JP3102888B2 - 植物の形質転換方法及びそのためのベクター - Google Patents

植物の形質転換方法及びそのためのベクター

Info

Publication number
JP3102888B2
JP3102888B2 JP07516092A JP51609295A JP3102888B2 JP 3102888 B2 JP3102888 B2 JP 3102888B2 JP 07516092 A JP07516092 A JP 07516092A JP 51609295 A JP51609295 A JP 51609295A JP 3102888 B2 JP3102888 B2 JP 3102888B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
vector
plant
region
agrobacterium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP07516092A
Other languages
English (en)
Inventor
敏彦 小鞠
靖人 斎藤
祐弘 樋江井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Tobacco Inc
Original Assignee
Japan Tobacco Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Tobacco Inc filed Critical Japan Tobacco Inc
Application granted granted Critical
Publication of JP3102888B2 publication Critical patent/JP3102888B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Control Of Steam Boilers And Waste-Gas Boilers (AREA)
  • Image Analysis (AREA)
  • Paper (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、植物の形質転換方法及びそのためのベクタ
ーに関する。
背景技術 高等植物に外来遺伝子を導入する方法（形質転換法）
には、大別して、直接導入法、とアグロバクテリウム属
細菌を介する方法がある。前者には、電気刺激を用いる
方法（エレクトロポレーション法、エレクトロインジェ
クション法）、PEGなどの化学的な処理による方法、遺
伝子銃を用いる方法などが含まれる。前者は、従来後者
が利用しにくかった単子葉植物に多く用いられている方
法である。後者は、Agrobacterium tumefaciensやA.rhi
zogenesなどのアグロバクテリウム属細菌の有する高等
植物細胞形質転換能力を利用した方法である。後者は、
比較的大きくかつ両端の定まったDNA断片を効率良く高
等植物に導入でき、かつ、プロトプラスト培養など特殊
な培養技術を必要としない優れた方法である。後者は、
双子葉植物に多く用いられている方法であるが、近年で
は、単子葉植物についても利用が始まっている。
形質転換法は、高等植物の遺伝子工学や分子生物学の
研究において必須の手法となっており、任意のDNA断片
を効率良く植物細胞に導入し、効率良くそのDNA断片を
含む植物体を得る方法が必要とされている。遺伝子導入
の際、外来遺伝子の導入された植物細胞を、外来遺伝子
が導入されていない植物細胞から選び出す方法が必要で
ある。通常は、後者の細胞がはるかに多いため、検出の
容易な遺伝子を選抜マーカーとして用いる必要がある。
選抜マーカーとして最も多く用いられているのが、薬剤
耐性遺伝子である。例として、カナマイシン耐性遺伝
子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺
伝子や、バスタ耐性遺伝子、ラウンドアップ耐性遺伝子
など除草剤耐性遺伝子があげられる。
薬剤耐性遺伝子を選抜マーカーとして用いる場合、通
常は、植物に導入する任意のDNA断片と薬剤耐性遺伝子
を接続し、この接続遺伝子を植物に導入する操作を行な
い、薬剤耐性細胞を選抜し、さらに薬剤耐性の植物体を
再生して形質転換植物を得ることが行なわれている。こ
のような形質転換植物には、薬剤耐性遺伝子と接続した
任意のDNA断片も同時に導入されているのである。
