでいるＡＨｒｏｌｉａｃＬ
ｅｒ’ｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１に接合させる。ツバリンＴｉ
プラスミドとの最初の単一乗換えを選択するのにｐＢＩ
λ３２２のアンピシリン耐性を利用する。アンピシリン
耐性をＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋ｏ中で安定させるこ
とができる唯一の方法は、Ｔ−領域境界近くの相同領域
の１つでｐＧＶ ３８３９と相同組換えにより乗換えを
することである。池の相同領域での２回目の乗換えによ
り、ａｐｔ遺伝子（カナマイシン耐性）を含んでいる１
＋Ｃｉ Ｖ ’３８３９のＴ−領域の中央部がクローン
ｐ Ａ ｃＢ ［３の＋＋Ｂ Ｒ３２２配列で置換され
る。従って、第２の組換え体はアンピシリン耐性、カナ
マイシン感受性である。第２の組換え体を分離する確率
を高めるために、最初の組換え体（ｐＡｃＢＢ：：ｐＧ
〜’３８３９）を保持しているり７アンピシリ耐性Ａｇ
ｒｏｌｚａｃｔｅｒｉｕｍを、Ｔｉプラスミドを持って
いない第２のタロラムフェニコール／エリスロマイシン
耐性Ａ ｇｒｏｂａｃ Ｌｅｒ ｉ ｕｒｎ株と接合さ
せる。この様にして、約６００コロニー中、１コロニー
の割合で、アンピシリン耐性、カナマイシン感受性のク
ロラムフェニコール／エリエロマイシン耐性Ａｇｒｏｂ
ａｃＬｅｒｉｕ＋ｏ ＩＩＣ； Ｖ ３８５ （ｌを得
ることができる。 勿論、９ＧＶ ３．ｉｊ ５１Ｊタイプの７クセプター
Ｔｉプラスミドを組み立てるのに使用することができる
その池のＴｉプラスミドもある。゛Ｉ′−領域の中央近
くに選択し得るマーカー遺伝子を持ったＴｉプラスミド
は全て受容体として使用で外る。更に、左境界７ラグメ
ン）−１）ＢＲ３２２−右境界７ラグメン韮の方向に、
左右の境界７ラグメントの中間にｐＢＲ配列が位置する
様に、ｐＢＲ３２２にＴ−領域境界フラグメントな挿入
することによってｐＡｃＢＢ様のプラスミドを組み立て
ることがでとる。例えば、ツバリンＴｉプラスミドの左
および右境界７ラグメントはそれぞれＨｉｎｄ ｌｌｌ
７ラグメント１０および２３である（ Ｄｅｌ＋１ｃ
ｋｅｒ呟ＰＩａｓｎ＋ｉｄ ３（１９８０）、 １９
３−２１４）。 ＠−，乗換えによって、ｐＢＲ３２２またはその誘導体
に挿入されている所望の遺伝子を含んだ中間クローニン
グベクターがｐＧ Ｖ、３８５０の改良されたＴ −Ｄ
Ｎ Ａ領域に導入される。唯一つ必要として使用する
為に、導入されるＤ Ｎ Ａか、既に１）ＢＲ３２２に
存在するものの池にもう１つの耐性マーカー遺伝子を含
んでいるということである。 この耐性マーカーは、ｐＢＲ配列内に含まれていてもよ
く （例えばｐＢＲ３２５のＣｈ、Ｒ１またはｐｌ（Ｃ
７のＫｍ ”） 、植物細胞内で試験される１）ＮＡ内
に含まれていてもよい。更に、アクセプター′旨プラス
ミド１）（ハ； ３ Ｕ ５ （ｌにおけるＡ−遺１云
子ｐｆ３ Ｒ３２２は、Ｋ＋ｏ”の様な別の耐性マーカ
ー遺伝子で置換してもよい。この様にして、Ａ１］Ｒで
あるｐＢＲ３２２含有中間クローニングベクターですら
、このｐＧＶ３８５０タイプのアクセプターＴｉプラス
ミドに直接摂動することかでとる。 １）ＧＶ ３８５０タイプの７クセプター゛ロブラス
ミドのもう１つの利点は、形質転換された植物細胞で腫
瘍をつくらないということである。１）（：Ｖ３８５０
の短かくなったＴ −Ｄ Ｎ ’ＡＡ領域、依然として
ツバリンシンターゼを暗号化している遺伝子を含んでい
るので、ｐＧＶ３８５１）で形質転換された細胞は、ツ
バリンか存在するかどうかを分析することにより、非形
質転換細胞から簡単に選り分けることができる。勿論、
アクセプターＴｉプラスミドＩＩｃ！ ’ｖ ３８５１
）に組込まれた中間クローニングベクターかマーカー遺
伝子を含んでいたら、それも直接スクリーニング、即ち
選別にかけることができる。 ＋＋ＢＲ３２２配列を含んだ上記の中間クローニングベ
クターの単一乗換えによるアクセプターＴｉプラスミド
への挿入のほか、このアクセプター１１プラスミドは、
［ショットガンｊタイプの実験に於いて、ｐＢＲ３２２
またはその誘導体中のクローンされたり、ＮＡバンクの
受容体としても使用することができる。Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕ＋ａ中の全てのハイブリッドプラスミドベク
ターは、植物細胞の感染に使用することかでき、次いで
所望の選択可能な遺ｆＦ、 Ｆｆ群）の発現についてス
クリーニングされる。 例えば、選ばれたアミノ酸力吹乏している植物細胞に全
バンクを適用する、二とにより、アミノ酸合成を暗号化
している遺伝子について市単に選別することかで外る。 アクセプター１１プラスミドＩＩＧＶ ３８５１）は、
２つの表現型の特徴を持っている：即ち、（ｉ）腫瘍生
成能力がないこと、および（ｉｉ）もビ「−ＤＮノ＼が
植物細胞ゲノム内に転移したら、ツバリン合成能を有す
ること、である。ｐにＶ ３ ｕ ’、） ０含有ＡＢ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋で感染させた各種の植物組織の
、これらの特徴を調べるために、種々の実験を行なりた
。 ａ）ポテトおよびニンノンディスクを用いた試験 ポテトおよびニンジンの切片にアクセプターＴｉプラス
ミドｐに Ｖ ３ ｊｉ ５ （ｌを接種すると、少量
の硬結組織が生成する。この組織に７パリンが存在する
かどうかを試験した所、陽性であることがわかった。こ
の突然変異体が少量の硬結組織を生産し得ることは興味
あることである。しｈ化、それは、これらのディスクを
低濃度のオーキシンおよびサイトキニンの両者を含んで
（する培地で生Ｗさせた時だけ得られる。 ｂ）全植物をアクセプター′ｌ゛１ブラ又ミドｌ］Ｇ後
に少量の組織成長か観察されただけである（通常、２週
間後に１゛野生型］腫瘍が検出される）。この組織はホ
ルモンを含まない培地では生ｆ７Ｌ鱈）できる。この組
織も／バリン陽性であることがわかった。 Ｃ）さらに、ｐＧＶ ３８５０（形質転換」細胞は腫瘍
性ではないので、これらの細胞は、転移したＤＮＡセグ
メントをそのゲノムに依然として保１￥している正常な
植物に再生することかできる。この形質（換細胞を通常
の再生培地（実施例！；を参照）で培養すると、止常稙
物が得られよう。 ｐＧＶ３８５０の、アクセプタープラスミドとしての有
用性を証明する為に、以下の実験を行なった。ｐＢＲ３
２５中にオクトピンＴ −１） Ｎ Ａの腫瘍機能を含
んでいる中間クローニングベクターをｐＧＶ ３８５０
を保持しているＡＢｒｏｌ〕ａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋に組
み込んだ。単一乗換えによって得られたＡｇｒｏ−ｂａ
ｃ １．ｅｒ ｉ ｕｎ＋中のハイブリッド′［ｉプラ
スミドを、傷つけたタバコ植物に接種した。２週間後に
腫瘍組織があられれた。このことは、腫瘍誘導１） Ｎ
ＡがｐＧＶ３８５０に再導入され、形質転換植物細胞
中で適切に発現されたことを示している。 ’Ｊｌ＆ｆＨ２中間クローニングベクター１】（：＼“
７００ ｂよＩ／ １＋ＧＶ ’７５０（７）組み立て
この組み立ての概略を第１４図に模式的に示した。オク
トピンｉ’ ｉプラスミド１３６ Ｓ、 ３のＴＬ−ｒ
、） Ｎ Ａの右側部分であり、ｐＧ Ｖ ０２０１
（１）ｅＶｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ ６（］ ９８１）
、２４９−２５３）中に存在するＨｉｎｄ ＩＩＩ フ
ラグメン１． ］を、まず、広範囲宿主性ベクターｐＧ
Ｖ １１２２ （Ｌｅｅｍａｏｓら、Ｇｅｎｅ １９
（１９８’２）、 ３６１−３６４）のＨｉ’ｎｄｌ
ｌｌサイトに挿入する。組換えプラスミドＨ）ＧＶ ０
２ （１１ハ、多ニア ヒーヘ９９− ｐＢＲ３２２（
Ｂｏｌｉｖａｒら、 Ｇｅｎｅ ２（１９°７７
）、 ９５−１１３）の特異なＨｉｎｄｌｌｌサイト
に挿入されたトｆｉｎｄ ＩＩＩフラグメント１を含ん
で′いる。１）（ハ′０２０１およびｐＧＶ］ １２２
ＤＮＡは、Ｂ ｅ ｔ、 ｌ −ａｃｈらが記載してい
る方法で調製される（ Ｆ ｅｄ。 Ｐｒｏｃ、３５（］ ９７６）＋ ２０３７−２０４
’３）。 最終Ｎ２０μで中、１）（（＼’０２Ｃ）Ｉｔ）ＮＡ
２μｇを、Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ ２単位（全ての制限酵
素はＢｏｅｈ−ｒｉｎＢｅｒ Ｍａｎｎｌ＋ｅｉ＋ｎか
ら購入した）を用いて、３°７℃で１時間完全に消化し
た。インキュベーション緩衝液はＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ
らにより記載されている（Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎ
ｅＬ １７９（１９８（’、１）、４２ ］ −４３５
）。同シ条件下テ＋１にＶ １１２２ ＤＮＡ ２μｇ
をＨｉｎｄ ＩＩＩで完全に消化した。 最終量２０μｐ中、Ｔ４す〃−ゼ（Ｂ ｏｅｌ＋ｒ ｉ
ｎ８ｅｒＭａ＋＋ｎｌ＋ｅｉ＋ｌｌ） ０ 、０２単
位を用い、０．１μｇの１−１ｉｎｄｌｌｌ消化ｐＧＶ
Ｏ２０１をＨｉｎｄ Ｉｌｌ消化ｐＧＶ １１２２とラ
イプ−ジョン（結紮ルた。インキュベージタン緩衝Ｗ１
．および条件は、製造業者の指示に従った（ Ｂ ｒｏ
ｃｌｉｕｒｅ″Ｔ４す〃−ゼ゛、ＢＯｅｌ＋ｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｌ＋ｅｉ＋ｎ＋ １９８０年８月、＃１
０゜Ｍ、８８ｔ）、４８６ ）。ライゲーション混合物
の−＋ コンピテントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ Ｓ ］ ４１＋ｓｒ
ｌ＋ｓ＋ｎ 細胞（Ｃｏｌｓｏｎら、ＧｅｎｅＬ
ｉｃｓ５２（１９６５Ｌ １０４３１ （’、１５１．
１ ）への導入（形質転換）は、Ｄａ８ｃｒｔおよびＥ
Ｍｉｃｌ＋の方法（Ｇｅｎｅ ６（］ ９８１，１）、
２３−２８）に従って行なった。細胞を、ストレプトマ
イシン（２（）μｇ／＋ｏｌ）およびスペクチノマイシ
ン（５０μｇ／Ｉｌ＋ｌ）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌ
ｌｅｒ。 Ｅｘｐｃｒｉ＋ｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃ；ｅｎｅＬｉｃｓ （１’ｊ ７２）＋
Ｃｏ１ｄ Ｓ１＋ｒｉｎＢ１１ａｒｌ）ｏｒ Ｌａｌ＋
ｏｒａＬｏｒｙ、 Ｎｅｕ＋Ｙｏｒｋ）に塗抹した。組
換えプラスミド゛を含有している形質転換体を、テトラ
サイクリン耐性をｎｉ号化している遺伝子への挿入によ
るその不活性化（Ｌｅｅ＋ｏａｎｓ呟Ｇｅｎｅ １９（
１９８−２）、 ３６１−３６４）に基づき、テトラサ
イクリン感受性（１０μｇ／＋ｎｌ）でスクリーニング
（選り分はルだ。ストレプトマイシンおよびスペクチ７
マイシンに耐性を示し、テトラサイクリンに感受性を有
するクローンを物理的に同定した。マイクロスケールの
ＤＮＡ調製はＫｌｅｉｎらの方法（Ｆ’ ｌａｓｍｉｄ
３ （１９８０）、８８−９１＞に従って実施した。 １）に＼・“１１２２のＨｉｎｄ ＩＩＩサイト中の
ｔｌｉｎｄ Ｉｌｌ ７ラグメント１の配向は、Ｓａｌ
Ｉ消化によって決定した。組換えプラスミドを消化し
く０ ’ Ｐ ａｒｒｅｌ Ｉ らの条件、Ｍｏｌ、
Ｃ酬ｅｎ、 ＧｅｎｅＬ、 １ ７９（１９８０
）、 ４２１−４３５）、アガロースゲル電気泳動に
かけると２個の７ラグメントが得られた。α−配向には
０．７７ｋｂおよび２２．７６ｋｌ）の７ラグメント、
β−配向には、１（１，３３ｋｌ〕および１３．２＋ｌ
ｋ＋３の７ラグメントがあった。α−配向の紐換えプラ
スミドをその後のクローニングに使用し、これを１）に
＼・“１１６８と名付けた。 Ｔ Ｌ −Ｄ Ｎ Ａの左側部分（左の境界配列を含ん
でいる）を含有しているＢｇｌ Ｊｌ−８ａｌ Ｉ ７
ラグメントを１３８１ ｌｌ−３ａｌ ｌで開裂したｐ
ＧＶ’１ｌＧ８に尋人する。このフラグメントは、ベク
ター１＋ＢＲ３２２に挿入された、１）′ｌ″１Ｂ６Ｓ
３ のＴ領域からの、Ｂａ＋ＪＩ Ｉフラグメント８を
含んでいる組換えプラスミドｐＧ Ｖ ０１５３ （Ｄ
ｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓ＋ａｉｄ（１９８１）、 ２
４９−２５３）から得られる。１）に＼、’１Ｎ５３お
よびＩ）ＧＶＩ１６８ＤＮＡはＢｅｔ、１ａｃｈらの方
法で調製する（ Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ。 ３５（１９°７Ｇ）、２０３７−２（１４３）、ｖＧ＼
゛０］ ５３１）ＮＡ １１）μＢを１０単位のＢｇｌ
ＩＩ および１０単位のＳａｌ ｌを用い、最終量１
ｔ）１．）μｅ中３７℃で１時間、完全に消化した。消
化混合物をプレパラティブ（）、８％アガロースゲル上
に置いた。Ａ Ｉ Ｉ １ｎＨＬｏｎらの方法（Ａｎａ
ｌ、 Ｂｉｏｃｈｉ＋ｎ、 ８５（１９７８）、１
８８−．１９６）で電気溶出し、ゲルから２．１４ｋｌ
ｒ ＢｌｇＩＩ−８ａｔ １１７ラグメン）・を回収し
た。Ｉ）ＧＶＩ １６８ＤＮＡ ２μｇを２単位のＢｇ
ｌ ＩＩおよび２単位のＳａｌ ｌで完全に消化した
。ｆｔ１ｉ２１）μ、ｇ中、Ｔ４ＤＮＡ’Ｊｆｆ−ゼ（
’ｌ。 （）２単位を用いてＢ８Ｉ ｌｌ−８ａｌ １７ラグメ
ントＤＮＡ０．１μＨを０．１）２μｇのＢｇｌ ｌ
１ｌ−８ａｌｌ消化１）ＧＶ１１６８とライゲーション
した。このライプ−ジョン混合物をコンビテン）Ｅ、ｃ
ｏｌｉＫ５１４１、ｓｒ ｂｓ＋。子細胞（Ｄａｇｅ
ｒｔおよびＥｒｌ＋１ｉｃｈ。 Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３−２８）に導入した。 細胞をストレプトマイシン（２（）μＢ／ｌｏｌ ）お
よびスペクチ７マイシン（５０μｇ／＋ｎｌ）を補足し
たＬＢ倍地（Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｅｒｉ＋ｎｅｎＬ
ｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ （１
９７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓ１＋ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ｏｂｏｒａＬｏｒｙ＊ Ｎｅｕ＋ ＹｏｒＫ）に塗抹し
た。 ストレプトマイシン−およびスペクチ７マイシンー耐性
形質転換体から、マイクロスケールＤＮＡプレバレージ
ョン（Ｋｌｅｉｎら、Ｐ Ｉａｓ＋ｎｉｄ ３ （１９
８０）、８８−９１）を行なった。２．１４ｋｂＢｇｌ
ｌｌ−３ａｌ ［７ラグメントがＢｇｌ ｌｌ−３ａ
ｌ ！消化ｐＧＶ ｌ’ｌ ６８に挿入されている組換
えプラスミドをＢｇｌ ｌｌ−３ａｌ Ｉ消化により同
定した。 この消化で２．１４ｋｌ）および２１．８２ｋｌ）の２
つの７ラグメントが得られた。これらの分子量（２，１
４ｋｂおよび２１ ；８２ｋｌ））に相当する消化パタ
ーンを持ったプラスミドを１）に〜“１１７１と名イ（
ｊけ、さらにクローンするのに用いた。＋＋ＧＶ １１
７ ］ ｈ・らの１２．６５ｋｂフラグメントは、左右
のｉ” Ｌ −１） Ｎ Ａ境界配列（ＤｅＢｅｕｃｋ
ｅｌｅｅｒら、ｉｎ Ｆ”ｒｏ−ｃｒ＋０ｄｉｒ＋Ｂｓ
ｌＶｌ、ｌ＋ Ｉｏｌ、ｐｒｎａｌ、１ｏｎａｌ Ｃ
ｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎｌ”１ａｎＬ ｌ−’ａ１．ｌ
＋ｏＦｉｅｏｉｃ ＢａｃＬｅｒｉａ、 Ｍ、 Ｒｉｄ
ｅ’（ｅｄ。 ）（１９’ｉＪｔ １．Ｎ、、 Ｒ，Ａ、 ＋ＡＩ＋
８ｒｅＳｗｌ １５−１２ （５）および腫瘍性の増殖
を可能にする遺伝子（Ｌｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、
（１９８２）、］ ４７−１５２）を含んでいる。この
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメントをプラスミドｐＢＲ３
２５に挿入した（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｇｅｎｅ４（１９７
８）、１２１ １３Ｇ）。 １＋（ｉＶ１１°７１および１＋ｌ’３ Ｒ３２５はＢ
ｅｔ、１ａｃｂらの方法で調製した（Ｆｅｄ、 Ｆ’ｒ
ｏｃ、 ３５（１９７６）。 ２（１３７−２＋１４３）。それぞれのｌ） Ｎ Ａ
２μｇをυＦ位のＨｉｎＪＩＩＩ を用い、３°７℃で
１時間完全に消化した（インキュベーション緩衝液はＱ
゛Ｆａｒｒｅｌｌらにより記載されている（Ｍｏｌ、
Ｃ；ｅｎ。 Ｇｅｎ（１，ビア９（１”９８０）ｗ ４２１ ４３５
））。 ０．１ 、ｌｊＨノｔｌｉｎｄ ＩＩＩ消化シタｐＧ
Ｖ １ ］ ７４ ヲ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで線状化した
０、０５μｇのｐＢＲ３２５と、Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａリ
ガーゼ０．＋１２単位を用いてライゲーションした。ラ
イゲーション混合物を用５またコンピテントＥ、 ｃｏ
ｌｉ Ｋ Ｓ ｌ ４１＋ｓｒ・ ｌ＋ｓ＋ｎ の形
質転換はＤａＨｅｒｔおよびＥＭｉｃｂの方法で行なっ
た（Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３−２８）。細胞を
、カルベニシリン（１００μＢ ／ ＋Ｏｌ ）を補足
したＬＢ培地（Ｍ！１ｌｅｒ＋ Ｅｘｌ）ｅｒｉｍｅｎ
ｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ （
１９７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓ１＋ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に置いた。 カルベニシリン耐性コロニーを、テトラサイクリン耐性
を暗号化している遺伝子に挿入することによるその不活
性化に基づト、テトラサイクリン（１（）μｇ／ ＋ｎ
ｌ ）感受性でスクリーニングした（ Ｂｏｌｉｖａ
ｒ＋ Ｇｅｎｅ４（１９７８）、１２１−１３６）。カ
ルベニシリン耐性、テトラサイクリン感受性のコロニー
を、そのコロニーから調製したＤＮＡの制限酵素消化に
より、マイクロスケール技法（Ｋｌｅｉｎら、 Ｐ ｌ
ａｓ＋ｎ１ｄ３（１９８０）、８８−９１）によって物
理的に特性化した。即ち、Ｂａｎ＋Ｉ−１日前化により
、４つのＤＮへ７ラグメントか得られる：α配向の場合
は０．９８に’ｂ、４． ’７１ ｋｂ、５．９８ｋｂ
および７．０２ｋｂの７ラグメントが得られ、β配向の
場合は０．９８ｋｂ、４．７１ｋｂ、１．７］ｋｂおよ
び１１．２０ｋｂの７ラグメントがｌ＞られる。α配向
に相当する組換えプラスミドが荊咲ｉ萩＝占れはｐＧ
Ｖ ７００と名利けられた。このプラスミドがその後の
実験に用いられた。 ｐＧ Ｖ ’７５０１Ｊ：、ｐＧ Ｖ ７００１ｍ挿入
’ａ しなＴＬ−領域の内部の腫瘍に必須の機能を暗号
化している３、４９ｋｂ ＢｇＩ ＩＩ−８ｍａ ｌ
７ラグメントをカナマイシン耐性をＩ暗号化している２
、８１ｋｂＢａ＋ｎＨＩ −Ｈｐａ Ｉ フラグメン
トで置換することにより、ｐＧＶ７００から誘導される
。カナマイシン耐性を暗号化しているＢａ＋ｎＨＩ −
Ｈ１］ａ Ｉ ７ラグメントはλ：：Ｔｎ５（Ｂｅｒｇ
呟Ｆ’ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、）＼Ｃａｃ１． Ｓｃｉ、
ＵＳＡ’？ ２（１９７５）、３６２８−３６３２
）から得られる。λ：：Ｔｎ５の調製は ム１ｉ ｌ
Ｉｅｒにより記載されている（ Ｅｘｐｅｒｉ＋ｎｅｎ
ｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１
９７２）、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｌ−１ａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｕ＋ Ｙｏｒｋ
）。 １）に ＼’７００ＤＮＡはＢｅｔｌａｃｈら
の方法で調製する（’Ｆｅｄ。 Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２（）３７−２０４．’
（）。 ｐＧＶ７００ＤＮＡ２μＨを２単位のＢｇｌ Ｉ
＃よび２単位のＳ＋ｎａＩ で完全に消化した。λ：
：Ｔｎ５１） Ｎ Ａ ２μ８を２単位のＢａｒｏｎ−
ＩＩ および２単位のＨｐａｌで完全に消化した。１μ
εのＢ ａ＋ｎ ）（−１−Ｈｐａ １消化λ：：Ｔｎ
５を、最終量１０μ夕中、Ｔ 、ｌ ｌ’） ＮＡリガ
ーゼ０．５単位を用いて、（〕、２μ８のＢ ｇＩＩＩ
−８ｈｏａｌ消化１）（、； Ｖ ７００とライゲーシ
ョンした（製造業者の指示する条件に従った）。このラ
イプ−ジョン混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ５
１４ｈｓｒ ｈｓ＋ｎ＋細胞（ＤａＢｅｒｔおよびＥ
ｒｂｌｉｃｌ＋、 Ｇｅｎｅ６（１９８１３）、２３−
２８）に導入した。細胞を、カルベニシリン（１００μ
ｇ／＋ｎｌ）およびカナマイシン（２５μＢ／ｒｏｆ）
を補足したＵＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ。 Ｅｘｐｅｒｉ＋ｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９７２）＋Ｃｏ１ｄ Ｓ１＋
ｒｉｎｊ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅ
ｕ＋ Ｙｏｒｋ）上に置いた。マイクロスケール技法（
Ｋｌｅｉｎら。 ＰＩａｓｍｉｄ、３（１９８０）８８−９１）に従って
調製したｌ） Ｎ Ａの制限酵素分析により、Ｃ１，Ｒ
およびＫｉｎ’コロニーを物理的に特性化した。このＤ
ＮＡｔ（ＢｇＩＩｆ／Ｂａ５ａｌ旧で二重消化すると、
３．９４ｋｂ、５．８９ｋｌ）およびａ、、ｏ９ｋｂの
３つの７ラグメントが、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化すると
２．６８ｋｌ）、５．９９ｋｂおよび９，２５ｋｂの３
つの７ラグメントが得られる。この消化パターンを示す
プラスミドをｐ（ｘ＼硲５０と名付け、第１７図に模式
的に示した。 ｐＧＶ ７ ｔ） ＯトｐＧＶ ７５０ハ、オフ）ビン
Ｔｉ７”７スミｆ’ ｐＴｉＢ６ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの
左右の境弊配列を含む、２−？の相異なる中間クローニ
ングベクターである。更に、これら２つのプラスミドで
は′ｒ−領域内の削除の程度が異なっている。 １）に＼１７旧）は、オクトピンシンターセ′（トラン
スクリプト３）およびその他３つの生成物、即ち４．６
ａおよび６ｂ （Ｔ−領域の生成物についてはＷ ｉ
ｌ ｂｅ ｉ Ｌｚｅｒ ら、ＥＮＢＯＪ、１ （１
９８２）。 １３！Ｊ−１４６参照）のための遺伝情報を持った縮小
′Ｉ゛−顧域を含んでいる。この３つの生成物（４，６
ａおよび６ｂ）の組み合せが形質転換された植物の新芽
形成を促す。＋３Ｇ Ｖ ７５１）はもっと小さいＴ−
領域、即ちオクトビンシンターゼ遺伝子だけを含んでい
る。生成物４，６ａおよび６１〕の為の情報は、カナマ
イシン（ネオマイシン）耐性を暗号イ些している抗生物
質耐性マーカー遺伝イによって置換されてしまっている
。 ｐＧＶ ７００ＭＭｏ’ Ｉ）ＧＶ ７ Ｓ （’、）
１．ｔ、Ｂタイプの７クセプターＴｉプラスミド（第８
図および後記実施例３参照）と共に使用し得る中間クロ
ーニングベクターの例である。これらのベクターは、そ
れらが所望の遺伝子を含んでいないことを除けば、第９
図に示したものと部分的に類似している。 これらのベクターは、その改良Ｔ−領域内にクローンす
る為の１個の制限エンドヌクレアーゼサイトを含んでい
′るので、所望の遺伝子を簡単にそれらのベクターに挿
入することができる（第１４図および第１５図参照）。 享ｍ９ｕ３ アクセプタづｉプラスミドｐＧＶ２２６
０（タイプＢ）の組み立て 出発株およびプラスミド： ＡＢｒｏｂａｃＬｅｒｉｔｕ＋白、ｕｍｅｒａｃｉｅｎ
ｓ （野生型ＡＨｒｏｂａ−ｃｔ、ｅｒｉｕ＋０から誘
導される、す７アンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ］およびエリ
スロマイシン−クロラムフェニコール耐性２株Ｃ５８Ｃ
１） ′１盲 プラスミド＝ ｐＧＶ２２１ ？中間べ’）９
−（第１６図）＝ｐＧＶ７４５Ｔｉプラスミド１＋ＧＶ
２２］７の組み立てについては詳細に記載されている（
Ｌｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、１
４７ １５２）。 これは、オクトピンＴｉプラスミドの全Ｔ １．−領域
の欠失置換突然変異体を含んでいる：即ち、Ｂａｍｆ（
Ｉ ７ラグメント８．３０ｂ、２８．１７ａおよびＢａ
ｔ訂１１フラグメント２の左の３．７６ｋｌ）ＢａｍＨ
Ｉ −ＥｃｏＲＩ ７ラグメント （Ｄｅ Ｖｏｓ ら
。 Ｐｌａｓ＋ｏｉｄ ６（１９８１）、 ２４９−２５３
）が、ｉ” ｎ ５ のａｐｔ （アセチルホスホトラ
ソス７エラーゼ）遺伝子を含んでいるＩ）ＫＯ２のＥｃ
ｏＲ’ｌ−Ｂａｍｔｌｌフラグメント（Ｒａｏ ＆ Ｒ
ｏｇｅｒｓ、 Ｃ：ｅｎｅ７（’１９７９）ｗ７９”
８２）で置ぎ換えられている。 この遺伝子はアミノグリコシド、ネオマイシンおよびカ
ナマイシンに対する耐性を暗号化している。 中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立てを第１６図に模式
的に示した。これについて以下に詳述する。組換えプラ
スミドＩ）Ｇ＼・“７１３を、α配向でＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ ７ラグメント１４．１８Ｃ，２２ｅおよび３８Ｇを
含む、オクトピンＴｉプラスミドサブクローンｐＧ Ｖ
Ｏ２１９（Ｄｅ Ｖｏｓら、 Ｉｙ’ ｌ ａｓ＋ｎ
１ｄ６（１９８１）、２４９−２５３）から誘導した
。 ｐＧＶＯ２１９ＤＮＡをＢａｔＯ）−（Ｉで完全に消化
し、次いで自己結紮（セルフライプ−ジョン）（こ有利
な条件下で・ライゲージコンした（ライプ−ジョン）１
を合物中のＤ Ｎ Ａの最終濃度〈１μｇ ＤＮＡ／ｍ
ｌ）。 アンピシリン耐性で形質転換体を選別し、制限酵素によ
る消化で物理的に特性化した。ｐＧＶ＋３２１９に存在
する６ 、 ５ ｋｂ Ｂａ＋１１ＨＩ ７ラグメント
をもはや含んでいないクローンを分離し、これをｐｃｖ
Ｖ７１３と名（１Ｒた。コ（１） りｏ ＞ ｐＧＶ
７１３をその後のりａ−ニングに使用した（以下の記
載参照）。Ｂａｍ’ＨＩ ７ラグメント２を含んでいる
ｐＧＶｏ １２０ （’Ｄｅ Ｖｏｓら、 ＰＩａ
ｓ＋ｏｉｄ ６（１９２７］）、 ２４９−２５３）か
ら組換えプラスミド１＋（＋ Ｖ ７３８ 全誘導した
。１）（ハ’０１２０１’）ＮＡをＩＥｃＯＲＩで消化
し、Ｉ）ＧＶ ７１３の場合と同様にして自己結紮させ
た。形質転換体をアンピシリン耐性によって選別し、制
限酵素消化により５）析した。ＥｃｏＲＩ ７ラグメン
ト２０．１２およびＥｃ。 ＲＩフラグメント１９ａの一部とρＢＲ３２２のｐＧ
Ｖ ７３８と名付けた。このプラスミドは、依然として
Ｂａ＋ｎｌ（Ｉ ７ラグメント２の右側部分から（７）
５ 、６５ｋｂ Ｅ’ｃｏＲｌ −Ｂａｎ＋ＨＩ ７
ラグメントを含んでいる（Ｄｅ Ｖ’ｏｓら、 Ｐｌａ
ｓｍｉｄ ６（１９８］ ）。 ２４９−２５３ ）。 次いでｐＧＶ７１’３ＤＮＡを１−１ｉｎｄ ＩＩＩお
よび１３ａｍｌ（Ｉで消化し、消化物をプレバラティブ
ア〃ロースケ゛ルにかけた。電気泳動の後、１］（ハｆ
Ｔ１３内に含まれている２ 、 ３１） ｋｂＨｉｎｄ
ＩＩ’ｌ−’Ｂａｈ＋ＨＩ７ラグメントを電気溶出で
純化した（ＡｌｌｉＢＬｏｎら、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏ
ｃｌ＋ｅ＋ｎ、 ８５（１９７Ｓ）’、１８８−１９
６）。この７ラグメントをＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍ
ＨＩで完全に消化したｐＧ Ｖ ７３８とライゲーショ
ンした。形質転換後、アンピシリン耐性フ拓ニーを、制
限酵素消化により物理的に特性化する。例えば、Ｅｃｏ
Ｒｒ Ｂａ＋ｎＨＩ ？ｈ化により、それぞれ３．９
ｆ３ｋｂ（＝ベクタ一部分）と７．（３５に１）（＝挿
入部分）の２つの７ラグメントが得られるはずである。 この特性を持った組換えプラスミドはｐＧＶ７４５と命
名され、７クセプター１゛１ プラスミドｐＧ〜７２２
６０を組み立てるための中間ベクターとして使用された
。 プラスミドｐＧＶ７４５はｐＢＲ３２２部分にＣｏ１Ｅ
１特異的ｂｏ＋□サイトを持っており、実施例１に記載
した様に（アクセプターＴｉ プラスミドｐＧｖ３８５
０の組み立てについて）、ヘルパープラスミドＲ６４ｄ
ｒｄｌｌおよびｐＧ Ｊ ２８を１史ってＥ、ｃｏｌｉ
からＡ８ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋Ｉ＋へ摂動させること
がでとる。 ｐＧＶ７４５を、す７アンピシン耐性でありＴｉプラス
ミミドＧＶ ２２１７を含んでいるＡｇｒｏｂａ、−ｃ
ｔ、ｅｒｉｕ＋１１株Ｃ５８Ｃ１に授動させた。最初の
乗り換えは、実施例１ （アクセプターＴｉプラスミド
１＋Ｇ’Ｖ ３８ Ｓ ｌ）の組み立て）に記載した方
法と同じ方法で、ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性を使
って選択した。２回目の来り換えにより、ｐｃ； Ｖ
２２１７に存在する欠失置換突然変異体がプラスミドｐ
（ハ゛′７４５のｐＢＲ３２２配列によって置換３ｈる
。１＋Ｇ Ｖ ７４５（７） ｐＧＶ ２２ ］ ７と
の相互組込みの結果得られるアンピシリン耐性トランス
接合体を、カナマイシン耐性の欠落により直接選別する
ことにより第２の組換え体を得た。この様１コシテ、（
＋ＧＶ２２６０ （７ンピシ’）ンｆｉｒ）性、カナマ
イシン感受性）を含んでいるり７アンピシンＡＢｒｏｌ
、ａｃＬｅｒｉｕ＋＋＋株Ｃ５８Ｃ］を祷た。 このｉ’ｉ プラスミドｐＧＶ２２６０１．ｔ、ｐＧＶ
７（月）−またはｌ）Ｇ Ｖ ’７５ Ｃ１−タイプの
中間クローニングベクター用のアクセプタープラスミド
（Ｂタイプ）として使用されるものである。これらは、
（ｉ）アンピシリン耐性遺伝子、複製起源およびｐＢＲ
３’２２の１）０１１＋サイトを持ったＤＮＡ７ラグメ
ント、（ｉｉ）ＴＬ−ＤＮＡの左右の境界配列および、
中間クローニングベクターのＥ、 ｃｏｌｉからＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋への転移並びにそのアクセプ
ターＴｉプラスミド１）ＧＶ２２６０への相互組込みを
遺伝学的に選別し得る、Ｉ）ＢＲ３２２に既に存在して
いる耐性マーカーとは別のもう１つの耐性マーカーを含
んでいるＤＮＡ７ラグメン）・、で構成されている。 例えば、本発明者らは、ｐＧ〜’２２６０と＋）（ＩＶ
°７００との間の相互組込み体を持っているＡｇｒｏ−
ｂａｃｔｅｒｉｕｍは、所望のＤ Ｎ Ａ配列（ｉ’
−Ｉ） Ｎ Ａ境界の間に含まれている）を植物細胞ゲ
ノムヘ転移６ａ、６１） ； Ｗｉｌｌ＋＋＋１ｔｚｅ
ｒ ら、ＥＭＢｏ 、１．１（１９８２）、１３９−１
４６）を含んでいる場合は、期待される表現型、即ち新
芽を生じる腫脹を示す、この様に、本発明者らは、Ｂタ
イプのアクセプターＴｉプラスミドは、第９図に示し、
そして実施例２に記載したタイプの中間クローニングベ
クターとの相互組込み体として使用すると、ＤＮＡを植
物細胞に転移させることがでトることを証明した。 天逓追ロ 植物に発現させようとする遺伝子を含んだ中
間クローニングベクターの組み立て本発明が完成される
まで、Ｔｉプラスミドの′１゛−領域内の、多かれ少な
かれでたらめな位置に全遺伝子を挿入しても、その外来
性の配列が植物ゲ７ムヘ転移した後発現されるというこ
とはなかった。本発明方法では、所望の外来性遺伝子（
群）の方法の有用性は、ツバリンシンターゼ遺伝子を１
１ｈ号化しているＤＮＡ配列が関与する、本発明の実験
によって例証される。、この遺伝子の全配列および正確
な転写開始および終了は既知である（Ｄｅｐ−ｉｃｋｅ
ｒらＪ 、 Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、 ＧｅｎｅＬ、
１ （１９８２）。 ５６１−５７４ ）。本発明によれば外来性遺伝子の蛋
白質暗号化領域はＩＩ（ｉｓプロモーターの隣りに挿入
することができる。外米性遺伝子配列の例として、オク
トピンシンターゼ遺伝子の暗号領域（Ｄｅ Ｇｒｅｖｅ
ら＋ Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅ
Ｌ、 １（１９８２）、４９９−５１２）を１１ＯＳ
プロモーターに隣接させて挿入する。この構造物はアク
セプターＴｉプラスミド内に授動され、植物を感染させ
るのに使用される。生成した腫瘍組織にオクトピンが存
在するかどうかを分析した所、陽性であることがわかっ
た。 キメラツバリンプロモーターを含有している中間クロー
ニングベクターの組み立て：オクトビンシンターゼ構造
遺伝子を第１８図〜第２０図に示す。 簡単に言えば、１１０Ｓ遺伝子を含んでいる制限７ラグ
メントＨｉｎｄ ｌ Ｉｆ” ２３ をインビトロで
処理してｌＩＯ３暗号配列の大部分を除去し、制限エン
ドヌクレアーゼサイトＢａ＋ｎＨＩに隣接している１１
０Ｓプロモーターは保持する（第１８図）。１０μｇ１
） ｐＧＶＯ４２２（完全なＩＩｏｓ遺伝子を含むＨ
ｉｎｄ ｌｌｌ−２３７ラグメントを持った１）ＢＲ３
２２誘導体； Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、 Ｐ ｌａｓｍｉ
ｄ （１９８０Ｌ１９３ ２１１）ＢＳａｕ ３Ａで消
化し、ｌｌ０Ｓプロモーターを含んだ３５（１１）ｌ）
の７ラグメントをプレパラティブ５％ポリアクリルアミ
ドゲルで分離する。このプロモーター７ラグメントを、
５゛−末端燐酸エステル基を除去するために予め細菌性
アルカリホスファターゼ（Ｂ Ａ １＝’ ）で処理し
た、１３８１１１−切１４ＩｉｐＫＣ７（Ｒａｏら、Ｇ
ｅｎｅ７（１９°７９）、’？９−８２）に結合させる
。得られたプラスミド（ｐＬ（、ｉ Ｖ １３ ）２０
μｇをＢｇｌ ＩＩで消化し、４００μでの１２ｍＭ
ＭＢＣＩ２．１２ｍＭ ＣａＣｌ７．０゜６ＭＮａＣ１
，１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ （１） ｌ＠ Ｍ ｔリ
ス−〇 Ｃｌ （ｐ Ｈ８、（’ｌ ）中、３（）℃で
゛Ｂａ１３１＋−キソヌクレアーゼ（Ｂ １ｏｌａｂｓ
、 Ｎｅｗ Ｅｎ８１ａｎｄ） ７ ！ｉｔ位を用いて
４・〜１０分間処理する。この間、約２＋）・−５０１
＋１＋のｌ） Ｎ Ａが除去される。この１．’３ａ１
３１−処理分子をＢａｎ＋１旧で消化し、１．） Ｎ
ＡポリメラーゼのＫＩｅｎｃｏｕ７ラグメントと共益イ
中Ａ１−た＝填されたＢａｒｎ）−ＩＩ末端とＢａ１３
１除去末端のライプ−ジョンから得られる再生Ｂａ＋ａ
ト目サイトを持ったプラスミドを選別する。いくつかの
候補のＢａｒｎＨＩ Ｓａｃ ＩＩフラグメントのサ
イズを６％尿素 ゛−ポリアクリルアミドデル中で
見積り、サイズが２００〜２８０ヌクレオチドの範囲に
ある候補のヌクレオチド配列を決定する。プロモーター
を持った２ 、０３１）ｌ）の５ａｃｌｌ −ＢａｍＨ
Ｉ ７ラグメントを含んでいるクローンｐＬ Ｇ■８１
を、ｐＧ Ｖ ０４２２の ｌＩＯ３遺伝子中のＳａｃ
ＩＩ−Ｂａｎ＋ＨＩ ７ラグメントと置換するのに
使用する二二の最終プロモーターベクターはｐＬＧＶ
２３８１と呼ばれる。 全ての組換えプラスミドはＥ、 ｃｏｌｉ株ＨＢ ｉ
ｏ １の形質転換により選択する。 この様に処理した＋１０８プロモータを含んで′ｖ）る
プラスミドベクターをＢａｎ＋１旧で消化し、Ｂａ＋ｌ
ｌＨＩ７ラグメントに含まれているｏｃｓの暗合配列を
このサイトに挿入する。このｏｃＳ暗号配列も、インビ
トロで処理し、第１９図に示した様に、Ｂａａ＋Ｈ１制
限エンドヌクレアーゼサイトで囲まれる様にする。オク
トピンＴｉプラスミドＢ６Ｓ３のＢａｒｎ１］Ｉ７ラグ
メン白７ａ １ Ｇ μｇ （’Ｄｅ Ｖｏｓら。 ＰＩａｓ＋１１ｉｄ ６（１９８１Ｌ２４９−２５３）
をＢａｒｎｌｌＮ；よびＳｍａｌで消化し、ｏｃｓ−暗
号配列を含む７ラグメントを１％ア〃ロースデルから分
離し、＋）ＢＲ，３２２の大きイＢａ＋ｎＨｆ Ｐｖ
ｕ Ｉ Ｉ ７ラグメントに結合させる；得られたプラ
スミド′、ｐＡＧ Ｖ ８２８ （２０μｇ）をＢａｍ
ＨＩで消化し、第１８図に示した様にエキソヌクレアー
ゼＢａ１３］で処理し、次いでＨｉｎｄ ＩＩＩで消化
し、末端を充填し、自己結合させる。Ｂａ１３１除去体
のサイズは６％ポリアクリルアミドゲル中で見積る。い
くつかの候補のヌクレオチド配列を決定し、５゛−非翻
訳リーダー配列の残り７１）ｌ）だけを持った候補を選
択して以下の操作にイ１す（＋）ＯＣＳ△）。ｏｃｓ配
列をＢａ＋ｎ１ｌＩサイトで囲むために、Ｃ１ａｌ−Ｒ
ｓａ１７ラグメントを充填し、１）ＬＣ２３６（Ｒｅ＋
＋＋ａｕＬら、Ｇｅｎｅｌ ５（１９８］）、８１−９
３）のＢａｌ Ｉサイトにサブクローンする。得られた
プラスミド１＋ＡＣｉ＼ｉ４０をＢａｎ＋１旧で消化し
、ｏｃｓ配列を持ったブラグメントをプレパラライブ１
％アガロースデルから電気溶出により分離し、予めＢａ
ｒｎＨＩで消化しＢＡＰ（細菌性アルカリホスファター
ゼ）で処理したｐＬＧＶ２３８１に結合させる。 ｏｃｓ配列のＩ）ＬＧＶ ２３８１への挿入により、両
方の配向のものが得られる（ｐＮＯ］および１）ＮＯ−
２）。 ｎｏｓ ： ｏｃｓ融合の正確な接合点を示すヌクレオ
チド配列を第２０図に示す。 更に、処理した１１０Ｓプロモーターを含有しているプ
ラスミドベクターは、酵素ジヒドロ７オレートレグクタ
ーゼを暗号化しているプラスミドＲｅｆ７か□らのＤＮ
’Ａを挿入するのに使用される。ジヒドロ７オレートレ
グクターゼ遺伝子を含んでいる暗号配列は、Ｂ’ａｍＨ
Ｉに含まれており （０’Ｈａｒｅ呟Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７８（ｆ’Ｊ８１
）、１５２７−１．５３１）、従って既述した様に、プ
ロモーター領域に隣接するＢａ＋ｎＨＩサイトを含んで
いる１１０Ｓプロモーターベクターに容易に挿入される
。この遺伝子は、発現されると抗生物質メ□ト）・レキ
セードに対する耐性を付与するので、選択可能なマーカ
ー遺伝子の１つの例である（第２．３，４．５および７
図参照）。この中間クローニングベクターが野生型７パ
リンアクセプタ＝′ロブラスミドを含んでいるＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋に摂動されると、単一乗換えが起
り、ハイブリッド′１゛１プラスミドベクターか得られ
る。このベクター組成物を、植物の感染に使用する。得
られた腫瘍組織は、（）、５μｇ／ｍ ｌのメトトレキ
セートの存在下で継続して生長し得ることがわかった。 ＯｅＳおよび上記のｌｌ０Ｓプロモーターの後のジヒド
ロ７オレートレダクターゼ暗号領域を含んでいる中間ク
ローニングベクターを組み立て、ノ＼Ｂｒｏ−ｂａｃｌ
ｅｒｉｕ＋ｎのＴｉ７リスミドと相互組込みした後、７ させることができるということが証明される。 謁例ｙ 染色体に挿入された所望の遺伝子を含む植物細
胞および植物の分離 本発明者らは、以下の３つの方法のいづれかを使って１
．非腫瘍性アクセプター′「ｉプラスミド誘導体（例え
ばｐｃ；ｖ３ｓｓｏ）で形質転換された植物細胞および
全植物を得た。 （１） インビボでの全植物の接種、次いで新芽の再生
が可能な培地上、インビトロでの培養、（２）損傷部位
で直接新芽の生成を促す他のＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉａ
株の存在下、インビボにおける全植物の相互感染、 （３）インビトロでの単一植物細胞プロトブラストの共
生培養。 これらの方法について以下に詳述する。 最初の方法は、クラウンガル組織が生産されることとな
る、全植物組織の野生型Ａ ｇｒｏｂａｃ Ｌｅｒ ｉ
１１１１１株による感染体を得る為に通常使用される
方法を改良したものである。μＧＶ３８５０は腫瘍を形
成しなイＡＢｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ誘導体であるので
、感染部位において腫瘍の増殖はみられない。しかし感
染した組織を取り除外、組織培養で増殖させると、形質
転換された組織を容易に得ることができる。 初期培養期間（単に組織の量を増やすため）の後、損傷
部位組織を新芽形成が可能な条件下で増殖させる。非形
質転換細胞およびｐＧＶ３８５０で形質転換した細胞の
両者が新芽を発生する。形質転換新芽は、ツバリンの存
在をみる簡単な分析により容易に区別することができる
。 本発明者らは、次のプロトコールに従って、Ｎ １ｃｏ
ｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３
８の頭部を切断したタバコの苗木か呟 ｐＧＶ３８５０
−形質転換カルスおよび新芽を得た（全ての操作はラミ
ナー７０−７−ド中、滅菌条件下で行なった）。 （１）小さなびん（直径１０ｃＩｏ、高さ１４）ｃ＋ｎ
）の中で、０．８％の寒天を含む固形のＭｕｒａｓｈｉ
Ｈｅ ＆Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地（Ｍｕｒａｓｂｉ８ｅ
および５ｋｏｏ８゜ＰＩ＋ｙｓｉｏ１．’ＰｌａｎＬ、
、１５（１９Ｇ２）、 ４７．３−４９７）で生育させ
た６周令のタバコの苗木を使用する。 （２）外科用メスで最も若い頭頂の葉奮切り取って捨て
る （３）選択的条件（例えばゴミプラスミドｐＧｖ３ Ｆ
＋ ５０を含んでいるす７７ンピシン耐性、アンピシリ
ン耐性ＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋ｎ株の場合は、１０
０Ｍｇ／ｍ１のり７７ンピシンと１００ μｇ／＋ｎｌ
のカルベニシリンを含んでいる’）’ Ｅ Ｂ培地を使
用する；ＹＥＢ培地”５ｇ／ＲＢａｃＬｏビーフェキス
、１ｇ／Ｉ Ｂａｃｔｏ酵ｌｘキス、５ ｇ／ １
ヘプトン、５ｇ／ｌシュクロース、２ Ｘ 】０−３Ｍ
ＭｇＳ ０４−１）Ｈ７，２，１５ｇ／ｌ寒天）で増
殖させた新鮮な平板培養からのＡＢｒｏｂａｃＬｅｒｉ
ｕｕ＋を、スパーチルまたはつまようじで損傷表面に接
種する。各１）（ハフ３８５０組み立て物を、少なくと
も８本の苗木に接種する。 （４）２週間インキュベートする。接種部位にほとんど
あるいは全く反応が表われないはずであるが、時々非常
に小さいカルス（ｃａｌｌｉ）か観察される。 （５）
損傷表面から１１６１１１より薄い切片を切り取る。損
傷表面を、オーキシンおよびサイトキニン（ＩＩＩＩｇ
／夕ＮＡＡ、０．２１＋＋Ｂ／ρ ＢＡＰ）および１％
シュクロースを添加したＬｉｎ５＋ｎａｉｅｒ ＆ Ｓ
ｏｏｇ （ＬＳ）寒天培地（Ｌｉｎｓｔｎａｉｅｒ ａｎｄ ５
ｋｏｏＨ，ＰＩ＋ｙｓｉｏｌ。 Ｐｌａｎｔ、、 １８（１９６５）、１００−１２７
）を含む（６）約６週問後、カルスはその一部をとって
ツバリンの存在を試験するのに十分なだけの火トさにな
る（少なくとも直径が約５＋ｎｍになる）。全ての損傷
カルスが７パリンを生産する訳ではない。・１本の植物
の内約１本がツバリン陽性損傷カルスをつくる。 （７）７パリン陽性カルスを再生培地を含む寒天平板に
移す二上記のＬＳ培地＋１％シュクロースおよびｌ ｍ
Ｉｉ／ （ＨＢ Ａ Ｐサイトキこン（８）約・１・−
〇週間後に良好なサイズの新芽（高さ１ｃｂ＋）が出る
。更に成長させ、根を形成させるために、この新芽を、
ホルモンを含まないｌ Ｓ ｋ、ｒ’。 地＋１％シュクロースを含有している新しい：す；入３
１Ｌ板に移＃−０ （９） ツバリンの存在を試験するのに、その−・部＜
＋＝２枚の小さな葉）を切り取れる様に、この新芽を１
・〜２週間成長させる。 （１０） ツバリン陽性の新月を、（１）と同じＭＳ
培地を入れたやや大きい容器（上記と同じＮ）ｃｍのび
ん）に移し、更に成長させる。 注）感染させた組織のための全ての植物培養培ａｘｉｍ
ｅ、 Ｃ１ａｆｏｒａｎ Ｉ＜、ヘキスト） ５ （’
、１０ ｕ ｇ／Ｉｌｌ １が含まれている。この薬物
は、全てのＡｇｒｏｌＪａｃｆ、ｅｒｉｏｌｌｌ（カル
ベニシリン耐性のものを含む）の生長をよく阻止する。 本発明者らの研究室で、形質転換された新芽を出す組織
を得る別の方法が開発された。この方法は、ＡＢｒｏｂ
ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎのある種のミュータアトＴｉプラス
ミド株が、新芽を出すクラウンガル腫脹を生成させると
いうことを観察したことに基いて開発された。この様な
新芽−誘起（ｓｌ＋ｉ）ミュータン１゛は、Ａ、ｔｕ＋
＋＋ｅｆａｃｉｅｎｓの′１１１プラスミドのＴ −Ｄ
ＮＡ（転移Ｄ Ｎ Ａセグメント）の特定の領域に位置
している（ＬｅｅＴｏａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１９
Ｅ＋２）。 １４’７−］ ５２； Ｊｏｏｓら、 Ｃｅ１ｌ
３２（１９８３）。 １０５Ｖ＝１０６７’）。誘起された新芽は完全にｊＥ
常な非形質松換細胞で構成されていることが多い。従っ
て本発明者らは、２つの異なったＡｇｒｏ−ｌ〕ａｃ１
．ｃｒｉａ、即ち１つはオクトピン′１゛ｉプラスミド
放出（ｓｂｏｏｌ、ｅｒ）ミュータントを持ったもの、
もう１つは１１（：＼・”；（Ｔ３５０を持ったもの、
の混合物でｊ＋１１＊を接種した。この様にすることは
、オクトピン放出ミューテーショ□ンが、（ＩＧ Ｖ
３８５ （、’）で形質転換された根を誘起することが
出来るよい成分である。Ｔ１プラスミドｐに〜“３８５
１）およびオクトピン新芽誘起Ｔ１プラスミドを５：１
の割合で含んでいるＡｇｒｏｂａｃｌｅｒｉ＋ｏｎを植
物に接種した。こうｔ ７）こトニより１）に＼“３８
５０−形質転換新芽を１（１−た。この新芽は、ツバリ
ンの存在について分析することにより、容易に選別する
ことができる。 この方法は、精功な組織培養法を必要としない、。 ツバリン陽性新芽・を、更に成長させるための成長調節
ホルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含んだ培地に移す。 新芽が十分な大きさに達した後、容易に繁殖の為の土壌
に移すことができる。この共感染法は、簡単に組織培養
しにくい種類の植物を形質転換するのに特に有用である
。従って、あらゆる範囲の農学的にあるいは経済的に重
要な植物、例えば豆科植物、薬用植物および装飾植物を
Ａ８ｒｏｌ）ａＣ’ｔｅｒ’ｉ’ｕ＋ｎで処置すること
か゛で）よう。 第３の方法は、Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔ、ａｂａｃ
ｕ＋ｎプロトプラストの単離およびホルモン−非依存性
のｉ” −Ｉ）との共培養後に実施し得るものである。 池の優勢な選択マーカー、例えば高等植物細胞で発現さ
れを使用することかできる。しカルこの場合は、それぞ
れのケースについて選択の条件を最善にするまたは細胞
コロニーの濃度など）。形質転換細胞を選択できない場
合、例えば１）に＼’ ３ 乏ｉ ５１ＪホたはｐＧ
Ｖ ２２１７ （Ｌｅｅｎ＋ａｎｓら、Ｉ−ＪＩＩＢＯ
Ｊ、 １（１９８２）、］４７ １５２）の様な非毒
性のＴ−ＤＮＡミュータントを用いたために選択できな
い場合、遺伝学的形質転換の後に細胞をオーキシン−お
よびサイトキニン−含有培地（例えば２１１１ｇ７’ｐ
のＮＡＡ（Ｑ−ナフタレン酢酸）および０．３ｍＢ１
、Ｑ （１）カイネチンを含むＭ ｕｒａｓｌ＋ ｉｇ
ｅおよびＳ ｋｏｏＢ培地（Ｍｕｒａｓｂ晴ｅおよび５
ｋｏｏ８． Ｆ’ｌ＋ｙｓｉｏ１． Ｉ”１ａｎｋ
１５（］！Ｊ ｂ ２）、４”７３−４’；）°７）
）で培養し、形質転換コロニーをそのオパイン（０＋山
＋ｅ）含有量で同定することがでｂる。この様にして、
アグロピン（ａＨ＋・０１＋ｉｎ’ｅ）および７ノピン
（＋ｏａｎｎｏｐｉ＋ｉｅ）合成の電気泳動外４ｆ（方
法にツいてはＬｅｅｒｎａｎｓら、 、Ｊ 、ｈ’ｉｏ
１． Ａ１＋１＋ｌ。 （’１ｅｎｅ１．． ．１（］ ９８１）ｔ ｊ ４
９−］ ６４参照）の後、約６６０コσニーが、１）Ｃ
；＼’２２１７で感染後にｊｌられ、Ｔ Ｒ−＋＋９号
化オパイン・マノピン（Ｎ”−（］−マニチル）−グル
タミン）を合成するＮ １ｃｏＬｉａｎａ Ｌａｂａ
ｃｕ＋ｎ Ｓ Ｒ１セルラインであることがわかった
。このセルラインのカルス切片を内生培地（唯一の植物
成長調節剤として１３Ａｆ’ （６と、故多くの新芽か
形成した。分析した２ｏの新芽の全てか、依然としてマ
ノピンを合成することかできた。ホルモンを含まなイＭ
ｕｒａｓｂｉｇｅ ａｎｄＳ ｋｏｏｇ培地に移した後
、これらの新芽は、依然としてマノピンを含有している
形態学的に正常なタストの分離および形質転換法は、Ｎ
、１＋Ｉｕ＋ｎｂａ８ｉｎｉ−ｆｏｌ ｉａにも用いる
ことができる。 ２、実験手法 ２．１．新芽培養条件 培養室内の滅菌条件下（１Ｆ１１６時間、Ｉ ５ （’
、１０ルツクスの白色蛍光（“ＡＣＢＣＬＰ” ５８
Ｗ／２４３ （１０°Ｋ Ｅｃｏｎｏｍｙ”）、２４
℃、相対湿度７（）％）、２５１）Ｊのガラスびんに入
れたホルモン不含のＭｕｒａｓｌ＋ｉＢｅ ａｎｄ ５
ｋｏｏＢ培地（Ｍｕｒａｓｌ＋ｉ６ｅおよびＳｋｏｏｇ
＋Ｐｂｙｓｉｏ１．Ｐｌａｎｔ、 １５（］ ！Ｊ
６２ ）。 ４７３−４９７）Ｊ−でＮ １ｃｏ１．１ａｎａ １
．ａｂａｃｕｍの新芽培養を維持する。５調合の新芽培
養をプロトプラストの分離に使用する。 ２．２．プロトプラストの分離 プロトプラストの分離および培養における全ての１．程
は無菌操作で行なう。混合酵素法によりプロトプラスト
を分Ｓする。ンｅｌｌｌより小さい非常に若い葉を除く
全ての葉をプロ［プラストの分＃ｉ１１に使用すること
ができる。鋭利な外斜用のメスで、葉を幅約２−３ ｍ
ｈＩｌの細長い小片に切断する。この葉材１２ □−３
ｇを、酵素混合物５１） ｍ 、（’、中、かぎまぜる
ことなく、ｕｉ所°で、２４°Ｃにて１８時時間インキ
ュベートする。この酵素混合物は、ホルモン不含のに３
培地中、０．５％セルラーゼＯｎｏｚｕｋａ Ｒ−１
０および（）、２％マセロザイムＯｎｏｚｕｋａ Ｒ−
１（）からなっている（ＮａｇｙおよびＭａｌｉＢａ、
Ｚ、。 Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｌ＋ｙｓｉｏｌ、 ７８（１９’
