JPS62175187A - 新規植物ベクタ− - Google Patents

新規植物ベクタ−

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JPS62175187A
JPS62175187A JP61253509A JP25350986A JPS62175187A JP S62175187 A JPS62175187 A JP S62175187A JP 61253509 A JP61253509 A JP 61253509A JP 25350986 A JP25350986 A JP 25350986A JP S62175187 A JPS62175187 A JP S62175187A
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JP
Japan
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dna
plant
plasmid
dieminivirus
segment
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Pending
Application number
JP61253509A
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English (en)
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スチーブン　ゲイリイ　ロジヤーズ
レズリー　アン　ブランド
ジエームス　スコツト　エルマー
ロバート　トーマス　フラリイ
ロバート　ブルース　ホースク
デビツド　マチユー　ビサロ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Co
Original Assignee
Monsanto Co
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Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 く技術分野〉 本発明は、植物プラスミド、あるいは植物プラスミドを
生ぜしめる新規ベクター、及びこれらベクターを創製す
るあるいは使用するための方法並びに組成物に関する。
１つの重要な態様に於いては、ジエミニウイルスＤＮＡ
は、自律的に複製し同時に植物中で外来ＤＮＡ配列を複
製することができるＤＮＡ分子を生み出すように修正さ
れる。
〈発明の背景〉 遺伝子組換え技術及び遺伝子工学の進歩により、商業的
、工業的に重要なタンパクをバクテリア中で製造する手
法が開発されている。多くの例においては、バクテリア
中で製造されるタンパクは真核細胞由来のものである。
真核細胞由来のタンパクを製造するための宿主細胞の開
発の段階で、バクテリアでは、製造されたタンパクを更
に機能的なタンパクに変換させるた−めに必要なホール
ディング、グリコシレージョンなどの修正を行えないと
いうことが益々明白にならで来た。それ故に、これらの
修正を行うことができ、ぞして機能的及び／又は抗原性
のない真核細胞由来のタンパクを製造することのできる
真核細胞を用いたシステムの開発が望まれている。
真核細胞あるいは原核細胞を用いた遺伝子工学において
、外来タンパクを効果的に製造するための重要な要素は
、ベクターあるいは宿主−ベクターシステムの開発であ
る。本発明でベクターあるベクターシステムとは、目的
とする（すなわち、外来の）核酸配列あるいは宿主細胞
中の配列を複製し得る核酸（すなわちＤＮＡ及び／又は
ＲＮＡ）分子として定義される。本発明で宿主−ベクタ
ーシステムとは、ある特定のベクター分子をそのゲノム
に受は入れることのできる宿主細胞を意味する。ここで
ゲノムとは、宿主細胞あるいはウィルス粒子に存在する
、いがなるそしてすべてのＤＮＡ、すなわちクロモシー
ムＤＮＡ及びエピゾームＤＮＡを含むものとして定義さ
れる。ここで遺伝子とは、ＤＮＡ配列の発現ηなわちタ
ンパクの製造に必要なすべてのＤＮＡ、あるいは遺伝子
甲で」−ドを可能にするそのフラグメントＤ１らなるも
のと定義される。
原核細胞についての宿主、及びＭ母、核種の韻乳動物セ
ルラインのような真核屑■胞についての宿主に関する多
数のベクターシステムが開発されているが、植物に関す
るそのようなシステムについは、わずかにしか報告され
ていない。ここで植物という言葉は、他にことわりのな
いかぎり植物全体、植物の部分及び個々の細胞を含む。
植物宿主中での効率の良い蛋白合成あるいは■　ｎｏｖ
ｏ蛋白合成は、哺乳動物の細胞培養システムに比べて、
植物ＭＢ胞のそれは低コストであるために、望ましいこ
とであり、また植物において、２次的生成物をより多く
製造するためにも望ましノい。植物における２次的生成
物には、シコニン、ジギタリス、ビンブラスチン、ビン
クリスチン等の医薬品上重要な、植物の生成物が含まれ
る。遺伝子工学的手法により、そのような植物での２次
的生成物の製造は、そのような製造に用いられる酵素を
限定する及び／又はより早く限定することによって、及
び／又はそのような酵素をコードする遺伝子のコピー数
を増加することによって、益々多くなって行くかもしれ
ない。
今日まで、特定の遺伝子を高等植物に導入して目的とす
る蛋白を製造するためのベクターシステムとしては、わ
ずかに２つの例が開示されているのみである。第１のシ
ステムは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｒｕｍ中にＴｉプラス
ミドあるいはその一部をＪ　Ｎする腫瘍を用いたもので
ある。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが植物に感染して、
クラウンゴール腫瘍を生み出す時に、７−ｉプラスミド
の１部分が細菌から植物細胞に導入される。この導入さ
れたＤＮＡは、以後、トランスファーＤＮＡ　（Ｔ−Ｄ
ＮＡ）と云う。このトランスファーＤＮＡは、植物のク
ロモシームＤＮＡに組み込まれ、適当な条件下に、該Ｄ
ＮＡ中に含まれる遺伝子が発現される。トランスファー
ＤＮＡが組み込まれた単一の植物細胞から再生した植物
全体は、そのずべての細胞中にその組み込まれたＤＮＡ
を有することが明らかにされた。
しかしながら、これらの細胞は、一般例には、１〜ラン
スファーＤＮＡの１〜５個のコピーを右するのみであり
、従って、植物細胞中で製造されるトランスファーＤＮ
Ａ！仏子による生成物の量は、限られている。ある特定
のＤＮＡ配列あるいは遺伝子のコピーを増加せしめるこ
とによって、より多くの目的とする蛋白が１ｑられると
考えられる。
それ故に、生成物を増加せしめるために、宿主細胞１つ
あたりの遺伝子のコピーを５個以上どする手段の開発が
望まれる。
第２のベクターシステムは、植物細胞に目的とするＤＮ
Ａ配列を導入するベクターとして、カリフラワーモザイ
クウィルス（ＣａＭＶ）ＤＮＡを用いるものである。Ｃ
ａＭＶは、カリモウイルスの１つであり、２本鎖ＤＮＡ
ゲノムを含む。今日まで、ＣａＭＶシステムは、植物全
体に適用されたのみであり、ウィルス感染を引き起こす
。従って、ＣａＭＶベクターは、３つの重要なファクタ
ーによってその使用が限定されている。第１は宿主の範
囲であり、第２はＣａＭＶ　　ＤＮＡ中に含まれる目的
とするＤＮＡ配列の大きざが制限されることであり、第
３はウィルスＤＮＡ全体を導入することによって疾患が
引き起こされるということである。Ｃａ　Ｍ　Ｖベクタ
ーシステムを適用することによって疾患が引き起こされ
るため、植物を形質転換せしめて、除草剤耐性あるいは
仙の要素に対重−る耐性を向上せしめる、あるいは蛋白
合成、収ｇ量等を促進せしめるという用途に、Ｃａ　Ｉ
ｖｌ　Ｖベクターシステムを使用することが困難であっ
た。
更に植物全体が感染されるために、Ｃａ〜ＩＶＤＮＡは
、感染、複製、植物全体に亘る動き、及び感染したウィ
ルス粒子を包む動きのために必要なウィルスの機能を保
持しなければならない。従って、ＣａＭＶ　　ＤＮＡベ
クターに含まれる目的とするＤＮＡ配列の最大の大ぎさ
は、小さなペプチドをコードするに必要なりＮＡ、２４
０ｂｐに限られていた。更にＣａＭＶベクターシステム
の場合には、導入された外来ＤＮＡは、種子に伝達され
ないという制限がある。
最近、目的とする（ずなわら外来の）ＤＮＡ配列を、宿
主に導入する新しい技術が開発された。
この技術はエレクトロポレーション （ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　）と云われるもの
である。しかしながら、この技術により、ＤＮＡが宿主
に導入される頻度が低く、植物ではプ０１へブラストに
のみ実施可能であり、それ故、プロトプラストから植物
全体が再生されることが不可能な植物工学に、実際的に
は、この技術は適用できない。
それ故に、小さい及び大きい（すなわち２５０ｂｐ以上
の）外来ＤＮＡ配列あるいは遺伝子を含むことができ、
導入されたＤＮＡ配列の多くのコピーを産生ずることが
でき、かつ広範囲の宿主において機能を発揮し得る植物
ベクターシステムの１５ｉ１発が望まれている。
現在まで、ＲＮＡゲノムではなくＤＮＡを含む他の植物
ウィルスとしては、１つのグループのみが同定されてい
る。このグループはジエミニウイルスからなる。ジエミ
ニウイルスは、正２０面体により対構造を取る（エレク
トロン・ミクログラフによる）植物ウィルスである。あ
る種のジエミニウイルスは、２つの異なった環状１本鎖
（ＳＳ）ＤＮＡゲノムからなる。そのような２つのゲノ
ムあるいはバイナリー・ジエミニウイルスの例としては
、”Ａ”ＤＮＡ及び“Ｂ”ＤＮＡを持つ１ヘマト・ゴー
ルデン・モザイク・ウィルス（ＴＧＭＶ）、（ｌｌａｍ
ｉｌｔｏｎ、　１９８１．１９８２゜１９８３及び１９
８４）　：　（Ｓｔｅｉｎ　、　１９８３）　：及び（
Ｂｉｓａｒｏ、　１９８２　）　、及び’１”ＤＮＡ及
び’２”ＤＮＡを持つキャサバ・ラテン１〜・ウィル’
）、　（ＣＩ−Ｖ　）　　（５ｔａｎｌｅｙ及びＧａｙ
、１９８３）がある。メイズ・ストリーク・ウィルス（
ＩＶＩ　Ｓ　Ｖ　）は、環状１本鎖５ｓＤＮ八ゲノムを
持っていると考えられティる（Ｄａｎｓｏｎ、　１９８
４　）　。２つのゲノム（バイナリ−）ジエミニウイル
スは、白ハエによって伝達され、単一ゲノムジエニミウ
イルスはバッタによって伝達される。１つのグループと
して、ジエミニウイルスは、中子葉及び双子葉植物の両
者に感染し、それ故広範囲の宿主で機能を発揮し得る。
すべてのジエミニウイルス粒子は、環状５ｓＤＮ△を持
っている。感染した植物細胞においては、ジエミニウイ
ルスＤ　Ｎ　Ａ　配列は、ＳＳ及び２本鎖（ＣＩＳ）Ｄ
ＮＡとして、大部分が環状で検出される。、感染植物細
胞では、そのような配列は核中に、■ピゾームとして、
核中に２，３百のコピーの割合で存在する。それ故に、 ＡｇｒＯｂａＣｔｅｒｉＵｍのＴｉプラスミドから誘導
されるトランスファーＤＮＡ　＜Ｔ−ＤＮＡ）とは異っ
て、ジエミニウイルスＤＮＡＩＰ列は、植物細胞のクロ
モシームＤＮＡ中に組込まれず、１つの細胞につき数多
くのくすなわち５以上の）コピーを産生ずる。感染植物
においては、感染細胞から放出されたジエミニウイルス
粒子は、植物を通して、他の細胞に感染する。ＴＧＭＶ
のような２つのゲノムジエミニウイルスシステムでは、
感染、複製、及び植物全体を通しての動きのためには、
Ａ及びＢ−コンボーネンｌ〜の両者が必要であるとされ
ていた。バイナリージエミニウイルスの２つのＤＮＡゲ
ノムは、植物全体における完全なかつ体系的なバイナリ
ージエミニウイルスの感染のために、必要であるという
報告以外に、植物中でのあるいは他物細胞中でのジエミ
ニウイルスＤＮ、ＩＪＩの正確な様式あるいはそのため
に必要なものについては、明らかにされていない。
化学者はこれまで、ジエミニウイルスを用いて植物細胞
中でプラスミドとして機能するエピゾームＤＮＡ分子を
創製することを考えていた（　ＢＬＩＣｋ、１９８３）
。ここでプラスミドとは、宿主細胞中で、自律的に複製
し１ｑるエピゾームＤＮＡ分子として定義される。
ジエミニウイルスＤＮＡを、植物のベクターとして用い
るためには、ＤＮＡが植物中で自律的に複製し、植物中
で多くのコピーを産生じ、そこに外来ＤＮＡ配列あるい
は遺伝子を挿入することができ、自動的にそれ自身及び
挿入した遺伝子あるいはＤＮＡ配列を植物細胞中で膚製
し、好ましくは同定のための及び／又はベクターで形質
転換された植物の選択のためのマーカーを含み、そして
理想的には疾患を引ぎ起こさないということが必要であ
る。
上記のような方法で機能するようにジエミニウ＝　２３
− イルスゲツムを修正する方法について、これまで誰れも
報音していない。
核酸（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列（分子）ある
いは遺伝子に適用するときの″外来の（ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ）　”と云う言葉は、少なくともその１部が
、ジエミニウイルスゲノムに生来含まれていない核酸配
列をそれぞれ持つ核酸配列あるいは遺伝子を意味する。
蛋白に゛外来の （ｂｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）　”と云う言葉を適用す
るときには、それは、少なくともその１部が、ジエミニ
ウイルスゲノムによって生来コード化されていない蛋白
配列を含む蛋白を意味する。
〈発明の要約〉 本発明は、外来ＤＮＡ配列、及びコート蛋白をコードす
るジエミニウイルスＤＮＡセグメントであって植物細胞
中で植物プラスミドの自律的複製を可能にするセグメン
トを含む植物プラスミドを提供する。１つの好ましい態
様どして、コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤ
ＮＡセグメントは、バイナリ−（２つのゲノム）ジエミ
ニウイルスから選択され、外米ＤＮＡはジエミニワイル
スのコート蛋白遺伝子中に挿入される。
他の１つの態様として、植物細胞中でプラスミドＤＮＡ
を産生じ得る植物ベクターが提供される。
そのようなベクターは、外来ＤＮＡ配列、及びコート蛋
白をコードするジエミニウイルスＤＮＡセグメントであ
って植物細胞中でプラスミドＤＮＡの自律的複製を許容
するセグメントを含む。１つの好ましい態様として、外
来ＤＮＡ配列を含む第１のＤＮＡセグメント、及び植物
細胞中でプラスミドＤＮＡの自律的複製を可能にするコ
ート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＩ’ＪＡセグ
メントであって、イの中で、植物ベクターから植物プラ
スミドを放出ぜ［）める第２のＤＮＡセグメントに第１
のＤＮＡセグメントが接している、コート蛋白をコード
するジエミニウイルスＤＮＡセグメントを含む植物ベク
ターが提供される。
更に他の１つの態様として、本発明の植物プラスミド及
び植物ベクターを製造する方法、及びそのための組成物
が提供される。
更に他の１つの態様として、Ｍ物中て一目的とツる（す
なわち、外来の）ポリペプチドを製造する方法、及びそ
のための組成物が提供される。
更に伯の１つの態様として、目的とするポリペプチドを
多量に製造し得る形質転換されたＮ物を製造する方法、
及びそのための組成物が提供される。
〈発明の詳細な記述〉 本発明は、新規植物プラスミド及び植物ベクターを製造
するための、ジエミニウイルスＤＮＡ特に２つのゲノム
（バイナリ−）ジエミニウイルスＤＮＡを修正する方法
、及びそのための組成物を提供する。更に本発明は、安
定に形質転換された植物あるいは植物細胞中で、新規植
物プラスミドを産生ずる方法、及びそのための組成物を
提供する。加えて、本発明により製造された新規植物プ
ラスミドは、植物あるいは植物細胞中で外来ＤＮＡ配列
あるいは遺伝子を複製及び／又は発現せしめるための有
用な手段、を提供する。そのような外来ＤＮＡ配列とし
ては、内因性植物細胞ＤＮＡ配列あるいは遺伝子、外因
性で非シエミニウイルスのＤＮＡ配列あるいは遺伝子、
及び少なくともその１部としてジエミニウイルス・ゲノ
ムに生来含まれていないＤＮＡ配列を持つキメラＤＮＡ
配列あるいは遺伝子がある。これらの外米ＤＮＡ配列あ
るいは遺伝子は、植物をより有用なものたらしめる蛋白
（すなわち、除草剤耐性、病気耐性及び／又は収獲最に
関係したあるいはこれらを産み出す蛋白）の産生、植物
あるいは植物細胞から回収される有用な蛋白の産生、及
び植物並びに植物細胞を農業的医薬的により有用なもの
どする化合物あるいは物質の合成を引き起す蛋白の産生
、等に関係のあるものである。
本発明により多層に生産し得る目的とするポリペプチド
及び／又は有機化合物としては以下のものがある。すな
わち、ジギタリス、ビンブラスチン、ビンクリスチン、
植物成長因子、除草剤耐性因子、病気耐性因子、及び収
穫を高める他の化学物質等である。更に、外来ＤＮＡあ
るいは遺伝子の例としては、以下の如きものを産生ずる
ＤＮＡあるいは遺伝子がある。、ｔなわら、エノール・
ビルヘート・シキメー１〜・ホスフェ−ｉ−（ＥＰＳＰ
）シンターゼ、グルタチオン−３−１〜ランスフエラー
ゼ、フィトホルモン、フィ１〜アレキシン、リクニン、
ウィルス抗原（例えばコート蛋白）：プラスミノーゲン
・アクチベーター、哺乳動物成長ホルモン、インシュリ
ン様成長因子、心房ペプチドなどの医薬上重要なポリペ
プチド；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼの如き真核あるいは原
核細胞酵素等がある。
目的とする化学物質を産生するためのＤＮＡ配列あるい
は遺伝子が選択されると、次いでそれらＤＮＡ配列ある
いは遺伝子は、化学的及び／又は酵素的な慣用手段によ
って、本発明の植物ベクター中に挿入あるいは連結され
る。
２つのゲノムジエミニウイルスのいくつかのコート蛋白
のアミノ酸組成及び配列と同様に、２つのグノムジエミ
ニウイルスのいくつかの完全なりＮＡ配列が知られてい
る（ｓｔａｎｌｅｙ及びＧａｙ。
１９８３　）　：　＜Ｈｕｌｌｉｎｅａｕｘ、　Ｐ、　
Ｈ，ら、１９８４）；　（ｌｌａｍｉｌｔｏｎ、　Ｗ、
　Ｄ、　Ｏ，ら、１９８４）；及び（Ｈｏｗａｒｔｈ、
　Ｒ，ら、１９８５）。これらの配列は、リファレンス
として引用する。バイナリージエミニウイルスの２つの
ゲノムＤＮＡの１つが、コー１−１白をコードするＤＮ
Ａ配列（すなわち、コート蛋白遺伝子）を含むことが明
らかにされた（　Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、１９８５）。”
コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤ　Ｎ　Ａ　
”あるいはバコード蛋白をコードするＤ　Ｎ　Ａ　”と
云う言葉は、特にことわりのない限り、ジエミニウイル
スのコート蛋白遺伝子を有する一つのゲノムジエミニウ
イルスＤＮＡおよびバイナリ−（二つのゲノム）ジエミ
ニウイルスのＤＮＡ分子を意味する。このようなコート
蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮＡとしては、例
えばウイート・ドウオルノ・ウィルス（ＷＤＶ）のゲノ
ム、メイズ・ス１〜リーク・ウィルス（ＭＳＶ）のゲノ
ム、ビート・キュリー・トップ・ウィルス（ＢＣＴＶ）
　、ビーン・ゴールデン・モザイク・ウィルス（Ｂ　Ｇ
　Ｍ　Ｖ　）の”　ｉ　”−コンポーネント、キャラサ
バ・ラテント・ウィルス（ＣＬＶ）の１１１　＋＋−コ
ンポーネント、トマト・ゴールデン・モザイク・ウィル
ス（ＴＧＭＶ）の゛′Ａ″−コンポーネン１〜等が挙げ
られる。
以下の例で詳細に説明されるように、バーｒナリージエ
ミニウイルスのＤＮＡ分子の一つが、植物細胞及び安定
に形質転換されたくすなわち、遺伝子的に転換された）
植物中で、自律的複製できることが見出された。特に、
植物細胞中で及び／又は第２（すなわち、コート蛋白を
コードしない）のゲノムＤＮＡ分子が存在しない形質転
換された植物中で、２つのゲノムジエミニウイルスのコ
ート蛋白をコードするＤＮＡが複製（ずなわち、５ＳＤ
Ｎ△及びｄｓＤＮＡの両者を産生ずる）することが見出
された。更には、バイナリージエミニウイルスの自律的
複製する、コート蛋白をコードするＤＮＡを持つ、形質
転換されたくすなわち、遺伝的に転換された）植物は、
それによって疾患を起こさないことが見出された。これ
らの発見は、＝　３０− ２つのグノムシエミニウイルスのコートＩ　Ｅｌをコー
ドするＤＮＡが、植物中の外来ＤＮＡあるいは遺伝子の
複製及び／又は発現を可能にする植物ベクターとして使
用できることを示唆するものであり、その意義は極めて
大きい。加えて、これらの発見は、バイナリージエミニ
ウイルスのコート蛋白をコードするＤＮＡが、植物中で
、病気のような好ましくない副作用を引き起こすことな
く、目的とする化学物質をコードする外来ＤＮＡを、効
果的に複製し発現せしめるために、使用し得ることを示
唆している。
実際に、以下に詳述する如く、本発明により、植物細胞
中で外来ＤＮＡの複製及び発現を可能にする方法及びそ
のための組成物が１７供される。更には、ここに記述す
る方法及び組成物を使用することによって、外来ＤＮＡ
配列を含む植物プラスミドＤＮＡは、植物細胞中で産生
されそれによって植物あるいは植物細胞中での目的とす
るポリペプチド合成を促進せしめることが可能であると
いうことが明らかになった。ここで″“促進″されたポ
リペプチドの合成とは、目的とするポリペプチドを直接
コードする及び／又は目的とする化学物質あるいはポリ
ペプチドの合成を誘導するポリペプチドをコードする特
定の遺伝子の内因性のコピー数よりも、多くのコピー数
を産生ずることを意味する。
ＴＧＭＶが、本発明の詳細な例として、用いられている
が、当業者によれば、本発明の方法及び組成物は、ど−
ン・ゴールデン・モザイク・ウィルス（ＢＧＭＶ）、マ
ングビーン・イエロウ・モザイク・ウィルス（ＭＹＭＶ
）、及びキラサバ・ラテント・ウィルス（ＣＬ　Ｖ　）
　　（Ｆｒａｎｃｋｉ　ら、１９８５　：５ｔａｎｌｅ
ｙ　、　１９８５）等のいずれのバイナリー・ジエミニ
ウイルスにも適用することができる。
約２００〜２５０のヌクレオチドのＤＮＡ配列が、バイ
ナリー・ジエミニウイルスのＡ及びＢ−（あるいは１及
び２−）ＤＮＡに共通している。
以後この配列を′″共通領域゛′と云う。更に、１つの
及び２つのゲノムジエミニウイルスＤＮＡについて、比
較分析した結果、約９個のヌクレオチドの長さの高度に
保持された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　）　Ｄ　Ｎ　Ａ配列
が、すべてのジエミニウイルスグノムに存在することが
わかった（）ｌａｃｄｏｗｅｌｌ　、１９８５　）。
この高度に保持された配列はバイナリージエミニウイル
スの共通領域、及び単一コンボーネンｌ〜ジエミニウイ
ルスの遺伝子間（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ）領域に位置し
、そしてこのいずれの場合でも、その１部はステム・ア
ンド・ループ構造を有することが、ジエミニウイルスＤ
ＮＡの構造分析により、提案される。本出願人は、その
メカニズムに拘束されたくないが、ステム・アンド・ル
ープ構造及び／又は５　’　−ＴＡＡＴＡＴＴＡ（＞３
　’からなる高度に保持されたＤＮＡ配列が、ジエミニ
ウイルスＤＮＡの複製に必須であると考えられる。それ
故、単一あるいは２つのグノムジエミニウイルスＤＮＡ
のいずれからのものであっても、好ましいジエミニウイ
ルス植物ベクターは、高度に保持されたＤＮＡ配列、及
び／又はステム・アンド・ループ構造とそのまわりの種
々のヌクレオチドを持　３３　一 つＤＮＡ配列を含む。
後に詳細に説明するように、目的とする外来ＤＮＡ配列
を含むジエミニウイルスベクターの構築は、第１に、ベ
クターを植物あるいは植物細胞に導入するために選択す
る方法によって決定される。
今日までに、ＤＮＡ配列を植物に導入する方法がいくつ
かある。これらの方法としては、以下のものがある。す
なわち、ウィルス全体の感染、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　Ｔ　ｉプラスミド・システム、すりへらされたあ
るいはカットされた植物表面へのフリーＤＮＡの適用；
例えばポリエチレングリコール、カルシウムホスフェー
ト、ボリームーオルニチン、ミクロ−インジェクション
、エレクトロポレーション等による植物プロトプラスト
へのフリーＤＮＡの導入などである（　ｒｒｅｃｍａｎ
ら、１９８４、Ｆｒ０１ｍら、１９８５及びＧｒｉｅｓ
ｂａｃｈ　１９８３）。Ｔｉプラスミド・システムとし
ては、コインテグレイト（ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅ　）
及びバイナリ−ベクターシステムがあることは、当業者
にとっては、理解されよう。
本発明により、各種の導入システムに適用しうる植物ベ
クターを得るために必要なジエミニウイルスＤＮＡ、特
にバイナリージエミニウイルスの構成及びコンポーネン
トが明らかにされた。特にフリーのＤＮＡを用いた、Ｄ
ＮＡ配列の植物への導入用には、外来ＤＮＡ配列及び植
物細胞中でプラスミドＤＮＡの自律的複製を可能にする
、コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮＡから
なるベクターが好ましい。Ｔｉプラスミドシステム用に
は、八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ　Ｔ　−ＤＮＡ　：外来ＤＮＡ配列及び植物細胞
中でプラスミドＤＮＡの自律的複製を可能にするコート
蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮＡを含む第１の
セグメント：及びベクターあるいは植物染色体ＤＮＡか
ら植物プラスミドの放出を可能にし且つその中で第１の
ＤＮＡセグメントと接している第２のＤＮＡセグメント
を含むベクターが好ましい。
いずれのベクターにおいても、外来ＤＮＡ配列は、ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列及び／又は目的とする
（ヒ学物質あるいはポリペプチドの合成を誘導するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。
植物中でのコート蛋白をコードするＤＮＡの独立した複
製 後の例で詳述するように、ＴＧＭＶのコート蛋白をコー
ドするＤＮＡ配列を有するＴＧＭＶｆ７）Ａ−ＤＮＡ（
コンポーネント）（第１図）は、ＴＧＭＶ−８の非存在
下に、植物中で複製できることが最初に見出された。加
えて、疾患を引き起こずことなく、植物中での該複製が
起こることが見出された。しかして、疾患を引き起こす
ことなく、植物中でのそれ自身の複製と、多くのコピー
を産生ずるために必要なすべてのＤＮＡ配列の情報を、
ＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡは含んでいる。以後、”　Ｔ　
Ｇ　Ｍ　Ｖ−Δ　Ｄ　Ｎ　Ａ　”と″″ＴＧＭＶ−ＡＴ
ＧＭＶ−Ａコンポーネント″同義に使用し、いずれも第
１図に示されるＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡを云う。同様に