しかしながら、この方法には２つの問題点がある。す
なわち、 1.選抜マーカーは導入操作の時だけに必要であるのに、
これ以後の生長過程、さらには後代の植物においても、
常に導入した任意のDNA断片と挙動を伴にする。そのた
めに、不要な遺伝子を含む形質転換植物が得られてしま
うことになる。とくに作物育種に形質転換法を利用した
場合、このような不要な遺伝子を含まない品種の方が、
より受入れられやすいと考えられるので、大きな問題と
なる。また、形質転換植物に、さらに、他のDNA断片を
導入する場合、別の選抜マーカーを用いる必要があると
いう不便を生み、大きな問題である。
2.選抜マーカーと植物に導入する任意のDNA断片を接続
する操作が必要であるため、導入遺伝子構築操作におい
て１段階の余分な操作を行なわなくてはならない。
これらの問題点を回避するために、直接導入法の場合
には、いわゆる共形質転換法（co−transformation法）
が開発され、広く用いられている（Shimamotoら、Natur
e 338:274−276、1989）。この方法では、選抜マーカー
の薬剤耐性遺伝子のDNAと植物に導入する任意のDNA断片
とを接続しないで、単に混合し植物細胞に導入するので
ある。そして、薬剤耐性の植物を選抜すると、その中に
は、薬剤耐性遺伝子のDNAと植物に導入する任意のDNA断
片とがともに含まれている植物も存在するのである。２
種のDNAの混合比を調整することにより、薬剤耐性植物
に占める２種のDNAの含まれる植物の割合が50％以上と
なることが多い。
このようにして導入された２種のDNA断片は、接続さ
れていないので、独立に遺伝し次世代において分離する
ため、次世代において選抜マーカーを含まず導入した任
意のDNA断片のみが含まれる形質転換植物を得ることが
できるのである。
アグロバクテリウム属細菌によって植物に導入される
DNA断片は通常Ｔ−DNA（transfer DNA）と呼ばれ、右ボ
ーダーおよび左ボーダーと呼ばれる反復配列を両端に持
つことが特徴である。また、左右ボーダー配列と任意の
DNAとによって作成した人工的なDNA断片もＴ−DNAと呼
ぶことができる。野生のアグロバクリウム属細菌には２
種のＴ−DNAを含むものも多く、このような細菌によっ
て形質転換された植物細胞には２種のＴ−DNAが含まれ
ているので、共形質転換の現象自体は古くから知られて
いた。
しかし、現在用いられているアグロバクテリウム属細
菌を介する形質転換法の基本となっている技術（特開昭
60−70080;特公平２−58917;Herrera−Estrellaら、The
EMBO Journal 6:987−995、1983;Bevanら、Nature 30
4:184−187、1983;Fraleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
80:4803−4807、1983）、ならびに、改良された高効率
の形質転換技術（Komari、Plant Cell Reports 9:303−
306、1990）では、２種のＴ−DNAを植物に導入する方法
についての言及はされていない。
２種のＴ−DNAを同時に植物を導入する方法として、 1.第１のＴ−DNAと第２のＴ−DNAを同一のアグロバクテ
リウム属細菌中に配置する場合 2.第１のＴ−DNAと第２のＴ−DNAを別々のアグロバクテ
リウム属細菌中に配置し２種のアグロバクテリウム属細
菌を混合して用いる場合 とがありうる。そして、どちらの場合でも、植物に導入
された２種のＴ−DNAは独立に遺伝し、次世代において
分離することが示された（Depickerら、Mol.Gen.Genet.
201:477−484、1985;de Framondら、Mol.Gen,Genet.20
2:125−131、1986;McKnightら、Plant Molecular Biolo
gy 8:439−445、1987）。
しかしながら、これらの従来技術では、２種のＴ−DN
Aがともに導入されさらに再生した植物体を得ることの
できる効率が低いために、アグロバクテリウム属細菌を
介した共形質転換法は広く用いられるに至っていないの
である。
発明の開示 本発明の目的は、高い効率で所望の遺伝子が導入され
た再生した形質転換植物を作成し、次世代において該所
望の遺伝子を含むが、選抜マーカーとして用いる薬剤耐
性遺伝子を含まない形質転換植物を得ることを可能とす
る植物の形質転換方法を提供することである。また、本