７ Ｇ）ｔ −４５３−／＋５５）。この混合物は、０
．２２μＩＩＩ細孔膜を通してシ濾過滅菌し、顕著な活
性の低下をきたすことなく、−２０°Ｃで少くとも６力
月間貯ｉ＆することかでとる。 ２．３．プロトプラスト培養 １；；時間インキュベートした後、プロトプラストを放
出するために混合物を穏やかにかぎまぜる。 次いでこの混合物を５（）μｍ１１のふるいを通してシ
濾過し、ｐ液を］ ｌ’） ｕ＋ ／’の遠心管に移す
。振動バケツローターに入れて６０・−〇 （、’）
Ｂで６分間遠心分離すると、プロトプラストか゛１后緑
色の浮遊バンド（帯）を形成する。プロトプラストの下
層の液およびペレット状の残骸を、輸動ポンプに連結し
た毛細管を使って取り除く。プロトプラストを１つの遠
心管に集め、培養培地で２回洗浄する。この培養培地は
、Ｎ Ａ Ａ （１） 、 ］ ｍｇ７θ）およびカイ
ネチン（０，２＋ｎｇ、旬を成長調節剤として含７ａす
るに３培地である（Ｎａ８ｙおよびＭａｌｉｇａ、 Ｚ
、 Ｆ’ｒｌａ＋＋ｚｅｎ−ｐｌ＋ｙｓｉｏ１．７ ｉ
３（］ ９°７６）、 ４５３−／１５５）。この培地
はｐＨ５，６に調節し、０．２２μＩ１１の濾過膜を通
して滅菌する。２回目の洗浄の後、ｉ’ ｈｏ＋ｔ＋ａ
ｌｆｌ１球計算器（”Ａｓ５ｉｓＬａｎｔ”＋ Ｆ、
Ｒ，Ｇ、がら人′Ｆ−）を用いてプロトプラストを８１
測し、最外密度１１）５プロトプラスト１ＩｎＣとなる
様に培養培地に懸濁する。直径９ｃ＋＋＋の組織培養用
良質ペトリ皿当たりＨ，ｌＪの容量で゛プロトプラスト
を培養する。このペトリ皿をＦ’ｒｈｒａｆ ｉ Ｌｍ
Ｒでシールし、２パ１℃で、１１１“ｉ所次いでがすが
な光（５（’、１ （’３〜１０ ｏ ｏルックス）を
当てて２４時間インキュベートする。 ２ 、 ＝１．共生培養による形質転換分離５１」後に
プロトプラスト培養株を感染させる。ノ＼８ｒｏｂａｃ
Ｌｅｒｉｃｕｎ培養株を液体ＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ。 １’：ｘｐｅｒｉ＋＋＋ ｅｕＬ＊ ｉｎ Ｍ
ｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｇｅ＋＋ Ｑｔｉｃｓ（１９
’７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓｌ）ｒｉｎｇＨａｒｌ〕ｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。 Ｎｅｕ Ｙｏｒｋ）中で１８時開発Ｈさせ、２Ｘ］ｆ
＋”細胞７ｍ（′の密度となる様にに３ｍ首培地に山ｊ
５１濁する３、この懸濁液５０μＣを植物プロ）・プラ
ストｋｉ’ｒＵ組こ加え、Ｐａｒａｆ山誹でシールした
後・この培養株を２．３．と同し条件Ｆでインキュベー
トする。・１８時間後に培養株を１０ ＋ｎ ｆ４の遠
心管に移し、振動バケ′加−夕−に入れ、６０〜８（）
８で６分間遠心分８１［する。浮遊バンドおよびペレッ
トを東め、抗生物質（カルベニシリンＪ １．＋ ＋１
１１μ３ ／Ｉｌ＋ 、／’またはセ７才タキシム５０
０μｇ／’ｍ 、（’、 ）を補足したに３１ｊｊ地（
１’Ｊａ８ｙおよびＭａｌｉｇａ、 ７．、 Ｐｆｌａ
ｎｚｃｎ−ｐＨｙｓｉｏｌ、 ’７ ８ （１’：〕
７６ ）、 、１５’３−．１５５）Ｎ、１ｍ Ｃ’
にｉｔｉ懸濁する。 ２週間インキュベートした後、プロトプラスト−誘導マ
イクロカルスを遠心分離し、前記と同様の成長調節剤濃
度および抗生物質濃度で゛あるがシュクロー−又は（，
１、４Ｍの代りに（１，３Ｎ、’ｌで゛あるＫ ３培地
（Ｎａ８ｙおよびへ４ａｌｉ８ａ、 Ｚ、 Ｉ’ｆ
ｌａｎｚｅｎｌ＋ｌ＋ｙｓｉ。 １、’７８（１９７Ｇ）、４５３ 、ｉ、５５＞１こ
山）４濁１ンキユベートした後カルスを、前記と同じ抗
生物質濃度であるが、減少させた濃度のンユクロース（
ｏ、２Ｍ）と成長ｎ！Ｊ Ｉｊ剤（Ｎ八人□ 、 （、
ｌ ］ １ｌｌｉ；／（’、カイネチンＯ、（’ｌ ２
ｍＢ；’ ｆ’ ）を含むＫ ３培地に移す。 ２〜３週間のインキュベージクンの後、形質転換体と推
定されるらのは、その淡緑色の密な外観および、より良
好な成長度から認識することがで終る。これらのコロニ
ーを、 、−ヶ 、；″ −ｔ−、減少させた濃度の抗
生物質（カルベニシリン５００μｇ／−またはセフオタ
キシム２５（）μ８／１１Ｉで）を含むホルモン不含の
ぜ■粟訂秤＝■十母旧停曜藩中４ （Ｌ ｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ＋ 円＋ｙｓ
ｉｏｌ。 Ｐｌａｎｔ、 ］ ８（］ ９６５）、 １１’、ｌ
Ｏ−１２７）に移ｔｏ形質転換体と推定されるものが
直径約３−５１１１１＋１１に達した時、ホルモン不含
の培地で生育しているそれらにオパイン試験を施すこと
がでトる。各コロニーの半分を、オクトピンおよびツバ
リン（Ａｅ ｒ １． ｓら汀’Ｉａｎ１． Ｓｃ’
ｉ、” ＬｅＬＬ、 ］°７（１’、） ７９）。 ４３−５ ＋’、１ ）またはアゲａピンおよびマノピ
ン（１験により、ホルモン不含の培地で選択された形質
転換された性質のコロニーを確認することかでトる。そ
の後、選択されたコロニーを抗生物質不含の培地で培養
することがでとる。 生培養 形質転換細胞のｌ）の選択かでトない（例えば無期性Ｔ
”ＤＮＡミュータントを使つなため）場合、またはそれ
が必要でない場合（抗生物質耐性遺伝ｒ−の様な優勢な
選択し得るマーカーがｉ” −Ｄ Ｎ Ａに存在してい
る為）、プロトプラスト−誘導細胞の処理を簡略化する
ことができる（ホルモン減少工程はもはや必要でない）
。感染段階まで、プロトプラストを既述した様に処理す
る。細菌を加えて４８時間後にプロトプラスト−誘導細
胞を遠心分離しく６分、６０６０−８Ｏ、非常に低密度
で細胞の成長を維持することがでとるＡ Ｃ＋培地（Ｃ
ａｌｒｏｃｌ＋ｅ。 ＰｌａｎＬａ ｊ４９（］ ９８０）、７−］ ８）
に−ＩＩＱ、ｊ％濁する。Ｆ ｕｃｌ＋ｓ−Ｒｏｓｅｎ
Ｌｌ＋ａｌ計数チェインハ’ （＋１Ａｓｓｉｓｔａ
ｎｔ”＋ Ｆ、Ｒ，Ｇ、より人手）を使って計測し、以
下の操作に必要な密度になる様にｉｌｉ 懸濁する。オ
パイン試験のためにコロニーを個々に操作しなければな
らない場合は、低細胞密度←］＋ｎρ当たり１００プロ
トプラスト−誘導細胞および細胞コロ＝−）で植えつ（
すると、１力月のインキュベーションで大きい細胞コロ
ニーが得られる。形質転換細胞を薬物で選択で外る場合
は、細胞を高密度（１０３−１０４７＋ｎｌ！、 ）で
インキュベーＩ・し、各タイプの選択に最適となる時期
に、そして濃度で、その使用する選択剤を培地に添加す
る。 ２．６．カルス組織から全植物の再生 カルス糾織から正常植物を容易に得ることができる（例
えばプロドプラ又ト形質転換か呟または全植物接種から
（２，７参照）誘導する）。カルス糾織を、ｌ １ｌｌ
ｉ； ７’ｌｌｌ ＣのＢ Ａ Ｌ’を含んでいるＮ４
ｕｒａｓｈｉ８ｅａｎｄ ５ｋｏｏＢ培地で増殖させ
る二二の培地は１〜２力月後に新芽を形成させる。この
新芽をホルモン不含の培地に移し、根を形成させ、完全
な１１１物を−バらぜることかで外る。 ２ 、 ’７ 、タバコｉＷ木への腫瘍の誘導タバコの
種ｒ（例えば栽培品種Ｗ １ｓｃｏｎｓｉＩ＋ ：（
ｉｉ）の表面を７（）％変性エタノール／ＩＬ（、）て
′２分間、次いで１（）％の市販の標白剤と０．１％ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で゛処理して滅菌し、
更にｌ＆菌水で・５回洗浄する。この滅菌した種γ−を
、＃モむ大型試験管（幅２５ ＋ｎ＋ｎ）にまく。次い
でこの試験管を培養室（＋ ２ 、’＋１ ＋１ ＋、
１ルックス、１６時間照射／′；；時間非照射１．’７
０％相対湿度、２４°Ｃ）に入れてインキュベートする
。４〜６週間経つと植物は使用できる状態になる。少な
くともその後１カ月間は最適の状態を維持する。苗木は
少なくとも高さ３ｃ＋ｎになり、４枚またはそれ以上の
葉を持つはずである。新しい外科用メスで植物の最も若
い面間を通して横に頭部を切断針る。植物の上の部分を
５試験管から取り除と、火にかけたスパーチルで′平板
寒天培養から細菌を損傷表面に塗抹する。 野生をの場合は２週間後に、ある種の変性ミュータント
株の場合はちっと後に腫脹が現れる。、−の方法は＼タ
バコ（Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ １．ａｌ＋ａｃｕ＋ｎ
）、Ｎ１ｃｏ−１，１ａｎａ ｐｌｕ＋ｎｂａＢｉｎ
ｉｆｏｌｉａおよびＰｅ１．ｕｎｉａ ｂｙｂｒｉｄ
ａを接種するのに使われる。 以」二述べた如く、本発明はまず、野生型′１゛；プラ
スミド′のＴ−領域の腫瘍機能が欠落しているノ１イブ
リッド′ｌ゛１プラスミドを保持している１Ｘ８ｒｏ−
ｌ＋ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎで、植物を形質転換することを
可能ならしめたものである。′Ｆ１プラスミドから植物
細胞へのＤＮＡの転移に及ぼす′ｌ゛−領域の腫瘍（戊
能の影響は知られていないので゛、それで゛も石ケ所望
の遺伝子を含んでいる改良１゛−領域の植物細胞への転
移か起ることは驚くべきことである。この転移１’）
Ｎ Ａは植物細胞ゲノムに相互組込みされ、安定に保持
される。更に、選択した１１′ｉ望の遺伝子は、その遺
伝ｊ′−か適当なプロモーター配列を含んでいるか、あ
るいは含む様に組み立てられると発現することが゛でと
る。所望の遺伝子を含んで゛いる申開り０−ニングベク
ターと、特別に設計されたアクセプター１゛１プラスミ
ドとの間で単−乗換えを行わせるという本発明の思想は
、植物細胞の形質転換の為のハイブリッド゛ｌ゛ｉプラ
スミドベクターの糺み立てを著しく簡単なものにするも
のである。 この特別に設計されたアクセプター１゛１プラスミドは
、所望の遺伝子（これは中間クローニングベクターの一
部と同じであるがまたはこれに関連しているクローニン
グ媒体中に挿入されている）が！ｉｔ −乗換えによっ
て相互組込み体を形成することがで終る様に、通常のク
ローニング媒体の１：） ＮＡ上セグメント含んでいる
。このクローニング媒体の２つのセグメントが、組換え
の為に必要な相同領域を提供する。 本発明方法によって調製された微生物、中間クローニン
グベクター、アクセプター１゛１プラスミド、およびハ
イブリッドプラスミドベクターは、１９８３年１２月２
１比（ｌ ｅ ｒ ｌ＋、ａｎ Ｃｏｔ １ｐｃ１．
ｉｏｎｏｒＭｉｃｒｏｏｒＨａｎｉｓ＋ｎｓ（１）ＳＭ
）（（、ｉｏ（＋１．Ｉ団Ｈ；ｃｎ：ｌに寄託され、確
認された以Ｆの培養株で例示される：（１）Ｅｓｃｌ＋
ｅｒｉｃｂｉａ ｃｏｌｉ Ｋ Ｉ ２ ＩＩ Ｈ］
ｔｌ ］ ｒｌの中間ベクタープラスミドｐＡｅＲ１
３１（２）カルベニシリン耐性アクセプター′ロブラス
ミドｐｃｉ Ｖ ３８５ （，１を保有しているＡｐ、
ｒｏｂａｃｌ、（・ｒｉｕｍ Ｌｕ＋ｎｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｃ５＜’ｒ ＣＩ リファンピシン耐性株、 （３）Ｅ、’５ｃｂｔ・ｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ
Ｋ ］ ２株に５］４（１、Ｉ＋ｒ ｌｅｕ ｔｂ
ｉ ｌａｃ ｌ１ｓｄＲ）中の申開ベクタープラス
ミド１】（：＼’ ７ Ｃ１１１、（４）Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ Ｋ］２株に５１４（（３）
と同じ）中の中間ベクタープラスミド１）（ハ゛７５０
、 （５）カルベニシリン耐性アクセプター１゛１プラスミ
ド’１）ＧＶ ２２６ （，１を保有しているＡｇｒｏ
ｌ＋ａｃｔｅｒ１ｔｕｎ １．ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
Ｃ５ｉ３ Ｃ］ リファンピシン耐性株、 （６）Ｅｓｃｂｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１
２ ＨＢＩＩ）１中の、７パリンプロモーター支配
下のオクトビンシンターゼ暗号領域を保有している中間
ベクタープラスミドｐＮｏ−１、 （’７）中間ベクターのＡＨｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍへ
の摂動に使用された株二摂動プラスミドｌｌＣＮ Ｊ
２８およびＲ（ｉ□Ｉｄｒｄｌｌ（〜’Ｉｌ＋！ 、
Ｈａｕｌ、ｅら、ＥＭＢＣ） Ｊ。 ２（］ ９ ｊｉ ：Ｅ ）、 ｌｌ ］ に４１８
）を保有しているＧ、Ｊ２３； ＧＪ２３はＥｓｃｌ＋
ｅｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ Ｋ ］２、、）（１
２’：）２Ｇ、ＡＢＩ １５７のｒｅｃ、Ａ誘導１本で
ある（／１ｌｏｕ＋ａｒｄ −Ｆ １ａｎｄｅｒｓ呟Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ４．９（１９Ｇ４）、２３°７−２
４６）。 これらの培養株の受理番号は、それぞれ２７１ノ２（１
）、２ ’７ ’、） Ｆｉ（２）、２’７９Ｇ（３）
、２゛１９”ｊ（・１）、２°７！Ｊ９（５）、２）り
３３（Ｇ）、および２°７’：） 、Ｅ （’７ ）で
ある。 本発明の態様を色々と記述したが、その基本的な構成を
変化させれば本発明に係る方法および組成物を利用する
その池の態様か得られることは言うまでもない。
失置換突然変異体（ミュータント）を含んでいる：即ち
、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント１９の内部のＳｍａ
Ｉフラグメント２４ （Ｄｅｌ〕１ｃｋｅｒら、ｌ？
ｌａ５ｍ１ｄ ３ （１９８０）； １９３−２１１
）は、Ｔｎ５のａ ｐ １．（アセチルホスホトランス
フェラーゼ）遺伝子を含んでいる１）ＫＣ？のＨｉｎｄ
ＩＩ ７ラグメント （Ｒａｏら、 Ｇｅｎｅ ７（
１９７９，７９−８２）で置換されている。この遺伝子
はアミノグリコシドネオマイシンおよびカナマイシンに
月する耐性を暗号化している。ｐＧＶ３８３９の゛１゛
−領域の制限地図を第１２図に示す。 プラスミドｐＡｃｇＢは、Ｔ −Ｄ Ｎ Ａの境界部だ
けを含んでいるｐＢＲ３２２中のＡｃｇＢの挿入体であ
る（第１１図参照）。この境界部はＴ −１’） Ｎ
Ａの末端部として定義され、これらの領域は、′Ｆ−Ｄ
Ｎ Ａの植物細胞デ７ムへの安定な組込みに役割を果
たす。このクローンの起源および分析については詳しく
記載されている（ Ｚ ａ＋ｏｂｒｙｓｋ ｉ 呟５ｃ
ｉｐｕｃｅ２０ ’、）（１９８０）、１３８５−１３
’月）。 このクローンは、形質転換されたタバコＤ Ｎ Ａ ｈ
・らＩ”−１） Ｎ Ａの部分を再分離することにより
得られた。ｐＡｃＢＩ３は、Ｔ −１）、Ｎ Ａの左右
の境界を含む様に縦列に並んだ２つのｒ’ −Ｄ Ｎ
Ａコピーめ接合点を含んでいる。更に、ｐＡｃｇＢは、
その遺伝情報が右側Ｔ−ＤＮＡ境界のすぐ近くに位置し
ているという理由で７パリンシンターゼ遺伝子を含んで
いる。このプラスミドｐＡｃｇＢは、「タイプＡ」アク
セプターＴｉ プラスミド、 ｌ］ＧＶ３８５０の組み
立てに使用される。第６図は関与する構造の概略を、第
１３図はｐＧＶ３８５０が得られることになる二重乗換
えに関与するＤＮＡ領域をより正確に示したものである
。 上記のプラスミドｐＡｃＢＢは、その＋＋ＢＲ３２２部
分にＣｏ１Ｅ１−特異ｂｏｒｏサイトを持っており、ヘ
ルパープラスミドＲ６４ｄｒｄｌｌおよび１）（ｘＪ２
８を使ってＥ、 ｃｏｌｉからＡ８ｒｏｂａｃｔ、ｅｒ
ｉｕ＋ｎへ摂動することができる。Ｅ、ｃｏｌｉに含ま
れているプラスミドＲ’６４ｄｒｄ １１およびｐｃ；
Ｊ ２８は、接合により、ｐＡｃｇＢを持ったＥ、
ｃｏｌｉ株に導入される。トランス接合体は、アンピシ
リン耐性（ｐＡｃｇＢのｌ］ＢＲ３２２配列から）、ス
トレプトマイシン耐性（Ｒ６４ｄｒｃｌ １１から）、
およびカナマイシン耐性（ｐＧＪ２８から）コロニーと
して選択される。 ；）つのプラスミドの全てを保持している ＩＥ。 ｃｏｌｉ株を、す７７ンピシン耐性て゛ありＴＩプラス
ミミドＧＶ ３８３９を含んでいるＡＨｒｏｌｉａｃＬ
ｅｒ’ｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１に接合させる。ツバリンＴｉ
プラスミドとの最初の単一乗換えを選択するのにｐＢＩ
λ３２２のアンピシリン耐性を利用する。アンピシリン
耐性をＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋ｏ中で安定させるこ
とができる唯一の方法は、Ｔ−領域境界近くの相同領域
の１つでｐＧＶ ３８３９と相同組換えにより乗換えを
することである。池の相同領域での２回目の乗換えによ
り、ａｐｔ遺伝子（カナマイシン耐性）を含んでいる１
＋Ｃｉ Ｖ ’３８３９のＴ−領域の中央部がクローン
ｐ Ａ ｃＢ ［３の＋＋Ｂ Ｒ３２２配列で置換され
る。従って、第２の組換え体はアンピシリン耐性、カナ
マイシン感受性である。第２の組換え体を分離する確率
を高めるために、最初の組換え体（ｐＡｃＢＢ：：ｐＧ
〜’３８３９）を保持しているり７アンピシリ耐性Ａｇ
ｒｏｌｚａｃｔｅｒｉｕｍを、Ｔｉプラスミドを持って
いない第２のタロラムフェニコール／エリスロマイシン
耐性Ａ ｇｒｏｂａｃ Ｌｅｒ ｉ ｕｒｎ株と接合さ
せる。この様にして、約６００コロニー中、１コロニー
の割合で、アンピシリン耐性、カナマイシン感受性のク
ロラムフェニコール／エリエロマイシン耐性Ａｇｒｏｂ
ａｃＬｅｒｉｕ＋ｏ ＩＩＣ； Ｖ ３８５ （ｌを得
ることができる。 勿論、９ＧＶ ３．ｉｊ ５１Ｊタイプの７クセプター
Ｔｉプラスミドを組み立てるのに使用することができる
その池のＴｉプラスミドもある。゛Ｉ′−領域の中央近
くに選択し得るマーカー遺伝子を持ったＴｉプラスミド
は全て受容体として使用で外る。更に、左境界７ラグメ
ン）−１）ＢＲ３２２−右境界７ラグメン韮の方向に、
左右の境界７ラグメントの中間にｐＢＲ配列が位置する
様に、ｐＢＲ３２２にＴ−領域境界フラグメントな挿入
することによってｐＡｃＢＢ様のプラスミドを組み立て
ることがでとる。例えば、ツバリンＴｉプラスミドの左
および右境界７ラグメントはそれぞれＨｉｎｄ ｌｌｌ
７ラグメント１０および２３である（ Ｄｅｌ＋１ｃ
ｋｅｒ呟ＰＩａｓｎ＋ｉｄ ３（１９８０）、 １９
３−２１４）。 ＠−，乗換えによって、ｐＢＲ３２２またはその誘導体
に挿入されている所望の遺伝子を含んだ中間クローニン
グベクターがｐＧ Ｖ、３８５０の改良されたＴ −Ｄ
Ｎ Ａ領域に導入される。唯一つ必要として使用する
為に、導入されるＤ Ｎ Ａか、既に１）ＢＲ３２２に
存在するものの池にもう１つの耐性マーカー遺伝子を含
んでいるということである。 この耐性マーカーは、ｐＢＲ配列内に含まれていてもよ
く （例えばｐＢＲ３２５のＣｈ、Ｒ１またはｐｌ（Ｃ
７のＫｍ ”） 、植物細胞内で試験される１）ＮＡ内
に含まれていてもよい。更に、アクセプター′旨プラス
ミド１）（ハ； ３ Ｕ ５ （ｌにおけるＡ−遺１云
子ｐｆ３ Ｒ３２２は、Ｋ＋ｏ”の様な別の耐性マーカ
ー遺伝子で置換してもよい。この様にして、Ａ１］Ｒで
あるｐＢＲ３２２含有中間クローニングベクターですら
、このｐＧＶ３８５０タイプのアクセプターＴｉプラス
ミドに直接摂動することかでとる。 １）ＧＶ ３８５０タイプの７クセプター゛ロブラス
ミドのもう１つの利点は、形質転換された植物細胞で腫
瘍をつくらないということである。１）（：Ｖ３８５０
の短かくなったＴ −Ｄ Ｎ ’ＡＡ領域、依然として
ツバリンシンターゼを暗号化している遺伝子を含んでい
るので、ｐＧＶ３８５１）で形質転換された細胞は、ツ
バリンか存在するかどうかを分析することにより、非形
質転換細胞から簡単に選り分けることができる。勿論、
アクセプターＴｉプラスミドＩＩｃ！ ’ｖ ３８５１
）に組込まれた中間クローニングベクターかマーカー遺
伝子を含んでいたら、それも直接スクリーニング、即ち
選別にかけることができる。 ＋＋ＢＲ３２２配列を含んだ上記の中間クローニングベ
クターの単一乗換えによるアクセプターＴｉプラスミド
への挿入のほか、このアクセプター１１プラスミドは、
［ショットガンｊタイプの実験に於いて、ｐＢＲ３２２
またはその誘導体中のクローンされたり、ＮＡバンクの
受容体としても使用することができる。Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕ＋ａ中の全てのハイブリッドプラスミドベク
ターは、植物細胞の感染に使用することかでき、次いで
所望の選択可能な遺ｆＦ、 Ｆｆ群）の発現についてス
クリーニングされる。 例えば、選ばれたアミノ酸力吹乏している植物細胞に全
バンクを適用する、二とにより、アミノ酸合成を暗号化
している遺伝子について市単に選別することかで外る。 アクセプター１１プラスミドＩＩＧＶ ３８５１）は、
２つの表現型の特徴を持っている：即ち、（ｉ）腫瘍生
成能力がないこと、および（ｉｉ）もビ「−ＤＮノ＼が
植物細胞ゲノム内に転移したら、ツバリン合成能を有す
ること、である。ｐにＶ ３ ｕ ’、） ０含有ＡＢ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋で感染させた各種の植物組織の
、これらの特徴を調べるために、種々の実験を行なりた
。 ａ）ポテトおよびニンノンディスクを用いた試験 ポテトおよびニンジンの切片にアクセプターＴｉプラス
ミドｐに Ｖ ３ ｊｉ ５ （ｌを接種すると、少量
の硬結組織が生成する。この組織に７パリンが存在する
かどうかを試験した所、陽性であることがわかった。こ
の突然変異体が少量の硬結組織を生産し得ることは興味
あることである。しｈ化、それは、これらのディスクを
低濃度のオーキシンおよびサイトキニンの両者を含んで
（する培地で生Ｗさせた時だけ得られる。 ｂ）全植物をアクセプター′ｌ゛１ブラ又ミドｌ］Ｇ後
に少量の組織成長か観察されただけである（通常、２週
間後に１゛野生型］腫瘍が検出される）。この組織はホ
ルモンを含まない培地では生ｆ７Ｌ鱈）できる。この組
織も／バリン陽性であることがわかった。 Ｃ）さらに、ｐＧＶ ３８５０（形質転換」細胞は腫瘍
性ではないので、これらの細胞は、転移したＤＮＡセグ
メントをそのゲノムに依然として保１￥している正常な
植物に再生することかできる。この形質（換細胞を通常
の再生培地（実施例！；を参照）で培養すると、止常稙
物が得られよう。 ｐＧＶ３８５０の、アクセプタープラスミドとしての有
用性を証明する為に、以下の実験を行なった。ｐＢＲ３
２５中にオクトピンＴ −１） Ｎ Ａの腫瘍機能を含
んでいる中間クローニングベクターをｐＧＶ ３８５０
を保持しているＡＢｒｏｌ〕ａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋に組
み込んだ。単一乗換えによって得られたＡｇｒｏ−ｂａ
ｃ １．ｅｒ ｉ ｕｎ＋中のハイブリッド′［ｉプラ
スミドを、傷つけたタバコ植物に接種した。２週間後に
腫瘍組織があられれた。このことは、腫瘍誘導１） Ｎ
ＡがｐＧＶ３８５０に再導入され、形質転換植物細胞
中で適切に発現されたことを示している。 ’Ｊｌ＆ｆＨ２中間クローニングベクター１】（：＼“
７００ ｂよＩ／ １＋ＧＶ ’７５０（７）組み立て
この組み立ての概略を第１４図に模式的に示した。オク
トピンｉ’ ｉプラスミド１３６ Ｓ、 ３のＴＬ−ｒ
、） Ｎ Ａの右側部分であり、ｐＧ Ｖ ０２０１
（１）ｅＶｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ ６（］ ９８１）
、２４９−２５３）中に存在するＨｉｎｄ ＩＩＩ フ
ラグメン１． ］を、まず、広範囲宿主性ベクターｐＧ
Ｖ １１２２ （Ｌｅｅｍａｏｓら、Ｇｅｎｅ １９
（１９８’２）、 ３６１−３６４）のＨｉ’ｎｄｌ
ｌｌサイトに挿入する。組換えプラスミドＨ）ＧＶ ０
２ （１１ハ、多ニア ヒーヘ９９− ｐＢＲ３２２（
Ｂｏｌｉｖａｒら、 Ｇｅｎｅ ２（１９°７７
）、 ９５−１１３）の特異なＨｉｎｄｌｌｌサイト
に挿入されたトｆｉｎｄ ＩＩＩフラグメント１を含ん
で′いる。１）（ハ′０２０１およびｐＧＶ］ １２２
ＤＮＡは、Ｂ ｅ ｔ、 ｌ −ａｃｈらが記載してい
る方法で調製される（ Ｆ ｅｄ。 Ｐｒｏｃ、３５（］ ９７６）＋ ２０３７−２０４
’３）。 最終Ｎ２０μで中、１）（（＼’０２Ｃ）Ｉｔ）ＮＡ
２μｇを、Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ ２単位（全ての制限酵
素はＢｏｅｈ−ｒｉｎＢｅｒ Ｍａｎｎｌ＋ｅｉ＋ｎか
ら購入した）を用いて、３°７℃で１時間完全に消化し
た。インキュベーション緩衝液はＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ
らにより記載されている（Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎ
ｅＬ １７９（１９８（’、１）、４２ ］ −４３５
）。同シ条件下テ＋１にＶ １１２２ ＤＮＡ ２μｇ
をＨｉｎｄ ＩＩＩで完全に消化した。 最終量２０μｐ中、Ｔ４す〃−ゼ（Ｂ ｏｅｌ＋ｒ ｉ
ｎ８ｅｒＭａ＋＋ｎｌ＋ｅｉ＋ｌｌ） ０ 、０２単
位を用い、０．１μｇの１−１ｉｎｄｌｌｌ消化ｐＧＶ
Ｏ２０１をＨｉｎｄ Ｉｌｌ消化ｐＧＶ １１２２とラ
イプ−ジョン（結紮ルた。インキュベージタン緩衝Ｗ１
．および条件は、製造業者の指示に従った（ Ｂ ｒｏ
ｃｌｉｕｒｅ″Ｔ４す〃−ゼ゛、ＢＯｅｌ＋ｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｌ＋ｅｉ＋ｎ＋ １９８０年８月、＃１
０゜Ｍ、８８ｔ）、４８６ ）。ライゲーション混合物
の−＋ コンピテントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ Ｓ ］ ４１＋ｓｒ
ｌ＋ｓ＋ｎ 細胞（Ｃｏｌｓｏｎら、ＧｅｎｅＬ
ｉｃｓ５２（１９６５Ｌ １０４３１ （’、１５１．
１ ）への導入（形質転換）は、Ｄａ８ｃｒｔおよびＥ
Ｍｉｃｌ＋の方法（Ｇｅｎｅ ６（］ ９８１，１）、
２３−２８）に従って行なった。細胞を、ストレプトマ
イシン（２（）μｇ／＋ｏｌ）およびスペクチノマイシ
ン（５０μｇ／Ｉｌ＋ｌ）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌ
ｌｅｒ。 Ｅｘｐｃｒｉ＋ｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃ；ｅｎｅＬｉｃｓ （１’ｊ ７２）＋
Ｃｏ１ｄ Ｓ１＋ｒｉｎＢ１１ａｒｌ）ｏｒ Ｌａｌ＋
ｏｒａＬｏｒｙ、 Ｎｅｕ＋Ｙｏｒｋ）に塗抹した。組
換えプラスミド゛を含有している形質転換体を、テトラ
サイクリン耐性をｎｉ号化している遺伝子への挿入によ
るその不活性化（Ｌｅｅ＋ｏａｎｓ呟Ｇｅｎｅ １９（
１９８−２）、 ３６１−３６４）に基づき、テトラサ
イクリン感受性（１０μｇ／＋ｎｌ）でスクリーニング
（選り分はルだ。ストレプトマイシンおよびスペクチ７
マイシンに耐性を示し、テトラサイクリンに感受性を有
するクローンを物理的に同定した。マイクロスケールの
ＤＮＡ調製はＫｌｅｉｎらの方法（Ｆ’ ｌａｓｍｉｄ
３ （１９８０）、８８−９１＞に従って実施した。 １）に＼・“１１２２のＨｉｎｄ ＩＩＩサイト中の
ｔｌｉｎｄ Ｉｌｌ ７ラグメント１の配向は、Ｓａｌ
Ｉ消化によって決定した。組換えプラスミドを消化し
く０ ’ Ｐ ａｒｒｅｌ Ｉ らの条件、Ｍｏｌ、
Ｃ酬ｅｎ、 ＧｅｎｅＬ、 １ ７９（１９８０
）、 ４２１−４３５）、アガロースゲル電気泳動に
かけると２個の７ラグメントが得られた。α−配向には
０．７７ｋｂおよび２２．７６ｋｌ）の７ラグメント、
β−配向には、１（１，３３ｋｌ〕および１３．２＋ｌ
ｋ＋３の７ラグメントがあった。α−配向の紐換えプラ
スミドをその後のクローニングに使用し、これを１）に
＼・“１１６８と名付けた。 Ｔ Ｌ −Ｄ Ｎ Ａの左側部分（左の境界配列を含ん
でいる）を含有しているＢｇｌ Ｊｌ−８ａｌ Ｉ ７
ラグメントを１３８１ ｌｌ−３ａｌ ｌで開裂したｐ
ＧＶ’１ｌＧ８に尋人する。このフラグメントは、ベク
ター１＋ＢＲ３２２に挿入された、１）′ｌ″１Ｂ６Ｓ
３ のＴ領域からの、Ｂａ＋ＪＩ Ｉフラグメント８を
含んでいる組換えプラスミドｐＧ Ｖ ０１５３ （Ｄ
ｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓ＋ａｉｄ（１９８１）、 ２
４９−２５３）から得られる。１）に＼、’１Ｎ５３お
よびＩ）ＧＶＩ１６８ＤＮＡはＢｅｔ、１ａｃｈらの方
法で調製する（ Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ。 ３５（１９°７Ｇ）、２０３７−２（１４３）、ｖＧ＼
゛０］ ５３１）ＮＡ １１）μＢを１０単位のＢｇｌ
ＩＩ および１０単位のＳａｌ ｌを用い、最終量１
ｔ）１．）μｅ中３７℃で１時間、完全に消化した。消
化混合物をプレパラティブ（）、８％アガロースゲル上
に置いた。Ａ Ｉ Ｉ １ｎＨＬｏｎらの方法（Ａｎａ
ｌ、 Ｂｉｏｃｈｉ＋ｎ、 ８５（１９７８）、１
８８−．１９６）で電気溶出し、ゲルから２．１４ｋｌ
ｒ ＢｌｇＩＩ−８ａｔ １１７ラグメン）・を回収し
た。Ｉ）ＧＶＩ １６８ＤＮＡ ２μｇを２単位のＢｇ
ｌ ＩＩおよび２単位のＳａｌ ｌで完全に消化した
。ｆｔ１ｉ２１）μ、ｇ中、Ｔ４ＤＮＡ’Ｊｆｆ−ゼ（
’ｌ。 （）２単位を用いてＢ８Ｉ ｌｌ−８ａｌ １７ラグメ
ントＤＮＡ０．１μＨを０．１）２μｇのＢｇｌ ｌ
１ｌ−８ａｌｌ消化１）ＧＶ１１６８とライゲーション
した。このライプ−ジョン混合物をコンビテン）Ｅ、ｃ
ｏｌｉＫ５１４１、ｓｒ ｂｓ＋。子細胞（Ｄａｇｅ
ｒｔおよびＥｒｌ＋１ｉｃｈ。 Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３−２８）に導入した。 細胞をストレプトマイシン（２（）μＢ／ｌｏｌ ）お
よびスペクチ７マイシン（５０μｇ／＋ｎｌ）を補足し
たＬＢ倍地（Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｅｒｉ＋ｎｅｎＬ
ｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ （１
９７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓ１＋ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ｏｂｏｒａＬｏｒｙ＊ Ｎｅｕ＋ ＹｏｒＫ）に塗抹し
た。 ストレプトマイシン−およびスペクチ７マイシンー耐性
形質転換体から、マイクロスケールＤＮＡプレバレージ
ョン（Ｋｌｅｉｎら、Ｐ Ｉａｓ＋ｎｉｄ ３ （１９
８０）、８８−９１）を行なった。２．１４ｋｂＢｇｌ
ｌｌ−３ａｌ ［７ラグメントがＢｇｌ ｌｌ−３ａ
ｌ ！消化ｐＧＶ ｌ’ｌ ６８に挿入されている組換
えプラスミドをＢｇｌ ｌｌ−３ａｌ Ｉ消化により同
定した。 この消化で２．１４ｋｌ）および２１．８２ｋｌ）の２
つの７ラグメントが得られた。これらの分子量（２，１
４ｋｂおよび２１ ；８２ｋｌ））に相当する消化パタ
ーンを持ったプラスミドを１）に〜“１１７１と名イ（
ｊけ、さらにクローンするのに用いた。＋＋ＧＶ １１
７ ］ ｈ・らの１２．６５ｋｂフラグメントは、左右
のｉ” Ｌ −１） Ｎ Ａ境界配列（ＤｅＢｅｕｃｋ
ｅｌｅｅｒら、ｉｎ Ｆ”ｒｏ−ｃｒ＋０ｄｉｒ＋Ｂｓ
ｌＶｌ、ｌ＋ Ｉｏｌ、ｐｒｎａｌ、１ｏｎａｌ Ｃ
ｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎｌ”１ａｎＬ ｌ−’ａ１．ｌ
＋ｏＦｉｅｏｉｃ ＢａｃＬｅｒｉａ、 Ｍ、 Ｒｉｄ
ｅ’（ｅｄ。 ）（１９’ｉＪｔ １．Ｎ、、 Ｒ，Ａ、 ＋ＡＩ＋
８ｒｅＳｗｌ １５−１２ （５）および腫瘍性の増殖
を可能にする遺伝子（Ｌｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、
（１９８２）、］ ４７−１５２）を含んでいる。この
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメントをプラスミドｐＢＲ３
２５に挿入した（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｇｅｎｅ４（１９７
８）、１２１ １３Ｇ）。 １＋（ｉＶ１１°７１および１＋ｌ’３ Ｒ３２５はＢ
ｅｔ、１ａｃｂらの方法で調製した（Ｆｅｄ、 Ｆ’ｒ
ｏｃ、 ３５（１９７６）。 ２（１３７−２＋１４３）。それぞれのｌ） Ｎ Ａ
２μｇをυＦ位のＨｉｎＪＩＩＩ を用い、３°７℃で
１時間完全に消化した（インキュベーション緩衝液はＱ
゛Ｆａｒｒｅｌｌらにより記載されている（Ｍｏｌ、
Ｃ；ｅｎ。 Ｇｅｎ（１，ビア９（１”９８０）ｗ ４２１ ４３５
））。 ０．１ 、ｌｊＨノｔｌｉｎｄ ＩＩＩ消化シタｐＧ
Ｖ １ ］ ７４ ヲ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで線状化した
０、０５μｇのｐＢＲ３２５と、Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａリ
ガーゼ０．＋１２単位を用いてライゲーションした。ラ
イゲーション混合物を用５またコンピテントＥ、 ｃｏ
ｌｉ Ｋ Ｓ ｌ ４１＋ｓｒ・ ｌ＋ｓ＋ｎ の形
質転換はＤａＨｅｒｔおよびＥＭｉｃｂの方法で行なっ
た（Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３−２８）。細胞を
、カルベニシリン（１００μＢ ／ ＋Ｏｌ ）を補足
したＬＢ培地（Ｍ！１ｌｅｒ＋ Ｅｘｌ）ｅｒｉｍｅｎ
ｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ （
１９７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓ１＋ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に置いた。 カルベニシリン耐性コロニーを、テトラサイクリン耐性
を暗号化している遺伝子に挿入することによるその不活
性化に基づト、テトラサイクリン（１（）μｇ／ ＋ｎ
ｌ ）感受性でスクリーニングした（ Ｂｏｌｉｖａ
ｒ＋ Ｇｅｎｅ４（１９７８）、１２１−１３６）。カ
ルベニシリン耐性、テトラサイクリン感受性のコロニー
を、そのコロニーから調製したＤＮＡの制限酵素消化に
より、マイクロスケール技法（Ｋｌｅｉｎら、 Ｐ ｌ
ａｓ＋ｎ１ｄ３（１９８０）、８８−９１）によって物
理的に特性化した。即ち、Ｂａｎ＋Ｉ−１日前化により
、４つのＤＮへ７ラグメントか得られる：α配向の場合
は０．９８に’ｂ、４． ’７１ ｋｂ、５．９８ｋｂ
および７．０２ｋｂの７ラグメントが得られ、β配向の
場合は０．９８ｋｂ、４．７１ｋｂ、１．７］ｋｂおよ
び１１．２０ｋｂの７ラグメントがｌ＞られる。α配向
に相当する組換えプラスミドが荊咲ｉ萩＝占れはｐＧ
Ｖ ７００と名利けられた。このプラスミドがその後の
実験に用いられた。 ｐＧ Ｖ ’７５０１Ｊ：、ｐＧ Ｖ ７００１ｍ挿入
’ａ しなＴＬ−領域の内部の腫瘍に必須の機能を暗号
化している３、４９ｋｂ ＢｇＩ ＩＩ−８ｍａ ｌ
７ラグメントをカナマイシン耐性をＩ暗号化している２
、８１ｋｂＢａ＋ｎＨＩ −Ｈｐａ Ｉ フラグメン
トで置換することにより、ｐＧＶ７００から誘導される
。カナマイシン耐性を暗号化しているＢａ＋ｎＨＩ −
Ｈ１］ａ Ｉ ７ラグメントはλ：：Ｔｎ５（Ｂｅｒｇ
呟Ｆ’ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、）＼Ｃａｃ１． Ｓｃｉ、
ＵＳＡ’？ ２（１９７５）、３６２８−３６３２
）から得られる。λ：：Ｔｎ５の調製は ム１ｉ ｌ
Ｉｅｒにより記載されている（ Ｅｘｐｅｒｉ＋ｎｅｎ
ｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１
９７２）、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｌ−１ａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｕ＋ Ｙｏｒｋ
）。 １）に ＼’７００ＤＮＡはＢｅｔｌａｃｈら
の方法で調製する（’Ｆｅｄ。 Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２（）３７−２０４．’
（）。 ｐＧＶ７００ＤＮＡ２μＨを２単位のＢｇｌ Ｉ
＃よび２単位のＳ＋ｎａＩ で完全に消化した。λ：
：Ｔｎ５１） Ｎ Ａ ２μ８を２単位のＢａｒｏｎ−
ＩＩ および２単位のＨｐａｌで完全に消化した。１μ
εのＢ ａ＋ｎ ）（−１−Ｈｐａ １消化λ：：Ｔｎ
５を、最終量１０μ夕中、Ｔ 、ｌ ｌ’） ＮＡリガ
ーゼ０．５単位を用いて、（〕、２μ８のＢ ｇＩＩＩ
−８ｈｏａｌ消化１）（、； Ｖ ７００とライゲーシ
ョンした（製造業者の指示する条件に従った）。このラ
イプ−ジョン混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ５
１４ｈｓｒ ｈｓ＋ｎ＋細胞（ＤａＢｅｒｔおよびＥ
ｒｂｌｉｃｌ＋、 Ｇｅｎｅ６（１９８１３）、２３−
２８）に導入した。細胞を、カルベニシリン（１００μ
ｇ／＋ｎｌ）およびカナマイシン（２５μＢ／ｒｏｆ）
を補足したＵＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ。 Ｅｘｐｅｒｉ＋ｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９７２）＋Ｃｏ１ｄ Ｓ１＋
ｒｉｎｊ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅ
ｕ＋ Ｙｏｒｋ）上に置いた。マイクロスケール技法（
Ｋｌｅｉｎら。 ＰＩａｓｍｉｄ、３（１９８０）８８−９１）に従って
調製したｌ） Ｎ Ａの制限酵素分析により、Ｃ１，Ｒ
およびＫｉｎ’コロニーを物理的に特性化した。このＤ
ＮＡｔ（ＢｇＩＩｆ／Ｂａ５ａｌ旧で二重消化すると、
３．９４ｋｂ、５．８９ｋｌ）およびａ、、ｏ９ｋｂの
３つの７ラグメントが、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化すると
２．６８ｋｌ）、５．９９ｋｂおよび９，２５ｋｂの３
つの７ラグメントが得られる。この消化パターンを示す
プラスミドをｐ（ｘ＼硲５０と名付け、第１７図に模式
的に示した。 ｐＧＶ ７ ｔ） ＯトｐＧＶ ７５０ハ、オフ）ビン
Ｔｉ７”７スミｆ’ ｐＴｉＢ６ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの
左右の境弊配列を含む、２−？の相異なる中間クローニ
ングベクターである。更に、これら２つのプラスミドで
は′ｒ−領域内の削除の程度が異なっている。 １）に＼１７旧）は、オクトピンシンターセ′（トラン
スクリプト３）およびその他３つの生成物、即ち４．６
ａおよび６ｂ （Ｔ−領域の生成物についてはＷ ｉ
ｌ ｂｅ ｉ Ｌｚｅｒ ら、ＥＮＢＯＪ、１ （１
９８２）。 １３！Ｊ−１４６参照）のための遺伝情報を持った縮小
′Ｉ゛−顧域を含んでいる。この３つの生成物（４，６
ａおよび６ｂ）の組み合せが形質転換された植物の新芽
形成を促す。＋３Ｇ Ｖ ７５１）はもっと小さいＴ−
領域、即ちオクトビンシンターゼ遺伝子だけを含んでい
る。生成物４，６ａおよび６１〕の為の情報は、カナマ
イシン（ネオマイシン）耐性を暗号イ些している抗生物
質耐性マーカー遺伝イによって置換されてしまっている
。 ｐＧＶ ７００ＭＭｏ’ Ｉ）ＧＶ ７ Ｓ （’、）
１．ｔ、Ｂタイプの７クセプターＴｉプラスミド（第８
図および後記実施例３参照）と共に使用し得る中間クロ
ーニングベクターの例である。これらのベクターは、そ
れらが所望の遺伝子を含んでいないことを除けば、第９
図に示したものと部分的に類似している。 これらのベクターは、その改良Ｔ−領域内にクローンす
る為の１個の制限エンドヌクレアーゼサイトを含んでい
′るので、所望の遺伝子を簡単にそれらのベクターに挿
入することができる（第１４図および第１５図参照）。 享ｍ９ｕ３ アクセプタづｉプラスミドｐＧＶ２２６
０（タイプＢ）の組み立て 出発株およびプラスミド： ＡＢｒｏｂａｃＬｅｒｉｔｕ＋白、ｕｍｅｒａｃｉｅｎ
ｓ （野生型ＡＨｒｏｂａ−ｃｔ、ｅｒｉｕ＋０から誘
導される、す７アンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ］およびエリ
スロマイシン−クロラムフェニコール耐性２株Ｃ５８Ｃ
１） ′１盲 プラスミド＝ ｐＧＶ２２１ ？中間べ’）９
−（第１６図）＝ｐＧＶ７４５Ｔｉプラスミド１＋ＧＶ
２２］７の組み立てについては詳細に記載されている（
Ｌｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、１
４７ １５２）。 これは、オクトピンＴｉプラスミドの全Ｔ １．−領域
の欠失置換突然変異体を含んでいる：即ち、Ｂａｍｆ（
Ｉ ７ラグメント８．３０ｂ、２８．１７ａおよびＢａ
ｔ訂１１フラグメント２の左の３．７６ｋｌ）ＢａｍＨ
Ｉ −ＥｃｏＲＩ ７ラグメント （Ｄｅ Ｖｏｓ ら
。 Ｐｌａｓ＋ｏｉｄ ６（１９８１）、 ２４９−２５３
）が、ｉ” ｎ ５ のａｐｔ （アセチルホスホトラ
ソス７エラーゼ）遺伝子を含んでいるＩ）ＫＯ２のＥｃ
ｏＲ’ｌ−Ｂａｍｔｌｌフラグメント（Ｒａｏ ＆ Ｒ
ｏｇｅｒｓ、 Ｃ：ｅｎｅ７（’１９７９）ｗ７９”
８２）で置ぎ換えられている。 この遺伝子はアミノグリコシド、ネオマイシンおよびカ
ナマイシンに対する耐性を暗号化している。 中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立てを第１６図に模式
的に示した。これについて以下に詳述する。組換えプラ
スミドＩ）Ｇ＼・“７１３を、α配向でＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ ７ラグメント１４．１８Ｃ，２２ｅおよび３８Ｇを
含む、オクトピンＴｉプラスミドサブクローンｐＧ Ｖ
Ｏ２１９（Ｄｅ Ｖｏｓら、 Ｉｙ’ ｌ ａｓ＋ｎ
１ｄ６（１９８１）、２４９−２５３）から誘導した
。 ｐＧＶＯ２１９ＤＮＡをＢａｔＯ）−（Ｉで完全に消化
し、次いで自己結紮（セルフライプ−ジョン）（こ有利
な条件下で・ライゲージコンした（ライプ−ジョン）１
を合物中のＤ Ｎ Ａの最終濃度〈１μｇ ＤＮＡ／ｍ
ｌ）。 アンピシリン耐性で形質転換体を選別し、制限酵素によ
る消化で物理的に特性化した。ｐＧＶ＋３２１９に存在
する６ 、 ５ ｋｂ Ｂａ＋１１ＨＩ ７ラグメント
をもはや含んでいないクローンを分離し、これをｐｃｖ
Ｖ７１３と名（１Ｒた。コ（１） りｏ ＞ ｐＧＶ
７１３をその後のりａ−ニングに使用した（以下の記
載参照）。Ｂａｍ’ＨＩ ７ラグメント２を含んでいる
ｐＧＶｏ １２０ （’Ｄｅ Ｖｏｓら、 ＰＩａ
ｓ＋ｏｉｄ ６（１９２７］）、 ２４９−２５３）か
ら組換えプラスミド１＋（＋ Ｖ ７３８ 全誘導した
。１）（ハ’０１２０１’）ＮＡをＩＥｃＯＲＩで消化
し、Ｉ）ＧＶ ７１３の場合と同様にして自己結紮させ
た。形質転換体をアンピシリン耐性によって選別し、制
限酵素消化により５）析した。ＥｃｏＲＩ ７ラグメン
ト２０．１２およびＥｃ。 ＲＩフラグメント１９ａの一部とρＢＲ３２２のｐＧ
Ｖ ７３８と名付けた。このプラスミドは、依然として
Ｂａ＋ｎｌ（Ｉ ７ラグメント２の右側部分から（７）
５ 、６５ｋｂ Ｅ’ｃｏＲｌ −Ｂａｎ＋ＨＩ ７
ラグメントを含んでいる（Ｄｅ Ｖ’ｏｓら、 Ｐｌａ
ｓｍｉｄ ６（１９８］ ）。 ２４９−２５３ ）。 次いでｐＧＶ７１’３ＤＮＡを１−１ｉｎｄ ＩＩＩお
よび１３ａｍｌ（Ｉで消化し、消化物をプレバラティブ
ア〃ロースケ゛ルにかけた。電気泳動の後、１］（ハｆ
Ｔ１３内に含まれている２ 、 ３１） ｋｂＨｉｎｄ
ＩＩ’ｌ−’Ｂａｈ＋ＨＩ７ラグメントを電気溶出で
純化した（ＡｌｌｉＢＬｏｎら、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏ
ｃｌ＋ｅ＋ｎ、 ８５（１９７Ｓ）’、１８８−１９
６）。この７ラグメントをＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍ
ＨＩで完全に消化したｐＧ Ｖ ７３８とライゲーショ
ンした。形質転換後、アンピシリン耐性フ拓ニーを、制
限酵素消化により物理的に特性化する。例えば、Ｅｃｏ
Ｒｒ Ｂａ＋ｎＨＩ ？ｈ化により、それぞれ３．９
ｆ３ｋｂ（＝ベクタ一部分）と７．（３５に１）（＝挿
入部分）の２つの７ラグメントが得られるはずである。 この特性を持った組換えプラスミドはｐＧＶ７４５と命
名され、７クセプター１゛１ プラスミドｐＧ〜７２２
６０を組み立てるための中間ベクターとして使用された
。 プラスミドｐＧＶ７４５はｐＢＲ３２２部分にＣｏ１Ｅ
１特異的ｂｏ＋□サイトを持っており、実施例１に記載
した様に（アクセプターＴｉ プラスミドｐＧｖ３８５
０の組み立てについて）、ヘルパープラスミドＲ６４ｄ
ｒｄｌｌおよびｐＧ Ｊ ２８を１史ってＥ、ｃｏｌｉ
からＡ８ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋Ｉ＋へ摂動させること
がでとる。 ｐＧＶ７４５を、す７アンピシン耐性でありＴｉプラス
ミミドＧＶ ２２１７を含んでいるＡｇｒｏｂａ、−ｃ
ｔ、ｅｒｉｕ＋１１株Ｃ５８Ｃ１に授動させた。最初の
乗り換えは、実施例１ （アクセプターＴｉプラスミド
１＋Ｇ’Ｖ ３８ Ｓ ｌ）の組み立て）に記載した方
法と同じ方法で、ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性を使
って選択した。２回目の来り換えにより、ｐｃ； Ｖ
２２１７に存在する欠失置換突然変異体がプラスミドｐ
（ハ゛′７４５のｐＢＲ３２２配列によって置換３ｈる
。１＋Ｇ Ｖ ７４５（７） ｐＧＶ ２２ ］ ７と
の相互組込みの結果得られるアンピシリン耐性トランス
接合体を、カナマイシン耐性の欠落により直接選別する
ことにより第２の組換え体を得た。この様１コシテ、（
＋ＧＶ２２６０ （７ンピシ’）ンｆｉｒ）性、カナマ
イシン感受性）を含んでいるり７アンピシンＡＢｒｏｌ
、ａｃＬｅｒｉｕ＋＋＋株Ｃ５８Ｃ］を祷た。 このｉ’ｉ プラスミドｐＧＶ２２６０１．ｔ、ｐＧＶ
７（月）−またはｌ）Ｇ Ｖ ’７５ Ｃ１−タイプの
中間クローニングベクター用のアクセプタープラスミド
（Ｂタイプ）として使用されるものである。これらは、
（ｉ）アンピシリン耐性遺伝子、複製起源およびｐＢＲ
３’２２の１）０１１＋サイトを持ったＤＮＡ７ラグメ
ント、（ｉｉ）ＴＬ−ＤＮＡの左右の境界配列および、
中間クローニングベクターのＥ、 ｃｏｌｉからＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋への転移並びにそのアクセプ
ターＴｉプラスミド１）ＧＶ２２６０への相互組込みを
遺伝学的に選別し得る、Ｉ）ＢＲ３２２に既に存在して
いる耐性マーカーとは別のもう１つの耐性マーカーを含
んでいるＤＮＡ７ラグメン）・、で構成されている。 例えば、本発明者らは、ｐＧ〜’２２６０と＋）（ＩＶ
°７００との間の相互組込み体を持っているＡｇｒｏ−
ｂａｃｔｅｒｉｕｍは、所望のＤ Ｎ Ａ配列（ｉ’
−Ｉ） Ｎ Ａ境界の間に含まれている）を植物細胞ゲ
ノムヘ転移６ａ、６１） ； Ｗｉｌｌ＋＋＋１ｔｚｅ
ｒ ら、ＥＭＢｏ 、１．１（１９８２）、１３９−１
４６）を含んでいる場合は、期待される表現型、即ち新
芽を生じる腫脹を示す、この様に、本発明者らは、Ｂタ
イプのアクセプターＴｉプラスミドは、第９図に示し、
そして実施例２に記載したタイプの中間クローニングベ
クターとの相互組込み体として使用すると、ＤＮＡを植
物細胞に転移させることがでトることを証明した。 天逓追ロ 植物に発現させようとする遺伝子を含んだ中
間クローニングベクターの組み立て本発明が完成される
まで、Ｔｉプラスミドの′１゛−領域内の、多かれ少な
かれでたらめな位置に全遺伝子を挿入しても、その外来
性の配列が植物ゲ７ムヘ転移した後発現されるというこ
とはなかった。本発明方法では、所望の外来性遺伝子（
群）の方法の有用性は、ツバリンシンターゼ遺伝子を１
１ｈ号化しているＤＮＡ配列が関与する、本発明の実験
によって例証される。、この遺伝子の全配列および正確
な転写開始および終了は既知である（Ｄｅｐ−ｉｃｋｅ
ｒらＪ 、 Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、 ＧｅｎｅＬ、
１ （１９８２）。 ５６１−５７４ ）。本発明によれば外来性遺伝子の蛋
白質暗号化領域はＩＩ（ｉｓプロモーターの隣りに挿入
することができる。外米性遺伝子配列の例として、オク
トピンシンターゼ遺伝子の暗号領域（Ｄｅ Ｇｒｅｖｅ
ら＋ Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅ
Ｌ、 １（１９８２）、４９９−５１２）を１１ＯＳ
プロモーターに隣接させて挿入する。この構造物はアク
セプターＴｉプラスミド内に授動され、植物を感染させ
るのに使用される。生成した腫瘍組織にオクトピンが存
在するかどうかを分析した所、陽性であることがわかっ
た。 キメラツバリンプロモーターを含有している中間クロー
ニングベクターの組み立て：オクトビンシンターゼ構造
遺伝子を第１８図〜第２０図に示す。 簡単に言えば、１１０Ｓ遺伝子を含んでいる制限７ラグ
メントＨｉｎｄ ｌ Ｉｆ” ２３ をインビトロで
処理してｌＩＯ３暗号配列の大部分を除去し、制限エン
ドヌクレアーゼサイトＢａ＋ｎＨＩに隣接している１１
０Ｓプロモーターは保持する（第１８図）。１０μｇ１
） ｐＧＶＯ４２２（完全なＩＩｏｓ遺伝子を含むＨ
ｉｎｄ ｌｌｌ−２３７ラグメントを持った１）ＢＲ３
２２誘導体； Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、 Ｐ ｌａｓｍｉ
ｄ （１９８０Ｌ１９３ ２１１）ＢＳａｕ ３Ａで消
化し、ｌｌ０Ｓプロモーターを含んだ３５（１１）ｌ）
の７ラグメントをプレパラティブ５％ポリアクリルアミ
ドゲルで分離する。このプロモーター７ラグメントを、
５゛−末端燐酸エステル基を除去するために予め細菌性
アルカリホスファターゼ（Ｂ Ａ １＝’ ）で処理し
た、１３８１１１−切１４ＩｉｐＫＣ７（Ｒａｏら、Ｇ
ｅｎｅ７（１９°７９）、’？９−８２）に結合させる
。得られたプラスミド（ｐＬ（、ｉ Ｖ １３ ）２０
μｇをＢｇｌ ＩＩで消化し、４００μでの１２ｍＭ
ＭＢＣＩ２．１２ｍＭ ＣａＣｌ７．０゜６ＭＮａＣ１
，１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ （１） ｌ＠ Ｍ ｔリ