”ＴＧＭＶ−Ｂ　　ＤＮＡ”と”　Ｔ　Ｇ　ｌｖｌ　Ｖ
　−Ｂ　　コンポーネント″という言葉も−３６＝ 同義に使用し、いずれも第１図に示されるＴＧＭｖ−Ｂ
　ＤＮＡを云う。
本発明の１つの態様として、ＴＧＭＶ　　ＤＮＡは、植
物細胞の染色体に挿入されあるいはされないより大きな
中間体Ｔｉプラスミドによって、植物細胞に導入される
。ＴＧＭＶ−Ａ及び−Ｂコンポーネントはそれぞれ別個
に別のＴｉベクターに挿入され、キメラＴｉベクターを
生ずる。特に、ＴＧＭＶ−Ａ及び−Ｂ　　ＤＮＡはそれ
ぞれ別個に、無毒化された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）　Ｔ　
ｉプラスミドのトランスファーＤＭＡ　（Ｔ−ＤＮＡ）
領域に、Ｔ　Ｇ　Ｍ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　ＡがＴ　Ｇ　Ｍ　
Ｖ共通領域と接するようにあるいは第２のＴＧＭＶゲノ
ムと縦に並ぶように、挿入される。ここで接する″とは
、ＤＮＡ配列（例えばＴＧＭＶ共通領域）があるＤＮＡ
配列あるいはセグメントの両末端と隣接していることを
意味している。これらのキメラベクターは、その後、植
物細胞を形質転換するために用いられる。ここでパ形質
転換″とは、宿主細胞のゲノムにＤＮＡ配列を導入及び
／又は受は入れる手段を意味するところの１〜ランスフ
エクシヨン、感染、トランスダクション等を含むものと
理解されるべきである。
本発明の好ましい１つの態様として、ＴＧＭＶ−Ａ　　
ＤＮＡは、Ｉ）ＡＴ１５３のＥｃｏＲＩ部位に、２，５
８８ｂｐ　ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｈａｍｉｌｔｏｎ
、ら１９８４）として挿入され、ｐＢ　Ｈ４０４（Ｂ１
５ａｒａら、１９８２　）　カ得うレル（第２図Ａ）。
形質転換された植物の染色体で産生されたコピーからの
ＴＧＭＶ−ＡＩ伝公子発現能ヲ調ヘルタメニ、ｐＢＨ４
０４ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して、２．６ｋｂのＥｃ
ｏＲＩフラグメントを精製し、ＥＣＯＲＴで消化したｐ
ＭＯＮ２００ＤＮＡ　（Ｆｒａｌｅｙら、１９８５及び
Ｒｏｇｅｒｓら、１９８５）と混合し、次いでＤＮＡリ
ガーゼで処理して、ｐＭＯＮ３０５と命令されるキメラ
Ｔｉプラスミドを得た（第２図２△）。
１）ＭＯＮ２００＜よ、ｐＴｉ　Ｂ６Ｓ３−３Ｅの如き
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔｉプラスミドに組み込
んで、機能的で無毒化したＴ−ＤＮＡを持つＴｉプラス
＝　３８　＝ ミドに構成することができる中間体ベクターである。ｐ
”ｒ　ｉ　Ｂ６Ｓ３−８Ｅプラスミドを持つ八ｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　　Ｇ
　Ｖ　３　１　１　１　−８Ｅ株は、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（ロックビ
ルＭ　Ｄ　）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号５３００２
が与えられた。かくしてｐＭＯＮ　２００は、′コイン
テグレイトへｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔ　ｉプラス
ミドデリバリ−システムの１例を示すものである。後に
詳述する如く、他のバイナリ−・デリバリ−・システム
も使用できる。第２図に示されるように、バクテリア中
での選択マーカーとして有用なスペクチノマイシン耐性
遺伝子（ＳｐＣ１′ｌ）及び植物細胞中での選択マーカ
ーとして有用なキメラカナマイシン耐性（ＮＯ３−ＮＰ
Ｔ　ＩＩ　’−ＮＯ８）３ｆｆ伝子を、ｐＭＯＮ２００
は持ツ＜ｒｒａｔｅＶら、１９８５及びＲｏｇｅｒｓら
１９８５）。当業者にとって知られた他の選択マーカー
を用いることもできる。
ＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡを持つｐＭＯＮ２００を含むコ
インテグレイト・プラスミドは、次いでＡｇｒｏｔｒａ
ｃｔｅｒｉｕｍと一緒になり、コインテグレイト・プラ
スミドを持つＡ（ｌｒＯｂａｃｔｅｒｉｌＪｍが、憤用
手段によって植物細胞中にＴ　Ｇ　Ｍ　Ｖ　−Ａ　　Ｄ
　Ｎ　Ａを導入するために使われる。得られたプラスミ
ドの１つであるｐＭ　ＯＮ　３０５は、Ｄ　ｆｖｌ　Ｏ
Ｎ　２００の［：ｃｏＲ■部位に、ＴＧＭＶ−Ａ　　Ｅ
ｃｏＲｒフラグメントの２つのコピーが続いて並んだ構
成を有するＤＭＯＮ２ＱＯから構成される。ｐＭｌ０Ｎ
３０５を持つＬ　並旦　ＭＭ２９４株はＡＴＣＣに寄託
され、ＡＴＣＣ受託番号５３３０．４が与えラレタ。同
１　ニＬ／　Ｔ、Ｔ　Ｇ　ＩＶＩ　Ｖ　−Ｂ　　Ｄ　Ｎ
　Ａ　ハ、ｐＡＴ１５３のＣ１ａ　１部位に、２５０８
　ｂｐＣ１ａＩフラグメントとして挿入され、Ｉ）　Ｂ
　Ｉ−１６０２（Ｂ１５ａｒｏら、１９８２）が得られ
た。ｐＢＨ６０２のＤＮＡをＣ１ａ　　Ｉで切断し、２
，５ｋｂ７ラグメントを精製し、Ｃｊ！ａｌで開裂した
ｐ　Ｍ　ＯＮ　２００のＤＮＡと連結せしめた。得られ
たプラスミドの１つは、ＴＧＭＶ−Ｂ ＤＮＡＣ１ａＩフラグメントの３つのコピーを並んで持
っており、Ｉ）ＭＯＮ３０８と命名した（第２図Ｂ）。
他の１つのプラスミドは、ＴＧ〜ＩＶ−Ｂ　　ＤＮＡ　
　Ｃ１ａ　　Ｉフラグメントの４つのコピーを並んで、
しかしｐＭＯＮ３０８とは逆方向に持っており、ｐＩＶ
Ｉ　ＯＮ　３０９と命名した（第２図Ｂ）。
ｐＭＯＮ３０５，３０８及び３０９プラスミドは、個々
に別々のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ；ｕｍ　　ｔｕｍｅｌ’
ａｃｉｅｎｓＧＶ３１１１−８Ｅ［胞に、Ｆｒａｌｅｙ
ら（１９８３゜１９８５）によって記載されたトリーパ
レンタルナイテイング（ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌ　ｎ
ａｔｉｎり〉法を用いて導入した。無毒化されて、内在
するｐＴｉＢ６８３−３Ｅプラスミドに統合されたｐｔ
ｖｌ　ＯＮ　３０５．３０８及び３０９プラスミドを持
つＡ（］ｒＯｂａＣｔｅｒｉｔ１ｍ株は、それぞれ、別
に、リーフ・ディスク・トランスフォーメーション法（
Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５）に用いられ、形質転換され
て、再生されたペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ　）　　（
Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａ　）及びツバ−１（Ｎ１
ｃｏｔｉａｎａ　ｂｃｎｔｈａｍｉａｎａ植物を得た。
この植物は、以前に記載された（Ｉｌｏｒｓｃｈら、１
９８５）ようにして、功ナマイシンの存在下に再生され
、ｐＭＯＮ２００誘導体を持つ植物に期待されるツバリ
ン（ｎｏｐａｌ　１ｎｅ）を産生じた。ＴＧＭＶ−への
２つのコピーあるいはＴ　Ｇ　Ｍ　Ｖ−Ｂ　　Ｄ　Ｎ　
Ａ　（Ｄ　３　ツ（７１ルイＬ、ｔ　４　ツ（７）　ｍ
ｌ　ヒーを有するＤＮＡを持つこれらの植物は、形態学
上は、正常であった。
形質転換された植物中のＴＧ〜！Ｖ−Ａ及び−Ｂ−ＤＮ
Ａの構造は、サザンハイプリダイゼーション（５ｏｕｔ
ｈｅｒｎ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｌｊｏｎ）分析（ＴｈＯ
ｍａＳｈＯＷら、１９８０）により決定した。後の例で
詳述するように、全ＤＮＡは、形質転換されたペチュニ
ア又は感染したタバコの葉から得、Ｔ　Ｇ　Ｍ　Ｖ　−
Ａ又はＴＧ〜ＩＶ−Ｂ　　ＤＮＡを切断しない１−１ｉ
ｎｄｌＩＩで開裂した後、アガロースゲルで分離した。
１−（ｉｎｄｌＩＩによる消化は、アガロースゲル中に
ＤＮＡが入れるように全ＤＮＡの大きさを小さくするた
めに行った。それ故に、△又はＢ−ＤＮＡを切断してよ
いものであれば、いずれの制限酵素でも使用できる。
ＤＮＡ分離のため、２回アガロースゲル分離を行った。
得られたＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移し、
それぞれのフィルターは、別々にラジオアイソ１〜−プ
でラベル化したＴＧＭＶ−Ａクローン化ＤＮＡ（ｔ）Ｍ
ＯＮ３４．９、第３図）あるいはＴＧＭｖ−Ｂクローン
化ＤＮＡ　（１）ＭＯＮ３５０Ｘ第３図）とともにイン
キュベートした。
ｐＭＯＮ３４９及びｐＭＯＮ３５０プラスミドの構築は
、第３図に示されている。各種のＴ　Ｇ　ＭＶＤＮＡの
ためのポジティブ・コン１〜ロールとして、ＴＧＭＶウ
ィルス感染Ｎ、　　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物（７）
　ｒＫから得た全ＤＮＡをゲルで分離した。ネガティブ
・コントロールとして、未処理ペヂュニア植物の葉の全
ＤＮＡをゲルで分離した。
ポジイティブ・コントロールＴＧＭＶウィルス感染Ｎ、
　　ｂｅｎｊｈａｍｉａｎａ植物では、Ｔ　Ｇ　ｌｖｌ
　Ｖ　−Ａ及びＴ　Ｇ　ｌｖｌ　Ｖ　−Ｂの両者の特異
的なラベル化ＤＮＡは、葉の全ＤＮＡとハイブリダイズ
し、これによりウィルスＤＮＡ　（ｓｓ環状）に期待さ
れる３つの大きな分子内の形態（ｔｌａｍ　ｉ　ｌ　ｔ
ｏｎら、１９８２）及び細胞内の複製形態（２本鎖開環
状及び閉環状）の存在が示される。Ｔ　Ｇ　ｌｖｌ　Ｖ
−Ａの縦列コピーを含むｐ〜１ＯＮ３０５を持つ植物の
葉から調製される全ＤＮＡは、ウィルス感染植物と同じ
形態を示すことが判った。これらの形態はＴＧＭＶ−Ａ
配列のみを含み、ＴＧＭＶ−８配列は含まなかった。
ｔ）ＭＯＮ３０８を保持する植物から調製される葉のＤ
ＮＡは、いずれのフリーＤＮＡの形態を持たなかった。
クローン化Ｔ　Ｇ　ＭＶ−△あるいはクローン化ＴＧＭ
Ｖ−Ｂと、非感染植物から得られる葉の全ＤＮＡとは、
ハイブリダイゼーションを起こさなかった。
これらの結果から次のことが証明される。７Ｊ’なわち
、Ｔ　Ｇ　Ｍ　Ｖ　−Ａ　　Ｄ　Ｎ　Ａ　ハ、Ｔ　Ｇ　
Ｍ　Ｖ　−ＡＤＮΔの植物での複製及び増幅に必要なす
べての機能を有しており、更にＴＧ〜１ｖ−八　ＤＮＡ
は、染色体あるいはＴ−Ｄ　Ｎ　Ａにそれが組み込まれ
た場所に無関係に、１本鎖（ＳＳ）環状ＤＮＡを産生す
ることができるのに必要なすべての機能を有している。
これらＴ　Ｇ　ＭＶ　−Ａ　　ｓ　ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａは、
ＴＧＭＶ−△　ＤＮＡの複製の結果どしてのみ生じる。
丁Ｇ　Ｍ　Ｖ−△　ＤＮＡ、あるいは２つのゲノム（バ
イナリ−）ジエミニウイルスのコート蛋白をコードする
ＤＮＡは、コート蛋白をコードすることを可能ならしめ
ないＤＮＡ配列の非存在下に、植物あるいは植物細胞中
で複製する能力を有していることが判った。更には、Ｔ
ＧＭｖ−Ａコンポーネントのみに感染された植物は、ウ
ィルス感染のいかなる症状（例えば疾患）も示さない。
ＴＧＭＶ−Ａコンポーネントの２つ以下の完全な縦列コ
ピーを有する各種のコインテグレイト（ｃｏｉｎｔｅｇ
ｒａｔｅ　）　Ｔｉプラスミドを用いた研究の結果、コ
インケグレイトＴｉプラスミドで形質転換された植物組
織から再生した植物は、同様に自由に複製するＴＧＭＶ
−Ａ　ＤＮＡを右することが判った。これらの結果から
次のことが判る。すなわち、例えばＴ　Ｇ’　Ｍ　Ｖ−
Δ　ＤＮＡなどの、コート蛋白をコードするジエミニウ
イルスＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡは、植物ベクター
ＤＮＡ及び／又は植物染色体ＤＮＡから植物細胞中で製
造されることが判った。この場合、植物ベクター及び／
又は植物染色体からプラスミドＤＮＡを放出せしめる（
例えば、組み換え及び／又は複製により）重複重複（ｄ
ｉｒｅｃｔｌｙ　ｒｅａｐ目ｎａ　）セグメントに直接
結合した、コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤ
ＮＡを含むコインテグレイト及び／又はコインテグレイ
ト（例えばバイナリ−）植物ベクター造成物を用いるこ
とによって、上記プラスミドＤＮＡの製造が行なわれる
。
コート蛋白をコードするＤＮＡに結合した重複ＤＮＡセ
グメントの好ましい長さあるいは重複の程度は、ここに
記載した方法及び組成物から、当業者は容易に判断でき
よう。かかる重複ＤＮＡ配列は、ぞの長さは、約５０−
６００６ｐが適当であり、好ましくは約２５０−６００
１）Ｄ、更に好ましくは約６００　ｂｐである。好まし
い態様においては、重複ＤＮＡ配列にお１プる重複の割
合は、特に短かい長さの場合、約１００である。更に、
植物ベクター及び／又は植物染色体からプラスミドＤＮ
Ａの放出を可能ならしめる重複ＤＮＡ配列は、ジエミニ
ウイルスＤＮＡ　（例えば第３１図参照）から誘導され
る。あるい１ま外来Ｄ　Ｎ　Ａ配列からｈｌ成すること
もできる。
以下に更に詳細に述べるように、植物細胞中で自律的に
プラスミドＤＮＡが復製するためには、ツー１〜蛋白を
コードするジエミニウイルスＤＮＡの１つのセグメント
のみが必要であることが判った。特に、ジエミニウイル
スコー１〜蛋白をコードするＤＮＡ配列は、コート蛋白
をコードするジエミニウイルスＤ　Ｎ　Ａの植物細胞中
での自律的複製には必須ではないことが判かった。しか
して、コート蛋白をコードする配列を欠失したあるいは
ツー１〜蛋白をコードする配列が肚１された、ジエミニ
ウイルスのコー１へ蛋白をコードする配列であっても、
植物細胞中での複製は可能であるが、昆虫ベクターによ
るウィルスＤＮＡの更なる伝達が阻止されるため、ウィ
ルス全体は製造されない。更には、自律的な複製に必要
とされない、コート蛋白をコードで“るＤＮＡの部分あ
るいは付加的な配列は、慣用的な突然変￥２手法及び／
又はここで記述する欠失実験によって決定された。
　４７　一 本発明によれは、第３１図に植物プラスミドの形成が示
されており、そこには、ｐ　ｌＩ、１ＯＮ３８２で表わ
され、Ｔｉプラスミドデリバリ−システム用に構成され
た本発明の植物ベクターから得られる、ｐＭＯＮ３８２
植物プラスミドが示されている。第３１図には、植物ベ
クターが染色体中に組み込まれた中間体を形成し、それ
から最終的に植物プラスミドが得られることを示してい
るが、植物プラスミドは、植物ベクターより直接得る（
例えば組み換え及び／又は複製により）こともできる。
このように、第３１図に示した植物ベクターは、Ｔｉプ
ラスミドデリバリ−システムでは好ましくは使用される
が、ベクターは、他に、慣用的なフリーＤＮＡデリバリ
−システムに用いることもできる。また、第３１図に例
示した如き植物ベクターは、Ｔ−ＤＮＡを削除し、残っ
た鎖状のあるいは再環状化したベクターフラグメントで
形質転換せしめることによって、フリーＤＮＡデリバリ
−システム用に修正することもできる。更に、以下に詳
細に記述するように、慣用的なフリーθＮＡデＪツバ１
ノーシステムに有用でｈｌつ植物プラスミドＤＮＡの形
成を可能にする植物ベクターは、１つのＤＮＡ配列と、
植物細胞中でのプラスミドＤＮＡの自律的な複製を可能
にする、コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
Ａのセグメントを含んでいればよい。
ジエミニウイルス複製の磯構と発現ベクターバイナリー
ジエミニウイルスのコート蛋白をコードするＤＮＡ、特
にＴＧＭＶ−Ａコンポーネントは、形質転換された植物
中で自律的に′＃製することができ、そしてこれらのＤ
ＮＡは、植物ゲノム中に組み込まれた状態で、ＤＮＡを
自律的に複製できることが照明された。そしてそのよう
なツー１〜蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮＡを
、Ｔｉ感染及び／又はフリーＤＮＡデリバリ−システム
に有用なベクターに修正することもできる。
いかなるベクターでもその第１特徴は、外来ＤＮＡ配列
の挿入部位を有し、そして該部位は、ベクターが宿主（
例えば植物）細胞中で外来ＤＮＡ配列を複製する能力を
妨げないでとである。
プラスミドベクターは、外来ＤＮＡ配列あるいは植物細
胞中で複製及び／又は発現すべき遺伝子の挿入用の制限
酵素部位を含んでいるのが好ましい。
そのような、制限酵素部位は、ジエミニウイルスＤＮＡ
に存在する部位から選択することもでき（第１図参照）
、また慣用的組み換ＤＮＡ法によって導入することもで
きる。あるいはまた、外来ＤＮＡは、ベクターに結合（
例えば化学的に）せしめることもできる。
存在する制限酵素部位の選択及び／又は変換、及び／又
は１つまたはそれ以上の部位の付加をする際の基準は、
そのような修正及び／又はそれに続く外来ＤＮＡ配列の
挿入が、ジエミニウイルスＤＮＡ　（例えばコート蛋白
をコードするＤＮＡ）が植物細胞中で自立的に複製する
能力を、耐えられない程に妨げないということである。
この基準は、例えば、修正されたジエミニウイルスＤ　
Ｎ　Ａで形質転換された植物あるいは植物について、ジ
１ミニウィルスの複製体（ＳＳ及び／又はｄｓ環状ＤＮ
Ａ）の存在を以下に示す方法によりアツセー　５〇　− イすることによって、確認することかできる。他の有用
な制限酵素部位の選択基準としては、これに限定されな
いが、例えば、挿入及び／又はそれに続く外来ＤＮＡ配
列の操ｆ’ｌＦを促進するような制限酵素部位が挙げら
れる。
本発明の好ましい１態様においては、存在する制限酵素
部位である、ＴＧＭＶのコート蛋白をコードするＤＮＡ
配列中にあるＳｃａ　　１部位〈第１図）を選択し、そ
れを変えることである。以下に］２１Ｓべるように、Ｔ
ＧＭＶ　　ＤＮＡの包被に必要なコート蛋白遺伝子は除
去しあるいはその作用を阻止することができる。このよ
うに、コート蛋白遺伝子は、ＴＧＭＶ　　Ａ　　ＤＮＡ
の植物におりる複製には必須の領域ではないことが判っ
た。この結果からまた、コート蛋白をコードするジエミ
ニウイルスＤＮＡ分子、例えばＴＧＭＶ−△　ＤＮＡの
完全なコピーは、ジエミニウイルスのコート蛋白をコー
ドするＤＮＡを含む植物プラスミド分子の植物中での創
製に必須できないことが示される。
コート蛋白遺伝子は、ジエミニウイルスーへＤＮＡの植
物中での複製には必要ではないことが証明され、従って
、ジエミニウイルス（例えば、ＴＧＭＶ）コート蛋白を
コードする全配列より短い及び／又は少なくともツー１
〜蛋白遺伝子と同じ長さの外来ＤＮＡを挿入することが
可能となった。
実際に、以下の実施例で示すように、ジエミニウイルス
のコート蛋白をコードするＤＮＡ配列を修正しく例えば
阻害及び／又は除去し）で、外来ＤＮＡ挿入部位を導入
し複製づることができる。
また、１つの態様どして、ＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡに挿
入される外来ＤＮＡ配列は、ＴＧＭＶのコート蛋白をコ
ードするＤＮＡ配列よりも長くすることができることが
示された。従って、制限酵素部位あるいはマルヂリン力
−を持つＤＮＡセグメントと同じぐらい小さい外来ＤＮ
Ａ、あるいは少むくとも、４．３ｋｂ（キロベース〉の
外来ＤＮＡを、本発明の植物ベクターを用いてプラスミ
ドＤＮＡとして植物細胞中で複製することができる。更
に、後］ホする実施例で示されるように、そのような外
来ＤＮＡ配列は、植物細胞中で発現することもでぎる。
１つの態様において、外来ＤＮＡ配列はＴ　Ｇ　Ｍ　Ｖ
−Δ　ＤＮＡのコート蛋白遺伝子中に挿入され、そして
植物の葉の細胞へのＤＮＡデリバリーシスデムとして八
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ　　ｔｕｍｆａｃｉｅｎｓの
中間体Ｔｉプラスミドベクターを用いて、外来ＤＮＡ配
列が植物中へ導入され、ＴＯＭＶ−ＡＤＮＡが一部自由
に（例えば自律的に）複製することが示された。後に詳
述するように、形質転換された植物細胞中で製造された
ジエミニウイルス植物プラスミドは、１）ＵＣｌ　８の
複製開始点を含んでおり、それによって植物プラスミド
ベクターが、植物及びＥ、　　ｃｏ月濃胞中で複製する
ことが可能となる。この特性によって、受容能力のある
Ｅ。
ｃｏｌｉの形質転換により放出される２本鎖環状ＤＮＡ
を取り出すことができる。１つ以上の宿主（例えば植物
細胞及びバクテリア）で複製できるプラスミドを、“シ
ャトルベクター″と云い、これは、１つの宿主（例えば
植物細胞）から他の宿主（例えばバクテリア）へベクタ
ーを移ずことかできまた仙の宿主で慣用的な遺伝子組み
換え操作を行うこともできる。
１つの好ましい態様においては、ジエミニウイルスベク
ター創製の出発点は、ｐＭＯＮ５０５である（第４図）
。ｐＭＯＮ５０５は、バイナリ−Ｔｉベクターの１例で
ある。他のジエミニウイルスベクターは、他のバイナリ
−Ｔｉベクター、あルイハｐＭＯＮ　２００．　ｐＭＯ
Ｎ　１２０　（Ｆｒａｌｅｙら、１９８３）のようなコ
インテグレイトＴ＋ベクターを用いて構築することがで
きる。プラスミドＤＮＡとして、Ｔ１ベクターｐＭＯＮ
５０５を有するＥ、匹旦　ＭＭ２９４株はＡＴＣＣへ寄
託され、ＡＴＣＣ受託番号５３３０１が与えられた。
ｐＭＯＮ５０５プラスミドは、ｐＭＯＮ２００（Ｆｒａ
ｌｅｙら、１９８５）の誘導体である゛′バイナリーベ
クター”　　（Ｈｏｅｋｅｍａら、１９８３　：　Ｂｅ
ｖａｎ　。
１９８４）であり、ＡＧｒＯｂａＣｔｅｒｉＵｍに内在
するＴ１プラスミドと相同のＤＮＡセグメント（ＬＩＨ
）が、ＲＫ２広範囲宿主プラスミドの３．８ｋｂセグメ
ント（ＲＫ２レプリコーン、第４図）で置換されている
。この置換の結果、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞内
で複製することができ、Ｔｉベクターと内在するＴｉプ
ラスミドどの間での組み換えの必要性が取り除かれたＴ
ｉプラスミドに基づくベクターが得られる。第４図に示
されるように、相同領域の１部は、Ｎｄｅ　　Ｉでの部
分消化と再すゲーションによってｐＭＯＮ２００から除
かれている。次いで、３，８ｋｂのＲＫ２ＤＮＡフラグ
メント（ＲＫ２レプリコーン）が、１−１ｉｎｄＩＩＩ
及びＳｍａ　　Ｔでの開裂の後にｐＴ　Ｊ　Ｓ　７５　
（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ及びＨｅ１ｉｎｓｋｉ、　
　１９８５）から単離され、ｐＭＯＮ５０３の７．４ｋ
ｂのフラグメントに結合されて、ｐ　Ｉｖｌ　ＯＮ　５
０５が製造される。ｐＭＯＮ５０５（第４図）は、ｐＢ
Ｒ３２２の複製開始点：　ＲＫ　２複製開始点；接合伝
達Ｕ）１始点：ＥｃｏＲＩ、　Ｃｊ！ａ　　３ＥｃｏＲ
Ｖ、　Ｘｂａ　　Ｉ、　ＢＱｊ！　　ＩＩ　、　Ｘｈｏ
　　Ｉ。
Ｓａｃ　　Ｉ及びｌ−１ｉｎｄｌＮで開裂する部位を右
する合成マルチリンカ−；植物細胞におけるカナマイシ
ン耐性のためのＮ０８−ＮＰＴ　ＩＩ　’　−ＭＯＳキ
メラ遺伝子；［、ｃｏｌｉ及び仁ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓでのｐＭＯＮ５０５プラスミドの選択のためのスペク
チノマイシン／ストレプトマイシン耐性マーカー遺伝子
（Ｓｐｃ　　／５ｔｒＲ）；ツバリンシンターゼ遺伝子
；及び■−のツバリン型Ｔ−ＤＮＡライトポーター（ｒ
ｉ（Ｊｈｔ　ｂｏｒｄｅｒ）配列（ＮＲＢ）を持ってい
る。
第５図に示されるように、容易に使用し得る制限酵素部
位をコート蛋白遺伝子中に導入するために、ｐＭＯＮ３
０５ＤＮＡ　（第２Ａ図）をＳＣａ　■で消化し、コー
ト蛋白をコードする遺伝子配列の７９１　ｂｐの位置で
ＴＧＭＶ−八　ＤＮＡを１回切断した。これにより、合
成ＨｔｎｄＩＩＩリンカ−（５’−ＣＡＡＧＣＴＴＧ、
ＮｅｗＥｎａｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ、　ＭＡ　）に結合した完全なＴＧＭＶ−Ａ　　Ｄ
ＮＡを含む２．６ｋｂの３ｃａ　　ｌフラグメントが放
出された。
１−１ｉｎｄＩ１１で演化後、２，６ｋｂのＨｉｎｄｌ
ＩＩの直鎖状フラグメントを、あらかじめ １−１ｉｎｄｌＩＩで切断したｐ　Ｕ　Ｃ１８（Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５　）　　（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　８ｉｏ１ａｂｓ。
Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ　Ａ　）に導入した。得られるプ
ラスミドはｐＭＯＮ３４４　（第５図）と命名した。次
いで２．６ｋｂのＴＧＭＶ−Ａのトｌ　ｉ　ｎｄ　　ｌ
ｌｌ７７グメントを、Ｈｉ　ｎｄ　　ｌｌＩｒ消化した
ｐＩＶＩ　ＯＮ　３４４から精製し、ｐＭＯＮ５０５の
ＨｉｎｄｌＩＩ部位に導入した。得られるバイナリ−ベ
クター、ｐＭＯＮ３４５は第６図に示した。
ｐＭＯＮ３４５バイナリ−ベクターは、ＮＰＴ　　ＩＩ
　’　−ＮＯＳカナマイシン耐性遺伝子の３′末端から
１４２ｂｐの位置に、非反復３ｔｕ　　ｒ部位を有して
いる。ｐＭＯＮ３４４は、ｐＵｃ１８合成マルチリンカ
−に非反復ｓｍａ　　Ｉ部位を有する。ｐＭＯ’Ｎ３４
４のＤＮＡは、ＳｍａＩで切断され、Ｓｔｕ　　Ｉで切
断されたｐＭＯＮ３４５ＤＮＡと混合され、ＤＮＡリガ
ーゼ処理される。
細胞を形質転換し、２つのＴＧＭＶ−Ａコンポーネント
が正しい配位で（例えば直接くり返り）組み込まれたプ
ラスミドをスクリーニングし、プラスミド３５２（第６
及び７図）を単離した。第７図に示したように、プラス
ミドｐＭＯＮ３５２は、次のＤＮＡセグメントを含むバ
イナリ−ベクターである。
ａ）゛バイナリー°′型のｐＭＯＮ５０５、すなわちＴ
ｉプラスミドに基づく植物形質転換ベクター（１）。
ｂ）コート蛋白コード配列の直鎖状の阻害配列としてク
ローン化されたＴ　Ｇ　Ｍ　Ｖ　−Ａ　　Ｄ　Ｎ　Ａの
１つのコピー（２）。
Ｃ）形質転換植物細胞の選択のための、キメラＮ０８−
ＮＰＴ　ＩＩ　’　−ＮＯ８カーｊ−マイシン耐性遺伝
子（３）。
ｄ）　　Ｅ、　　ｃｏ旦　ｔ）ＵＣｌ　８マルチコピー
プラスミドクローニングベクターの１つのコピー（４）
。
ｅ）　コート蛋白コード配列の直鎖状の阻害配列として
クローン化されたＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡの第２のコピ
ー（５）。このコピーは、最初のＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮ
Ａ挿入部位の重複配列である。
プラスミドｐＭＯＮ３５２は、植物中で複製及び／又は
外来ＤＮＡの発現に有用なジエミニウイルス植物ベクタ
ーの１つの例である。ｐ　！ｖｌ　ＯＮ　３５２型のジ
エミニウイルスベクターは、慣用的デリバリ−システム
によって植物に導入することができる。慣用的な技術に
よってｐＭＯＮ３５２ベクターに修正、変換が加えられ
て、植物あるいは植物細胞内で複製及び／又は外来ＤＮ
Ａの発現に有用な、同様のジエミニウイルスベクターを
創製することができる。このような廃正としては、例え
ば、弛のマーカー遺伝子の付加及び／又は置換；ｐｕｃ
ｉｓ配列の除去及び／又は宿主（例えばバクテリアある
いは酵母）によって決定される他のＤ　Ｎ　Ａ　ｌｉｄ