発明の目的は、この方法に用いられるベクターを提供す
ることである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、アグロバクテリウ
ム属細菌を介する高等植物の形質転換法において、選抜
マーカー遺伝子を含む第１のＴ−DNAと、植物に導入す
べき任意のDNA断片が挿入された第２のＴ−DNAとを共形
質転換法により同時に高等植物に導入し、選抜マーカー
遺伝子により植物を選抜することにより、上記目的を達
成することができることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記第１のＴ−DNA（１）と下
記第２のＴ−DNA（２）によって植物細胞を共形質転換
し、選抜マーカー遺伝子により細胞を選択することを特
徴とする、アグロバクテリウム属細菌を介する植物の形
質転換方法を提供する。
（１）植物中で機能する、上記選抜マーカー遺伝子を含
む第１のＴ−DNA。
（２）下記ハイブリッドベクター中に含まれ、植物に導
入すべき所望のDNA断片が内部に挿入された第２のＴ−D
NA。
上記ハイブリッドベクターは、下記アクセプターベク
ターと下記中間ベクターとの、アグロバクテリウム属細
菌中での相同組換えによって調製されたものである。
上記アクセプターベクターは、少なくとも、 （ａ）アグロバクテリウム属細菌中および大腸菌中で有
効なプラスミド複製機能を有するDNA領域と、 （ｂ）アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens）のTiプラスミドpTiBo542のヴ
ィルレンス領域のvirBおよびvirG遺伝子を含むDNA領域
と、 （ｃ）下記中間ベクターの一部と相同であり、この部分
を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組換えの可
能なDNA領域 を含むものである。
上記中間ベクターは、少なくとも、 （ｉ）大腸菌中では機能するが、アグロバクテリウム属
細菌中では機能しないプラスミド複製機能を有するDNA
領域と、 （ii）上記アクセプターベクターの一部と相同であり、
この部分を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組
換えの可能なDNA領域と、 （iii）上記第２のＴ−DNAの少なくとも一部を構成する
DNA領域 を含むものである。
また、本発明は、（１）植物中で機能する選抜マーカ
ー遺伝子を含む第１のＴ−DNAと、 （２）制限酵素認識部位を有する第２のＴ−DNAとを含
むハイブリッドベクターを提供する。
該ハイブリッドベクターは、下記アクセプターベクタ
ーと下記中間ベクターとの、アグロバクテリウム属細菌
中での相同組換えによって調製されたものである。
上記アクセペターベクターは、少なくとも、 （ａ）アグロバクテリウム属細菌中および大腸菌中で有
効なプラスミド複製機能を有するDNA領域と、 （ｂ）アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens）のTiプラスミドpTiBo542のヴ
ィルレンス領域のvirBおよびvirG遺伝子を含むDNA領域
と、 （ｃ）下記中間ベクターの一部と相同であり、この部分
を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組換えの可
能なDNA領域 を含むものである。
上記中間ベクターは、少なくとも、 （ｉ）大腸菌中では機能するが、アグロバクテリウム属
細菌中では機能しないプラスミド複製機能を有するDNA
領域と、 （ii）上記アクセプターベクターの一部と相同であり、
この部分を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組
換えの可能なDNA領域と、 （iii）上記第２のＴ−DNAの少なくとも一部を構成する
DNA領域 を含むものである。
本発明によれば、高い効率で所望の遺伝子が導入され
た再生した形質転換植物を作成し、次世代において該所
望の遺伝子を含むが、選抜マーカー遺伝子を含まない形
質転換植物を得ることが可能になる。
図面の簡単な説明 図１は、アグロバクテリウム属細菌中での相同組換え
により、アクセプターベクターと中間ベクターから、ハ
イブリッドベクターが調製される現象を模式的に示した
図である。
図２は、pSB21の構成を示す図である。
図３は、pSB22の構成を示す図である。
図４は、pSB24の構成を示す図である。