ス−〇 Ｃｌ （ｐ Ｈ８、（’ｌ ）中、３（）℃で
゛Ｂａ１３１＋−キソヌクレアーゼ（Ｂ １ｏｌａｂｓ
、 Ｎｅｗ Ｅｎ８１ａｎｄ） ７ ！ｉｔ位を用いて
４・〜１０分間処理する。この間、約２＋）・−５０１
＋１＋のｌ） Ｎ Ａが除去される。この１．’３ａ１
３１−処理分子をＢａｎ＋１旧で消化し、１．） Ｎ
ＡポリメラーゼのＫＩｅｎｃｏｕ７ラグメントと共益イ
中Ａ１−た＝填されたＢａｒｎ）−ＩＩ末端とＢａ１３
１除去末端のライプ−ジョンから得られる再生Ｂａ＋ａ
ト目サイトを持ったプラスミドを選別する。いくつかの
候補のＢａｒｎＨＩ Ｓａｃ ＩＩフラグメントのサ
イズを６％尿素 ゛−ポリアクリルアミドデル中で
見積り、サイズが２００〜２８０ヌクレオチドの範囲に
ある候補のヌクレオチド配列を決定する。プロモーター
を持った２ 、０３１）ｌ）の５ａｃｌｌ −ＢａｍＨ
Ｉ ７ラグメントを含んでいるクローンｐＬ Ｇ■８１
を、ｐＧ Ｖ ０４２２の ｌＩＯ３遺伝子中のＳａｃ
ＩＩ−Ｂａｎ＋ＨＩ ７ラグメントと置換するのに
使用する二二の最終プロモーターベクターはｐＬＧＶ
２３８１と呼ばれる。 全ての組換えプラスミドはＥ、 ｃｏｌｉ株ＨＢ ｉ
ｏ １の形質転換により選択する。 この様に処理した＋１０８プロモータを含んで′ｖ）る
プラスミドベクターをＢａｎ＋１旧で消化し、Ｂａ＋ｌ
ｌＨＩ７ラグメントに含まれているｏｃｓの暗合配列を
このサイトに挿入する。このｏｃＳ暗号配列も、インビ
トロで処理し、第１９図に示した様に、Ｂａａ＋Ｈ１制
限エンドヌクレアーゼサイトで囲まれる様にする。オク
トピンＴｉプラスミドＢ６Ｓ３のＢａｒｎ１］Ｉ７ラグ
メン白７ａ １ Ｇ μｇ （’Ｄｅ Ｖｏｓら。 ＰＩａｓ＋１１ｉｄ ６（１９８１Ｌ２４９−２５３）
をＢａｒｎｌｌＮ；よびＳｍａｌで消化し、ｏｃｓ−暗
号配列を含む７ラグメントを１％ア〃ロースデルから分
離し、＋）ＢＲ，３２２の大きイＢａ＋ｎＨｆ Ｐｖ
ｕ Ｉ Ｉ ７ラグメントに結合させる；得られたプラ
スミド′、ｐＡＧ Ｖ ８２８ （２０μｇ）をＢａｍ
ＨＩで消化し、第１８図に示した様にエキソヌクレアー
ゼＢａ１３］で処理し、次いでＨｉｎｄ ＩＩＩで消化
し、末端を充填し、自己結合させる。Ｂａ１３１除去体
のサイズは６％ポリアクリルアミドゲル中で見積る。い
くつかの候補のヌクレオチド配列を決定し、５゛−非翻
訳リーダー配列の残り７１）ｌ）だけを持った候補を選
択して以下の操作にイ１す（＋）ＯＣＳ△）。ｏｃｓ配
列をＢａ＋ｎ１ｌＩサイトで囲むために、Ｃ１ａｌ−Ｒ
ｓａ１７ラグメントを充填し、１）ＬＣ２３６（Ｒｅ＋
＋＋ａｕＬら、Ｇｅｎｅｌ ５（１９８］）、８１−９
３）のＢａｌ Ｉサイトにサブクローンする。得られた
プラスミド１＋ＡＣｉ＼ｉ４０をＢａｎ＋１旧で消化し
、ｏｃｓ配列を持ったブラグメントをプレパラライブ１
％アガロースデルから電気溶出により分離し、予めＢａ
ｒｎＨＩで消化しＢＡＰ（細菌性アルカリホスファター
ゼ）で処理したｐＬＧＶ２３８１に結合させる。 ｏｃｓ配列のＩ）ＬＧＶ ２３８１への挿入により、両
方の配向のものが得られる（ｐＮＯ］および１）ＮＯ−
２）。 ｎｏｓ ： ｏｃｓ融合の正確な接合点を示すヌクレオ
チド配列を第２０図に示す。 更に、処理した１１０Ｓプロモーターを含有しているプ
ラスミドベクターは、酵素ジヒドロ７オレートレグクタ
ーゼを暗号化しているプラスミドＲｅｆ７か□らのＤＮ
’Ａを挿入するのに使用される。ジヒドロ７オレートレ
グクターゼ遺伝子を含んでいる暗号配列は、Ｂ’ａｍＨ
Ｉに含まれており （０’Ｈａｒｅ呟Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７８（ｆ’Ｊ８１
）、１５２７−１．５３１）、従って既述した様に、プ
ロモーター領域に隣接するＢａ＋ｎＨＩサイトを含んで
いる１１０Ｓプロモーターベクターに容易に挿入される
。この遺伝子は、発現されると抗生物質メ□ト）・レキ
セードに対する耐性を付与するので、選択可能なマーカ
ー遺伝子の１つの例である（第２．３，４．５および７
図参照）。この中間クローニングベクターが野生型７パ
リンアクセプタ＝′ロブラスミドを含んでいるＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋に摂動されると、単一乗換えが起
り、ハイブリッド′１゛１プラスミドベクターか得られ
る。このベクター組成物を、植物の感染に使用する。得
られた腫瘍組織は、（）、５μｇ／ｍ ｌのメトトレキ
セートの存在下で継続して生長し得ることがわかった。 ＯｅＳおよび上記のｌｌ０Ｓプロモーターの後のジヒド
ロ７オレートレダクターゼ暗号領域を含んでいる中間ク
ローニングベクターを組み立て、ノ＼Ｂｒｏ−ｂａｃｌ
ｅｒｉｕ＋ｎのＴｉ７リスミドと相互組込みした後、７ させることができるということが証明される。 謁例ｙ 染色体に挿入された所望の遺伝子を含む植物細
胞および植物の分離 本発明者らは、以下の３つの方法のいづれかを使って１
．非腫瘍性アクセプター′「ｉプラスミド誘導体（例え
ばｐｃ；ｖ３ｓｓｏ）で形質転換された植物細胞および
全植物を得た。 （１） インビボでの全植物の接種、次いで新芽の再生
が可能な培地上、インビトロでの培養、（２）損傷部位
で直接新芽の生成を促す他のＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉａ
株の存在下、インビボにおける全植物の相互感染、 （３）インビトロでの単一植物細胞プロトブラストの共
生培養。 これらの方法について以下に詳述する。 最初の方法は、クラウンガル組織が生産されることとな
る、全植物組織の野生型Ａ ｇｒｏｂａｃ Ｌｅｒ ｉ
１１１１１株による感染体を得る為に通常使用される
方法を改良したものである。μＧＶ３８５０は腫瘍を形
成しなイＡＢｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ誘導体であるので
、感染部位において腫瘍の増殖はみられない。しかし感
染した組織を取り除外、組織培養で増殖させると、形質
転換された組織を容易に得ることができる。 初期培養期間（単に組織の量を増やすため）の後、損傷
部位組織を新芽形成が可能な条件下で増殖させる。非形
質転換細胞およびｐＧＶ３８５０で形質転換した細胞の
両者が新芽を発生する。形質転換新芽は、ツバリンの存
在をみる簡単な分析により容易に区別することができる
。 本発明者らは、次のプロトコールに従って、Ｎ １ｃｏ
ｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３
８の頭部を切断したタバコの苗木か呟 ｐＧＶ３８５０
−形質転換カルスおよび新芽を得た（全ての操作はラミ
ナー７０−７−ド中、滅菌条件下で行なった）。 （１）小さなびん（直径１０ｃＩｏ、高さ１４）ｃ＋ｎ
）の中で、０．８％の寒天を含む固形のＭｕｒａｓｈｉ
Ｈｅ ＆Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地（Ｍｕｒａｓｂｉ８ｅ
および５ｋｏｏ８゜ＰＩ＋ｙｓｉｏ１．’ＰｌａｎＬ、
、１５（１９Ｇ２）、 ４７．３−４９７）で生育させ
た６周令のタバコの苗木を使用する。 （２）外科用メスで最も若い頭頂の葉奮切り取って捨て
る （３）選択的条件（例えばゴミプラスミドｐＧｖ３ Ｆ
＋ ５０を含んでいるす７７ンピシン耐性、アンピシリ
ン耐性ＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋ｎ株の場合は、１０
０Ｍｇ／ｍ１のり７７ンピシンと１００ μｇ／＋ｎｌ
のカルベニシリンを含んでいる’）’ Ｅ Ｂ培地を使
用する；ＹＥＢ培地”５ｇ／ＲＢａｃＬｏビーフェキス
、１ｇ／Ｉ Ｂａｃｔｏ酵ｌｘキス、５ ｇ／ １
ヘプトン、５ｇ／ｌシュクロース、２ Ｘ 】０−３Ｍ
ＭｇＳ ０４−１）Ｈ７，２，１５ｇ／ｌ寒天）で増
殖させた新鮮な平板培養からのＡＢｒｏｂａｃＬｅｒｉ
ｕｕ＋を、スパーチルまたはつまようじで損傷表面に接
種する。各１）（ハフ３８５０組み立て物を、少なくと
も８本の苗木に接種する。 （４）２週間インキュベートする。接種部位にほとんど
あるいは全く反応が表われないはずであるが、時々非常
に小さいカルス（ｃａｌｌｉ）か観察される。 （５）
損傷表面から１１６１１１より薄い切片を切り取る。損
傷表面を、オーキシンおよびサイトキニン（ＩＩＩＩｇ
／夕ＮＡＡ、０．２１＋＋Ｂ／ρ ＢＡＰ）および１％
シュクロースを添加したＬｉｎ５＋ｎａｉｅｒ ＆ Ｓ
ｏｏｇ （ＬＳ）寒天培地（Ｌｉｎｓｔｎａｉｅｒ ａｎｄ ５
ｋｏｏＨ，ＰＩ＋ｙｓｉｏｌ。 Ｐｌａｎｔ、、 １８（１９６５）、１００−１２７
）を含む（６）約６週問後、カルスはその一部をとって
ツバリンの存在を試験するのに十分なだけの火トさにな
る（少なくとも直径が約５＋ｎｍになる）。全ての損傷
カルスが７パリンを生産する訳ではない。・１本の植物
の内約１本がツバリン陽性損傷カルスをつくる。 （７）７パリン陽性カルスを再生培地を含む寒天平板に
移す二上記のＬＳ培地＋１％シュクロースおよびｌ ｍ
Ｉｉ／ （ＨＢ Ａ Ｐサイトキこン（８）約・１・−
〇週間後に良好なサイズの新芽（高さ１ｃｂ＋）が出る
。更に成長させ、根を形成させるために、この新芽を、
ホルモンを含まないｌ Ｓ ｋ、ｒ’。 地＋１％シュクロースを含有している新しい：す；入３
１Ｌ板に移＃−０ （９） ツバリンの存在を試験するのに、その−・部＜
＋＝２枚の小さな葉）を切り取れる様に、この新芽を１
・〜２週間成長させる。 （１０） ツバリン陽性の新月を、（１）と同じＭＳ
培地を入れたやや大きい容器（上記と同じＮ）ｃｍのび
ん）に移し、更に成長させる。 注）感染させた組織のための全ての植物培養培ａｘｉｍ
ｅ、 Ｃ１ａｆｏｒａｎ Ｉ＜、ヘキスト） ５ （’
、１０ ｕ ｇ／Ｉｌｌ １が含まれている。この薬物
は、全てのＡｇｒｏｌＪａｃｆ、ｅｒｉｏｌｌｌ（カル
ベニシリン耐性のものを含む）の生長をよく阻止する。 本発明者らの研究室で、形質転換された新芽を出す組織
を得る別の方法が開発された。この方法は、ＡＢｒｏｂ
ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎのある種のミュータアトＴｉプラス
ミド株が、新芽を出すクラウンガル腫脹を生成させると
いうことを観察したことに基いて開発された。この様な
新芽−誘起（ｓｌ＋ｉ）ミュータン１゛は、Ａ、ｔｕ＋
＋＋ｅｆａｃｉｅｎｓの′１１１プラスミドのＴ −Ｄ
ＮＡ（転移Ｄ Ｎ Ａセグメント）の特定の領域に位置
している（ＬｅｅＴｏａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１９
Ｅ＋２）。 １４’７−］ ５２； Ｊｏｏｓら、 Ｃｅ１ｌ
３２（１９８３）。 １０５Ｖ＝１０６７’）。誘起された新芽は完全にｊＥ
常な非形質松換細胞で構成されていることが多い。従っ
て本発明者らは、２つの異なったＡｇｒｏ−ｌ〕ａｃ１
．ｃｒｉａ、即ち１つはオクトピン′１゛ｉプラスミド
放出（ｓｂｏｏｌ、ｅｒ）ミュータントを持ったもの、
もう１つは１１（：＼・”；（Ｔ３５０を持ったもの、
の混合物でｊ＋１１＊を接種した。この様にすることは
、オクトピン放出ミューテーショ□ンが、（ＩＧ Ｖ
３８５ （、’）で形質転換された根を誘起することが
出来るよい成分である。Ｔ１プラスミドｐに〜“３８５
１）およびオクトピン新芽誘起Ｔ１プラスミドを５：１
の割合で含んでいるＡｇｒｏｂａｃｌｅｒｉ＋ｏｎを植
物に接種した。こうｔ ７）こトニより１）に＼“３８
５０−形質転換新芽を１（１−た。この新芽は、ツバリ
ンの存在について分析することにより、容易に選別する
ことができる。 この方法は、精功な組織培養法を必要としない、。 ツバリン陽性新芽・を、更に成長させるための成長調節
ホルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含んだ培地に移す。 新芽が十分な大きさに達した後、容易に繁殖の為の土壌
に移すことができる。この共感染法は、簡単に組織培養
しにくい種類の植物を形質転換するのに特に有用である
。従って、あらゆる範囲の農学的にあるいは経済的に重
要な植物、例えば豆科植物、薬用植物および装飾植物を
Ａ８ｒｏｌ）ａＣ’ｔｅｒ’ｉ’ｕ＋ｎで処置すること
か゛で）よう。 第３の方法は、Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔ、ａｂａｃ
ｕ＋ｎプロトプラストの単離およびホルモン−非依存性
のｉ” −Ｉ）との共培養後に実施し得るものである。 池の優勢な選択マーカー、例えば高等植物細胞で発現さ
れを使用することかできる。しカルこの場合は、それぞ
れのケースについて選択の条件を最善にするまたは細胞
コロニーの濃度など）。形質転換細胞を選択できない場
合、例えば１）に＼’ ３ 乏ｉ ５１ＪホたはｐＧ
Ｖ ２２１７ （Ｌｅｅｎ＋ａｎｓら、Ｉ−ＪＩＩＢＯ
Ｊ、 １（１９８２）、］４７ １５２）の様な非毒
性のＴ−ＤＮＡミュータントを用いたために選択できな
い場合、遺伝学的形質転換の後に細胞をオーキシン−お
よびサイトキニン−含有培地（例えば２１１１ｇ７’ｐ
のＮＡＡ（Ｑ−ナフタレン酢酸）および０．３ｍＢ１
、Ｑ （１）カイネチンを含むＭ ｕｒａｓｌ＋ ｉｇ
ｅおよびＳ ｋｏｏＢ培地（Ｍｕｒａｓｂ晴ｅおよび５
ｋｏｏ８． Ｆ’ｌ＋ｙｓｉｏ１． Ｉ”１ａｎｋ
１５（］！Ｊ ｂ ２）、４”７３−４’；）°７）
）で培養し、形質転換コロニーをそのオパイン（０＋山
＋ｅ）含有量で同定することがでｂる。この様にして、
アグロピン（ａＨ＋・０１＋ｉｎ’ｅ）および７ノピン
（＋ｏａｎｎｏｐｉ＋ｉｅ）合成の電気泳動外４ｆ（方
法にツいてはＬｅｅｒｎａｎｓら、 、Ｊ 、ｈ’ｉｏ
１． Ａ１＋１＋ｌ。 （’１ｅｎｅ１．． ．１（］ ９８１）ｔ ｊ ４
９−］ ６４参照）の後、約６６０コσニーが、１）Ｃ
；＼’２２１７で感染後にｊｌられ、Ｔ Ｒ−＋＋９号
化オパイン・マノピン（Ｎ”−（］−マニチル）−グル
タミン）を合成するＮ １ｃｏＬｉａｎａ Ｌａｂａ
ｃｕ＋ｎ Ｓ Ｒ１セルラインであることがわかった
。このセルラインのカルス切片を内生培地（唯一の植物
成長調節剤として１３Ａｆ’ （６と、故多くの新芽か
形成した。分析した２ｏの新芽の全てか、依然としてマ
ノピンを合成することかできた。ホルモンを含まなイＭ
ｕｒａｓｂｉｇｅ ａｎｄＳ ｋｏｏｇ培地に移した後
、これらの新芽は、依然としてマノピンを含有している
形態学的に正常なタストの分離および形質転換法は、Ｎ
、１＋Ｉｕ＋ｎｂａ８ｉｎｉ−ｆｏｌ ｉａにも用いる
ことができる。 ２、実験手法 ２．１．新芽培養条件 培養室内の滅菌条件下（１Ｆ１１６時間、Ｉ ５ （’
、１０ルツクスの白色蛍光（“ＡＣＢＣＬＰ” ５８
Ｗ／２４３ （１０°Ｋ Ｅｃｏｎｏｍｙ”）、２４
℃、相対湿度７（）％）、２５１）Ｊのガラスびんに入
れたホルモン不含のＭｕｒａｓｌ＋ｉＢｅ ａｎｄ ５
ｋｏｏＢ培地（Ｍｕｒａｓｌ＋ｉ６ｅおよびＳｋｏｏｇ
＋Ｐｂｙｓｉｏ１．Ｐｌａｎｔ、 １５（］ ！Ｊ
６２ ）。 ４７３−４９７）Ｊ−でＮ １ｃｏ１．１ａｎａ １
．ａｂａｃｕｍの新芽培養を維持する。５調合の新芽培
養をプロトプラストの分離に使用する。 ２．２．プロトプラストの分離 プロトプラストの分離および培養における全ての１．程
は無菌操作で行なう。混合酵素法によりプロトプラスト
を分Ｓする。ンｅｌｌｌより小さい非常に若い葉を除く
全ての葉をプロ［プラストの分＃ｉ１１に使用すること
ができる。鋭利な外斜用のメスで、葉を幅約２−３ ｍ
ｈＩｌの細長い小片に切断する。この葉材１２ □−３
ｇを、酵素混合物５１） ｍ 、（’、中、かぎまぜる
ことなく、ｕｉ所°で、２４°Ｃにて１８時時間インキ
ュベートする。この酵素混合物は、ホルモン不含のに３
培地中、０．５％セルラーゼＯｎｏｚｕｋａ Ｒ−１
０および（）、２％マセロザイムＯｎｏｚｕｋａ Ｒ−
１（）からなっている（ＮａｇｙおよびＭａｌｉＢａ、
Ｚ、。 Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｌ＋ｙｓｉｏｌ、 ７８（１９’
７ Ｇ）ｔ −４５３−／＋５５）。この混合物は、０
．２２μＩＩＩ細孔膜を通してシ濾過滅菌し、顕著な活
性の低下をきたすことなく、−２０°Ｃで少くとも６力
月間貯ｉ＆することかでとる。 ２．３．プロトプラスト培養 １；；時間インキュベートした後、プロトプラストを放
出するために混合物を穏やかにかぎまぜる。 次いでこの混合物を５（）μｍ１１のふるいを通してシ
濾過し、ｐ液を］ ｌ’） ｕ＋ ／’の遠心管に移す
。振動バケツローターに入れて６０・−〇 （、’）
Ｂで６分間遠心分離すると、プロトプラストか゛１后緑
色の浮遊バンド（帯）を形成する。プロトプラストの下
層の液およびペレット状の残骸を、輸動ポンプに連結し
た毛細管を使って取り除く。プロトプラストを１つの遠
心管に集め、培養培地で２回洗浄する。この培養培地は
、Ｎ Ａ Ａ （１） 、 ］ ｍｇ７θ）およびカイ
ネチン（０，２＋ｎｇ、旬を成長調節剤として含７ａす
るに３培地である（Ｎａ８ｙおよびＭａｌｉｇａ、 Ｚ
、 Ｆ’ｒｌａ＋＋ｚｅｎ−ｐｌ＋ｙｓｉｏ１．７ ｉ
３（］ ９°７６）、 ４５３−／１５５）。この培地
はｐＨ５，６に調節し、０．２２μＩ１１の濾過膜を通
して滅菌する。２回目の洗浄の後、ｉ’ ｈｏ＋ｔ＋ａ
ｌｆｌ１球計算器（”Ａｓ５ｉｓＬａｎｔ”＋ Ｆ、
Ｒ，Ｇ、がら人′Ｆ−）を用いてプロトプラストを８１
測し、最外密度１１）５プロトプラスト１ＩｎＣとなる
様に培養培地に懸濁する。直径９ｃ＋＋＋の組織培養用
良質ペトリ皿当たりＨ，ｌＪの容量で゛プロトプラスト
を培養する。このペトリ皿をＦ’ｒｈｒａｆ ｉ Ｌｍ
Ｒでシールし、２パ１℃で、１１１“ｉ所次いでがすが
な光（５（’、１ （’３〜１０ ｏ ｏルックス）を
当てて２４時間インキュベートする。 ２ 、 ＝１．共生培養による形質転換分離５１」後に
プロトプラスト培養株を感染させる。ノ＼８ｒｏｂａｃ
Ｌｅｒｉｃｕｎ培養株を液体ＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ。 １’：ｘｐｅｒｉ＋＋＋ ｅｕＬ＊ ｉｎ Ｍ
ｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｇｅ＋＋ Ｑｔｉｃｓ（１９
’７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓｌ）ｒｉｎｇＨａｒｌ〕ｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。 Ｎｅｕ Ｙｏｒｋ）中で１８時開発Ｈさせ、２Ｘ］ｆ
＋”細胞７ｍ（′の密度となる様にに３ｍ首培地に山ｊ
５１濁する３、この懸濁液５０μＣを植物プロ）・プラ
ストｋｉ’ｒＵ組こ加え、Ｐａｒａｆ山誹でシールした
後・この培養株を２．３．と同し条件Ｆでインキュベー
トする。・１８時間後に培養株を１０ ＋ｎ ｆ４の遠
心管に移し、振動バケ′加−夕−に入れ、６０〜８（）
８で６分間遠心分８１［する。浮遊バンドおよびペレッ
トを東め、抗生物質（カルベニシリンＪ １．＋ ＋１
１１μ３ ／Ｉｌ＋ 、／’またはセ７才タキシム５０
０μｇ／’ｍ 、（’、 ）を補足したに３１ｊｊ地（
１’Ｊａ８ｙおよびＭａｌｉｇａ、 ７．、 Ｐｆｌａ
ｎｚｃｎ−ｐＨｙｓｉｏｌ、 ’７ ８ （１’：〕
７６ ）、 、１５’３−．１５５）Ｎ、１ｍ Ｃ’
にｉｔｉ懸濁する。 ２週間インキュベートした後、プロトプラスト−誘導マ
イクロカルスを遠心分離し、前記と同様の成長調節剤濃
度および抗生物質濃度で゛あるがシュクロー−又は（，
１、４Ｍの代りに（１，３Ｎ、’ｌで゛あるＫ ３培地
（Ｎａ８ｙおよびへ４ａｌｉ８ａ、 Ｚ、 Ｉ’ｆ
ｌａｎｚｅｎｌ＋ｌ＋ｙｓｉ。 １、’７８（１９７Ｇ）、４５３ 、ｉ、５５＞１こ
山）４濁１ンキユベートした後カルスを、前記と同じ抗
生物質濃度であるが、減少させた濃度のンユクロース（
ｏ、２Ｍ）と成長ｎ！Ｊ Ｉｊ剤（Ｎ八人□ 、 （、
ｌ ］ １ｌｌｉ；／（’、カイネチンＯ、（’ｌ ２
ｍＢ；’ ｆ’ ）を含むＫ ３培地に移す。 ２〜３週間のインキュベージクンの後、形質転換体と推
定されるらのは、その淡緑色の密な外観および、より良
好な成長度から認識することがで終る。これらのコロニ
ーを、 、−ヶ 、；″ −ｔ−、減少させた濃度の抗
生物質（カルベニシリン５００μｇ／−またはセフオタ
キシム２５（）μ８／１１Ｉで）を含むホルモン不含の
ぜ■粟訂秤＝■十母旧停曜藩中４ （Ｌ ｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ＋ 円＋ｙｓ
ｉｏｌ。 Ｐｌａｎｔ、 ］ ８（］ ９６５）、 １１’、ｌ
Ｏ−１２７）に移ｔｏ形質転換体と推定されるものが
直径約３−５１１１１＋１１に達した時、ホルモン不含
の培地で生育しているそれらにオパイン試験を施すこと
がでトる。各コロニーの半分を、オクトピンおよびツバ
リン（Ａｅ ｒ １． ｓら汀’Ｉａｎ１． Ｓｃ’
ｉ、” ＬｅＬＬ、 ］°７（１’、） ７９）。 ４３−５ ＋’、１ ）またはアゲａピンおよびマノピ
ン（１験により、ホルモン不含の培地で選択された形質
転換された性質のコロニーを確認することかでトる。そ
の後、選択されたコロニーを抗生物質不含の培地で培養
することがでとる。 生培養 形質転換細胞のｌ）の選択かでトない（例えば無期性Ｔ
”ＤＮＡミュータントを使つなため）場合、またはそれ
が必要でない場合（抗生物質耐性遺伝ｒ−の様な優勢な
選択し得るマーカーがｉ” −Ｄ Ｎ Ａに存在してい
る為）、プロトプラスト−誘導細胞の処理を簡略化する
ことができる（ホルモン減少工程はもはや必要でない）
。感染段階まで、プロトプラストを既述した様に処理す
る。細菌を加えて４８時間後にプロトプラスト−誘導細
胞を遠心分離しく６分、６０６０−８Ｏ、非常に低密度
で細胞の成長を維持することがでとるＡ Ｃ＋培地（Ｃ
ａｌｒｏｃｌ＋ｅ。 ＰｌａｎＬａ ｊ４９（］ ９８０）、７−］ ８）
に−ＩＩＱ、ｊ％濁する。Ｆ ｕｃｌ＋ｓ−Ｒｏｓｅｎ
Ｌｌ＋ａｌ計数チェインハ’ （＋１Ａｓｓｉｓｔａ
ｎｔ”＋ Ｆ、Ｒ，Ｇ、より人手）を使って計測し、以
下の操作に必要な密度になる様にｉｌｉ 懸濁する。オ
パイン試験のためにコロニーを個々に操作しなければな
らない場合は、低細胞密度←］＋ｎρ当たり１００プロ
トプラスト−誘導細胞および細胞コロ＝−）で植えつ（
すると、１力月のインキュベーションで大きい細胞コロ
ニーが得られる。形質転換細胞を薬物で選択で外る場合
は、細胞を高密度（１０３−１０４７＋ｎｌ！、 ）で
インキュベーＩ・し、各タイプの選択に最適となる時期
に、そして濃度で、その使用する選択剤を培地に添加す
る。 ２．６．カルス組織から全植物の再生 カルス糾織から正常植物を容易に得ることができる（例
えばプロドプラ又ト形質転換か呟または全植物接種から
（２，７参照）誘導する）。カルス糾織を、ｌ １ｌｌ
ｉ； ７’ｌｌｌ ＣのＢ Ａ Ｌ’を含んでいるＮ４
ｕｒａｓｈｉ８ｅａｎｄ ５ｋｏｏＢ培地で増殖させ
る二二の培地は１〜２力月後に新芽を形成させる。この
新芽をホルモン不含の培地に移し、根を形成させ、完全
な１１１物を−バらぜることかで外る。 ２ 、 ’７ 、タバコｉＷ木への腫瘍の誘導タバコの
種ｒ（例えば栽培品種Ｗ １ｓｃｏｎｓｉＩ＋ ：（
ｉｉ）の表面を７（）％変性エタノール／ＩＬ（、）て
′２分間、次いで１（）％の市販の標白剤と０．１％ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で゛処理して滅菌し、
更にｌ＆菌水で・５回洗浄する。この滅菌した種γ−を
、＃モむ大型試験管（幅２５ ＋ｎ＋ｎ）にまく。次い
でこの試験管を培養室（＋ ２ 、’＋１ ＋１ ＋、
１ルックス、１６時間照射／′；；時間非照射１．’７
０％相対湿度、２４°Ｃ）に入れてインキュベートする
。４〜６週間経つと植物は使用できる状態になる。少な
くともその後１カ月間は最適の状態を維持する。苗木は
少なくとも高さ３ｃ＋ｎになり、４枚またはそれ以上の
葉を持つはずである。新しい外科用メスで植物の最も若
い面間を通して横に頭部を切断針る。植物の上の部分を
５試験管から取り除と、火にかけたスパーチルで′平板
寒天培養から細菌を損傷表面に塗抹する。 野生をの場合は２週間後に、ある種の変性ミュータント
株の場合はちっと後に腫脹が現れる。、−の方法は＼タ
バコ（Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ １．ａｌ＋ａｃｕ＋ｎ
）、Ｎ１ｃｏ−１，１ａｎａ ｐｌｕ＋ｎｂａＢｉｎ
ｉｆｏｌｉａおよびＰｅ１．ｕｎｉａ ｂｙｂｒｉｄ
ａを接種するのに使われる。 以」二述べた如く、本発明はまず、野生型′１゛；プラ
スミド′のＴ−領域の腫瘍機能が欠落しているノ１イブ
リッド′ｌ゛１プラスミドを保持している１Ｘ８ｒｏ−
ｌ＋ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎで、植物を形質転換することを
可能ならしめたものである。′Ｆ１プラスミドから植物
細胞へのＤＮＡの転移に及ぼす′ｌ゛−領域の腫瘍（戊
能の影響は知られていないので゛、それで゛も石ケ所望
の遺伝子を含んでいる改良１゛−領域の植物細胞への転
移か起ることは驚くべきことである。この転移１’）
Ｎ Ａは植物細胞ゲノムに相互組込みされ、安定に保持
される。更に、選択した１１′ｉ望の遺伝子は、その遺
伝ｊ′−か適当なプロモーター配列を含んでいるか、あ
るいは含む様に組み立てられると発現することが゛でと
る。所望の遺伝子を含んで゛いる申開り０−ニングベク
ターと、特別に設計されたアクセプター１゛１プラスミ
ドとの間で単−乗換えを行わせるという本発明の思想は
、植物細胞の形質転換の為のハイブリッド゛ｌ゛ｉプラ
スミドベクターの糺み立てを著しく簡単なものにするも
のである。 この特別に設計されたアクセプター１゛１プラスミドは
、所望の遺伝子（これは中間クローニングベクターの一
部と同じであるがまたはこれに関連しているクローニン
グ媒体中に挿入されている）が！ｉｔ −乗換えによっ
て相互組込み体を形成することがで終る様に、通常のク
ローニング媒体の１：） ＮＡ上セグメント含んでいる
。このクローニング媒体の２つのセグメントが、組換え
の為に必要な相同領域を提供する。 本発明方法によって調製された微生物、中間クローニン
グベクター、アクセプター１゛１プラスミド、およびハ
イブリッドプラスミドベクターは、１９８３年１２月２
１比（ｌ ｅ ｒ ｌ＋、ａｎ Ｃｏｔ １ｐｃ１．
ｉｏｎｏｒＭｉｃｒｏｏｒＨａｎｉｓ＋ｎｓ（１）ＳＭ
）（（、ｉｏ（＋１．Ｉ団Ｈ；ｃｎ：ｌに寄託され、確
認された以Ｆの培養株で例示される：（１）Ｅｓｃｌ＋
ｅｒｉｃｂｉａ ｃｏｌｉ Ｋ Ｉ ２ ＩＩ Ｈ］
ｔｌ ］ ｒｌの中間ベクタープラスミドｐＡｅＲ１
３１（２）カルベニシリン耐性アクセプター′ロブラス
ミドｐｃｉ Ｖ ３８５ （，１を保有しているＡｐ、
ｒｏｂａｃｌ、（・ｒｉｕｍ Ｌｕ＋ｎｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｃ５＜’ｒ ＣＩ リファンピシン耐性株、 （３）Ｅ、’５ｃｂｔ・ｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ
Ｋ ］ ２株に５］４（１、Ｉ＋ｒ ｌｅｕ ｔｂ
ｉ ｌａｃ ｌ１ｓｄＲ）中の申開ベクタープラス
ミド１】（：＼’ ７ Ｃ１１１、（４）Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ Ｋ］２株に５１４（（３）
と同じ）中の中間ベクタープラスミド１）（ハ゛７５０
、 （５）カルベニシリン耐性アクセプター１゛１プラスミ
ド’１）ＧＶ ２２６ （，１を保有しているＡｇｒｏ
ｌ＋ａｃｔｅｒ１ｔｕｎ １．ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
Ｃ５ｉ３ Ｃ］ リファンピシン耐性株、 （６）Ｅｓｃｂｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１
２ ＨＢＩＩ）１中の、７パリンプロモーター支配
下のオクトビンシンターゼ暗号領域を保有している中間
ベクタープラスミドｐＮｏ−１、 （’７）中間ベクターのＡＨｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍへ
の摂動に使用された株二摂動プラスミドｌｌＣＮ Ｊ
２８およびＲ（ｉ□Ｉｄｒｄｌｌ（〜’Ｉｌ＋！ 、
Ｈａｕｌ、ｅら、ＥＭＢＣ） Ｊ。 ２（］ ９ ｊｉ ：Ｅ ）、 ｌｌ ］ に４１８
）を保有しているＧ、Ｊ２３； ＧＪ２３はＥｓｃｌ＋
ｅｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ Ｋ ］２、、）（１
２’：）２Ｇ、ＡＢＩ １５７のｒｅｃ、Ａ誘導１本で
ある（／１ｌｏｕ＋ａｒｄ −Ｆ １ａｎｄｅｒｓ呟Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ４．９（１９Ｇ４）、２３°７−２
４６）。 これらの培養株の受理番号は、それぞれ２７１ノ２（１
）、２ ’７ ’、） Ｆｉ（２）、２’７９Ｇ（３）
、２゛１９”ｊ（・１）、２°７！Ｊ９（５）、２）り
３３（Ｇ）、および２°７’：） 、Ｅ （’７ ）で
ある。 本発明の態様を色々と記述したが、その基本的な構成を
変化させれば本発明に係る方法および組成物を利用する
その池の態様か得られることは言うまでもない。
第１図はアクセプターＴｉプラスミドの模式図、第２図
および第３図はアクセプター゛１゛ｉプラスミドに挿入
される中間クローニングベクターの模式図、第４図はハ
イブリッドＴｉプラスミドベクターの調製法を示す模式
図、第５図は中間クローニングベクターの遺伝子転移過
程の概略を示す模式図、第６図はＡタイプの７クセプタ
ー１゛ｉプラ又ミドの組み立てを示す模式図、第°７図
は中間クローニングベクターの組み立てを示す模式図、
第８図は１３タイプのアクセプターＴｉプラスミドの組
み立てを示す模式図、第９図はＢタイプの７クセプター
′ｌ″ｉプラスミドに挿入される中間クローニングベク
ターの模式図、第１０図はハイ７リツドＴｉプラスミド
ベクターの組み立てを示す模式図、第１１図は５ 、２
ｋｂＨ１ｎｄｌ ＩＩフラグメントＡｃｇＢのＩＩＢ
Ｒ３２２への挿入を示す模式図、第１２図１、ｔｚバリ
ンＴ ｉ７’７スミＦ”ｐＧＶ ３８３９ノＴ−領域を
示す模式図、第１３図はアクセプターＴｉプラスミド１
＋（ｉ Ｖ ３８５０の組み立てを示す模式図、第１４
図は中間クローニングベクター１）に＼’７００の組み
立てを示す模式図、第１５図は中間クローニングベクタ
ーｐＣ： Ｖ ’７５０の（１１１造を示す１か式目、
第１６図は中間ベクター１）に＼・“７・１５の組みＳ
”ｆ、 −Ｃを示す模式図、第１７図はアクセプタープ
ラスミｈＧ Ｖ ２２６１１ノｊｌｌミ立てを示スト只
式目、第１８図はプラスミドｐＬＧＶ ２３８１の糾み
立てを示す模式図、第１９図はプラスミド１）ノ＼（Ａ
ｕ（）の組み立て、およびその、プラスミド１往５（：
＼゛２３８１への挿入を示す模式図、第２０図はオクト
ピンシンターゼ遺伝子暗合化領域と融合する前後の７パ
リンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域の周囲のヌク
レオチド配列を示す模式図である。 特許出願人 マックス・ブランク・ ゲゼルシャフト・ツア・ ７エルデルング・デア・ ヴイッセンシャ７テン・ニー・ ７アウ 代理人 弁理士青山葆外１名 Ｆｉｇ、４ ■ Ｆｉｇ、５ Ｆｉｇ、 ７ Ｆｉｇ、 １０ Ｆｉｇ、 １２ Ｆｉｇ、 １３ ρ６■０Ｏ２０１０５ｖ１１２ ２Ｆｉ、１７ （ＣＩ２ Ｎ ５１００ Ｃ１２Ｒ１／９１ ） ０発 明 者 ジョセフφニス・シェルドイツ連邦共和
国ケルン３０デ ー −５０００番 ＠ｌ！ 間者 ジャン・ビニール・ニー・ツ工−・
ヘルナルシュテーンズ ベルギー国ブリュッセル・ベ 一−１１５０番 ０発 明 者 マーク・チャールズ・ヴアン・モンタギ
ュー ベルギー国ブリュッセル・ベ −−１０５０番 ■発明者 ルイス・ラフアニル・ヘレーラ・エストレ
ラ ベルギー国ジエント・ベー−９０ ００番 、ゆ発 明 者 ジャン・ジョセフ・アウグスト・リー
マンズ ベルギー国ボンハイデン・ベ −−２９２０番 手続補正書（帥）′ 昭和５°禅 ２月１；稍」 特許庁 艮 宜 殿 １事件の表示 昭和５ ｐ）年特許願第 ５５１２ 号２、発
明の名称 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法３補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 ドイツ連邦共和国３・・↓旧）ゲッティンヶ゛ン
、７ンゼンシユトラ一セ１０番 名称 マックス・ブランク・ケ゛セ゛ルシャフ）・・
ツア・フェルテ゛ルング・デア・ヴイッセンシャフテン
・ニー・７アラ４代Ｉ１１人 住所 大阪府大阪市東区本町２〜１０ 本町ビル内６
補正の対象：明細書の全文 ゛ｉ、補１１：、の内容：別紙の通り 明細書 １、発明の名称 植物細胞ゲ／ノ、への発現可能な遺伝ｆの導入法２、特
許請求の範囲 １、 （ａ）野生型′Ｉ″ｉプラスミドのｉ” １ｉ
ｒｌ域の２つの境界配列（１）および（２）、 （ｂ）単一乗換えがｎ（能な中間クローニングベクター
中のＤ’Ｎｉ〜配列の少なくとも１部と相同な■）ＮＡ
配列を含む２つの境界配列の開に設置バされたクローニ
ング媒体由来の非腫瘍性Ｌ） ｌ’Ｊ Ａセグメント（
３）、および （ｃ）ＡＨｒｏｂａｃ’１．、ｃｒｉｕｍによる、野生
型′Ｉ゛１プラスミドの′１゛−領域の植物細胞ゲノム
中への転移に必須であるＤ Ｎ Ａ、配列を含んでいる
野生４１；！ ｌ’ ｉプラスミドのセグメント（４） と含んでいるアクセプター′１゛ｉプラスミド。 ２、（ａ）Ｔ−領域およびｉ’−領域の２つの境界配列
を持たない野生型′１゛１プラスミドのＤ Ｎ Ａセグ
メント（４）、および （、ｂ）野生型ｉ’ ｉプラスミドの′ｌ゛−領域の２
つの境界配列を含んでいる中間クローニングベクターの
ＤＮＡ配列と相同なりローニング媒体由来のＤＮＡ配夕
ＩＩ（３） を含んで′いるアクセプターＴｉプラスミド。 ３、（ａ）少なくとも１つの所望の遺伝子（５）、およ
び （ｂ）特許請求の範囲第１項に記載のアクセプターＴｉ
プラスミド中のＤＮＡ配列と相同なりＮＡ配列を含んで
いるクローニング媒体セグメント（３′） を含んでいる中間クローニングベクター。 ４、 （ａ）野生型Ｔｉプラスミドの１゛−領域の２つ
の境界配列（１）および（２）、並びに特許請求の範囲
。 第２項に記載の７クセブターＴｉプラスミド中のＤ Ｎ
Ａ配列と相同なりＮＡ配列を含んでいるクローニング
媒体セグメン）（３’）、および（ｂ）その２つの境界
配列の開に設置された少なくとも１つの所望の遺伝子（
５） を含んでいる中間クローニングベクター。 ５、所望の遺伝子（５）に隣接して少なくとも１つの選
択可能なマーカー遺伝子を更に含有している特許請求の
範囲第３項または第４項に記載の中間クローニングベク
ター。 ６、所望の遺伝子（５）がその天然のプロモーターの支
配下にあることを特徴とする特許請求の範囲第３項また
は第４項に記載の中間クローニングベクター。 ７、所望の遺伝子（５）が外来性プロモーターの支配下
にあることを特徴とする特許請求の範囲第３項または第
４項に記載の中間クローニングベクター。 ８、ヘルパープラスミドの存在下で特許請求の範囲第３
項〜第７項のいずれかに記載の中間クローニングベクタ
ーを特許請求の範囲第１項または第２項に記載の７クセ
プターＴｉプラスミドを含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕ＋ａに摂動せしめ、その中間クローニングベクタ
ーと７クセプターＴｉプラスミドを単一乗換えにより相
互組込みさせることからなるベクター組成物の調製法。 ９、 （ａ）野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域の２つの
境界配列（１）および（２）、 （ｂ）クローニング媒体由来の非腫瘍性ＤＮＡセグメン
ト（３）および（３゛）、および（ｃ）Ａｇｒｏｂａｃ
Ｌｅｒｉｕｍにより、野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域
を植物細胞ゲノム中に転移させるのに必須であるＤＮＡ
配列および２つの境界配列（１）および（２）の間に設
置された少なくとも１つの所望の遺伝子（５）を含んで
いる野生型Ｔｉプラスミドのセグメント（４） を含んでいるハイブリッドＴｉプラスミドベクター。 １０、所望の遺伝子（５）に隣接して、少なくとも１つ
の選択可能なマーカー遺伝子を更に含有している特許請
求の範囲第９項に記載のハイブリッドＴｉプラスミドベ
クター。 １１、所望の遺伝子（５）がその天然のプロモーターの
支配下にあることを特徴とする特許請求の範囲第９項に
記載のハイブリッドＴｉプラスミドベクター。 １２、所望の遺伝子（５）が外来性プロモーターの支配
下にあることを特徴とする第９項に記載の／％イブリッ
ドＴｉプラスミドベクター。 １３、特許請求の範囲第９項〜第１２項のいづれかに記
載のハイブリッドＴｉプラスミドベクターを保持してい
るＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ａ。 １４、特許請求の範囲第１３項に記載のノ１イブリッド
Ｔｉプラスミドベクターを保持しているＡｇｒｏ−ｂａ
ｃｔｅｒｉｕＩｌｌで植物細胞を感染させることからな
る形質転換植物細胞の調製法。 １５、特許請求の範囲第９項〜第１２項のいづれかに記
載のハイブリッドＴｉプラスミドベクターの２つの境界
配列（１）および（２）の間に設置されたＤＮＡセグメ
ントを、そのゲノム中に組込んで含有している形質転換
植物細胞。 ３、発明の詳細な説明 本発明は組換え分子、その調製法、植物細胞へのその導
入法、お上びゲノム中に外米ＤＮＡ配列を含んでいる植
物細胞またはその植物に関する。 更に詳しくは、本発明は適当な宿主植物細胞中で発現さ
れるＤＮＡ配列に関する。本発明に係る組換えＤＮＡ分
子は、植物の成長、栄養物としてのその品質の改良、ま
たは有用な代謝物（例えばアルカロイドあるいはステロ
イドの前駆体）の生産、に有用なアミノ酸やポリペプチ
ドの如き生産物を暗号化している配列を有することをそ
の特徴としている。 以下に本明細書で使用する用語について説明する。 ｂｏｍサイト 特異的に約す機能体が相互作用して自律
的ＤＮＡ転移移動を開始させるＤ Ｎ Ａ領域境界配列
Ｔ −Ｄ Ｎ Ａの末端を含むＤＮＡ配列広範囲宿主
レプし壬？ 多種多様の宿主細胞に、転移（トランスフ
ァー）され、保持され得るＤＮＡ分子 Ｉルス組織 未組織、未分化の細胞の塊２隻二三ング
無性生殖によ１）、１個の生物またはＤ Ｎ Ａ配列か
ら一部の該生物またはＤＮＡ配列を得る操作過程、また
は、よりわかり易く言えば、特定の生物またはその一部
を分離し、そのサブ７ラクシタンを均質な集団として増
殖させる操作過程 クローニング媒体 宿主細胞中で複製し得るプラスミド
、７アーシ゛ＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であって
、そのＤＮＡ配列は、例えば複製、外殻蛋白質の生産な
ど、そのＤＮＡの必須の生物学的機能、あるいはプロモ
ーターまたは結合部位を刊随的に失なうことなく、その
場所で正確にその配列を切断することのできる１個また
は少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を持っており、ま
た、それが導入された細胞（形質転換された細胞）を同
定確認するのに有用なマーカー（例えばテトラサイクリ
ン耐性あるいはアンピシリン耐性）を持っていることで
特徴づけられる。クローニング媒体は、しばしばベクタ
ーとも呼ばれる。 賭号配刀 ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するＤＮ
Ａ配列 相 組込み体（コインテグし１１２個の環状ＤＮＡ分子
開の単一交叉により得られる構造体−Ｌ２２１１ｉｔ性
他のレプリコンに物理的に結合していないＤＮＡ分子
（＋／プリコン）が、その結合していない他のレプリコ
ンにとって必要かつ欠落している拡散性物質を供給する
ことができる過程 兼介（コンジュゲーション） 細胞同志の接触により、
１つのタイプの細菌から・池のタイプの細菌にＤ Ｎ
Ａが転移すること 米換え 相同なりＮＡ配列間で遺伝物質が交換すること 欠損置換 １個のＤＮＡ配列が除去され、その代りとし
て異なったＤ Ｎ Ａ配列で置換されること分化 ある
細胞の子孫が特殊な構造と機能を獲得し、更にそれを維
持すること Ｄ Ｎ Ａ配列またはＤ Ｎ、 Ａセグメント 隣接す
るペントースの３゛位と５゛位の炭素間の燐酸ジエステ
ル結合により互いに連結したヌクレオ４１群の一直線の
配列 ４、來傍 相互組込み（コインテグレート）構造が２個
の環状ＤＮＡ分子に分解する過程。この過程は遺伝情報
を交換するのに利用される。このＤＮＡ環状体の一方は
、゛それによって組換えが生じ得る標的ＤＮＡと相同な
２つの領域を持っており、この２つの領域は、標的ＤＮ
Ａと交換される非相同ＤＮＡ配列をはさんでいる。もし
１回目の交叉と２回目の交叉が同じＤＮＡ領域で起ると
、ちとのＤＮＡ環状体が生成する。この２回目の交叉が
第２の相同領域で起ると、２つの環状体の開で遺伝子の
交換が起ることになる。 １現 構造遺伝子によりポリペプチドが生産される過程
。これは転写と翻訳の組合せである。 発現調節（コントロール）配列 構造遺伝子に有効に結
合された場合、それらの構造遺伝子の発現を調筋し、統
制するヌクレオチド配列 Ｆ型プラスミド Ｆ因子（Ｆはｆｅｒｔｉｌｉｔｙ（生
殖 □力））を持ったプラスミドであって、Ｆ因
子を持だない宿主に該プラスミドのコピーを移入するこ
とのできるプラスミド 遺伝子 ２つの部分、即ち（１）遺伝子生産物のための
暗号配列および（２）その遺伝子が発現されるかどうか
を調節しているプロモーター領域内の配列、から構成さ
れているＤＮＡ配列 グＡム 細胞またはウィルスの全ＤＮＡ。これは、まず
ポリペプチドを暗号化している構造遺伝子、更にオペレ
ーター、プロモーター、リボゾームの結合配列および相
互作用配列（たとえばＳｔ山１ｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配
列）を含んでいる。 清仏子型 ある生物に含まれている遺伝情報の全て 相同的（性）組換え 相同配列を含んでいるＤＮＡ上の
２つ領域間の組換え Ｉ型プラスミド Ｆとは異なる不和合性グループの一部
の自律転移性プラスミド １）」 選択圧（ｓｅｌｅｃＬｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒ
ｅ）がないと、同一の細胞に２個のＤＮＡが共存し得な
いこと 延入 あるＤ Ｎ Ａ配列を、別の分子のＤ Ｎ Ａ配
列内にｆ１カーけること セダー配列 ５゛末端から最初の構造遺伝子の先端に至
るまでの＋ａＲＮＡ上の領域。これには構造遺伝子の暗
号配列の翻訳を開始するのに重要な部位が含まれている
。 減数分裂 はじめの４ｎ個の染色体が、２回の連続した
分裂により生成した４個の細胞のそれぞれにＩｎ個ずつ
分布するようになる過程。この過程は有性生殖に於いて
重要である。 ｎ＋ｏｂ （摂動機能体） ｔｒａ機能体との組合せ
に於いてのみＤＮＡの転移を促す一連の生成物。ｍｏ
ｂはｂｏｍサイトを含んでいるプラスミドの移動を促す
ことかで外る。 摂動（モビリゼーシａン）別の細胞へ転移することので
きないＤＮＡ分子が、池のＤＮＡ分子の助けを借りて転
移する過程 摂動ヘルパープラスミド 他のプラスミドが持っていな
い、別の宿主細胞へ転移するための拡散性生成物を供給
することかできるプラスミド非接合性組換えプラスミド
細胞同志の接触によ」）、それ自体では、もとの宿主
細胞から池の宿主細胞へ転移することかできないＤＮＡ
分子。転移するには、他のＤＮＡ、例えばヘルパープラ
スミドによって供給される機能体が必要となる。 ヌクレオチド 糖部分（ペントース）、燐酸エステルお
よび含窒素異項環塩基から構成されているＤ Ｎ Ａま
たはＲＮＡの単量体単位。この塩基は糖部分とグリコシ
ド結合で連結しており（ペントースの１゛位の炭素）、
この塩基と糖とが結合したものがヌクレオシドである。 ヌクレオチドの特性はこの塩基によって決まる。ＤＮＡ
の４個の塩基はアデニン（“Ａ″）、グアニン（“＊
に ｕ ）、シトシン（“Ｃ゛）およびチミン（“１’
” ）である。ＲＮＡの４個の塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよ
びウラシル（Ｕ゛）である。 ＊ＴＡ）３質 発育環境と遺伝子形質との相互関係によ
って生成する個体の観察し得る特性プラスミド それ自
体が宿主細胞中で複製される、完全な（無傷の）レプリ
コンからなる非染色体性の２本鎖ＤＮＡ配列。このプラ
スミドを単細胞生物に入れると、そのプラスミドのＤ
Ｎ Ａによって、その生物の性質が変わる、即ち形質転
換される。例えば、テトラサイクリン耐性（ＴｃＲ）の
ための遺伝子を持ったプラスミドにより、本来はテトラ
サイクリンに感受性のある細胞が耐性のある細胞に形質
転換される。プラスミドによって形質転換された細胞を
形質転換体と呼ぶ。 ポリペプチド 隣接するアミノ酸どうしがａ−アミノ基
とカルボキシル基とのペプチド結合により互いに連結し
た線状のアミノ酸連鎖 プロモーター領域 遺伝子の転写を統制している、暗号
配列の開始点より上流のＤ Ｎ Ａ配列プロモーター配
列 ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列であり、ポリメ
ラーゼはそれより下流の配列の忠実な転写を促進する。 組換えＤＮＡ分子または雑種（ハイブリッド）Ｄ易 少
なくとも２個のヌクレオチド配列からなり、その一方の
配列は、自然界では通常第２の配列と共存しない、その
様な配列からなる雑種のＤＮＡ配列 別換え ＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の一部分の新しい
結合体を創製すること 相同領域 ＤＮＡの別の領域に於ける配列と同じＤＮＡ
配列を持っているＤ Ｎ Ａ領域レプリコン ＤＮＡの
複製開始サイトオよび複製を支配するのに必要な機能を
指定している遺伝子を持った自己複製遺伝子単位 糾１人之グメント 特定の標的ＤＮＡ配列を認識する酵
素による２本鎖開裂によって生じるＤＮＡ分子 」Ｎへポリメラー￥ Ｄ Ｎ ＡのＲＮ Ａへの転写を
つかさどる酵素 洒択可囮ｔヱユ久ユ遺伝子 あるＤ Ｎ Ａ配列であっ
て、それがある細胞内で発現された時、その１’） Ｎ
Ａ配列を含んでいない細胞より増殖しやすい有利性を
その細胞に与えるＤＮＡ配列。細胞を適当な選択的増殖
培地に置くと、この２つのタイプの細胞を区別すること
ができる。通常使用される選択可能なマーカー遺伝子は
抗生物質耐性を暗号化している遺伝子である。 単一乗換 ２個の環状Ｄ Ｎ Ａ分子を組換えて、相互
組込みされた大きい環状体を形成させる操作過程 構潅遺仏子 ポリペプチドを暗号化している遺伝子 エニＤ Ｎ Ａ 植物細胞ゲノムに安定に組込まれる
ことが見い出されているＴｉプラスミドの部分子−領域
植物細胞ゲノムへ転移するＤ Ｎ Ａ配列を含んでい
るＴｉプラスミドの部分 子ｉプラスミド 感受性植物に腫脹（クラウンガル）を
誘発させるだめの遺伝情報を含んでいるＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕ＋＋＋ ｔｕ＋ｎｅｒａｃｉｅｎｓ株に存在
する大きいプラスミド Ｔ Ｌ −Ｄ Ｎ ＡおよびＴＲ−ＤＮＡ オクトピ
ンクラウンガル腫脹細胞は２つのＴ −Ｄ Ｎ Ａ配列
、即ち左Ｔ −Ｄ Ｎ Ａ （ＴＬ −Ｄ Ｎ Ａ）お
よび右Ｔ −ＤＮ Ａ（Ｔ Ｒ−ＤＮ Ａ）全含有し得
る。ｉ’ Ｌ −Ｄ Ｎ Ａはツバリン腫脹細胞のＴ−
ＤＮＡと共通している配列を持っているがＴＲ−ＤＮＡ
は持っていない。 ｔｒａ （転移機能（体刀 プラスミドに暗号化されて
いる拡散性の生成物、および細胞間のＤＮＡ転移の際に
利用される作用部位の両者を指す。例えば２つの細胞の
間に橋を作るのに必要な生成物およびＤＮＡ転移が開始
する部位。 電防 構造遺伝子からｍ ＲＮ Ａが生産される過程、
または、塩基対（ベースペア）の形成により、Ｌ’）
Ｎ Ａに含まれてい□る遺伝情報に基外それに相補的な
塩基配列をもつＲ’ＮＡ鎖が形成される過程形質転換
細胞のＤＮＡ補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に外米性Ｄ
Ｎ Ａが導入されることによって生じる遺伝的修飾 ＩＩＩ？ ＋ｎＲＮＡからポリペプチドが生産される
過程、あるいは、＋ｎ”ＲＮ Ａ分子に存在する遺伝情
報が、ポリペプチド合成において特定のアミノ酸の順序
を指定する過程 非分化表現形質 いかなる特異な部分もなく、組織中の
細胞の外観が均一であること ベクター 異なった宿主細胞間を転移するように設計さ
れたＤＮＡ分子 組換えＤＮＡ技術の進歩によって、微生物の遺伝子工学
に新たな展望が開けた。もし１個の体細胞から、完全な
生物を再生することができた呟これらの技術は多細胞真
核生物にまで広がるであろう。ある種の高等植物の細胞
は、優れた再生能力を有し、従って高等生物の遺伝子工
学にとってかっこうの材料となる。 植物の遺伝子工学の主たる問題点は、外米性ＤＮＡを植
物ゲノムに導入する為の系の利用性にある。この様な系
には、ダラム陰性土壌細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ Ｌｕ＋ｎｅｆａｃｉｅｎｓが持っている腫脹誘起（
Ｔｉ）プラスミドがある。この微生物は、広範囲の双子
葉植物の損傷組織に、クラウンガル（ｃｒ。 ｗｎｇａｌｌ、冠状コブ）と呼ばれる腫脹性形質転換を
引き起す原因となることがわかっている。この増殖性の
腫脹は、オパイン（＋）ｐｉｎｅｓ）と呼ばれるＴｉに
特異な新しい代謝物を合成する。この形質転換は、分子
レベルでみると、Ｔｉプラスミドの実体のはっきりわか
っているＴ −Ｄ Ｎ Ａ （転移Ｄ−ＮＡ）フラグメ
ントが植物細胞ゲノムに転移して安定に組込まれたこと
によって起る。換言すれば、クラウンガル腫脹は、その
染色体ＤＮＡに、腫脹セルラインをもたらしたＴｉプラ
スミド中のり、ＮＡＡ配列相同のＴ−ＤＮＡと呼ばれる
Ｄ Ｎ Ａセグメントを含んでいる。あらゆる場合に於
いて、このＴ−ＤＮＡは、連続した一連のＴｉプラスミ
ドＤＮＡに相当しており、また、これと共直線性である
。 従ってこれはＴ−領域と呼ばれる。 Ｔｉプラスミドはクラウンガル細胞で合成されたオパイ
ンのタイプによって分類される。クラウンガル細胞でツ
バリン［Ｎ−α−（１，３−ジカルボキシプロビル）−
Ｌ−フルギニン１の合成を惹起させるＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ株はツバリン株と呼ばれ、オクトピン［Ｎ−
α−（Ｎ−１−カルボキシエチル＞−ｔ、−フルギニン
１を合成するものはオクトビン株と呼ばれる。これらが