列ト（Ｄ　置ｍ　：　Ｔ　Ｇ　Ｍ　Ｖ−Ａ　　Ｄ　Ｎ　
Ａ　配列と、他の機能的に等価の、バイナリージエミニ
ウイルスのコート蛋白をコード化する配列との置換；ｐ
ＭＯＮ５０５ＤＮＡ配列の除去：及びｌ：）ＭＯＮ５０
５ＤＮＡ配列と、コインケグレイトＴｉベクターＤＮＡ
配列との置換などがある。、ｌ）ＭＯＮ３５２の好まし
い変換体を含むジエミニウイルスベクターとして、後に
詳述するｐＭＯＮ３８２がある。
１つの好ましい態様として、ｐＭＯＮ３５２は、ｌｉベ
クターデリバリ−システムを用いて植物細胞内へ導入さ
れる。特に、ｔ）ＭＯＮ３５２は、Ｆｒａｌｅｙら（１
９８３，１９８５）によって記載されたトリーバレンタ
ルメーティング（ｔｒ＋−ｐａｒｅｎｔａｌ　ｍａｔｉ
ｎ（］　）法によって、ｐＴ　ｉ　Ｂ６Ｓ３−８Ｅを含
むＡ（ｌｒｏｂａｃｔｅｒｉｌＪｍ　　ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｃｎｓ細胞にさ入される。得られるｐＭＯＮ３５２プ
ラスミドを保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞は、次イテ、葉ディスク法（
Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５）を用いて植物細胞内にｐＭ
ＯＮ３５２配列を導入するために用いる。ｐＭＯＮ３５
２は、他方、修正されないフリーＤＮＡ用の、あるいは
ＤＭＯＮ５０５ＤＮＡ配列が除去されたフリーＤＮＡ用
のジエミニウイルス植物プラスミドベクターとして用い
ることもできる。
植物細胞に導入されたｌ）ＭＯＮ３５２ＤＮＡは、宿主
細胞のゲノムに取り込まれ、宿主植物細胞の染色体内に
統合される。かくして、以前に述べた如く、コート蛋白
遺伝子が阻害されたＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡ及び／又は
コート蛋白遺伝子のＨｉｎｃｌＩＩＩ部位に、Ｎ０８−
ＮＰｌ−ＩＴ　’　−ＮＯ３ＤＮＡ及び１）ＵＣｌ　８
ＤＮＡを含む外来ＤＮＡ配列が挿入されたＴＧＭｖ−Ａ
　ＤＮＡからなるＴＧＭＶ−Ａ　ＤＮＡ体の自由な複製
が起こる。かかる複製は、染色体に統合されないｐＭＯ
Ｎ３５２　　ＤＮＡ分子に含まれるＴＧＭＶ−Ａ　　Ｄ
ＮＡとの間の組み換えを通して及び／又は染色体に統合
されたＴ　Ｇ　Ｍ　Ｖ　−Ａ　　Ｄ　Ｎ　Ａ配列と非統
合ＤＮＡとの間の組み換によって及び／又はまた統合Ｄ
ＮＡあるいはＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡの染色体内のコピ
ーの直接複製によって、起こる。
形質転換植物におけるＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡの自律的
あるいは独立した複製を証明する際に用いた分析手法に
より、ＴＧＭＶコート蛋白をコードするＤＮＡ配列が阻
害されたＴ　Ｇ　ｌｖｌ　Ｖ−八ＤＮＡは、同様に、形
質転換植物細胞（例えば葉ディスク組織）内で自由に（
例えば自イ４１的に）複製できることが判った。特に、
ｐＭＯＮ３５２の染色体内ＤＮＡあるいはプラスミドＤ
ＮＡは以下の手法により同定された。ずなわち、ｐ　Ｍ
　ＯＮ　３５２で形質転換された葉組織からＤＮＡを単
離し、アガロースゲル電気泳動により分Ｎ［シ、ニトロ
ごルロースに移し、放射標識したＴＧＭＶ−ＡＤＮＡあ
るいはＩ）ＵＣｌ　８に特異的なプローブとハイブリダ
イズし、次いでフィルターをＸ−線フイルムにきらずこ
とによって、同定した。カナマイシンを含む培地で形質
転換された葉ディスクの組織を選択できると云うことは
、ジエミニウイルスベクターが、植物細胞内でカナマイ
シン耐性遺伝子（例えばＮ０８−ＮＰＴ　ＩＩ　’　−
ＮＯ３）を発現することができるということを示してい
る。
また検出された５ｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡは、第８図に
示されたｌ）ＭＯＮ３５８の構造に対応する大きさく例
えば約７，０ｋｂ）であった。かくして、このような結
果から、コート蛋白遺伝子は、バイナリージエミニウイ
ルスのコート蛋白をコードするＤＮＡ　（例えばＴＧＭ
’ｌ−Ａ　　ＤＮＡ＞の自由な複製には必須ではないこ
とが判る。このような結果から更に、外来ＤＮＡは、ジ
エミニウイルスコート蛋白遺伝子内に挿入することがで
き、次いで、コート蛋白をコードするＤＮへジエミニウ
イルスの１つのセグメントを含むプラスミドＤ　Ｎ　Ａ
分子（例えば染色体外の）の部分を、植物芹■胞内で複
製し発現せしめることができることが判った。
更に、外来ＤＮＡは、ジエミニウイルスのコート蛋白遺
伝子よりも大きく（例えば塩基対数で）することができ
る。このように、本発明の１つの態様においては、植物
内で外来ＤＮＡの複製及び発現を可能にするベクターの
１つの例として、ｐＭ’０Ｎ３５２を挙げることができ
る。本発明の１つの態様においては、Ｔｉプラスミドに
基づくデリバリ−システムを用いているが、本発明のバ
イナリージエミニウイルスベクター、例えばｐＭＯＮ３
５２あるいはその変換体（すなわち、第８図のｐＭＯＮ
３５８）は、悄用的なフリーＤＮＡデリバリ−システム
に用いることもできる。
本発明の他の１つの態様においては、他のベクターが、
フリーＤＮＡデリバリ−システム用に４Ｍ成される。フ
リーＤＮＡデリバリ−システムによ　６３　一 つて、プラスミドＤＮＡ分子を直接、植物細胞のゲノム
に挿入することができる。このようなベクターは、植物
の懸濁細胞培養物を形質転換せしめ、外来ＤＮＡを経済
的に複製及び／又は発現するのに、特に有用である。
フリーＤＮＡデリバリ−システム用の、プラスミドＤＮ
Ａ分子からなるベクターは、典型的には、外来ＤＮＡ配
列、及び植物細胞内でプラスミドＤＮＡの自律的な複製
を可能にする、コート蛋白をコードするジエミニウイル
スＤＮＡのセグメントを含む。前記した如く、外来ＤＮ
Ａは、典型的には、形質転換された植物細胞内で複製し
発現されるべき目的ペプチドをコードする遺伝子、そし
て好ましくは、選択及び／又は形質転換細胞の同定のた
めのマーカーを含む。コート蛋白をコードするセグメン
トは、少なくとも、植物細胞内で複製するために必須の
ＤＮＡ配列を含む。かかるコート蛋白をコードするジエ
ミニウイルスＤＮＡセグメントの１つの例としては、ジ
エミニウイルスのコート蛋白をコードするＤＮＡ配列を
除去したコート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
Ａの全分子が挙げられる。また、本出願はその理論に拘
束されたくないが、ジエミニウイルスの共通領域が複製
開始点と考えられる。このように、共通領域は、コート
蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮＡのセグメント
に要求される１つのコンポーネントである。そしてかか
るジエミニウイルスＤＮＡは、植物細胞を直接形質転換
するために用いるプラスミドＤＮＡ分子内に、あるいは
植物細胞内でプラスミドＤＮＡを９１Ｗするベクターで
植物あるいは植物細胞を形質転換せしめた結果生ずるプ
ラスミドＤＮＡ分子内に、通常含まれている。
る。
本発明の好ましい態様においては、フリーＤＮＡデリバ
リ−システムに使用されるベクターは、以下のようにし
て構築される。第８図に示すように、ｐＭＯＮ３５２Ｄ
ＮＡはｌ−１ｔ）ａｉテ消化されて、ＴｉプラスミドＤ
ＮＡから誘導されるｐＭＯＮ５０５が除去され、ＤＮＡ
リガーゼにより再連結され、その後バクテリア宿主細胞
の形質転換に使用される。バクテリア宿主細胞の形質転
換後、１つのプラスミドが単離され、ｐ　Ｍ　ＯＮ　３
５８と命名された（第８図〉。
ｐ〜１ＯＮ３５８プラスミドは、その後、ポリエチレン
グリコール、リン酸カルシウム、ポリーＬ−オルニチン
（Ｍａｒｔｅｎら、１９７９；フリーマンら、１９８４
．）、ミイクロインジエクション（Ｇｒｉｅｓｂａｃｈ
　、　１９８３　）あるいはエレクトロポＬ、ｒ　−シ
Ｅ　ン（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５　；　Ｆｒｏｍ
ｍら、１９８５）の如き慣用手段を用いて、フリーＤＮ
Ａとして植物プロトプラストへ導入することができる。
形質転換された植物は、前記した如きＴＧＭＶ−Ａ　　
ＤＮＡあるいはｐＵｃｌ　８ＤＮＡに特異的なプローブ
を用いた方法により複製したｐＭＯＮ３５８ＤＮＡの存
在を分析することにより同定される。植物プロトプラス
ｌ−内で自律的に複製できないコントロールプラスミド
として、ｐＭＯＮ３５８の誘導体を作成した。特に、Ｔ
ＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡを放出する）ｌ　ｉ　ｎ　ｄ’　
ｌｌＩｒ、ｐＭＯＮ３５８のＤＮＡを消化し、ＤＮＡリ
ガーゼで処理し、次いでバクテリアの形質転換に用いた
。ＴＧＭＶ−Δ　ＤＮＡが除去されたこの誘導体を単離
し、ｔ）ＭＯＮ３６０（第８図）と命名した。
ｐＭＯＮ３５８あるいはｐ〜１ＯＮ３６０の精製したＤ
ＮＡは、次いで、ペチュニアあるいはキャロット（Ｄａ
ｕｃｕｓ　ｃａｒｏｔａ　）　懸濁細胞から誘導される
３Ｘ１０”のプロトプラストと混合され、高電圧がかけ
られる。処理されたプロトプラストは次いで生長培地に
希釈され、２５℃で４８−７２時間インキュベートされ
る。この時、ＤＮＡはプロトプラストから調製され、放
射標識されたプローブとして、ｐＭＯＮ３４９（第３図
）に特異的なＴＧＭＶ−ＡあるいはｐＵＣｌ　８ＤＮＡ
　（第５図）を用いたサザンブロット分析に付される。
形質転換されたプロトプラスト内でのｐＭＯＮ３５８の
複製ニヨリ、ＴＧＭＶ　　Ａ　　ＤＮＡを欠いたｐＭＯ
Ｎ３６０ではそうではないが、ＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡ
の複製に特徴的な１本鎖環状ＤＮＡが生じる。１本鎖環
状ＤＮＡは、ｐ　ｆｖｌ　ＯＮ　３５８　ｉ）　Ｎ　Ａ
に期待される大きさく約７ｋｌｌ）を持っている。
第８図に示したように、ｐＭＯＮ３５８植物プラスミド
は、ｐＵ　Ｃ１８Ｄ　Ｎ　Ａ配列を含んでいる。
この１）ＵＣＩ　８配列は、バクテリアの複製（例えば
レブリコーン）の開始点を含んでおり、それによって、
Ｅ、　　ｃｏｌｔ７の如きバクテリア宿主内でのｐＭＯ
Ｎ３５８の操作あるいはレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）が
可能である。すべてのシャトルベクターの場合と同様に
、ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ’ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
で活動可能な如き酵母の複製開始点を含むＤＮＡ配列を
、付加的にあるいは他の方法として、プラスミド及び／
又はベクター１）　Ｎ△に挿入することかでき、これに
よって、酵母細胞において更に操作あるいはレスキュー
（ｒｅｓｃｕｅ）が可能となる。
コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮＡが植物
内で外来ＤＮＡを複製するために用いることができるこ
とが証明され、従って、該ジエミニウイルスＤＮＡを用
いた新規植物発現ベクターが０１製される。本発明の新
規発現ベクターは、植物細胞あるいは植物中で目的とげ
る化学物質を製造するのに使用することができる。かく
して製造された目的物質は、次いで、アフイニテイクロ
マ１〜グラフィーの如き慣用的手法及び／又は製造部位
（例えば植物細胞あるいは植物組織）を決める慣用的手
法により回収することができる。
発現ベクターは、該発現ベクターにより形質転換された
宿主の同定あるいは選択のためのマーカーとともに、外
来ＤＮＡ配列の複製及び発現に必要なすべてのＤＮＡ配
列を含む必要がある。いくつかの例においては、外来Ｄ
ＮＡ配列によってコードされる目的物質自身が、形質転
換宿主の同定及び／又は選択用のマーカーとして機能で
きる場合がある。外来ＤＮＡ３Ｅ２伝子ににる生成物、
あるいは該生成物からその合成を誘導される化学物質あ
るいはポリペプチド以外に、形質転換選択用のマーカー
が必要な場合には、抗生物質耐性の如き慣用的マーカー
を用いることができる。
植物内で、外来ＤＮＡが発現するためには以下の要素が
必要であることが判る。すなわち、植物細胞内で活動で
きるプロモーター配列；プロモーター配列に直結しであ
るいはその内部に存する転写開始あるいはリーダー配列
（例えば、メツセンジャーＲＮＡの５′−非翻訳領域）
：翻訳開始シグナルコドンをコードするＤＮＡ配列：目
的物質（例えば外来の）をコードするＤＮＡ配列：翻訳
終止コドンをコードする少なくとも１つのＤＮＡトリプ
レット；及びポリアデニル化シグナルを含む３′−非翻
訳領域をコードするＤＮＡ配列である。
前記した通り、植物細胞内で活動できればいかなるプロ
モーターでも用いることができる。プロモーターは、Ｄ
ＮＡ配列の転写を可能にするＤＮＡ配列を意味するもの
と理解できる。かかるプロモーターとしては、例えば、
カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５８プロ
モーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモ
ーター、及びエントウ、ペチュニア、大豆、タバコのＲ
ｕＢＰカルボキシラーゼのサブユニットをコ一１〜する
遺伝子ハ＼らｊ＠られるプロモーターなどがあり、なか
でもＣａ　ＭＶ　３５　Ｓプロモーターが好ましい。更
に、以下の実施例Ｃ・示すように、ＴＧＭＶコー１〜蛋
白プロモーターが、外来ＤＮＡの発現には有効であるこ
とが判った。同様に、真核細胞好ましくは植物細胞のｍ
　ＲＮへ分子あるいは植物ウィルスのｍＲＮＡ分子にあ
る５′−非翻訳領域をコードするＤＮＡ配列も使用する
ことができる。植物細胞におりる翻訳終止コドンをコー
ドづるＤＮＡｌ−リブレツ１−としては、例えば、ＴＡ
Ａ、ＴＡＧ、ＴＧＡがある。植物細胞で活動できるポリ
アデニル化配列も使用することができる。かかるＤＮＡ
配列としては、例えば、ＣａＭＶ、ジエミニウイルス、
あるいは発現可能な植物遺伝子から１ｑられる配列があ
り、なかでも、ＮＯ３あるいはＴＧＭＶコー１−蛋白遺
伝子から得られるものが好ましい。
外来ＤＮＡは、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラ
リー、あるいは目的物質を発ｖＡ覆る細胞から慣用的手
法により単離することができ、また化学的に合成するこ
ともできる。かかる単離あるいは化学合成された外来Ｄ
ＮＡは、翻訳開始シグナル及び蒲訳終止配列を含む。こ
こで゛′発現ノ１セット″と云う言葉を、外来ＤＮＡ配
列自身、翻訳開始シグナルコドン及び翻訳終止コドンを
コードするＤＮＡ配列を除いた、宿主中で外来ＤＮＡ配
列が発現するために必要なすべでの情報を含むＤＮＡ分
子あるいは配列を意味する言葉として使う。ここで、翻
訳開始シグナルコドン及び翻訳終止コドンをコードする
配列は、通常、外来ＤＮＡ配列中に含まれているので除
いた。
好ましい態様においては、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ＤＮＡ配列が除かれた
ｐＭＯＮ３８２　（第１８図）が、かかる発現カセット
を含むベクターとして例示することができる。
通常、真核細胞の発現ベクターは、バクテリア、酵母の
ような簡単に操作ができかつよく開発された宿主−ベク
ターシステム用に組み立てられる。
例えば、公知の配列、あらかじめ同定された制限酸素部
位、及び公知の宿主を持つ酵母あるいはバクテリアのク
ローニングベクターか選ばれる。そのような宿主−ベク
ターシステムによれば、外来ＤＮＡ配列の発現に必要と
される要素が集められた手段が提供される。発現カセッ
トはバクテリアあるいは酵母ベクターに一度に挿入する
ことがで゛き、また慣用的組み換えＤＮＡ手法により、
各ステップを踏んで挿入することもできる。
本発明の好ましい態様においては、ｐＵｃ８プラスミド
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ、　ＭＡ　）が、多缶の各種中間体を得るため
に用いられた。
特に、第９図で示すように、ｐＵｃ８ＤＮＡは、ＥＣＯ
ＲＩとＨｉｎｄｌ１１部位の間に含マレルマルチリンカ
ーを、ＥｃｏＲＩとｌ−１ｉｎｄＩＩＩ部位をその末端
に有し、次式で表わされる新たなマルチリンカ−で置換
し、修正された。
ニー−ニー　　　Ｃ１三ニーっ−−−−−−−＝ニニ己
＝工工（＋−，−：λλ″二Ｃλ：ニニ；、：λ：二：
Ｓヒ（二λ二二Ｔ・二こλ：こ７口・ここ５λλλＧ＝
７Ｔ−３＋１つまたはそれ以上の制限酵素部位を含む同
様のリンカ−を使用することができ、かかるリンカ−に
よって、目的とするＤＮＡ配列及び／又はジエミニウイ
ルスプラスミドベクターＤＮＡに必要な発現要素を組み
立てることができる。
好ましいリンカ−は、各要素から植物プラスミドベクタ
ーを絹み立てるのに必要な、制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ
、　Ｃｊ！ａ　Ｉ、　ＢＱ、ｉ！　ＩＩ　。
Ｓａｃ　　Ｉ、　Ｈｉ　ｎｄ　　ＩＩＩ）を含む。修正
されたｐＵｃ８クローニングビークルはｐＵＣ８Ｎ＋−
と命名された（第９図）。ｐＵｃ８ＮＬは、Ｎｄｅ　　
Ｉ及びマングビーンヌクレアーゼで処理し次いでリガー
ゼで再連結せしめて、ｐＵｃ８配列（Ｙａｎｉｓｃｈ−
Ｐｅｒｒｏｒら、１９８５）の１８３ｂｐに存する唯一
のＮｄｅ　　Ｉ部位を除いて、更に修正した。
得られるプラスミドは第９図に示されており、ｐ　ｆｖ
ｌ　ＯＮ　３６８と命名された。
本発明の１つの好ましい態様においては、プロモーター
と転写開始シグナル配ＴｊＩＪをコードするカリフラワ
ーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターが
選ばれる。他のプロモーターを使用することもでき、そ
れは当業者に公知のものであろう。３０ｏｂｐの５ａｕ
３Ａ−Ｂ（Ｊｊ！　　ＩＩフラグメン１〜上に保持され
たＣ　ａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓプロモーターが、ｐＭ　Ｏ
Ｎ　２９５から精製され、ｐ　ｌｖｌ　ＯＮ３６８のＢ
Ｑｊ！ＩＩ部位に導入されて、リンカ−のＨｉｎｄｌｌ
ｒ部位末端に最も近いところにＢｇＡＩＩ部位が再生さ
れた（第９図）。第９図に示したように、得られるプラ
スミドは、ｐＭＯＮ３７１と命名される。ｐＭ　ＯＮ　
２９５プラスミドを保持するＥ、　　ｃｏｌｉ　　ｆｖ
ｌｆＶｌ　２９４株はＡＴＣＣに寄託され、△ＴＣＣ受
託番号５３３０３が与えられた。
次いで、植物及び／又は植物細胞内で機能する選択マー
カーが（ｄ加される。１つの好ましい態様においては、
カナマイシン耐性が選択され、以下のようにして構築さ
れた。ツバリンシンターゼプロモーターが、修正された
バクテリアＴｎ５ネオマイシンホスボトランスフエラー
ゼ（ＮＯ８−ＮＰＴ　ＩＩ　’−ＮＯ８）をコードする
配列（ここから、過剰のＡＵＧ翻訳開始シグナルが除か
れる）に連結され、次いで以前に記述した如き（Ｆｒａ
ｔｅｙら、１９８３）ツバリンシンターゼ３−非翻Ｕ（
配列が連結される。このマーカー遺伝子は、ＥＣＯＲＩ
及びＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメン１〜で処
理してＥＣＯＲＴ部位を除いたｐＭＯＮ５０５の誘導体
であるｐＭＯＮ３６９から得られる１、６ｋｂのＣ，ｉ
ｉａ　　Ｉフラグメント上に保持されている（第１０図
）。ＤＮＡアデニンメチラーゼ欠損Ｅ、　　ｃｏｌｉか
ら調製されたｐＭ○Ｎ３６つから単離された１、６ｋｂ
のＣｊ！ａｌフラグメントは、ｐＭＯＮ３７１の非反復
Ｃ！ａＩ部位に導入され、ｐＭＯＮ３７３が得られた（
第１０図）。マーカー遺伝子の３′−末端の（１！８１
部位の開裂が、ＤＮＡアデニンメチラーゼに富むＥｃｏ
ｌｉ株から調製されたＤＮＡの重複５′　−ＧＡＴＣ配
列のメチル化によって妨げられることから、そのような
株から調製されるｐＭＯＮ３７３ＤＮＡは、非反復、開
裂可能なＣａＩ　　Ｉ部位を有する。
１８１　／Ｉ　ｂｐの位置にあるＣＪｌａ　１部位から
共通領域を通って２５９　ｂｐの位置にあるＡｈａ■Ｉ
■（Ｄｒａｒ）部位までのフラグメントから得られるＴ
ＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡの一部分を、ｌ）ＭＯＮ３７３の
唯一で開裂可能なＣｊ！ａ　　１部位に挿入した。
ＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡセグメントの［）ｒａ　　１部
位末端は、あらかじめ、合成Ｃｊ２ａ　　Ｉリンカ−（
ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｌ
ｙ、ＭＡ、　、　５’　−ＣＡＴＣＧＡＴＧ）を付加し
て、ｐＭＯＮ３７３のＣ１ａ　　Ｉ部位へ挿入できるよ
うに修正されていた。得られるプラスミドをｐＭＯＮ３
７４と命名した。（第１１図）。
次いで、外来ＤＮＡ配列を挿入した。慣用技術によって
微生物材料から抽出される、あるいは目的とする（例え
ば外来の）化学物質、蛋白、あるいはそのフラグメント
をコードする化学的に合成されたいかなる外来ＤＮＡ配
列も使用することができる。かかる外来ＮＤＡの例は公
知であり当業者にとって入手可能であり、例示した化学
物質に限定されるものではない。
１つの好ましい態様においては、Ｅ、　　ｃｏｌｉのク
ロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ（ＣＡ
Ｔ）のコードを可能にするＮＤＡ配列が、本発明のジエ
ミニウイルスベクターへ挿入するために選ばれる。当業
者に公知の如く、ＣＡＴ配列は、Ｅ、　　ｃｏｌｉプラ
スミドＤ　Ｂ　Ｒ３２５（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。
Ｍａｒｙｌａｎｄ）から単離することができ、あるいは
また化学的に合成することもできる。ＣＡＴ蛋白は、容
易に分析可能であり、少Ｒであっても正確に定量できる
Ｌめに選択された。酵素活性は、３×１０６のプロトプ
ラストで検出可能である（　Ｆｒｏｍｍら、１９８５）
、ラジオイムノアッセイあるいはエンザイムイムノアツ
セイの如き手段によって、抽出物中で検出可能な蛋白を
生み出す伯の外来ＤＮＡ３ｍ伝子はい公子も、発現のた
めにプラスミドに挿入することができる。このような、
蛋白の例としては、例えばヒト漿膜のコナドトロピンの
アルファザブユニット、ティッシュ−プラスミノーゲン
アクティベイター、インシュリン様成長因子、心房ペプ
チド、酵素、前述した化学物質、あるいはネオマイシン
ホスホ１〜ランスフエラーゼＩＩ酵素などが挙げられ、
これらはまた選択マーカーとしてプラスミドに挿入ヅ゛
ることもできる。
容易に構築するために、ＣＡＴ配列は、プラスミドｐ　
Ｍ　ＯＮ　２４１４から得たく第１２Ｍ）。このプラス
ミドにお（プるＣ　Ａ　Ｔ　遺伝子は、開始コドンＡ　
Ｔ　Ｇの所に、Ｎｃｏ　　Ｉ部位を含んでおり、Ｎｃｏ
　　Ｉ部位とＥｃｏＲＩ部位との間の配列はオリゴヌク
レオチド関係部位に特異的な突然変異により、除かれて
いる（Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍ１ｔｔ）、１９８２）。更
に、第２のＮＣＯＩ部位は、ＣＡＴ領域の３′末端の下
流２００＋）Ｉｌｌの位置にある。
フラグメントの５′末端にＢｃｚｉｏ部位、３′末端に
、５ａｃ　　ｉ部位を導入するために、Ｎｃｏ　　Ｉフ
ラグメント〜を、Ｄ　ＭＯＮ　５５０の非反復ＮＣＯＩ
部位に挿入した（第１２図〉。
ｐＭＯＮ５５０プラスミドはｐＵｃｌ　９　（Ｙａｒｉ
ｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５）の誘導体であり、そ
こではｌ−１ｉｎｄｌｌＩとＥＣＯＲＩ部位との間のマ
ルチリンカ−は、下に示すその末端がＨｉｎｄｅｒ及−
７９〜 びＥｃｏＲ１部（ヴに接し７ている合成配列によって２
換されている。
）：ｉ　：Ｉ（ｉ　工工Ｉ　　　　　Ｅ’Ｅｌニエ　　
Ｎ（Ｏｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　ＳａＣ工
　　ＥｚＯＲ工５“−二＝噸・ニニτττ・二τＡＧＡ
ンｊ；、！、Ｔ：二τＣＣ２χτＧこ二ＧＧＣ二τＣっ
ＴＡＣπＡ・二二二〇二λλτで１少なくとも１つの非
反復制限酵素部位を有するいかなるマルチリンカ−も、
目的とする外来ＤＮＡ配列の組み立てに役立てるために
使うことができる。好ましい配列は、Ｂｇｊ！　　ＩＩ
　、　Ｎｃｏ　　Ｉ、及びＳａｃ　　Ｉで開裂する非反
復部位を有するものである。得られるプラスミドは、Ｄ
ＭＯＮ３７５と命名され（第１２図）、９６０ｂｌ）の
ＢＱｊ２ＩＩ−３ａｃ　　Ｉフラグメント上のＣＡＴコ
ード配列の単離のために用いられる。第１２図に示され
ている如く、このフラグメントは、ｐｆｖｌ　ＯＮ　３
７３の３５Ｓプロモーターの次のＢｇｊ！　　ＩＩ　−
３ａｃ　　Ｉ部位に挿入される。得られるプラスミドは
、ｐＭ　ＯＮ　３７７と命名されたく第１２図）。
発現ベクターを作成するために組み立てられる最後の配
列は、スタンダード丁ＧＭＶ−Ａ配列（Ｉｌａｍｉｌｔ
ｏｎら、１９８４）の７９１　ｂｐに位置する非反復Ｓ
ｃａ　　１部位に、合成１−（ｉｎｄｌＩＴリンカ−（
ＮｅＩｙ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖ
ｅｌｙ１ＭΔ、５′−〇　Ａ　Ａ　Ｇ　ＣＴ　Ｔ　Ｇ　
）が挿入されたことによって、コート蛋白をコードする
配列に欠陥のある修正ＴＧＭＶ−Ａゲノムである。これ
は、Ｓｃａ　　Ｉでｔ）ＭＯＮ３０５を開裂し、合成リ
ンカ−を連結し、過剰のｌ−１ｉｎｄＩＩＴで開裂する
ことによって達成され、得られる２、６ｋｂのフラグメ
ントはＨｉｎｄｌｌｌで開裂したｐ　Ｕ　Ｃ１８に挿入
され、プラスミドｐＭＯＮ３４４が得られる〈第１３図
）、。
プラスミドｐＭＯＮ３４４は、更にＡｓｕ　ＩＩで消化
されて１０３７ｂｌｌの位置でＴＧＭＶ−△ＤＮＡ挿入
部位が１回開裂され、３ｍａ　　Ｉの消化により、Ｉ）
ＵＣＩ　８マルチリンカ一部分を１回開裂される。消化
物は、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメンｌ−及
びＤＮＡリガーゼによって処理される。得られるプラス
ミドｐＭＯＮ３７６（第１３図）は、そのＳａｃ　　Ｉ
部位が罰１害されたコート蛋白をコードする配列の３′
一部分と境を接しており、そのｌ−１ｉｎｄＩＩＴ部位
が阻害されたコート蛋白をコードする配列の５′一部分
に接している対称フラグメントとして、矩正ＴＧＭ’ｌ
−へゲツムを保持している。
第１３図に示されるように、本発明の好ましい１つの態
様においては、完全な発現ベクター中間体が以下の方法
により構築される。プラスミド１）ＭＯＮ３７７をＳａ
ｃ　　Ｉ及びＨｉｎｄＴｌｌで開裂し、次いでｐＭＯＮ
３７６からＮ製される２、６ｋｌｌのＳａｃ　　Ｉ−Ｈ
ｉ　ｎｄ　　ＩＩＩ　　ＴＧ〜ＩＶ−Ａフラグメントと
混合する。第１４図に示される如く、得られるプラスミ
ドｌ）　ｆＶＩ　ＯＮ　３７８は次の特徴を持つ。すな