図５は、pNB1の構成を示す図である。
図６は、pSB1の構成を示す図である。
図７は、pSB3の構成を示す図である。
図８は、pSB4の構成を示す図である。
図９は、pNB1とpSB24の相同組換えにより調製されるp
NB124の構成を示す図である。
図10は、pSB1とpSB24の相同組換えにより調製されるp
SB124の構成を示す図である。
図11は、pSB3とpSB24の相同組換えにより調製されるp
SB324の構成を示す図である。
図12は、pSB4とpSB24の相同組換えにより調製されるp
SB424の構成を示す図である。
図13は、pGA482−GUSの構成を示す図である。
図14は、pTOK253の構成を示す図である。
なお、上記図中に記載されている参照符号の意味を以
下に記す。
AV アクセプターベクター IV 中間ベクター HV ハイブリッドベクター HR アクセプターベクターとハイブリッドベクターに
ともに含まれる断片であり、この断片中のDNA配列の間
で相同組換えが起きる。
ORI ColElの複製開始点 COS ラムダファージのCOS部位 SP 大腸菌中ならびにアグロバクテリウム属細菌中で
機能するスペクチノマイシン耐性遺伝子 TC 大腸菌中ならびにアグロバクテリウム属細菌中で
機能するテトラサイクリン耐性遺伝子 KAN 大腸菌中ならびにアグロバクテリウム属細菌中
で機能するカナマイシン耐性遺伝子 NPT 植物細胞中で機能するNOSプロモーターを接続し
たカナマイシン耐性遺伝子。大腸菌ならびにアグロバク
テリウム属細菌にも低レベルの耐性を付与する。
HPT 植物細胞中で機能する35Sプロモーターを接続し
たハイグロマイシン耐性遺伝子。アグロバクテリウム属
細菌にも低レベルの耐性を付与する。
GUS 植物細胞中で機能する35Sプロモーターを接続し
たGUS遺伝子 Ｉ−GUS 植物細胞中で機能する35Sプロモーターを接
続した、イントロンを含むGUS遺伝子 Ｔ−DNA アグロバクテリウム属細菌から植物に転移
するDNA断片 BR Ｔ−DNAの右ボーダー配列 BL Ｔ−DNAの左ボーダー配列 15.2 kb Kpn I pTiBo542のヴィルレンス領域由来の1
5.2kb Kpn I断片 Ｂ pTiBo542のvirB遺伝子 Ｇ pTiBo542のvirG遺伝子 発明を実施するための最良の形態 本発明の方法により形質転換できる植物は、アグロバ
クテリウム属細菌に感染し、それによって形質転換され
るいかなる植物であってもよく、例として、タバコ、イ
ネ、トマト、ジャガイモ、ペチュニア、トウモロコシ及
びアブラナ等の種々の高等植物を挙げることができるが
これらに限定されるものではない。
アグロバクテリウム属細菌を介する高等植物の形質転
換方法自体はこの分野において周知である。形質転換に
用いることができるアグロバクテリウム属細菌として、
アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacter
ium tumefaciens）及びアグロバクテリウム・リゾゲネ
ス（Agrobacterium rhizogenes）等を挙げることができ
る。これらのアグロバクテリウム属細菌は植物細胞を形
質転換し、腫瘍化する能力を有する土壌細菌であり、こ
れらの細菌には腫瘍誘導性プラスミド（Tiプラスミド）
が含まれている。Tiプラスミドにおいて重要な部位は形
質転換に関与する領域であるヴィルレンス領域と、植物
細胞に転移される腫瘍化遺伝子が含まれているＴ−DNA
領域である。そして、Ｔ−DNA領域においては、腫瘍化
遺伝子の転移に必須の部分はその両端に位置する境界配
列と呼ばれる領域のみである。従って、従来より、アグ
ロバクテリウム属細菌を介する植物の形質転換方法にお
いては、このＴ−DNA中に所望の遺伝子を挿入したプラ
スミドを含むアグロバクテリウム属細菌を植物に感染さ
せることにより形質転換を行っている。本発明の方法に
おいても、植物に導入する選抜マーカー遺伝子及び所望
の任意の遺伝子はそれぞれＴ−DNA中に挿入される。
本発明の方法では、選抜マーカー遺伝子を含む第１の
Ｔ−DNAと、植物に導入しようとする所望のDNA断片が導
入された第２のＴ−DNAとにより植物を共形質転換す
る。第１のＴ−DNA中に含まれる選抜マーカー遺伝子と
しては、薬剤耐性遺伝子が好ましく、中でも、カナマイ
シン耐性遺伝子又はハイグロマイシン耐性遺伝子が好ま
しいがこれらに限定されるものではない。第１及び第２
のＴ−DNAのうち、少なくとも第２のＴ−DNAは後述する