最も普通に用いられるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ１０株
である。 植物の遺伝手術にｒ−ＤＮＡをベクターとして使用する
試みがモデル実験で行なわれた。この実験では、インビ
ボにおいて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎ ’ｒ３
７株のＴｉプラスミドからのＴ−ＤＮＡの右側境界部の
近くに１４ｋｂ細菌性トランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏ
ｓｏｎ） Ｔｎ ７が挿入された。すると、このＴｉプ
ラスミドを持っているアゲロバクチリアによって惹起さ
れる腫脹中のツバリン合成が消滅した。更に、サザーン
・プロッティング・ハイブリディゼーションの結果、そ
の様な挿入を行なわなけれぼ正常であるＴ−ＤＮＡ配列
の一部分として、この腫脹の染色体ＤＮＡ中に全Ｔｎ７
が存在することがわかった（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ
呟Ｎａｔｕｒｅ２８７（１９８０）、６５４−６５６；
Ｈｏ１ｓｔｅｒｓら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎ
ｅｔ、 １８５ （１９８２） 、２８３−２８９）
。この様に、２３ｋｂＴ−ＤＮＡに１４ｋｌ＋ＤＮＡ７
ラグメントを導入しても、２３ｋｂＴ−ＤＮＡの植物細
胞ゲノムへの転移能力に変化は見られなかった。 ７８９７株、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎＴ ３７の
ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界部は非常に正確に調
べられている。これは全ツバリンＴｉプラスミドの極く
一部、約２３ｋｂに過ぎない。更に、このＴ−ＤＮＡの
境界部は知られている：即ち、この′ｒ−ＤＮＡの境界
部を決めているヌクレオチド配列が調べられ、ツバリン
１゛ｉプラスミドの同じ領域と比較された（ Ｚ ａＩ
ＩＩｂｒｙｓｋ ｉら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０９ （１
９８０）ｒ １３８５−１３９１；Ｚａｍｂｒｙｓｋ
ｉら、Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、
１’（１９８２）、３６１−３７０ ）。このＴ−領域
の境界部が、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの組込みに
最も関係している様である。 ＤＮＡを植物細胞へ転移させる為のベクターとしてＴｉ
プラスミドを使用するには、転移したＤＮＡの境界部を
決めているＴ−ＤＮＡ配列を知ることが基本的に必要で
ある。そうすれば、外米性ＤＮＡをこの境界内に挿入し
、確実に植物細胞ゲノムヘ転移させることができる。更
に、この系を利用しようとすれば、形質転換された植物
細胞が、その生育特性において腫瘍の性質を持たず、正
常であるということが重要である。Ｔ−ＤＮＡ転移の後
、正常細胞を生産するには、Ｔ−ＤＮＡ自体によって暗
号化されている機能を知る必要がある。 従って、どの領域が腫瘍表現形質に関係しているか調べ
るために、ＴｉプラスミドのＴ−領域の徹底的な遺伝子
分析が行なわれた。 Ｔ−ＤＮＡは、クラウンガル表現形質の原因となる機能
体を暗号化している。その遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡの特定
の領域に局在化している（ ＬｅｅｍａＩＩｓ呟ＥＭＢ
ＯＪ、［１９８２）、１４７−１５２ ； Ｗｉｌｌｍ
ｉｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、ｊ（１９８２）、１３９−
１４６ ）。一般に、腫瘍カルス組織の非分化表現形質
を寞配している少なくとも４つの遺伝子が存在している
。これらの遺伝子の突然変異体（ミュータント）は、新
芽様のあるいは根の様な外観の形質転換組織を形成させ
ることができる。この後者の成果は、腫瘍組織ではなく
正常植物組臓中で発現させる為にＤＮＡを植物に転移し
たいと思う場合には特に重要である。 最近、完全な正常植物に再生することができる形質転換
新芽を誘導するＴｉプラスミド変異体がみつかった。こ
れらの植物は繁殖力が旺盛であり、減数分裂によっでＴ
−ＤＮＡ特異配列を伝達することさえした：即ち、子孫
の植物もＴ−ＤＮＡ特異配列を含んでいた（ ０ｔＬｅ
ｎ呟Ｍｏ１．Ｇｅｎ。 Ｇｅｎｅｔ、 １８３（１９８１）、 ２０９−２１
３ ）。 しかし、この形質転換植物組織は、その染色体ＤＮＡ中
に、腫瘍表現形質を支配しているＴ−ＤＮＡ領域が除去
さ□れる大がかりな欠損が発生したことにより、著しく
小さくなったＴ−ＤＮＡを含んでいた。この欠損が当初
の形質転換時に起ったのか、新芽の形成をもたらすその
後の過程で起ったのかは不明である。 Ｔｉ プラスミドは太きく（２００ｋｂ）、そのＴｉプ
ラスミドの種々の場所に存在している多くの遺伝子が植
物の形質転換に関係している。従って、］゛−領−領域
切な場所に特殊なエンドヌクレアーゼ認識サイトを有し
、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させて安定に挿入
するのに必要な全ての機能を持ったＴｉプラスミミド由
来小型のクローニングベクターを組み立てることは不可
能である。所望のＤＮＡ７ラグメントを゛ｒｉプラスミ
ドの′ｒ−領域の特定の制限酵素開裂サイトに導入する
為の既知の方法の１つは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｌ＋ｉａ
ｃｏｌｉ（大腸菌）におけると同様、ＡｇｒｏｂａｃＬ
ｅｒｉｕｍｌにイても複製することかでき、Ｔ −Ｄ
Ｎ Ａの所望の制限７ラグメントを含んでいるクローニ
ングプラスミドを組手立てることである。この様なりロ
ーニ、ングベクターは「中間ベクター］と命名された。 この様な中間ベクターは、Ｔ−領域によって暗号化され
ている機能を分析するのに使用された（ Ｌｅｅｌｆｌ
ａｌｌｓ ら、Ｊ、 ＭＯ＋、ＡＩ）＋１１１１．
Ｇｅｎｅｔ、１ （１９８１）、１４９−１６４）
。 本発明は、発現し得る遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入す
る方法に関するものである。本発明の１つの目的は所望
のあらゆる遺伝子（群）を導入することのできる改良さ
れたアクセプターＴｉプラスミドを提供することにある
。導入される所望の遺伝子（群）は、そのアクセプター
Ｔｉプラスミドの相当する領域と相同の領域を持った新
規な中間クローニングベクター内に含まれている。この
中間クローニングベクターを提供することも本発明の目
的の１つである。 所望の遺伝子（群）の７クセプクーＴｉプラスミドへの
導入は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに保持されている
アクセプター′「１プラスミドと中間クローニングベク
ターの２つの相同ＤＮＡセグメントの間で起る単一乗換
えによって達成される。この中間クローニングベクター
は、ヘルパープラスミドを使って、それが増殖するＥｓ
ｃｂｅｒｉｃｂｉａ ｃｏｌ ｉがらＡｇｒｏ−ｂａｃ
Ｌｅｒｉｕ＋ｏに摂動される。この様なヘルパープラス
ミドおよび摂動のための機能は知られている（■゛盲１
１１１ｅ８１１１＋１ ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔ、 １８５ （１９８２）、３４４−
３５１）。 Ａ ｇｒｏｂａｃ Ｌｅｒ ｉ ｕｕ＋での単一乗換え
の結果、ハイブリッドＴｉプラスミドベクターが得られ
る。この □様なハイブリッドＴｉプラスミドも本発明
の目的の１つである。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに保持されたこのハイブリ
ッドプラスミドベクター（以降、ベクター組成物という
）を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所望の遺伝子
生成物の発現についてスクリーニングする。植物細胞を
ベクター組成物で感染させて形質献換稙物細胞を調製す
るこの方法、その形質転換された植物細胞、およびそれ
から発生した植物を提供することも本発明の目的である
。この技法はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの植物転移性
のプラスミド全てに適用することができる。 以下に添付の図面について詳細に説明する。 第１図は、境界配列（１）および（２）を除き、Ｔ−領
域の内部部分を除去して得られる本発明の７クセプター
Ｔｉプラスミドの１態様を示している。 この境界配列は、Ｔ−領域を植物細胞ゲノムに組込むの
に必須である。境界配列（１）と（２）の間の領域（３
）が、植物に転移されるであろうＤＮＡセグメントであ
る。このアクセプターＴｉプラスミドは、中間クローニ
ングベクターを単一乗換えによって組込ますことを可能
にしている中間クローニングベクター内のＤＮＡ配列の
少なくとも一部と相同のＤＮＡ配列を持ったＤＮＡセグ
メント（３〜 ）を含んでいる。Ｔｉプラスミド領域（４）は、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒ＋ｕｍによってＴ−領域が植物細胞ゲノ
ムに転移するのに必要な機能を暗号化している。この領
域は、ｖｉｒ−領域と呼ばれる。 第２図は、単−乗換えによって第１図のアクセプターＴ
ｉプラスミドに挿入される本発明の中間クローニングベ
クターを示している。このベクターは、所望の単一乗換
えを可能にするアクセプターＴｉプラスミドのＤＮＡセ
グメント（３）の少なくとも一部と相同なりＮＡ配列を
持ったクローニング媒体ＤＮＡセグメント（３゛）を含
んでいる。 更に、この中間クローニングベクターは、その天然のプ
ロモーター配列を備えた遺伝子あるいは遺伝子群（５）
を含んでいる。この組み立てに於いては、一般に植物の
遺伝子を使用することができる。 それは、他のものに比較して発現され易いと思われるか
らである。しかし、原理的には、全ゆる所望の遺伝子を
挿入することがで外る。この中間クローニングベクター
は選択マーカー遺伝子（６）を含んでいてもよい。この
遺伝子は、植物細胞中でこの遺伝子の発現を可能にする
プロモーター配列を含んで゛いな（すれは゛ならない。 このマーカー遣１云子を含んでいる植物細胞は、それを
含んでいない細胞より、成長の選択有利性を持っていな
ければならない。何故なら、この様にして、このマーカ
ー遺伝子を含んでいるＤＮＡによって形質転換された植
物細胞を、非形質転換細胞と区別することができるから
である。 第３図は、第２図の中間クローニングベクターと類似の
、第１図のアクセプターＴｉプラスミドに単一乗換えに
よって挿入される本発明に係る中間クローニングベクタ
ーのもう１つの態様を示している。これは、クローニン
グ媒体ＤＮＡセグメン）（３’）、所望の遺伝子の統制
のとれた発現を可能にする外米性プロモーター配列（８
）、および、所望により、マーカー遺伝子（６）を含ん
でいる。 第４図は、第１図の７クセプターＴｉプラスミドおよび
第２図並びに第３図の中間クローニングベクターからの
、単−乗換えによる本発明に係るハイブリッドＴｉプラ
スミドベクターの調製を示す模式図である。 第５図は、Ｅ、 ｃｏｌｉから７クセプターＴｉプラス
ミドを含んでいるＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ１１ヘノ、
中間クローニングベクターの遺伝子転移に関する諸過程
を概略したものである。第１段階は、中間クローニング
ベクターを含んでいるＥ、 ｃｏｌｉ株（１）と、その
後のＡｇｒｏｌ＋ａｃｔｅｒｉｕｍとの接合の為の２つ
のヘルパープラスミドを含んでいるもう１つのＥ、 ｃ
。 １１株との接合である。１方のヘルパープラスミドはプ
ラスミド転移に重要なりＮＡ配列（ｔｒａ）を含んでお
り、池方のヘルパープラスミドは摂動に重要な配列しｏ
ｂ）を含んでいる。接合によってこれらのヘルパープラ
スミドがＥ、 ｃｏｌｉ株（１）に導入されると、そこ
に含まれている中間クローニングベクターが池の細菌株
へ転移することができる様になる。ＬｒａおよびＩＩＩ
ｏｂヘルパープラスミドは、中間クローニングベクター
が持っている抗生物質ｉｌｌママ−（ＡＩ）”）トＪ、
ｔＭナルマーカー、Ａｂｒ２およびＡｂｒ３をそれぞれ
持っている。従って、全てのプラスミドが存在するかど
うかを選択培地上でモニターすることができる。こうし
て摂動株（３）が得られる。この摂動株（３）を、第１
図の７クセプターＴｉプラスミドを含んでいるＡ、 Ｌ
ｕｔｏｅｆａｃｉｅｌｌｓ株（４）と接合させ、中間ク
ローニングベクターの抗生物質耐性マーカーで選択する
。中間クローニングベクターはＡ ｇｒｏｂａｃ ｔｅ
ｒ ｉ ｕＩＩＩ中で複製できないので、受容アクセプ
ターＴｉプラスミドと相互組込み体を形成した場合にの
み、保持されることができ゛る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ中のこの相互組込み構造体（５）が、ＤＮＡを植
物細胞ゲノムに転移させるのに使用される最終的なハイ
ブリッドＴｉプラスミドである。 第６図は、第１図に示したものと同類のモデルアクセプ
ターＴｉプラスミド（タイプＡ）の組み立てを示してい
る。ここでは、Ｔｉプラスミドと、このもとのＴ１プラ
スミドの一部と置ぎ換わるＤＮＡ配列を含んでいる別の
プラスミドとの間で、二重乗換え−が起る。より具体的
に述べると、小さい方のプラスミドはクローニング媒体
（３）の中にＴ−領域の境界配列（１，２）を含んでい
る。二重乗換えの結果、Ｔ領域の内部の１部分が除去さ
れ、代ってクローニング媒体で置き換えられる。得られ
たアクセプター′１゛ｉプラスミド（Ａ）は、境界配列
（１，２）の間に含まれているＤＮＡを植物細胞ゲノム
に転移させることができる。得られた、形質転換された
ＤＮＡは、Ｔｉプラスミド（Ａ）では腫脹の増殖を支配
している遺伝子が除去されているので腫瘍性のクラウン
ガル組織をつくらない。 Ｔｉプラスミド（Ａ）は、クローニング媒体（３）と相
同性を有するあらゆる中間クローニングベクター用の極
めて普遍的なアクセプターＴｉプラスミドである。この
クローニング媒体（３）は通常のプラスミドでよく、例
えばｐＢＲ３２２またはその誘導体などによって置き換
えることができる。 ｔｊＳ７図は、中間クローニングベクターをＵ、、 ｃ
ｏ ｌ ｉ宿主細胞中で組みたてる工程を模式的に示し
たものである。制限エンドヌクレアーゼサイトＲ１に囲
まれた所望の遺伝子（５）および制限エンドヌクレアー
ゼサイ）Ｒ２で囲まれた選択し得るマーカー遺−伝子（
６）を、酵素Ｒ１およびＲ２の為のそれぞれ１つの制限
サイトを含んでいるクローニング媒体（３゛）に挿入す
る。３つの分子を全て制限酵素Ｒ１および／またはＲ２
で消化し、ＤＮＡリカ゛−ゼを用いてライゲーション（
結紮）して中■１クローニングベクターを形成させる。 このクローニング媒体（３゛）は、細菌遺伝子学の選択
マーカーとして使用する抗生物質耐性（Ａｂ”）を暗号
化しているもう１つのＤＮＡ配列を含んでいなければな
らない。所望の遺伝子（５）はその天然のプロモーター
または第２図および第３図に概説した外米性プロモータ
ーの支配下にある。 第８図は本発明に係るアクセプターＴｉプラスミド（タ
イプＢ）のもう１つの具体的態様を組み立てるための模
式図である。この態様では、境界配列（１）および（２
）のすぐ外側のＴｉ配列に相同の、それぞれＤＮＡ配列
（９）および（１０）を含んでいるクローニング媒体と
Ｔｉプラスミドとの間で二重乗換えが起る。この二重乗
換えによって、境界配列（１）および（２）を含んでい
る′Ｆ−領域Ｔ全体が削除され、それがクローニング媒
体（３）で置き換えられる。Ｔｉプラスミド（Ｂ）は、
境界配列（１）および（２）の間にクローンされた所望
の遺伝子を含有している中間クローニングベクターのた
めの７クセプターである（第９図参照）。 第９図は、第８図の７クセプターＴｉプラスミド（Ｂ）
に単一乗換えによって挿入される本発明の中間クローニ
ングベクターを例示している。これは、所望の遺伝子（
５）の両端に位置する境界配列（１）および（２）を含
んでいる。これはまた、２つのプラスミド間の相同的組
換えを可能にするため、アクセプターＴｉプラスミド（
Ｂ）中のクローニング媒体配列と少なくとも一部が相同
であるクローニング媒体配列（３゛）をも含んでいる。 第１０図は、第８図のアクセプター１−ｉプラスミドお
よびそれに対応する第９図の中間クローニングベクター
か呟本発明のハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組
み立てを示す模式図である。 単一ゑ換えによって第９図の中間クローニングベクター
が第８図のアクセプターＴｉプラスミド（Ｂ）に導入さ
れる。 第１１図〜第２０図は本発明をより具体的に例示するも
のである。 第１１図は、５．２ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメ
ントＡｃ８ＢのＩ）ＢＲ３２２への挿入を示している（
Ｚ ａｍｂｒｙｓｋ ｉ ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０
９（１９８０）。 １３８５−１３９１）。この７ラグメント ＡｃｇＢは
ツバリン１゛ｉプラスミドの左右の境界領域を含んでい
る。このクローンｐＡＣｇＢは、第６図に示した１−Ａ
−タイプ］の７クセプタープラスミド、ｐＧＶ３８５０
の組み立てに使用される。野生型Ｔｉプラスミドの左右
の境界領域を含んでいるこのクローンされた制限７ラグ
メントを使って、クローンｐＡｃ８Ｂと類似のクローン
を得ることができることは、当業者には容易に理解され
るはずである。 第１２図はツバリンＴｉプラスミド１）Ｇ Ｖ ３８３
９のＴ−領域を示している。ｌ−１ｉｎｄ ＩＩＩ制限
エンドヌクレアーゼサイトは（１−１）で示しである。 変異したＨｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント１つは（１９
”）で示しである。カナマイシンまたはネオマイシン耐
性を付与するアセチルホスホトランスフェラーゼ遺伝子
はａｐｌで表わし、これは黒くぬりつぶしｔこ部分に存
在している。Ｔ領域の境界は矢印で示しである。ツバリ
ンシンターゼ（ｓｙｎＬｂａｓｅ）遺伝子は１１０Ｓで
表わした。数値は、Ｄｅｐｉｃｋｅｒら（１〕Ｉａｓｍ
ｉｄ、３（１９８０）、１９３−２１１）の方法による
制限７ラグメントの大きさを表わしている。Ｔｉプラス
ミド１）ＧＶ３８３８は、実施例１およびそこに挙げｔ
こ２つの文献に従って組み立てることができ第１３図は
、アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０の組み立
てを示している。プラスミドｐＢＲ３２２−ｐＡｃｇＢ
（第１１図）は、線状化した形で描いである。ｐＢＲ
３２２の配列は斜線を入れた領域で示し、ｐＢＲ３２２
のアンピシリン耐性遺伝子はＡＩで示した。第１２図に
示したｐＧＶ３８３９のＴ−領域の一部がここに描かれ
ている： ｐＡｃｇＢ との相同的組換えに関与するＨ
ｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント（１ｏ）および（２３）
およびａｐｔ遺伝子が含まれている。二重乗換えによっ
てｐＧＶ３８５０および失われたａｐｔ遺伝子を含むも
う１つのレプリコンが組み立てられる。 第１４図は、実施例２に詳細に記載した中間クローニン
グベクターｐＧＶ７００の組み立てを模式的に示したも
のである。制限エンドヌクレアーゼサイトを示すのに以
下の略号を用いた： Ｂ＝ＢａｍＨＩ 、 Ｂｇ ＝Ｂ
ｇｌ ＩＩ 、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ ％Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉ 、５＝Ｓａｌ Ｉ、 Ｓｉ＝Ｓｍａ１．抗生物質ｉ
ｌ性を示すのに以下の略号を用いた： Ａｐ＝アンピシ
リン、Ｃ＋ｎ＝クロラムフェニコール、ＳＩ。 ＝ストレプトマイシン、Ｔｃ＝テトラサイクリン。 ＴＬ−ＤＮＡで示した図の下部の数値は、この領域のＲ
ＮＡ転写体を示している（Ｗ ｉ Ｉ ｌ＋ｎ ｉ ｔ
ｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、 １３９−
１４６）。 第１５図は中間クローニングベクターｐＧＶ７５０の構
造を示している。その組み立ては実施例２に記載した。 制限エンドヌクレアーゼサイトは、キロ塩基対（ｋｂ）
の数で表わしたその相対的位置で示した。Ｐｓｔ Ｉ
サイトは示していないがＫＩｎＲ／Ｎ’ｍＲ領域に３
つ、ｃｂＲ遺伝子に１つ存在する。 左右の境界領域も示しである。Ｉ）ＧＶ７５０の組み立
てに使用されたＢｇＩ ＩＩ／ Ｂ’ａ＋ｎＨＩサイト
およびＨｐａ Ｉ ／ ＳＩｎａ Ｉサイトが示されて
いるが、これはｐＧＶ７５０ には存在しない。影をつ
けた領域はＴＬ−ＤＮＡに、黒い領域はＫｉｎＲ／Ｎｍ
Ｒ領域に、白ぬぎ部分は隣接するＴｉプラスミド配列に
、そして線はクローニング媒体ｐＢＲ３２５にそれぞれ
相当する。その他の略号は以下の意味を有する： ０ｃ
ｓ−オクトビンシンターゼ、ＣａｎＲ＝クロラムフェニ
コール耐性、ＣＩ）Ｒ＝カルベニシリン（アンピシリン
類似体）耐性、Ｋｕ＋ ”／ Ｎ＋ｏＲ＝カナマイシン
耐性／ネオマイシン耐性。 第１６図は実施例３・に詳細に記載した中間ベクター１
＋ＧＶ７４５の組み立てを示している。 ＋１（−；
Ｖ７４５は、第８図に示した「Ｂタイプ」アクセプター
プラスミド、ｐＧＶ２２６０の組み立てに使用される。 制限エンドヌクレアーゼサイトは以下の略号で示した：
Ｂ＝ＢａｍＨＩ、 Ｈ＝Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ、Ｒ＝ＩＥｃ
ｏＲ１゜アンピシリン耐性遺伝ｒはＡ １＋”で示した
。斜線を施した領域はオクトピン′ｌ゛１プラスミドの
ｉ’ −Ｄ Ｎ Ａ領域の左側と相同のｆ） Ｎ Ａを
、白ぬき領域はオクトピン′ｒｉプラスミドの′Ｉ゛−
ｌ） Ｎ Ａ領域の右側と相同のＤ Ｎ Ａを示してい
る。 出発物質であるプラスミドｐにＶ（１２ＨＪおよびｐ（
、； Ｖ ｌ） １２ ＋）についての物理的位置およ
び記述は、ｌ’）ｅ ＶｏｓらのＰｌａｓｍｉｄ’６（
１９８１）、２４９−２５３にみられる。 第１７図はアクセプタープラスミドｐＧ Ｖ ２２６０
の組み立てを示している。ｐＧＶ２２１？ 中の欠損置
換が、ネオマイシンとカナマイシンに対する耐性を付与
するアセチルホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｔ
で表わしである）を含んでいる黒色部分で示しである。 中間ベクターμＧ’ｖ ７４５（第１６図参照）は線状
化して描いである。これは第１６図に示した１フＧＶ７
４５のＨｉｎｄ ＩＩＩサイトで開裂したものである。 ｐＢＲ３２２の配列は斜線を施した部分で示し、アンピ
シリン耐性遺伝子はＡｐｌで示しである。二重乗換えに
よって、ｐＧＶ ２２６０が組み立てられ、ａｐｌ遺伝
子が失われる。制限エンドヌクレアーゼサイトは以下の
略号で示した： Ｂ ＝ Ｂａ＋ｎＨＩ、Ｈ＝ト１ｉｎ
ｄ ＩＩＩ、Ｒ＝ＥｃｏＲＩ。 第１８図は、ツバリンシンターゼ遺伝子（口ｏｓ）のプ
ロモーターの下流の遺伝子を発現するためのプラスミド
ｐＬ（＋ ’ｖ ２３３１の組み立てを示している。５
゛および３゛はそれぞれ転写開始と転写終了を意味し、
ＡＴＧおよびＴ’ＡＡは翻訳開始および翻訳終了に使わ
れるコドンを表わしている。 太線は＋１０８プロモーター領域、白ぬ５部分は＋１０
３暗号領域を示している。Ａ、Ｒはアンピシリン耐性、
Ｋ＋ｏ１（はカナマイシン耐性を示している。 第１９図は、完全なオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）暗
号配列を含んでいるプラスミドｐＡ Ｇ Ｖ １ （、
’）の組み立て、およびプラスミド１）ＬＧＶ２３８１
（第１８図参照）中１１０３プロモーターの後部へのそ
の挿入を示している。太線はプロモーター領域、白ぬき
部分はｏｃｓ暗号領域を示している。その他の記号は第
１８図と同じである。 第２０図は、ノパリンシンターセ゛（ｎｏｓ） ｌｉ（
元手のプロモーター領域の周囲のヌクレオチド配列およ
びオクトピンシンターゼ遺伝子暗号領域と融合した後の
同じ領域の周囲のヌクレオチド配列を示している。融合
点は星印（＊）で示した。いくつかの制限エンドヌクレ
アーゼサイト、即ち、Ｂ ａｍ ）−１１、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ 、および５ａｃｌｌ も示しである。 ５゛および３゛は転写開始および終了を意味する。 Ａ′ｒＧは翻訳に使われる最初のコドン、ＴＡＡは翻訳
に使われる終了コドンを表わしている。白ぬきの大きい
矢印はツバリン遺伝子の暗号化領域、縞の入った矢印は
オクトピン遺伝子を表わしている。 以下に本発明の詳細な説明する。 第１図にアクセプター′１′１プラスミドを簡単に図式
化して示した。このアクセプターＴｉプラスミドは、野
生型腫瘍誘起（Ｔ ｉ ）プラスミドの２つの境界配列
（１，２）または領域を含んでいる。この境界配列は、
Ｔｉプラスミドの１゛−領域を植物 ゛細胞ゲノム
ヘ組込むのに必須である。換言すれば、あらゆるＤ Ｎ
Ａ配列（３）または１゛−領域を、これらの配列１１
］ｉこ存在している植物細胞ゲノムに組込むのにこの境
界配列が絶対に必要である。 このアクセプターＴｉプラスミドのＩ） Ｎ Ａ配列（
３）には、第２図および第３図に示した中間クローニン
グベクターのＤＮＡ配列（３゛）の少なくとも１部と相
同のＤＮＡセグメントが含まれている。 この相同性は、中間クローニングベクターとアクセプタ
ーＴｉプラスミドが単一乗換え（相同性組換え）によっ
て相互組込みするのに必要である。 相互組込み体の得られる頻度は、基本的には相同領域の
長さできまる。相同性組換えを高頻度で起すには、通常
１−４ｋｌ）の領域が使われる（Ｌｅｃｑ＋＋ａ＋＋Ｓ
呟Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、１ （，
１９８１）。 １４９−１６４）。 アクセプターＴｉプラスミドは更に、ＡＨｒｏｂａ−ｃ
ｌ、ｅｒｉｕｍによってＴｉプラスミドのＴ−領域が植
物細胞ゲノムへ移動するのに必要な配列（４）を含んで
いる。 この様なアクセプターＴｉプラスミドの組みＶておよび
第２図および第３図に示した中間クローニングベクター
とのその相互組込みについて、第４図を参照しながら以
下に詳述する。 第２図および第３図に、発現しようとする、即ち、植物
細胞中でプロモーターの支配下に転写され、翻訳される
所望の原核性または真核性遺伝子をクローンするための
中間クローニングベクターを簡略化した図で示した。こ
れらの中間クローニングベクターは、アクセプター′１
゛ｉプラスミ、ドの１’） Ｎ Ａセグメント（３）の
少なくとも一部と相同であり、従って単一乗換えを可能
にするＩ） Ｎ Ａ配列を含んでいるクローニング媒体
からのＤ Ｎ Ａセグメン）（３’）を含んでいる。さ
らに、この中間クローニングベクターは、その天然のあ
るいは外米性のプロモーター配列を含む少なくとも１つ
の所望の遺伝子（５，７）を含んでいる。このプロモー
ター配列によって、挿入された遺伝子配列の発現が可能
である。所望の挿入遺伝子（群）の発現を調整するため
に、外米性のプロモーター配列（仕立て上げたプロモー
ター）を使うことも可能である。 調整の各種の例として、以下のものを挙げることができ
る：（ｉ）組織に特異な発現、即ち、葉、根、茎、花な
ど、（ｉｉ）発現レベル、即ち、発現の強弱、（ｉｉυ
誘導性発現、即ち、温度、尤または添加された化学的因
子による発現など。 中間クローニングベクター用の所望の遺伝子の例として
は、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成をコントロール
して植物の栄養価や成長度を改良する遺伝情報を持った
ＤＮＡ７ラグメントまたは配列、外部から病原物質に対
する保護、例えば病原生物またはストレスとなる環境因
子に対する耐性、をイ；１与する生産物の合成をコント
ロールする遺伝情報を持ったＤ Ｎ Ａ ７ラグメン）
、１．ｔこは配列、；在伝子工学によって改良しようと
する植物の基本的な過程に情報を与える生産物の合成を
コントロールする遺伝情報を持ったＩ）ＮＡフラグメン
トまたは配列など。 第２図および第３図は、選択可能なマーカー遺伝子（６
）を含んでいることもある中間クローニングベクターを
表わしている。選択Ｉｌｌ能なマーカー遺伝子としては
、例えば抗生物質または有毒な類似物質（例えばアミノ
酸′Ｂ縁体）を暗号化している遺伝子、受容宿主細胞の
欠損を補う遺伝子などが挙げられる。 第４図は、ハイブリッド１゛１プラスミドベクターの組
み立てに関与する構成を示しており、第５図は、そのハ
イブリッドＴｉプラスミドベクターを保持しているＡＢ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎの分離に関与する実際の接合
二り程を表わしている。この工程は、中間クローニング
ベクターがＥ、ｃｏｌｉ中で組み立てられるので、この
中間クローニングベクターをＡＢｒｏｌ）ａｃｔｅｒｉ
ｕｎ＋中の７クセプタープラスミドに転移させるのに必
要である。 Ｔ−領域の一部が変更された配列で置換されている改良
Ｔｉプラスミドを調製するのに用いられる既知の転移手
法は多数の工程からなっている。 通常、大抵のＤＮＡ組換え操作は、特別に設計されたク
ローニング媒体、例えは＋＋ＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅ
ｒ 、 Ｇｅｎｅ ２ （１９７７）、７５−９３）中
で行なわれる。しかしこのクローニング媒体は、それ自
体Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎに移動することかでき
ない。この問題は、既知の方法では次の様にして解決さ
れている： ａ） ＡＦｉｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋ｔｌ】でも
複製し得る別の広範囲宿主用クローニング媒体、例えば
ｍ１ｎｉ−３ａプラスミド（Ｌｅｅｍａｎｓ呟Ｇｅｎｅ
１９（１９８２）。 ３６１−３６４＞でｐＢＲクローニング媒体配列を置換
する。この繰作はＥ、ｃｏｊｉ中で行ない、中間クロー
ニングベクターが得られる。 ｂ）所望のｌ） Ｎ Ａを含有している中間クローニン
グベクターを保持したＥ、ｃｏｌｉ株と、Ａｇｒｏｂａ
−ｃｔｅｒｉｕ＋ｏ中では複製でトないがそれ自体およ
び他のＤＮＡのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移を
仲介することのできるヘルパープラスミドを保持した別
のＥ。 ｃｏｌｉ株との接合。 Ｃ）工程（１））で得られるＥ、ｃｏｌｉとＴｉプラス
ミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃ Ｌｅｒ ｉ ｕｍ
の接合＠′ルバープラスミドは失われる。 ｄ） 中１１１１クローニングベクターは、独立しタ
レプリフンとしてＡ ｇｒｏｂａｃ ｔｅｒ ｉ ｕｍ
中で複製し、存在することがでとるので、工程（ｅ）で
得られた接合１本は、中期クローニングベクターとＴｉ
プラスミドとの相互組込み体を含んでいる細胞、または
中間クローニングベクターおよび相互組込みが起らなか
ったＴｉプラスミドを含んでいる別の細胞の混合物であ
る。相互組込み体だけを特異的に分離する為に、Ｔｉプ
ラスミドのない別のＡｇｒｏｂａｃｔ−ｅｒｉｕｍ株と
の接合をもう一度行なわなければならない。この転移は
、Ｔｉプラスミド自体によって暗号化されている機能に
゛よって仲介される。この第２のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕ鎗株への中間クローニングベクターの転移は、Ｔｉ
プラスミドとの相互組込み体の形でのみ行なわれる。 ｅ）所望の置換を行なった最終的な改良′旨プラスミド
を得るために、第２回目の乗換えが行なわれる （Ｌｅ
ｅｔＯａｎｓ ら、Ｊ、Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 に
ｅｎｅｔ。 １ （１９８１）、１４９−１６４）。 僅かにもう１つの既知の方法は、上記工程（ｄ）におい
て、中間クローニングベクターと適合しない別のプラス
ミドをＡｇｒｏｆ＋ａｃＬｅｒｉｔｕｎに導入すること
を除けば、上の方法と基本的に同じである。この場合、
独立したレブリフンのままでし）る中間クローニングベ
クターは全て失われるので、相互組込み（単一乗換え）
を選択することができる（ＭａＬｚｋｅ ら、 Ｊ、
Ｍｏ１． ＡＩ］Ｉ）ｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 １
（１９８１）、３９−．４９ ）。 ここに本発明者らは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎの
アクセプターＴｉプラスミドに中間クローニングベクタ
ーを導入する為の、新規な非常に簡素化された方法を提
供するものである。簡単に言えば、この方法は、多くの
通常使用されているクローニングプラスミド（例えばＩ
）ＢＲ３２２）を■Ａｇｒｏｂａｃ−１、ｅｒｉｕｍに
転移させるのに、Ｅ、 ｃｏｌｉのヘルパープラスミド
が役立つということを見い出した事実に基づいている。 これらのプラスミドは、いづれもＡＢｒｏｂａｃＬｅｒ
ｉｕＩＩｌ中では複製でとないので、アクセプターＴｉ
プラスミドと相互組込みし得るものだけが保持されるこ
とになる。さらに、本発明者らは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕ＋ｎ中のこの相互組込み体を、植物細胞への感染
の為の直接のベクター組成物として使用するのである。 この様にして、本発明者らは前記の工程（ｄ）および（
ｅ）を省略した。これによって、改良ハイブリッドＴｉ
プラスミドを組み立てるのに要する時間が減少し、可能
な組み立てに柔軟性が増加し、かくして、植物細胞ゲノ
ムヘｒ）ＮＡを転移させる為のベクターとしてこのアク
セプターＴｉプラスミドを使用でトる可能性が著しく高
まったのである。 即ち、第５図に概略を示した様に、アクセプターＴｉ
プラスミドへの中間クローニングベクターの導入は２工
程で行なわれる。先づ、中間クローニングベクターを持
ったＥ、 ｃｏｌｉ株（１）を、この中間クローニング
ベクターのＡＢｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの摂動を促す
２つのプラスミドを持った別のＥ。 ｃｏｌｉ株（２）と接合させる。これらのヘルパープラ
スミドの代表的な、そして好ましい例は、＋ｎｏｌ）機
能を含んだＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｔｒａ機能を含んだ
ｐＧＪ２８である（Ｆｉｎｎｅｇａｎら、Ｍｏ１． Ｇ
ｅｎ。 ＧｅｎｅＬ、 １８５（１９８２）、３４４−３５１）
。中間クローニングベクターのクローニングＩＭ （Ｉ
上のｂ ｏ ｔｎサイト（Ｗａｒｒｅｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ２７４（１９７８）。 ２５９−２６１．）が池の２つのプラスミドによって暗
号化されている機能体によって認識され、転移できる様
になる。全てのプラスミドは、その存在を検出するため
に抗生物質耐性マーカーを含んでいるのが好ましい。次
いで、得られたＥ、ｃｏｌｉ。 株、即ち３つのプラスミド全てを保持している摂動株（
３）を、中間クローニングベクターと相同の領域を持っ
たアクセプターＴｉ７”ラスミドを保持しているＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋０と接合させる。中間クローニン
グベクターと７クセプターＴｉプラスミドとの単一乗換
えが行なわれたかどうかは、中間クローニングベクター
の抗生物質耐性マーカーについての選択によって検出で
外る。 第６図は、第１図の７クセプター１’ ｉプラスミドの
組み立てに用いられたＤＮＡ分子を模式的に示したもの
である。本明細書では、このプラスミドを７クセプター
Ｔｉプラスミド（タイプＡ）と呼び、池のアクセプター
Ｔｉプラスミド（タイプＢ）と区別することにする（第
８図参照）。この組み立てには、′１゛ｉ プラスミド
と、クローニング媒１本（３）中に境界配列（１）およ
び（２）を持っているもう１つのプラスミドと９間に二
重乗換えが起ることが必要である。図に示した様に、ク
ローニング媒体配列（３）は左側の境界配列（１）と右
側の境界配列（２）との財にある。このＤＮＡ鎖の正し
い極性を示すために、これを環」二に描くことがでおる
。 しかし、二重乗換えに使用される相同領域を示すために
は、この環を開裂させて図示した。これは理解を助ける
為のやリカとして重要であり、第８図に於けるアクセプ
ターＴｉプラスミド（Ｂ）の組み立てに於いても用いら
れている。即ち、もし境界配列（１）および（２）が、
単にクローニング媒体配列（３）−内に挿入されたのな
呟二重乗換えによって、Ｔ−領域が削除されてはいるが
この境界配列（１）および（２）の間のクローニング媒
体配列の−ないＴｉプラスミドが得られることになる。 第６−図に示した様に、二重乗換えによって、境界配列
（１）および（２）の間にもとの］゛−領領域持った環
状ＤＮＡ分子が生成する。これはレプリコンではないの
で消失する運命にある。この二重乗換えが起ったかどう
かは〜、例えばゴミプラスミドのＴ−領域内に含まれる
抗生物質マーカーの欠落について選択したり、クローニ
ング媒体配列（３）内の抗生物質耐性マーカーについて
選択したりして、遺伝子学的に選択することができる。 第７図は、第２図および第３図の中間クローニングベク
ターの組み立てを示す模式図である。制限エンドヌクレ
アーゼサイトＲＩまたはＲ２でそれぞれ囲まれた所望の
遺伝子（５）および選択可能なマーカー遺伝子（６）が
、酵素Ｒ１およびＲ７の為の特異な制限サイトを含んで
いるクローニング媒体配列（３゛）に、これら全ての分
子の消化およびライプ−ジョンによって種本される。得
られた組換えＤＮＡ分子は、Ｅ、 ｃｏｌｉ宿主細胞を
形質転換するのに使用され、その形質転換体は、クロー
ニング媒体配列（３゛）の抗生物質耐性マーカー（Ａｂ
”）で選択される。 第８図は本発明のもう１つの態様、即ちアクセプターＴ
ｉプラスミド（Ｂ）を組み立てるのに使用されるｌ）
Ｎ Ａ分子の模式図である。この場合は、境界配列（１
）および（２）のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列（９）
および（１（１）の刺にクローニング媒体配列（３）を
含んでいるプラスミドとＴｉプラスミドとの開で二重乗
換えが起る。乗換えに使用される相同領域を示す為に、
小さい方のプラスミドは開裂しである（第６図と同様）
。二重乗換えによる生成物は、アクセプター′１゛ｉ
プラスミド（Ｂ）と、もとの′１゛１プラスミドからの
］゛−領領域よびＤＮＡ配列（２）、（１０）、（９）
および（１）を含んでい遺伝子学的選択は第６図につい
て記載したものと同様にして行なうことがでトる。 第９図は、第８図のアクセプターＴｉ プラスミドＢと
組み合せて使用される中間クローニングベクターの模式
図である。ここでは、所望の遺伝子（５）は、クローニ
ング媒体配列（３゛）中に含まれている境界配列（１）
および（２）の間に挿入される。 第１０図は、単一乗換により第９図の中間クローニング
ベクターかどの様にしてアクセプターＴｉプラスミド（
８）に挿入されるかを模式的に示している。この場合、
中間クローニングベクターのクローニング媒体配列（３
゛）の抗生物質耐性マーカーで選択すると、２つのプラ
スミドの間の相互組込みの結果としてのハイブリッドＴ
ｉ プラスミドを確実に見つけることができる。こうし
て境界配列（１）および（２）内に含まれている所望の
遺伝子を持ったハイブリッドＴｉプラスミドが得られる
。この様にして組み立てられたハイブリッドプラスミド
は、その１゛−領域に、例えば第４図のハイブリッド゛
１゛１プラスミド中の配列（３）および（３゛）の様な
直接反復の配列を含有しておらず、従つ′ζ、分子内組
換えゐ結果として、／％４ブリ・ンドベクターまたは植
物細胞ゲノム中に導入されたＩＮＮＡが不安定になる可
能性が避けられる。 本発明者らの研究室で行なった実験結果か呟第９図の中
間ベクターの血み立てには、境界配列１および２の両者
を所有する必要はなり・ことがわかった（未発表）。し
かし、所望のＤＮＡ配列を植物ゲノムに組込むには、少
なくとも右側の境界配列（２）（第１図および第９図参
照）を有することが必要十分条件である。 ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴ１プラスミド、例えば
７ノ々リンまたはオクトビンＴｉプラスミドの制限エン
ドヌクレアーゼ地図についての知見（Ｄｅｌ）ｉｃｋｅ
ｒら、Ｐｌａｓ＋ｎｉｄ ３（１９８０）−１９３−？
’ｌ’：Ｄｅ ＶＯ３ら、Ｐｌａｓ＋１ｌｉｄ ６（１
”９８４ ）、２４９−５２３）およびＴ −１） Ｎ
Ａ境界配列を含んでいる制限フラグメントについての
知見（Ｚａｍｌ＋ｒｙｓｋｉ呟Ｊ、Ｍｏｌ。 ＡＩ）ｌｌ’１． （、ｅｎ（・Ｌ、ｌＮ９８２Ｌ３６
１ ３７（，１；１）ｅ Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒら、Ｍ
ｏ１． Ｇｅｌ１． Ｇ、ｅｎｅｔ、Ｈｆ ３（１９８
１’）、２８３−２８８）か呟当業者であれば誰れでも
、本発明方法に従ってアクセプターＴｉプラスミドを組
み立てることができる。この池、通常の組換えＤＮＡ技
術および基礎的な細菌の遺伝子操作を実施できる能力が
要求されるに過ぎない。本発明は、ハイブリッドＴｉプ
ラスミドベクターを組み立てるのに有効であることがわ
かった本明細書に記載したアクセプターＴｉプラスミド
を具体的に提案している点でユニークなものである。更
に、これらのアクセプターＴｉプラスミドは、遺伝子を
植物細胞ゲノムへ導入するための方法の一部を構成する
様に設計されたものである。 既述したアクセプター′１゛ｉプラスミド、中間クロー
ニングベクター、ハイブリッドＴｉプラスミドベクター
およびベクター組成物を更に例示し、植物細胞ゲノムへ
組込まれた外来性遺伝子の発現を示す形質転換植物細胞
および植物を提供するのにこのベクター組成物が有効で
あることを例証するために、以下に実施例を挙げる。 実施例１ アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０
（Ａタイプ）の組み立て 出発株およびプラスミド： ＡＢｒｏｌ）ａｃＬｅｒｉ＋ｎａ ｔｕ＋ｎｅｆａｃｉ
ｅｎｓ （野性型Ａｇｒｏｌ＋ａ−ｃＬｅｒｉｕｍ由来
のり７７ンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１およびクロラムフェ
ニコール−エリスロマイシン耐性株Ｃ５８Ｃ］） Ｔｉ プラスミド＝ｐＧＶ３８３９ 第１１図のプラスミド＝ρＡｃｇＢ １゛ｉプラスミドｐＧＶ３８３９は７パリンプラスミド
ｐＴｉ Ｃ５８Ｌｒａ ０（ｐＧＶ３１旧〕；１−１ｏ
ｌｓｔｅｒｓら、 Ｆ’ｌａｓｍｉｄ ３（１９８
０）、２１２−２３０）から組み立てる。これはＴ−領
域の中央近くに欠失置換突然変異体（ミュータント）を
含んでいる：即ち、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント１
９の内部のＳ＋ｎａｌフラグメント２４ （Ｄｅｌ）ｉ
ｃｋｅｒ呟円ａｓｕ＋ｉｄ ３ （１９８０）＋
１９３．２１１）は、Ｔ。 ５のａｐｌ（アセチルホスホトランスフェラーゼ）遺伝
子を含んでいる。ｐＫＣ７のＨｉｎｄ ＩＩ ７ラグメ
ンＩＩＲａｏら、 Ｇｅｎｅ ７（１９７９，７９−８
２）で置換されている。この遺伝子はアミノグリコシド
ネオマイシンおよびカナマイシンに対する耐性を暗号化
している。１）ＧＶ３８３９の１゛−領域の制限地図を
第１２図に示す。 プラスミドｐＡｃｌＢは、Ｔ −、Ｄ Ｎ Ａの境界部
だけを含んでいるｐＢＲ３２２中のＡｃｇＢの挿入体で
ある（第１１図参照）。この境界部はＴ−ＤＮＡの末端
部として定義され、これらの領域は、１゛−ＤＮＡの植
物細胞ゲ７ムへの安定な組込みに役割を果たす。このク
ローンの起源および分析については詳しく記載されてい
る（ ７． ａ＋ｎｂｒｙｓｋ ｉ ら、５ｃｉｅｎ
ｃｅ２０９（１９８０）、１３８５−１３９１）。 このクローンは、形質転換されたタバコＤＮＡからＴ
−Ｄ Ｎ Ａの部分を再分離することにより得られた。 ｐＡｃｇＢは、ＴＤＮＡの左右の境界を含む様に縦列に
並んだ２つのＴ −Ｄ Ｎ Ａコピーの接合点を含んで
いる。更に、ｐＡｃｇＢは、その遺伝情報が右側Ｔ−Ｄ
ＮＡ境界のすぐ近くに位置しているという理由で７パリ
ンシンターゼ遺伝子を含んでいる。このプラスミドｐＡ
ｃｇＢは、「タイプＡ」アクセプターＴｉ プラスミド
、ｐＧＶ３８５（）の組み立てに使用される。第６図は
関与する構造の概略を、第１３図はｐＧＶ３８ｓＯを与
える二重乗換えに関与するＤ Ｎ Ａ領域をより正確に
示したものである。 上記のプラスミドｐＡｃｇＢは、そのｐ Ｂ ｌ’＜
３２２部分にＣｏ１Ｅ］−特異ｂｏｍサイトを持ってお
り、ヘルパープラスミドＲ６４ｄｒｄ １．１およびｐ
ＧＪ２８を使ってＥ、ｃｏｌｉからＡｇｒｏｂａｃＬｅ
ｒｉｕｍへ摂動することができる。Ｅ、 ｃｏｌｉに含
まれているプラスミドＲ６４ｄｒｄ １１およびＩＪＧ
Ｊ２８は、接合により、ｐＡｃｇＢを持ったＥ、 ｃｏ
ｌｉ株に導入される。トランス接合体は、アンピシリン
耐性（ｐＡｃｇＢの１）ＢＲ３２２配列がら）、ストレ
プトマイシン耐性（Ｒ６４ｄｒｄ １１から）、および
カナマイ沖耐性（ｐＧＪ２８から）コロニーとして選択
“される。 ３つのプラスミドの全てを保持しているＥ。 ｃｏｌｉ株を、１ノア７ンピシン耐性でありＴｉプラス
ミド、ＧＶ３８３９を含んでいるＡＢｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１に接合させる。ツバリン下ニブラス
ミドとの最初の単一乗換えを選択するのにｐＢＲ３２２
のアンピシリン耐性を利用する。アンピシリン耐性をＡ
ｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ中で安定させることができる
唯一の方法は、１゛−領域境界近くの相同領域の１つで
ｐＧＶ３８３９と相同組換えにより乗換えをすることで
ある。池の相同領域での２回目の乗換えにより、ａｐｌ
遺伝子（カナマイシン耐性）を含んでいる１）ＧＶ３８
３９の゛１゛−領域の中央部がクローンｐＡｃｇＢのｐ
ＢＲ３２２配列で置換される。従って、第２の組換え体
はアンピシリン耐性、カナマイシン感受性である。第２
の岨換え体を分離する確率を高めるために、最初の組換
え体（ｐＡｃｇ’Ｂ ：：ｌ）Ｇ Ｖ ３８３９ ）を
保持しているり７７ンビシン耐性Ａｇｒｏｌ）ａｃｔｅ
ｒｉｕｍを、Ｔｉプラスミドを持っていない第２のクロ
ラムフェニコール／エリスロマイシン耐性Ａｇｒｏｂａ
ｃＬｅｒｉｕｍ株と接合させる。この様にして、約６（
）Ｏコロニー中、１コロニーの割合で、アンピシリン耐
性、カナマイシン感受性のクロラムフェニコール／エリ
エロマイシン耐性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｉ）Ｇ
Ｖ ３８５０を得ることができる。 勿論、ｐＧＶ３８５０タ４プノアクセプ９ ’ｒｉＴ
ｉプラスミドみ立てるのに使用することかでトるその他
のＴｉプラスミドもある。Ｔ−領域の中央近くに選択し
得るマーカー遺伝子を持ったＴｉプラスミドは全て受容
体として使用できる。更１こ、左境界フラグメン）
ｐＢＲ３２２−右境界フラグメントの方向に、左右の境
界７ラグメントの中間にｐＢＲ配列が位置する様に、ｐ
ＢＲ３２２に゛ｒ−領域境界フラグメントを挿入するこ
とによってｐＡｃ８Ｂ様のプラスミドを組み立てること
かできる。例えば、ツバリン゛１゛ｉプラスミドの左お
よび＜ｉ境界フラグメントはそれぞれＨｉｎｄ Ｉｌｌ
フラグメント１０および２３である（ Ｄｅｌ＋１ｃｋ
ｅｒら、ＰＩａｓｈ＋ｉｄ ３（］ ９８０）、 １９
３ ２１１）。 単−乗換えによって、ｐＢＲ３２２またはその誘導体に
挿入されている所望の遺伝子を含んだ中間クローニング
ベクターが＋）（ｌ Ｖ ’３８ Ｓ Ｏの改良された
Ｉ’−１）ＮＡ領領域導入される。唯一つ必要なことは
、中間クローニングベクターのＥ、ｃｏｌｉからＡｇｒ
ｏｂａｃｔｃｒｉｕ＋ｎへの転移を選択する為の手段と
して使用する為に、導入されるＤＮＡが、既にｐＢＲ３
２２に存在するものの池にもう１つの耐性マーカー遺伝
子を含んでいるということである。 この耐性マーカーは、ｌ］ＢＲ配列内に含まれていても
よく（例えばｐＢＲ３２５のＣａｎ”、または１）ＫＯ
２のＫｔｏ ”） 、植物細胞内で試験されるＤＮノ＼
内に含まれていてもよい。更に、アクセプターＴｉプラ
スミドｐＧＶ３８ｓＯにおけるｌ＼１】Ｒ遺伝子ｐＢＲ
３２２は、Ｋｉｎ’の様な別の耐性マーカー遺伝子で置
換してもよい。この様にして、Ａ、、 ｆ＜であるｌ］
ＢＲ３２２含有中開クローニングベクターです呟このｐ
ＧＶ３８５０タイプのアクセプターＴｉプラスミドに直
接摂動することができる。 ｐＧＶ３８５０タイプのアクセプターＴｉプラスミドの
もう１つの利点は、形質転換された植物細胞で腫瘍をつ
くらないということである。ｐＧＶ３８ＳＯの短かくな
ったＴ −Ｄ Ｎ ’Ａ領領域、依然としてツバリンシ
ンターゼを暗号化している遺伝子を含んでいるので、ｌ
）Ｇ Ｖ ３８５ 、ｔ’）で形質転換された細胞は、
ツバリンが存在するかどうかを分析することにより、非
形質転換細胞から簡単に選り分けることができる。勿論
、アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ ３８．５０ｆ二
組込まれた中間クローニングベクターがマーカー遺伝子
を含んでいた呟それも直接スクリーニング、即ち選別に
かけることがで外る。 ｐＢＲ３２２配列を含ん戸上記の中間クローニングベク
ターの単一乗換えによるアクセプター１１プラスミドへ
の挿入のほか、このアクセプター１１プラスミドは、１
−ショットガン４タイプの実験に於いて、ｐＢＲ３２２
またはその誘導体中のクローンされたＩ） Ｎ Ａバン
クの受容体としても使用することがでトる。Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｕ＋中の全ての７１イブリツドプラスミ