わちＥ、　　ｃｏｌｉにおける複製のために、四牧旦選
択用のアンピシリン耐性を含むｐＵｃ８レプリコーン（
１）がある。次いで、共通領域を含む１８１４ｂｌ）か
ら２５９　ｂｐの丁ＧＭＶ−ΔＤＮＡセグメント（２）
がある。このセグメントの次に、植物細胞及び植物中で
カナマイシン耐性マーカーとして機能するキメラＮ０８
−ＮＰＴ　　ＩＩ　’−ＮＯ３遺伝子（３）がある。こ
のキメラ遺伝子は、その転写方向が共通領域から離れて
おり、コート蛋白遺伝子と同じ方向に調整されている。
次いでＣａ　ｆｖｌ　Ｖ　３５　Ｓプロモーター（４）
がＣＡＴＩ−ド配列（５）に結合しており、Ｎ０８−Ｎ
ＰＴ　ＩＩ　’　−ＮＯ８３ｉｆｆ伝子と同じ方向に転
写される。次いで、コート蛋白をコードする配列の３′
末端で結合し、そのポリアデニル化シグナルがＣＡＴコ
ード配列の３′末端に接している修正ＴＧＭＶ−八ゲツ
ムへ６）がある。修正ＴＧＭＶ−Ａゲノムの他の末端は
ＨｉｎｄＩ１１部位を通してｐＵＣ８プラスミドに結合
している。これらの要素は、発現ベクターを創製するた
めに用いることのできる機能的要素の例である。
ｐＭＯＮ３７８プラスミド（第１４図）は、慣用手段に
よって植物プロトプラストに導入することができる。他
方、このプラスミドは、ｐＵＣベクターから植物プラス
ミドの放出を可能に覆る２つのＥＣＯＲＩ部位を含んで
いるため、中間体プラスミドＤＮＡが、ＥＣＯＲＩの開
裂によって得られ、この直鎖状の植物プラスミドフラグ
メン１へは、慣用法によって植物プラスミドに導入する
ことができる。このようなりＮＡを、植物プロトプラス
トあるいは植物懸濁細胞培養物に導入後、形質転換細胞
から抽出甥を調製し、Ｆｒｏｍｍら（１９８５）の方法
を用いて、ＣＡＴ酵素活性により分析する。コントロー
ルとして、プロ１−ブラストを、同量のプラスミドｐＭ
ＯＮ３８０　（第１５図）のＤＮＡで処理する。ｐＭＯ
Ｎ３８０は、ＴＧＭＶ−ＡのＢａｍＨＩ（１３５４ベー
ス）部位からＣｆａ　　Ｔ（１８１４ベース）部位まで
のフラグメン１〜が除去された以外はｐＭＯＮ３７８と
同じである。この結果、Ａ　Ｌ　１　、八Ｌ２及びＡｌ
１の転写解読枠が欠失される〈第１図）。コート蛋白の
ポリアデニル化シグナルは、依然として、ＣＡＴ遺伝子
に接しており、ｍＲＮＡの安定性のために必要なシグナ
ルを与える。
形質転換及びＣＡＴ遺伝子の発現は、ｐＭＯＮ３８０プ
ラスミドの場合に比べて、ｐＭＯＮ３７８プラスミドの
場合に生じるＣＡＴ酵素活性の増加によって知ることが
でざる。２つのプラスミドの唯一の相違は、ｐＭＯＮ３
７８に（、土、コート蛋白を欠いた完全なＴＧＭＶ−Ａ
　　ＤＮＡがあり、ｐＭＯＮ３８０にはないということ
であり、従って、このＴＧＭＶ−Ａセグメントによって
、ｐＭＯＮ３７８プラスミドに、植物プロトプラスト中
で多くのコピー数を複製し、そしてＣＡＴ遺伝子のコピ
ー及び生成されるＣＡＴ酵素の量を増幅せしめる能力が
与えられると結論付けることができる。
前述した如く、植物細胞内で植物プラスミドを生成する
ことのできる中間体ＤＮＡの他の導入方法は、八ｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｔｉ
プラスミド形質転換システム（Ｆｒａｌｅｙら、１９８
３．１９８５　：　Ｈｏｒｃｈら、１９８５　）　ヲ用
イテ間ｆ？＝’ａした。このシステムの利点の１つとし
て、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍがＤＮＡを、高頻度で
植物細胞内へ導入できることである。加えて、植物プラ
スミドを生成することのできるＤＮ△配列が植物■１胞
の染色体に導入され、その結果、ある外来遺伝子の発現
により生ずる不安定化等の原因により、もし植物プラス
ミドが失われた場合には、組み換えあるいは複製により
、染色体より植物プラスミドが放出されて補充される。
更に、導入された外来ＤＮＡは、種子に伝達されていく
。
次に、形質転換された植物細胞において、プラスミドＤ
ＮＡを生成するＴｉプラスミドに基づいた発現ベクター
の好ましい構築及び使用について述べる。
プラスミドｐＭＯＮ　１２０　（Ｆｒａｌｅｙら、１９
８３）はＳｔｕ　　Ｉ及びＥＣＯＲＩで開裂され、Ｓｔ
ｕ　　Ｉ及びＥｃｏＲＩで開裂されたｐＭＯＮ５２１と
混合される。ｐＭＯＮ５２１プラスミドは、その非反復
Ｓｍａ　　１部位がＸｍａ　　Ｉによる開裂により除去
されたｐ　Ｍ　ＯＮ　５０５の１１休であって、その末
端が、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントによ
る処理及びリゲーションにより埋め込まれたものである
。ｐＭＯＮ１２０とｐＭＯＮ５２１のフラグメントの結
合によって生じるプラスミドｐＭＯＮ３７２　（第１６
図）は、もはやキメラカナマイシン耐性遺伝子を含まず
、しかしｐＭＯＮ５２１のマルチリンカ−を保持してい
る。
次いでＴＧＭＶ−八　ＤＮへ、選択マーカー及びキメラ
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター−ＣＡ丁コード配列が、以
下の方法によってｏＭＯＮ３７２に導入される。プラス
ミドｐＭＯＮ３７７は、ＥＣＯＲ１及びＳａｃ　　Ｉで
消化され、ＴＧＭＶ−Δ共通領域、キメラＮＯ８−ＭＰ
Ｔ　　ＩＩ　’　−ＮＯＳカナマイシン耐性、３５Ｓプ
ロモーター及びＣΔ丁コード配列を有する３、５ｋｂの
得られるフラグメンｈが、予め、ＥＣＯＲ■及び３ｃａ
　　Ｉで消化されたｐｆｖｊＯＮ３７２ＤＮ△に挿入さ
れる。
得られるプラスミドｐＭＯＮ３８１は第１７図に示され
ている。
第１７図に示した如く、コート蛋白配列において切断さ
れたＴＧＭＶ−八　ＤＮＡが、３ａｃ　　１及びＨｉｎ
ｄＩＩＩＦ切断されたｐＭＯＮ３７６から単離され、３
ａｃ　　Ｉ及びｌ−１ｉｎｄｌＩＩで切断されたｐＭＯ
Ｎ３８１に結合される。得られるプラスミドｐＭＯＮ３
８２　（第１７図及び第１８図）は、Ｆｒａｌｅｙら（
１９８３，１９８５＞によって記載されたトリーバレン
タルメーティング法を用いて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　　ｔｕｍａｆａｃｉｅｎｓ　ｌｌ胞に導入される
。第１８図に示した如く、プラスミドｐ　Ｍ　ＯＮ　３
８２は以下のＤＮＡセグメントから構成される。
ａ）ｐＭＯＮ３７２”バイナリ−型”　、Ｔ　ｉ−プラ
スミドに基づく植物形質転換ベクター（１）。
ｂ）、共通領域を含むＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡのセグメ
ント（２）。
Ｃ）、形質転換細胞の選択のためのキメラＮ０８−ＮＰ
Ｔ　　ＩＩ　’　−ＮＯＳカナマイシン耐性遺伝子（３
）。
ｄ）、３５８　　ＣａＭＶプロモーター（４）。
ｅ）、ＣＡＴコード配列（５）。
ｆ）、コート蛋白コード配列が阻害されたクローン化Ｔ
　Ｇ　Ｍ　Ｖ−△　ＤＮＡのコピー（６）。このＴＧＭ
Ｖ−Ａ　　ＤＮＡの共通領域は第１の共通領域（２）の
重複配列である。
かくして得られるｐＭＯ’Ｎ３８２は、プラスミドｐＭ
ＯＮ３５２の変換体の１例であり、植物中での外来ＤＮ
Ａの発現及び複製に有用である。
コントロールとして、完全なコート蛋白をコードするも
のではない欠陥Ｔ　Ｇ　Ｉｖｌ　Ｖ−Ａ　　Ｄ　Ｎ　Ａ
を、次の方法により、ｐＭＯＮ３８１に挿入した。プラ
スミドｐＭＯＮ３８１を３＋ａｃ！及びＨｉｒｄ２１１
ｒ切断し、ｐＭＯＮ３７９の１．２ｋｂのＳａｃ　　Ｉ
−Ｈ１ｎｄ　　ＩＩＩフラグメン１〜をｐＭＯＮ３８１
プラスミドに挿入しプラスミドｐＭＯＮ３８３を得た（
第１９図）、、このプラスミドを、Ｆｒａｌｅｙらの方
法（１９８３，１９８５）を用いて、Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに導入した。
ｐＭＯＮ３８２あるいは３８３プラスミドを持ツへＱｒ
ＯｂａＣｔｅｒｉｕｍ細胞を、Ｈｏｒｓｃｈら（９８５
）によって記載された方法を用いてペチュニア細胞に中
間体植物プラスミドを持つＴ−ＤＮＡを導入するために
用いた。カナマイシンを含む培地で生育し得る植物組織
を選択することによって、カナマイシン逗公子（ＮＯ３
−ＮＰＴ　ＩＩ’　−ＮＯ８）が万力に発現されたこと
が示された。そこに含まれる外来（例えばＮ０８−ＮＰ
Ｔ　ＩＩ　’　−ＮＯ８あるいはＣＡＴ）ＤＮＡを複製
するジエミニウイルスプラスミドに期待される大ぎさく
例えば約４．６ｋｂ）のジエミニウイルスを含むＤＮＡ
のｃｊｓＤＮＡを複製できることが検出された。これら
の複製ＤＮＡは、前述した方法により検出された。
本発明により、発現ベクターが、いずれのジエミニウイ
ルスからのコート蛋白をコードするゲノムより創製でき
ることが示される。次に、そのような発現ベクターを、
コート蛋白をコードするキツサバラテントウイルス（Ｃ
ＬＶ）ＤＮＡＩより製造する方法について述べる。
ＣＬＶ−１ＤＮＡを含む出発物セグメントは、ウィルス
から単離されたーｅｓｔ　Ｋｅｎｙａｎ　８４４（５ｔ
ａｎｌｅｙ及びＧａｙ、　１９８３　）で感染されたＬ
ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ内で生成されるＣ　Ｌ　Ｖ　−
１Ｄ　Ｎ　Ａの２本鎖から抽出することによって得られ
る。感染Ｎ、　　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物は、Ｂ１
５ａｒｏら（１９８２）の方法を用いて、感染した葉の
１１０出物で若い植物８接種することにより得られる。
２５℃で３週間放置後、感染した植物（よじれて、しわ
になった黄色の葉）からの葉を集めて、Ｄｅｌ　１ａＤ
Ｏｒｔａら（１９８３）によって記載された方法によっ
て処理し、感染植物ＤＮＡを単離した。
一コート蛋白コード配列が阻害された、コート蛋白をコ
ードするＣＬＶ−１環状ＤＮＡのサブフラグメントを、
次のようにして得た。仝ＣＬＶＤＮ△（５０ｕｓ）を３
ｑｍＨＩ（１００］−ニット）で完全消化し、予備アガ
ロースゲル上に置いた。十分な時間後、共通領域を含む
ＣＬ　Ｖ　−１ＤＮＡの２５８５　ｂｐの３μｍｌ−Ｉ
　　Ｉフラグメントがゲル上で分離し、ＮＡ−４５膜法
にＪ二り精製した。
２．６ｋｂの得られるフラグメント（０，２μｑ）を、
予めＢａｍ１−１１で消化しアルカリフォスファターゼ
で処理したｐＵ　Ｃ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏ
ｎら、１９８５）ＤＮＡ　　０．２ｔｌｑと混合してク
ローン化した。Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４細胞を
形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選択後、プラ
スミドＤＮＡを調製し、３ｑｍＨＩで消化することによ
って、２．６ｋｂの挿入部位の存在が確認され、またＥ
ｃｏＲＩで消化することにより、挿入されりＣＬ　Ｖ−
Ｉ　　Ｄ　Ｎ　Ａの方向が決定された。それぞれの方向
を有するプラスミドを保存し、それぞれｐｔｖｌ　ＯＮ
　ａ及びｌ）ＭＯＮｂと命名した。
ＬＣＬ−１共通領域フラグメントの受容プラスミドとし
て、ｐＭＯＮ３７７の誘専体を、プラスミドＤＮＡ０．
５μｑをＣｆａＩ２ユニットで浦化し１ｋｂのＴＧＭ−
△共通領域を削除することによって１ｑた。リゲーショ
ンそしてＥ、　　ｃｏｌｉＭ　ｌｖ＋　２９４細胞を形
質転換後、得られるアンピシリン耐性コロニーから試験
用のＤＮＡを調製した。
このＤＮＡをＣｊ！ａｌｒ消化し、１　ｋ　ｂ　ノ挿入
部４；１の欠損を調べた。挿入部位を欠くプラスミドを
保存しｐＭＯＮｃと命名した（第２０図）。
ＣＬＶ−１共通領域のフラグメントのドナーとして、プ
ラスミドｐＭＯＮａ　　ＤＮＡ　（１μｓ）をＳａｃ　
　［２ユニツト）で消化し、マングビーンヌクレアーゼ
で処理して、３ａｃ　　Ｉ開裂部位配列を取った。リゲ
ーション、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ｆｖ１Ｍ２９４１Ｉｉ
ｌ胞を形質転換後、試験用ＤＮＡを、アンピシリン耐性
コロニーから調製し、３ａｃ　　Ｉで消化す゛ることに
よりＳａｃ　　Ｉ開裂部位の欠失が確認され、ＥＣＯＲ
ｒで消化することにより、３５０ｂｐの共通領域フラグ
メントが維持されていることが確認された。これらのプ
ラスミドの１つを保存し、ｐｌＶＩＯＮｉｄと命名した
（第２１図）。
ＣＬＶ−１共通領域フラグメントは、Ｎ０８−ＮＰＴ　
　ＩＩ　’　−ＮＯＳカナマイシン耐ｆ１７．−カーに
結合することができ、続いてＣａＭＶ、３５Ｓプロモー
ターが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＣＡＴ）コード配列に結合される。プラスミドｐ
ＭＯＮｄ　　ＤＮＡ（２０μｇ）をＥｃｏＲＩ（２０，
］−ニット）で消化し、得られる３５０ｂｐのフラグメ
ントをＮ　Ａ−４５ＷＪ法を用いて単離する。３５０ｂ
ｐのフラグメント（０，，２μｇ）を、ＥＣ０ＲＩで消
化し仔牛７）Ｉｉカリフォスファターゼで処理して得た
ｐＭＯＮｃＤＮＡｏ、５μ３と混合する。リゲーション
、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４細胞を形質転換後、
アンピシリン耐性コロニーを選択し、試験用ＤＮＡを調
１７１、た。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することによっ
て、３５０ｂｐのフラグメントの存在が示され、Ｂａｍ
ＨＩで消化することによって挿入されたフラグメントの
方向が決定される。挿入部位を有し、１．３ｋｂの間隔
で離れた２つの３ｑｍＨ１部位を有するプラスミドを保
存しｐＭＯＮｅ　（第２１図）と命名した。２つの共通
領域が接しているコー１へ蛋白の欠陥ＣＬＶ−１ＤＮＡ
を持つ中間体プラスミドであって、カナマイシン耐性マ
ーカー及びＣＡＴ遺伝子に結合したＣａＭＶ３５ｓプロ
モーターを持つ中間体プラスミドの組み立てを完成する
ため、以下のことを行なう。プラスミドＩ）ＭＯＮｂ　
　ＤＮＡ（２μ９＞を、Ｓａｃ　　Ｉ（４ユニツト）及
びＨｉｎｄＩＩＩ（４ユニツト）で消化して、２，６ｋ
ｂのコート蛋白の阻害されたＣＬＶ−１ＤＮＡを切り出
し、更にＰＶＬＪＩ（４ユニツト）で消化してｐＭＯＮ
ｂ　　ＤＮＡの０００部分を不活性化する。この消化Ｄ
ＮＡを、予め３ａｃ　　Ｉ（２−Ｌニット）及び）−１
ｉｎｄＩＩＩ（２ユニツト）で消化したＤＭＯＮｅ　　
ＤＮＡ１μｑと混合する。リガーゼで処理、Ｅ、　　ｃ
ｏｌｉＭＭ　２９４細胞を形質転換後、得られるアンピ
シリン耐性コロニーから試験用ＤＮＡを調整する。
このＤＮＡを３ａｃ　　Ｉ及びＨｉｎｃｌｌＴＩで消化
することにより、６ｋｂのＤＭＯＮｅプラスミドに２．
６ｋｂの挿入部位が挿入されたことが示される。
この特徴を有するプラスミドが保存され、ｐＭＯＮ　ｆ
、！：命名サすル（第２２図）、。
得られるｐＭＯＮｆプラスミドは、ｐＭＯＮ３７８プラ
スミドのＣＬＶ−１アナログであり、ｐＭＯＮ３７８と
同様の特徴を持っている〈第１４図）。
ＣＬ　Ｖ　−１のアナログセグメントをＴ１プラスミド
に基づくベクターに導入する人：めには、ｐＭＯＮ３８
２の創製（第１８図）に用いたと同様の方法を採用する
。
〈実施例〉 以下の実施例は、本発明の好ましい態様を説明するもの
であり、いかなる場合においても本発明の範囲を限定す
るためのものではない。不発明は、その好ましい態様に
関連して記載されるが、そこから生じる各種の改良は、
本出願を読めば当業者に（ま自明であろう。
微生物及びプラスミド 次の微生物は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）　、１２３０ゴＰａｒｋｌａＷｎ
　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭａｒＶｌａ
ｎｄ、　２０８５２、Ｕ、Ｓ、八、から入手できる。
（ｐＴｉ５６Ｓ３−ＩＥＥ　） これらの寄託菌は、本出願の譲受人であるモンサントカ
ンパニーにＵ、Ｓ、パテントが許可されて公衆に入手可
能となる。これらの寄託菌は、本出願の出願日の利益を
有するＵ、Ｓ、パテントの存続期間中は入手可能である
。しかしながら、寄託菌の入手は、対象特許を実施し得
るライセンスを構成するものではない。更に、本発明は
、寄託した菌によってその範囲が限定されるものでもな
い。なぜなら寄託は、本発明の特定部分についてのみの
説明のためのものだからである。
材料及び一般的方法 すべての制限酵素は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ
ｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ　、　Ｍ　Ａ　）　、Ｐｒｏ
ｍｅｇａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｈａｄｉｓｏｎ　、　Ｗ　
Ｉ　）　、Ｂｏｅｈｒｉｎｏｅｒ　ＨａｎｎｈｅｉｍＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ
、　　Ｉ　Ｎ　）及びＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ。
Ｍ　Ｄ　）から入手し、製造業者の説明書に基いて使用
した。制限酵素の認識配列は、ＫｅＳＳｌｅｒらく１９
８５）の文献かられかる。バクテリオファージＴ４　　
ＤＮＡリガーゼは、Ｈｕｒｒａｙら（１９７９）の変法
を用いて調製した。ＤＮＡリガーゼ処理は、２５ｎ＋Ｈ
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　　ｐＨ７，６，１ＱｍＨＭｇ
Ｃｊ！　　、１０ｍＭジチオスレイトール、０．２ｍＭ
スペルミゾイン及び１ｍＨＡＴＰからなるＩｔＭ１５−
１００Ｉｘｊ！中で実施した。一般的には、１０−３０
ユニツトが添加され、反応混合物は、１２℃で１６時間
インキュベートした。クレノーポリメラーゼ及び１牛ア
ルカリホスファターゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｈａ
ｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａ
ｎａｐｏｌｉｓ、　　Ｉ　Ｎ　）から得、製造業者の説
明書に基いて用いた。マングビーンヌクレアーゼはＰｈ
ａｒｍａｃｉａ　−ＰＬ　　Ｂｉｏｃｈｅｉｃａｌｓ　
　（Ｐｉｓｃａｔａｌ＃ａｙ。
ＮＪ）から得、製造業者の説明書に基いて用いた。
早くスクリーニングするためのプラスミドＤＮＡは、Ｉ
ｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ及びＢｕｋｅ　（１９８１）の
アルカリ抽出法により調製した。大量のプラスミドＤＮ
Ａの精製は、Ｄａｖ　ｉ　ｓら（１９８０）（７）方法
ニヨリ、アルイＬｔ　ｌ５ｈ−ＨｏｒｏＷｉｃｚ及びＢ
ｕｒｋｅ　　（１９８１）のアルカリ溶菌変法それに続
＜ＮＡＣ３−５２カラム精製（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍ　Ｄ　）により行なった。
ＤＮＡ制限酵素フラグメントは、ＮＡ−４５ＤＥＡＥ膜
（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕｌｌ、　Ｋｅｅｎ
ｃ　。
Ｎ　＋−１）を用いた水平アガロースゲルの電気泳動に
より単離した。
プラスミドをＦＴ＋５するだめの合成りＮＡマルチリン
カ−は、製造業者の方法に基づき、バイオシステムＤＮ
Ａシンセサイザー（八ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ、　　ＩｎＣ，、ＦＯ３ｔｅｒ　ｃｉｔｙ、　　Ｃａ
１ｉｆｏｒｎｉａ　）より０１製した。
次の大腸菌株を形質転換の受容菌として用いた。
Ｌ′Ｅ　３９２及びＭ　Ｍ　２９４　（Ｈａｎｉａｔｉ
ｓら、１ＪＭ　１　Ｑ　１（Ｖｉｅｉｒａ及びＭｅｓｓ
ｉｎｇ、　１９８２　）Ｇ〜１４８（Ｂａｌｅら、１９
７９） Ｌ　止具　ＬＥ３９２．ＭＭ２９４．、及びＪＭ１０１
株はＡＴＣＣ受託番号３３５７２．３３６２５．３３８
７６に基づきＡＴＣＣから得ることができる。Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　　ＧＭ４８．ｄａｍ−、及Ｕｄ、　ｃ　ｍ−株は
、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、　Ｈａｓｓ　、　０１６０５の
マザチューセツツ大学、メディカルスクール、ファーマ
コロジーデパートメントのＨ，Ｇ、　Ｈａｒｉｎｕｓか
ら得ることができる。
Ｅ、　　ｃｏｌｉ株はＨａｎｉａｔｔｓら（１９８２）
の方法により形質転換した。
ルリアブロース（Ｌ６）及びプレー１〜は、ＤａＶ　ｒ
　ｓら（１９８０）の文献により調製した。フィルター
滅菌し凍結して保存した抗生物質は次の濃度で用いた。
アンピシリン（Ａｔ）＞２００μり／ｄ；スベクチノマ
イシン（ＳｐＣ）５０μｑ／ｙ、ｐｕｃプラスミドある
いはその中間体のクローニングのために、［ＰＴＧ（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）１０Ｍｇ−／
−及びｘｇａｚ　（５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）２５μｑ／ｍｌ
を含む培地を用いた。
アガロースゲル電気泳動は、１μ！７．／ｍｆ！の臭化
エチジウムを含むＴｒ　’＋　５−ａｃｅｔａｔｅ　Ｅ
　Ｄ　ＴＡ中で、Ｈａｎｉａｔｉｓら（１９８２）の文
献に記載された方法により行なった。アガロースゲル濃
度は０．８％（Ｗ／Ｖ　）であった。
植物からのＤＮＡの単離は、Ｄｅｌ　１ａｐｏｒｔａら
（１９８３）の方法により実施した。
クロラムフェニコールアセチル１−ランフェラーゼの分
析は、Ｃａｎｏｎ及びＰｒｉｍｒｏｓｅ　（１９７４）
の文献に記載された方法により実施しノこ。バクテリア
のスタンダードどして用いたものは、クロラムフェニコ
ール−３−〇−アセチルトランスフェラーゼ、Ｅ、Ｃ，
２，３，１，２８，ジグ？　Ｎｏ、　Ｃ−２９００（ジ
グｖ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｈｉｓｓｏｕｒｉ　）
であり、０．２５Ｍ　　王ｒ　ｉ　ｓ、　ｐＨ７，８の
５．０ｄで、終濃度０．１ユニット／μｍに再構成され
る。
伯の試薬としては、アセチルＣｏ△、シグマＮｏ、　Ａ
−２８９７（トリーソジウム、トリーハイドレート）（
シグマ、ｓｔ、　ＬｏｕｉＳ、旧５ｓｏｕｒｉ　）　、
エタノール中で４５　、５ｍ　Ｃｉ　／ｍｍｏｌｅの”
Ｃ−’７　Ｄ　７ムフエニコール（ＮＥＮ４０８、ジク
ロロアセチル−１、２−”Ｃ）　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）、及び４℃で保存した１００
％酢酸エチルなどがある。典型的なアッセイは次のよう
にして行なった。
葉の組織を、０．２５Ｍトリス、ｐＨ７，８，２００μ
ｌ中に入れ、マイクロビーズを含むマイクロビーズ（ｍ
ｉｃｒｏｆｕｇｅ　）チューブにつめて、２秒間渦動せ
しめ、次いでマイクロビーズ中で４℃、１０分間遠心し
た。上浦液を６５℃で１５分間加熱し、加熱された抽出
物１５０μｌを１′１Ｃ−クロラムフェニコール１０μ
ｌと混合し、３７°Ｃで５分間インキュベートした。、
４＋＋＋ＨアセチルＣｏＡ２０μｊを加え、混合物を渦
動させしめ、３７℃で３０ｆＯｆ間１′ンキュベートし
た。反応を４℃の酢酸エチル２ｍを加えて、停止させ、
次いで渦動せしめた。有渋層を取り、エバポレーターで
乾燥し、酢酸エチル３０μｌに懸濁せしめ、シリカゲル
ＴＬＣプレートにスポットし、９５：５のクロロホルム
−メタノールで、４５分間展開した。プレー１〜を乾燥
し、−晩、Ｘ−線フィルムにさらした。
サザンプロット分析については、ＤＮＡ（通常０．５−
１μｇ）を、臭化エチジウム１μ９／ｄを含む前記した
如くして得られた０、８％（Ｗ／ｌアガロースゲル上に
置き、効果的分離が達成されるまで（８５Ｖで４時間）
、電気泳動を行なった。ゲルを次いで、Ｕｖ照射に１５
−３０秒さらした。次いで、ゲルを２回（それぞれ１０
−１５秒間）、０．２５ＭＪ！酸水溶液で洗い、次いで
蒸留水でリンスした。リンス後、ゲルを、０．５へ水酸
化ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む変性溶液
で２回（それぞれ３０分間Ｉ・トータル１時間）洗い、
再び蒸留水でリンスした。
次いでゲルを、０．５Ｍ１−リス（ｐＨ７＞及び３Ｍ塩
化ナトリウムを含む変性溶液で２回（それぞれ３０秒間
、トータル１時間）洗った。
次いで、２０Ｘ　　ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム、０．
３Ｍクエン酸ナトリウム）で飽和したスポンジ（Ｃｅｌ
　１ｏｏｅｌ　）の上の２つのホワットマン３　Ｍ　Ｍ
紙上に、ゲルを置いた。あらかじめ２０ＸＳＳＣで湿ら
せたニトロセルロース膜 （５ｃｈｌｃｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕｌｌ、　Ｋｅｅｎ
ｅ、　Ｎｅｗ　Ｈａｍｐｓ旧ｒｅ）を、ゲルの上に置き
、次いで２枚の３ＭＭ紙、２゜３枚のペーパータオル、
及びゲルから二［ヘロセルロース膜へＤＮＡが移動する
ために良好な接触が保もてるための軽いものを置いた。
４峙間後、ニトロセルロース膜を取り、２０Ｘ　　ＳＳ
Ｃでリンスし、それから８０℃で２時間、減圧下に焼い
た。
次いで、ニトロセルロース膜を、５０％ホルムアミド、
５Ｘ　　ＳＳＣ，５Ｘデンハルド（Ｄｅｒ＋’ｒ＋ａｒ
ｄＳ）　ｇＨ（Ｈａｑｉａｔｉｓら、’１９８２．ｌ　
、０．２％ＳＤＳ、及び変性サケスペルマＤＮＡ１００
μＳ７／ｍＩｌを含むハイブリダイゼーション緩衝液中
で、４２℃で２時間インキュベー１〜した。次いでニト
ロセルロース膜を、加熱し次いで冷却した３２Ｐ−ラベ
ル化プローブＤ　Ｎ　Ａ　（１？１ｇ１ｌＶら、１９７
７）を含むｆ′ｒ鮮なハイブリダイゼーション緩衝液中
で、４２℃で４８時間インキュベートした。
次いで、ニトロセルロース膜を、２Ｘ　　ＳＳＣ１５ｍ
ＨＥＤＴＡ、０．２％ＳＤＳで、６５℃で３０分間２回
洗い、ついで０．２Ｘ　Ｓｓｃ、５ｉＨＥＤＴＡ、０．
２％Ｓ　Ｄ　Ｓ　Ｔ−１６５℃Ｆ３０分間洗った。次い
でニトロセルロース膜を、プラスチックバッグにシール
し、放射活性を有するプローブにハイブリダイズするＤ
ＮＡを発色させるためＸ−線フイルムにさらした。
実施例１ 次の実施例は、バイナリージエミニウイルスのコート蛋
白をコードするＤＮＡ、特にＴ　Ｇ　ＩＶＩ　Ｖ　−Ａ
コンポーネントの植物中での自律的複製を確立するため
に用いたベクターを含む３つのジエミニウイルスＤＮＡ
の構築を示すものである。
ＴＧＭＶ−ＡあるいはＴＧＭ、Ｖ−８コンポーネントＤ
ＮＡを含む植物の創製及び形質転換された植物中での丁
ＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡの自律的複製の証明についても記
述する。
ａ、ｐＭＯＮ３０５の構築 プラスミドｐＢＨ４０４（Ｂｉｓａｒｏら、１９８２）
ＤＮＡ（２０Ｐｇ）をＥｃｏＲＩ（４０ユニツト）で消
化し、２．６ＫｂのＴＧＭＶ−Ａ；７ラグメントをＮＡ