ハイブリッドベクター上に存在する。
ハイブリッドベクターは、アクセプターベクターと中
間ベクターとのアグロバクテリウム属細菌中での相同組
換えにより調製されるものである。ここで、アクセプタ
ーベクターは、アグロバクテリウム属細菌中および大腸
菌中で複製され増殖するプラスミドであって、中間ベク
ターと相同なDNA断片を含み、アグロバクテリウム属細
菌中でのこの部位を介した相同組換えによって、中間ベ
クターを組込むことのできるプラスミドである。また、
中間ベクターは、大腸菌中では複製され増殖するが、ア
グロバクテリウム属細菌中では単独では複製されず増殖
しないプラスミドであって、アクセプターベクターと相
同なDNA断片を含み、この部位を介した相同組換えによ
って、アクセプターベクターに組込まれることができ、
組込まれた状態でアグロバクテリウム属細菌中で維持す
ることのできるプラスミドである。
上記アクセプターベクター上には、 （ａ）アグロバクテリウム属細菌中および大腸菌中で有
効なプラスミド複製機能を有するDNA領域と、 （ｂ）アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens）のTiプラスミドpTiBo542のヴ
ィルレンス領域のvirBおよびvirG遺伝子を含むDNA領域
と、 （ｃ）下記中間ベクターの一部と相同であり、この部分
を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組換えの可
能なDNA領域とが存在する。
ここで、TiプラスミドpTiBo542は、アグロバクテリウ
ム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s）A281（ATCC）に含まれるTiプラスミドであって、そ
のヴィルレンス領域の能力が高いことで知られるもので
ある（フッドら、Bio Technol.2:702−709,1984;フッド
ら、J.Bacteriol.,168:1283−1209,1986;コマリら、J.B
acteriol.,166:88−94,1986;ジンら、J.Bacteriol.169:
4417−4425,1987;コマリ、Plant Science,60:223−229,
1989）。pTiBo542のヴィルレンス領域virB及びvirG遺伝
子も公知であり、これらの文献に記載されている。pTiB
o542のヴィルレンス領域virB及びvirG遺伝子は、pTiBo5
42を制限酵素Kpn Iで処理して得られる15.2kbのDNA断片
中に含まれるので、本発明においてもこの断片を用いる
ことができる。なお、上記（ａ）（ｂ）及び（ｃ）を含
むアクセプターベクター自体は公知であり、例えば特開
平４−222527号及びEP−Ａ−0 504 869に記載されてい
る。
一方、中間ベクターには、 （ｉ）大腸菌中では機能するが、アグロバクテリウム属
細菌中では機能しないプラスミド複製機能を有するDNA
領域と、 （ii）上記アクセプターベクターの一部と相同であり、
この部分を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組
換えの可能なDNA領域と、 （iii）上記第２のＴ−DNAの少なくとも一部を構成する
DNA領域とが含まれている。上記第２のＴ−DNAの一部は
上記アクセプターベクターに含まれていてもよいが、第
２のＴ−DNAの全域が中間ベクターに含まれている方
が、所望のDNA断片を植物に導入できる効率が高いので
好ましい。なお、植物に導入すべき所望のDNA断片は、
中間ベクター上の第２のＴ−DNA内に制限酵素認識部位
を利用して挿入されていることが好ましい。なお、上記
（ｉ）、（ii）及び（iii）を含む中間ベクター自体は
公知であり、例えば特開平４−222527号及びEP−Ａ−0
504 869に記載されている。
アグロバクテリウム属細菌中での上記アクセプターベ
クターと上記中間ベクターとの相同組換えは公知の方法
（ヘレラ−エステレラら、EMBO J.2:987−995,1983;ホ
ーチら、Science,223:496−498,1984）により行うこと
ができる。
上記第１のＴ−DNAは、上記第２のＴ−DNAを含むハイ
ブリッドベクター上に存在していてもよいし、他のプラ
スミド上に存在していてもよい。後者の場合、ハイブリ
ッドベクター及び他のベクターは単一のアグロバクテリ
ウム属細菌中に含まれていてもよいし、別個のアグロバ
クテリウム属細菌中に含まれて（２菌系法）いてもよ