ドベクターは、植物細胞の感染に使用することかで忽、
次いで所望の選択可能な遺伝子（群）の発現についてス
クリーニングされる。 例えば、選ばれたアミノ酸が欠乏している植物細胞に全
バンクを適用することにより、アミノ酸合成を暗号化し
ている遺伝子について葡単に選別することができる。 アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０は、２つの
特徴的な表現形質を持っている：即ち、（ｉ）腫瘍生成
能力がないこと、および（ｉｉ）もしＴ−Ｄ Ｎ Ａが
植物細胞ゲノム内に転移したら、ツバリン合成能を有す
ること、である。ｐＧＶ ３８５０含有ＡＢｒｏｂａｃ
Ｌｅｒｉｕｔｏで感染させた各種の植物組織のこれらの
特徴を調べるために、種々の実験を行なった・ ａ） ジャカ゛イモおよびニンジンテ゛イスクを片ｊす
）た試験 ジャガイモおよびニンジンの切片にアクセプターＴｉプ
ラスミドｐ（：；Ｖ３８５０を接種すると、少量の硬結
組織が生成する。この組織にツバリンが存在するかどう
かを試験した所、陽性であることがわかった。この突然
変異体が少量の硬結組織を生産し得ることは興味あるこ
とである。しかし、それは、これらのディスクを低濃度
のオーキシンおよびサイトキニンの両者を含んでいる培
地で生育させた時だけ得られる。 ｂ）全植物をアクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ ３８
５０で接種 ホルモンを含よない滅菌寒天培地で生育しているタバコ
およびペチュニアの苗木にｐＧ Ｖ ３８５０を接種す
る。数カ月後に少量の組織成長か観察されただけである
（通常、２週問後に１野生型」腫瘍が検出される）。こ
の組織はホルモンを含まない培地では生育しないが、オ
ーキシンおよびサイトキニン含有培地での滅菌組織培養
では、さらに増殖することができる。このＭｌ織もツバ
リン陽性であることがわかった。 Ｃ）さらに、ｐＧＶ ３８５０Ｆ形質転換」細胞は腫瘍
性ではないので、これらの細胞は、伝移したＤ Ｎ Ａ
セグメントをそのゲノムに依然として保持している正常
な植物に再生することができる。この形質転換細胞を通
常の再生培地（実施例５を参照）で培養すると、正常植
物が得られよう。 ＋１ｃ； Ｖ ３４ｆ ５０の、アクセプタープラス
ミドとしての有用性を証明する為に、以下の実験を行な
った。ｐＢＲ３２５中にオクトピンＴ−ＤＮＡの腫瘍機
能を含んでいる中間クローニングベクターを、ｐＧＶ３
８５０を保持しているＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋ｎに
組み込んだ。単一乗換えによって得られたＡｇｒｏ−ｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ中のハイブリッドＴｉ プラスミドを
、傷つけたタバコ植物に接種した。２週間後に腫瘍組織
があられれた。このことは、腫瘍誘導ＤＮＡがｐＧＶ３
８５０に再導入され、形質転換植物細胞中で適切に発現
されたことを示している。 大施仰文 中間クローニングベクターｐＧＶ７００およ
びｐＧ＼Ｘ７５０の組み立て この組み立ての概略を第１４図に模式的に示した。オク
トピン′１゛ｉプラスミドＢ６Ｓ３のｒＬ−ＤＮＡの右
側部分であり、−〜’ ０２０１ （ＤｅＶｏｓら、
Ｐｌａｓｍｉｄ ６（１９８１）、２４９−２５３）
中に存在するＨｉｎｄ Ｉｌｌ ７ラグメント１を、ま
ず、広範囲宿主性ベクターｐＧＶ ］ １２２ （Ｌｅ
ｅｎ＋ａｎｓ呟ＧｅＩ＋ｅ １９（１９Ｂ ２）、 ３
．６１−３６４）のＨｉｎｄ ＩＩＩサイトに挿入する
。組換えプラスミドｐＧＶ ｌ） ２０１は、多コピー
ベクターｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒらｔ Ｇｅｎ
ｅ ２（１９７７）＋ ９５−１１３）の特異なｌ−
１ｉ＋＋ｄ ＩＩＩサイトに挿入されたＨｉ＋＋ｄ Ｉ
ＩＩ ７ラグメント１を含んでいる。ｌ）’Ｃ；＼′（
１２０１およびＩ）ＧＶ ］ １２２ ＤＮＡは、Ｂｃ
ｔｌ−ａｃｌ＋らが記載している方法で調製される（Ｆ
ｅｄ。 Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７−２０４３）。 最終量２０μＣ中、ｌ）Ｇ Ｖ ０２０’ｌ Ｄ Ｎ
Ａ ２μｇを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ２単位（全ての制限
酵素はｌ’３ ｏｅｌ＋ −ｒｉｎＢｅｒ Ｍａｏｎｌ
＋ｅｉ＋ｎから購入した）を用いて、３°７゛Ｃで・１
時間完全に消化した。インキュベーション緩衝液はＯ’
Ｆ”ａｒｒｅｌ ｌ らにより記載されている（Ｍｏ
ｌ、 Ｇｅｎ、 ＧｅｏｅＬ ’１ ７ ９（１９
８０）、４２ １ −４３５）。同シ条件下テｐＧＶ
１１２２ ＤＮＡ ２μｓをＨｉｎｄ ＩＩＩで完全に
消化した。 最終量２（）μρ中、′Ｆ４リカ゛−ゼ（Ｂｏｅｌ＋ｒ
ｉｎ８ｅｒＭａｎｎｌ＋ｅｉｍ ） （’、１．０２単
位を用い、０．１μｇの１４ｉｎｄ Ｉｌｌ ’を
肖化 １）Ｃ；ＶＯ２０１をＨｉｎｄ Ｉｌｌ ？
肖化ｐＧＶ１］２２とライプ−ジョン（結紮）した。イ
ンキュベーション緩衝液および条件は、製造業者の指示
に従った（ Ｂｒｏｃｂｕｒｅ″’Ｔ４リカ゛−ゼ゛、
Ｂｏｅｌ＋ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｔ＋ｅｉｍｙ １
９８０年８月、＃１ｏ。 Ｍ、８８０．４８６ ）。ライゲーション混合物の−＋ フンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ ５１４ ｈｓｒ ｈ
ｓｍ 細胞（Ｃｏｌｓｏｎら、ＧｅｎｅＬｉｃｓ５２
（１９６５）、１０４３−１０５０）への導入（形質転
換）は、ＤａｇｅｒｔおよびＥｈｒｌｉｃｈ （１）方
法（Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３−２８）に従って
行なった。細胞を、ストレプトマイシン（２０μｇ／＋
ｏｌ）および又ペクチ／マイシン（５０μｇ／ｍｌ）を
補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ。 ＥｘｐｅｒｉｍｅｎＬｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （］ ９７２ ）＊ Ｃ
ｏ１ｄ ５ｐｒｉｎＢ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ＋ Ｎｅ１ｕＹｏｒｋ）に塗抹した。組換えプラ
スミドを含有している形質転換体を、テトラサイクリン
耐性を暗号化している遺伝子への挿入によるその不活性
化（Ｌｅｅｍａｏｓら、Ｇｅｎｅ １９（１，９８２）
、 ３６１−３６４）に基づき、テトラサイクリン感
受性（１（）μｇ／＋ｌｌ１）でスクリーニング（選り
分はルだ。ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシ
ン１こ而（性を示し、テトラサイクリンに感受性を有す
るクロ−ンを物理的に同定した。マイクロスケールのＤ
ＮＡ調製はＫｌｅｉｎらの方法（Ｐ ｌａｓｍｉｄ ３
（１９８０’）、８８ ９１）に従って実施した。ｐ
Ｇ１１２２の）ｆｉｎｄ ＩＩＩサイト中のＨｉｎｄ
ＩＩＩ ７ラグメント１の配向は、Ｓａｔ １消化によ
って決定した。組換えプラスミドを消化しく０ ’ Ｆ
ａｒｒｅｌ ｌ らの条件、Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ、 Ｇ
ｅｎｅｔ、 １’７９（１９８０）、 ４２１−４３
５）、アガロースデル電気泳動にかけると２個の７ラグ
メントが得られた。ａ−配向には０．７７ｋｂおよび２
２．７６ｋｂの７ラグメント、β−配向には、１０．３
３ｋｂおよび１３．２０ｋｌ）の７ラグメン）があった
。α−配向の組換えプラスミドをその後のクローニング
に使用し、これを１）にＶ１１６８と名イ；ｊけた。 ＴＬ−ＤＮＡの左側部分（左の境界配列を含んでいる）
を含有しているＢｇＩ ｌｌ−８ａｌ’ｌ ７ラグメン
トをＢｇｌ ｌｌ−８ａｌ ｒで開裂したｐＧＶ１１６
８に導入する。この７ラグメントは、ベクターｐＢＲ３
２２に挿入ｉ’レタ、ｐＴｉＢ６Ｓ３ の’ｒ領領域ら
の、Ｂａｎ＋Ｈ４フラグメント８を含んでいる組換えプ
ラスミドｐＧＶ０１５３ （Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａ
ｓｍｉｄ（１９８１）、 ２４９−２５３）から得ら
ｉる。ｐＧＶＯ１５３＃、ｌ：びｐＧＶｌ １６８１）
ＮＡはＢｅｔｌａｑｈらの方法で調製する（ ｔ１７ｅ
ｄ、 Ｐｒｏｃ。 ３５（１９７６）、２０３７−２１）４３）、１）ＧＶ
Ｏ１５３ＤＮＡ１０μ８を１０単位のＢｇｌ ＩＩおよ
・び１０単位の５ａｌｌを用い、最終量１００μ５Ｃ中
３７℃で１時間、完全に消化した。消化混合物をプレバ
ラティ１０．８％アガロースデル上、Ａ１１ｉｎＢｔｏ
ｎらの方法（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｂｉｍ、 ｉ３５
（１９７８）、１８８−１９６）で電気溶出し、ゲルか
ら２゜１４ｋｂ Ｂｌ′ＦｉＩＩ Ｓａｌ １１フラ
グメン）・を回収した。■＋ＧＶ１１６８ＤＮＡ ２μ
８を２単位のＢ８１１Ｉおよび２単位のＳａｔ、 Ｉで
完全に消化した。最終量２０μ！中、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ０．０２単位を用いてＢＢＩ ｌｌ−８ａｌ Ｉフラ
グメントＤＮＡ０．１μｇを０．０２μｇのＢｇｌ Ｉ
ＩＩ ５ａｌｌ消化ｐＧＶ１１６８とライゲーション
した。このライゲーション混合物をコンピテントＥ、
ｃｏｌｉＫ５１４ｈｓｒ−ｂｓ−細胞（Ｄａｇｅｒｔお
よびＥｒｌ山ｃ１１゜Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３
−２８）に導入した。細胞をストレプトマイシン（２０
μｇ／＋ｎｌ）およびスペクチノマイシン（５０μ８７
ｍ ｌ ）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎ
ｅｔｉｃｓ （１９？ ２ ）＋ Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬｏｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｎｅｕｌｌ、 ＹｏｒＫ）に塗抹した。 ストレプトマイシン−およびスペクチノマイシンー耐性
形質転換体から、マイクロスケールＤＮＡプレバレージ
ョン（Ｋｌｅｉｎ呟Ｐ ｌａｓ＋ｎｉｄ ３ （１９８
０）、ｌ−９１）を行なった。２．１４ｋｌ〕ＢＢＩ
ｌｌ−８ａｌ １７ラグメントがＢｇｌ ＩＩ Ｓａ
ｌ ｌ消化ｐＧＶ １１６８に挿入されている組換えプ
ラスミドを１３ビｌ１ｌ−８ａｌｔ消化により同定した
。 この消化で２．１４ｋｂおよび２１．８２ｋｂのンつの
７ラグメントが１υられた。これらの分子量（２，１４
ｋｌ）および２１．．８２ｋｌ＋）に相当する消化パタ
ーンを持ったプラスミドをｐＧＶ３１７１と名利け、さ
ら（こクローンするの１こ用いた。ｐＧＶ１ ］ ’７
１ ｈ・らの１２．６５ｋｂ ７７グメン１１ｉ、左右
の’ｒＬ−Ｄ Ｎ Ａ境界配列（Ｄｅ Ｂｅｕｃｋｅｌ
ｅｅｒら、ｉｎ Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎＢｓ Ｉｖｔ
ｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅ
ｎｃｅ ｏｎＰｌａｎｔ Ｐａｔｌ＋ｏｇｅｎｉｃ Ｂ
ａｃｔｅｒｉａ、 Ｍ、Ｒｉｄｅ’（ｅｄ。 ）（１９７８）、 １． Ｎ、 Ｒ，Ａ、 、Ａｎｇｒ
ｃｓ、１１５−１２６）および腫瘍性の増殖を可能にす
る遺伝子（Ｌｅｅｎ＋ａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、（１９８
２）、１．４７−１５２）を含んでいる。このＩ−１ｉ
夏＋ｄｌｌｌ フラグメントをプラスミドＩ）ＢＲ３２
５に挿入した（Ｂｏｌｉｖａｒ＋ Ｇｅｎｅ４（］ ９
７８）、１２１−１３６）。 １）ＧＶ１１７１およびｐＢＲ３２５はＢｅ１ｌａｃｌ
＋らの方法で調製した（Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ、３５（１
９７６）。 ２０３７−２１３４３）。それぞれのＤ Ｎ Ａ’ ２
μｇを２単位のＨｉｎｄ ＩＩＩを用い、３７°Ｃで１
時間完全に消化した（インキュベーション緩衝液はＯ゛
Ｆａｒｒｅｌｌらにより記載されている（Ｍｏ１．Ｇｅ
ｏ。 ＧｅｎｅＬ、１７９（１９８０）ｔ ４２］−４３５
））。 ０．１μ８のＨｉｎｄ ＩＩＩ消化したｐＧＶ １１７
１を、Ｈｉｎｄｌｌｌで線状化した０、０５μＢの１）
ＢＲ３２Ｓと、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．０２単位を用い
てライゲーションした。ライゲーション混合物によるコ
ンピテントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ５１４ ｂｓｒ ｂｓ
＋Ｉ＋＋の形質転換はＤａＢｅｒＬおよびＥｂｒｌｉｃ
ｈの方法で行なった（Ｇｅｎｅ ６（１９’８０ ）、
２ ’３−２８’）。細胞を、カルベニシリン（１０
０μｇ／ｌ１１１）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ
、 Ｅｘｐｅｒｉ＋ｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＧｅｎｅＬｉｃｓ （１９？ ２）、Ｃｏ１ｄ
Ｓ１＋ｒｉＢ ｌ−１ａｒｂｏｒ］、ａｂｏｒａｔｏ
ｒｙｗ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に塗抹した。カルベニシリ
ン耐性コロニーを、テトラサイクリン耐性を１晴号化し
ている遺伝子に挿入することによるその不活性化に基づ
ト、テトラサイクリン（１０μ８／ｎ１１）感受性でス
クリーニングした（ Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｇｅｎｅ ４
（１り°ン８）、１２１−１３６）。カルベニシリン
耐性、テトラサイクリン感受性のコロニーを、そのコロ
ニーから調製したＤＮＡの制限酵素消化により、マイク
ロスケール技法（Ｋｌｅｉｎら９ Ｐｌａｓｍｉｄ３（
１９８０）、８８−９１ ）によって物理的に特性化し
た。即ち、Ｂａ＋ｎＨＩ消化により、・１つのｌ）Ｎ
Ａ ７ラグメントが得られる：ａ配向の場合は０゜９８
ｋｂ、’ ４．７１ｋｂ、 ５．９８ｋｂおよび７．
０２ｋｂの７ラグメントが得られ、β配向の場合は０．
９８ｋｂ、４．？１ｋｂ、１．７１’ｋｂおよび１１．
２０ｋｂの７ラグメントが得られる。こうして得られた
ａ配向の組換えプラスミドはｐＧ’ｖ ７０ｊ）と名付
けられ、更にその後の実験に用いられた。 ｐＧＶ７５０は、ｐＧ Ｖ ７０１）に挿入されたＴＬ
−領域の内部の腫瘍に必須の機能を暗号化している３、
４９ｋｂ Ｂ’ＢＩ ＩＩ−８ｍａ ｌ ７ラグメン
トをカナマイシン耐性を暗号化している２、８１ｋｌ）
Ｂａ＋＋＋ＨＩ Ｈｐａ Ｉ ７ラグメントで置換
することにより、１）ＧＶ７００から誘導される。カナ
マイシン耐性を暗号化しているＢａ＋ｎＨＩ Ｈｐａ
Ｉ ７ラグメントはλ：： ｉ” ｎ ５ （Ｂ ｅ
ｒａ呟Ｐｒｏｃ、 ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ’＋、Ｌ
ＩＳＡ’？２（１９７５）、３６２８ ３６３２ ）か
ら得られる。λ：：Ｔｎ５の調製は Ｍｉｌｌｅｒによ
り記載されている（ Ｅｘｐｅｒｉ＋ｏｅｎｊ、ｓ ｉ
ｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（］９ ’７
２ ）、Ｃｏ１ｄ Ｓｌ）ＣｉｎｇＨａｒｌ）ｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ＋ Ｎｃｉｕ Ｙｏｒｋ）、 ｐＧ
〜’７００ＤＮＡはＢｅｔｌａｃｈらの方法で調製する
（ Ｆｅｄ、Ｆ’ｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７
−２９４３）。１）ＧＶ７００ＤＮ八２ｕｓ＆２単位ノ
ＢＢＩ Ｉ オ及び２単位の５ｈｏａｌ で完全
に消化した。λ：：Ｔｎ５Ｌ）ＮＡ２μｇを２単位のＢ
ａｍＨ’Ｉ および２単位の１−１ ｐａ Ｉで完全
に消化した。１μｇのＢａ５ａｌ−ＩＩ Ｈｐａｌ消
化λ：：ｉ’篩を、最終量１０μで中、Ｔ４’ＤＮＡす
〃−ゼ０．５単位を用いて、０．２μｇのＢｇｌＩＩ
５ｈｏａｌ消化ｐＧＶ７００とライゲーションした（
ｔ！！遺業者の指示する条件に従った）。このライゲー
ション混合物をコンビテン）Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ５１４−
十 ｂｓｒ ｌ＋ｓ＋＋＋ 細胞（１）ａｇｅｒＬおよ
びＥｒｂｌｉｃｌ＋、 Ｇｅｎｅ６（］ ９８１’））
、２３−２８）に導入した。細胞を、カルベニシリン（
１００μＢ／ｍ ｌ ）およびカナマイシン（２５μ８
／１ｅｌ）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ。 １尤ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
ＧｅｎｅＬｉｃｓ （１９７２）。 Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉＢ ）ｌａｙ市ｏｒ Ｌａｌ
＋ｏｒａＬｏｒｙ、Ｎｅｕ＋ Ｙｏｒｋ）−にに塗抹
した。マイクロスケール技法（Ｋｌｅｉｎら。 Ｐｌａｓ＋ｎ１ｄ３（１９８０）８８ ９１）に従って
調製したｌ） Ｎ Ａの制限酵素分析により、ＣｂＲお
よびＫｍ”コロニーを物理的に特性化した。この１）Ｎ
ＡをＢａｌ Ｉｆ／ Ｂａ５ａｌ旧で二重消化すると、
３．９４ｋｂ、ｓ、５ｑｋｂおよび８．０９ｋｌ＋の３
つの７ラグメントが、１ｌｉｎｄ ＩＩＩで消化すると
２．６８ｋｂ、５．９９ｋｂおよび９．２５ｋｂの３つ
の７ラグメントが得られる。この消化パターンを示すプ
ラスミドをｐＧ■７５０と名付け、第１７図に模式的に
示した。 ｐＧＶ７００とｐＧＶ７５０１ｉ、オフ） ビン’ｒｉ
プラスミドｐＴｉＢ６ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの左右の境界
配列を含む、２つの相異なる中間クローニングベクター
である。更に、これら２つのプラスミドではＴ−領域内
の削除の程度が異なっている。 ｐＧＶ７００は、オクトピンシンターゼ（トランスクリ
プト３）およびその他３つの生成物、即ち４．６ａおよ
び６ｂ （Ｔ−領域の生成物についてはＷｉｌｌ＋ｏｉ
ｔｚｅｒ ら、ＥＮＢＯＪ、］ （１９８２）。 １３９−１４６参照）のための遺伝情報を持った縮小Ｔ
−領領域含んでいる。この３つの生成物（４，６ａおよ
び６ｂ）の組み合せが形質転換された植物の新芽形成を
促す。ｐＧＶ７５０はもっと小さい］゛−領領域即ちオ
クトピンシンターゼ遺伝子だけを含んでいる。生成物４
，６ａおよび６１）の為の情報は、カナマイシン（ネオ
マイシン）耐性を暗号化して゛いる抗生物質耐性マーカ
ー遺伝子によりて置換されてしまっている。 ｐｃｉ Ｖ ７ （，１０およびｐＧ Ｖ ’７５０は
、Ｂタイプのアクセプター′旨プラスミド（第８図およ
び後記実施例３参照）と共に使用し得る中間クローニン
グベクターのイ列で゛ある。、これらのベクター（土、
それらがｌｌ１ｊ望の遺伝子を含んでいないことを除け
ば、第５ｊ図に示したものと部分的に類似している。 これらのベクターは、その改良′１゛−領域内にクロー
ンする為の１個の制限エンドヌクレアーゼサイトを含ん
でいるので、所望の遺伝子を簡単にそれらのベクターに
挿入することができる（第１・′［図および第１５図参
照）。 実施例３ アクセプター′Ｆｉプラスミド１）（ハ・”
２２６１．１ （タイプＢ）の組み立て出発株およびプ
ラスミド： Ａ８ｒｏｂａｃ１．ｅｒｉ＋ｎ＋＋ Ｌｕ＋ｎｅｆａｃ
ｉｅｎｓ （野生型ＡＢｒｏｂａ−ｃＬｅｒＩｕａ＋か
ら誘導される、リファンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１および
エリスロマイシン−クロラムフェニコール耐性株Ｃ５８
Ｃ１） Ｔｉ プラスミド＝ｐＧＶ２２１？ 中間ベクター（第１６図）＝ Ｉ）ＧＶ ７４５Ｔｉプ
ラスミドｐＧＶ２２１７の組み立てについては詳細に記
載されている（ Ｌｅｅ＋＋＋ａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、
［１９８２）、１４７−１５２）。 これは、オクトピン′１゛１プラスミドの全′１゛Ｌ−
領域の欠失置換突然変異体を含んでいる：即ち、Ｂａｍ
ＨＩフラグメント８．３（）ｂ、２８．１７ａおよびＢ
ａｍＨＩフラグメント２の左の３．７６ｋｂＢａｍＨＩ
−ＥｃｏＲｌフラグメント （Ｉｃｅ Ｖｏｓら。 Ｐｌａｓｍｉｄ ６（１９３１）、 ２ □１．９−
２ ’、＞ ３）か゛、Ｔ ｎ ５ のａｐｌ （アセ
チルホスホトランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいるｐ
ＫＣ７のＥｃｏＲＩ−１３ａｍＨＩ ７ラグメント（Ｒ
ａｏ ＆ Ｒｏｖｅｒｓ、 Ｇｅｎｅ７（１’：） ７
９）＋７９ ８２）で′置き換えられている。 この遺伝子はアミノグリフシト、ネオマイシンおよびカ
ナマイシンに対する耐性を暗号化している。 中間ベクターｐＧＶ？４５の組み立てを第１６図に模式
的に示した。これについて以下に詳述する。組換えプラ
スミドｐＧＶ７１３を、α配向でＨｉｎｄ ＩＩＩフラ
グメント１４．１８ｃ、２２ｅおよび３８ｃを含む、オ
クトピンＴｉプラスミドサブクローンｌ）Ｇ Ｖ ０２
１ ’、３ （Ｄｅ Ｖｏｓら、 Ｐ ｌａｓ＋ｎ１ｄ
６（１９８１）、 ２４９−２ｓ３）から誘導した。 １１ｃ；ＶＯ２１９ＤＮＡをＢａｍＨＩで完全に消化し
、次いで自己結紮（セルフライプ−ジョン）に有利な条
件下でライプ−ジョンした（ライゲージａン混合物中の
Ｄ Ｎ Ａの最終濃度く１μｓ Ｄ Ｎ Ａ ／＋ｎｌ
’）。 アンピシリン耐性で形質転換体を選別し、制限酵素によ
る消化で物理的に特性化した。こうしてｐｃｔ Ｖ （
、＞ ２１．９に存在する６、５ｋｌ〕Ｂａ＋ｎｊ刊フ
ラグメントをもはや含んでいないクローンを分離し、こ
れを １ｌＧＶ７１３と名（；Ｉけ、その後のクローニ
ングに使用した（以下の記載参照）。Ｂａｍ）−１１７
ラグメント２を含んでいる Ｉ）に＼；ｏ１２ｏ＜Ｉ）
ｅＶｏｓら＋ Ｆ’ｌａｓ＋１１ｉｄ 、６（１９８
１）、 ２４９−２５３）から組換えプラスミ°ド
ｌ）Ｇ Ｖ ７３８を誘導した。１）（八゛（月２０１
） Ｎ ＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐ（ｉＶ“７１３の
場合と同様にして自己結紮させた。 形質転換体をアンピシリン耐性によって選別上制限酵素
消化により分析した。ＥｃｏＲ１７ラグメント２０．１
２およびＥｃｏＲ１７ラグメント１９８の一部とＩ）Ｂ
Ｒ３２２の一部を含んでいる２゜９５ｋｂ ＥｃｏＲＩ
７ラグメントが全て除去されたりａ−ンをｐＧＶ７３
８と名付け、更にその後のクローニングに利用した。こ
のプラスミドは、依然としてＢａ＋ｎＨＩ ７ラグメン
ト２の右側部分からの５．６５ ｋｂ ＥｃｏＲＩ −
Ｂａ５ｏｌ（ｌフラグメントを含んでいる（Ｄｅ〜’ｏ
ｓら、 Ｐｌａｓ＋ｎｉｄ ６（］ ９８ ］）。 ２４９−２５３）。 次いでｐｃｉＶ ７１３ ＤＮＡを１−ｆｉｎｄ ＩＩ
ＩおよびＢａｎ＋ＨＩで消化し、消化物をプレパラティ
ブアガロースゲルにかけた。電気泳動の後、ｐＧ Ｖ
’７１３内に含まれている２、３０ｋｌ＋ Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ−Ｂａ＋＋＋ＨＩフラグメントを電気溶出で純化
した（Ａｌｌｉ１１８Ｌｏｎ呟Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｂ
ｅｍ、 ８５（１９７５）、 １８８−１９６）。この
フラグメントをｌ−１ｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨＩ
で完全に消化した１）に＼１７３８とライゲーションし
た。形質転換後、アンピシリン耐性コロニーを、制限酵
素消化により物理的に特性化する。例えは、ＥｃｏＲＩ
−Ｂａ＋ｎＨＩ消化により、それぞれ３． Ｌ：）
８ｋｂ （＝ベクタ一部分）と７Ｊ５ｋｂ（＝挿入部分
）の２つの７ラグメントが得られるはずである。この特
性を持った組換えプラスミドは１）ＣＩ Ｖ ７４５と
命名され、アクセプターＴｉプラスミド匹：＼・“２２
６ ＋）を組み立てるための申開ベクターとして使用さ
れた。 ７’？スミＨ＋＋ＧＶ７４５１ｉ ｐＢＲ３２２部９に
Ｃｏ１１ＥＪ特異的ＩＪＯ＋ｎサイトを持ってお１）、
実施例１に記載した様に（アクセプター′１゛１プラス
ミド１）に＼’ ：（８５（，１の組み立てについて）
、ヘルパープラスミド゛ＲＧ ４ ｄｒｄ ］ ４およ
びｐ（＋ Ｊ ２８を使ッてＥ、ｃｏｌｉからＡＨｒｏ
ｌ＋ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎへ摂動さぜることがでｂる。 １）に＼′７４５を、す７アンピシン耐性であり′１′
ｉプラスミド１）に＼’２２１７を含んでいるＡＢｒｏ
ｂａ−ｃ １．ｅ ｒ ｉ ＬＩ Ｉｌｌ抹Ｃ５３Ｃ］
に摂動させた。最初の乗り換えは、実施例１ （アクセ
プター′］゛ｉプラスミドｐＧＶ ３８５ｔ３の組み立
て）に記載した方法と同じ方法で、ｐＢＲ３２２のアン
ピシリン耐性を使って選択した。２回目の乗り換えによ
り、 １＋ＧＶ２２１７に存在する欠失置換突然変異体
がプラスミドｐＧＶ’７４５の１）ＢＲ３２２配列によ
って置換サレル。ｐＧＶ ７４５ノＩＩＧＶ ２２１７
トノ４ｔＪ互組込みの結果得られるアンピシリン耐性
トランス接合体を、カナマイシン耐性の欠落により直接
選別することにより第２の組換え体を得た。この様にし
て、ｐＧＶ２２６０（アンピシリン耐性、カナマイシン
感受性）・を含んでいるリファンピシンＡ ｇｒｏｂａ
ｃ Ｌｅｒ ｉ ＋ｕ＋＋株Ｃ５８Ｃ１を得た。 コノＴ＋ フッスミ）’ Ｉ）Ｃ； Ｖ ２２６１）１
．ｔ、Ｉ）Ｇ■７００−または１フＣ呵’＝”７５ り
一タイプの申開クローニングベクター用のアクセプター
プラスミド′（Ｂタイプ）として１史用されるもので゛
あｌる。これらは、（１）アンピシリン耐′ｌ／１．遺
伝子、複製起源および１］ＢＲ３２２のｂｏｍサイトを
持ったＤＮＡフラグメント、（ｉｉ）ＴＬ ＤＮＡの
左右の境界配列および、中間りａ−ユングベクターのＥ
、ｃｏｌｉがらＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移並
びにそ＜７）７クセプターＴｉプラスミｌ’ｐＧＶ２２
６０への相互組込みを遺伝学的に選別し得る、Ｉ）ＢＲ
３２２に既に存在している耐性マーカーとは別の、もう
１つの耐性マーカーを含んでいるＤ Ｎ Ａ ７ラグメ
ント、で構成されている。 例えば、本発明者らは、ｐＧＶ２２６０とｐＧＶ７００
との間の相互組込み体を持っているＡＢｒｏ−ｂａｃｊ
ｅｒｉｕｎ＋は、所望のＤＮ、Ａ配列（Ｔ−ＤＮＡ境界
の開に含まれている）を植物細胞ゲノムヘ転移させ得る
ことを立証した。この形質転換された植物細胞は、もし
ｌ）Ｇ’７００が３つの生産物のための遺伝情報（４，
６ａ、６ｂ ； Ｗｉｌｌ＋ｎ１ｔｚｅｒ呟ＥＭＢＯＪ
、 １（１９８２）、１３９−１４６）を含んでいる場
合は、期待される表現形質、即ち新芽を生じる腫脹を示
す。をの緑に、本発明者らは、Ｂタイプのアクセプター
Ｔｉプラスミドは、第９図に示し、更に実施例２に記載
したタイプの申開りａ−ユングベクターとの相互組込み
体として使用すると、Ｄ Ｎ Ａを植物細胞に転移させ
ることができることを証明した。 大箱−１１ｆ１４ 植物に発現させようとする遺伝子
を含んだ中間りＶ−ユングベクターの組み立て本発明が
完成されるまで、′１゛Ｉプラスミドの１゛−領域内の
、多かれ少ながれでたらめな位置に全遺伝子を挿入して
も、その外米性の配列が植物ゲノムへ転移した後発現さ
れるということはなかった。本発明方法に従えば、所望
の外米性遺伝子（群）の暗号領域を、植物細胞中で機能
することが知られている転写開始および終了信号に連結
することができる。この方法の有用性は、ツバリンシン
ターゼ遺伝子を暗号化しているＤＮＡ配列が関与する、
本発明の実験によって例証される。この遺伝子の全配列
および正確な転写開始および終了は既知である（Ｄｅｐ
−ｉｃｋｅｒらＪ 、 Ｍｏｌ、 Ａｐｌ＋ｌ、 Ｇｅ
ｎｅＬ、１（１９８２）、５６１−５７４ ）。本発明
によれば外来性遺伝子の蛋白質ｕｉ号化領域はｌｌＯｓ
プロモニターの隣りに挿入することができる。外米性遺
伝子配列の例として、オクトピンシンターゼ遺伝子の暗
号領域（Ｄｅ Ｇｒｅｖｅら、Ｊ、八４ｏ１゜ＡＩ）Ｉ
）Ｉ、 Ｇｅｎｅｔ、 １（４９８２）、４’：）
９ ５１２）をｌｌ０Ｓプロモーターに隣接させて挿
入する。この構造物はアクセプターＴｉプラスミド内に
授動され、植物を感染させるのに使用される。生成した
腫瘍組織にオクトピンが存在するがどうかを分析した所
、陽性であることがわかった。 キメラツバリンプロモーターを含有している中１１りり
ａ−ユングベクターの組み立て：オクトビンシンターゼ
構造遺伝子を第１８図〜第２０図に示す。 簡単に言えば、ｌＩＯ３遺伝子を含んでいる制限７ラグ
メントＨｉｎｄ ｌｌｌ−２３をインビトロで処理して
１ｌＯ８Ｉ］ｊｔｆ配列の大部分を除去するーノへ制限
エンドヌクレアーゼサイ） Ｂａ＋ｎＨＩに＠接してい
るｌｌ０Ｓプロモーターは保持する（第１８図）。１０
μ８の ｐＧＶＯ４２２（完全なｎｏｓ遺伝子を含むｌ
１ｉｎｄ ｌｌｌ−２３７ラグメントを持った１）ＢＲ
３２２誘導体； Ｄｅｌ＋１ｃｋｅｒら、Ｐｌａｓ＋１
Ｉｉｄ （１９８（、））、１９’３−．２１ ］）を
５ａｕ３Ａで消化り、ｎＯＳプａモーターを含んだ３５
０１＋ｐの７ラグメントをプレパラティブ５％ポリアク
リルアミドデルで分離する。このプロモーター７ラグメ
ントｉ、５゛−末端燐酸エステル基を除去するために予
め細菌性アルカリホス７７ターゼ（ＢＡＰ）で処理した
、Ｂｇｌ Ｉｌ−切断ｐＫＣ７（Ｒａｏら、Ｇｅｎｅ７
（１９７９）、７９−８２）に結合させる。得られたプ
ラスミド（ｐＬＧＶｌ ３）２０ｕｇをＢｇｌｌｌＦ消
化し、４００ｐｉの１２ｍＭ ＭｇＣｌ□、１２Ｉ＋＋
Ｍ ＣａＣｌ２．０．６Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡおよび２０１ｎＭトリスーＨＣＩ（ｐＨ８，０）中
、３０℃でＢａｌ ３１エキソヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌ
ａｂｓｓ Ｎｅｕ＋ ＥＨｌａｎｄ）７単位を用いて４
〜１０分間処理する。この間、約２Ｏ−５０ｂｐのＤＮ
Ａが除去される。このＢａ１３１−処理分子をＢａ＋ｎ
ＨＩで消化した後、ＤＮＡポリメラーゼのＫ ｌ ｅｎ
ｏｕ＋ ７ラグメントと４つのデオキシヌクレオシドト
リ本スフニー） （それぞれ１０１０１ｆ１と共にイ
ンキュベートして、その末端を満たす。充填されたＢａ
ｎ＋ＨＩ末端とＢａ１３１除去末端とのライプ−ジョン
から得られる再生Ｂａ＋ｏＨＪサイトを持ったプラスミ
ドを選別する。いくつかの候補のＢａ＋ｏＨＩ −８ａ
ｃ ＩＩ ７ラグメントのサイズを６％尿素−ポリアク
リルアミドデル中で見積り、サイズが２００〜２８０ヌ
クレオチドの範囲にある候補のヌクレオチド配列を決定
する。 プロモーターを持った２ １） ３ ｂｐの５ａｃｌｌ
−、Ｂａ＋ｎＨｌフラグメントを含んでいるりひ−ンｐ
Ｌ （＋ Ｖ３（１を、ＩＩＧ ■０４２２の １１
０８遺伝子中のＳａｃｌｌ−ＢａｍＨＩ７ラグメントと
置換するのに使用するユニの最終プロモーターベクター
は１＋ １． Ｃｉ ’Ｖ２３８１と呼ばれる。全ての
組換えプラスミドはＥ、ｃｏｌｉ株ＨＢ １ ’０１の
形質転換により選択する。 この様に処理した＋１０８プロモータを含んでいるプラ
スミドベクターをＢａ＋ｎＨＩで消化し、Ｂａ＋ｎＨＩ
フラグメントに含まれているＯｅＳの暗号配列をこのサ
イトに挿入する。このＯｅＳ暗号配列も、インビトロで
処理し、第１９図に示した様に、Ｂａ＋ｎｌｌ ｌ制限
エンドヌクレアーゼサイトで囲まれる様にする。オクト
ピンＴｉブラスミｒＢ６ｓ３のＢａｒｎｌ−Ｉ Ｉ ７
ラグメント１ ’７ａｌ Ｏμｇ（Ｄｅ Ｖｏｓら。 Ｐｌａｓ＋ｏｉｄ ６（１９８１）、２４９−２５３）
をＢａｍ１−Ｉ ＩおよびＳｍａＩで消化し、ｏｃｓ−
暗号配列を含むフラグメントを１％アガロースゲルから
分離し、１３ＢＲ３２２の大きイＢａｍＨＩ Ｐｖｕ
ｌ Ｉ ７ラグメントに結合させる；得られたプラス
ミド、ｐＡＧＶ ８２８（２０μｇ）をＢａｍＨＩで消
化し、第１８図に示した様にエキソヌクレアーゼＢａ１
３１で処理し、次いでＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、末端
を充填し、自己結合させる。Ｂａ１３１除去体のサイズ
は６％ポリアクリルアミドデル中で見積る。いくつかの
候補のヌクレオチド配列を決定し、５゛−非翻訳リーダ
ー配列の残り７ｂ１】だけを持った候補を選択して以下
の操作に付す（＋）ＯＣ３△）。ｏｃｓ配列をＢａ＋ｎ
ＨＩサイトで囲むために、Ｃ１ａｎ−Ｒｓａ■７ラグメ
ントを充填し、ＩＩＬ Ｃ２３６（Ｒｅｍａｕｔら、Ｇ
ｅｎｅ１５（１９８１）、８ｌ−９３）のＢａｌ Ｉサ
イトにサブクローンする。得られたプラスミドｐＡＧＶ
４０をＢａＩＩＩＨＩで消化し、ｏｃｓ配列を持ったフ
ラグメントをプレパラ７４１１％アガロースデルから電
気溶出により分離し、予めＢａｍＨＩで消化しＢ Ａ
Ｐ （細菌性アルカリホスファターゼ）で処理したｐＬ
ＧＶ２３８１に結合させる。 ｏｃｓ配列のｐＬＧＶ２３８１への挿入により、両方の
配向の、ものが得られる曽）’Ｎ０−１およびｐＮ０−
２）。 ｎｏｓ ： ｏｃｓ融合の正確な接合点を示すヌクレオ
チド配列を第２０図に示す。 更に、処理したｎｏｓプロモーターを含有しているプラ
スミドベクターは、酵素ジヒドロフォレートレグクター
ゼを暗号化しているプラスミドＲ６７からのＤＮＡを挿
入するのに使用される。ノヒドロ７オレートレダクター
ゼ遺伝子を含んでいる暗号配列は、Ｂａ＋ｎＨＩに含ま
れており （０’１１ａｒｅら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７８（］ ９
８１）＋１５２７ １５３１）、従って既述した様に、
プロモーター領域に隣接するＢａ＋１１）Ｉ Ｉサイト
を含んでいる口ＯＳプロモーターベクターに容易に挿入
される。この遺伝子は、発現されると抗生物質メ））レ
キセードに対する耐性をイ４与するので、選択可能なマ
ーカー遺伝子の１つの例である（第２．３，４．５およ
び７図参照）。この中間クローニングベクターか野生型
ツバリンアクセプターｉ’ ｉ プラスミドを含んでい
るＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎに摂動されると、単一
乗換えが起り、ハイブリッドＴｉプラスミドベクターが
得られる。このベクター組成物を、植物の感染に使用す
る。得られた腫瘍組織は、０．５μｇ／Ｉｎｌのメ））
レキセードの存在下で継続して生長し得ることがわがっ
た。 ｏｃｓおよび上記のｎｏｓプロモーターの後のジヒドロ
フオレートレグクターゼロｉ号領域を含んでいる中間ク
ローニングベクターを組み立て、Ａｇｒｏ−ｂａｃＬｅ
ｒｉｕｍのＴｉプラスミドと相互組込みした後、形質転
換植物細胞に転移、発現させることにより、本発明方法
によって外来性遺伝子を植物細胞に転移し、発現させる
ことができるということが証明される。 ヌ施例５ 染色体中に所望の挿入遺伝子を含む植物細胞
および植物の分離 本発明者らは、以下の３つの方法のいづれがを使って、
非腫瘍性アクセプタ−１゛１プラスミド誘導体（例えば
Ｉ）ＧＶ３８５Ｕ）で形質転換された植物細胞および全
植物を得た。 （１） インビボでの全植物の接種、次いで新芽の再生
が可能な培地上、インビトロでの培養、（２）損傷部位
で直接新芽の生成を促す他のＡＢｒｏｂａｃｌｅｒｉａ
株の存在下、インビボにおける全植物の相互感染、 （３）インビトロでの単一植物細胞プロトプラストの共
生培養。 これらの方法について以下に詳述する。 最初の方法は、クラウンガル組織の生産をもたらす全植
物組織の野生型Ａｇｒｏｌ＋ａｃＬｅ、ｒｉｕｂ＋株に
よる感染体を得る為に通常使用される方法を改良したも
のである。ｐＧＶ３８ｇＯは腫瘍を形成しないＡ２ｒｏ
ｂａｃｌｅｒｉ＋ｕ＋＋誘導体であるので、感染部位に
おいて腫瘍の増殖はみられない。しかし感染した組織を
取り除き、組織培養η増殖させると、形質転換された組
織を容易に得ることができる。初期培養期間（単に組織
の量を増やすため）の後、損傷部位組織を新芽形成が可
能な条件下で増殖させる。 非形質転換細胞およびＩ）、Ｇ Ｖ ３８５０−形質転
換細胞の両者が新芽を発生する。形質転換新芽は、７パ
リンの存在をみる簡単な分析により容易に区別すること
がでトる。 本発明者らは、次のプロトコールに従って、Ｎ１ｃｏｔ
ｉａｎａ Ｌａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｃｏｏｓｉｎ ３８
の頭部を切断したタバコの苗木から、ｐＧＶ３８５０−
形質転換カルスおよび新芽を得た（全ての操作はラミナ
ー７０−フード中、無菌条件下で行なった）。 （１）小さなびん（直径１０ｃｔｎ、高さ１０ｃ＋ａ）
の中で、０．８％の寒天を含む固形のＭｕｒａｓｌ＋ｉ
Ｂｅ ＆Ｓ ｋｏｏｇ（Ｍ Ｓ ）培地（Ｍｕｒａｓｌ
＋ｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ。 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｐｌａｎｔ、 １５（１９６２）
＋ ４．７３−４９７）で生Ｗさせた６周令のタバコ
の苗木を使用する。 （２）外科用メスで最も若い頭頂の葉を切り取って捨て
る （３）選択的条件（例えばＴｉプラスミド１）ＧＶ３８
５０を含んでいるり７７ンピシン耐性、アンピシリン耐
性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の場合は、１００μ８
／［１１１のり７７ンビシンと１００μ８／ｍ１のカル
ベニシリンを含んでいるＹＥＢ培地を使用する；ＹＥＢ
培地＝５ｇ／１． ＢａｃＬｏビーフェキス、１ｇ／Ｉ
！、 Ｂａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／（！、ペプトン
、５ｇ／ｉシュクロース、２×１０°３ Ｍ Ｍｇ５Ｏ
４ｔ１］Ｈ７，２，１５ｇ／４寒天）で増殖させた新鮮
な平板培養からのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、スパ
ーチルまたはつまようじで損傷表面に接種する。各ｐＧ
Ｖ ３８５０組み立て物を、少なくとも８本の苗木に
接種する。 （４）２週間インキュベートする。接種部位にほとんど
あるいは全く反応が表われないはずであるが、時々考償
に小さいカルス（ｃａ’ｌ ｌ ｉ ）が観察される。 （５）損傷表面から厚さ１ ｍａｎ以下の薄い切片を切
り取る。損傷表面を、オーキシンおよびサイトキニン（
１＋ｎＨ／ 、ＣＮ Ａ Ａ、０．２ｍ１Ｂ／ｆｌ
ＢＡＰ）および１％シュクロースを添加したＬ ｉｎｓ
ｍａｉｅｒ ＆Ｓ ｋｏｏｇ（１，ｓ）寒天培地（Ｌ
ｉｎｓ＋ｎａｉｅｒ ａｎｄ ５ｋｏｏｌ；、 ＰＩ＋
ｙｓｉｏｌ。１）ｌａｕｔ、１８（１９６５）、１００
１２７）を含む平板上で培養する。 （６）約６週間後、カル又はその一部をとって７パリン
の存在を試験するのに十分なだけの大きさになる（少な
くとも直径が約５ｍｍになる）。全ての損傷カルスがツ
バリンを生産する訳ではない。４本の植物の内約１本が
ツバリン陽性損傷カルスをつくる。 （７）ツバリン陽性カルスを再生培地を含む寒天平板に
移す二上記のＬＳ培地＋１％シュクロースおよび１ ｎ
＋ｇ／ ｌ Ｂ Ａ Ｐサイ）・キニン（８）約４〜６
週問後に良好なサイズの新芽（高さ１ｃ＋ｏ）力咄る。 更に成長させ、根を形成させるために、この新芽を、ホ
ルモンを會↓ｔｒＬＳ培地＋１％シュクロースを含有し
ている新しい寒天平板に移す。 （９）ツバリンの存在を試験するのに、その一部（１〜
２枚の小さな葉）を切り取れる様に、この新芽を１〜２
週間成長させる。 （１０） ツバリン陽性の新芽を、（１）と同しＭＳ
培地を入れたやや大こい容器（上記と同じ１０ｃｎ＋の
びん）に移し、更に成長させる。 注）感染させた組織のための全ての植物培養培地には、
ｐＧＶ３８５０含有ＡＨｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋ｏに対
する選択的毒物として、抗生物質セフオタキシム（ｃｅ
ｆｏｌ、ａｘｉｍｅ、 Ｃ１ａｆｏｒａｎ Ｒ、ヘキス
ト）５００ ｕＢ／ｍ ｌが含まれている。この薬物は
、全てのＡＢｒｏｌ〕ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎ（カルベニシ
リン耐性のも゛のを含む）の生長をよく阻止する。 本発明者らの研究室で、形質転換された新芽を出す組織
を得る別の方法が開発された。この方法は、Ａｇｒｏｂ
ａｃＬｅｒｉｕｍのある種のミュータントＴｉプラスミ
ド株が、新芽を出すクラウンガル腫脹を生成させるとい
うことを観察したことに基いて開発された。この様な新
芽−誘起（ｓｌ＋ ｉ ）に関する突然変異は、Ａ、Ｌ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドの′１゛ＤＮＡ
（転移ＤＮＡセグメント）の特定の領域に位置している
（Ｌｅｅｔａａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、
１４７−１５２； Ｊｏｏｓら、Ｃｅ１ｌ ３
２（１９８３）＋ １０５７ １０６７）。誘起され
た新芽は完全に正常な非形質（換細胞で構成されている
ことが多い。従って本発明者らは、２つの異なったＡｇ
ｒｏ−ｂａｃＬｅｒｉａ、即ち１つはオクトピンＴｉプ
ラスミド放出（ｓｈｏｏＬｅｒ）ミュー〉ントを持った
もの、もう１つはｐＧＶ３８５０を持ったもの、の混合
物で植物を接種した。この様にすることは、オクトピン
放出ミューチージョンが、ｐＧＶ３８５０で形質転換さ
れた根を誘起することが出来るよい（成金を与える。Ｔ
ｉプラスミミドＧＶ３８５Ｕおよびオクトピン新芽誘起
Ｔｉプラスミドを５：１の割合で含んでいる’ＡＢｒｏ
ｂａｃＬｅｒｉｕｍを植物に接種した。こうすることに
よりｐＧＶ３８５０−形質転換新芽を得た。この新芽は
、ツバリンの存在について分析することにより、容易に
選別することができる。この方法は、精功な紹織培養法
を必要としない。ツバリン陽性新芽を、更に成長させる
ために、長調節ホルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含ん
だ培地に移す。新芽が十分な大きさに達した後、容易に
繁殖の為の土壌に移すことができる。 この共感染法は、簡単に組織培養しにくい種類の植物を
形質転換するのに特に有用である。従って、あらゆる範
囲の農学的にあるいは経済的に重要な植物、例えば豆科
植物、薬用植物および装飾植物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍで処置することか゛できよう。 第３の方法は、Ｎ １ｃｏＬｉａｎａ ｔａｂａｃｃ
ｕ＋＋プロトプラストの単離およびホルモン−非依存性
の′Ｉ゛〜ＤＮＡ−形質転換細胞クローンの選択を、そ
のプロトプラスト−由来細胞と腫瘍性Ａｇｒｏｌ〕ａｃ
ｔｅｒｉｕｔｎ株との共培養後に実施し得るものである
。池の優勢な選択マーカー、例えば高等植物細胞で発現
−れる様に組み立てられた抗生物質耐性遺伝子を使用す
れば（実施例３参照）、形質転換細胞を選択するのに類
似の方法を使用することがでとる。しｈ化この場合は、
それぞれのケ スについて選択の最適条件をみつける必
要がある（選択剤の濃度、形質転換と選択の開の時間、
選択培地中のプロトプラスト−由来細胞または細胞コロ
ニーの濃度など）。 形質転換細胞の選択ができない場合、例えば１）ＧＶ
３８５０またはｐＧ Ｖ ２２１ ？ （Ｌｅｅｔａａ
ｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１ （１９８２）、１４７−１
５２）の様な非毒性の゛ｒ−ＤＮＡミュータントを用い
たために選択が不可能な場合は、遺伝学的形質転換の後
に細胞をオーキシン−およびサイトキニン−含有培地（
例えば２ ｍｇ／矛のＮ Ａ Ａ （ａ−す７タレン酢
酸）ｊＨよび０．３ｆＩ１ｇ／ ｐのカイネチンを含む
Ｍｕｒａｓｈ’ｒｇｅおよびＳ ｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒ
’ａｓｂｉｇｅおよび５ｋｏｏＨ，Ｐ ｔ＋ｙｓｉｏｌ
、 Ｐｌａｎｔ １５（１９６２Ｌ ４７３−４９７）
）で培養し、形質転換コロニーをそのオパイン（ｏｐｉ
ｌｌｅ）含有量で同定することができる。この様にして
、アグロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ）およびマノピン（Ｉ
ｌｌａ １１１１Ｏｐｉｎｅ）合成の電気泳動分析（方
法については［、ｅｅＩｌｌａ１１８ ら＋ Ｊ、
Ｍｏｌ、 Ａ１＋ｐ１． Ｇｅｎｅｔ、 １
（１９８１）＋１４９−１６４参照）の後、約６６０コ
ロニーが、１）ＧＶ２２１７ テ感染後ニ得うレ、’ｒ
’Ｒ−１１ｉ号化オパイン・マノピン（Ｎ２−（１−マ
ニチル）−グルタミン）を合成する Ｎ １ｃｏＬｉａ
ｎａ ｔａｌ〕ａｃｕ＋ｎ ＳＲ１セルラインであ
ることかわがった。このセルラインのカルス切片を再生
培地（唯一の植物成長調節剤としてＢ Ａ Ｐ （６−
ベンジルアミノプリン）口１ｇｉ ｆｌ ）を含むＭｕ
ｒａｓｌ＋ｉｇｅ ａｎｄ ５ｋｏｏ８培地）上で培養
すると、数多くの新芽が形成した。分析した２０の新芽
の全てが、依然としてマノピンを合成することができた
。ホルモンを含まないＭｕｒａｓｂｉｇｅ ａｎｄ
Ｓｋｏｏｇ培地に移した後、これらの新芽は、依然とし
てマノピンを含有し、形態学的に正常なタバコ植物に成
長した。 Ｎ、 Ｌａｂａｃｕｎ＋につぃて次に記載するプロトプ
ラストの分離および形質転換法は、Ｎ 、ｉｔ ｌ ｕ
＋ｎｂａｇ’ｉ ｎ ｉ −ｒｏｌｉａにも用いること
ができる。 ２、実験手法 ２．１．新芽培養条件 培養室内の無菌条件下（１日１６時間、ｉ ｓｏｕルッ
クスの白色蛍光（“ＡＣＥＣＬＦ ５８Ｗ／′２４、
３０ （１’ Ｋ Ｅｃｏｎｏ＋ｎｙ”）、２４℃、
相月洛！度７（）％）、２５０＋Ｊのガラスびんに入れ
たホルモン不含のＭｕｒａｓｈｉＩｌｌｅ ａｎｄ Ｓ
ｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒａｓｌ＋ｉ８ｅおよびＳｋｏｏｇ
＋Ｐｂｙｓｉｏｌ、 Ｐｌａｎｔ １５（１’、）
６２Ｌ４．７３−４９７）Ｊ二でＮ １ｃｏｔｉａｎａ
ｔａｌ〕ａｃｕ＋ｎの新芽培養を維持する。５退会
の新芽培養をプロドブ２ ラストの分離に使用する。 ２．２．プロトプラストの分離 プロトプラストの分Ｓｌおよび培養における全ての工程
は無菌操作で行なう。混合５ｙ素法によりプロトプラス
トを分離する。長さ２ｒ：ｔｎ以下のｊ；ニ常に若い葉
を除く、全ての葉をプロトプラストの分離に使用するこ
とができる。鋭利な外科用のメスで、葉を幅約２−３１
１ＩＩ１１の細長い小片に切断する。この葉材料２〜３
ｇを、酵素混合物５０ Ｉｌｌ ｌ中、暗所で、２４℃
にて１８時間静置培養する。この酵素混合物は、ホルモ
ン不含のに３培地中、０．５％セルラーゼＯｎｏｚｕｋ
ａ Ｒ−１０および０．２％マセロザイム０ｎｏｚｕ
ｋａＲ−１０からなっている（ＮａｇｙおよびＭａｌｉ
ｇａ＋ Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｂｙｓｉｏｌ、 ７
８（１９７６）、４５３−４５５）。この混合物は、０
．２２μ翰細孔膜を通して）濾過滅菌し、顕著な活性の
低下をきたすことなく、−２０’Ｃで少くとも６力月間
貯蔵することができる。 ２．３．プロトプラスト培養 １８時間培養した後、プロトプラストを放出するために
混合物を穏やかに攪拌する。次いでこの混合物を５０μ
ｍのふるいを通して濾過し、シ戸液／を１０ｍ１の遠心
管に移す。振動バケツローターに入れて６０〜８０ｇで
６分間遠心分離すると、プロ）プラストが暗緑色の浮遊
バンド（帯）を形成する。プロトプラス１の下層の液お
よびペレット状の残骸を、蝶動ポンプに連結した毛細管
を使って取り除く。プロトプラストを１つの遠心管に集
め、培養培地で２回洗浄する。この培養培地は、ＮＡＡ
（０，１ｍｇ／／２）およびカイネチン（０，２ａ＋ｇ
／夕）を成長調筋剤として含有するに３培地である（Ｎ
ａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚ
ｅｎｐｌ＋ｙｓｉｏｌ。 ７８（１，９７６）、４５３−４５５）。この培地は１
）Ｈ５，６に調節し、０．２２μｍの濾過膜を通して滅
菌する。２回目の洗浄の後、ＴＩ＋ｏ＋ｏａ血球計算器
（“Ａ’５ｓｉｓＬａｎｔ”＋西ドイツから入手）を用
いてプロトプラストを計測し、最終密度１０５プロトプ
ラス）／Ｊとなる様に培養培地に懸濁する。直径９ｃｍ
の組織培養用良質ペトリ皿当たり１．０ｍρの容量でプ
ロトプラストを培養する。このペトリ皿をＰａｒａＦｉ
ｌｍＲでシールし、２４°Ｃで、暗所次いでかすかな光
（５００〜１０００ルツクス）を当てて２４時間培養す
る。 ２．４．共生培養による形質転換 分離５日後１こプロトプラスト培養株を感染させる。Ａ
ｇｒｏｌ）ａｃＬｅｒｉｕｍを液体ＬＢ培地（Ｍｉｌ
ｌｅｒ。 Ｅｘｐｅｒｉ＋ａｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕ’
ｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）、 Ｃｏ１ｄ
Ｓ１＋ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ。 Ｎ ｅｗ Ｙ ｏｒｋ ）中で１８時間培養後、２Ｘ
１１Ｊ９細胞／１１の密度となる様にに３培養培地に再
懸濁する。この懸濁液５０μρを植物プロトプラスト培
養株に加え、Ｐ ａｒａｆ ｉ ｌ＋ｎＲでシールした
後、この培養株を２．３．と同し条件下で培養する。４
８時間後に培養株をＩＯＪの遠心管に移し、振動バケツ
ローターに入れ、６０〜８０８で゛６分間遠心分離する
。浮遊パンＶおよびペレットを集め、抗生物質（カルベ
ニシリン１０００μＢ７Ｊまたはセ７才タキシム５００