−４５膜で精製した。精製したフラグメント２μｑを、
ＥｃｏＲＩで開裂したｐ　Ｍ　ＯＮ　２００ＤＮＡ０．
１μ９と混合し、仔牛アルカリフォスファターゼで処理
した。リゲーションし、次いでスペクチノマイシン耐性
を選択マーカーとしてＥ、　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４
細胞を形質転換せしめ、５０のコロ−を得た。これらの
１２のコロニーから試験用にＤＮＡを得た。ＥＣＯＲＩ
及びＣｊ！８１を用いた制限酵素分析により、これらの
プラスミドの一つは、第２図に示されるように・、Ｔ　
Ｇ　Ｍ　Ｖ一へフラグメントの２つが縦ニー列で組込ま
れていることが判かった。このプラスミドをｐＭ　ＯＮ
３０５と命名した。
ｂ　、　ＯＭ　ＯＮ　３０８　及Ｕ　ＯＭ　ＯＮ　３０
９　（７）　Ｍ築プラスミドｐＢＨ６０２（Ｂｉｓａｒ
ｏら、１９８２）ＤＮＡ　（２Ｃ１ｇ）をｃｚａ　　Ｉ
（５０ユニツト）で消化し、２．５ｋｂのＴＧＭＶ−Ｂ
フラグメントを精製した。精製したフラグメント２μ３
を、あらカＵメＣｆ！　ａ　　ｒテｎｎ裂したｐＭＯＮ
２００（Ｆｒａｌｅｙら、１９８５）０．１μびと渥合
し、仔牛アルカリフォスファターゼで処理した。リグ−
ジョンし、Ｅ、　　ｃｏ旦　ＭＭ２９４細胞を形質転換
せしめた後、スベクチノマイシン耐性の１００コロ−を
得た。これらの１２のコロニーから試験用にＤＮＡを得
た。制限酵素分析の結果、これらのプラスミドの一つは
、ＴＧＭＶ−Ｂ　　ＤＮＡ３が縦に１列に組込まれてお
り、他の１つは４つが縦１列に組込まれていた。これら
のプラスミドを、それぞれｐＭＯＮ３０８．ＤＭＯＮ３
０９．！：命名し、第２図にその構造を示した。
Ｃ１丁Ｇ〜１ｖ−△あるいは−Ｂコンボーネン１〜実施
例１３で示したようにして得られたカナマイシン耐性の
ベチニア及びタバコカルスを、カルベニシリン５０μ！
？／Ｉｎ！！及びカナマイシン３００μ９／ｍ２を含む
再生培地（Ｍ　Ｓ　１０４　）　　（１ｌｏｒｓｃｈら
、１．９８５　）で、健車な新芽が生長するまで、３〜
６週間生育せしめた。これらの新芽が適当な大ぎさく　
１　、５−２．５ｃ、７＋）になった時に、それらを取
り、根を定着させるための培地（ｒｏｏｔｉｎｇｍｅｄ
ｉｕｍ　　）　　（ＭＳＯ）　　（Ｈｏｒｓｃｈら、１
９８５）　に、根の形成が促進されるように、新芽の先
を埋め込むようにして置いた。根を形成した１−５週後
の新芽を取り、土壌中に植え、成熟せしめた。
このようにして得られた植物が、Ｎ０８ｉ伝子とＮ０３
−ＮＰＴ　　［’−ＮＯ３Ｉ伝子を含む組込まれた（　
ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）　Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａを有するか
否かを確認するため、次のテストを行なった。これらの
植物においてのツバリンの発現を、ロジャース（Ｒｏｇ
ｅｒｓ　）らの方法により調べた。形質転換されたベヂ
コーニア植物のＮ０８−ＮＰＴ　１！’−ＮＯ３遺伝子
の発現を調べるため、葉の組織を採取し、カナマイシン
３００μσ／厩を含むＭＳ１０４培地に置いた。葉の組
織からのカルスの成長により、植物でのこの遺伝子の発
現が確認された。
タバコについては、形質転換した植物の自己交雑により
得た種子を、カナマイシン３００μ９　／　ｍ＋２を含
むＭＳＯ培地に置いた。この培地で発芽し、成長できる
種子が、Ｎ０８−ＮＰＴ　Ｈ’　−ＮＯ３ｉ伝子の公子
のメンデル遺伝の法則から期待されるような割合いで、
形質転換された親の植物から得られた。
転換されたペチュニア及びタバコから全ＤＮＡを単離し
、８％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルで電気泳動にかけ、ニ
トロセルロース上に塗付し、ｐＵＣ８及びＴＧＭＶ−Ａ
コンポーネントに特異的な挿−１０８’− 入配列（ｐＭＯＮ３４９）を含むプローブにハイブリダ
イズさせた。ペチュニア及びタバコからの両者のＤＮＡ
は、ＴＧＭＶ−Ａプローブとハイブリダイズし１本鎖（
ＳＳ）及び２本鎖（ｄｓ）のＴＧＭＶウィルスＤＮＡと
コミゲイト（ｃｏｍｉｇａｔｅ）するバンドを含んでい
た。
形質転換されたタバコでのＴＧＭＶ−８コンポーネント
の存在を確認するため、フリーＤＮＡデリバリ−試験を
次のようにして行なった。八ｔｕｍｅ　Ｉ’ａｃ　ｉ　
ｅｎｓで形質転換された遺伝子間（ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃ）植物のカナマイシン耐性の子孫の葉に、カーボラン
ダムによる研摩で表面に傷を付けた後で、ｌ）ＭＯＮ３
３７ＤＮＡ　（１０μｇ／植物）を接種した。接種後１
０−２０日で、ＴＧＭＶＩ染の特徴的症状が現われた。
この症状が表われるためには、両者のＴ　Ｇ　Ｍ　Ｖコ
ンポーネントが必要であることから、この試験により、
ｐＭＯＮ３０８あるいはｐ〜＋０Ｎ３０９を含むＡ、　
　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで形質転換された植物中での
ＴＧＭＶ−Ｂの存在が確認された。
ベヂュニアについては、形質転換されｉこ植物中でのＴ
ＧＭＶ−８コンポーネントの存在は、ＴＧＭＶ−Ａで形
質転換された植物との交配によって確認した。ｐＭ　Ｏ
Ｎ　３０８あるいはｐＭＯＮ３０９のいずれかを含むＡ
、　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで形質転換されたカナマ
イシン耐性のペチュニアで、ｎｏｐ＋株の子孫を、自由
に複製する組込まれたＴＧＭＶ−ＡウィルスＤＮＡを有
することが知られた形質転換ペチュニアからの子孫と交
配した。
一方の親からのＴＧＭＶ−Ａコンポーネント及び他方の
親からのＴＧＭＶ−Ｂコンポーネントの単純なメンデル
遺伝の法則から期待される割合いで、これらの交配から
の子孫は、ＴＧＭＶ感染に特徴的な症状を示した。この
結果から、ＤＭＯＮ３０８あるいはｐＭＯＮ３０９を含
む八。
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで形質転換された植物中でのＴ
ＧＭＶ−Ｂの存在が証明された。
実施例２ 次の実施例は、それぞれＴＧＭＶ共通領域を欠くクロー
ン化されたＴＧＭＶ−Ａ及びＴＧＭＶ−Ｂコンポーネン
トの構築を示すもので必る。
ａ　、　　ＯＭ　ＯＮ　３４４１７）　ａ築ｐＭＯＮ３
４４を得るためには、丁Ｇ　ｌｖｉ　Ｖ　−Ａのツー１
−蛋白をコードする配列中におる非反復の３ｃａ　　Ｔ
部位を、Ｈｉｎｄｌ１１部位に変換する必要がある。こ
れは、ｐＭＯＮ３０５ＤＮへ　５μｑを３ｃａ１１０ユ
ニツトで開裂せしめることにより、達成された。３ｃａ
　　Ｉで開裂したｐ　Ｍ　ＯＮ　３０５　Ｄ　Ｎ△を、
ｌ−１ｉｎｄｌｌｌリンカ−（５′　−ρ　ＣＡＡＧＣ
ＴＴＧ、　　Ｎｅｖ　　ＥＨ１ａｒ＋ｄＢｉｏｌａｂｓ
　）　４０　ｒ＋ｇの存在下にリガーゼで処理した。
１４℃で１６時間後に、リガーゼを７０℃で１５分間不
活化し、苗温に冷却後、過剰の Ｈｉ　ｎｄ　　ＩＩＩ（２０ユニツト）で、３７℃で２
時間処理した。このＤＮＡ約２．５μ７を、あらかじめ
ＨｉｎｄＩＩＩで開裂したｐｌＪＣｌ　８ＤＮＡ１．０
μｑに加え、修生アルカリフォスファターゼで処理した
。リガーゼ処理した混合物で１ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０１
１ｔｌ胞を形質転換し、ＸＱａ、ｆ！及びＩ　ＰＴＧを
含むＬＢ　　Δｐｐ−レート上選択した。５０コロニー
を拵だ。そのうち二つのコロニーはＤＮＡが挿入された
ことを示す白色であった。
これらのコロニーを、アンピシリンを含む培地で生育し
、アルカリ溶菌によりＤＮＡを回収した。
１−１　ｉ　ｎｄ　　ＩＩｌ、　　ＢａｍＨＩ、　　Ｃ
ｊ！ａ　　Ｔ及びｘｈＯ■を用いた制限酵素分析により
、これらのうち１つが正しいことが示された。挿入笛れ
たＤＮＡのオリエンテーションは、Ｂａｍ１−Ｉ　　Ｉ
消化部位からであることが示された。かくして得られた
ものをｐＭＯＮ３４４　（第５図）と命名した。
ｂ、ｐＭＯＮ３４９の構築 プラスミドｐＭＯＮ３４４　（第５図）ＤＮＡ（２μｇ
−）を、ｌ−１ｉｎｄＩＩＩ（１０ユニツト〉及びＥｃ
ｏＲＩ（１０ユニツト）で消化した。制限酵素を熱で不
活性化し、得られる消化物をリガーゼで処理した。この
混合物をＪ　ＩＶＩ　１０１細胞に形質転換せしめ、次
いでＸｇａｌ及びＩ　ＰＴＧを含むＬＢ　　Ａｔ）プレ
ート上で平板培養した。約４００コロニーを得、そのう
ちの１５０コロニーは、ＤＮＡが挿入されたことを示す
白色であった。これらのうちの１２のコロニーから試験
用ＤＮＡを得た。次イｃ−３ａｍＨＩ、　Ｅ　ＣＯＲＩ
及びＨｉｎｄｉｌＩで消化した。これらのうち１つは、
１４６０ｂｌ）のＥＣＯＲｌ−Ｈｌｎｄ　　ＩＩＩフラ
グメントを有することが分った。このプラスミドを、ｐ
ＭＯＮ３４９（第３図）と命名し、保存した。
Ｃ，ｌ）ＭＯＮ３５０の構築 プラスミドｐｕ０８ＮＬ（第９図）ＤＮＡ　（２μｇ）
をＢｇｊ！　　ＩＩ　　＜１０ユニツト）、Ｃ，ｅａＩ
（１０ユニツト）及び修生アルカリフオ゛スファターゼ
で開裂した。７０℃で１０分間熱による不活性化後、こ
のＤＮＡを、ＢＯＡＩＩ及びＣｊ！ａ　　１のそれぞれ
１０ユニツトで消化し不活性化した。ＭＯＮ３０９　　
ＤＮＡと一緒にした。この測合物をＤＮＡリガーゼで処
理し、ＪＭ１０１細胞の形質転換に用い、次いでアンピ
シリン耐性によりｍ択した。３００コロニーを得、その
うち１２コロニーからＤＮＡを得た。このＤＮＡをＣｊ
！ａｌ及びＢＱｉ　１．［Ｔ−消化し、１５７０ｂＤの
Ｃｊ！ａ　　Ｉ−ＢＯｊ！ＩＩフラグメントの存在をス
クリーニングした。このフラグメントをａｏｌつのプラ
スミドを保存し、ｏ　Ｍ　ＯＮ　３５０（第３図）と命
名した。
実施例３ 次の実施例は、中間体バイナリ−丁１プラスミドベクタ
ー、特にジエミニウイルスプラスミドベクターが挿入さ
れるｐＭＯＮ５０５の構築に用いられる中間体ベクター
の構築について示す。
ａ、、ｌ）ＭＯＮ５０３１７）構築 プラスミドｐＭＯＮ　２００　（Ｆｒａｌｅｙら、１９
８５）ＤＮＡ　（４μｇ＞をＮｄｅＩｒ消化、ＤＮＡリ
ガーゼで処理した。Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ｆｖ１Ｍ２９
４細胞を形質転換後、スペクチノマイシン耐性細胞を選
択し、３００コロニーを得た。このうちの２４コロニー
からＤＮＡを１１．、ＮｄｅＩの消化により、９０Ｃ）
ｂｐのＮｄｅ　　Ｅフラグメントを欠いていることが分
った。また残存するＮｄｅｌフラグメントの方向を決定
するため、ＢａｍＨＩ、Ｐｓｔ　　Ｉ必るいはＢａｍＨ
Ｉ及びＥＣＯＲ■で消化した。１つのプラスミドが正し
いオリエンテーションを示し、９００ｂｃ＋のＮｄｅ　
　Ｉフラグン：ントを欠いていた。これを保存し、Ｉ）
ＭＯＮ５０３（第４図）と命名した。
ｂ、ｐＭＯＮ５０５の構築 プラスミドｐＭＯＮ５０３ＤＮＡ　（４μｇ）を３ｍａ
　　Ｉ及びｌ−１ｉｎｄＩＩＩで消化し、次イテＳｍａ
　　Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂したｐＴＪＳ７５Ｄ、
ＮＡ　　４μ３ど混合した。ＤトＩＡリガーゼ処理後、
形質転換し、アクヂノマイシン耐性のＬ免虹ｌｉ　　Ｍ
〜１２９４の２５０コロニーを得た。このうちの１２コ
ロニーから試験用のＤＮＡを得た。
次いでＳｍａ　　Ｉ及びＨｉ　ｎｄ　　ＩＩＩ：　Ｐｓ
　ｔ：　　Ｉ。
Ｓａｌ　■及びｐｓｔ　　Ｔ：及びＰｓｔ　　Ｉ及びＳ
ｍ　ａ　Ｉ！ｒの消化により３．８ｋｂのｌ−１−１ｉ
ｎｄｌＩＩ−８Ｉフラグメン１〜の存在を調べた。これ
らのうち、１つが正しい構造を示し、ｐ　ＭＯＮ　５０
５（第４図）と命名し保存した。
実施例４ 以下の実施例は、植物細胞中へ導入するために、Ｔｉプ
ラスミドに挿入できるようにＴＧＭＶ−Ａコンポーネン
トを組み立てる上で有用な各種ｒ：Ｆ−間体プラスミド
ベクターについて証明するものである。特に、ＴＧ〜１
ｖ共通領域に接してコート蛋白マイナス（ｃｐ−）Ａ　
　ＤＮＡ配列を、コート蛋白をコードするＤＮＡ配列が
造成しないようにＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡを組み立てる
。得られるｐＭＯＮ３５２ベクターは、ジエミニウイル
ス植物プラスミドを生ぜしめるために、フリーＤＮＡの
導入に使用される。
ａ、　ｐＭＯＮ３４！Ｍ）構築 プラスミドｐ〜ｌ０Ｎ３４４　（第６図）ＤＮＡ（１０
μＵ）をＨｉｎｄｌｌｌ及び３ｃａ　　Ｉで消化し、２
．６ｋｂのＨｉ　ｎｄ　　［Ｉ　　ＴＧＭＶ−Ａフラグ
メントをＮＡ−４５膜法により精製した。精製したフラ
グメン１〜５μ９を、あらかじめ　　　　。
１−１ｉｎｄｒｌ［で開裂し、１牛アルカリフォスファ
ターゼで処理したｐＭＯＮ５０５ＤＮＡ　　１μ９と混
合した。リガーゼ処理、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＭＩｖ１
２９４細胞を形質転換後、４７０個のスペクチノマイシ
ン耐性コロニーを得た。１２個のコロニーをアンビシリ
ン耐性テストに用い、８個が感受性であることが分かっ
た。これら８個のコロニーから試験用のＤＮＡを取り、
２．６ｋｂのＨｉｎｄｌｌ１７ラグメントの存在をスク
リーニングした。２つのプラスミドが挿入部分を有し、
ＥＣＯＲＩ消化により、１つのプラスミドが第６図に示
した如き方向を示した。このプラスミドを保存し、ｐＭ
ＯＮ３４５と命名した。
ｂ、ＤＭＯＮ３５２の構築 プラスミドｐＭＯＮ３４５ＤＮＡ　（５μｇ）を３ｔｕ
Ｉで消化し、Ｎ０８−ＮＰＴ　　ＩＩ　　’　−ＮＯ８
ｍ伝子の３′末端から１４２ｂｐの部位を切断した。こ
のＤＮＡを、ｐＵＣ１８合成マルチリンカ−中に有する
非反復３ｍａ　　１部位であらかじめ切断したｐＭＯＮ
３４４ＤＮＡ５μりと混合した。リガーゼ処理、ＭＭ２
’９４細胞の形質転換後、５６個のアンピシリン及びス
ペクチノマイシン耐性のコロニーを得た。１２個のコロ
ニーから試験用プラスミドを得て、ＢａｍＨＬ　Ｅｃｏ
ＲＩ。
ＢＱｊ！ＩＩ及びＮｄｅ　　Ｉによる消化によりその正
しい構造を調べ、第６図及び第７図に承り構造が分かっ
た。これらのプラスミドの１つを保存しｐＭＯＮ３５２
と命名した。
実施例５ 以下の実施例は、ジエミニウイルス植物プラスミドベク
ター（ｐＭＯＮ３５８）、特に、フリーＤＮＡデリバリ
−システムに有用な、ＴＧＭＶ−Ａコンポーネント植物
プラスミドベクターの構築を示す。また、フリーＤＮＡ
デリバリ−システムに有用なＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡ配
列を欠いたネガティブコントロールベクター（ｐＭＯＮ
３６０）の構築を示すものである。
ａ、ｐＭＯＮ３５８の’）ａ築 プラスミドｐＭＯＮ３５２ＤＮＡ　（１μｑ）をＨｐａ
　　Ｉで消化し、５倍に希釈し、次いでＤＮＡリガーゼ
で処理した。ＭＭ２９４細胞を形質転換後、２０００個
のアンピシリン耐性コロニーを得た。このうちの６５個
のコロニーを、５０μび７ｍ（ｌのスベクチノマイシン
を含むプレート上に塗り付けた。いずれのコロニーもス
ベクチノマイシン耐性ではな刀）つだ。これらのうち１
２個のコロニーから試験用のＤＮＡを採取し、）−１ｐ
ａ　　Ｔ及びＨｉｎｄｌＩＩで浦化した。１１個のコロ
ニーが２．６ｋｂのＨｉｎｄｌＴＩフラグメン１へ及び
１ケ所のＨｐ８　１部位を有していた。これらの１つを
保存しｐＭＯＮ３５８　（第８図）と命名した。
ｂ、ｐ〜ｌ０Ｎ３６０の構築 プラスミドｐＭＯＮ３５８ＤＮＡ　（１ａｇ）をＨｉｎ
ｄｌｌｌで消化し、５培にの赤釈し、ＤＮＡリガーゼで
処理した。Ｉ）　ＩＶＩ　ＯＮ　２９４細胞を形質転換
後、約２０００個のアンピシリン耐性コロニーを得た。
これらの１２個のコロニーから試験用プラスミドＤＮＡ
を取り、ｌ−１ｉｎｄｌｒＴで消化した。そのうちの１
１個のコロニーは、−’ｙ所のＨｉｎｃｆ１１１部位を
持ち、２．ｉｔ）のｌ−１ｉｎｄｌｌＩフラグメントを
欠いていた。これらの１個を促存し、ｐＭＯＮ３６０　
（第８図）と命名した。
実施例６ 以下の実施例は、フリーＤＮＡデリバリ−システムに有
用なジエミニワイルス発現ベクターｐＭＯＮ３７８の組
み立てのための各種中間体プラスミドの構築を示ずもの
である。、ｐｆｖｌＯＮ３７８は８０，２１Ｔ及びＳａ
ｃ　　ｒで開裂され、ＣＡＴＤＮＡコード配列を放出し
、ジエミニウイルス発現ベクターｐＭＯＮ３７８へ目的
とするＤＮＡコード配列を挿入するための部位を提供す
る。
ａ、ｆ）ＵＣ８ＮＬの構築 ＢｅｔｈｅＳｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ。
Ｇａ　ｉ　ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍ　Ｄから入手した
プラスミドｏＵｃ８　（ν１ｅｉｒａ及びＨｅｓｓｉｎ
ｇ、１９８２　）、ＤＮＡ　（１μ９＞をＥＣＯＲＩ及
びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。次いでＥｃｏＲＩ及びｌ
−１ｉｎｄｌｌＩ付着末端で構成される合成マルチリン
カ−４０ｎ（＋を加え、混合物をＤＮＡリガーゼ処理し
た。Ｊ　ｆｖｌｌｏｌを形質転換し、アンピシリン、Ｘ
Ｑａｊ！及びＴ　ＰＴＧを含むプレート上の白いコロニ
ーを選択し、約５００コロニーを得た。これらのコロニ
ーのうち１２個から試験用（ＤＮＡを取り、消化により
、ＥｃｏＲＩ、　Ｈｉ　ｎｄ　　ＩＩＩＩ　、　Ｃ１ａ
　　Ｉ。
８ｇｆｆ１　　ＩＩｉ、　Ｓｃａ　　Ｔ及びＸｈｏ　　
ｉ部位の存石をテストした。１つのプラスミドがこれら
の特性を有し、これを保存し、１）ＵＣ８ＮＬ　（第９
図）と命名した。
ｂ、ｌ）ＭＯＮ３６８の構築 プラスミドｐＵｃ８ＮＬ　　ＤＮＡ　（１ａｇ）をＮｄ
ｅ　　Ｉで浦化し、マングビーン（ｍｕｎｇｂｅａｎ）
ヌクレアーゼで処理して、１本鎖末端を除いた。
ＤＮＡリガーゼで処理し、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２
９４細胞を形質転換し、２００個のアンピシリン耐性コ
ロニーを得た。これらのうち１２個のコロニーから試験
用ＤＮＡを取り、Ｎｄｅ　　Ｉ部位の欠失を調べた。Ｎ
　ｄ　ｅ　　Ｉ認識部位を欠失した１つのプラスミドの
保存し、ｐＭＯＮ３６８（第９図）と命名した。
Ｃ，ｐＭＯＮ３７１の構築 プラスミドｐＭＯＮ２９５は、カリフラワーモザイクウ
ィルスの３５８プロモーター領域から誘導される３２０
ｂｏ　　ＤＮＡフラグメントを持つ１）ＭＯＮ２００の
誘導体である。このフラグメントは下に示す通りであり
、その構築はＲｏｖｅｒ’ｓら、（−１９８５＞に記載
されている。
Ｃａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓプロモーター配列の５′末端か
ら３′末端の番号は図面上の目的のためのみのものであ
る。
プラスミドｐＭＯＮ２９５ＤＮＡ（２ｏμび）をＥ３ｇ
ｉ、　　Ｉｆ　及ヒＥｃｏＲＩ（７）４０．：１．二’
／トｒｉ化した。得られる３３０ｂρフラグメントをＮ
Ａ−４５Ｆ！法を用いて蹟製し、次いで５ａｕ３Ａ　　
１０ユニツトで消化した。５ａＬＩ３Ａで消化したフラ
グメントを、あらかじめＢＱｆｆｌ　　ＩＩ　　（５ユ
ニツト）で消化し、修生アルカリフォスファターゼで処
理したｐＭＯＮ３６８ＤＮＡ　　１μ９と混合した。リ
ガーゼ処理、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ｆｖｌＭ　２９４細
胞を形質転換後、１００個のアンピシリン耐性コロニー
を得た。これらのうち１２’１１７１１のコロニーから
試験用ＤＮＡを取り、ｐｖｕＩＩでの消化により、３３
０６ｐのＤＮＡ配列が挿入されたことが分かり、Ｂｇｊ
！　　ＩＩ　、　ＥｃｏＲＶ及びＸｍｎｒ（７）消化ニ
ヨリ、この挿入されたフラグメントの方向が分かった。
１２個のうち２個が、３５Ｓプロモーターフラグメント
を、ｐＭ　ＯＮ　３６８のＨｉｎｄｌ１１部位に最も近
いＢＣＩＩ１１部位に含んでいた。これらの１つを保存
し、ｐＭＯＮ３７１　（第９図）と命名した。
ｄ、ｐＭｏＮ３６９の構築 プラスミドｐＭＯＮ５０５ＤＮＡ　（２μ分）をＥｃｏ
ＲＩ（１０ユニツト）で消化し、４つのデオキシヌクレ
オチドトリフオスフェートの存在下に、Ｅ、　　ｃｏｌ
ｉ　　ＤＮＡポリメラーゼの大きなタレナラ（にｌｅｎ
ｏｗ）フラグメントで処理した。リガーゼ処理し、Ｅ、
　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４細胞を形質転換後、約５０
０のスベクチノマイシン耐性コロニーを（ｑだ。このう
ちの１２個７′Ｊ１ら試験用のプラスミドを得、ＥＣＯ
ＲＩで消化した。１２個のうち１個はＥＣＯＲ１部位を
欠いてあり、これを保存し、ｐＭＯＮ３６９（第１０図
〉と命名した。
ｅ、　ｐＭＯＮ３７３（７）１ｍ Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＧＭ４８　　ｄａｍ−細胞カラ得
うレるプラスミドｐＭＯＮ３６９　２０μｑを、Ｃ１！
ａＩの２０ユニツトｒ　ｈｇ化し、Ｎ０８−ＮＰＴ　Ｉ
Ｉ　’−ＮＯＳカナマイシン耐性遺伝子を有する１、５
ｋｂフラグメントをＮＡ−４５膜法により精製した。精
製したフラグメント（′１μＪ）を、あらかじめｃｚａ
　　ｒの２ユニツトで消化し、修生アルカリフオ゛スフ
ァターゼで処理したｐＭＯＮ３７１ＤＮＡ　　１μ９と
混合した。リガーゼ処理、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２
９４細胞を形質転換後、約８００個のアンピシリン耐性
コロニーを得た。これらのうちの１２個のコロニーから
試験用ＤＮＡを取り、次いでＣｊ！ａｌ及びＢＣＩ！Ｉ
ＩＴ−消化することにより、１．６ｋｂのフラグメント
及びそのオリエンテーションが分かった。正しい構造を
（ｑつこれらのプラスミドの１つを保存し、ｐ〜１ＯＮ
３７３（第１０図）と命名した。
ｆ、ｐＭＯＮ３７０の構築 プラスミドＩ）ＭＯＮ３４４（第５図）ＤＮＡ（１μ３
）を、ＡｈａＩＩＩのイソシゾマーである［）ｒａＩＴ
”消化し、合成ＣＡａ　　Ｉリンカ−（５’　ｐＣＡＴ
ＣＧＡＴＧ、　ＮｅＷ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ
、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ｆｖｌ　Ａ　）の４０ｒ＋ｇと
混合し、ＤＮＡリガーゼで処理した。リガーげ処理して
得られる混合物をＣｊ！ａ　　Ｉ（５０ユニツト）で消
化笹、得られたＤ　Ｎ　Ａフラグメントを、あらかじめ
ＣＩ！、ａＩで開裂し、仔牛アルカリフォスファターゼ
で処理したｐＭＯＮ３１６ＤＮＡ　（１μｑ）にに加え
た。リガーゼ処理、形質転換後、５００個のスベクチノ
マイシン耐性コロニーを得た。これらのうち１２個から
試験用ＤＮＡを取り、Ｃ−ｊｌａＩで消化した。これら
のプラスミドのうち１つは、ＥＣＯＲＩ及びＮＣ０ｊ！
部位を有する１ｋｂのＣｊ！ａ　　Ｉフラグメントを持
っていた。このプラスミドを保存し、ｐＭＯＮ３７０（
第１０図）と命名した。
Ｇ、ＤＭＯＮ３７４の構築 プラスミドｐＭＯＮ３７０ＤＮＡ　（５μｇ）をＣｊ！
ａ　　Ｉ（２０ユニツト）で消化し、あらかじめＣ１ａ
　　Ｉ（２ユニツト）で消化し、仔牛アルカリフォスフ
ァターゼで処理したｐ〜ＩＣ）Ｎ３７３ＤＮＡ０．２μ
ｑと混合した。リガーゼ処理、Ｌ　並置　ＭＭ　２９４
細胞を形質転換後、３００個のアンピシリン耐性コロニ
ーを得た。スペクチノマイシン感受性のコロニーのうち
の１２個のコロニーから、試験用ＤＮＡを調製した。６
個のコロニーは、１ｋｂのＣＩ！ａ　　Ｉフラグメント
を有していた。ＥｃｏＲＩによる消化により、これらの
プラスミドのうち４つが、第１２図に示す如きオリエン
テーションのＣｊ！ａ　　Ｉフラグメントを有していた
。このうちの１つを保存し、ｐＭ　ＯＮ　３７４と命名
した。
ｈ、ＤＭＯＮ５５０の構築 プラスミドｐ　Ｕ　Ｃｌ　９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｃ
ｒｒｏｎ　　ら、１９８５）ＤＮＡ　（１ａｇ）を、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ（２ユニツト）及びＥｃｏＲＴ（２ユニツ
ト）て消化し、合成りＮＡマルヂリン力−（＠１１図）
と混合した。リガーゼ処理、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＪＭ
１０１細胞の形質転換後、約５００個のコロニーを、ア
ンピシリン、Ｘｇａｌ及びＩ　ＰＴＧプ１ノート上で得
た。１２個の青いコロニーから試験用のＤＮＡを調製し
た。次いでＥＣ０ＲＩ。
ＢｇＩ　　ＩＩ　、　Ｎｃｏ　　Ｉ、　Ｓａｃ　　Ｉ　
　及びＨｉｎｄｒＩＩで消化した。これらの制限酵素の
認識部位を含む１つのプラスミドを保有し、ｐＭＯＮ５
５０　（第１１図）と命名シタ。
ｉ、ｐＭＯＮ３７５＋７）ｍＷ プラスミドｐ〜ｌ０Ｎ２４１４＜第１２図）ＤＮＡ　（
２０μｇ）を、ＮＣＯＩ（５０ユニツ１〜）で消化し、
クロラムフェニコール　アセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）をコードする配列を有する９４０ｂｐフラグメ
ントを、ＮＡ−４５膜法により精製した。このフラグメ
ント（２μ９）を、あらかじめＮＣＯＩ（５ユニツト）
で消化し、修生アルカリフォスファターゼで処理したプ
ラスミドｐ　Ｍ０１Ｎ５５０ＤさＩＡ（ｉμ９ンと混合
した。
リガーゼ処理、Ｅ、　　ｑｏｌｉ　　ｆｖｌＭ　２９４
ｊｌＡＰｆ＆の形質転換後、約５００個のアンピシリン
耐性コロニーを得た。このうちの１２個から試験用ＤＮ
Ａを調製した。同じ１２個のコロニーについて、２５μ
ｇ／ｄのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上で
クロラムフェニコール耐性をテストした。
これらのうち６個のコロニーはクロラムフェニコール耐
性であった。この６個は、第１２図に示したようなオリ
エンテーションで、ｐＭＯＮ　５５０でプラスミド中に
９４０ｂｐのＮｃｏ　　Ｔフラグメントを有していた。
このうちの１個を保存し、ρｆｔ／＋０Ｎ３７５と命名
した。
ｊ、ｐＭｏＮ３７７の構築 プラスミドｐＭＯＮ３７５ＤＮＡ　（５０μｇ）をＳａ
Ｃ■（５０ユニツト）、及び＋３Ｑｊ！ＩＴ（５０ユニ
ツト）で消化し、得られるＣΔＴコード配列を持つ９６
０ｂｐフラグメントをＮＡ−４５膜法により精製した。
このＢＱｊ！　　ＩＩ　−８ａｃ　　１フラグメント（
１μｇ）を、あらかじめＥ３Ｑｆ　　Ｉｆ　　＜５ユニ
ツト）及びｓ　Ｂ　Ｃ丁／　３−１　ニット）で消化し
たｐＭ　ＯＮ　３７４　Ｄ　Ｎ　Ａ　　１μｑと混合し
た。リガーゼ処理、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４細
胞の形質転換後、アンピシリン耐性コロニーを得た。こ
れらのコロニーについて、２５μＪ／ｄのクロラムフェ
ニコールに対する耐性をテストした。これらの１２個か
ら試験用のＤＮＡをＩＩし、ＢＯｊ！ＩＩ及びＳａｃ　
　Ｉ消化により、９６０ｂｐのＣＡＴフラグメントの存
在を分析した。これらのうち１つのプラスミドが正しい
構造（第１２図）を示し、これを保存し、ρＭＯＮ３７