い。もっとも、選抜マーカー遺伝子により選抜した植物
細胞が、第２のＴ−DNAをも含んでいる確率は、第１の
Ｔ−DNA及び第２のＴ−DNAが単一のハイブリッドベクタ
ー上に存在する場合の方が有意に高くなるので、第１の
Ｔ−DNAもハイブリッドベクター上に存在することが好
ましい。しかも、驚くべきことに、第１のＴ−DNAと第
２のＴ−DNAとが単一のベクター上に存在する場合であ
っても、これらは独立的に植物に導入され、次世代にお
いて遺伝的に分離可能である。単一のベクター上に存在
するＴ−DNAで植物を効率良く共形質転換する方法は本
願発明者らが初めて開発したものであり、しかも、それ
が高頻度で遺伝的に独立的に植物に導入され得ることは
本願発明者らが初めて見出したものである。
第１のＴ−DNAがハイブリッドベクター上に存在する
場合、第１のＴ−DNAと第２のＴ−DNAとが遺伝的に独立
的に植物に導入される可能性を高めるために、第１のＴ
−DNAと第２のＴ−DNAとの距離が大きいことが好まし
い。この目的のために、第１のＴ−DNAはアクセプター
ベクターに由来することが好ましい。また、この目的の
ために、第１のＴ−DNAと、上記第２のＴ−DNAは、上記
ハイブリッドベクター上で、 （１）アグロバクテリウム属細菌中および大腸菌中で有
効なプラスミド複製機能を有するDNA領域と、 （２）アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens）のTiプラスミドpTiBo542のヴ
ィルレンス領域のvirBおよびvirG遺伝子を含むDNA断
片、 によって互いに隔てられていることが好ましい。
上記ハイブリッドベクターは、アグロバクテリウム属
細菌に公知の方法で導入することができる。例えば、細
菌の三系交雑法（ディッタら、Proc.Natl.Acad.sci.US
A,77:7347−7351,1980）により行うことができる。
植物の形質転換に用いられるアグロバクテリウム属細
菌としては、従来より、この目的のために用いられてい
るものを用いることができる。すなわち、Ｔ−DNAを含
まないが、Ｔ−DNAの植物への転移に必要なヴィルレン
ス領域を含むTiプラスミド又はRiプラスミドに由来する
プラスミドを有するものを好ましく用いることができ
る。この例として、例えばアグロバクテリウム・チュメ
ファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404
（ホエケマら、nature,303:179−180,1983）を挙げるこ
とができるがこれに限定されるものではない。このよう
なアグロバクテリウム属細菌に上記ハイブリッドベクタ
ー又は第１のＴ−DNAを含むプラスミド（２菌系法の場
合）を導入したものを形質転換に用いる。
次いで、ハイブリッドベクター又は第１のＴ−DNAを
含むプラスミド（２菌系法の場合）を導入したアグロバ
クテリウム属細菌で植物を形質転換する。これは、植物
の細胞、例えば植物の子葉断片を、アグロバクテリウム
属細菌を含む液体培地中で培養することにより行うこと
ができる。２菌系法の場合には、２種類の菌を含む液体
培地中で培養すればよい。この形質転換方法自体は公知
であり、例えば特開平４−222527号及びEP−Ａ−0 504
869に記載されている。
形質転換処理した植物細胞のうち、第１のＴ−DNA中
に含まれる選抜マーカー遺伝子が発現した細胞を選択す
る。次いで、これらの細胞から、常法により植物体を再
生させる。
このようにして得られた植物体は、かなりの確率で第
２のＴ−DNAをも含む。下記実施例では、第１のＴ−DNA
と第２のＴ−DNAとが単一のハイブリッドベクター上に
存在する場合には、得られた植物体のうち約50％以上、
２菌系法の場合でも約35％が第２のＴ−DNAをも有して
いた。
第１のＴ−DNAと第２のＴ−DNAを含む形質転換植物の
多くのものにおいて、第１のＴ−DNAと第２のＴ−DNAと
は独立に遺伝することが確認された。すなわち、下記実
施例では、第１のＴ−DNAと第２のＴ−DNAとが単一のハ
イブリッドベクター上に存在している場合、第１のＴ−
DNAと第２のＴ−DNAとを含む形質転換植物の79％が、２
菌系法の場合71％において、第１のＴ−DNAと第２のＴ
−DNAとが独立に遺伝することが確認された。従って、
これらの形質転換植物を栽培すれば、次世代において、
第２のＴ−DNAを含むが第１のＴ−DNAを含まない植物を
得ることが可能である。
本発明はさらに、（１）植物中で機能する選抜マーカ