μｇ７’ｌｌ＋／）を補足したに３培工也（Ｎａｇｙお
よびＭａｌｉ８ａ、 ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎ １ｄ＋
ｙｓｉｏ１゜７８（１９７６）、４５３−４５５）１（
１，＋Ｃに内１強濁する。 培養２週間後、プロ「プラスＦ−山米マイクロカルスな
遠心分離し、前記と同濃度の成長調節剤および抗生物質
を含むがシュクロー−スに関しては０．４Ｍの代りに０
．３Ｍ含むに３培地（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ＋
Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｂｙｓｉｏｌ、７８（１９７
６）、４５３−４５５）に再懸濁する。この培地の細胞
密度は約２５Ｘ１０’マイクａカルス７Ｈ（，１に調節
する。同じ条件下で更に２週問培養した後、カルスを、
前記と同濃度の抗生物質を含むが、より低濃度のシュク
ロース（０，２Ｍ）と成長調節剤（ＮＡ Ａ Ｏ、（１
１ｍｇ／ムカイネチン０．０２ｍｇ／、ｅ）を含む）（
３培地に移す。更に２〜３週問培養後、形質転換体と推
定されるものは、その淡緑色の密な外観、およびより良
好な成長度から認識することができる。これらのコロニ
ーを、より低濃度の抗生物質（カルベニシリン５００μ
ｇ／Ｊまたはセ７オタキシム２５０μｇ／＋ｏ、ｅ）を
含むがホルモン不含の（）、６％寒天固形培地（Ｌ ｉ
ｎｓｍａｉｅｒおよび５１（００＆＋ Ｐｌ＋ｙｓｉｏ
Ｌ Ｐｌａｎｔ、 ］ ８（１９６５）＋ Ｉ （、）
０−１２ ’７ ）に移す。形質転換体と推定される
ものが直径約３−４１１１１１１に達した時、ホルモン
不含の培地で生育しでいるそれらにオパイン試験を施す
、二とか゛できる。各コロニーの半分を、オクトピンお
上びツバリン（Ａｅ、ｒｔｓら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ
、 Ｌｅｆｔ。 １７（１９７９）、４３−５０）またはアグロピンおよ
びマノピン（Ｌｅｅ＋ｏａｎｓら９Ｊ、Ｍｏ１．）＼１
１１）ｌ。 Ｇｅｏｃｔ、１（１９８１）、１４’Ｊ”１６４）の検
出に使用する。この試験により、ホルモン不含の培地で
選択されたコロニーの形質転換された性質を確認するこ
とＡ藏できる。その後、選択されたコロニーを抗生物質
不含の培地で培養することができる。 ２．５．ホルモン不含培地上の選択なしの共生培養 形質転換細胞の為の選択ができない（例えば無毒性Ｔ−
ＤＮＡミュータントを使ったため）場合、またはそれが
必要でない場合（抗生物質耐性遺伝子の様な優勢な選択
し得るマーカーかＴ−ＤＮＡに存在している為）、プロ
トプラスト−由来細胞の処理を簡略化することができる
（ホルモン減少工程はもはや必要でない）。感染段階ま
で、プロトプラストを既述した様に処理する。細菌を加
えて４８時間後にプロトプラスト−由来細胞を遠心分離
しく６分、６０６０−８Ｏ、非常に低密度で細胞の成長
を維持することができるＡＧ培地（Ｃａｌ〕ｏｃｂｅ。 Ｆ’１ａｎＬａ ｉ ４９（１９８０）、 ７−１８
）に再懸濁する。Ｆｕｃｌ＋５−Ｒｏｓｅｎｔｌ＋ａｌ
計数チェインバー（“Ａ ｓｓ ｉ ｓ Ｌａｐ Ｌ”
、西ドイツより入手）を使って計測し、以下の操作に
必要な密度になる様に再懸濁する。 オパイン試験のためにコロニーを個々に繰作しなければ
ならない場合は、低細胞密度（１１０ρ当たり１０ （
’ｌプロトプラストー由未来胞および細胞コロニー）で
植えつけると、１力月の培養で大きい細胞コロニーが得
られる。形質転換細胞を薬物で選択で外る場合は、細胞
を高密度（１１’、ｌ ’ １０ ’７ｍ℃）で培養
し、各タイプの選択に最適な時期及び濃度で、その使用
する選択剤を培地に添加する。 ２．６．カルス組織から全植物の再生 カルス組織から正常植物を容易に得ることができる（例
えばプロトプラスト形質転換から、または全植物接種か
ら（２，７参照）得られる）。カルス組織を、］ ｕ＋
ｇ／ｌｌ１ｐのＢ Ａ Ｐを含んでいるＭｕｒａｓｌ＋
ｉｇｅａｎｄ ’Ｓｋｏｏｇ培地で増殖させる：この培
地は１〜２力月後に新芽を形成水せる。この新芽をホル
モン不含の培地に移し、根を形成させ、完全な植物をつ
くらせることができる。 ２．７．タバコ苗木への腫瘍の誘導 タバコの種子（例えば栽培品種Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
３８）の表面を７０％変性エタノール／トＩ２０で２分
間、次いで１０％の市販の標白剤と０．１％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）で処理して滅菌し、更に滅菌水
で５回洗浄する。この滅菌した種子を、Ｍｕｒａｓｈｉ
Ｈｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（０，７％寒天）培地の
塩類を含む大型試験管（幅２５ Ｉｎ１１）、ポリカー
ボネー１製のキップ付）にまく。次いでこの試験管を培
養室（１２，０００ルツクス、１６時間照射／８時間非
照射、７０％相対湿度、２４℃）に入れて培養する。４
〜６週間経つと植物は使用で外る状態になる。少なくと
もその後１カ月間は最適の状態を維持する。苗木は少な
くとも高さ３ｃｕ＋になり、４枚またはそれ以上の葉を
持つはずである。新しい外科用メスで植物の最も若い部
間を通して横に頭部を切断する。植物の上の部分を試験
管から取り除き、火にかけたスパーチルで平板寒天培養
から細菌を損傷表面に塗抹する。野生型の場合は２週間
後に、ある種の変性ミュータント株の場合はもっと後に
腫脹が現れる。この方法は、タバコ（Ｎ １ｃｏＬｉａ
ｎａ Ｌａｂａｃｕｎ＋）、 Ｎ １ｃｏＬｉａｎ
ａ ｐ、ｌｕｎ＋ｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａおよびび
ＰｅＬｕｎ１ａ ｈｙｂｒｉｄａを接種するのに使わ
れる。 以上述べた如く、本発明は、野生型Ｔｉプラスミドの１
゛−領域の腫瘍機能が欠落しているハイブリッドＴｉプ
ラスミドを保持しているＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍで
、初めて植物を形質転換することを可能ならしめたもの
である。Ｔｉプラスミドから植物細胞へのＬ） Ｎ Ａ
の転移に及ぼす１゛−領域の腫瘍機能の影響は知られて
いないので、それでも所望の遺伝子を含んでいる改良１
゛−領域の植物細胞への転移が起ることは驚くべきこと
である。この転移ＤＮＡは植物細胞ゲ゛ツムに相互組込
みされ、安定に保持される。更に、選択した所望の遺伝
子は、その遺伝子が適当なプロモーター配列を含んでい
るか、あるいは含む様に組み立てられると発現すること
ができる。所望の遺伝子を含んでいる中間クローニング
ベクターと、特別に設計されたアクセプターＴｉプラス
ミドとの開で単一乗換えを行わせるという本発明の概念
（アイディア）は、植物細胞の形質転換の為のハイブリ
ッドＴｉプラスミドベクターの組み立てを著しく簡単な
ものにするものである。この特別に設計されたアクセプ
ターＴｉプラスミドは、所望の遺伝子（これは中間クロ
ーニングベクターの一部と同じであるがまたはこれに関
連しているクローニング媒体中に挿入されている）が単
一乗換えによって相互組込み体を形成することかでｂる
様に、通常のクローニング媒体のＤＮ、Ａセグメントを
含んでいる。このクローニング媒体の２つのセグメント
が、組換えの為に必要な相同領域を提供する。 本発明方法によって調製された微生物、中間クローニン
グベクター、アクセプターＴｉプラスミド、およびハイ
ブリッドプラスミドベクターは、１９８３年１２月２１
日、Ｇｅｒ＋ｏａｎ Ｃｏｌ １ｅｃＬｉｏｎｏｆ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＤＳＭ）（Ｇｏｅｔ
ｔｉｎｇｅｎ）に寄託され、確認された以下の培養株で
例示される：（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃ，ｏｌ
ｉ Ｋ １２ ＨＢ １０１中の中間ベクタープラス
ミドｐＡ’ｃｇＢ。 （２）カルベニシリン耐性アクセプターＴｉプラスミド
Ｉ）ＧＶ３８５０を保有しているＡ ｇｒｏｂａｃ ｔ
ｅｒｉｕｎ＋ Ｌｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ
１’） ７アンピシン耐性株、 （３）Ｅｓｃｂｅｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２
株に５１４（Ｌｂｒ Ｉｅ’ｕ Ｌｂｉ ｌａｃ
Ｉ＋５ｄＲ）中の中間ベクタープラスミドｐＧＶ７
００、 （４）Ｅｓｃｂｃｒｉｃｂｉａ ｃｏｌｉ Ｋ １２
株に５１４（（３）と同じ）中の中間ベクタープラスミ
ドｐｃ＋■７５０、 （５）カルベニシリン耐性アクセプターＴ１プラスミド
Ｉ］ＧＶ２２６０を保有しているＡ ｇｒｏｂａｃ ｔ
ｅｒｉｕ＋ｎ Ｌｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ
１リファンピシン耐性株、 （６）Ｅｓｃｌ＋ｅｒｉｃｂｉａ ｃｏｌ ｉ
Ｋ １ ２ ＦＩＢＩＯＩ中の、ツバリン
プロモーター支配下のオクトピンシンターゼ暗号領域を
保有している中間ベクタープラスミド１）Ｎｏ １、 （７）中間ベクターのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの
摂動に使用された株：摂動プラスミドｐＧ Ｊ ２８お
よびＲ６’４ｄｒｄｌｌ（Ｖａｎ Ｈａｕｔｅ呟ＥＭＢ
ＯＪ。 ２（１９８３）、４１１−４１’８）を保有しているＧ
Ｊ２３； ＧＪ２３はＥｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌ ｉ Ｋ １２、ＪＣ２９２６，ＡＢ１１５７のｒ
ｅｃ Ａ誘導体である（Ｈｏｗａｒｄ −Ｆ １ａｎｄ
ｅｒｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４９（１９６４）、２
３７−２４６）。 これらの培養株の受理番号は、それぞれ２７９２（１）
、２７９８（２）、２７９６（３）、２７９７（４）、
２７９９（５）、２８３３（６）、および２７９３（７
）である。 本発明の態様を色々と記述したが、その基本的な構成を
変化させれば本発明に係る方法および組成物を利用する
その池の態様゛が得られることは言うまでもない。 ４、図面の簡単な説明 第１図はアクセプターＴｉプラスミドの模式図、第２図
および第３図はアクセプターＴ１プラスミドに挿入され
る中間クローニングベクターの模式図、第４図はハイブ
リッドＴｉプラスミドベクターの調製法を示す模式図、
第５図は中間クローニングベクターの遺伝子軒移過程の
概略を示す模式図、第６図はＡタイプのアクセプターＴ
ｉプラスミドの組み立てを示す模式図、第７図は中間ク
ローニングベクターの組み立てを示す模式図、第８図は
ＢタイプのアクセプターＴｉプラスミドの組み立てを示
す模式図、第９図はＢタイプのアク虫ブター１゛ｉプラ
スミドに挿入される中間クローニングベクターの模式図
、第１０図はハイブリッド１゛ｉプラスミドベクターの
組み立てを示す模式図、第１１図は５ 、２ ｋｂＨ１
ｎｄｌ ［１７ラグメントＡｃｇＢのｐＢＲ３２２への
挿入を示す模式図、第１２図は７パリンＴｉプラスミド
ｐＧＶ３８３９の１゛−領域を示す模式図、第１３図は
アクセプターＴ１プラスミドｐＧ Ｖ ３８５ （ｌの
組み立てを示す模式図、第１４図は中間クローニングベ
クターｐＧＶ７００の組み立てを示す模式図、第１５図
は中間クローニングベクターｐＧ■７５０の構造を示す
模式図、第１６図は中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立
てを示す模式図、第１７図はアクセプタープラスミドｐ
ＧＶ、２２６０の組み立てを示す模式図、第１８図はプ
ラスミド１）ＬＧＶ ２３８１の組み立てを示す模式図
、第１９図はプラスミドＩ） Ａ ＧＶ １ ’Ｏの組
み立て、およびその、プラスミドｐＬ ｃ； Ｖ ２３
８１への挿入を示す模式図、第２０図はオクトピンシン
ターゼ遺伝子暗合化領域と融合する前後のツバリンシン
ターゼ遺伝子のプロモーター領域の周囲のヌクレオチド
配列を示す模式図である。 特許出願人 マックス・ブランク・ ゲゼルシャフト・ツ７・ フェルデルング・−デア・ ヴイッセンシャフテン・ニー・ ファｌン 代理人 弁理士青白 葆外１名
および第３図はアクセプター゛１゛ｉプラスミドに挿入
される中間クローニングベクターの模式図、第４図はハ
イブリッドＴｉプラスミドベクターの調製法を示す模式
図、第５図は中間クローニングベクターの遺伝子転移過
程の概略を示す模式図、第６図はＡタイプの７クセプタ
ー１゛ｉプラ又ミドの組み立てを示す模式図、第°７図
は中間クローニングベクターの組み立てを示す模式図、
第８図は１３タイプのアクセプターＴｉプラスミドの組
み立てを示す模式図、第９図はＢタイプの７クセプター
′ｌ″ｉプラスミドに挿入される中間クローニングベク
ターの模式図、第１０図はハイ７リツドＴｉプラスミド
ベクターの組み立てを示す模式図、第１１図は５ 、２
ｋｂＨ１ｎｄｌ ＩＩフラグメントＡｃｇＢのＩＩＢ
Ｒ３２２への挿入を示す模式図、第１２図１、ｔｚバリ
ンＴ ｉ７’７スミＦ”ｐＧＶ ３８３９ノＴ−領域を
示す模式図、第１３図はアクセプターＴｉプラスミド１
＋（ｉ Ｖ ３８５０の組み立てを示す模式図、第１４
図は中間クローニングベクター１）に＼’７００の組み
立てを示す模式図、第１５図は中間クローニングベクタ
ーｐＣ： Ｖ ’７５０の（１１１造を示す１か式目、
第１６図は中間ベクター１）に＼・“７・１５の組みＳ
”ｆ、 −Ｃを示す模式図、第１７図はアクセプタープ
ラスミｈＧ Ｖ ２２６１１ノｊｌｌミ立てを示スト只
式目、第１８図はプラスミドｐＬＧＶ ２３８１の糾み
立てを示す模式図、第１９図はプラスミド１）ノ＼（Ａ
ｕ（）の組み立て、およびその、プラスミド１往５（：
＼゛２３８１への挿入を示す模式図、第２０図はオクト
ピンシンターゼ遺伝子暗合化領域と融合する前後の７パ
リンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域の周囲のヌク
レオチド配列を示す模式図である。 特許出願人 マックス・ブランク・ ゲゼルシャフト・ツア・ ７エルデルング・デア・ ヴイッセンシャ７テン・ニー・ ７アウ 代理人 弁理士青山葆外１名 Ｆｉｇ、４ ■ Ｆｉｇ、５ Ｆｉｇ、 ７ Ｆｉｇ、 １０ Ｆｉｇ、 １２ Ｆｉｇ、 １３ ρ６■０Ｏ２０１０５ｖ１１２ ２Ｆｉ、１７ （ＣＩ２ Ｎ ５１００ Ｃ１２Ｒ１／９１ ） ０発 明 者 ジョセフφニス・シェルドイツ連邦共和
国ケルン３０デ ー −５０００番 ＠ｌ！ 間者 ジャン・ビニール・ニー・ツ工−・
ヘルナルシュテーンズ ベルギー国ブリュッセル・ベ 一−１１５０番 ０発 明 者 マーク・チャールズ・ヴアン・モンタギ
ュー ベルギー国ブリュッセル・ベ −−１０５０番 ■発明者 ルイス・ラフアニル・ヘレーラ・エストレ
ラ ベルギー国ジエント・ベー−９０ ００番 、ゆ発 明 者 ジャン・ジョセフ・アウグスト・リー
マンズ ベルギー国ボンハイデン・ベ −−２９２０番 手続補正書（帥）′ 昭和５°禅 ２月１；稍」 特許庁 艮 宜 殿 １事件の表示 昭和５ ｐ）年特許願第 ５５１２ 号２、発
明の名称 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法３補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 ドイツ連邦共和国３・・↓旧）ゲッティンヶ゛ン
、７ンゼンシユトラ一セ１０番 名称 マックス・ブランク・ケ゛セ゛ルシャフ）・・
ツア・フェルテ゛ルング・デア・ヴイッセンシャフテン
・ニー・７アラ４代Ｉ１１人 住所 大阪府大阪市東区本町２〜１０ 本町ビル内６
補正の対象：明細書の全文 ゛ｉ、補１１：、の内容：別紙の通り 明細書 １、発明の名称 植物細胞ゲ／ノ、への発現可能な遺伝ｆの導入法２、特
許請求の範囲 １、 （ａ）野生型′Ｉ″ｉプラスミドのｉ” １ｉ
ｒｌ域の２つの境界配列（１）および（２）、 （ｂ）単一乗換えがｎ（能な中間クローニングベクター
中のＤ’Ｎｉ〜配列の少なくとも１部と相同な■）ＮＡ
配列を含む２つの境界配列の開に設置バされたクローニ
ング媒体由来の非腫瘍性Ｌ） ｌ’Ｊ Ａセグメント（
３）、および （ｃ）ＡＨｒｏｂａｃ’１．、ｃｒｉｕｍによる、野生
型′Ｉ゛１プラスミドの′１゛−領域の植物細胞ゲノム
中への転移に必須であるＤ Ｎ Ａ、配列を含んでいる
野生４１；！ ｌ’ ｉプラスミドのセグメント（４） と含んでいるアクセプター′１゛ｉプラスミド。 ２、（ａ）Ｔ−領域およびｉ’−領域の２つの境界配列
を持たない野生型′１゛１プラスミドのＤ Ｎ Ａセグ
メント（４）、および （、ｂ）野生型ｉ’ ｉプラスミドの′ｌ゛−領域の２
つの境界配列を含んでいる中間クローニングベクターの
ＤＮＡ配列と相同なりローニング媒体由来のＤＮＡ配夕
ＩＩ（３） を含んで′いるアクセプターＴｉプラスミド。 ３、（ａ）少なくとも１つの所望の遺伝子（５）、およ
び （ｂ）特許請求の範囲第１項に記載のアクセプターＴｉ
プラスミド中のＤＮＡ配列と相同なりＮＡ配列を含んで
いるクローニング媒体セグメント（３′） を含んでいる中間クローニングベクター。 ４、 （ａ）野生型Ｔｉプラスミドの１゛−領域の２つ
の境界配列（１）および（２）、並びに特許請求の範囲
。 第２項に記載の７クセブターＴｉプラスミド中のＤ Ｎ
Ａ配列と相同なりＮＡ配列を含んでいるクローニング
媒体セグメン）（３’）、および（ｂ）その２つの境界
配列の開に設置された少なくとも１つの所望の遺伝子（
５） を含んでいる中間クローニングベクター。 ５、所望の遺伝子（５）に隣接して少なくとも１つの選
択可能なマーカー遺伝子を更に含有している特許請求の
範囲第３項または第４項に記載の中間クローニングベク
ター。 ６、所望の遺伝子（５）がその天然のプロモーターの支
配下にあることを特徴とする特許請求の範囲第３項また
は第４項に記載の中間クローニングベクター。 ７、所望の遺伝子（５）が外来性プロモーターの支配下
にあることを特徴とする特許請求の範囲第３項または第
４項に記載の中間クローニングベクター。 ８、ヘルパープラスミドの存在下で特許請求の範囲第３
項〜第７項のいずれかに記載の中間クローニングベクタ
ーを特許請求の範囲第１項または第２項に記載の７クセ
プターＴｉプラスミドを含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕ＋ａに摂動せしめ、その中間クローニングベクタ
ーと７クセプターＴｉプラスミドを単一乗換えにより相
互組込みさせることからなるベクター組成物の調製法。 ９、 （ａ）野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域の２つの
境界配列（１）および（２）、 （ｂ）クローニング媒体由来の非腫瘍性ＤＮＡセグメン
ト（３）および（３゛）、および（ｃ）Ａｇｒｏｂａｃ
Ｌｅｒｉｕｍにより、野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域
を植物細胞ゲノム中に転移させるのに必須であるＤＮＡ
配列および２つの境界配列（１）および（２）の間に設
置された少なくとも１つの所望の遺伝子（５）を含んで
いる野生型Ｔｉプラスミドのセグメント（４） を含んでいるハイブリッドＴｉプラスミドベクター。 １０、所望の遺伝子（５）に隣接して、少なくとも１つ
の選択可能なマーカー遺伝子を更に含有している特許請
求の範囲第９項に記載のハイブリッドＴｉプラスミドベ
クター。 １１、所望の遺伝子（５）がその天然のプロモーターの
支配下にあることを特徴とする特許請求の範囲第９項に
記載のハイブリッドＴｉプラスミドベクター。 １２、所望の遺伝子（５）が外来性プロモーターの支配
下にあることを特徴とする第９項に記載の／％イブリッ
ドＴｉプラスミドベクター。 １３、特許請求の範囲第９項〜第１２項のいづれかに記
載のハイブリッドＴｉプラスミドベクターを保持してい
るＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ａ。 １４、特許請求の範囲第１３項に記載のノ１イブリッド
Ｔｉプラスミドベクターを保持しているＡｇｒｏ−ｂａ
ｃｔｅｒｉｕＩｌｌで植物細胞を感染させることからな
る形質転換植物細胞の調製法。 １５、特許請求の範囲第９項〜第１２項のいづれかに記
載のハイブリッドＴｉプラスミドベクターの２つの境界
配列（１）および（２）の間に設置されたＤＮＡセグメ
ントを、そのゲノム中に組込んで含有している形質転換
植物細胞。 ３、発明の詳細な説明 本発明は組換え分子、その調製法、植物細胞へのその導
入法、お上びゲノム中に外米ＤＮＡ配列を含んでいる植
物細胞またはその植物に関する。 更に詳しくは、本発明は適当な宿主植物細胞中で発現さ
れるＤＮＡ配列に関する。本発明に係る組換えＤＮＡ分
子は、植物の成長、栄養物としてのその品質の改良、ま
たは有用な代謝物（例えばアルカロイドあるいはステロ
イドの前駆体）の生産、に有用なアミノ酸やポリペプチ
ドの如き生産物を暗号化している配列を有することをそ
の特徴としている。 以下に本明細書で使用する用語について説明する。 ｂｏｍサイト 特異的に約す機能体が相互作用して自律
的ＤＮＡ転移移動を開始させるＤ Ｎ Ａ領域境界配列
Ｔ −Ｄ Ｎ Ａの末端を含むＤＮＡ配列広範囲宿主
レプし壬？ 多種多様の宿主細胞に、転移（トランスフ
ァー）され、保持され得るＤＮＡ分子 Ｉルス組織 未組織、未分化の細胞の塊２隻二三ング
無性生殖によ１）、１個の生物またはＤ Ｎ Ａ配列か
ら一部の該生物またはＤＮＡ配列を得る操作過程、また
は、よりわかり易く言えば、特定の生物またはその一部
を分離し、そのサブ７ラクシタンを均質な集団として増
殖させる操作過程 クローニング媒体 宿主細胞中で複製し得るプラスミド
、７アーシ゛ＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であって
、そのＤＮＡ配列は、例えば複製、外殻蛋白質の生産な
ど、そのＤＮＡの必須の生物学的機能、あるいはプロモ
ーターまたは結合部位を刊随的に失なうことなく、その
場所で正確にその配列を切断することのできる１個また
は少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を持っており、ま
た、それが導入された細胞（形質転換された細胞）を同
定確認するのに有用なマーカー（例えばテトラサイクリ
ン耐性あるいはアンピシリン耐性）を持っていることで
特徴づけられる。クローニング媒体は、しばしばベクタ
ーとも呼ばれる。 賭号配刀 ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するＤＮ
Ａ配列 相 組込み体（コインテグし１１２個の環状ＤＮＡ分子
開の単一交叉により得られる構造体−Ｌ２２１１ｉｔ性
他のレプリコンに物理的に結合していないＤＮＡ分子
（＋／プリコン）が、その結合していない他のレプリコ
ンにとって必要かつ欠落している拡散性物質を供給する
ことができる過程 兼介（コンジュゲーション） 細胞同志の接触により、
１つのタイプの細菌から・池のタイプの細菌にＤ Ｎ
Ａが転移すること 米換え 相同なりＮＡ配列間で遺伝物質が交換すること 欠損置換 １個のＤＮＡ配列が除去され、その代りとし
て異なったＤ Ｎ Ａ配列で置換されること分化 ある
細胞の子孫が特殊な構造と機能を獲得し、更にそれを維
持すること Ｄ Ｎ Ａ配列またはＤ Ｎ、 Ａセグメント 隣接す
るペントースの３゛位と５゛位の炭素間の燐酸ジエステ
ル結合により互いに連結したヌクレオ４１群の一直線の
配列 ４、來傍 相互組込み（コインテグレート）構造が２個
の環状ＤＮＡ分子に分解する過程。この過程は遺伝情報
を交換するのに利用される。このＤＮＡ環状体の一方は
、゛それによって組換えが生じ得る標的ＤＮＡと相同な
２つの領域を持っており、この２つの領域は、標的ＤＮ
Ａと交換される非相同ＤＮＡ配列をはさんでいる。もし
１回目の交叉と２回目の交叉が同じＤＮＡ領域で起ると
、ちとのＤＮＡ環状体が生成する。この２回目の交叉が
第２の相同領域で起ると、２つの環状体の開で遺伝子の
交換が起ることになる。 １現 構造遺伝子によりポリペプチドが生産される過程
。これは転写と翻訳の組合せである。 発現調節（コントロール）配列 構造遺伝子に有効に結
合された場合、それらの構造遺伝子の発現を調筋し、統
制するヌクレオチド配列 Ｆ型プラスミド Ｆ因子（Ｆはｆｅｒｔｉｌｉｔｙ（生
殖 □力））を持ったプラスミドであって、Ｆ因
子を持だない宿主に該プラスミドのコピーを移入するこ
とのできるプラスミド 遺伝子 ２つの部分、即ち（１）遺伝子生産物のための
暗号配列および（２）その遺伝子が発現されるかどうか
を調節しているプロモーター領域内の配列、から構成さ
れているＤＮＡ配列 グＡム 細胞またはウィルスの全ＤＮＡ。これは、まず
ポリペプチドを暗号化している構造遺伝子、更にオペレ
ーター、プロモーター、リボゾームの結合配列および相
互作用配列（たとえばＳｔ山１ｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配
列）を含んでいる。 清仏子型 ある生物に含まれている遺伝情報の全て 相同的（性）組換え 相同配列を含んでいるＤＮＡ上の
２つ領域間の組換え Ｉ型プラスミド Ｆとは異なる不和合性グループの一部
の自律転移性プラスミド １）」 選択圧（ｓｅｌｅｃＬｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒ
ｅ）がないと、同一の細胞に２個のＤＮＡが共存し得な
いこと 延入 あるＤ Ｎ Ａ配列を、別の分子のＤ Ｎ Ａ配
列内にｆ１カーけること セダー配列 ５゛末端から最初の構造遺伝子の先端に至
るまでの＋ａＲＮＡ上の領域。これには構造遺伝子の暗
号配列の翻訳を開始するのに重要な部位が含まれている
。 減数分裂 はじめの４ｎ個の染色体が、２回の連続した
分裂により生成した４個の細胞のそれぞれにＩｎ個ずつ
分布するようになる過程。この過程は有性生殖に於いて
重要である。 ｎ＋ｏｂ （摂動機能体） ｔｒａ機能体との組合せ
に於いてのみＤＮＡの転移を促す一連の生成物。ｍｏ
ｂはｂｏｍサイトを含んでいるプラスミドの移動を促す
ことかで外る。 摂動（モビリゼーシａン）別の細胞へ転移することので
きないＤＮＡ分子が、池のＤＮＡ分子の助けを借りて転
移する過程 摂動ヘルパープラスミド 他のプラスミドが持っていな
い、別の宿主細胞へ転移するための拡散性生成物を供給
することかできるプラスミド非接合性組換えプラスミド
細胞同志の接触によ」）、それ自体では、もとの宿主
細胞から池の宿主細胞へ転移することかできないＤＮＡ
分子。転移するには、他のＤＮＡ、例えばヘルパープラ
スミドによって供給される機能体が必要となる。 ヌクレオチド 糖部分（ペントース）、燐酸エステルお
よび含窒素異項環塩基から構成されているＤ Ｎ Ａま
たはＲＮＡの単量体単位。この塩基は糖部分とグリコシ
ド結合で連結しており（ペントースの１゛位の炭素）、
この塩基と糖とが結合したものがヌクレオシドである。 ヌクレオチドの特性はこの塩基によって決まる。ＤＮＡ
の４個の塩基はアデニン（“Ａ″）、グアニン（“＊
に ｕ ）、シトシン（“Ｃ゛）およびチミン（“１’
” ）である。ＲＮＡの４個の塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよ
びウラシル（Ｕ゛）である。 ＊ＴＡ）３質 発育環境と遺伝子形質との相互関係によ
って生成する個体の観察し得る特性プラスミド それ自
体が宿主細胞中で複製される、完全な（無傷の）レプリ
コンからなる非染色体性の２本鎖ＤＮＡ配列。このプラ
スミドを単細胞生物に入れると、そのプラスミドのＤ
Ｎ Ａによって、その生物の性質が変わる、即ち形質転
換される。例えば、テトラサイクリン耐性（ＴｃＲ）の
ための遺伝子を持ったプラスミドにより、本来はテトラ
サイクリンに感受性のある細胞が耐性のある細胞に形質
転換される。プラスミドによって形質転換された細胞を
形質転換体と呼ぶ。 ポリペプチド 隣接するアミノ酸どうしがａ−アミノ基
とカルボキシル基とのペプチド結合により互いに連結し
た線状のアミノ酸連鎖 プロモーター領域 遺伝子の転写を統制している、暗号
配列の開始点より上流のＤ Ｎ Ａ配列プロモーター配
列 ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列であり、ポリメ
ラーゼはそれより下流の配列の忠実な転写を促進する。 組換えＤＮＡ分子または雑種（ハイブリッド）Ｄ易 少
なくとも２個のヌクレオチド配列からなり、その一方の
配列は、自然界では通常第２の配列と共存しない、その
様な配列からなる雑種のＤＮＡ配列 別換え ＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の一部分の新しい
結合体を創製すること 相同領域 ＤＮＡの別の領域に於ける配列と同じＤＮＡ
配列を持っているＤ Ｎ Ａ領域レプリコン ＤＮＡの
複製開始サイトオよび複製を支配するのに必要な機能を
指定している遺伝子を持った自己複製遺伝子単位 糾１人之グメント 特定の標的ＤＮＡ配列を認識する酵
素による２本鎖開裂によって生じるＤＮＡ分子 」Ｎへポリメラー￥ Ｄ Ｎ ＡのＲＮ Ａへの転写を
つかさどる酵素 洒択可囮ｔヱユ久ユ遺伝子 あるＤ Ｎ Ａ配列であっ
て、それがある細胞内で発現された時、その１’） Ｎ
Ａ配列を含んでいない細胞より増殖しやすい有利性を
その細胞に与えるＤＮＡ配列。細胞を適当な選択的増殖
培地に置くと、この２つのタイプの細胞を区別すること
ができる。通常使用される選択可能なマーカー遺伝子は
抗生物質耐性を暗号化している遺伝子である。 単一乗換 ２個の環状Ｄ Ｎ Ａ分子を組換えて、相互
組込みされた大きい環状体を形成させる操作過程 構潅遺仏子 ポリペプチドを暗号化している遺伝子 エニＤ Ｎ Ａ 植物細胞ゲノムに安定に組込まれる
ことが見い出されているＴｉプラスミドの部分子−領域
植物細胞ゲノムへ転移するＤ Ｎ Ａ配列を含んでい
るＴｉプラスミドの部分 子ｉプラスミド 感受性植物に腫脹（クラウンガル）を
誘発させるだめの遺伝情報を含んでいるＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕ＋＋＋ ｔｕ＋ｎｅｒａｃｉｅｎｓ株に存在
する大きいプラスミド Ｔ Ｌ −Ｄ Ｎ ＡおよびＴＲ−ＤＮＡ オクトピ
ンクラウンガル腫脹細胞は２つのＴ −Ｄ Ｎ Ａ配列
、即ち左Ｔ −Ｄ Ｎ Ａ （ＴＬ −Ｄ Ｎ Ａ）お
よび右Ｔ −ＤＮ Ａ（Ｔ Ｒ−ＤＮ Ａ）全含有し得
る。ｉ’ Ｌ −Ｄ Ｎ Ａはツバリン腫脹細胞のＴ−
ＤＮＡと共通している配列を持っているがＴＲ−ＤＮＡ
は持っていない。 ｔｒａ （転移機能（体刀 プラスミドに暗号化されて
いる拡散性の生成物、および細胞間のＤＮＡ転移の際に
利用される作用部位の両者を指す。例えば２つの細胞の
間に橋を作るのに必要な生成物およびＤＮＡ転移が開始
する部位。 電防 構造遺伝子からｍ ＲＮ Ａが生産される過程、
または、塩基対（ベースペア）の形成により、Ｌ’）
Ｎ Ａに含まれてい□る遺伝情報に基外それに相補的な
塩基配列をもつＲ’ＮＡ鎖が形成される過程形質転換
細胞のＤＮＡ補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に外米性Ｄ
Ｎ Ａが導入されることによって生じる遺伝的修飾 ＩＩＩ？ ＋ｎＲＮＡからポリペプチドが生産される
過程、あるいは、＋ｎ”ＲＮ Ａ分子に存在する遺伝情
報が、ポリペプチド合成において特定のアミノ酸の順序
を指定する過程 非分化表現形質 いかなる特異な部分もなく、組織中の
細胞の外観が均一であること ベクター 異なった宿主細胞間を転移するように設計さ
れたＤＮＡ分子 組換えＤＮＡ技術の進歩によって、微生物の遺伝子工学
に新たな展望が開けた。もし１個の体細胞から、完全な
生物を再生することができた呟これらの技術は多細胞真
核生物にまで広がるであろう。ある種の高等植物の細胞
は、優れた再生能力を有し、従って高等生物の遺伝子工
学にとってかっこうの材料となる。 植物の遺伝子工学の主たる問題点は、外米性ＤＮＡを植
物ゲノムに導入する為の系の利用性にある。この様な系
には、ダラム陰性土壌細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ Ｌｕ＋ｎｅｆａｃｉｅｎｓが持っている腫脹誘起（
Ｔｉ）プラスミドがある。この微生物は、広範囲の双子
葉植物の損傷組織に、クラウンガル（ｃｒ。 ｗｎｇａｌｌ、冠状コブ）と呼ばれる腫脹性形質転換を
引き起す原因となることがわかっている。この増殖性の
腫脹は、オパイン（＋）ｐｉｎｅｓ）と呼ばれるＴｉに
特異な新しい代謝物を合成する。この形質転換は、分子
レベルでみると、Ｔｉプラスミドの実体のはっきりわか
っているＴ −Ｄ Ｎ Ａ （転移Ｄ−ＮＡ）フラグメ
ントが植物細胞ゲノムに転移して安定に組込まれたこと
によって起る。換言すれば、クラウンガル腫脹は、その
染色体ＤＮＡに、腫脹セルラインをもたらしたＴｉプラ
スミド中のり、ＮＡＡ配列相同のＴ−ＤＮＡと呼ばれる
Ｄ Ｎ Ａセグメントを含んでいる。あらゆる場合に於
いて、このＴ−ＤＮＡは、連続した一連のＴｉプラスミ
ドＤＮＡに相当しており、また、これと共直線性である
。 従ってこれはＴ−領域と呼ばれる。 Ｔｉプラスミドはクラウンガル細胞で合成されたオパイ
ンのタイプによって分類される。クラウンガル細胞でツ
バリン［Ｎ−α−（１，３−ジカルボキシプロビル）−
Ｌ−フルギニン１の合成を惹起させるＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ株はツバリン株と呼ばれ、オクトピン［Ｎ−
α−（Ｎ−１−カルボキシエチル＞−ｔ、−フルギニン
１を合成するものはオクトビン株と呼ばれる。これらが
最も普通に用いられるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ１０株
である。 植物の遺伝手術にｒ−ＤＮＡをベクターとして使用する
試みがモデル実験で行なわれた。この実験では、インビ
ボにおいて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎ ’ｒ３
７株のＴｉプラスミドからのＴ−ＤＮＡの右側境界部の
近くに１４ｋｂ細菌性トランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏ
ｓｏｎ） Ｔｎ ７が挿入された。すると、このＴｉプ
ラスミドを持っているアゲロバクチリアによって惹起さ
れる腫脹中のツバリン合成が消滅した。更に、サザーン
・プロッティング・ハイブリディゼーションの結果、そ
の様な挿入を行なわなけれぼ正常であるＴ−ＤＮＡ配列
の一部分として、この腫脹の染色体ＤＮＡ中に全Ｔｎ７
が存在することがわかった（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ
呟Ｎａｔｕｒｅ２８７（１９８０）、６５４−６５６；
Ｈｏ１ｓｔｅｒｓら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎ
ｅｔ、 １８５ （１９８２） 、２８３−２８９）
。この様に、２３ｋｂＴ−ＤＮＡに１４ｋｌ＋ＤＮＡ７
ラグメントを導入しても、２３ｋｂＴ−ＤＮＡの植物細
胞ゲノムへの転移能力に変化は見られなかった。 ７８９７株、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎＴ ３７の
ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界部は非常に正確に調
べられている。これは全ツバリンＴｉプラスミドの極く
一部、約２３ｋｂに過ぎない。更に、このＴ−ＤＮＡの
境界部は知られている：即ち、この′ｒ−ＤＮＡの境界
部を決めているヌクレオチド配列が調べられ、ツバリン
１゛ｉプラスミドの同じ領域と比較された（ Ｚ ａＩ
ＩＩｂｒｙｓｋ ｉら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０９ （１
９８０）ｒ １３８５−１３９１；Ｚａｍｂｒｙｓｋ
ｉら、Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、
１’（１９８２）、３６１−３７０ ）。このＴ−領域
の境界部が、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの組込みに
最も関係している様である。 ＤＮＡを植物細胞へ転移させる為のベクターとしてＴｉ
プラスミドを使用するには、転移したＤＮＡの境界部を
決めているＴ−ＤＮＡ配列を知ることが基本的に必要で
ある。そうすれば、外米性ＤＮＡをこの境界内に挿入し
、確実に植物細胞ゲノムヘ転移させることができる。更
に、この系を利用しようとすれば、形質転換された植物
細胞が、その生育特性において腫瘍の性質を持たず、正
常であるということが重要である。Ｔ−ＤＮＡ転移の後
、正常細胞を生産するには、Ｔ−ＤＮＡ自体によって暗
号化されている機能を知る必要がある。 従って、どの領域が腫瘍表現形質に関係しているか調べ
るために、ＴｉプラスミドのＴ−領域の徹底的な遺伝子
分析が行なわれた。 Ｔ−ＤＮＡは、クラウンガル表現形質の原因となる機能
体を暗号化している。その遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡの特定
の領域に局在化している（ ＬｅｅｍａＩＩｓ呟ＥＭＢ
ＯＪ、［１９８２）、１４７−１５２ ； Ｗｉｌｌｍ
ｉｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、ｊ（１９８２）、１３９−
１４６ ）。一般に、腫瘍カルス組織の非分化表現形質
を寞配している少なくとも４つの遺伝子が存在している
。これらの遺伝子の突然変異体（ミュータント）は、新
芽様のあるいは根の様な外観の形質転換組織を形成させ
ることができる。この後者の成果は、腫瘍組織ではなく
正常植物組臓中で発現させる為にＤＮＡを植物に転移し
たいと思う場合には特に重要である。 最近、完全な正常植物に再生することができる形質転換
新芽を誘導するＴｉプラスミド変異体がみつかった。こ
れらの植物は繁殖力が旺盛であり、減数分裂によっでＴ
−ＤＮＡ特異配列を伝達することさえした：即ち、子孫
の植物もＴ−ＤＮＡ特異配列を含んでいた（ ０ｔＬｅ
ｎ呟Ｍｏ１．Ｇｅｎ。 Ｇｅｎｅｔ、 １８３（１９８１）、 ２０９−２１
３ ）。 しかし、この形質転換植物組織は、その染色体ＤＮＡ中
に、腫瘍表現形質を支配しているＴ−ＤＮＡ領域が除去
さ□れる大がかりな欠損が発生したことにより、著しく
小さくなったＴ−ＤＮＡを含んでいた。この欠損が当初
の形質転換時に起ったのか、新芽の形成をもたらすその
後の過程で起ったのかは不明である。 Ｔｉ プラスミドは太きく（２００ｋｂ）、そのＴｉプ
ラスミドの種々の場所に存在している多くの遺伝子が植
物の形質転換に関係している。従って、］゛−領−領域
切な場所に特殊なエンドヌクレアーゼ認識サイトを有し
、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させて安定に挿入
するのに必要な全ての機能を持ったＴｉプラスミミド由
来小型のクローニングベクターを組み立てることは不可
能である。所望のＤＮＡ７ラグメントを゛ｒｉプラスミ
ドの′ｒ−領域の特定の制限酵素開裂サイトに導入する
為の既知の方法の１つは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｌ＋ｉａ
ｃｏｌｉ（大腸菌）におけると同様、ＡｇｒｏｂａｃＬ
ｅｒｉｕｍｌにイても複製することかでき、Ｔ −Ｄ
Ｎ Ａの所望の制限７ラグメントを含んでいるクローニ
ングプラスミドを組手立てることである。この様なりロ
ーニ、ングベクターは「中間ベクター］と命名された。 この様な中間ベクターは、Ｔ−領域によって暗号化され
ている機能を分析するのに使用された（ Ｌｅｅｌｆｌ
ａｌｌｓ ら、Ｊ、 ＭＯ＋、ＡＩ）＋１１１１．
Ｇｅｎｅｔ、１ （１９８１）、１４９−１６４）
。 本発明は、発現し得る遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入す
る方法に関するものである。本発明の１つの目的は所望
のあらゆる遺伝子（群）を導入することのできる改良さ
れたアクセプターＴｉプラスミドを提供することにある
。導入される所望の遺伝子（群）は、そのアクセプター
Ｔｉプラスミドの相当する領域と相同の領域を持った新
規な中間クローニングベクター内に含まれている。この
中間クローニングベクターを提供することも本発明の目
的の１つである。 所望の遺伝子（群）の７クセプクーＴｉプラスミドへの
導入は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに保持されている
アクセプター′「１プラスミドと中間クローニングベク
ターの２つの相同ＤＮＡセグメントの間で起る単一乗換
えによって達成される。この中間クローニングベクター
は、ヘルパープラスミドを使って、それが増殖するＥｓ
ｃｂｅｒｉｃｂｉａ ｃｏｌ ｉがらＡｇｒｏ−ｂａｃ
Ｌｅｒｉｕ＋ｏに摂動される。この様なヘルパープラス
ミドおよび摂動のための機能は知られている（■゛盲１
１１１ｅ８１１１＋１ ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔ、 １８５ （１９８２）、３４４−
３５１）。 Ａ ｇｒｏｂａｃ Ｌｅｒ ｉ ｕｕ＋での単一乗換え
の結果、ハイブリッドＴｉプラスミドベクターが得られ
る。この □様なハイブリッドＴｉプラスミドも本発明
の目的の１つである。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに保持されたこのハイブリ
ッドプラスミドベクター（以降、ベクター組成物という
）を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所望の遺伝子
生成物の発現についてスクリーニングする。植物細胞を
ベクター組成物で感染させて形質献換稙物細胞を調製す
るこの方法、その形質転換された植物細胞、およびそれ
から発生した植物を提供することも本発明の目的である
。この技法はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの植物転移性
のプラスミド全てに適用することができる。 以下に添付の図面について詳細に説明する。 第１図は、境界配列（１）および（２）を除き、Ｔ−領
域の内部部分を除去して得られる本発明の７クセプター
Ｔｉプラスミドの１態様を示している。 この境界配列は、Ｔ−領域を植物細胞ゲノムに組込むの
に必須である。境界配列（１）と（２）の間の領域（３
）が、植物に転移されるであろうＤＮＡセグメントであ
る。このアクセプターＴｉプラスミドは、中間クローニ
ングベクターを単一乗換えによって組込ますことを可能
にしている中間クローニングベクター内のＤＮＡ配列の
少なくとも一部と相同のＤＮＡ配列を持ったＤＮＡセグ
メント（３〜 ）を含んでいる。Ｔｉプラスミド領域（４）は、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒ＋ｕｍによってＴ−領域が植物細胞ゲノ
ムに転移するのに必要な機能を暗号化している。この領
域は、ｖｉｒ−領域と呼ばれる。 第２図は、単−乗換えによって第１図のアクセプターＴ
ｉプラスミドに挿入される本発明の中間クローニングベ
クターを示している。このベクターは、所望の単一乗換
えを可能にするアクセプターＴｉプラスミドのＤＮＡセ
グメント（３）の少なくとも一部と相同なりＮＡ配列を
持ったクローニング媒体ＤＮＡセグメント（３゛）を含
んでいる。 更に、この中間クローニングベクターは、その天然のプ
ロモーター配列を備えた遺伝子あるいは遺伝子群（５）
を含んでいる。この組み立てに於いては、一般に植物の
遺伝子を使用することができる。 それは、他のものに比較して発現され易いと思われるか
らである。しかし、原理的には、全ゆる所望の遺伝子を
挿入することがで外る。この中間クローニングベクター
は選択マーカー遺伝子（６）を含んでいてもよい。この
遺伝子は、植物細胞中でこの遺伝子の発現を可能にする
プロモーター配列を含んで゛いな（すれは゛ならない。 このマーカー遣１云子を含んでいる植物細胞は、それを
含んでいない細胞より、成長の選択有利性を持っていな
ければならない。何故なら、この様にして、このマーカ
ー遺伝子を含んでいるＤＮＡによって形質転換された植
物細胞を、非形質転換細胞と区別することができるから
である。 第３図は、第２図の中間クローニングベクターと類似の
、第１図のアクセプターＴｉプラスミドに単一乗換えに
よって挿入される本発明に係る中間クローニングベクタ
ーのもう１つの態様を示している。これは、クローニン
グ媒体ＤＮＡセグメン）（３’）、所望の遺伝子の統制
のとれた発現を可能にする外米性プロモーター配列（８
）、および、所望により、マーカー遺伝子（６）を含ん
でいる。 第４図は、第１図の７クセプターＴｉプラスミドおよび
第２図並びに第３図の中間クローニングベクターからの
、単−乗換えによる本発明に係るハイブリッドＴｉプラ
スミドベクターの調製を示す模式図である。 第５図は、Ｅ、 ｃｏｌｉから７クセプターＴｉプラス
ミドを含んでいるＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ１１ヘノ、
中間クローニングベクターの遺伝子転移に関する諸過程
を概略したものである。第１段階は、中間クローニング
ベクターを含んでいるＥ、 ｃｏｌｉ株（１）と、その
後のＡｇｒｏｌ＋ａｃｔｅｒｉｕｍとの接合の為の２つ
のヘルパープラスミドを含んでいるもう１つのＥ、 ｃ
。 １１株との接合である。１方のヘルパープラスミドはプ
ラスミド転移に重要なりＮＡ配列（ｔｒａ）を含んでお
り、池方のヘルパープラスミドは摂動に重要な配列しｏ
ｂ）を含んでいる。接合によってこれらのヘルパープラ
スミドがＥ、 ｃｏｌｉ株（１）に導入されると、そこ
に含まれている中間クローニングベクターが池の細菌株
へ転移することができる様になる。ＬｒａおよびＩＩＩ
ｏｂヘルパープラスミドは、中間クローニングベクター
が持っている抗生物質ｉｌｌママ−（ＡＩ）”）トＪ、
ｔＭナルマーカー、Ａｂｒ２およびＡｂｒ３をそれぞれ
持っている。従って、全てのプラスミドが存在するかど
うかを選択培地上でモニターすることができる。こうし
て摂動株（３）が得られる。この摂動株（３）を、第１
図の７クセプターＴｉプラスミドを含んでいるＡ、 Ｌ
ｕｔｏｅｆａｃｉｅｌｌｓ株（４）と接合させ、中間ク
ローニングベクターの抗生物質耐性マーカーで選択する
。中間クローニングベクターはＡ ｇｒｏｂａｃ ｔｅ
ｒ ｉ ｕＩＩＩ中で複製できないので、受容アクセプ
ターＴｉプラスミドと相互組込み体を形成した場合にの
み、保持されることができ゛る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ中のこの相互組込み構造体（５）が、ＤＮＡを植
物細胞ゲノムに転移させるのに使用される最終的なハイ
ブリッドＴｉプラスミドである。 第６図は、第１図に示したものと同類のモデルアクセプ
ターＴｉプラスミド（タイプＡ）の組み立てを示してい
る。ここでは、Ｔｉプラスミドと、このもとのＴ１プラ
スミドの一部と置ぎ換わるＤＮＡ配列を含んでいる別の
プラスミドとの間で、二重乗換え−が起る。より具体的
に述べると、小さい方のプラスミドはクローニング媒体
（３）の中にＴ−領域の境界配列（１，２）を含んでい
る。二重乗換えの結果、Ｔ領域の内部の１部分が除去さ
れ、代ってクローニング媒体で置き換えられる。得られ
たアクセプター′１゛ｉプラスミド（Ａ）は、境界配列
（１，２）の間に含まれているＤＮＡを植物細胞ゲノム
に転移させることができる。得られた、形質転換された
ＤＮＡは、Ｔｉプラスミド（Ａ）では腫脹の増殖を支配
している遺伝子が除去されているので腫瘍性のクラウン
ガル組織をつくらない。 Ｔｉプラスミド（Ａ）は、クローニング媒体（３）と相
同性を有するあらゆる中間クローニングベクター用の極
めて普遍的なアクセプターＴｉプラスミドである。この
クローニング媒体（３）は通常のプラスミドでよく、例
えばｐＢＲ３２２またはその誘導体などによって置き換
えることができる。 ｔｊＳ７図は、中間クローニングベクターをＵ、、 ｃ
ｏ ｌ ｉ宿主細胞中で組みたてる工程を模式的に示し
たものである。制限エンドヌクレアーゼサイトＲ１に囲
まれた所望の遺伝子（５）および制限エンドヌクレアー
ゼサイ）Ｒ２で囲まれた選択し得るマーカー遺−伝子（
６）を、酵素Ｒ１およびＲ２の為のそれぞれ１つの制限
サイトを含んでいるクローニング媒体（３゛）に挿入す
る。３つの分子を全て制限酵素Ｒ１および／またはＲ２
で消化し、ＤＮＡリカ゛−ゼを用いてライゲーション（
結紮）して中■１クローニングベクターを形成させる。 このクローニング媒体（３゛）は、細菌遺伝子学の選択
マーカーとして使用する抗生物質耐性（Ａｂ”）を暗号
化しているもう１つのＤＮＡ配列を含んでいなければな
らない。所望の遺伝子（５）はその天然のプロモーター
または第２図および第３図に概説した外米性プロモータ
ーの支配下にある。 第８図は本発明に係るアクセプターＴｉプラスミド（タ
イプＢ）のもう１つの具体的態様を組み立てるための模
式図である。この態様では、境界配列（１）および（２
）のすぐ外側のＴｉ配列に相同の、それぞれＤＮＡ配列
（９）および（１０）を含んでいるクローニング媒体と
Ｔｉプラスミドとの間で二重乗換えが起る。この二重乗
換えによって、境界配列（１）および（２）を含んでい
る′Ｆ−領域Ｔ全体が削除され、それがクローニング媒
体（３）で置き換えられる。Ｔｉプラスミド（Ｂ）は、
境界配列（１）および（２）の間にクローンされた所望
の遺伝子を含有している中間クローニングベクターのた
めの７クセプターである（第９図参照）。 第９図は、第８図の７クセプターＴｉプラスミド（Ｂ）
に単一乗換えによって挿入される本発明の中間クローニ
ングベクターを例示している。これは、所望の遺伝子（
５）の両端に位置する境界配列（１）および（２）を含
んでいる。これはまた、２つのプラスミド間の相同的組
換えを可能にするため、アクセプターＴｉプラスミド（
Ｂ）中のクローニング媒体配列と少なくとも一部が相同
であるクローニング媒体配列（３゛）をも含んでいる。 第１０図は、第８図のアクセプター１−ｉプラスミドお
よびそれに対応する第９図の中間クローニングベクター
か呟本発明のハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組
み立てを示す模式図である。 単一ゑ換えによって第９図の中間クローニングベクター