７と命名した。
ｋ、　ｐＭＯＮ３７６の構築 プラスミドｐＭＯＮ３４４　（第５図及び１３図）ＤＮ
Ａ　（５μ９）をＳｍａ　　Ｉ（ｉＱユニ’ｚト）及び
ＡＳＵ　　ＩＩ　　（１０ユニツト）で消化し、ＤＮＡ
ポリメラーゼの大きなりレナウ（Ｋｌｅｎｏ＋ｖ）フラ
グメントで処理した。リガーゼ処理、Ｅ、　　ｃｏｌｉ
ＭＭ２９４１胞の形質転換後、１個のアンピシリン耐性
コロニーを得た。試験用ＤＮＡを調製し、Ｓｍａ　　ｉ
、　Ｈ１ｎｄＩｒＩ、及びＳｐｈ　　Ｉでの消化により
、Ｓｍａ　■からＡＳＵＩＩのフラグメントの欠失を調
べた。正しい構造のものを保存し、ｐＭＯＮ３７６　（
第１３図）と命名した。
１、ｐ！ｖｌＯＮ３７８の構造 プラスミドｐＭＯＮ３７６ＤＮＡ　（２０μ９）をＨｉ
　ｎｄ　　ＩＩＩ（２０−１ニツト）及びＳａｃ　　Ｉ
（２０ユニツト）で消化し、１ｑられるＴＧＭＶ−Ａ２
．５ｋｂフラグメントをＮＡ−４５膜法により精製し、
あらかじめＨｉｎｄｌＩＪ及びＳａｃ　　Ｉで消化した
１）ＩＶＩＯＮ３７７ＤＮＡ　（１μｇ）と混合した。
リガーゼ処理及び形質転換後、アンピシリン耐性コロニ
ーを得た。１２個のコロニーから試験用ＤＮＡを調製し
、ｓａｃ　　Ｉ及び）１ｉｎｄｌＩＩ及びＥＣ０ＲＩで
消化した。このうちの１つのプラスミドが、正しい挿入
配列及び５．４ｋｂｌｋｌすれたところに２個のＥｃｏ
ＲＩ部位を有していた。これを保存しｐＭＯＮ３７８　
（第１３図及び第１４図）と命名した。
実施例７ 以下の実茄例は、中間体プラスミドｐ〜ｌ０Ｎ３７９か
らのプラスミドｐ　Ｍ　ＯＮ　３８０の構築を示すもの
である。ｐＭＯＮ３８０は、主たる知られたフレームは
すべて発現が防止されたＴ　Ｇ　Ｍ　Ｖ　−Δコンポー
ネントを持つ。ｐ〜１ＯＮ３８０は、フリーＤＮＡデリ
バリ−システムのネガティブコントロールとして有用で
あり、ＴＧ〜ＩＶ−ＡＤＮＡは、形質転換された植物中
では複製不能になっている。
ａ、ｐＭＯＮ３７９の構築 プラスミドｐｔｖｌＯＮ３７６ＤＮＡ　　１μ分をＣｊ
！ａＩ（２，：＋−ニツ［〜）及びＢａｍＨＩ（２ユニ
ツト）で浦化し、［）ＮＡポリメラーゼの大きなりレナ
ウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントで処理した。リガーゼ
処理、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４細胞の形質転換
後、アンピシリン耐性のコロニーを得た。１２個のコロ
ニーから試験用のＤＮＡをの調製した。次いで、欠損誘
導体を開裂する３ａｍ）（Ｉで消化し、ざらにＥ、　　
ｃｏｌｉ　　ｆｖｌＭ　２９４に似たｄａｍ“細胞中か
ら得られるＣｊ！ａ　　Ｉであって、目的とする欠−１
３１’− 損誘啓体は開裂しないＣ１ａ　　Ｉで消（ヒし、次いで
）−１ｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃ　　Ｉで消化して、約１
．９ｋｂの欠損フラグメン１〜を同定した。プラスミド
の１つはこれらの特徴を有しており、保存し、１）ＭＯ
Ｎ３７９　（第１５図）と命名した。
ｂ、ｐＭＯＮ３８０の構築 プラスミドｐＭＯＮ３７９ＤＮ−Ａ　（２０μり）を５
ｃａｎ　　Ｉ（２０ユニツト）及びＨｉｎｄｌＩＩ（２
０ユニツ１〜）で消化し、得られる１、９ｋｂフラグメ
ン１〜をＮ　Ａ　−４，５膜法により精製した。フラグ
メント（３μｇ）を、あらかじめ３ｃａ　　Ｉ（２ユニ
ツト）及びＨｉ　ｎｄ　　ＩＩＩ（２］ニツト）で消化
したＤＭＯＮ３７７ＤＮＡ　　１μびと混合した。リガ
ーゼ処理、形質転換後。アンピシリン耐性のコロニーを
得た。１２個のコロニーから試験用のＤＮＡを調製し、
１．９ｋｂのＳａｃ　　ｌ−Ｈ１ｎｄＩＩフラグメント
の存在を分析した。１つのプラスミドがこの構造を示し
、これを保存し、ｐＭＯＮ３８０　（第１５図）と命名
した。
実施例８ 以下の実Ｍ１例は、フリーＤ　Ｎ　Ａデリバリ−システ
ムのベクターどして有用なりｌｖ［）Ｎ３７８を、Ｔｉ
テ゛リバリーシステム用の植物プラスミドベクターとし
て有用なｐＭＯＮ３８２に変換させるための、各種中間
体ベクターの構築を示すものである。特に、ｌ）　ＭＯ
Ｎ　３７８中にある１）ＵＣＤＮＡ配列をρＭＯＮ５０
５ＤＮＡ配列で置換した。
ａ、ｌ）ＭＯＮ５２１の構築 プラスミドｐ　Ｍ　ＯＮ　５０５　Ｄ　Ｎ　Ａ　（１μ
ｇ）をＸｍａ　　Ｉ（２ユニツト）で浦化し、ＤＮＡポ
リメラーゼの大きなりレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメ
ント処理した。リガーゼ処理、Ｊ〜１１ｏ１細胞の形質
転換後、８０個のスペクチノマイシン耐性コロニーを得
た。１２個のコロニーから試験用のＤＮＡを調製した。
次いで３ｍａ　　Ｉで消化してＳｍａ　　Ｉ（Ｘｍａ　
　Ｉ）部位の欠失を調べた。１つのコロニーが３ｍａ　
　１部位を欠失しており、これを保存し、ｐＭＯＮ５２
１　（第１６図）と命名した。
ｂ、ρＭＯＮ３／２の構築 プラスミドｐＭＯＮ　１２０　（Ｆｒａｌｅｙら、１９
８３）ＤＮＡ　（２０μｙ）をＳｔｕ　　Ｉ（２０ユニ
ツト）及びＥｃｏＲＩ（２０ユニツト）で消化し、Ｓｔ
ｕ　　Ｉ（２ユニツト）及びＥｃｏＲＩ（２ユニツト〉
で消化したｔ）ＭＯＮ５２１　１μ９と混合した。リガ
ーゼ処理後、混合物を３ｍａ　Ｉで消化、Ｅ、　　ｃｏ
ｌｉ　　ＭＭ２９４の形質転換に用いた。４００個以上
のスペクチノマイシン耐性のコロニーを得た。これらの
１２個のコロニーから試験用ＤＮＡを得、Ｓｍａ　　１
部位の欠失、及び第二番目の３ａｍｌ−Ｉ　　Ｉ部位の
欠失による１゜６ｋｂのＮ０８−ＮＰＴ　ＩＩ　’−Ｎ
ＯＳフラグメントの欠損をスクリーニングした。これら
のうち１つが正しい構造を示し、これを保存し、ｐＭＯ
Ｎ３７２（第１６図）と命名した。
ｃ、、ＤＭＯＮ３８１の構築 プラスミドｐＭＯＮ３７７ＤＮＡ　（２０μ９）をＳａ
ｃ　　Ｉ（２０ｔニツト）及びＥＣＯＲＩ（２０ユニツ
ト）で消化し、ＮＡ−４５膜法により、３　、５　ｋｆ
＞フラグメン１を精製した。精製したフラグメンｌ−５
μ９を、あらかじめＥｃｏＲＩ（２ユニツト）及び３ａ
ｃ　　Ｉ（２ユニツト）で開裂せしめＤＮＡＮカリゼ処
理したｐ〜１ＯＮ３７２ＤＮＡ１μびと混合した。Ｅ、
　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４細胞を形質転換後、約１０
０個のスベクチノマイシン耐性コロニーを得た。これら
の１２個のコロニーから試験用ＤＮＡを調製し、ＥＣＯ
ＲＩ及び３ａｃ　　Ｉで消化し、３．５ｋｂの挿入部（
ヴが確ル２された。この挿入部位を有する１つのプラス
ミドを保存し、ｐＭＯＮ３８１　（第１７図）と命名し
た。
ｄ、ｔ）ＭＯＮ３８２の構築 プラスミドｐＭＯＮ３７６ＤＮＡ　（２０μび〉をＨｉ
　ｎｄ　　ＩＩＩ（２０−Ｌニット）及び３ａｃ　　１
（２０ユニツ１〜）で消化し、得られる２、５ｋｌ）フ
ラグメン１〜をＮ　Ａ　−４５膜法により精製した。こ
のフラグメント２μＪを、あらかじめ Ｈｉ　ｎｄ　　ＩＩＩ（２ユニツト）及び５ａｃｒ（２
］−ニラ１〜）で開裂したｐＭＯＮ３８１ＤＮ△（１μ
９）と混合した。リガーゼ処理、Ｅ、　　ｃｏｌｉ：〜
１〜１２９４１！１１胞を形質転換後、スペクチノマイ
シン耐性コロニーを得た。これらのうち１２個のコロニ
ーから試験用ＤＮＡを調製し、これをＨｉｎｄｌＩＩ及
び３ａｃ　　ｌで消化することにより、２．５ｋｂの挿
入部位の存在が示された。この１つのプラスミドを保存
し、ρ１ｖｌＯＮ３８２（第１７図及び第１８図）と命
名した。
実施例９ 以下の実施例は、Ｔｉプラスミドデリバリ−システムの
ネガティブコントロールとして用いられるベクターの構
築を示す。特に、ｌ）ＭＯＮ３８３は、Ａｌ−１，Ａｌ
２及びＡｌ３の転写解読枠が除かｈたＴＧＭＶ−Ａ　　
ＤＮＡを持つ。
ａ　、　ＯＭ　ＯＮ　３８３　（７）構築プラスミドｐ
ＭＯＮ、３７９ＤＮ△（２０μｇ）をＨｉｎｄ　　ＩＩ
Ｉ（２０ユニツト）及びＳａｃ　　Ｉ（２０ユニツト）
で消化し、得られる１、９ｋｂのフラグメントをＮ　Ａ
　−４，５Ｂ！ｒ！法により精製した。
この１．９ｋｂのフラグメン１〜２μ９を、あらかじめ
Ｈｉ　ｎｄ　　ＩＩＩ（１ユニツト）及び３ａｃ　　Ｉ
（２ユニット）で消化したｌ）ＭＯＮ３８１ＤＮＡ　　
’１μグと混合した。リガーゼ処理、Ｅ、　　ｃｏｌｉ
　　Ｍ〜１２９４細胞を形質転換後、スペクチノマイシ
ン耐性コロニーを得た。これらのうち１２個のコロニー
から試験用ＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄＩＩＴ及びＳａｃ
　　Ｉでの消化により、１．９ｋｂの挿入部位の存在が
示された。この１つのプラスミドを保存し、ｐＭＯＮ３
８３　（第１９図）と命名した。
実施例１０ 以下の実施例は、コート蛋白遺伝子の代わりに、ＣＡＴ
遺伝子を有するＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡが挿入され、Ｔ
ＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡは直接反復ＤＮＡセグメントに接
しているｌ−ｉプラスミドからなるｐＭＯＮ４１７の構
築を示す。
ａ、　ｐＭＯＮ３３３の構築 ｐＭＯＮ５５０　２μグをＢｇｊ！ＩＩ５ユニットで消
化し、仔牛アルカリフォスファターゼで処理し、あらか
じめＸｈｏＩ１１０ユニットで消化したｐＢＨ４０４２
μびと混合した。ＤＮＡリガーゼ処理、Ｅ、　　ｃｏｌ
ｉ　　ＭＭ３９４細胞を形質転換後、２００個のアンピ
シリン耐性コロニーを得た。１２個のコロニーを制限酵
素分析によりスクリーニングし、正しい構造を示す１個
を保存し、ＤＭＯＮ３３３　（第２３図）と命名した。
ｂ、ＣＭＯＮ４１４の構築 プラスミドｐＭＯＮ３３３ＤＮＡ　　５μびを、Ｅｃｏ
ＲＩ　　１０ユニツト、Ｘｈｏ　　ＩＩ　１０ユニツト
で消化し、仔牛アルカリフォスファターゼで処理し、次
いでＥｃｏＲ丁　１０ユニツト及びＢＱｊ！　　ＩＩ　
１０：ｉ−ニットで消化したｐｔＶＩ　ＯＮ　３７７Ｄ
ＮＡ　　５μ９と混合し、ＤＮＡリガーゼ処理し、Ｅ、
　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４細胞の形質転換に用いた。
１７３個のアンピシリン耐性コロニーから１２個のコロ
ニーをアルカリ細胞溶解に付し、制限酵素分析によりス
クリーニングした。正しい構造を示した１つのコロニー
を保存し、ｐＭＯＮ４１４（第２３図）と命名した。
Ｃ，Ｉ）ＭＯＮ３５１（７）構築 １）ＭＯＮ３４５ＤＮＡ　　２μ９をＥｃｏＲＩ５ユニ
ットで消化し、５倍に希釈し、次いでＤＮＡリガーゼで
処理して、Ｅ、製置　ＩＶＩ　Ｍ　２９４細胞を形質転
′！Ａ−ｔ！ｂめるために用いた。約２５０個のスベク
チ、ノマイシン耐性コロニーのうちの１２個から試験用
ＤＮＡを調製し、２．８ｋｂのＥＣＯＲＩフラグメント
の欠撓をスクリーニングした。フラグメントを欠いた１
つのコロニーを保存し、ｐＭＯＮ３５１　（第２４図）
と命名した。
ｄ、ＤＭＯＮ４１６の構築 ｐＭＯＮ４１４．ＤＮＡ　　５ｕｑを）−１ｉｎｄｌＩ
１１０ユニツト、及びＡｓｕ　　ＩＩ　ＩＣ）ｒ−ニッ
トで消化し、あらかじめＨｉｎｄ　　ＩＩＩ　　１０ユ
ニツト及びＡｓｕ　　Ｈ１Ｑユニットで消化したｐ　Ｍ
　ＯＮ　３４４５μｑと混合した。次いでＤＮＡリガー
ゼ処理し、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４１胞を形質
転換し、アンシピリン耐性菌を選択した。３００個のコ
ロニーのうち１２個をアルカリ細胞溶解に酊し、次いで
制限酵素分析を行なった。正しいパターンを示す１つの
コロニーを保存し、ｐ　Ｍ　ＯＮ　４１６（第２４図）
と命名した。
ｅ、ｐＭＯＮ４１７ｔＤ構築 ｐｌ還１ＯＮ３５’１Ｄ１ＮＡ　　　５μり：’ｉＥｃ
：ＯＲ１１０ユニツ１へで消化し、分生アルカリフォス
エートで処理し、ＤＮＡリガーゼの存在下に、ＥＣＯＲ
Ｉ　　１０ユニツトで消化した。　ｆｖｌ　ＯＮ　４１
６ＤＮＡ　　５μＵと混合した。リガーゼ処理、Ｌ　凹
　ＩＶＩ　ｌｖｌ　２９４細胞を形質転換後、３００個
のスペクヂノマイシン耐性コロニーを得た。これらのう
ち１２個のコロニーを制限酵素分析に付し、これらのう
ち正しいパターンを示す１つを保存し、ＯＭ○Ｎ４１７
　（１２４図及び第２５図）と命名した。
実ＡＩｊ例１ゴ 以下の実施例は、ＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡ配列あるいは
その部分からなる反ｌＤＮＡセグメン１−に直接接して
いる遺伝子であって、形質転換細胞にメトトレキサー１
〜ＶｆＩ性を付与しうる蛋白をコードするＤＮＡ配列が
発現することを可能にする遺伝子からなるｐＭＯＮ３５
４の構築を示す。
ａ、　ｐＭＯＮ８００（７）構築 ｐＭＯＮ５０５　（第５図）ＤＮＡ　　１０μσをＳｍ
ａ　　Ｉにより完全に消化し、次いでＮｄｅ　　Ｉで部
分的に消化して、得られる７、３ｋｂのフラグメントを
、ｐＢＲ３２２の０１９ｋｂのＮｄｅ　　Ｉ（ヌクレオ
チドＮｏ、　　２２９７）−１）ｒａ　　Ｉ（Ｎｏ、　
３２３２）フラグメントと混合した。ヌクレオチドＮｏ
、は、ス１〜クリア　（ＳｕｔｃｌｉＮ）　（１９７８
）の配列からのものである。リガーゼ処理、Ｊ　ＩＶＩ
　１０１１胞の形質転換後、これら２つの結合したフラ
グメントを有する１つのプラスミドを同定した。
このプラスミドを保存し、ＤＭＯＮ８００（第２６図）
と命名した。
ｂｌ）ｌｖｌＯＮ８０１の構築 オクトピンシンターゼ遺伝子及びオクトピンＴ−ＤＮＡ
　　ＴＬ右側のより広い配列を含む、ｐＴｉＡ６の３．
５ｋｂのＳｍａ　　Ｉ（ｎ、１１２０７＞−８ｔｕ　　
Ｉ（ｎ、１４６７５）フラグメン１〜を、ＤＭＯＮ８０
０の非反復配列３ｔｕ　　１部位に挿入した。ｐＴｉΔ
６はオクトピンタイプのＴｉプラスミドである。オクト
ピンシンターゼ遺伝子及びオクトピン丁−ＤＮＡ　　Ｔ
Ｌ右側のより広い−１４１’− 配列を含む相当するＤ　ＮＡフラグメントは、ｐＴｉＢ
６Ｓ３．　ｐＴｉＡＣＨ５あるいはｐＴｉ１５９５５の
ような他のオクトピンタイプのＴｉプラスミドからも得
ることができる。ヌクレオチドＮｏ、は、Ｂａｒｋｅｒ
ら（１９８３）、の配列からのものである。ＪＭ１０１
細胞を形質転換後、スベクチノマイシン耐性形質転換体
を選択し、正しい方向く第２６図）のｐＴｉＡ６フラグ
メントを有するクローンを同定した。このプラスミドを
ｐＭＯＮ８０１と命名した。
ｃ、ｐＭＯＮ８０９ キメラＮ０３−ＮＰＴ　ＩＩ　’　−ＮＯＳカナマイシ
ン耐性遺伝子をコード化するｐＭ　ＯＮ　８０１の１．
８ｋｂのＳｔｕ　　ｌ−Ｈｌｎｄ　　ＨＩフラグメント
を、キメラメトヒレキサ−１〜耐性遺伝子を持つ１．４
ｋｂのＳｔｕ　　Ｉ−Ｈｉ　ｎｄ　　ＩＩＩフラグメン
トと置換した。このキメラ遺伝子は、ｐＭＯＮ２９５（
第１２図）のＣａ〜ＩＶ　　３５８プロモーターと、そ
れに連結した、メトトレキサート耐性ｄｈｆｒ酵素をコ
ード化するマウスジヒドロ葉酸還元酸素を持つ６６０１
）ρのフラグメントからなる。ポリアゾニレ−ジョンシ
グナルは、ＮＯ３３’非翻訳領域から提供される。得ら
れるプラスミドをｐＭＯＮ８０９　（第２７図）と命名
した。
ｄ、ｐＭＯＮ３４７の構築 プラスミドｐＭＯＮ８０９．５μ７を ＨｉｎｄｌｌＩで洲化し、修生アルカリフォスファター
ゼで処理した。プラスミドｐｔｖｌＯＮ３４４ＤＮＡ　
　５１１９をＨｉｎｄＴＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ
で消化したｐＭＯＮ８０９ＤＮＡと混合し、ＤＮＡリガ
ーゼで処理し、受容能力のあるＥ、　　ｃｏｌｉ　　Ｍ
Ｍ２９４細胞の形質転換に用いた。
約１３０個のアンピシリン耐性コロニーを得た。
その１２のコロニーをアルカリ細胞溶解に付し、制限酵
素分析を行なった。正しい構造を示したプラスミドの１
つを保存し、ｐＭＯＮ３４７　（第２８図）と命名した
。
ｅ　、　Ｄ　Ｍ　ＯＮ　３５４　ＩＩ’）　１ｍ　ＺＥ
、　　ｃｏｌｉ　　０Ｍ４８　　ｄｃｍ−細胞から調製
されるｐ１’ｖｌ　Ｏ＋Ｎ　３４７　Ｄ　Ｎ　Ａの５μ
りを３ｔｕ［）１０ユニツ１〜で消化し、３ｍａ１１０
ユニットで消化したｐＭｃ１３４４　　ＯＮＡ　　５μ
グと混合した。ＤＮＡリガーゼ処理後、混合物をＭＭ２
９４細胞の形質転換に用いた。５０個のアンピシリンー
アクチノマイシン耐性コロニーを得、そのうちの１２個
のコロニーをアルカリ細胞溶解し、制限酵素分析に付し
た。正しい構造を示す１つのコロニーを保存し、ｐＭＯ
Ｎ３５４（第２８図）と命名した。
実施例１２ 以下ノ”Ｘ　ｋ　例ハ、ＥｃｏＲＩ１位に、ＴＧＭＶ共
通領域に隣接したＴＧＭＶ−Ａコンポーネントの完全な
コピーを挿入したｐ　Ｍ　ＯＮ　５０５ベクターからな
るｌ）ＭＯＮ３３７の構築を示す。この実施例１２は、
また、Ｔ　Ｇ　Ｍ　Ｖ共通領域を含まないＴＧＭＶ−Ａ
　　ＤＮＡ配列ニ隣接Ｌ　ｔｃ　Ｔ　Ｇ　Ｍ　Ｖ　−Ａ
コンポーネントの完全なコピーが挿入されたｐＭＯＮ５
０５ベクターからなるｐＭＯＮ３４１の構築を示す。各
種の中間体ベクターもまた記載されて５゛・る。
ａ、ｐｆｖｌＯＮ３３７の′Ｍ４築 ｐＭＯＮ３５１ＤＮＡ　　５μ９をＥＣＯＲ１１０ユニ
ツトで消化し、修生アルカリフォスファターゼで処理し
て、ＥｃｏＲ１１０ユニツトで消化したｐＢＨ４０４Ｄ
ＮＡ　　５μ９と、ＤＮＡリガーゼの存在下、混合した
。リガーゼ処理後、Ｅ、釦　ＭＭ２９４細胞を形質転換
し、５０周のスペクチノマイシン耐性コロニーを得た。
これらのうち１２個のコロニーを、制限酵素分析し、ｐ
ＭＯＮ３５１のＴＧＭＶ−Δ配列と同じ方向の、１）Ｂ
Ｈ４０４の２．６ｋｂ（７）ＴＧＭＶ−ＡＥＣＯＲＩフ
ラグメント〜が挿入された１つのコロニーを保存し、ｐ
ＭＯＮ３３７　（第２９図）と命名した。
ｂ、　　ｐＭＯＮ３４６　の４Ｍ　築 ｐＭＯＮ５０５　（第５図）ＤＮＡ　１０μグを、Ｈｉ
ｎｄｌＩＩで完全消化し、アルカリフォスファターゼで
処理し、次いでｌ−１ｉｎｄＩＩＩで消化したｐｌｖｌ
ＯＮ３４４ＤＮＡ　　１０μ９とともにリガーａ処理し
た。受容能力のあるＭ　ｌν１２９４細胞を形質転換し
、５０個のスベクチノマイシン耐性コロニーを得た。こ
のうち１２個のコロニーを制限酵素分析に付し、ｐＭＯ
Ｎ５Ｑ５に、ｐＭ　ＯＮ　３４４の２．６ｋｂの丁ＧＭ
Ｖ−Ａ　　Ｈｉ　ｎｄ　　ｌｌｌ７ラグメントが挿入さ
れた１つのコロニーを保存し、ｐＭ１ＯＮ３４６と命名
した。
ｃ、ｐＭＯＮ３３６の構築 １）ＭＯＮ３４６ＤＮＡ　　１０μ９を、ＥＣＯＲＩで
完全消化した。このＤＮＡをリガーゼ処理し、受容能力
のあるＭＭ　２９４細胞を形質転換し、５０個のスベク
チノマイシン耐性コロニーを得た。このうち１２個のコ
ロニーを制限酵素分析に付し、１，４ｋｂのＥｃｏＲＩ
フラグメントを欠失した１つのコロニーを保存し、ｌ）
ＭＯＮ　３３６（第３０図）と命名した。
ｄ、　ｐＭＯＮ３４１の構築 ＤＭＯＮ３３６の１０μ３を、ＥＣＯＲｒで消化し、ア
ルカリフオスファターげで処理し、次いでＤＮＡリガー
ゼの存在下、ＥｃｏＲＩ　　１０ニニットで消化した１
）ＢＨ４０４ＤＮＡ　　５μＪと混合した。リガーゼ処
理後、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ｆｖ１Ｍ２９４細胞を形質
転換し、５０個のスペクチノマイシン耐性コロニーを得
た。このうち１２個のコロニーを制限酵素分析に付し、
ｌ）ＭＯＮ３３６に、１）ＢＨ４０４の２．６ｋｂのＴ
ＧＭＶ　−ＡＥｃｏＲＩフラグメントが挿入された（ｐ
〜ｌ０Ｎ３３６のＴＧＭＶ−Δ配列と同じ方向）１つの
コロニーを保存し、ｐＭＯＮ３４１（第３０図）と命名
した。
実施例１３ 以下の実施例は、本発明の各種ジエミニウイルスベクタ
ーで形質転換した植物の創製及び選択を示す。この実施
例は、更に、本発明のジェミニウイルス植物プラスミド
を用いた、外来ＤＮＡ配列の植物での複製及び発現を示
す。
ａ、ペチュニア細胞の形質転換 表面滅菌したペチュニア［ペチュニア・ハイブリダ（Ｐ
ｅｊｌｌｎ！ａ　ｈｙｂｒ　ｉｄａ　）コの葉から、直
径６　ｍｍ（１／４インチ）の莱のディスクを１得た。
それを、Ｍ　Ｓ　１０．１寒天培地上で２日間培養し、
傷をつけた表面に、部分的に細胞壁が形成されるのを促
進ゼしめた。無毒化したｆ）ＴｉＢ６Ｓ３−８Ｅ及びｐ
ＭＯＮ３０５．ｐＭＯＮ３３７．ｐＭＯＮ３４１、ｐＭ
ＯＮ３５２．ｐＭＯＮ３５４．　ｐＭＯＮ３８２あるい
はｐＭＯＮ３８２のいずれかであって２８°Ｃでルリア
ブロース（Ｌｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ　）　Ｔ：　−晩生
前せしめ、ゆるやかに撹拌したものを含むＡ、　　ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞培地に、上記で得られる葉のデ
ィスクを沈めた。次いでディスクをバクテリアサスペン
ションから取り出し、乾かし、次いで、ＭＳ１０４寒天
培地に逆さまにして接種した。２゜３日後に、ディスク
を、１ｍｌあたり５０μｑのカルベニシリン、及び、ｐ
ＭＯＮ３０５．ｐＭＯＮ３３７、ｐＭＯＮ３４１．ｐＭ
ＯＮ３５２゜ｐＭＯＮ３８２あるいはｐ　ｔｖｌ　ＯＮ
　３８３で処理したディスク用には１ｍ（！あたり３．
ＯＯｕｇのカナマイシン：ｐＭＯＮ３５４で処理したデ
ィスク用には４５０μ９／１のメトトレキサートを含む
Ｍ　５１０４の選択培地に、移した。ｐＭＯＮ３５２あ
るいはｐ〜ｌ０Ｎ３５４で形質転換したディスクの選択
のために、５００μり／−のセフオドキシを培地に加え
た。
が取り、ＤＭＯＮ２００　、　ｐＭ　ＯＮ　３０５　。
１）　Ｍ　ＯＮ　３０８　、　ｐＭ　ＯＮ　３０９及び
ヘルパープラスミドｐＴｉＢ６ｓ３−８Ｅを含む Ａ、　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｒ４［１胞で、上記
したペチュニア細胞の場合と同様にして処理した。これ
らで形質転換された細胞から、実質的な包のカナマイシ
ン耐性カルスが得られた。
ｃ、ＤＮＡ分析 選択培地に移して４−１０日後に、全ＤＮＡを、Ｄｅｌ
ｌａｐｏｒｔａ　（１９８３）の方法により、葉のディ
スクから単離した。６個のディスクより、全量０．５■
の組織を得た。この切断されていないＤＮＡを、前記し
たサザーンプロットハイプリダイゼーション法により調
製した。３２Ｐ−ラベル化プローブを用いて、ｐＵｃ８
ＤＮＡ及びｒ　Ｇ　ｌｖｌ　Ｖ−△コンポーネントに特
異的な挿入部位を含むＤＮＡ複製体を、前記した方法に
より同定した。
ｄ、結果 ｐＭＯＮ３５２を含むＡＬｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで処
理された葉ディスクのサザーンプロット分析により、Ｔ
ＧＭＶ−Ａコンポーネント、アンピシリン耐性遺伝子を
含むｐＵＣ１８フラグメント及びＮ０８−ＮＰＴ　ＩＩ
　’−ＮＯ８遭伝子からなる約７．０キロベース（ｋｂ
）の自律的に複製した超らぜんｄ　Ｓ　−ＤＮＡ分子と
断定される部分にバンドが現われた。ｐＭＯＮ３５４を
含むＡ、　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで処理された葉デ
ィスクから調整されたＤＮＡについては、サザーンプロ
ット分析により、ＴＧＭＶ−Ａ−１ン＊−ネ’、ｉ’ｒ
−１ｐＵＣ１８（７）アンピシリン耐性遺伝子、及びＣ
ａＭＶ３５Ｓプロモーター並びにＤＨＦＲ−ＮＯＳコー
ド配列からなるＤＮＡ配列から構成される、約５，７ｋ
ｂの自律的に複製した超らせんｄｓ−ＤＮＡと断定され
る部分にバンドが現われた。
ｐＭＯＮ３８２を含むＡ　、　　ｔｕｍｅｆａＣｌ−但
態一テ％理しに葉ディスクから得たＤＮＡのサザーンプ
ロット分析により、Ｔ　Ｇ　ｔｖｌ　Ｖ　−Ａ　　Ｄ　
Ｎ　Ａ配列、Ｎ０３−ＮＰＴ　　ＩＩ　’　−ＮＯ８ｍ
伝子及公子ａｔｖｌＶ３５Ｓ−ＣＡＴｍ伝子か公子る、
約４．５ｋｂの自律的に複製した超らせんｄｓ−ＤＮＡ
と断定される部分にバンドが坦われた。
４．６ｋｂのバンドは、ＣΔ丁あるいはＮ０３−ＮＰ丁
ＩＩ　’　−ＮＯ３ＤＮＡ配列に特異的なプローブによ
っても検出された。更に、ｐＭＯＮ３８２を含む醪　ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｃｎｓで処理された葉ディスクから得ら
れるＤＮＡを、１３ｏｚ＋ｉあるいはＢａｍＨＩで消化
したものについてのＩナザーンプロット分析により、Ｂ
Ｑｊ！　ＩＩで消化したＤＮＡについては約４．６ｋｂ
のフラグメントを含むリニアーｄｓ−ＴＧＭＶ−Ａが、
Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ　Ｔ’　ｎ’５化したＤＮＡについて
は約２，８ｋｂ及び１，８ｋｂのフラグメントを含むリ
ニア＝ｄｓ−ＴＧＭＶ−Ａと判断されるバンドが現われ
、これによりｐＭＯＮ３８２ベクターから得られる自律
的に複製した植物プラスミドＤ　Ｎ　Ａの存在が確認さ
れる。
ｐ〜１ＯＮ３３７あるいはｏ　Ｍ　ＯＮ　３４１を含む
八、　　ｔｕｍｅｆａｃｉｃｎｓで処理された葉ディス
クから得られるＤＮＡのサザーンプロット分析により、
自律的に複製した。ＴＧＭＶ感染植物からの超らせんｄ
ｓ　−ＤＮＡ及びｓｓ−ＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡととも
に移動するバンドが珂われる。
上記した結果から、ベクターを含むジエミニウイルスは
、植物細胞中で外来ＤＮＡ配列を複製し発現せしめるこ
とが可能であることが、明らかに証明される。更に、こ
れらの外来ＤＮＡ配列は、それと置換されるジエミニウ
イルスゲノムＯＮ△配列と同じあるいはそれより大きい
（例えば４．３ｋｂ）ことも可能であり、また植物細胞
中での外来ＤＮＡ配列の複製及び／又は発現は、自由な
く例えば自律的な）、プラスミドＤＮＡ分子を含むジエ
ミニウイルスの複製の一部として起こり得ることが、上
記の結果より証明される。更に加えて、ジエミニウイル
スＤＮＡ、特にＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮへは、挿入された
外来ＤＮＡ配列を保持し・つつ、自己をクロモシーム及
び／又はＴ−ＤＮＡ配列から放出せしめて自律的にＤＮ
Ａ分子を複製できることが証明される。更にまた、ジエ
ミニウイルスのコート蛋白遺伝子の阻止及び／又は除去
によっては、ジエミニウイルスのコート蛋白をコードす
るＤＮＡ分子（例えばＴＧＭＶ−ＡＤＮＡ）の、形質転
換された植物細胞中での自律的複製の能力を妨げないと
いうことも証明される。
プラスミドＤＮＡ分子の自律的な複製という形での植物
内での外来ＤＮＡ配列の複製を証明する上記した実施例
のすべてにおいて、外来ＤＮＡ配列は、重複ＤＮＡ配列
に接している。これらの特に好ましい態様においては、
重？！！ＤＮＡ配列は、ジエミニウイルスＤＮＡ配列（
例えばＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡ）あるいはその部分から
構成される。
ｐｔｖｌ　ＯＮ　３４１　カ’Ｂ　ｍ導；ｃ！れるＴＧ
ＭＶ−ＡＤＮＡ分子の自律的′ＦＩＪ製の効果的な形態
から示されるように、重′ｆｉＤＮＡ配列におけるジエ
ミニウイルス（例えばＴＧＭＶ＞共通領域の存在は、プ
ラスミド形成に必須ではない。それ故、そこに外来ＤＮ
Ａ配列が挿入されたジエミニワイルスコート蛋白をコー
ドするＤＮＡ　（例えばＴ　Ｇ　ＭＶ　−ＡＤＮＡ）に
接するＤＮＡ配列は、充分な長さのいずれの重１ＤＮＡ