ー遺伝子を含む第１のＴ−DNAと、 （２）制限酵素認識部位を有する第２のＴ−DNAとを含
むハイブリッドベクターであって、該ハイブリッドベク
ターは、 少なくとも、 （ａ）アグロバクテリウム属細菌中および大腸菌中で有
効なプラスミド複製機能を有するDNA領域と、 （ｂ）アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens）のTiプラスミドpTiBo542のヴ
ィルレンス領域のvirBおよびvirG遺伝子を含むDNA領域
と、 （ｃ）下記中間ベクターの一部と相同であり、この部分
を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組換えの可
能なDNA領域、 を含むアクセプターベクターと、 少なくとも、 （ｉ）大腸菌中では機能するが、アグロバクテリウム属
細菌中では機能しないプラスミド複製機能を有するDNA
領域と、 （ii）上記アクセプターベクターの一部と相同であり、
この部分を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組
換えの可能なDNA領域と、 （iii）上記第２のＴ−DNAの少なくとも一部を構成する
DNA領域を含む中間ベクターとの、アグロバクテリウム
属細菌中での相同組換えによって調製されたものである
ハイブリッドベクターを提供する。このハイブリッドベ
クターは、上記した本発明の方法に用いるハイブリッド
ベクターとほぼ同じものであり、第２のＴ−DNA中に未
だ所望のDNA断片が挿入されていない点が異なる。所望
のDNA断片を第２のＴ−DNA中の制限酵素部位を利用して
第２のＴ−DNAに挿入すれば、上記と同様に用いること
ができる。
実施例 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明す
る。もっとも、下記実施例は例示のためにのみ記載する
ものであって、いかなる意味においても限定的に解釈し
てはならない。
実施例１ プラスミドの構築 本例での構築作業は、別に示す場合をのぞき、Sambro
okら、Molecular Cloning,A laboratory Manual,Second
Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold
Spring Harbor,New York、1989に記載の方法により行っ
た。
中間ベクターpSB21、pSB24の構築 pBR322をEcoR IおよびCla Iで切断し、T4 DNA polyme
raseで処理後、Cla Iリンカー（５′−CATCGATG−
３′）を挿入し閉環した。トランスポゾンTn7（DeGreve
ら、Plasmid 6:235−248、1981）のスペクチノマイシン
耐性遺伝子（SP遺伝子）を含む2.6kb Dra I−EcoR I断
片を上記プラスミドのEcoR V−EcoR Iの間にクローン化
しした。このプラスミドをEcoR Iで開環後T4 DNA polym
eraseで処理し再環状化することによりEcoR I部位を除
去した。このプラスミドのSP遺伝子を含む2.4kb Cla I
断片を、T4 DNAポリメラーゼ処理後pUC19のSma I部位に
挿入しpTOK107を作成した。pGA482（An、Plant Physio
l.81:86−91、1986）の2.7kb EcoR I−Hind III断片
と、EcoR IおよびHind IIIで切断したpTOK107を結合しp
TOK170を作成した。
pTOK170をBamH IおよびBgl IIで切断後閉環し、pYS13
8とした。pYS138をEcoR IおよびAsp718Iで切断し、T4 D
NA polymerase処理後、Sal Iリンカー（５′−GGTCGACC
−３′）を挿入し閉環しpYS151を作成した。pYS151をSa
l Iで切断しこの部位に、pGA643（Anら、Plant Molecul
ar Biology Manual A3:1−19,Kluwer Academic,Dordrec
ht、1988）のＴ−DNAを含む4.7kbのSal I断片を導入しp
TOK235を作成した。
pTOK235をSac II部位で切断し、T4 DNAポリメラーゼ
により平滑末端化後、Bgl IIリンカー（５′−CAGATCTG
−３′）、または、Hind IIIリンカー（５′−CAAGCTTG
−３′）を挿入し閉環し、得られたプラスミドをそれぞ