が第８図のアクセプターＴｉプラスミド（Ｂ）に導入さ
れる。 第１１図〜第２０図は本発明をより具体的に例示するも
のである。 第１１図は、５．２ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメ
ントＡｃ８ＢのＩ）ＢＲ３２２への挿入を示している（
Ｚ ａｍｂｒｙｓｋ ｉ ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０
９（１９８０）。 １３８５−１３９１）。この７ラグメント ＡｃｇＢは
ツバリン１゛ｉプラスミドの左右の境界領域を含んでい
る。このクローンｐＡＣｇＢは、第６図に示した１−Ａ
−タイプ］の７クセプタープラスミド、ｐＧＶ３８５０
の組み立てに使用される。野生型Ｔｉプラスミドの左右
の境界領域を含んでいるこのクローンされた制限７ラグ
メントを使って、クローンｐＡｃ８Ｂと類似のクローン
を得ることができることは、当業者には容易に理解され
るはずである。 第１２図はツバリンＴｉプラスミド１）Ｇ Ｖ ３８３
９のＴ−領域を示している。ｌ−１ｉｎｄ ＩＩＩ制限
エンドヌクレアーゼサイトは（１−１）で示しである。 変異したＨｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント１つは（１９
”）で示しである。カナマイシンまたはネオマイシン耐
性を付与するアセチルホスホトランスフェラーゼ遺伝子
はａｐｌで表わし、これは黒くぬりつぶしｔこ部分に存
在している。Ｔ領域の境界は矢印で示しである。ツバリ
ンシンターゼ（ｓｙｎＬｂａｓｅ）遺伝子は１１０Ｓで
表わした。数値は、Ｄｅｐｉｃｋｅｒら（１〕Ｉａｓｍ
ｉｄ、３（１９８０）、１９３−２１１）の方法による
制限７ラグメントの大きさを表わしている。Ｔｉプラス
ミド１）ＧＶ３８３８は、実施例１およびそこに挙げｔ
こ２つの文献に従って組み立てることができ第１３図は
、アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０の組み立
てを示している。プラスミドｐＢＲ３２２−ｐＡｃｇＢ
（第１１図）は、線状化した形で描いである。ｐＢＲ
３２２の配列は斜線を入れた領域で示し、ｐＢＲ３２２
のアンピシリン耐性遺伝子はＡＩで示した。第１２図に
示したｐＧＶ３８３９のＴ−領域の一部がここに描かれ
ている： ｐＡｃｇＢ との相同的組換えに関与するＨ
ｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント（１ｏ）および（２３）
およびａｐｔ遺伝子が含まれている。二重乗換えによっ
てｐＧＶ３８５０および失われたａｐｔ遺伝子を含むも
う１つのレプリコンが組み立てられる。 第１４図は、実施例２に詳細に記載した中間クローニン
グベクターｐＧＶ７００の組み立てを模式的に示したも
のである。制限エンドヌクレアーゼサイトを示すのに以
下の略号を用いた： Ｂ＝ＢａｍＨＩ 、 Ｂｇ ＝Ｂ
ｇｌ ＩＩ 、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ ％Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉ 、５＝Ｓａｌ Ｉ、 Ｓｉ＝Ｓｍａ１．抗生物質ｉ
ｌ性を示すのに以下の略号を用いた： Ａｐ＝アンピシ
リン、Ｃ＋ｎ＝クロラムフェニコール、ＳＩ。 ＝ストレプトマイシン、Ｔｃ＝テトラサイクリン。 ＴＬ−ＤＮＡで示した図の下部の数値は、この領域のＲ
ＮＡ転写体を示している（Ｗ ｉ Ｉ ｌ＋ｎ ｉ ｔ
ｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、 １３９−
１４６）。 第１５図は中間クローニングベクターｐＧＶ７５０の構
造を示している。その組み立ては実施例２に記載した。 制限エンドヌクレアーゼサイトは、キロ塩基対（ｋｂ）
の数で表わしたその相対的位置で示した。Ｐｓｔ Ｉ
サイトは示していないがＫＩｎＲ／Ｎ’ｍＲ領域に３
つ、ｃｂＲ遺伝子に１つ存在する。 左右の境界領域も示しである。Ｉ）ＧＶ７５０の組み立
てに使用されたＢｇＩ ＩＩ／ Ｂ’ａ＋ｎＨＩサイト
およびＨｐａ Ｉ ／ ＳＩｎａ Ｉサイトが示されて
いるが、これはｐＧＶ７５０ には存在しない。影をつ
けた領域はＴＬ−ＤＮＡに、黒い領域はＫｉｎＲ／Ｎｍ
Ｒ領域に、白ぬぎ部分は隣接するＴｉプラスミド配列に
、そして線はクローニング媒体ｐＢＲ３２５にそれぞれ
相当する。その他の略号は以下の意味を有する： ０ｃ
ｓ−オクトビンシンターゼ、ＣａｎＲ＝クロラムフェニ
コール耐性、ＣＩ）Ｒ＝カルベニシリン（アンピシリン
類似体）耐性、Ｋｕ＋ ”／ Ｎ＋ｏＲ＝カナマイシン
耐性／ネオマイシン耐性。 第１６図は実施例３・に詳細に記載した中間ベクター１
＋ＧＶ７４５の組み立てを示している。 ＋１（−；
Ｖ７４５は、第８図に示した「Ｂタイプ」アクセプター
プラスミド、ｐＧＶ２２６０の組み立てに使用される。 制限エンドヌクレアーゼサイトは以下の略号で示した：
Ｂ＝ＢａｍＨＩ、 Ｈ＝Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ、Ｒ＝ＩＥｃ
ｏＲ１゜アンピシリン耐性遺伝ｒはＡ １＋”で示した
。斜線を施した領域はオクトピン′ｌ゛１プラスミドの
ｉ’ −Ｄ Ｎ Ａ領域の左側と相同のｆ） Ｎ Ａを
、白ぬき領域はオクトピン′ｒｉプラスミドの′Ｉ゛−
ｌ） Ｎ Ａ領域の右側と相同のＤ Ｎ Ａを示してい
る。 出発物質であるプラスミドｐにＶ（１２ＨＪおよびｐ（
、； Ｖ ｌ） １２ ＋）についての物理的位置およ
び記述は、ｌ’）ｅ ＶｏｓらのＰｌａｓｍｉｄ’６（
１９８１）、２４９−２５３にみられる。 第１７図はアクセプタープラスミドｐＧ Ｖ ２２６０
の組み立てを示している。ｐＧＶ２２１？ 中の欠損置
換が、ネオマイシンとカナマイシンに対する耐性を付与
するアセチルホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｔ
で表わしである）を含んでいる黒色部分で示しである。 中間ベクターμＧ’ｖ ７４５（第１６図参照）は線状
化して描いである。これは第１６図に示した１フＧＶ７
４５のＨｉｎｄ ＩＩＩサイトで開裂したものである。 ｐＢＲ３２２の配列は斜線を施した部分で示し、アンピ
シリン耐性遺伝子はＡｐｌで示しである。二重乗換えに
よって、ｐＧＶ ２２６０が組み立てられ、ａｐｌ遺伝
子が失われる。制限エンドヌクレアーゼサイトは以下の
略号で示した： Ｂ ＝ Ｂａ＋ｎＨＩ、Ｈ＝ト１ｉｎ
ｄ ＩＩＩ、Ｒ＝ＥｃｏＲＩ。 第１８図は、ツバリンシンターゼ遺伝子（口ｏｓ）のプ
ロモーターの下流の遺伝子を発現するためのプラスミド
ｐＬ（＋ ’ｖ ２３３１の組み立てを示している。５
゛および３゛はそれぞれ転写開始と転写終了を意味し、
ＡＴＧおよびＴ’ＡＡは翻訳開始および翻訳終了に使わ
れるコドンを表わしている。 太線は＋１０８プロモーター領域、白ぬ５部分は＋１０
３暗号領域を示している。Ａ、Ｒはアンピシリン耐性、
Ｋ＋ｏ１（はカナマイシン耐性を示している。 第１９図は、完全なオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）暗
号配列を含んでいるプラスミドｐＡ Ｇ Ｖ １ （、
’）の組み立て、およびプラスミド１）ＬＧＶ２３８１
（第１８図参照）中１１０３プロモーターの後部へのそ
の挿入を示している。太線はプロモーター領域、白ぬき
部分はｏｃｓ暗号領域を示している。その他の記号は第
１８図と同じである。 第２０図は、ノパリンシンターセ゛（ｎｏｓ） ｌｉ（
元手のプロモーター領域の周囲のヌクレオチド配列およ
びオクトピンシンターゼ遺伝子暗号領域と融合した後の
同じ領域の周囲のヌクレオチド配列を示している。融合
点は星印（＊）で示した。いくつかの制限エンドヌクレ
アーゼサイト、即ち、Ｂ ａｍ ）−１１、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ 、および５ａｃｌｌ も示しである。 ５゛および３゛は転写開始および終了を意味する。 Ａ′ｒＧは翻訳に使われる最初のコドン、ＴＡＡは翻訳
に使われる終了コドンを表わしている。白ぬきの大きい
矢印はツバリン遺伝子の暗号化領域、縞の入った矢印は
オクトピン遺伝子を表わしている。 以下に本発明の詳細な説明する。 第１図にアクセプター′１′１プラスミドを簡単に図式
化して示した。このアクセプターＴｉプラスミドは、野
生型腫瘍誘起（Ｔ ｉ ）プラスミドの２つの境界配列
（１，２）または領域を含んでいる。この境界配列は、
Ｔｉプラスミドの１゛−領域を植物 ゛細胞ゲノム
ヘ組込むのに必須である。換言すれば、あらゆるＤ Ｎ
Ａ配列（３）または１゛−領域を、これらの配列１１
］ｉこ存在している植物細胞ゲノムに組込むのにこの境
界配列が絶対に必要である。 このアクセプターＴｉプラスミドのＩ） Ｎ Ａ配列（
３）には、第２図および第３図に示した中間クローニン
グベクターのＤＮＡ配列（３゛）の少なくとも１部と相
同のＤＮＡセグメントが含まれている。 この相同性は、中間クローニングベクターとアクセプタ
ーＴｉプラスミドが単一乗換え（相同性組換え）によっ
て相互組込みするのに必要である。 相互組込み体の得られる頻度は、基本的には相同領域の
長さできまる。相同性組換えを高頻度で起すには、通常
１−４ｋｌ）の領域が使われる（Ｌｅｃｑ＋＋ａ＋＋Ｓ
呟Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、１ （，
１９８１）。 １４９−１６４）。 アクセプターＴｉプラスミドは更に、ＡＨｒｏｂａ−ｃ
ｌ、ｅｒｉｕｍによってＴｉプラスミドのＴ−領域が植
物細胞ゲノムへ移動するのに必要な配列（４）を含んで
いる。 この様なアクセプターＴｉプラスミドの組みＶておよび
第２図および第３図に示した中間クローニングベクター
とのその相互組込みについて、第４図を参照しながら以
下に詳述する。 第２図および第３図に、発現しようとする、即ち、植物
細胞中でプロモーターの支配下に転写され、翻訳される
所望の原核性または真核性遺伝子をクローンするための
中間クローニングベクターを簡略化した図で示した。こ
れらの中間クローニングベクターは、アクセプター′１
゛ｉプラスミ、ドの１’） Ｎ Ａセグメント（３）の
少なくとも一部と相同であり、従って単一乗換えを可能
にするＩ） Ｎ Ａ配列を含んでいるクローニング媒体
からのＤ Ｎ Ａセグメン）（３’）を含んでいる。さ
らに、この中間クローニングベクターは、その天然のあ
るいは外米性のプロモーター配列を含む少なくとも１つ
の所望の遺伝子（５，７）を含んでいる。このプロモー
ター配列によって、挿入された遺伝子配列の発現が可能
である。所望の挿入遺伝子（群）の発現を調整するため
に、外米性のプロモーター配列（仕立て上げたプロモー
ター）を使うことも可能である。 調整の各種の例として、以下のものを挙げることができ
る：（ｉ）組織に特異な発現、即ち、葉、根、茎、花な
ど、（ｉｉ）発現レベル、即ち、発現の強弱、（ｉｉυ
誘導性発現、即ち、温度、尤または添加された化学的因
子による発現など。 中間クローニングベクター用の所望の遺伝子の例として
は、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成をコントロール
して植物の栄養価や成長度を改良する遺伝情報を持った
ＤＮＡ７ラグメントまたは配列、外部から病原物質に対
する保護、例えば病原生物またはストレスとなる環境因
子に対する耐性、をイ；１与する生産物の合成をコント
ロールする遺伝情報を持ったＤ Ｎ Ａ ７ラグメン）
、１．ｔこは配列、；在伝子工学によって改良しようと
する植物の基本的な過程に情報を与える生産物の合成を
コントロールする遺伝情報を持ったＩ）ＮＡフラグメン
トまたは配列など。 第２図および第３図は、選択可能なマーカー遺伝子（６
）を含んでいることもある中間クローニングベクターを
表わしている。選択Ｉｌｌ能なマーカー遺伝子としては
、例えば抗生物質または有毒な類似物質（例えばアミノ
酸′Ｂ縁体）を暗号化している遺伝子、受容宿主細胞の
欠損を補う遺伝子などが挙げられる。 第４図は、ハイブリッド１゛１プラスミドベクターの組
み立てに関与する構成を示しており、第５図は、そのハ
イブリッドＴｉプラスミドベクターを保持しているＡＢ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎの分離に関与する実際の接合
二り程を表わしている。この工程は、中間クローニング
ベクターがＥ、ｃｏｌｉ中で組み立てられるので、この
中間クローニングベクターをＡＢｒｏｌ）ａｃｔｅｒｉ
ｕｎ＋中の７クセプタープラスミドに転移させるのに必
要である。 Ｔ−領域の一部が変更された配列で置換されている改良
Ｔｉプラスミドを調製するのに用いられる既知の転移手
法は多数の工程からなっている。 通常、大抵のＤＮＡ組換え操作は、特別に設計されたク
ローニング媒体、例えは＋＋ＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅ
ｒ 、 Ｇｅｎｅ ２ （１９７７）、７５−９３）中
で行なわれる。しかしこのクローニング媒体は、それ自
体Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎに移動することかでき
ない。この問題は、既知の方法では次の様にして解決さ
れている： ａ） ＡＦｉｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋ｔｌ】でも
複製し得る別の広範囲宿主用クローニング媒体、例えば
ｍ１ｎｉ−３ａプラスミド（Ｌｅｅｍａｎｓ呟Ｇｅｎｅ
１９（１９８２）。 ３６１−３６４＞でｐＢＲクローニング媒体配列を置換
する。この繰作はＥ、ｃｏｊｉ中で行ない、中間クロー
ニングベクターが得られる。 ｂ）所望のｌ） Ｎ Ａを含有している中間クローニン
グベクターを保持したＥ、ｃｏｌｉ株と、Ａｇｒｏｂａ
−ｃｔｅｒｉｕ＋ｏ中では複製でトないがそれ自体およ
び他のＤＮＡのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移を
仲介することのできるヘルパープラスミドを保持した別
のＥ。 ｃｏｌｉ株との接合。 Ｃ）工程（１））で得られるＥ、ｃｏｌｉとＴｉプラス
ミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃ Ｌｅｒ ｉ ｕｍ
の接合＠′ルバープラスミドは失われる。 ｄ） 中１１１１クローニングベクターは、独立しタ
レプリフンとしてＡ ｇｒｏｂａｃ ｔｅｒ ｉ ｕｍ
中で複製し、存在することがでとるので、工程（ｅ）で
得られた接合１本は、中期クローニングベクターとＴｉ
プラスミドとの相互組込み体を含んでいる細胞、または
中間クローニングベクターおよび相互組込みが起らなか
ったＴｉプラスミドを含んでいる別の細胞の混合物であ
る。相互組込み体だけを特異的に分離する為に、Ｔｉプ
ラスミドのない別のＡｇｒｏｂａｃｔ−ｅｒｉｕｍ株と
の接合をもう一度行なわなければならない。この転移は
、Ｔｉプラスミド自体によって暗号化されている機能に
゛よって仲介される。この第２のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕ鎗株への中間クローニングベクターの転移は、Ｔｉ
プラスミドとの相互組込み体の形でのみ行なわれる。 ｅ）所望の置換を行なった最終的な改良′旨プラスミド
を得るために、第２回目の乗換えが行なわれる （Ｌｅ
ｅｔＯａｎｓ ら、Ｊ、Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 に
ｅｎｅｔ。 １ （１９８１）、１４９−１６４）。 僅かにもう１つの既知の方法は、上記工程（ｄ）におい
て、中間クローニングベクターと適合しない別のプラス
ミドをＡｇｒｏｆ＋ａｃＬｅｒｉｔｕｎに導入すること
を除けば、上の方法と基本的に同じである。この場合、
独立したレブリフンのままでし）る中間クローニングベ
クターは全て失われるので、相互組込み（単一乗換え）
を選択することができる（ＭａＬｚｋｅ ら、 Ｊ、
Ｍｏ１． ＡＩ］Ｉ）ｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 １
（１９８１）、３９−．４９ ）。 ここに本発明者らは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎの
アクセプターＴｉプラスミドに中間クローニングベクタ
ーを導入する為の、新規な非常に簡素化された方法を提
供するものである。簡単に言えば、この方法は、多くの
通常使用されているクローニングプラスミド（例えばＩ
）ＢＲ３２２）を■Ａｇｒｏｂａｃ−１、ｅｒｉｕｍに
転移させるのに、Ｅ、 ｃｏｌｉのヘルパープラスミド
が役立つということを見い出した事実に基づいている。 これらのプラスミドは、いづれもＡＢｒｏｂａｃＬｅｒ
ｉｕＩＩｌ中では複製でとないので、アクセプターＴｉ
プラスミドと相互組込みし得るものだけが保持されるこ
とになる。さらに、本発明者らは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕ＋ｎ中のこの相互組込み体を、植物細胞への感染
の為の直接のベクター組成物として使用するのである。 この様にして、本発明者らは前記の工程（ｄ）および（
ｅ）を省略した。これによって、改良ハイブリッドＴｉ
プラスミドを組み立てるのに要する時間が減少し、可能
な組み立てに柔軟性が増加し、かくして、植物細胞ゲノ
ムヘｒ）ＮＡを転移させる為のベクターとしてこのアク
セプターＴｉプラスミドを使用でトる可能性が著しく高
まったのである。 即ち、第５図に概略を示した様に、アクセプターＴｉ
プラスミドへの中間クローニングベクターの導入は２工
程で行なわれる。先づ、中間クローニングベクターを持
ったＥ、 ｃｏｌｉ株（１）を、この中間クローニング
ベクターのＡＢｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの摂動を促す
２つのプラスミドを持った別のＥ。 ｃｏｌｉ株（２）と接合させる。これらのヘルパープラ
スミドの代表的な、そして好ましい例は、＋ｎｏｌ）機
能を含んだＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｔｒａ機能を含んだ
ｐＧＪ２８である（Ｆｉｎｎｅｇａｎら、Ｍｏ１． Ｇ
ｅｎ。 ＧｅｎｅＬ、 １８５（１９８２）、３４４−３５１）
。中間クローニングベクターのクローニングＩＭ （Ｉ
上のｂ ｏ ｔｎサイト（Ｗａｒｒｅｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ２７４（１９７８）。 ２５９−２６１．）が池の２つのプラスミドによって暗
号化されている機能体によって認識され、転移できる様
になる。全てのプラスミドは、その存在を検出するため
に抗生物質耐性マーカーを含んでいるのが好ましい。次
いで、得られたＥ、ｃｏｌｉ。 株、即ち３つのプラスミド全てを保持している摂動株（
３）を、中間クローニングベクターと相同の領域を持っ
たアクセプターＴｉ７”ラスミドを保持しているＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋０と接合させる。中間クローニン
グベクターと７クセプターＴｉプラスミドとの単一乗換
えが行なわれたかどうかは、中間クローニングベクター
の抗生物質耐性マーカーについての選択によって検出で
外る。 第６図は、第１図の７クセプター１’ ｉプラスミドの
組み立てに用いられたＤＮＡ分子を模式的に示したもの
である。本明細書では、このプラスミドを７クセプター
Ｔｉプラスミド（タイプＡ）と呼び、池のアクセプター
Ｔｉプラスミド（タイプＢ）と区別することにする（第
８図参照）。この組み立てには、′１゛ｉ プラスミド
と、クローニング媒１本（３）中に境界配列（１）およ
び（２）を持っているもう１つのプラスミドと９間に二
重乗換えが起ることが必要である。図に示した様に、ク
ローニング媒体配列（３）は左側の境界配列（１）と右
側の境界配列（２）との財にある。このＤＮＡ鎖の正し
い極性を示すために、これを環」二に描くことがでおる
。 しかし、二重乗換えに使用される相同領域を示すために
は、この環を開裂させて図示した。これは理解を助ける
為のやリカとして重要であり、第８図に於けるアクセプ
ターＴｉプラスミド（Ｂ）の組み立てに於いても用いら
れている。即ち、もし境界配列（１）および（２）が、
単にクローニング媒体配列（３）−内に挿入されたのな
呟二重乗換えによって、Ｔ−領域が削除されてはいるが
この境界配列（１）および（２）の間のクローニング媒
体配列の−ないＴｉプラスミドが得られることになる。 第６−図に示した様に、二重乗換えによって、境界配列
（１）および（２）の間にもとの］゛−領領域持った環
状ＤＮＡ分子が生成する。これはレプリコンではないの
で消失する運命にある。この二重乗換えが起ったかどう
かは〜、例えばゴミプラスミドのＴ−領域内に含まれる
抗生物質マーカーの欠落について選択したり、クローニ
ング媒体配列（３）内の抗生物質耐性マーカーについて
選択したりして、遺伝子学的に選択することができる。 第７図は、第２図および第３図の中間クローニングベク
ターの組み立てを示す模式図である。制限エンドヌクレ
アーゼサイトＲＩまたはＲ２でそれぞれ囲まれた所望の
遺伝子（５）および選択可能なマーカー遺伝子（６）が
、酵素Ｒ１およびＲ７の為の特異な制限サイトを含んで
いるクローニング媒体配列（３゛）に、これら全ての分
子の消化およびライプ−ジョンによって種本される。得
られた組換えＤＮＡ分子は、Ｅ、 ｃｏｌｉ宿主細胞を
形質転換するのに使用され、その形質転換体は、クロー
ニング媒体配列（３゛）の抗生物質耐性マーカー（Ａｂ
”）で選択される。 第８図は本発明のもう１つの態様、即ちアクセプターＴ
ｉプラスミド（Ｂ）を組み立てるのに使用されるｌ）
Ｎ Ａ分子の模式図である。この場合は、境界配列（１
）および（２）のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列（９）
および（１（１）の刺にクローニング媒体配列（３）を
含んでいるプラスミドとＴｉプラスミドとの開で二重乗
換えが起る。乗換えに使用される相同領域を示す為に、
小さい方のプラスミドは開裂しである（第６図と同様）
。二重乗換えによる生成物は、アクセプター′１゛ｉ
プラスミド（Ｂ）と、もとの′１゛１プラスミドからの
］゛−領領域よびＤＮＡ配列（２）、（１０）、（９）
および（１）を含んでい遺伝子学的選択は第６図につい
て記載したものと同様にして行なうことがでトる。 第９図は、第８図のアクセプターＴｉ プラスミドＢと
組み合せて使用される中間クローニングベクターの模式
図である。ここでは、所望の遺伝子（５）は、クローニ
ング媒体配列（３゛）中に含まれている境界配列（１）
および（２）の間に挿入される。 第１０図は、単一乗換により第９図の中間クローニング
ベクターかどの様にしてアクセプターＴｉプラスミド（
８）に挿入されるかを模式的に示している。この場合、
中間クローニングベクターのクローニング媒体配列（３
゛）の抗生物質耐性マーカーで選択すると、２つのプラ
スミドの間の相互組込みの結果としてのハイブリッドＴ
ｉ プラスミドを確実に見つけることができる。こうし
て境界配列（１）および（２）内に含まれている所望の
遺伝子を持ったハイブリッドＴｉプラスミドが得られる
。この様にして組み立てられたハイブリッドプラスミド
は、その１゛−領域に、例えば第４図のハイブリッド゛
１゛１プラスミド中の配列（３）および（３゛）の様な
直接反復の配列を含有しておらず、従つ′ζ、分子内組
換えゐ結果として、／％４ブリ・ンドベクターまたは植
物細胞ゲノム中に導入されたＩＮＮＡが不安定になる可
能性が避けられる。 本発明者らの研究室で行なった実験結果か呟第９図の中
間ベクターの血み立てには、境界配列１および２の両者
を所有する必要はなり・ことがわかった（未発表）。し
かし、所望のＤＮＡ配列を植物ゲノムに組込むには、少
なくとも右側の境界配列（２）（第１図および第９図参
照）を有することが必要十分条件である。 ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴ１プラスミド、例えば
７ノ々リンまたはオクトビンＴｉプラスミドの制限エン
ドヌクレアーゼ地図についての知見（Ｄｅｌ）ｉｃｋｅ
ｒら、Ｐｌａｓ＋ｎｉｄ ３（１９８０）−１９３−？
’ｌ’：Ｄｅ ＶＯ３ら、Ｐｌａｓ＋１ｌｉｄ ６（１
”９８４ ）、２４９−５２３）およびＴ −１） Ｎ
Ａ境界配列を含んでいる制限フラグメントについての
知見（Ｚａｍｌ＋ｒｙｓｋｉ呟Ｊ、Ｍｏｌ。 ＡＩ）ｌｌ’１． （、ｅｎ（・Ｌ、ｌＮ９８２Ｌ３６
１ ３７（，１；１）ｅ Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒら、Ｍ
ｏ１． Ｇｅｌ１． Ｇ、ｅｎｅｔ、Ｈｆ ３（１９８
１’）、２８３−２８８）か呟当業者であれば誰れでも
、本発明方法に従ってアクセプターＴｉプラスミドを組
み立てることができる。この池、通常の組換えＤＮＡ技
術および基礎的な細菌の遺伝子操作を実施できる能力が
要求されるに過ぎない。本発明は、ハイブリッドＴｉプ
ラスミドベクターを組み立てるのに有効であることがわ
かった本明細書に記載したアクセプターＴｉプラスミド
を具体的に提案している点でユニークなものである。更
に、これらのアクセプターＴｉプラスミドは、遺伝子を
植物細胞ゲノムへ導入するための方法の一部を構成する
様に設計されたものである。 既述したアクセプター′１゛ｉプラスミド、中間クロー
ニングベクター、ハイブリッドＴｉプラスミドベクター
およびベクター組成物を更に例示し、植物細胞ゲノムへ
組込まれた外来性遺伝子の発現を示す形質転換植物細胞
および植物を提供するのにこのベクター組成物が有効で
あることを例証するために、以下に実施例を挙げる。 実施例１ アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０
（Ａタイプ）の組み立て 出発株およびプラスミド： ＡＢｒｏｌ）ａｃＬｅｒｉ＋ｎａ ｔｕ＋ｎｅｆａｃｉ
ｅｎｓ （野性型Ａｇｒｏｌ＋ａ−ｃＬｅｒｉｕｍ由来
のり７７ンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１およびクロラムフェ
ニコール−エリスロマイシン耐性株Ｃ５８Ｃ］） Ｔｉ プラスミド＝ｐＧＶ３８３９ 第１１図のプラスミド＝ρＡｃｇＢ １゛ｉプラスミドｐＧＶ３８３９は７パリンプラスミド
ｐＴｉ Ｃ５８Ｌｒａ ０（ｐＧＶ３１旧〕；１−１ｏ
ｌｓｔｅｒｓら、 Ｆ’ｌａｓｍｉｄ ３（１９８
０）、２１２−２３０）から組み立てる。これはＴ−領
域の中央近くに欠失置換突然変異体（ミュータント）を
含んでいる：即ち、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ７ラグメント１
９の内部のＳ＋ｎａｌフラグメント２４ （Ｄｅｌ）ｉ
ｃｋｅｒ呟円ａｓｕ＋ｉｄ ３ （１９８０）＋
１９３．２１１）は、Ｔ。 ５のａｐｌ（アセチルホスホトランスフェラーゼ）遺伝
子を含んでいる。ｐＫＣ７のＨｉｎｄ ＩＩ ７ラグメ
ンＩＩＲａｏら、 Ｇｅｎｅ ７（１９７９，７９−８
２）で置換されている。この遺伝子はアミノグリコシド
ネオマイシンおよびカナマイシンに対する耐性を暗号化
している。１）ＧＶ３８３９の１゛−領域の制限地図を
第１２図に示す。 プラスミドｐＡｃｌＢは、Ｔ −、Ｄ Ｎ Ａの境界部
だけを含んでいるｐＢＲ３２２中のＡｃｇＢの挿入体で
ある（第１１図参照）。この境界部はＴ−ＤＮＡの末端
部として定義され、これらの領域は、１゛−ＤＮＡの植
物細胞ゲ７ムへの安定な組込みに役割を果たす。このク
ローンの起源および分析については詳しく記載されてい
る（ ７． ａ＋ｎｂｒｙｓｋ ｉ ら、５ｃｉｅｎ
ｃｅ２０９（１９８０）、１３８５−１３９１）。 このクローンは、形質転換されたタバコＤＮＡからＴ
−Ｄ Ｎ Ａの部分を再分離することにより得られた。 ｐＡｃｇＢは、ＴＤＮＡの左右の境界を含む様に縦列に
並んだ２つのＴ −Ｄ Ｎ Ａコピーの接合点を含んで
いる。更に、ｐＡｃｇＢは、その遺伝情報が右側Ｔ−Ｄ
ＮＡ境界のすぐ近くに位置しているという理由で７パリ
ンシンターゼ遺伝子を含んでいる。このプラスミドｐＡ
ｃｇＢは、「タイプＡ」アクセプターＴｉ プラスミド
、ｐＧＶ３８５（）の組み立てに使用される。第６図は
関与する構造の概略を、第１３図はｐＧＶ３８ｓＯを与
える二重乗換えに関与するＤ Ｎ Ａ領域をより正確に
示したものである。 上記のプラスミドｐＡｃｇＢは、そのｐ Ｂ ｌ’＜
３２２部分にＣｏ１Ｅ］−特異ｂｏｍサイトを持ってお
り、ヘルパープラスミドＲ６４ｄｒｄ １．１およびｐ
ＧＪ２８を使ってＥ、ｃｏｌｉからＡｇｒｏｂａｃＬｅ
ｒｉｕｍへ摂動することができる。Ｅ、 ｃｏｌｉに含
まれているプラスミドＲ６４ｄｒｄ １１およびＩＪＧ
Ｊ２８は、接合により、ｐＡｃｇＢを持ったＥ、 ｃｏ
ｌｉ株に導入される。トランス接合体は、アンピシリン
耐性（ｐＡｃｇＢの１）ＢＲ３２２配列がら）、ストレ
プトマイシン耐性（Ｒ６４ｄｒｄ １１から）、および
カナマイ沖耐性（ｐＧＪ２８から）コロニーとして選択
“される。 ３つのプラスミドの全てを保持しているＥ。 ｃｏｌｉ株を、１ノア７ンピシン耐性でありＴｉプラス
ミド、ＧＶ３８３９を含んでいるＡＢｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１に接合させる。ツバリン下ニブラス
ミドとの最初の単一乗換えを選択するのにｐＢＲ３２２
のアンピシリン耐性を利用する。アンピシリン耐性をＡ
ｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ中で安定させることができる
唯一の方法は、１゛−領域境界近くの相同領域の１つで
ｐＧＶ３８３９と相同組換えにより乗換えをすることで
ある。池の相同領域での２回目の乗換えにより、ａｐｌ
遺伝子（カナマイシン耐性）を含んでいる１）ＧＶ３８
３９の゛１゛−領域の中央部がクローンｐＡｃｇＢのｐ
ＢＲ３２２配列で置換される。従って、第２の組換え体
はアンピシリン耐性、カナマイシン感受性である。第２
の岨換え体を分離する確率を高めるために、最初の組換
え体（ｐＡｃｇ’Ｂ ：：ｌ）Ｇ Ｖ ３８３９ ）を
保持しているり７７ンビシン耐性Ａｇｒｏｌ）ａｃｔｅ
ｒｉｕｍを、Ｔｉプラスミドを持っていない第２のクロ
ラムフェニコール／エリスロマイシン耐性Ａｇｒｏｂａ
ｃＬｅｒｉｕｍ株と接合させる。この様にして、約６（
）Ｏコロニー中、１コロニーの割合で、アンピシリン耐
性、カナマイシン感受性のクロラムフェニコール／エリ
エロマイシン耐性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｉ）Ｇ
Ｖ ３８５０を得ることができる。 勿論、ｐＧＶ３８５０タ４プノアクセプ９ ’ｒｉＴ
ｉプラスミドみ立てるのに使用することかでトるその他
のＴｉプラスミドもある。Ｔ−領域の中央近くに選択し
得るマーカー遺伝子を持ったＴｉプラスミドは全て受容
体として使用できる。更１こ、左境界フラグメン）
ｐＢＲ３２２−右境界フラグメントの方向に、左右の境
界７ラグメントの中間にｐＢＲ配列が位置する様に、ｐ
ＢＲ３２２に゛ｒ−領域境界フラグメントを挿入するこ
とによってｐＡｃ８Ｂ様のプラスミドを組み立てること
かできる。例えば、ツバリン゛１゛ｉプラスミドの左お
よび＜ｉ境界フラグメントはそれぞれＨｉｎｄ Ｉｌｌ
フラグメント１０および２３である（ Ｄｅｌ＋１ｃｋ
ｅｒら、ＰＩａｓｈ＋ｉｄ ３（］ ９８０）、 １９
３ ２１１）。 単−乗換えによって、ｐＢＲ３２２またはその誘導体に
挿入されている所望の遺伝子を含んだ中間クローニング
ベクターが＋）（ｌ Ｖ ’３８ Ｓ Ｏの改良された
Ｉ’−１）ＮＡ領領域導入される。唯一つ必要なことは
、中間クローニングベクターのＥ、ｃｏｌｉからＡｇｒ
ｏｂａｃｔｃｒｉｕ＋ｎへの転移を選択する為の手段と
して使用する為に、導入されるＤＮＡが、既にｐＢＲ３
２２に存在するものの池にもう１つの耐性マーカー遺伝
子を含んでいるということである。 この耐性マーカーは、ｌ］ＢＲ配列内に含まれていても
よく（例えばｐＢＲ３２５のＣａｎ”、または１）ＫＯ
２のＫｔｏ ”） 、植物細胞内で試験されるＤＮノ＼
内に含まれていてもよい。更に、アクセプターＴｉプラ
スミドｐＧＶ３８ｓＯにおけるｌ＼１】Ｒ遺伝子ｐＢＲ
３２２は、Ｋｉｎ’の様な別の耐性マーカー遺伝子で置
換してもよい。この様にして、Ａ、、 ｆ＜であるｌ］
ＢＲ３２２含有中開クローニングベクターです呟このｐ
ＧＶ３８５０タイプのアクセプターＴｉプラスミドに直
接摂動することができる。 ｐＧＶ３８５０タイプのアクセプターＴｉプラスミドの
もう１つの利点は、形質転換された植物細胞で腫瘍をつ
くらないということである。ｐＧＶ３８ＳＯの短かくな
ったＴ −Ｄ Ｎ ’Ａ領領域、依然としてツバリンシ
ンターゼを暗号化している遺伝子を含んでいるので、ｌ
）Ｇ Ｖ ３８５ 、ｔ’）で形質転換された細胞は、
ツバリンが存在するかどうかを分析することにより、非
形質転換細胞から簡単に選り分けることができる。勿論
、アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ ３８．５０ｆ二
組込まれた中間クローニングベクターがマーカー遺伝子
を含んでいた呟それも直接スクリーニング、即ち選別に
かけることがで外る。 ｐＢＲ３２２配列を含ん戸上記の中間クローニングベク
ターの単一乗換えによるアクセプター１１プラスミドへ
の挿入のほか、このアクセプター１１プラスミドは、１
−ショットガン４タイプの実験に於いて、ｐＢＲ３２２
またはその誘導体中のクローンされたＩ） Ｎ Ａバン
クの受容体としても使用することがでトる。Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｕ＋中の全ての７１イブリツドプラスミ
ドベクターは、植物細胞の感染に使用することかで忽、
次いで所望の選択可能な遺伝子（群）の発現についてス
クリーニングされる。 例えば、選ばれたアミノ酸が欠乏している植物細胞に全
バンクを適用することにより、アミノ酸合成を暗号化し
ている遺伝子について葡単に選別することができる。 アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０は、２つの
特徴的な表現形質を持っている：即ち、（ｉ）腫瘍生成
能力がないこと、および（ｉｉ）もしＴ−Ｄ Ｎ Ａが
植物細胞ゲノム内に転移したら、ツバリン合成能を有す
ること、である。ｐＧＶ ３８５０含有ＡＢｒｏｂａｃ
Ｌｅｒｉｕｔｏで感染させた各種の植物組織のこれらの
特徴を調べるために、種々の実験を行なった・ ａ） ジャカ゛イモおよびニンジンテ゛イスクを片ｊす
）た試験 ジャガイモおよびニンジンの切片にアクセプターＴｉプ
ラスミドｐ（：；Ｖ３８５０を接種すると、少量の硬結
組織が生成する。この組織にツバリンが存在するかどう
かを試験した所、陽性であることがわかった。この突然
変異体が少量の硬結組織を生産し得ることは興味あるこ
とである。しかし、それは、これらのディスクを低濃度
のオーキシンおよびサイトキニンの両者を含んでいる培
地で生育させた時だけ得られる。 ｂ）全植物をアクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ ３８
５０で接種 ホルモンを含よない滅菌寒天培地で生育しているタバコ
およびペチュニアの苗木にｐＧ Ｖ ３８５０を接種す
る。数カ月後に少量の組織成長か観察されただけである
（通常、２週問後に１野生型」腫瘍が検出される）。こ
の組織はホルモンを含まない培地では生育しないが、オ
ーキシンおよびサイトキニン含有培地での滅菌組織培養
では、さらに増殖することができる。このＭｌ織もツバ
リン陽性であることがわかった。 Ｃ）さらに、ｐＧＶ ３８５０Ｆ形質転換」細胞は腫瘍
性ではないので、これらの細胞は、伝移したＤ Ｎ Ａ
セグメントをそのゲノムに依然として保持している正常
な植物に再生することができる。この形質転換細胞を通
常の再生培地（実施例５を参照）で培養すると、正常植
物が得られよう。 ＋１ｃ； Ｖ ３４ｆ ５０の、アクセプタープラス
ミドとしての有用性を証明する為に、以下の実験を行な
った。ｐＢＲ３２５中にオクトピンＴ−ＤＮＡの腫瘍機
能を含んでいる中間クローニングベクターを、ｐＧＶ３
８５０を保持しているＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋ｎに
組み込んだ。単一乗換えによって得られたＡｇｒｏ−ｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ中のハイブリッドＴｉ プラスミドを
、傷つけたタバコ植物に接種した。２週間後に腫瘍組織
があられれた。このことは、腫瘍誘導ＤＮＡがｐＧＶ３
８５０に再導入され、形質転換植物細胞中で適切に発現
されたことを示している。 大施仰文 中間クローニングベクターｐＧＶ７００およ
びｐＧ＼Ｘ７５０の組み立て この組み立ての概略を第１４図に模式的に示した。オク
トピン′１゛ｉプラスミドＢ６Ｓ３のｒＬ−ＤＮＡの右
側部分であり、−〜’ ０２０１ （ＤｅＶｏｓら、
Ｐｌａｓｍｉｄ ６（１９８１）、２４９−２５３）
中に存在するＨｉｎｄ Ｉｌｌ ７ラグメント１を、ま
ず、広範囲宿主性ベクターｐＧＶ ］ １２２ （Ｌｅ
ｅｎ＋ａｎｓ呟ＧｅＩ＋ｅ １９（１９Ｂ ２）、 ３
．６１−３６４）のＨｉｎｄ ＩＩＩサイトに挿入する
。組換えプラスミドｐＧＶ ｌ） ２０１は、多コピー
ベクターｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒらｔ Ｇｅｎ
ｅ ２（１９７７）＋ ９５−１１３）の特異なｌ−
１ｉ＋＋ｄ ＩＩＩサイトに挿入されたＨｉ＋＋ｄ Ｉ
ＩＩ ７ラグメント１を含んでいる。ｌ）’Ｃ；＼′（
１２０１およびＩ）ＧＶ ］ １２２ ＤＮＡは、Ｂｃ
ｔｌ−ａｃｌ＋らが記載している方法で調製される（Ｆ
ｅｄ。 Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７−２０４３）。 最終量２０μＣ中、ｌ）Ｇ Ｖ ０２０’ｌ Ｄ Ｎ
Ａ ２μｇを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ２単位（全ての制限
酵素はｌ’３ ｏｅｌ＋ −ｒｉｎＢｅｒ Ｍａｏｎｌ
＋ｅｉ＋ｎから購入した）を用いて、３°７゛Ｃで・１
時間完全に消化した。インキュベーション緩衝液はＯ’
Ｆ”ａｒｒｅｌ ｌ らにより記載されている（Ｍｏ
ｌ、 Ｇｅｎ、 ＧｅｏｅＬ ’１ ７ ９（１９
８０）、４２ １ −４３５）。同シ条件下テｐＧＶ
１１２２ ＤＮＡ ２μｓをＨｉｎｄ ＩＩＩで完全に
消化した。 最終量２（）μρ中、′Ｆ４リカ゛−ゼ（Ｂｏｅｌ＋ｒ
ｉｎ８ｅｒＭａｎｎｌ＋ｅｉｍ ） （’、１．０２単
位を用い、０．１μｇの１４ｉｎｄ Ｉｌｌ ’を
肖化 １）Ｃ；ＶＯ２０１をＨｉｎｄ Ｉｌｌ ？
肖化ｐＧＶ１］２２とライプ−ジョン（結紮）した。イ
ンキュベーション緩衝液および条件は、製造業者の指示
に従った（ Ｂｒｏｃｂｕｒｅ″’Ｔ４リカ゛−ゼ゛、
Ｂｏｅｌ＋ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｔ＋ｅｉｍｙ １
９８０年８月、＃１ｏ。 Ｍ、８８０．４８６ ）。ライゲーション混合物の−＋ フンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ ５１４ ｈｓｒ ｈ
ｓｍ 細胞（Ｃｏｌｓｏｎら、ＧｅｎｅＬｉｃｓ５２
（１９６５）、１０４３−１０５０）への導入（形質転
換）は、ＤａｇｅｒｔおよびＥｈｒｌｉｃｈ （１）方
法（Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３−２８）に従って
行なった。細胞を、ストレプトマイシン（２０μｇ／＋
ｏｌ）および又ペクチ／マイシン（５０μｇ／ｍｌ）を
補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ。 ＥｘｐｅｒｉｍｅｎＬｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （］ ９７２ ）＊ Ｃ
ｏ１ｄ ５ｐｒｉｎＢ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ＋ Ｎｅ１ｕＹｏｒｋ）に塗抹した。組換えプラ
スミドを含有している形質転換体を、テトラサイクリン
耐性を暗号化している遺伝子への挿入によるその不活性
化（Ｌｅｅｍａｏｓら、Ｇｅｎｅ １９（１，９８２）
、 ３６１−３６４）に基づき、テトラサイクリン感
受性（１（）μｇ／＋ｌｌ１）でスクリーニング（選り
分はルだ。ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシ
ン１こ而（性を示し、テトラサイクリンに感受性を有す
るクロ−ンを物理的に同定した。マイクロスケールのＤ
ＮＡ調製はＫｌｅｉｎらの方法（Ｐ ｌａｓｍｉｄ ３
（１９８０’）、８８ ９１）に従って実施した。ｐ
Ｇ１１２２の）ｆｉｎｄ ＩＩＩサイト中のＨｉｎｄ
ＩＩＩ ７ラグメント１の配向は、Ｓａｔ １消化によ
って決定した。組換えプラスミドを消化しく０ ’ Ｆ
ａｒｒｅｌ ｌ らの条件、Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ、 Ｇ
ｅｎｅｔ、 １’７９（１９８０）、 ４２１−４３
５）、アガロースデル電気泳動にかけると２個の７ラグ
メントが得られた。ａ−配向には０．７７ｋｂおよび２
２．７６ｋｂの７ラグメント、β−配向には、１０．３
３ｋｂおよび１３．２０ｋｌ）の７ラグメン）があった
。α−配向の組換えプラスミドをその後のクローニング
に使用し、これを１）にＶ１１６８と名イ；ｊけた。 ＴＬ−ＤＮＡの左側部分（左の境界配列を含んでいる）
を含有しているＢｇＩ ｌｌ−８ａｌ’ｌ ７ラグメン
トをＢｇｌ ｌｌ−８ａｌ ｒで開裂したｐＧＶ１１６
８に導入する。この７ラグメントは、ベクターｐＢＲ３
２２に挿入ｉ’レタ、ｐＴｉＢ６Ｓ３ の’ｒ領領域ら
の、Ｂａｎ＋Ｈ４フラグメント８を含んでいる組換えプ
ラスミドｐＧＶ０１５３ （Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａ
ｓｍｉｄ（１９８１）、 ２４９−２５３）から得ら
ｉる。ｐＧＶＯ１５３＃、ｌ：びｐＧＶｌ １６８１）
ＮＡはＢｅｔｌａｑｈらの方法で調製する（ ｔ１７ｅ
ｄ、 Ｐｒｏｃ。 ３５（１９７６）、２０３７−２１）４３）、１）ＧＶ
Ｏ１５３ＤＮＡ１０μ８を１０単位のＢｇｌ ＩＩおよ
・び１０単位の５ａｌｌを用い、最終量１００μ５Ｃ中
３７℃で１時間、完全に消化した。消化混合物をプレバ
ラティ１０．８％アガロースデル上、Ａ１１ｉｎＢｔｏ
ｎらの方法（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｂｉｍ、 ｉ３５
（１９７８）、１８８−１９６）で電気溶出し、ゲルか
ら２゜１４ｋｂ Ｂｌ′ＦｉＩＩ Ｓａｌ １１フラ
グメン）・を回収した。■＋ＧＶ１１６８ＤＮＡ ２μ
８を２単位のＢ８１１Ｉおよび２単位のＳａｔ、 Ｉで
完全に消化した。最終量２０μ！中、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ０．０２単位を用いてＢＢＩ ｌｌ−８ａｌ Ｉフラ
グメントＤＮＡ０．１μｇを０．０２μｇのＢｇｌ Ｉ
ＩＩ ５ａｌｌ消化ｐＧＶ１１６８とライゲーション
した。このライゲーション混合物をコンピテントＥ、
ｃｏｌｉＫ５１４ｈｓｒ−ｂｓ−細胞（Ｄａｇｅｒｔお
よびＥｒｌ山ｃ１１゜Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３
−２８）に導入した。細胞をストレプトマイシン（２０
μｇ／＋ｎｌ）およびスペクチノマイシン（５０μ８７
ｍ ｌ ）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎ
ｅｔｉｃｓ （１９？ ２ ）＋ Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬｏｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｎｅｕｌｌ、 ＹｏｒＫ）に塗抹した。 ストレプトマイシン−およびスペクチノマイシンー耐性
形質転換体から、マイクロスケールＤＮＡプレバレージ
ョン（Ｋｌｅｉｎ呟Ｐ ｌａｓ＋ｎｉｄ ３ （１９８
０）、ｌ−９１）を行なった。２．１４ｋｌ〕ＢＢＩ
ｌｌ−８ａｌ １７ラグメントがＢｇｌ ＩＩ Ｓａ
ｌ ｌ消化ｐＧＶ １１６８に挿入されている組換えプ
ラスミドを１３ビｌ１ｌ−８ａｌｔ消化により同定した
。 この消化で２．１４ｋｂおよび２１．８２ｋｂのンつの
７ラグメントが１υられた。これらの分子量（２，１４
ｋｌ）および２１．．８２ｋｌ＋）に相当する消化パタ
ーンを持ったプラスミドをｐＧＶ３１７１と名利け、さ
ら（こクローンするの１こ用いた。ｐＧＶ１ ］ ’７
１ ｈ・らの１２．６５ｋｂ ７７グメン１１ｉ、左右
の’ｒＬ−Ｄ Ｎ Ａ境界配列（Ｄｅ Ｂｅｕｃｋｅｌ
ｅｅｒら、ｉｎ Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎＢｓ Ｉｖｔ
ｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅ
ｎｃｅ ｏｎＰｌａｎｔ Ｐａｔｌ＋ｏｇｅｎｉｃ Ｂ
ａｃｔｅｒｉａ、 Ｍ、Ｒｉｄｅ’（ｅｄ。 ）（１９７８）、 １． Ｎ、 Ｒ，Ａ、 、Ａｎｇｒ
ｃｓ、１１５−１２６）および腫瘍性の増殖を可能にす
る遺伝子（Ｌｅｅｎ＋ａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、（１９８
２）、１．４７−１５２）を含んでいる。このＩ−１ｉ
夏＋ｄｌｌｌ フラグメントをプラスミドＩ）ＢＲ３２
５に挿入した（Ｂｏｌｉｖａｒ＋ Ｇｅｎｅ４（］ ９
７８）、１２１−１３６）。 １）ＧＶ１１７１およびｐＢＲ３２５はＢｅ１ｌａｃｌ
＋らの方法で調製した（Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ、３５（１
９７６）。 ２０３７−２１３４３）。それぞれのＤ Ｎ Ａ’ ２
μｇを２単位のＨｉｎｄ ＩＩＩを用い、３７°Ｃで１
時間完全に消化した（インキュベーション緩衝液はＯ゛
Ｆａｒｒｅｌｌらにより記載されている（Ｍｏ１．Ｇｅ
ｏ。 ＧｅｎｅＬ、１７９（１９８０）ｔ ４２］−４３５
））。 ０．１μ８のＨｉｎｄ ＩＩＩ消化したｐＧＶ １１７
１を、Ｈｉｎｄｌｌｌで線状化した０、０５μＢの１）
ＢＲ３２Ｓと、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．０２単位を用い
てライゲーションした。ライゲーション混合物によるコ
ンピテントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ５１４ ｂｓｒ ｂｓ
＋Ｉ＋＋の形質転換はＤａＢｅｒＬおよびＥｂｒｌｉｃ
ｈの方法で行なった（Ｇｅｎｅ ６（１９’８０ ）、
２ ’３−２８’）。細胞を、カルベニシリン（１０
０μｇ／ｌ１１１）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ
、 Ｅｘｐｅｒｉ＋ｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＧｅｎｅＬｉｃｓ （１９？ ２）、Ｃｏ１ｄ
Ｓ１＋ｒｉＢ ｌ−１ａｒｂｏｒ］、ａｂｏｒａｔｏ
ｒｙｗ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に塗抹した。カルベニシリ
ン耐性コロニーを、テトラサイクリン耐性を１晴号化し
ている遺伝子に挿入することによるその不活性化に基づ
ト、テトラサイクリン（１０μ８／ｎ１１）感受性でス
クリーニングした（ Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｇｅｎｅ ４
（１り°ン８）、１２１−１３６）。カルベニシリン
耐性、テトラサイクリン感受性のコロニーを、そのコロ
ニーから調製したＤＮＡの制限酵素消化により、マイク
ロスケール技法（Ｋｌｅｉｎら９ Ｐｌａｓｍｉｄ３（
１９８０）、８８−９１ ）によって物理的に特性化し
た。即ち、Ｂａ＋ｎＨＩ消化により、・１つのｌ）Ｎ
Ａ ７ラグメントが得られる：ａ配向の場合は０゜９８
ｋｂ、’ ４．７１ｋｂ、 ５．９８ｋｂおよび７．
０２ｋｂの７ラグメントが得られ、β配向の場合は０．
９８ｋｂ、４．？１ｋｂ、１．７１’ｋｂおよび１１．
２０ｋｂの７ラグメントが得られる。こうして得られた
ａ配向の組換えプラスミドはｐＧ’ｖ ７０ｊ）と名付
けられ、更にその後の実験に用いられた。 ｐＧＶ７５０は、ｐＧ Ｖ ７０１）に挿入されたＴＬ
−領域の内部の腫瘍に必須の機能を暗号化している３、
４９ｋｂ Ｂ’ＢＩ ＩＩ−８ｍａ ｌ ７ラグメン
トをカナマイシン耐性を暗号化している２、８１ｋｌ）
Ｂａ＋＋＋ＨＩ Ｈｐａ Ｉ ７ラグメントで置換
することにより、１）ＧＶ７００から誘導される。カナ
マイシン耐性を暗号化しているＢａ＋ｎＨＩ Ｈｐａ
Ｉ ７ラグメントはλ：： ｉ” ｎ ５ （Ｂ ｅ
ｒａ呟Ｐｒｏｃ、 ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ’＋、Ｌ
ＩＳＡ’？２（１９７５）、３６２８ ３６３２ ）か
ら得られる。λ：：Ｔｎ５の調製は Ｍｉｌｌｅｒによ
り記載されている（ Ｅｘｐｅｒｉ＋ｏｅｎｊ、ｓ ｉ
ｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（］９ ’７
２ ）、Ｃｏ１ｄ Ｓｌ）ＣｉｎｇＨａｒｌ）ｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ＋ Ｎｃｉｕ Ｙｏｒｋ）、 ｐＧ
〜’７００ＤＮＡはＢｅｔｌａｃｈらの方法で調製する
（ Ｆｅｄ、Ｆ’ｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７
−２９４３）。１）ＧＶ７００ＤＮ八２ｕｓ＆２単位ノ
ＢＢＩ Ｉ オ及び２単位の５ｈｏａｌ で完全
に消化した。λ：：Ｔｎ５Ｌ）ＮＡ２μｇを２単位のＢ
ａｍＨ’Ｉ および２単位の１−１ ｐａ Ｉで完全
に消化した。１μｇのＢａ５ａｌ−ＩＩ Ｈｐａｌ消
化λ：：ｉ’篩を、最終量１０μで中、Ｔ４’ＤＮＡす
〃−ゼ０．５単位を用いて、０．２μｇのＢｇｌＩＩ
５ｈｏａｌ消化ｐＧＶ７００とライゲーションした（
ｔ！！遺業者の指示する条件に従った）。このライゲー
ション混合物をコンビテン）Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ５１４−