配列、及び染色体ＤＮＡ及び／又はベクターＤＮＡ分子
から自律的に複製したプラスミドＤＮＡの放出を促進す
る相当するＤＮＡ配列を含むことができる。これらのベ
クター分子の変化体及びそれから得られるプラスミドＤ
ＮＡ分子を構築することが可能であり、それらは、ここ
に記載した態様の等価物と考えられる。
実施例１４ 以下の実施例により、本発明のジエミニウイルスベクタ
ーの形質転換植物内での移動性、及びそのような移動性
を有するベクターが接種部位とは違う植物組織中で外来
ＤＮＡ配列を複製し発現することができることが示され
る。特に、ＣＡＴ遺伝子が挿入されたＴＧＭＶ−Ａ　　
ＤＮＡを含むｐＭＯＮ４１７を用いて、予めＴＧＭＶ　
−ＢＤＮΔで形質転換された植物の断片に、接種した。
野性型のＮ１ｃｏｔｉａｎａ　　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎ
ａ植物及び実施例１に示した方法によって合られる丁Ｇ
〜１−Ｂコンポーネントの縦列コピーを含む植物（Ｂ−
植物）を、いくつかの葉が現われるまで（２−４週間〉
土壌中で生育せしめた。この段階で、２−３つの葉を残
してかみそりの刃で茎を切って、それぞれの植物の上半
分を除いた。その後直ぐに、ｐＭＯＮ４１７を含むＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒ：ｕｍ　　（栄餐プレート上で生育）
を、滅菌つまようじを用いて、切った植物の茎の上に広
げた。萎黄病のスポットが、接種したＢ−植物の新しく
成長した葉に現われた時に（２−４週間）、葉の組織を
、野性型及びＢ−植物から取り、ＤＮＡ分析及びＣＡＴ
活性アッセイに付した。野性型の植物の茎からの葉は数
週間正常のままであった。
Ｄｅｌ　１ａｐｏｒｔａら（１９８］にＪ：って記載さ
れた方法を用いて、葉組織から全ＤＮＡを単離した。
この非切断ＤＮＡを、０．８％（Ｗ／Ｖ　）　アカロー
スゲル電気泳動に付し、ニトロレルロース上に塗布し、
サザンプロット法により、ＴＧＭＶ−Ａコンポーネント
に特異的なプローブにハイブリダイズさせた。自費的に
複製した１本鎖及び２７Ｆ、鎖の形態のＴＧＭＶ−Ａコ
ンポーネントに関連したバンドとのハイブリダイゼーシ
ョンが、その茎に接種したＢ−植物の葉からのＤＮＡで
観察された。
また、その茎に接種された野性型の植物の葉からのＤＮ
Ａでは、ハイブリダイゼーションは観察されなかった。
この結果から、外′５Ｆ！、遺伝子（例えばＣＡＴ）を
含むＴ　Ｇ　Ｍ　Ｖ　−Ａコンポーネントは、自律的に
複製することができ、またＢ−コンポーネントが絹み込
まれたコピーを含む植物の細胞から細胞へ移動できるこ
とが判る。
更に、自律的複製及び外来ＤＮＡ配列の移動性に加えて
、本発明のベクター（よ、植物中で外来ＤＮＡ配列を発
現することが示された。特に、１ｖｌＯＮ４１７を含む
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで茎に接種された野性型及
びＢ−植物からの葉の組織について、前記した方法によ
り、ＣＡＴ活性をアッセイした。野性型の植物の揚台に
は、低レベルのＣＡＴ活性が検出され、一方、Ｂ−植物
の場合には、高レベルのＣＡＴ活性（例えば約１０−３
０倍〕が検量された。野性型の植物の場合における低レ
ベルのＣＡＴ活性は、野性型植物細胞内の内因性のＣＡ
Ｔ活性から生じたものか、あるいはｐ’ｆｖｌＯＮ４１
７を含む八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎ　ｋ：よル二次
的汚染により生じたものであり、それ故に、低レベルの
ＣＡＴ活性は、八ｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｍにおける内
因性のＣＡＴ活性あるいは染色体に組み込まれたＣＡＴ
ｉ伝子に公子ＣＡＴの生成を反映したものである。ＣＡ
Ｔ３１伝子が挿入されたＴＧＭＶ−ＡＤＮＡを含むプラ
スミドＤＮＡの、Ｂ−植物の葉における存在は、有意に
高いレベルのＣＡＴ活性と関連している。しかしながら
またこのことによって、Ｂ−植物のみが、プラスミドＤ
ＮＡ分子中中に保持されたＣＡＴｉ仏子を発現している
ことが示される。これらの結果の創１ま大ぎく、次のこ
とが証明される。すなわち、本発明のジエミニウイルス
ベクターは、自律的に複製したＤＮＡ分子（例えばプラ
スミド）に含まれる外来ＤＮＡ配列を複製し発現するこ
とができる、そしてこれらのプラスミド分子の生成によ
って、新規ベクターで形質転換された植物において、遺
伝子に特異的な物質の生産が増幅される、モしてＴ　Ｇ
　Ｍ　Ｖコート蛋白プロモーターが、外来ＤＮＡ配列の
発現を引き起こすことができる、そしてＴＧＭＶ−△と
ＴＧＭＶ−Ｂの存在は、本発明のベクターによる形質転
換の結果生ずるプラスミドＤＮＡ分子のシステミツク（
ｓｙｓｔｅｍｉｃ）な移動には必要である。
引用文献 Ｅ、　Ｃｏ１ｔ　Ｋ　１２株のＤＮＡアデニンメチル化
変異株の特徴：　Ｂａ１ｅ、八、、ｄ゛八へａｒｃａｏ
、　）１．及びＨａｒｉｎｕｓ、　Ｈ，Ｇ；　（１９７
９）　Ｈｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ、　５９゜１５７−１
６５゜ Ｂ１１１ｒｋｅｒら；　　（１９８３）　Ｐｌａｎｔ　
Ｈｏｔ、　　Ｂｉｏｌ、２　。
３３５゜ 植物の形質転換のためのバイナリ−・アグロバクテリウ
ム命ベクター；Ｂｅｖａｎ、　Ｈ，Ｗ、：　（１９８４
）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２．８７１１−
８７２１トマト・ゴールデン・モザイク・ウィルスの二
つのＤＮＡコンポーネントの分子クローニング及び特ｍ
　：　Ｂ１５ａｒｏ、　Ｄ、　Ｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ、
　Ｗ、　Ｄ、　Ｏ，。
ｃｏｕｔｔｓ、　Ｒ，ｉｆ、　Ａ及びＢｔ」ｃｋ、　Ｋ
、　Ｗ、　　（１９８２）　：Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｃｌ
ｓ　Ｒｅｓ、１０．　４９１３−４９２２゜熱帯地方の
収穫物のジエミニウイルス疾患；Ｂａｃｋ、に、　Ｒ，
＜　１９８２）　Ｐｌａｒ＋ｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ　６６
゜２６６−２７０゜ ウィルスベクターを用いた植物中でのバクテリア遺伝子
の発現；　Ｂｒ１ｓｓｏｎ、　Ｎ、、　Ｐａｓｚｋｏｗ
ｓｋｉ、　Ｊ、。
Ｐｅｎ５ｗ１ｃｋ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒ
ｎ、　Ｂ、、　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ。
■、及びＨｏｈｎ、　Ｔ、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　
　３１０．５１１−５１４゜ 植物宿主ベクターシステム構築にお（プるジエミニウイ
ルスの可能性；　Ｂｕｃｋ、　Ｋ、　Ｗ、及びＣｏｕｔ
ｔｓ。
Ｒ，Ｈ，八、（１９８’３　　）　　Ｐｌａｎｔ　　Ｈ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ＢｉｏｌｏｇＶ２．３５１−３５
４゜ 大腸菌でのＫｌｅｂｓｉｅｌ　ｌａ窒素固定遺伝子のク
ロモシーム・インテグレーション；　Ｃａｎｏｎ、　Ｆ
、　Ｃ，。
Ｐｏｓｔｇａｔｅ、　Ｊ、　Ｒ，、及びＰｒｉｍｒｏｓ
ｅ、　Ｓ、　Ｂ、　　（１９８４）　Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｑｙ　８
０　、　２２７−２３９゜ バクテリア遺伝子工学の進歩；Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，ＩＡ
、。
Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、及びＲｏｔｂ、　Ｊ、　Ｒ，
（’７９８０）。
Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ。
再生植物及びその子孫における外来遺伝子の発現；　Ｄ
ｅＢｌｏｃｋ、　Ｈ，、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌ
ｌａ、　Ｌ、、　ＶａｎＨｃｎｔａｇｕ、　Ｈ，５ｈｅ
ｌｌ、　Ｊ、　Ｚａ＋ｎｂｒｙｓｋｉ、　Ｐ、　　（１
９３４）、ＥＨＯｏＪ、３．Ｌ６８１−１６８９゜植物
ＤＮＡのミニプレバレイジョン； Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ、　Ｓ、　Ｌ、、　Ｗｏｏｄ、　
Ｊ、及びＪ、Ｂ、（１９８３）　Ｖｅｒｓｉｏｎ　Ｉｌ
、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｏｒｔ
ｅｒ。
１、Ｎｏ、４．１９−２１゜ 植物細胞におけるバクテリア遺伝子の発現：Ｆｒａｌｅ
ｙ、　Ｒ，、Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、、　Ｈｏｒｓｃｈ、
　Ｒ，、５ａｎｄｅｒｓ。
Ｐ、、　Ｎ１ｃｋ、　Ｊ、　Ａｄａｍｓ、　Ｓ、、　Ｂ
ｉｔｔｎｅｒ、　Ｈ，。
Ｂｒａｎｄ、　Ｌ、、　Ｆｉｎｋ、　Ｃ，、Ｆｒｙ、　
Ｊ、、　Ｇａ１ｌｕｐｐｉ、　Ｊ。
Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｓ、、　Ｈｏｆｆｍａｎｎ、　Ｎ
、及びＷｏｏ、　Ｓ、　　（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８０．４８
０３−４８０７゜ ＳＥＶシステム：新規無毒化Ｔ１プラスミドベクター；
　Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、、　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、
　Ｇ、。
Ｈｏｒｓｃｈ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ、　
Ｄ、、　Ｎ１ｃｋ、　Ｊ、　Ｓ、。
Ｆｉｎｋ、　ｃ、　Ｌ、”、　ＨＯｒｆｍａｎｎ、　Ｎ
、　Ｌ、及び５ａｎｄｆ！ｒＳ、　Ｐ。
Ｒ，（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ（１１／　
　３．６２９−６３５゜ 植物ウィルスの地図；　ＦｒａｎＣｌ＜ｉ、　＋？、　
Ｊ、　Ｂ、。
）１ｉｌｎｅ、　Ｒ，Ｇ、及びＨａｔｔａｎ、　Ｔ、　
（１９８５）　、。
Ｖｏｌ、　　Ｉ　ｐＤ、３３−４６．　ＣＲＣＰｒｅｓ
ｓ、　　Ｉｎｃ、　　ＢｏｃａＲａｔｏｎ、　　　Ｆｌ
ｏｒｉｄａ。
植物のプロトプラストへのプラスミド伝達方法の比較；
　Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｊ、　Ｐ、、　Ｄｒａｐｅｒ、　
Ｄａｖｅｙ、　Ｈ。
Ｒ，、Ｃｏｃｋｉｎｇ、　　Ｅ、　　Ｃ，、Ｇａｒｔｌ
ａｎｄ、　　Ｉ（、Ｈ，八、。
Ｈａｒｄｉｎｇ、　Ｋ、及びＰｅｎｔａｌ、　Ｄ、　（
１９８４）　Ｐｌａｎｔａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、　　２５．１３５３−１３６５゜単子葉及び双子
葉植物細胞へのエレクトロポレーションにより導入され
た遺伝子の発現：　ｒｒｏｍｍ。
Ｈ，、Ｔａｙｌｏｒ、　Ｌ、　Ｐ、及びＷａｌｂｏｔ、
　Ｖ、、（１９８５）ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　八ｃ
ａｄ、　　Ｓｃｉ、、　　ｌｌ５Ａ、８　２　　、　５
　８　２　４　−５８２８゜ ジエミニウイルス；　Ｇｏｏｄｍａｎ、　Ｒ，Ｈ，（１
９８１）Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、５４　、９−２
１　。
プロトプラストマイクロインジェクション；−’Ｔ６１
　− Ｇｒｉｅｓｂａｃｈ、　　Ｒ，Ｊ、　　　（１９８３）
　　Ｐｌａｎｔ　　ＭｏｌｅＣｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、　　１　、　　Ｎｏ、　　４．　
３２−３７゜ベクターとしてカリフラワーモザイクウィ
ルスを用いた植物での外来ＤＮＡの増殖； Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、　Ｂ、、　Ｇａｒｄｎｅｒ、　
Ｒ，Ｃ，、５ｃｈａｅｆｅｒ、　Ｓ。
及び５ｈｅｐｈｅｒｄ、　Ｒ，Ｊ、　　（１９８１）　
Ｎａｔｕｒｅ　　２９４．７７３−７７６゜ ジエミニウイルスとしての、トマトゴールデンモザイク
ウイルスの特徴；　ｆｏａｍ　ｉ　ｌ　ｔｏｎ、し１．
　Ｄ、　０．。
５ａｎｃｌｅｒｓ、　Ｒ，Ｃ，、Ｃｏｕｔｔｓ、　Ｒ，
Ｈ，Ａ、及びＢ　ｕ　Ｃｋ　、　Ｋ　。
’ｔ１．　　（１９８１）　ＦＥＨ３Ｈｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　ＩＩ。
２６３−２６７゜ トマトゴールデンモザイクウイルスで感染した組織にお
ける新規ＤＮＡの同定：２つのコンポーネントウィルス
ゲノムの実証；　Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　Ｗ、　Ｄ。
０、、　Ｂ１５ａｒｏ、　Ｄ、　Ｈ，及びＢｕｃｋ、　
Ｋ、　Ｗ、　　（１９８２）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、１０．４９１０−４９１２゜クローン化ＤＮＡ
コンポーネントの感染による１重鎖植物ウイスルゲノム
の２裂性の証明；Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　Ｗ、　Ｄ、　０
．、　Ｂ１５ａｒｏ、　Ｄ、　Ｈ，、ｃｏｕｔｔＳ。
Ｒ，ｔ４．　Ａ、及びＢｕｃｋ、　Ｋ、　Ｗ、　　（１
９８３）　。
Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、　　Ｉｌ、　　７３８
７−７３９６゜トマトゴールデンモザイクウイスの感染
クローン化ＤＮＡコンポーネントの完全なヌクレオチド
配列：潜在性コード配列及び規則性配列；１１ａｍｉｌ
ｔｏｎ、　Ｗ、　Ｄ、　０．、５ｔｅｉｎ、　Ｖ、　Ｅ
、、　Ｃｏｕｔｔｓ、　Ｒ。
Ｈ，Ａ、及びＢｕｃｋ、　Ｋ、　Ｗ、　　（１９８４）
　、　Ｔｈｅ　ＥＨＢＯＪ、３．２１９７−２２０５゜ １１ａｕｐｔｍａｎｎ、　Ｒ，及びＷｉｄｈｏｌｍ、　
Ｊ、　　（１９８２）Ｊ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、　　７０．３０−３４゜Ａ（ｌｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｌＪｍ　ｔｕｍｃｔ’ａｃｉｅｎｓ　Ｔｉ−プラスミド
のｖｉｒ−及びＴ−領域の分離に基づくバイナリ−植物
ベクターの用法；　ｌｌｏｃｋｃｍａ、　Ａ、、　Ｈｉ
ｒｓｃｈ、　Ｐ。
Ｒ，、Ｈｏｏｙｋａａｓ、　Ｐ、　Ｊ、　Ｊ、及び５ｃ
ｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ、　Ｒ。
Ａ、　　（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　　３９３　、１
７９−１８０゜ 植物における機能的外来遺伝子の継承：Ｈｏｒｓｃｈ、
　Ｒ，Ｂ、、　Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、、　Ｒｏｇｅ
ｒｓ、　Ｓ、　Ｇ、。
５ａｎｄｅｒｓ、　Ｐ、　Ｒ，、Ｌｌｏｙｄ、八、及び
肋ｒｆｍａｎｎ、　Ｎ。
１、、　　（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３．４９
６−４９８゜ 遺伝子を植物に導入する簡単で一般的な方法；Ｈｏｒｓ
ｃｈ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｆｒｙ、　Ｊ、　Ｅ、、　Ｈｏｆ
ｆｍａｎｎ、　Ｎ、　Ｌ、。
Ｗａｌｌｒｏｔｈ、　Ｈ，、Ｅｉｃｈｈｏｌｚ、　Ｄ、
、　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、　Ｇ、及びＦｒａｌｃｙ、　
Ｒ，Ｔ、　　（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７゜
１２２９−１２３１゜ ビーンゴールデンモザイクウイルスのヌクレオチド配列
及びジエミニウイルスの遺伝子規則のモデル；　Ｈｏｖ
ａｒｔｈ、　Ａ、　Ｊ、、　Ｃａｔｏｎ、　Ｃ，、Ｂｏ
ｓｓｅｒｔ、　Ｈ。
及びＧｏｏｄｍａｎ、　Ｉｔ、　Ｈ，（１９８５）　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　８２．３５７２−３
５７６゜メイズストリークウィルス（Ｋｅｎｙａｎ分離
）ゲノムＩ７）構造及び遺伝予相ｆ、　；　Ｈｏｖｅｌ
ｌ、　Ｓ、　Ｉｆ、　　（１９８４）　　Ｎｕｃｌ、　
　八ａｉｄｓ　　Ｒｅｓ、１　２．　７３５９　−７３
７５゜ 植物ＤＮＡウィルスの分子生物学；　ＨｏＷｅｌｌ、　
Ｓ。
Ｈ，（１９８５）　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　ｒｅｖｉ
ｅｗｓ　１ｎｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　　２．
２８７−３１６゜早くかつ効果的なコスミドクローニン
グ；　ｌ５ｈ−ＨＯｒＯＷｉＣＺ、　［）、及びＢｕｒ
ｋｅ、　Ｊ、　Ｆ、　（１９８１）ＮＵＣｌ、Ａｃ１ｄ
ｓ　　Ｒｅｓ、９．　２９８９−２９９８゜制限酵素及
びメチラーゼの認識配列：　Ｋｅｓｓｌｅｒ。
Ｃ，、Ｎａｕｍａｉｅｒ、　Ｐ、　Ｓ、及びＷｏｌｆ、
　Ｗ、　（１９８５）Ｇｐｎｅ　　３３　、１−１０２
　。
ＴトープラスミドＤＮＡによる植物プロトプラストのイ
ンビトロ形質転換；にｒｅｎｓ、　Ｆ、　八、。
Ｈｏ１ｅｎｄｉｊｋ、　Ｌ、　Ｗｖｌｌｅｍｓ、　Ｇ、
　Ｊ、及び５ｃｈｌｉｐｅｒｏｏｒｔ、　Ｒ，Ａ、　　
（１９８２）Ｎａｔｕｒｃ２９６゜７２−７４゜ ＭａｎｉａｔｉＳ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔＳＣｈ、　Ｅ、
　Ｆ、及びＳａｍｂｒｏｏｋ。
Ｊ、　（１９８２）　Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉ
ｎｏ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎａＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ、　Ｎ。
Ｙ。
Ｐｕｒｉｆｉｃａｃｏ　ｅ　ｍｏｒｆｏｌｏｇｉａ　ｄ
ｏ　ｖｉｒｕｓ　ｄ。
ｍａｓａｉｃｏ　　ｄｏｕｒａｄｏ　　ｄｏ　　ｔｏｍ
ａｔｅｉｒｏ；　　Ｈａｔｙｉｓ、　　　Ｊ、　　　Ｇ
、。
５ｉｌｖａ、　Ｄ、　Ｈ，、０ｌｉｖｅｉｒａ、八、Ｒ
５及びｃｏｓｔａ、　Ａ。
Ｓ、　　（１９７５）　　Ｓｕｍｍａ　　Ｐｈｙｔｏｐ
ａｔｈｏｌ、１　　、　　２　６　７　−２７４、 メイズストリークウィルスＤＮＡのヌクレオチド配列；
　Ｈｕｌｌｉｎｃａｕｘ、　Ｐ、　Ｈ，、Ｄｏｎｓｏｎ
、　Ｊ、。
Ｈｏｒｒｉｓ−にｒｓｉｎｉｃｔ＋、　８．　Ａ、　）
１．、　ＢｏｕｌｔＯｎ、　Ｈ，１，及びｎａｖｉｅｓ
、　　Ｊ、　　Ｗ、　　　（１９８４）　　丁ｈｅ　　
ＥＨＢＯＪ、、３　　。
３０６３−３０６８゜ バクテリオファージＴ４のＤＮＡリガーゼ遺伝子の分子
クローニング：　Ｈｕｒｒａｙ、　Ｎ、　Ｅ、、　Ｂｒ
ｕｃｅ。
Ｓ、　Ａ、及びＨｕｒｒａｙ、　Ｋ、　（１９７９）　
Ｊ、　Ｈｏｌ。
８１０１．１３２．４９３−５０５゜ 直接遺伝子導入技術の現状及びその将来性：Ｐｏｔｒｙ
ｋｕｓ、　１．、５ｈｉｌｌｉｔｏ、　Ｒ，Ｄ、、　５
ａｕｌ、　Ｈ，Ｗ、及びＰａｚｋｏｗｓｋｉ、　Ｊ　（
１９８５）　Ｐｌａｎｔ　ＨｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ
ｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、　３．１１７−１２８゜形
質転換植物でのｍＲＮ△の初期翻訳中のりボゾームスギ
ャンニングの証明；　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、　Ｇ、。
Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、、　Ｈｏｒｓｃｈ、　Ｒ，Ｂ
、。Ｌｅｖｉｎｅ、　／ｌ。
Ｄ、、　　Ｆｌｉｃｋ、　　Ｊ、　　Ｓ、、　　Ｂｒａ
ｎｄ、　　Ｌ、　　八、、　　Ｆｉｎｋ、　　Ｃ，Ｆ、
。
Ｈｏｚｅｒ、　Ｔ、、　Ｏ’ＣｏｎｎｅｌＩ、　Ｋ、及
びサンダーズ、Ｐ。
Ｒ，（１９８５）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
ＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒ　　３．１１１−１１
６゜植物科学のバイオテクノロジーにお【プる、形質転
換植物での外来蛋白発現の要素についての調査；Ｒｏｇ
ｅｒｓ、　Ｓ、　Ｇ、、　０°Ｃｏｎｎｅ　ｌ　＋　、
に、　ＨＯｒＳＣｈ、　Ｌ　Ｂ及びＦｒａｌｅｙ、　Ｒ
，Ｔ、　　（１９８５）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ。
Ｎｅ”ｖＹｏｒｋ、　　　Ｎ、　　　Ｙ、、２１９−２
２６゜植物での頂転子尋入：Ｔｉプラスミドベクターを
用いた形質転換植物の製造；　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、　
Ｇ、。
Ｉｆ　ｏ　ｒ　ｓ　ｃ　ｈ　、　Ｒ、Ｂ及びＦｒａｌｅ
ｙ、　Ｒ，Ｔ、　　（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　　ｉ　１８Ｗｅ
ｉＳＳｂａＣｈ、　　Ｈ及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ、　　
Ａ、、　　ｅｄ、、　　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　６２７−６４０　。
異なる９種のダラム陰性バクテリアでの、広範囲宿主プ
ラスミドＲ，に２？！製領域及び安定な維持：Ｓｃｈｍ
ｉｄｈａｕｓｅｒ、　Ｔ、　Ｊ、及び１ｌｃｌｉｎｓｋ
ｉ、　Ｄ、　Ｒ，（１９８５）Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇＶ、１６４．４４６−４５５゜ 植物ゲノムに組み込まれたカリフラワーモザイクウィル
スの転写；　Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ、　Ｃ，Ｋ、、　Ｃａ
ｔｏｎ。
Ｊ、　Ｒ，、１ｌｏｕｃｋ、　Ｃ，Ｈ，及びＧａｒｄｎ
ｅｒ、　Ｉｔ、　Ｃ，（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏａｙ　
　１４０．２８１−２８８゜キツサバラテントウイルス
ＤＮＡのヌクレオチド配列；　５ｔａｎｌｅｌ／、　Ｊ
及びＧａ、ｙ、　Ｈｌ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ　　　
３０　ｌ　、　２６０−２６２゜５ｕｉＣｌｉｆｆ　（
１９７８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｊ’１．ＡＣａｄ。
Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、　　７５．３７３７−３７４１
゜クラウンゴール腫瘍のＴｉプラスミド配列の組み込み
及び組織；　Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ、　）１．　Ｆ、、　
Ｎｕｔｔｅｒ。
Ｒ，、Ｈｏｎｔｏｙａ、　Ａ、　Ｌ、、　Ｇｏｒｄｏｎ
、　Ｈ，Ｐ、及びＮｅ５ｔｅｒ、　Ｅ、　Ｗ、　　（１
９８０）Ｃｅｌｌ　　１９．７２９−７３９゜ キツサバラテントウイルスのポリアデニル化の転写及び
コート蛋白をコード化せしめる遺伝子の位置；　Ｔｏｗ
ｎｓｅｎｄ、　Ｒ，、５ｔａｎｌｅｙ、　Ｊ、、　Ｃｕ
ｒｓｏｎ、　Ｓ。
Ｊ、、　５ｈｏｒｔ、　Ｈ，Ｎ、　（１９８５）　ＥＨ
ＢＯＪ、　４．３３−３７゜ ｐＵＣプラスミド、突然変異によるＭｌ　３ｍｐ７誘導
システム及び合成ユニバーザルブライマーの配列決定；
　Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、及びＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　
　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　　１９　、２５９−２６８
　。
改良Ｍ１３ファージクローニングベクター及び宿主細胞
株：　Ｍ　１３　ｍ　ｐ　１８及びｐＵＣ１９ベクター
ノヌクレオチド配列：　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ
、　Ｃ，。
ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、及びＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　、
　（１９８５）Ｇｅｎｅ３３、　１０３−１１９゜ Ｍ１３誘導ベクターを用いたオリゴヌクレオチドの変異
：　ＤＮＡフラグメントの変異を起こす効果的及び一般
的方法；Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｈ，Ｊ　　及び５ＩＴｌｉｔ
ｈ。
Ｈ，（１９８２）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１
０．６４８７−６５００゜
【図面の簡単な説明】
以下の図面において、矢印は、５′末端から３′末端へ
の配列の方向を表わす。関係のある制限酵素部位のみが
示されている。マーク付けされたＤＮＡ領域は、図面上
の目的から付けられたものであって、スケールを表わず
ものではない。アンピシリン、クロラムフェニコール及
びスペクチノマイシン耐性遺伝子は、それぞれ、Ａｐ’
。 ｃｍ’　、ｓｐｃ　　で略記する。くねくねと曲った線
は、取り除かれた、相当する制限酵素部位を表わす。プ
ラスミドあるいはＤＮＡフラグメントの−１６９＝ トを表わす。斜線部分はｒ　Ｇ　Ｎｒ１°Ｖ共通領域を
表わし、その中の黒い部分は、高度に保持されたジ工に
Ｔ　Ｇ　Ｍ　Ｖ−△　ＤＮＡのタンデムコピーが挿入さ
れたｐＭＯＮ２００を含むｐＭＯＮ３０５の構築を示す
。ＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡは黒の太線で表４つのＴ　Ｇ
　Ｍ　Ｖ　−Ｂ　　Ｄ　ＮＡのコピーを持つｐＭＯＮ２
００を含むｐＭ　ＯＮ　３０８及びｐＭＯＮ３０９の構
築を表わす。黒い太線は、ＴＧＭＶ−Ｂ　　ＤＮＡを表
わす。 第３図は、共通領域が除かれたＴ、　Ｇ　Ｍ　Ｖ−△Ｄ
ＮＡを有するｐＭＯＮ３４９及び共通領域が除かれたＴ
ＧＭＶ−Ｂ　　ＤＮＡを有するｐ　Ｍ　Ｑ　Ｎ　３５０
の構築を示す。 第４図は、コインテグレイトＴｉプラスミドベクターで
あるｐＭＯＮ２００から得られる、バイナリ−Ｔｉプラ
スミドベクターｐＭＯＮ５０５の構築を示す。黒の３角
形で示されるＮＲＢは、ツバリンＴ−ＤＮＡのライト・
ボーダーを示す。黒塗りのＲＫ２は、バクテリアのｏｒ
ｉ領域及び接合伝達領域を示し、Ｏｒｉ下は伝達開始点
、Ｏｒ　：　Ｖは複製開始点を示す。下の横線は、ｐＭ
ＯＮ５０５の指示した部分の、制限酵素認識部位を示す
。Ｓｐｃ／５ｔｒＲは、スベクチノマイシン／ス１〜レ
ブトマイシン耐性遺伝子を示す。 第５図ｔよ、ｐＭＯＮ３０５から単離された２、５ｋｂ
の３ｃａ　　Ｉフラグメントが、Ｈｉｎｄ１１１部位に
挿入されているｐＬＪｃ１８プラスミドを含むｐＭＯＮ
３４４の構築を示す。斜線を引いた部分は、ＴＧＭＶ共
通領域を示り。 第６図は、ＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡのダイマーを、直接
的に繰り返すＤＮＡ配列として持つρＭＯＮ３５２の構
築を示す。ＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡは、黒い太線部分で
示され、斜線部分はＴＧＭＶ共通領域を示す。 第７図は、ｐＭＯＮ３５２における、同定された対応す
るＤＮＡコード配列を示す。 第８図は、ｐＭＯＮ３５２からのｐＭ１ＯＮ３６０のＳ
築を示す。黒い太線は、ＩＧ〜ＩＶ−ＡＤＮＡ配列を示
し、斜線部分はＴ　Ｇ　ＩＶＩ　Ｖ共通領域を示し、点
線はカナマイシン耐性遺伝子（ＮＯ８−ＮＰＴ　　ＩＩ
　’−ＮＯ３）を示す。 第９図は、Ｂｇｆｆ１１１部位にＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーターが挿入された陶工ｐｕｃｓプラスミドからなるｐ
ＭＯＮ３７１の構築を示ず。 第１０図は、ｐＭＯＮ３７３及びｐＭ　ＯＮ　３７０の
ａ築を示ず。ｐＭＯＮ３７０の黒い太線はＴＧＭＶ−Ａ
　　ＤＮＡを示し、斜線部分はＴＧＭＶ共通領域を示す
。 第１１図は、ｐＭＯＮ３７０から単離されたＣ１ａ　　
Ｉフラグメント上の１ｋｂのＴＧＭＶ−ＡＤＮ、Ａフラ
グメントが、Ｃ１ａ　１部位に挿入されりｐ　Ｍ　ＯＮ
　３７３　ヲ含むｌ）ＭＯＮ３７４（７）構築を示す。 また、１）ＵＣｌ３　　ＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩフ
ラグメントの代わりに、合成マルチリンカ−が挿入され
た修正ｐＵＣ１９を含む１）ＭＯＮ　５５０（７）構築
を示す。ｐＭＯＮ５５０上の黒い太線は、合成マルチリ
ンカ−を示す。 第１２図は、ｐＭＯＮ３７７の構築を示す。黒い太線は
ＣＡＴ　　ＤＮＡコード配列を示す。 第１３図は、ｐＭＯＮ３７８の構築を示づ゛。黒い太線
は、第１４図のＤＮへ配列６を表わす。斜線部分は、Ｔ
ＧＭＶ共通領域を示す。黒く太い丸印は、ＴＧＭＶコー
ト蛋白（ｃｐ）ポリＡＤＮＡシグナル配列を示す。 第１４図は、ｐＭｌ０Ｎ３７８の同定された相当づ−る
ＤＮＡ配列を示す。黒く太い丸印は、ＴＧＭＶコート蛋
白（ｃｐ）ポリＡ（ポリアゾニレ−ジョン）ＤＮＡシグ
ナル配列を示す。 第１５図は、Ｈｉ　ｎｄ　　ｌｌｌ−８ａｃ　　Ｉフラ
グメントの代わりに、Ｃｊ！ａＩ部位から１３ａｍｌ−
Ｉ　　Ｉ部位までが除かれたＴＧＭＶ−Ａ　ＤＮＡ（黒
い太線）が挿入されたｐＭＯＮ３７７を含むｌ）ＭＯＮ
３８０の構築を表わす。斜線部分はＴＧＭＶ共通領域を
表わす。 第１６図は、ＤＭＯＮ５０５からＸｍａ　Ｉ（３ｍａ　
　Ｉ）部位を除去し、その後、Ｎ０８−ＮＰＴ　ＩＩ　
’　−ＮＯ８ＤＮＡ配列を持つＳｔｕ　　Ｉ−ＥｃｏＲ
Ｉフラグメントの代わりに、ＤＭＯＮ１２０から得られ
る３ｔｕＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを挿入して得られ
るｐＭＯＮ３７２の構築を示す。 第１７図は、６００　ｂｐのＴＧ’ＭＶ−Ａ　　ＤＮＡ
を持つｐＭＯＮ３７７から得られる３、５ｋｂのＥｃｏ
Ｒ１部位からＳａｃ　　Ｉ部位までのフラグメントを、
ＥｃｏＲｌ−３ａｃ　　Ｉ部位に挿入したｐＭＯＮ３７
２からなるｐＭＯＮ３８２の構築を示す。ここで該ｐＭ
ＯＮ３８２は、Ｔ　Ｇ　ｆｖｌ　Ｖ共通領域（斜線部分
＞、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、及びＣＡＴ　　ＤＮ
Ａ配列を有し、コート蛋白コード配列のＣ末端を欠いた
ＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡを持つｐＭＯＮ３７６から得ら
れる５ａｃＩ−ｌ−１ｉ　ｎ　ｄ　　ＩＩＩ認識部位が
、３ａｃＩ−Ｈｉ　ｎ　ｄ　　ＩＩＩ認識部位に挿入さ
れている。 ｐＭｏＮ３８２における黒い太線ハＴ　Ｇ　Ｍ　Ｖ−Ａ
ＤＮＡ配列を示し、斜線部分はＴＧＭＶ共通領域を示す
。 −１７４＝ 第１８図は、相当するＤＮＡ配列が同定されたＤＭＯＮ
３８２を示す。 第１９図は、ｐＭＯＮ３７９の黒い太線のＳａｃ　　Ｉ
−Ｈｉ　ｎｄ　　ＩＩＩフラグメントが、３ａｃ　　Ｔ
−Ｈｉ　ｎｄ　　ＩＩＩフラグメントの代わりに挿入さ
れたｐＭＯＮ３８１からなるｐＭＯＮ３８３の構築を示
す。白い三角形は、ＴＧＭＶ−ＡＤＮＡからＣｊ！ａ　
　ｌ−Ｂａｍ１−１　１７ラグメントが除かれているこ
とを示す。斜線部分はＴ　Ｇ　Ｍ　Ｖ共通領域を示ず。 第２０図は、３ａｍＨ１部位に、ＣＬＶＤＮ△１の２，
６ｋｆｉのＢａｍ１−１　１７ラグメント（黒い太線）
が一方向に挿入されたｐＵＣｌ　８を含むｐＭＯＮａの
構築を示づ−０また、１３ａｍｌ−ＩＩ部位にＣＬＶ　
　ＤＮＡ１の２．６ｋｂの３ａｍｌ−ＩＩフラグメント
（黒い太線）が他の一方向に挿入されたＩ）ＵＣｌ　８
を含むＤＭＯＮｂの横築を示寸。 ＣＬＶ共通領域は、斜線部分で示されており、思い丸印
はポリＡシグナルＤＮＡ配列を示ず。 第２１図は、ｐＭＯＮｄから単離され、ｐ　ｆｖｌ　Ｏ
ＮｃのＥｃｏＲＩ部位に挿入された３５０ｂｐの領域（
黒い太線）を持つｔ）ＭＯＮｃを含む１）ＭＯＮ（！の
構築を示す。 第２２図は、ｐＭＯＮｂから単離され ｏＭＯＮｅのＳａｃ　　Ｉ−Ｈｉ　ｎｄ　　ＩＩＩ部位
に挿入された２、６ｋｂのＳａｃ　　Ｉ−Ｈｉ　ｎｄ　
　ＩＩＩフラグメント（黒い太線）を持つｐＭＯＮｅを
含むｐＭＯＮｆの構築を示す。斜線部分はＣＬＶ共通領
域を示し、黒い丸印はポリＡシグナルＤＮＡ配列を示す
。ｐＭＯＮｆにお（づる相当するＤＮＡ配列が示されて
いる。 第２３図は、ＴＧＭＶコート蛋白ブローモー及びＴ　Ｇ
　Ｍ　Ｖ共通領域を含むＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮＡのセグ
メント、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）ｍ転子が挿入されたＤＭＯＮ５０５
を含むｐＭＯＮ４１４の構築を示す。黒い太線はＴ　Ｇ
　Ｍ　Ｖ−Ａ　　Ｄ　Ｎ　Ａを示し、斜線部分はＴ　Ｇ
　Ｍ　Ｖ共通領域を示す。 第２４図は、黒い太線で示されるＴＧＭＶ−ＡＤＮＡの
セグメントにその両端が接しており点線で示されるＣＡ
Ｔ３ｉ１伝子が挿入されたｏ　Ｍ　ＯＮ　５０５を含む
ｏＭＯＮ４．１７の構築を示す。斜線部分はＴ　Ｇ　Ｉ
ＶＩ　Ｖ共通領域を示す。 第２５図は、相当するＤＮＡ配列が示されたｏＭＯＮ４
１７を表す。 第２６図は、ＤＢＲ３２２の複製開始点（ｏｒｉ）、オ
クトピンシンターゼ（ＯＣ８）遺伝子及び黒い三角形で
示されるオクトピン型Ｔ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー配
列（ＯＲＢ）が挿入されたｐＭＯＮ５０５を含むｐＭＯ
Ｎ８０１の構築を示す。 第２７図は、３５Ｓプロモ一ター配列（３５Ｓ）、ジヒ
ドロ葉酸レダクターゼコード配列（ｄｈｆｒ）及びツバ
リンシンターゼ３′非コード配列（ＮＯ８）で、Ｎ０８
−ＮＰＴ　ＩＩ　’　−ＮＯ８ＤＮＡフラグメントが置
換、されたｐＭＯＮ８０１を含むｐＭＯＮ８０９の構築
を示す。 第２８図は、３５８プロモーター配刊（３５Ｓ）、ジヒ
ドロ葉酸レダクターゼコート配列（ｄｈｆｒ）及びツバ
リンシンターゼコード配列（ＮＯ８）を含む発現カセッ
トであって、黒い太線で示されるＴＧＭＶ−Ａ　　ＤＮ
Ａに接している発現カセットが挿入されているｐ〜ｌ０
Ｎ５０５を含むＤＭＯＮ３５４の構築を示す。斜線部分
は共通領域を示す。 第２９図は、黒い太線で示されるＴＧＭＶ−ＡＤＮＡの
１．５コピーが挿入されたｐＭＯＮ５０５を含むｐＭＯ
Ｎ３３７ｆ７）構築を示す。ＴＧＭＶ共通領域は斜線部
分で示される。 第３０図は、黒い太線で示されるＴＧＭＶ−ＡＤ’Ｎ　
Ａの１．５コピーが挿入されｏＭＯＮ　５０５を含むＤ
ＭＯＮ３４１の構築を示ず。ＴＧＭＶ共通領域は、斜線
部分で示される。 第３１図は、植物ベクター（、ｐＭＯＮ３８２）で形質
転換された植物ａ眼内での、植物プラスミド（ｐＭＯＮ
３８２植物プラスミド）の生成を示す。黒い太線は、Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｒａｃｉｅｎｓ
Ｔ−ＤＮＡ　（Ｔ−ＤＮＡ）　、斜線部分はＴＧＭＶ共
通領域、ＣＡＴはクロラムフェニコールアセチルトラン
スフエラーゼをコードするＤＮＡ配列、３５ＳはＣａＭ
Ｖ３５ＳブローＥ−ター配列、Ｎ０８−ＮＰＴ　　ＩＩ
　’　−ＮＯ，Ｓはカナマイシン耐性をコードする遺伝
子、黒い丸印は、２つの方向性を有するＴＧＭＶ−Ａ　
　ＤＮΔポリアデニル化部化部点線は、重複ＤＮＡ配列
を示づ゛。

Claims (55)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）外来ＤＮＡ配列、及びコート蛋白をコードするジ
    エミニウイルスＤＮＡのセグメントであつて植物細胞中
    で植物プラスミドの自律的複製を可能にするセグメント
    を含む植物プラスミド。
  2. （２）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮＡ
    のセグメントが、バイナリージエミニウイルスＤＮＡか
    ら誘導されたものである特許請求の範囲第１項記載の植
    物プラスミド。
  3. （３）バイナリー・ジエミニウイルスが、ＴＧＭＶであ
    る特許請求の範囲第２項記載の植物プラスミド。
  4. （４）バイナリージエミニウイルスＤＮＡが、ジエミニ
    ウイルスのコート蛋白遺伝子を含む特許請求の範囲第２
    項記載の植物プラスミド。
  5. （５）外来ＤＮＡ配列が、ジエミニウイルスのコート蛋
    白遺伝子内に挿入されている特許請求の範囲第４項記載
    の植物プラスミド。
  6. （６）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮＡ
    のセグメントが、単一ゲノムジエミニウイルスから誘導
    されたものである特許請求の範囲第１項記載の植物プラ
    スミド。
  7. （７）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮＡ
    のセグメントが、ＴＧＭＶコート蛋白をコードするＴＧ
    ＭＶ−Ａ　ＤＮＡ配列を除いたＴＧＭＶ−Ａ　ＤＮＡで
    ある特許請求の範囲第１項記載の植物プラスミド。
  8. （８）外来ＤＮＡ配列が、目的とするポリペプチドをコ
    ードするＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第１項記載の
    植物プラスミド。
  9. （９）目的とするポリペプチドが、ネオマイシンホスホ
    トランスフエラーゼ、クロラムフエニコールアセチルト
    ランスフエラーゼ、テイツシユプラスミノーゲンアクチ
    ベータ、心房ペプチド、成長ホルモン、インシュリン様
    成長因子、ＥＰＳＰシンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクタ
    ーゼ及びウイルス抗原からなる群から選ばれたものであ
    る特許請求の範囲第８項記載の植物プラスミド。
  10. （１０）外来ＤＮＡ配列が、目的とするポリペプチドを
    コードする遺伝子を含む特許請求の範囲第１項記載の植
    物プラスミド。
  11. （１１）外来ＤＮＡ配列が、選択マーカーをコードする
    ＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第１項記載の植物プラ
    スミド。
  12. （１２）選択マーカーが、抗生物質耐性である特許請求
    の範囲第１１項記載の植物プラスミド。
  13. （１３）植物に、ジエミニウイルス疾患を引き起こさな
    い特許請求の範囲第１項記載の植物プラスミド。
  14. （１４）外来ＤＮＡ配列が、酵母及びバクテリアからな
    る群より選ばれたレプリコンを含む特許請求の範囲第１
    項記載の植物プラスミド。
  15. （１５）プラスミドＤＮＡを植物細胞中で生成するベク
    ターであつて、外来ＤＮＡ配列及びコート蛋白をコード
    するジエミニウイルスＤＮＡのセグメントで且つ植物細
    胞中で植物プラスミドの自律的複製を可能にするセグメ
    ントを含むベクター。
  16. （１６）プラスミドＤＮＡを植物細胞中で生成するベク
    ターであつて、外来ＤＮＡ配列及びコート蛋白をコード
    するジエミニウイルスＤＮＡのセグメントで且つ植物細
    胞中で植物プラスミドの自律的複製を可能にするセグメ
    ントからなる第１のＤＮＡセグメントを含むベクターで
    あり、該第１のＤＮＡセグメントに、植物ベクターから
    植物プラスミドの放出を可能にする第２のＤＮＡセグメ
    ントが接しているベクター。
  17. （１７）第２のＤＮＡセグメントが、コート蛋白をコー
    ドするジエミニウイルスＤＮＡのセグメントから誘導さ
    れる重複（ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｒｅｐｅａｔｉｎｇ）Ｄ
    ＮＡ配列を含む、特許請求の範囲第１６項記載のベクタ
    ー。
  18. （１８）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
    Ａのセグメントが、バイナリージエミニウイルスから誘
    導されるものである特許請求の範囲第１５項又は第１６
    項記載のベクター。
  19. （１９）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
    Ａのセグメントが、ＴＧＭＶ−Ａ　ＤＮＡから誘導され
    るものである特許請求の範囲第１５項又は第１６項記載
    のベクター。
  20. （２０）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
    Ａのセグメントが、単一ゲノムジエミニウイルスから誘
    導されるものである特許請求の範囲第１５項又は第１６
    項記載のベクター。
  21. （２１）外来ＤＮＡ配列が、目的とするポリペプチドを
    コードするＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第１５項又
    は第１６項記載のベクター。
  22. （２２）外来ＤＮＡ配列が、ネオマイシンホスホトラン
    スフエラーゼ、クロラムフエニコールアセチルトランス
    フエラーゼ、テツシユプラスミノーゲンアクチベーター
    、心房ペプチド、成長ホルモン、インシュリン様成長因
    子、ＥＰＳＰシンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ及
    びウイルス抗原からなる群から選ばれたポリペプチドを
    コードするＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第１５項又
    は第１６項記載のベクター。
  23. （２３）外来ＤＮＡ配列が、目的とするポリペプチドを
    コードする遺伝子を含む特許請求の範囲第１５項又は第
    １６項記載のベクター。
  24. （２４）外来ＤＮＡ配列が、選択マーカーをコードする
    ＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第１５項又は第１６項
    記載のベクター。
  25. （２５）外来ＤＮＡ配列が、抗生物質耐性をコードする
    ＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第１５項又は第１６項
    記載のベクター。
  26. （２６）植物にジエミニウイルス疾患を引き起こさない
    特許請求の範囲第１５項又は第１６項記載のベクター。
  27. （２７）第２のＤＮＡセグメントが、外来ＤＮＡ配列か
    ら誘導される重複ＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第１
    ６項記載のベクター。
  28. （２８）重複ＤＮＡ配列が、約５０から約６００ヌクレ
    オチドの長さである特許請求の範囲第１６項、第１７項
    又は第２７項記載のベクター。
  29. （２９）更に￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥　￥ｔｕ
    ｍｅｆａｃｉｅｎｓ￥　Ｔ−ＤＮＡを含む特許請求の範
    囲第１６項記載のベクター。
  30. （３０）酵母及びバクテリアからなる群から選ばれたバ
    クテリアレプリコーンを含むバクテリアプラスミドＤＮ
    Ａを、更に含む特許請求の範囲第１６項又は第３１項記
    載のベクター。
  31. （３１）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
    Ａのセグメントが、ジエミニウイルスのコート蛋白をコ
    ードするＤＮＡ配列を除いた、コート蛋白をコードする
    全ＤＮＡを含む特許請求の範囲第１５項又は第１６項記
    載のベクター。
  32. （３２）植物細胞中でプラスミドＤＮＡを生成するベク
    ターであつて、￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥　￥ｔ
    ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ￥　Ｔ−ＤＮＡ及び、そこに外来
    ＤＮＡ配列が挿入されたコート蛋白をコードするジエミ
    ニウイルスＤＮＡのセグメントを含むベクターであり、
    コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮＡの該セ
    グメントは植物細胞中でプラスミドＤＮＡの自律的複製
    を可能にし、そしてコート蛋白をコードするジエミニウ
    イルスＤＮＡの該セグメントが、コート蛋白をコードす
    るジエミニウイルスＤＮＡから誘導されたＤＮＡ配列で
    あつて且つ植物ベクターあるいは植物染色体ＤＮＡから
    プラスミドＤＮＡの放出を可能にするＤＮＡ配列に隣接
    しているベクター。
  33. （３３）ｐＭＯＮ３８２である特許請求の範囲第３２項
    記載のベクター。
  34. （３４）ｐＭＯＮ３７８である特許請求の範囲第３２項
    記載のベクター。
  35. （３５）ｐＭＯＮ４１７である特許請求の範囲第３２項
    記載のベクター。
  36. （３６）（ａ）植物細胞中でプラスミドＤＮＡを生成す
    るベクターであつて、以下の（ｉ）及び、（ｉｉ）を含
    むベクターで植物細胞を形質転換せしめ、 （ｉ）植物細胞中でプラスミドＤＮＡの自律的複製を可
    能にする、コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤ
    ＮＡのセグメント； （ｉｉ）目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ配
    列が挿入された発現カセット； 次いで、 （ｂ）形質転換植物細胞を、外来ＤＮＡ配列の発現が可
    能な条件下で培養する、 工程からなる、植物細胞中で目的とするポリペプチドを
    製造する方法。
  37. （３７）（ａ）プラスミドＤＮＡを植物細胞中で生成す
    るベクターであつて、コート蛋白をコードするジエミニ
    ウイルスＤＮＡのセグメントで且つ植物細胞中で植物プ
    ラスミドの自律的複製を可能にするセグメント及び目的
    とするポリペプチドをコードする遺伝子を含む外来ＤＮ
    Ａ配列からなる第１のＤＮＡセグメントを含むベクター
    であり、該第１のＤＮＡセグメントに、植物ベクターか
    ら植物プラスミドの放出を可能にする第２のＤＮＡセグ
    メントが接しているベクターを用いて、植物細胞を形質
    転換せしめ、 次いで（ｂ）形質転換植物細胞を、外来ＤＮＡ配列の発
    現が可能な条件下で培養する、 工程からなる、植物細胞中で目的とするポリペプチドを
    製造する方法。
  38. （３８）更に、形質転換植物細胞から目的とするポリペ
    プチドを回収する工程を含む特許請求の範囲第３６項又
    は第３７項記載の方法。
  39. （３９）第２のＤＮＡセグメントが、コート蛋白をコー
    ドするジエミニウイルスＤＮＡのセグメントから誘導さ
    れる重複配列ＤＮＡを含む特許請求の範囲第３７項記載
    の方法。
  40. （４０）第２のＤＮＡセグメントが、外来ＤＮＡ配列か
    ら誘導される重複ＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第３
    ７項記載の方法。
  41. （４１）外来ＤＮＡが、更に、選択マーカーをコードす
    るＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第３６項又は第３７
    項記載の方法。
  42. （４２）ジエミニウイルスＤＮＡのセグメントが、バイ
    ナリージエミニウイルスから誘導されるものである特許
    請求の範囲第３６項又は第３７項記載の方法。
  43. （４３）ジエミニウイルスＤＮＡのセグメントが、単一
    ゲノムジエミニウイルスから誘導されるものである特許
    請求の範囲第３６項又は第３７項記載の方法。
  44. （４４）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
    Ａのセグメントが、ＴＧＭＶから誘導されるものである
    特許請求の範囲第３６項又は第３７項記載の方法。
  45. （４５）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
    Ａのセグメントが、ＴＧＭＶコート蛋白をコードするＤ
    ＮＡ配列を除去した全ＴＧＭＶ−Ａ　ＤＮＡである特許
    請求の範囲第３６項又は第３７項記載の方法。
  46. （４６）目的とするポリペプチドが、ネオマイシンフオ
    スホトランスフエラーゼ、クロラムフエニコールアセチ
    ルトランスフエラーゼ、テツシユ−プラスミノーゲンア
    クチベーター、心房性ペプチド、成長ホルモン、インシ
    ュリン様成長因子、 ＥＰＳＰシンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ及びウ
    イルス抗原からなる群より選ばれたポリペプチドである
    特許請求の範囲第３６項又は第３７項記載の方法。
  47. （４７）ベクターが、更に、選択マーカーをコードする
    ＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第３６項又は第３７項
    記載の方法。
  48. （４８）（ａ）植物細胞のゲノムに以下の（ｉ）及び（
    ｉｉ）を含むプラスミドＤＮＡを挿入し； （ｉ）植物細胞中で自律的複製を可能にするセグメント
    であつてコート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
    Ａのセグメント； （ｉｉ）目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を
    含む外来ＤＮＡ配列； （ｂ）形質転換植物細胞を得る； （ｃ）促進された量の目的とするポリペプチドを生成し
    得る形質転換植物を、形質転換植物細胞から再生する； 工程からなる、促進された量の目的とするポリペプチド
    を生成し得る遺伝子的形質転換植物を製造する方法。
  49. （４９）プラスミドＤＮＡが、特許請求の範囲第３６項
    又は第３７項の方法により、植物細胞に挿入される特許
    請求の範囲第４８項の方法。
  50. （５０）遺伝子的形質転換植物に、ジエミニウイルス疾
    患を生ぜしめない特許請求の範囲第４８項の方法。
  51. （５１）目的とするポリペプチドが、クロラムフエニコ
    ールアセチルトランスフエラーゼ、テイツシユプラスミ
    ノーゲンアクチベーター、心房性ペプチド、成長ホルモ
    ン、インシュリン様成長因子、ＥＰＳＰシンターゼ、ジ
    ヒドロ葉酸レダクターゼ及びウイルス抗原からなる群よ
    り選ばれたポリペプチドである特許請求の範囲第４８項
    記載の方法。
  52. （５２）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
    Ａのセグメントが、バイナリージエミニウイルスから誘
    導されるものである特許請求の範囲第４８項の方法。
  53. （５３）バイナリージエミニウイルスが、ＴＧＭＶであ
    る特許請求の範囲第５２項の方法。
  54. （５４）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
    Ａのセグメントが、ＴＧＭＶコート蛋白をコードするＤ
    ＮＡ配列を除去した全ＴＧＭＶ−Ａ　ＤＮＡである特許
    請求の範囲第４８項の方法。
  55. （５５）コート蛋白をコードするジエミニウイルスＤＮ
    Ａのセグメントが、単一ゲノムジエミニウイルスＤＮＡ
    から誘導されるものである特許請求の範囲第４８項の方
    法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61257186A (ja) * 1985-05-10 1986-11-14 Teijin Ltd 新規なｄｎａ及びハイブリツドｄｎａ

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPS61257186A (ja) * 1985-05-10 1986-11-14 Teijin Ltd 新規なｄｎａ及びハイブリツドｄｎａ

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