十 ｂｓｒ ｌ＋ｓ＋＋＋ 細胞（１）ａｇｅｒＬおよ
びＥｒｂｌｉｃｌ＋、 Ｇｅｎｅ６（］ ９８１’））
、２３−２８）に導入した。細胞を、カルベニシリン（
１００μＢ／ｍ ｌ ）およびカナマイシン（２５μ８
／１ｅｌ）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ。 １尤ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
ＧｅｎｅＬｉｃｓ （１９７２）。 Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉＢ ）ｌａｙ市ｏｒ Ｌａｌ
＋ｏｒａＬｏｒｙ、Ｎｅｕ＋ Ｙｏｒｋ）−にに塗抹
した。マイクロスケール技法（Ｋｌｅｉｎら。 Ｐｌａｓ＋ｎ１ｄ３（１９８０）８８ ９１）に従って
調製したｌ） Ｎ Ａの制限酵素分析により、ＣｂＲお
よびＫｍ”コロニーを物理的に特性化した。この１）Ｎ
ＡをＢａｌ Ｉｆ／ Ｂａ５ａｌ旧で二重消化すると、
３．９４ｋｂ、ｓ、５ｑｋｂおよび８．０９ｋｌ＋の３
つの７ラグメントが、１ｌｉｎｄ ＩＩＩで消化すると
２．６８ｋｂ、５．９９ｋｂおよび９．２５ｋｂの３つ
の７ラグメントが得られる。この消化パターンを示すプ
ラスミドをｐＧ■７５０と名付け、第１７図に模式的に
示した。 ｐＧＶ７００とｐＧＶ７５０１ｉ、オフ） ビン’ｒｉ
プラスミドｐＴｉＢ６ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの左右の境界
配列を含む、２つの相異なる中間クローニングベクター
である。更に、これら２つのプラスミドではＴ−領域内
の削除の程度が異なっている。 ｐＧＶ７００は、オクトピンシンターゼ（トランスクリ
プト３）およびその他３つの生成物、即ち４．６ａおよ
び６ｂ （Ｔ−領域の生成物についてはＷｉｌｌ＋ｏｉ
ｔｚｅｒ ら、ＥＮＢＯＪ、］ （１９８２）。 １３９−１４６参照）のための遺伝情報を持った縮小Ｔ
−領領域含んでいる。この３つの生成物（４，６ａおよ
び６ｂ）の組み合せが形質転換された植物の新芽形成を
促す。ｐＧＶ７５０はもっと小さい］゛−領領域即ちオ
クトピンシンターゼ遺伝子だけを含んでいる。生成物４
，６ａおよび６１）の為の情報は、カナマイシン（ネオ
マイシン）耐性を暗号化して゛いる抗生物質耐性マーカ
ー遺伝子によりて置換されてしまっている。 ｐｃｉ Ｖ ７ （，１０およびｐＧ Ｖ ’７５０は
、Ｂタイプのアクセプター′旨プラスミド（第８図およ
び後記実施例３参照）と共に使用し得る中間クローニン
グベクターのイ列で゛ある。、これらのベクター（土、
それらがｌｌ１ｊ望の遺伝子を含んでいないことを除け
ば、第５ｊ図に示したものと部分的に類似している。 これらのベクターは、その改良′１゛−領域内にクロー
ンする為の１個の制限エンドヌクレアーゼサイトを含ん
でいるので、所望の遺伝子を簡単にそれらのベクターに
挿入することができる（第１・′［図および第１５図参
照）。 実施例３ アクセプター′Ｆｉプラスミド１）（ハ・”
２２６１．１ （タイプＢ）の組み立て出発株およびプ
ラスミド： Ａ８ｒｏｂａｃ１．ｅｒｉ＋ｎ＋＋ Ｌｕ＋ｎｅｆａｃ
ｉｅｎｓ （野生型ＡＢｒｏｂａ−ｃＬｅｒＩｕａ＋か
ら誘導される、リファンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１および
エリスロマイシン−クロラムフェニコール耐性株Ｃ５８
Ｃ１） Ｔｉ プラスミド＝ｐＧＶ２２１？ 中間ベクター（第１６図）＝ Ｉ）ＧＶ ７４５Ｔｉプ
ラスミドｐＧＶ２２１７の組み立てについては詳細に記
載されている（ Ｌｅｅ＋＋＋ａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、
［１９８２）、１４７−１５２）。 これは、オクトピン′１゛１プラスミドの全′１゛Ｌ−
領域の欠失置換突然変異体を含んでいる：即ち、Ｂａｍ
ＨＩフラグメント８．３（）ｂ、２８．１７ａおよびＢ
ａｍＨＩフラグメント２の左の３．７６ｋｂＢａｍＨＩ
−ＥｃｏＲｌフラグメント （Ｉｃｅ Ｖｏｓら。 Ｐｌａｓｍｉｄ ６（１９３１）、 ２ □１．９−
２ ’、＞ ３）か゛、Ｔ ｎ ５ のａｐｌ （アセ
チルホスホトランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいるｐ
ＫＣ７のＥｃｏＲＩ−１３ａｍＨＩ ７ラグメント（Ｒ
ａｏ ＆ Ｒｏｖｅｒｓ、 Ｇｅｎｅ７（１’：） ７
９）＋７９ ８２）で′置き換えられている。 この遺伝子はアミノグリフシト、ネオマイシンおよびカ
ナマイシンに対する耐性を暗号化している。 中間ベクターｐＧＶ？４５の組み立てを第１６図に模式
的に示した。これについて以下に詳述する。組換えプラ
スミドｐＧＶ７１３を、α配向でＨｉｎｄ ＩＩＩフラ
グメント１４．１８ｃ、２２ｅおよび３８ｃを含む、オ
クトピンＴｉプラスミドサブクローンｌ）Ｇ Ｖ ０２
１ ’、３ （Ｄｅ Ｖｏｓら、 Ｐ ｌａｓ＋ｎ１ｄ
６（１９８１）、 ２４９−２ｓ３）から誘導した。 １１ｃ；ＶＯ２１９ＤＮＡをＢａｍＨＩで完全に消化し
、次いで自己結紮（セルフライプ−ジョン）に有利な条
件下でライプ−ジョンした（ライゲージａン混合物中の
Ｄ Ｎ Ａの最終濃度く１μｓ Ｄ Ｎ Ａ ／＋ｎｌ
’）。 アンピシリン耐性で形質転換体を選別し、制限酵素によ
る消化で物理的に特性化した。こうしてｐｃｔ Ｖ （
、＞ ２１．９に存在する６、５ｋｌ〕Ｂａ＋ｎｊ刊フ
ラグメントをもはや含んでいないクローンを分離し、こ
れを １ｌＧＶ７１３と名（；Ｉけ、その後のクローニ
ングに使用した（以下の記載参照）。Ｂａｍ）−１１７
ラグメント２を含んでいる Ｉ）に＼；ｏ１２ｏ＜Ｉ）
ｅＶｏｓら＋ Ｆ’ｌａｓ＋１１ｉｄ 、６（１９８
１）、 ２４９−２５３）から組換えプラスミ°ド
ｌ）Ｇ Ｖ ７３８を誘導した。１）（八゛（月２０１
） Ｎ ＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐ（ｉＶ“７１３の
場合と同様にして自己結紮させた。 形質転換体をアンピシリン耐性によって選別上制限酵素
消化により分析した。ＥｃｏＲ１７ラグメント２０．１
２およびＥｃｏＲ１７ラグメント１９８の一部とＩ）Ｂ
Ｒ３２２の一部を含んでいる２゜９５ｋｂ ＥｃｏＲＩ
７ラグメントが全て除去されたりａ−ンをｐＧＶ７３
８と名付け、更にその後のクローニングに利用した。こ
のプラスミドは、依然としてＢａ＋ｎＨＩ ７ラグメン
ト２の右側部分からの５．６５ ｋｂ ＥｃｏＲＩ −
Ｂａ５ｏｌ（ｌフラグメントを含んでいる（Ｄｅ〜’ｏ
ｓら、 Ｐｌａｓ＋ｎｉｄ ６（］ ９８ ］）。 ２４９−２５３）。 次いでｐｃｉＶ ７１３ ＤＮＡを１−ｆｉｎｄ ＩＩ
ＩおよびＢａｎ＋ＨＩで消化し、消化物をプレパラティ
ブアガロースゲルにかけた。電気泳動の後、ｐＧ Ｖ
’７１３内に含まれている２、３０ｋｌ＋ Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ−Ｂａ＋＋＋ＨＩフラグメントを電気溶出で純化
した（Ａｌｌｉ１１８Ｌｏｎ呟Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｂ
ｅｍ、 ８５（１９７５）、 １８８−１９６）。この
フラグメントをｌ−１ｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨＩ
で完全に消化した１）に＼１７３８とライゲーションし
た。形質転換後、アンピシリン耐性コロニーを、制限酵
素消化により物理的に特性化する。例えは、ＥｃｏＲＩ
−Ｂａ＋ｎＨＩ消化により、それぞれ３． Ｌ：）
８ｋｂ （＝ベクタ一部分）と７Ｊ５ｋｂ（＝挿入部分
）の２つの７ラグメントが得られるはずである。この特
性を持った組換えプラスミドは１）ＣＩ Ｖ ７４５と
命名され、アクセプターＴｉプラスミド匹：＼・“２２
６ ＋）を組み立てるための申開ベクターとして使用さ
れた。 ７’？スミＨ＋＋ＧＶ７４５１ｉ ｐＢＲ３２２部９に
Ｃｏ１１ＥＪ特異的ＩＪＯ＋ｎサイトを持ってお１）、
実施例１に記載した様に（アクセプター′１゛１プラス
ミド１）に＼’ ：（８５（，１の組み立てについて）
、ヘルパープラスミド゛ＲＧ ４ ｄｒｄ ］ ４およ
びｐ（＋ Ｊ ２８を使ッてＥ、ｃｏｌｉからＡＨｒｏ
ｌ＋ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎへ摂動さぜることがでｂる。 １）に＼′７４５を、す７アンピシン耐性であり′１′
ｉプラスミド１）に＼’２２１７を含んでいるＡＢｒｏ
ｂａ−ｃ １．ｅ ｒ ｉ ＬＩ Ｉｌｌ抹Ｃ５３Ｃ］
に摂動させた。最初の乗り換えは、実施例１ （アクセ
プター′］゛ｉプラスミドｐＧＶ ３８５ｔ３の組み立
て）に記載した方法と同じ方法で、ｐＢＲ３２２のアン
ピシリン耐性を使って選択した。２回目の乗り換えによ
り、 １＋ＧＶ２２１７に存在する欠失置換突然変異体
がプラスミドｐＧＶ’７４５の１）ＢＲ３２２配列によ
って置換サレル。ｐＧＶ ７４５ノＩＩＧＶ ２２１７
トノ４ｔＪ互組込みの結果得られるアンピシリン耐性
トランス接合体を、カナマイシン耐性の欠落により直接
選別することにより第２の組換え体を得た。この様にし
て、ｐＧＶ２２６０（アンピシリン耐性、カナマイシン
感受性）・を含んでいるリファンピシンＡ ｇｒｏｂａ
ｃ Ｌｅｒ ｉ ＋ｕ＋＋株Ｃ５８Ｃ１を得た。 コノＴ＋ フッスミ）’ Ｉ）Ｃ； Ｖ ２２６１）１
．ｔ、Ｉ）Ｇ■７００−または１フＣ呵’＝”７５ り
一タイプの申開クローニングベクター用のアクセプター
プラスミド′（Ｂタイプ）として１史用されるもので゛
あｌる。これらは、（１）アンピシリン耐′ｌ／１．遺
伝子、複製起源および１］ＢＲ３２２のｂｏｍサイトを
持ったＤＮＡフラグメント、（ｉｉ）ＴＬ ＤＮＡの
左右の境界配列および、中間りａ−ユングベクターのＥ
、ｃｏｌｉがらＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移並
びにそ＜７）７クセプターＴｉプラスミｌ’ｐＧＶ２２
６０への相互組込みを遺伝学的に選別し得る、Ｉ）ＢＲ
３２２に既に存在している耐性マーカーとは別の、もう
１つの耐性マーカーを含んでいるＤ Ｎ Ａ ７ラグメ
ント、で構成されている。 例えば、本発明者らは、ｐＧＶ２２６０とｐＧＶ７００
との間の相互組込み体を持っているＡＢｒｏ−ｂａｃｊ
ｅｒｉｕｎ＋は、所望のＤＮ、Ａ配列（Ｔ−ＤＮＡ境界
の開に含まれている）を植物細胞ゲノムヘ転移させ得る
ことを立証した。この形質転換された植物細胞は、もし
ｌ）Ｇ’７００が３つの生産物のための遺伝情報（４，
６ａ、６ｂ ； Ｗｉｌｌ＋ｎ１ｔｚｅｒ呟ＥＭＢＯＪ
、 １（１９８２）、１３９−１４６）を含んでいる場
合は、期待される表現形質、即ち新芽を生じる腫脹を示
す。をの緑に、本発明者らは、Ｂタイプのアクセプター
Ｔｉプラスミドは、第９図に示し、更に実施例２に記載
したタイプの申開りａ−ユングベクターとの相互組込み
体として使用すると、Ｄ Ｎ Ａを植物細胞に転移させ
ることができることを証明した。 大箱−１１ｆ１４ 植物に発現させようとする遺伝子
を含んだ中間りＶ−ユングベクターの組み立て本発明が
完成されるまで、′１゛Ｉプラスミドの１゛−領域内の
、多かれ少ながれでたらめな位置に全遺伝子を挿入して
も、その外米性の配列が植物ゲノムへ転移した後発現さ
れるということはなかった。本発明方法に従えば、所望
の外米性遺伝子（群）の暗号領域を、植物細胞中で機能
することが知られている転写開始および終了信号に連結
することができる。この方法の有用性は、ツバリンシン
ターゼ遺伝子を暗号化しているＤＮＡ配列が関与する、
本発明の実験によって例証される。この遺伝子の全配列
および正確な転写開始および終了は既知である（Ｄｅｐ
−ｉｃｋｅｒらＪ 、 Ｍｏｌ、 Ａｐｌ＋ｌ、 Ｇｅ
ｎｅＬ、１（１９８２）、５６１−５７４ ）。本発明
によれば外来性遺伝子の蛋白質ｕｉ号化領域はｌｌＯｓ
プロモニターの隣りに挿入することができる。外米性遺
伝子配列の例として、オクトピンシンターゼ遺伝子の暗
号領域（Ｄｅ Ｇｒｅｖｅら、Ｊ、八４ｏ１゜ＡＩ）Ｉ
）Ｉ、 Ｇｅｎｅｔ、 １（４９８２）、４’：）
９ ５１２）をｌｌ０Ｓプロモーターに隣接させて挿
入する。この構造物はアクセプターＴｉプラスミド内に
授動され、植物を感染させるのに使用される。生成した
腫瘍組織にオクトピンが存在するがどうかを分析した所
、陽性であることがわかった。 キメラツバリンプロモーターを含有している中１１りり
ａ−ユングベクターの組み立て：オクトビンシンターゼ
構造遺伝子を第１８図〜第２０図に示す。 簡単に言えば、ｌＩＯ３遺伝子を含んでいる制限７ラグ
メントＨｉｎｄ ｌｌｌ−２３をインビトロで処理して
１ｌＯ８Ｉ］ｊｔｆ配列の大部分を除去するーノへ制限
エンドヌクレアーゼサイ） Ｂａ＋ｎＨＩに＠接してい
るｌｌ０Ｓプロモーターは保持する（第１８図）。１０
μ８の ｐＧＶＯ４２２（完全なｎｏｓ遺伝子を含むｌ
１ｉｎｄ ｌｌｌ−２３７ラグメントを持った１）ＢＲ
３２２誘導体； Ｄｅｌ＋１ｃｋｅｒら、Ｐｌａｓ＋１
Ｉｉｄ （１９８（、））、１９’３−．２１ ］）を
５ａｕ３Ａで消化り、ｎＯＳプａモーターを含んだ３５
０１＋ｐの７ラグメントをプレパラティブ５％ポリアク
リルアミドデルで分離する。このプロモーター７ラグメ
ントｉ、５゛−末端燐酸エステル基を除去するために予
め細菌性アルカリホス７７ターゼ（ＢＡＰ）で処理した
、Ｂｇｌ Ｉｌ−切断ｐＫＣ７（Ｒａｏら、Ｇｅｎｅ７
（１９７９）、７９−８２）に結合させる。得られたプ
ラスミド（ｐＬＧＶｌ ３）２０ｕｇをＢｇｌｌｌＦ消
化し、４００ｐｉの１２ｍＭ ＭｇＣｌ□、１２Ｉ＋＋
Ｍ ＣａＣｌ２．０．６Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡおよび２０１ｎＭトリスーＨＣＩ（ｐＨ８，０）中
、３０℃でＢａｌ ３１エキソヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌ
ａｂｓｓ Ｎｅｕ＋ ＥＨｌａｎｄ）７単位を用いて４
〜１０分間処理する。この間、約２Ｏ−５０ｂｐのＤＮ
Ａが除去される。このＢａ１３１−処理分子をＢａ＋ｎ
ＨＩで消化した後、ＤＮＡポリメラーゼのＫ ｌ ｅｎ
ｏｕ＋ ７ラグメントと４つのデオキシヌクレオシドト
リ本スフニー） （それぞれ１０１０１ｆ１と共にイ
ンキュベートして、その末端を満たす。充填されたＢａ
ｎ＋ＨＩ末端とＢａ１３１除去末端とのライプ−ジョン
から得られる再生Ｂａ＋ｏＨＪサイトを持ったプラスミ
ドを選別する。いくつかの候補のＢａ＋ｏＨＩ −８ａ
ｃ ＩＩ ７ラグメントのサイズを６％尿素−ポリアク
リルアミドデル中で見積り、サイズが２００〜２８０ヌ
クレオチドの範囲にある候補のヌクレオチド配列を決定
する。 プロモーターを持った２ １） ３ ｂｐの５ａｃｌｌ
−、Ｂａ＋ｎＨｌフラグメントを含んでいるりひ−ンｐ
Ｌ （＋ Ｖ３（１を、ＩＩＧ ■０４２２の １１
０８遺伝子中のＳａｃｌｌ−ＢａｍＨＩ７ラグメントと
置換するのに使用するユニの最終プロモーターベクター
は１＋ １． Ｃｉ ’Ｖ２３８１と呼ばれる。全ての
組換えプラスミドはＥ、ｃｏｌｉ株ＨＢ １ ’０１の
形質転換により選択する。 この様に処理した＋１０８プロモータを含んでいるプラ
スミドベクターをＢａ＋ｎＨＩで消化し、Ｂａ＋ｎＨＩ
フラグメントに含まれているＯｅＳの暗号配列をこのサ
イトに挿入する。このＯｅＳ暗号配列も、インビトロで
処理し、第１９図に示した様に、Ｂａ＋ｎｌｌ ｌ制限
エンドヌクレアーゼサイトで囲まれる様にする。オクト
ピンＴｉブラスミｒＢ６ｓ３のＢａｒｎｌ−Ｉ Ｉ ７
ラグメント１ ’７ａｌ Ｏμｇ（Ｄｅ Ｖｏｓら。 Ｐｌａｓ＋ｏｉｄ ６（１９８１）、２４９−２５３）
をＢａｍ１−Ｉ ＩおよびＳｍａＩで消化し、ｏｃｓ−
暗号配列を含むフラグメントを１％アガロースゲルから
分離し、１３ＢＲ３２２の大きイＢａｍＨＩ Ｐｖｕ
ｌ Ｉ ７ラグメントに結合させる；得られたプラス
ミド、ｐＡＧＶ ８２８（２０μｇ）をＢａｍＨＩで消
化し、第１８図に示した様にエキソヌクレアーゼＢａ１
３１で処理し、次いでＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、末端
を充填し、自己結合させる。Ｂａ１３１除去体のサイズ
は６％ポリアクリルアミドデル中で見積る。いくつかの
候補のヌクレオチド配列を決定し、５゛−非翻訳リーダ
ー配列の残り７ｂ１】だけを持った候補を選択して以下
の操作に付す（＋）ＯＣ３△）。ｏｃｓ配列をＢａ＋ｎ
ＨＩサイトで囲むために、Ｃ１ａｎ−Ｒｓａ■７ラグメ
ントを充填し、ＩＩＬ Ｃ２３６（Ｒｅｍａｕｔら、Ｇ
ｅｎｅ１５（１９８１）、８ｌ−９３）のＢａｌ Ｉサ
イトにサブクローンする。得られたプラスミドｐＡＧＶ
４０をＢａＩＩＩＨＩで消化し、ｏｃｓ配列を持ったフ
ラグメントをプレパラ７４１１％アガロースデルから電
気溶出により分離し、予めＢａｍＨＩで消化しＢ Ａ
Ｐ （細菌性アルカリホスファターゼ）で処理したｐＬ
ＧＶ２３８１に結合させる。 ｏｃｓ配列のｐＬＧＶ２３８１への挿入により、両方の
配向の、ものが得られる曽）’Ｎ０−１およびｐＮ０−
２）。 ｎｏｓ ： ｏｃｓ融合の正確な接合点を示すヌクレオ
チド配列を第２０図に示す。 更に、処理したｎｏｓプロモーターを含有しているプラ
スミドベクターは、酵素ジヒドロフォレートレグクター
ゼを暗号化しているプラスミドＲ６７からのＤＮＡを挿
入するのに使用される。ノヒドロ７オレートレダクター
ゼ遺伝子を含んでいる暗号配列は、Ｂａ＋ｎＨＩに含ま
れており （０’１１ａｒｅら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７８（］ ９
８１）＋１５２７ １５３１）、従って既述した様に、
プロモーター領域に隣接するＢａ＋１１）Ｉ Ｉサイト
を含んでいる口ＯＳプロモーターベクターに容易に挿入
される。この遺伝子は、発現されると抗生物質メ））レ
キセードに対する耐性をイ４与するので、選択可能なマ
ーカー遺伝子の１つの例である（第２．３，４．５およ
び７図参照）。この中間クローニングベクターか野生型
ツバリンアクセプターｉ’ ｉ プラスミドを含んでい
るＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎに摂動されると、単一
乗換えが起り、ハイブリッドＴｉプラスミドベクターが
得られる。このベクター組成物を、植物の感染に使用す
る。得られた腫瘍組織は、０．５μｇ／Ｉｎｌのメ））
レキセードの存在下で継続して生長し得ることがわがっ
た。 ｏｃｓおよび上記のｎｏｓプロモーターの後のジヒドロ
フオレートレグクターゼロｉ号領域を含んでいる中間ク
ローニングベクターを組み立て、Ａｇｒｏ−ｂａｃＬｅ
ｒｉｕｍのＴｉプラスミドと相互組込みした後、形質転
換植物細胞に転移、発現させることにより、本発明方法
によって外来性遺伝子を植物細胞に転移し、発現させる
ことができるということが証明される。 ヌ施例５ 染色体中に所望の挿入遺伝子を含む植物細胞
および植物の分離 本発明者らは、以下の３つの方法のいづれがを使って、
非腫瘍性アクセプタ−１゛１プラスミド誘導体（例えば
Ｉ）ＧＶ３８５Ｕ）で形質転換された植物細胞および全
植物を得た。 （１） インビボでの全植物の接種、次いで新芽の再生
が可能な培地上、インビトロでの培養、（２）損傷部位
で直接新芽の生成を促す他のＡＢｒｏｂａｃｌｅｒｉａ
株の存在下、インビボにおける全植物の相互感染、 （３）インビトロでの単一植物細胞プロトプラストの共
生培養。 これらの方法について以下に詳述する。 最初の方法は、クラウンガル組織の生産をもたらす全植
物組織の野生型Ａｇｒｏｌ＋ａｃＬｅ、ｒｉｕｂ＋株に
よる感染体を得る為に通常使用される方法を改良したも
のである。ｐＧＶ３８ｇＯは腫瘍を形成しないＡ２ｒｏ
ｂａｃｌｅｒｉ＋ｕ＋＋誘導体であるので、感染部位に
おいて腫瘍の増殖はみられない。しかし感染した組織を
取り除き、組織培養η増殖させると、形質転換された組
織を容易に得ることができる。初期培養期間（単に組織
の量を増やすため）の後、損傷部位組織を新芽形成が可
能な条件下で増殖させる。 非形質転換細胞およびＩ）、Ｇ Ｖ ３８５０−形質転
換細胞の両者が新芽を発生する。形質転換新芽は、７パ
リンの存在をみる簡単な分析により容易に区別すること
がでトる。 本発明者らは、次のプロトコールに従って、Ｎ１ｃｏｔ
ｉａｎａ Ｌａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｃｏｏｓｉｎ ３８
の頭部を切断したタバコの苗木から、ｐＧＶ３８５０−
形質転換カルスおよび新芽を得た（全ての操作はラミナ
ー７０−フード中、無菌条件下で行なった）。 （１）小さなびん（直径１０ｃｔｎ、高さ１０ｃ＋ａ）
の中で、０．８％の寒天を含む固形のＭｕｒａｓｌ＋ｉ
Ｂｅ ＆Ｓ ｋｏｏｇ（Ｍ Ｓ ）培地（Ｍｕｒａｓｌ
＋ｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ。 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｐｌａｎｔ、 １５（１９６２）
＋ ４．７３−４９７）で生Ｗさせた６周令のタバコ
の苗木を使用する。 （２）外科用メスで最も若い頭頂の葉を切り取って捨て
る （３）選択的条件（例えばＴｉプラスミド１）ＧＶ３８
５０を含んでいるり７７ンピシン耐性、アンピシリン耐
性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の場合は、１００μ８
／［１１１のり７７ンビシンと１００μ８／ｍ１のカル
ベニシリンを含んでいるＹＥＢ培地を使用する；ＹＥＢ
培地＝５ｇ／１． ＢａｃＬｏビーフェキス、１ｇ／Ｉ
！、 Ｂａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／（！、ペプトン
、５ｇ／ｉシュクロース、２×１０°３ Ｍ Ｍｇ５Ｏ
４ｔ１］Ｈ７，２，１５ｇ／４寒天）で増殖させた新鮮
な平板培養からのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、スパ
ーチルまたはつまようじで損傷表面に接種する。各ｐＧ
Ｖ ３８５０組み立て物を、少なくとも８本の苗木に
接種する。 （４）２週間インキュベートする。接種部位にほとんど
あるいは全く反応が表われないはずであるが、時々考償
に小さいカルス（ｃａ’ｌ ｌ ｉ ）が観察される。 （５）損傷表面から厚さ１ ｍａｎ以下の薄い切片を切
り取る。損傷表面を、オーキシンおよびサイトキニン（
１＋ｎＨ／ 、ＣＮ Ａ Ａ、０．２ｍ１Ｂ／ｆｌ
ＢＡＰ）および１％シュクロースを添加したＬ ｉｎｓ
ｍａｉｅｒ ＆Ｓ ｋｏｏｇ（１，ｓ）寒天培地（Ｌ
ｉｎｓ＋ｎａｉｅｒ ａｎｄ ５ｋｏｏｌ；、 ＰＩ＋
ｙｓｉｏｌ。１）ｌａｕｔ、１８（１９６５）、１００
１２７）を含む平板上で培養する。 （６）約６週間後、カル又はその一部をとって７パリン
の存在を試験するのに十分なだけの大きさになる（少な
くとも直径が約５ｍｍになる）。全ての損傷カルスがツ
バリンを生産する訳ではない。４本の植物の内約１本が
ツバリン陽性損傷カルスをつくる。 （７）ツバリン陽性カルスを再生培地を含む寒天平板に
移す二上記のＬＳ培地＋１％シュクロースおよび１ ｎ
＋ｇ／ ｌ Ｂ Ａ Ｐサイ）・キニン（８）約４〜６
週問後に良好なサイズの新芽（高さ１ｃ＋ｏ）力咄る。 更に成長させ、根を形成させるために、この新芽を、ホ
ルモンを會↓ｔｒＬＳ培地＋１％シュクロースを含有し
ている新しい寒天平板に移す。 （９）ツバリンの存在を試験するのに、その一部（１〜
２枚の小さな葉）を切り取れる様に、この新芽を１〜２
週間成長させる。 （１０） ツバリン陽性の新芽を、（１）と同しＭＳ
培地を入れたやや大こい容器（上記と同じ１０ｃｎ＋の
びん）に移し、更に成長させる。 注）感染させた組織のための全ての植物培養培地には、
ｐＧＶ３８５０含有ＡＨｒｏｂａｃＬｅｒｉｕ＋ｏに対
する選択的毒物として、抗生物質セフオタキシム（ｃｅ
ｆｏｌ、ａｘｉｍｅ、 Ｃ１ａｆｏｒａｎ Ｒ、ヘキス
ト）５００ ｕＢ／ｍ ｌが含まれている。この薬物は
、全てのＡＢｒｏｌ〕ａｃＬｅｒｉｕ＋ｎ（カルベニシ
リン耐性のも゛のを含む）の生長をよく阻止する。 本発明者らの研究室で、形質転換された新芽を出す組織
を得る別の方法が開発された。この方法は、Ａｇｒｏｂ
ａｃＬｅｒｉｕｍのある種のミュータントＴｉプラスミ
ド株が、新芽を出すクラウンガル腫脹を生成させるとい
うことを観察したことに基いて開発された。この様な新
芽−誘起（ｓｌ＋ ｉ ）に関する突然変異は、Ａ、Ｌ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドの′１゛ＤＮＡ
（転移ＤＮＡセグメント）の特定の領域に位置している
（Ｌｅｅｔａａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、
１４７−１５２； Ｊｏｏｓら、Ｃｅ１ｌ ３
２（１９８３）＋ １０５７ １０６７）。誘起され
た新芽は完全に正常な非形質（換細胞で構成されている
ことが多い。従って本発明者らは、２つの異なったＡｇ
ｒｏ−ｂａｃＬｅｒｉａ、即ち１つはオクトピンＴｉプ
ラスミド放出（ｓｈｏｏＬｅｒ）ミュー〉ントを持った
もの、もう１つはｐＧＶ３８５０を持ったもの、の混合
物で植物を接種した。この様にすることは、オクトピン
放出ミューチージョンが、ｐＧＶ３８５０で形質転換さ
れた根を誘起することが出来るよい（成金を与える。Ｔ
ｉプラスミミドＧＶ３８５Ｕおよびオクトピン新芽誘起
Ｔｉプラスミドを５：１の割合で含んでいる’ＡＢｒｏ
ｂａｃＬｅｒｉｕｍを植物に接種した。こうすることに
よりｐＧＶ３８５０−形質転換新芽を得た。この新芽は
、ツバリンの存在について分析することにより、容易に
選別することができる。この方法は、精功な紹織培養法
を必要としない。ツバリン陽性新芽を、更に成長させる
ために、長調節ホルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含ん
だ培地に移す。新芽が十分な大きさに達した後、容易に
繁殖の為の土壌に移すことができる。 この共感染法は、簡単に組織培養しにくい種類の植物を
形質転換するのに特に有用である。従って、あらゆる範
囲の農学的にあるいは経済的に重要な植物、例えば豆科
植物、薬用植物および装飾植物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍで処置することか゛できよう。 第３の方法は、Ｎ １ｃｏＬｉａｎａ ｔａｂａｃｃ
ｕ＋＋プロトプラストの単離およびホルモン−非依存性
の′Ｉ゛〜ＤＮＡ−形質転換細胞クローンの選択を、そ
のプロトプラスト−由来細胞と腫瘍性Ａｇｒｏｌ〕ａｃ
ｔｅｒｉｕｔｎ株との共培養後に実施し得るものである
。池の優勢な選択マーカー、例えば高等植物細胞で発現
−れる様に組み立てられた抗生物質耐性遺伝子を使用す
れば（実施例３参照）、形質転換細胞を選択するのに類
似の方法を使用することがでとる。しｈ化この場合は、
それぞれのケ スについて選択の最適条件をみつける必
要がある（選択剤の濃度、形質転換と選択の開の時間、
選択培地中のプロトプラスト−由来細胞または細胞コロ
ニーの濃度など）。 形質転換細胞の選択ができない場合、例えば１）ＧＶ
３８５０またはｐＧ Ｖ ２２１ ？ （Ｌｅｅｔａａ
ｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１ （１９８２）、１４７−１
５２）の様な非毒性の゛ｒ−ＤＮＡミュータントを用い
たために選択が不可能な場合は、遺伝学的形質転換の後
に細胞をオーキシン−およびサイトキニン−含有培地（
例えば２ ｍｇ／矛のＮ Ａ Ａ （ａ−す７タレン酢
酸）ｊＨよび０．３ｆＩ１ｇ／ ｐのカイネチンを含む
Ｍｕｒａｓｈ’ｒｇｅおよびＳ ｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒ
’ａｓｂｉｇｅおよび５ｋｏｏＨ，Ｐ ｔ＋ｙｓｉｏｌ
、 Ｐｌａｎｔ １５（１９６２Ｌ ４７３−４９７）
）で培養し、形質転換コロニーをそのオパイン（ｏｐｉ
ｌｌｅ）含有量で同定することができる。この様にして
、アグロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ）およびマノピン（Ｉ
ｌｌａ １１１１Ｏｐｉｎｅ）合成の電気泳動分析（方
法については［、ｅｅＩｌｌａ１１８ ら＋ Ｊ、
Ｍｏｌ、 Ａ１＋ｐ１． Ｇｅｎｅｔ、 １
（１９８１）＋１４９−１６４参照）の後、約６６０コ
ロニーが、１）ＧＶ２２１７ テ感染後ニ得うレ、’ｒ
’Ｒ−１１ｉ号化オパイン・マノピン（Ｎ２−（１−マ
ニチル）−グルタミン）を合成する Ｎ １ｃｏＬｉａ
ｎａ ｔａｌ〕ａｃｕ＋ｎ ＳＲ１セルラインであ
ることかわがった。このセルラインのカルス切片を再生
培地（唯一の植物成長調節剤としてＢ Ａ Ｐ （６−
ベンジルアミノプリン）口１ｇｉ ｆｌ ）を含むＭｕ
ｒａｓｌ＋ｉｇｅ ａｎｄ ５ｋｏｏ８培地）上で培養
すると、数多くの新芽が形成した。分析した２０の新芽
の全てが、依然としてマノピンを合成することができた
。ホルモンを含まないＭｕｒａｓｂｉｇｅ ａｎｄ
Ｓｋｏｏｇ培地に移した後、これらの新芽は、依然とし
てマノピンを含有し、形態学的に正常なタバコ植物に成
長した。 Ｎ、 Ｌａｂａｃｕｎ＋につぃて次に記載するプロトプ
ラストの分離および形質転換法は、Ｎ 、ｉｔ ｌ ｕ
＋ｎｂａｇ’ｉ ｎ ｉ −ｒｏｌｉａにも用いること
ができる。 ２、実験手法 ２．１．新芽培養条件 培養室内の無菌条件下（１日１６時間、ｉ ｓｏｕルッ
クスの白色蛍光（“ＡＣＥＣＬＦ ５８Ｗ／′２４、
３０ （１’ Ｋ Ｅｃｏｎｏ＋ｎｙ”）、２４℃、
相月洛！度７（）％）、２５０＋Ｊのガラスびんに入れ
たホルモン不含のＭｕｒａｓｈｉＩｌｌｅ ａｎｄ Ｓ
ｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒａｓｌ＋ｉ８ｅおよびＳｋｏｏｇ
＋Ｐｂｙｓｉｏｌ、 Ｐｌａｎｔ １５（１’、）
６２Ｌ４．７３−４９７）Ｊ二でＮ １ｃｏｔｉａｎａ
ｔａｌ〕ａｃｕ＋ｎの新芽培養を維持する。５退会
の新芽培養をプロドブ２ ラストの分離に使用する。 ２．２．プロトプラストの分離 プロトプラストの分Ｓｌおよび培養における全ての工程
は無菌操作で行なう。混合５ｙ素法によりプロトプラス
トを分離する。長さ２ｒ：ｔｎ以下のｊ；ニ常に若い葉
を除く、全ての葉をプロトプラストの分離に使用するこ
とができる。鋭利な外科用のメスで、葉を幅約２−３１
１ＩＩ１１の細長い小片に切断する。この葉材料２〜３
ｇを、酵素混合物５０ Ｉｌｌ ｌ中、暗所で、２４℃
にて１８時間静置培養する。この酵素混合物は、ホルモ
ン不含のに３培地中、０．５％セルラーゼＯｎｏｚｕｋ
ａ Ｒ−１０および０．２％マセロザイム０ｎｏｚｕ
ｋａＲ−１０からなっている（ＮａｇｙおよびＭａｌｉ
ｇａ＋ Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｂｙｓｉｏｌ、 ７
８（１９７６）、４５３−４５５）。この混合物は、０
．２２μ翰細孔膜を通して）濾過滅菌し、顕著な活性の
低下をきたすことなく、−２０’Ｃで少くとも６力月間
貯蔵することができる。 ２．３．プロトプラスト培養 １８時間培養した後、プロトプラストを放出するために
混合物を穏やかに攪拌する。次いでこの混合物を５０μ
ｍのふるいを通して濾過し、シ戸液／を１０ｍ１の遠心
管に移す。振動バケツローターに入れて６０〜８０ｇで
６分間遠心分離すると、プロ）プラストが暗緑色の浮遊
バンド（帯）を形成する。プロトプラス１の下層の液お
よびペレット状の残骸を、蝶動ポンプに連結した毛細管
を使って取り除く。プロトプラストを１つの遠心管に集
め、培養培地で２回洗浄する。この培養培地は、ＮＡＡ
（０，１ｍｇ／／２）およびカイネチン（０，２ａ＋ｇ
／夕）を成長調筋剤として含有するに３培地である（Ｎ
ａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚ
ｅｎｐｌ＋ｙｓｉｏｌ。 ７８（１，９７６）、４５３−４５５）。この培地は１
）Ｈ５，６に調節し、０．２２μｍの濾過膜を通して滅
菌する。２回目の洗浄の後、ＴＩ＋ｏ＋ｏａ血球計算器
（“Ａ’５ｓｉｓＬａｎｔ”＋西ドイツから入手）を用
いてプロトプラストを計測し、最終密度１０５プロトプ
ラス）／Ｊとなる様に培養培地に懸濁する。直径９ｃｍ
の組織培養用良質ペトリ皿当たり１．０ｍρの容量でプ
ロトプラストを培養する。このペトリ皿をＰａｒａＦｉ
ｌｍＲでシールし、２４°Ｃで、暗所次いでかすかな光
（５００〜１０００ルツクス）を当てて２４時間培養す
る。 ２．４．共生培養による形質転換 分離５日後１こプロトプラスト培養株を感染させる。Ａ
ｇｒｏｌ）ａｃＬｅｒｉｕｍを液体ＬＢ培地（Ｍｉｌ
ｌｅｒ。 Ｅｘｐｅｒｉ＋ａｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕ’
ｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）、 Ｃｏ１ｄ
Ｓ１＋ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ。 Ｎ ｅｗ Ｙ ｏｒｋ ）中で１８時間培養後、２Ｘ
１１Ｊ９細胞／１１の密度となる様にに３培養培地に再
懸濁する。この懸濁液５０μρを植物プロトプラスト培
養株に加え、Ｐ ａｒａｆ ｉ ｌ＋ｎＲでシールした
後、この培養株を２．３．と同し条件下で培養する。４
８時間後に培養株をＩＯＪの遠心管に移し、振動バケツ
ローターに入れ、６０〜８０８で゛６分間遠心分離する
。浮遊パンＶおよびペレットを集め、抗生物質（カルベ
ニシリン１０００μＢ７Ｊまたはセ７才タキシム５００
μｇ７’ｌｌ＋／）を補足したに３培工也（Ｎａｇｙお
よびＭａｌｉ８ａ、 ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎ １ｄ＋
ｙｓｉｏ１゜７８（１９７６）、４５３−４５５）１（
１，＋Ｃに内１強濁する。 培養２週間後、プロ「プラスＦ−山米マイクロカルスな
遠心分離し、前記と同濃度の成長調節剤および抗生物質
を含むがシュクロー−スに関しては０．４Ｍの代りに０
．３Ｍ含むに３培地（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ＋
Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｂｙｓｉｏｌ、７８（１９７
６）、４５３−４５５）に再懸濁する。この培地の細胞
密度は約２５Ｘ１０’マイクａカルス７Ｈ（，１に調節
する。同じ条件下で更に２週問培養した後、カルスを、
前記と同濃度の抗生物質を含むが、より低濃度のシュク
ロース（０，２Ｍ）と成長調節剤（ＮＡ Ａ Ｏ、（１
１ｍｇ／ムカイネチン０．０２ｍｇ／、ｅ）を含む）（
３培地に移す。更に２〜３週問培養後、形質転換体と推
定されるものは、その淡緑色の密な外観、およびより良
好な成長度から認識することができる。これらのコロニ
ーを、より低濃度の抗生物質（カルベニシリン５００μ
ｇ／Ｊまたはセ７オタキシム２５０μｇ／＋ｏ、ｅ）を
含むがホルモン不含の（）、６％寒天固形培地（Ｌ ｉ
ｎｓｍａｉｅｒおよび５１（００＆＋ Ｐｌ＋ｙｓｉｏ
Ｌ Ｐｌａｎｔ、 ］ ８（１９６５）＋ Ｉ （、）
０−１２ ’７ ）に移す。形質転換体と推定される
ものが直径約３−４１１１１１１に達した時、ホルモン
不含の培地で生育しでいるそれらにオパイン試験を施す
、二とか゛できる。各コロニーの半分を、オクトピンお
上びツバリン（Ａｅ、ｒｔｓら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ
、 Ｌｅｆｔ。 １７（１９７９）、４３−５０）またはアグロピンおよ
びマノピン（Ｌｅｅ＋ｏａｎｓら９Ｊ、Ｍｏ１．）＼１
１１）ｌ。 Ｇｅｏｃｔ、１（１９８１）、１４’Ｊ”１６４）の検
出に使用する。この試験により、ホルモン不含の培地で
選択されたコロニーの形質転換された性質を確認するこ
とＡ藏できる。その後、選択されたコロニーを抗生物質
不含の培地で培養することができる。 ２．５．ホルモン不含培地上の選択なしの共生培養 形質転換細胞の為の選択ができない（例えば無毒性Ｔ−
ＤＮＡミュータントを使ったため）場合、またはそれが
必要でない場合（抗生物質耐性遺伝子の様な優勢な選択
し得るマーカーかＴ−ＤＮＡに存在している為）、プロ
トプラスト−由来細胞の処理を簡略化することができる
（ホルモン減少工程はもはや必要でない）。感染段階ま
で、プロトプラストを既述した様に処理する。細菌を加
えて４８時間後にプロトプラスト−由来細胞を遠心分離
しく６分、６０６０−８Ｏ、非常に低密度で細胞の成長
を維持することができるＡＧ培地（Ｃａｌ〕ｏｃｂｅ。 Ｆ’１ａｎＬａ ｉ ４９（１９８０）、 ７−１８
）に再懸濁する。Ｆｕｃｌ＋５−Ｒｏｓｅｎｔｌ＋ａｌ
計数チェインバー（“Ａ ｓｓ ｉ ｓ Ｌａｐ Ｌ”
、西ドイツより入手）を使って計測し、以下の操作に
必要な密度になる様に再懸濁する。 オパイン試験のためにコロニーを個々に繰作しなければ
ならない場合は、低細胞密度（１１０ρ当たり１０ （
’ｌプロトプラストー由未来胞および細胞コロニー）で
植えつけると、１力月の培養で大きい細胞コロニーが得
られる。形質転換細胞を薬物で選択で外る場合は、細胞
を高密度（１１’、ｌ ’ １０ ’７ｍ℃）で培養
し、各タイプの選択に最適な時期及び濃度で、その使用
する選択剤を培地に添加する。 ２．６．カルス組織から全植物の再生 カルス組織から正常植物を容易に得ることができる（例
えばプロトプラスト形質転換から、または全植物接種か
ら（２，７参照）得られる）。カルス組織を、］ ｕ＋
ｇ／ｌｌ１ｐのＢ Ａ Ｐを含んでいるＭｕｒａｓｌ＋
ｉｇｅａｎｄ ’Ｓｋｏｏｇ培地で増殖させる：この培
地は１〜２力月後に新芽を形成水せる。この新芽をホル
モン不含の培地に移し、根を形成させ、完全な植物をつ
くらせることができる。 ２．７．タバコ苗木への腫瘍の誘導 タバコの種子（例えば栽培品種Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
３８）の表面を７０％変性エタノール／トＩ２０で２分
間、次いで１０％の市販の標白剤と０．１％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）で処理して滅菌し、更に滅菌水
で５回洗浄する。この滅菌した種子を、Ｍｕｒａｓｈｉ
Ｈｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（０，７％寒天）培地の
塩類を含む大型試験管（幅２５ Ｉｎ１１）、ポリカー
ボネー１製のキップ付）にまく。次いでこの試験管を培
養室（１２，０００ルツクス、１６時間照射／８時間非
照射、７０％相対湿度、２４℃）に入れて培養する。４
〜６週間経つと植物は使用で外る状態になる。少なくと
もその後１カ月間は最適の状態を維持する。苗木は少な
くとも高さ３ｃｕ＋になり、４枚またはそれ以上の葉を
持つはずである。新しい外科用メスで植物の最も若い部
間を通して横に頭部を切断する。植物の上の部分を試験
管から取り除き、火にかけたスパーチルで平板寒天培養
から細菌を損傷表面に塗抹する。野生型の場合は２週間
後に、ある種の変性ミュータント株の場合はもっと後に
腫脹が現れる。この方法は、タバコ（Ｎ １ｃｏＬｉａ
ｎａ Ｌａｂａｃｕｎ＋）、 Ｎ １ｃｏＬｉａｎ
ａ ｐ、ｌｕｎ＋ｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａおよびび
ＰｅＬｕｎ１ａ ｈｙｂｒｉｄａを接種するのに使わ
れる。 以上述べた如く、本発明は、野生型Ｔｉプラスミドの１
゛−領域の腫瘍機能が欠落しているハイブリッドＴｉプ
ラスミドを保持しているＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍで
、初めて植物を形質転換することを可能ならしめたもの
である。Ｔｉプラスミドから植物細胞へのＬ） Ｎ Ａ
の転移に及ぼす１゛−領域の腫瘍機能の影響は知られて
いないので、それでも所望の遺伝子を含んでいる改良１
゛−領域の植物細胞への転移が起ることは驚くべきこと
である。この転移ＤＮＡは植物細胞ゲ゛ツムに相互組込
みされ、安定に保持される。更に、選択した所望の遺伝
子は、その遺伝子が適当なプロモーター配列を含んでい
るか、あるいは含む様に組み立てられると発現すること
ができる。所望の遺伝子を含んでいる中間クローニング
ベクターと、特別に設計されたアクセプターＴｉプラス
ミドとの開で単一乗換えを行わせるという本発明の概念
（アイディア）は、植物細胞の形質転換の為のハイブリ
ッドＴｉプラスミドベクターの組み立てを著しく簡単な
ものにするものである。この特別に設計されたアクセプ
ターＴｉプラスミドは、所望の遺伝子（これは中間クロ
ーニングベクターの一部と同じであるがまたはこれに関
連しているクローニング媒体中に挿入されている）が単
一乗換えによって相互組込み体を形成することかでｂる
様に、通常のクローニング媒体のＤＮ、Ａセグメントを
含んでいる。このクローニング媒体の２つのセグメント
が、組換えの為に必要な相同領域を提供する。 本発明方法によって調製された微生物、中間クローニン
グベクター、アクセプターＴｉプラスミド、およびハイ
ブリッドプラスミドベクターは、１９８３年１２月２１
日、Ｇｅｒ＋ｏａｎ Ｃｏｌ １ｅｃＬｉｏｎｏｆ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＤＳＭ）（Ｇｏｅｔ
ｔｉｎｇｅｎ）に寄託され、確認された以下の培養株で
例示される：（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃ，ｏｌ
ｉ Ｋ １２ ＨＢ １０１中の中間ベクタープラス
ミドｐＡ’ｃｇＢ。 （２）カルベニシリン耐性アクセプターＴｉプラスミド
Ｉ）ＧＶ３８５０を保有しているＡ ｇｒｏｂａｃ ｔ
ｅｒｉｕｎ＋ Ｌｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ
１’） ７アンピシン耐性株、 （３）Ｅｓｃｂｅｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２
株に５１４（Ｌｂｒ Ｉｅ’ｕ Ｌｂｉ ｌａｃ
Ｉ＋５ｄＲ）中の中間ベクタープラスミドｐＧＶ７
００、 （４）Ｅｓｃｂｃｒｉｃｂｉａ ｃｏｌｉ Ｋ １２
株に５１４（（３）と同じ）中の中間ベクタープラスミ
ドｐｃ＋■７５０、 （５）カルベニシリン耐性アクセプターＴ１プラスミド
Ｉ］ＧＶ２２６０を保有しているＡ ｇｒｏｂａｃ ｔ
ｅｒｉｕ＋ｎ Ｌｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ
１リファンピシン耐性株、 （６）Ｅｓｃｌ＋ｅｒｉｃｂｉａ ｃｏｌ ｉ
Ｋ １ ２ ＦＩＢＩＯＩ中の、ツバリン
プロモーター支配下のオクトピンシンターゼ暗号領域を
保有している中間ベクタープラスミド１）Ｎｏ １、 （７）中間ベクターのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの
摂動に使用された株：摂動プラスミドｐＧ Ｊ ２８お
よびＲ６’４ｄｒｄｌｌ（Ｖａｎ Ｈａｕｔｅ呟ＥＭＢ
ＯＪ。 ２（１９８３）、４１１−４１’８）を保有しているＧ
Ｊ２３； ＧＪ２３はＥｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌ ｉ Ｋ １２、ＪＣ２９２６，ＡＢ１１５７のｒ
ｅｃ Ａ誘導体である（Ｈｏｗａｒｄ −Ｆ １ａｎｄ
ｅｒｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４９（１９６４）、２
３７−２４６）。 これらの培養株の受理番号は、それぞれ２７９２（１）
、２７９８（２）、２７９６（３）、２７９７（４）、
２７９９（５）、２８３３（６）、および２７９３（７
）である。 本発明の態様を色々と記述したが、その基本的な構成を
変化させれば本発明に係る方法および組成物を利用する
その池の態様゛が得られることは言うまでもない。 ４、図面の簡単な説明 第１図はアクセプターＴｉプラスミドの模式図、第２図
および第３図はアクセプターＴ１プラスミドに挿入され
る中間クローニングベクターの模式図、第４図はハイブ
リッドＴｉプラスミドベクターの調製法を示す模式図、
第５図は中間クローニングベクターの遺伝子軒移過程の
概略を示す模式図、第６図はＡタイプのアクセプターＴ
ｉプラスミドの組み立てを示す模式図、第７図は中間ク
ローニングベクターの組み立てを示す模式図、第８図は
ＢタイプのアクセプターＴｉプラスミドの組み立てを示
す模式図、第９図はＢタイプのアク虫ブター１゛ｉプラ
スミドに挿入される中間クローニングベクターの模式図
、第１０図はハイブリッド１゛ｉプラスミドベクターの
組み立てを示す模式図、第１１図は５ 、２ ｋｂＨ１
ｎｄｌ ［１７ラグメントＡｃｇＢのｐＢＲ３２２への
挿入を示す模式図、第１２図は７パリンＴｉプラスミド
ｐＧＶ３８３９の１゛−領域を示す模式図、第１３図は
アクセプターＴ１プラスミドｐＧ Ｖ ３８５ （ｌの
組み立てを示す模式図、第１４図は中間クローニングベ
クターｐＧＶ７００の組み立てを示す模式図、第１５図
は中間クローニングベクターｐＧ■７５０の構造を示す
模式図、第１６図は中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立
てを示す模式図、第１７図はアクセプタープラスミドｐ
ＧＶ、２２６０の組み立てを示す模式図、第１８図はプ
ラスミド１）ＬＧＶ ２３８１の組み立てを示す模式図
、第１９図はプラスミドＩ） Ａ ＧＶ １ ’Ｏの組
み立て、およびその、プラスミドｐＬ ｃ； Ｖ ２３
８１への挿入を示す模式図、第２０図はオクトピンシン
ターゼ遺伝子暗合化領域と融合する前後のツバリンシン
ターゼ遺伝子のプロモーター領域の周囲のヌクレオチド
配列を示す模式図である。 特許出願人 マックス・ブランク・ ゲゼルシャフト・ツ７・ フェルデルング・−デア・ ヴイッセンシャフテン・ニー・ ファｌン 代理人 弁理士青白 葆外１名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列（１）および（２）、 （ｂ）単一乗換えが可能な中間クローニングベクター中
のＤＮＡ配列の少なくとも１部と相同なりＮＡ配列を含
む２つの境界配列の開に設置されたクローニング媒体由
来の非腫瘍性ＤＮＡセグメント（３）、および （ｃ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる、野生型Ｔｉ
プラスミドのＴ−領域の植物細胞ゲノム中への転移に必
須であるＤ Ｎ Ａ配列を含んでいる野生型゛１゛ｉプ
？スミドのセグメント（４） を含んでいるアクセプターＴｉプラスミド。 ２、（ａ）Ｔ−領域およびＴ−領域の２つの境界配列を
持たない野生型Ｔｉプラスミドのり、、ＮＡ上セグメン
ト４）、および （１））野生型］゛ｉｉプラスミド−領域の２つの境界
配列を含んでいる中間クローニングベクターのＤＮＡ配
列と相同なりローニング媒体由来のＤＮＡ配列（３） を含んでいるアクセプターＴｉプラスミド′。 ３、 （ａ）少なくとも１つの所望の遺伝子（５）、お
よび （ｂ）９８許請求の範囲第１項に記載の７クセプターＴ
ｉプラスミド中のＤ Ｎ Ａ配列と相同なＩ） Ｎ Ａ
配列を含んでいるクローニング媒体セグメント（３゛） を含んでいる中間クローニングベクター。 ４、（ａ）野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列（１）および（２）、並びに特許請求の範囲第２
項に記載の７クセプターＴ１プラスミド中のＤＮＡ配列
と相同な１）ＮＡ配列を含んでいるクロー二くグ媒体セ
グ〆ン）（３’）、および、（ｂ）その？つの境界配列
の開に設置された少なくとも１つの所望の遺伝子（５） を合本でいる中間クローニングベクター。 ５、所望の遺伝子（５）に隣接して少なくとも１つの選
択可能なマーカー遺伝子を更に含有している特許請求の
範囲第３項または第４項に記載の中間クローニングベク
ター。 ６、所望の遺伝子（５）がその天然のプロモーターの支
配下にあることを特徴とする特許請求の範囲第３項また
は第４項に記載の中間クローニングベクター。 ７、所望の遺伝子（５）が外来性プロモータ〜の支配下
にあることを特徴とする特許請求の範囲第３項または第
４項に記載の中間クローニングベクター。 ８、ヘルパープラスミドの存在下で特許請求の範囲第３
項〜第７項のいずれかに記載の中間クローニングベクタ
ーを特許請求の範囲第１項または第２項に記載のアクセ
プターＴｉプラスミドを含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔ、
ｅｒｉｕ＋ｎに授動せしめ、その中間クローニングベク
ターとアクセプターＴｉプラスミドを単一乗換えにより
相互組込みさせることからなるベクター組成物の調製法
。 ９、（ａ）野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列（１）および（２）、 （ｂ）クローニング媒体由来の非腫瘍性ＤＮＡセグメン
ト（３）および（３゛）、および（ｃ ） Ａ ｇｒｏ
ｂａｃ ｔｅｒ ｉ １１１１１により、野生型Ｔｉプ
ラスミドのＴ−領域を植物細胞デ７ム中に転移させるの
に必須であるＤＮＡ配列および２つの境界配列（１）お
よび（２）の開に設置された少なくとも１つの所望の遺
伝子（５）を含んでいる野生型Ｔｉプラスミドのセグメ
ント（４） を含んでいるハイブリッドｉ’ ｉプラスミドベクター
。 １０、所望の遺伝子（５）に隣接して、少なくとも１つ
の選択可能なマーカー遺伝子を更に含有している特許請
求の範囲第９項に記載のハイブリッドＴｉプラスミドベ
クター。 １１、所望の遺伝子（５）がその天然のプロモーターの
支配下にあることを特徴とする特許請求の範囲第９項に
記載のハイブリッドＴｉプラスミドベクター。 １２、所望の遺伝子（５）が外来性プロモーターの支配
下にあることを特徴とする第９項に記載のハイブリッド
Ｔｉプラスミドベクター。 １３、特許請求の範囲第９項〜第１２項のいづれかに記
載のハイブリッドＴ１プラスミドベクターを保持してい
るＡＨｒ’ｏ’ｂａｃｔｅｒｉｕｍ。 １４、特許請求の範囲第１３項に記載のハイブリッ８、
Ｔｉ７”Ｘ Ｅ Ｖ＜９９二を保持ビいい８．。−ｂａ
ｃＬｅｒｉｕｍで植物細胞を感染させることからなる形
質転換植物細胞の調製法。 １５、特許請求の範囲第９項〜第１２項のいづれかに記
載のハイブリッドＴｉプラスミドベクターの２つの境界
配列（１）および（２）の間に設置されたＤＮＡセグメ
ントを、そのゲノム中に組込んで含有している形質転換
植物細胞。
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