れpTOK245とPTOK246と命名した。
pTOK246をHind IIIおよびEcoR Iで切断し、Ｔ−DNA中
の大部分のDNAを除去した後、ここに、pBI221（Jeffers
on、Plant Molecular Biology Reporter 5:387−405、1
987）の2.9kb Hind III−EcoR I断片を挿入しpSB21を作
成した。pBI221の2.9kb Hind III−EcoR I断には、植物
細胞中で発現するベータグルクロニダーゼ遺伝子（GU
S）がふくまれている。pSB21は、大腸菌およびアグロ
バクテリウム属細菌中で機能するスペクチノマイシン耐
性遺伝子、pGA482の2.7kb EcoR I−Hind III断片に由
来する、大腸菌中では機能するがアグロバクテリウム属
細菌中では機能しないプラスミド複製機能を含む断片で
あって、同時にアクセプターベクターとの相同組換えを
起こすことのできる断片、Ｔ−DNAの左右ボーダー配
列とこれにはさまれたGUS遺伝子によって構成されるＴ
−DNA領域を含む断片、によって構成される中間ベクタ
ーである。
同様にHind IIIおよびEcoR Iで切断したpTOK246に、
同様にpIG221（Chtaら、Plant Cell Physiol.31:805−8
13、1990）の3.1kb Hind III−EcoR I断片を挿入しpSB2
4を作成した。この断片には、イントロン配列を挿入し
たGUS遺伝子（イントロンGUS）が含まれている。イント
ロンGUSは、植物細胞中では効率良く発現するが、イン
トロンの作用により大腸菌ならびにアグロバクテリウム
属細菌中ではまったく発現しない。pSB24は、GUS遺伝子
がイントロンGUS遺伝子になっている以外は、pSB21と同
様な中間ベクターである。
pSB22の構築 ハイグロマイシン耐性遺伝子（HPT、Gritzら、Gene 2
5:179−188、1983）、とpDH51（Pietrazak et al.Nucle
ic Acids Res 14:5857−5868、1986）より構成されてお
り、植物細胞中で機能するHPT遺伝子を含むpGL2を、Sal
Iで切断しT4 DNAポリメラーゼで処理後閉環することに
より、Sal I認識部位を削除しpTOK234とした。さらに、
pTOK234をKpn Iで切断後同様の処理を行うことにより２
か所のKpn I認識部位を削除しpTOK244とした。
pTOK244をHind IIIで切断後EcoR Iで不完全分解し、
1.9kb断片を単離してpTOK246のHind IIIとEcoR I認識部
位の間に導入することによりpSB22を作成した。pSB22
は、GUS遺伝子がHPT遺伝子に置換されている点以外は、
pSB21と同様な中間ベクターである。
pYS169の構築 pGA482をHind IIIおよびEcoR Iにより切断し、T4 DNA
ポリメラーゼ処理後閉環することにより2.7kb Hind III
−EcoR I断片を削除しpYS169を作成した。pYS169には、
Ｔ−DNAの左右ボーダー配列とこれにはさまれた植物細
胞中で機能するカナマイシン耐性遺伝子（NPT）によっ
て構成されるＴ−DNAが含まれている。なお、このNPT遺
伝子は、大腸菌およびアグロバクテリウム属細菌にもカ
ナマイシン耐性を付与する能力がある。
pNB1の構築 pVCK101（Knaufら、Plasmid、8:45−54、1982）をEco
R Iにより切断し、T4 DNAポリメラーゼで処理後閉環す
ることによってEcoR I部位を削除した。さらに、Bgl II
で切断後閉環する操作を行ったところ、Bgl II部位が削
除できたので、このプラスミドをpVCK101Qと命名した。
pVCK101QをHind IIIとXho Iで切断し、Hind II−Sal I
で切断したpUC18と結合しpTOK150を作成した。pTOK150
をHind IIIで切断し、T4 DNAポリメラーゼ処理後EcoR I
リンカー（５′−CCGAATTCGG−３′）を挿入し閉環する
ことにより、Hind III部位をEcoR I部位に変換し、pTOK
239とした。
pGA482をHpa Iで切断し、Xho Iリンカー（５′−CCTC
GAGG−３′）を挿入し閉環してpTOK236を作成した。pTO
K236をXba IおよびEcoR Iで分解し、2.6kbを単離した。
pTOK239をEcoR IおよびXba Iで切断し、2.7kb断片を除
去し、pTOK236の2.7kb Xba I−EcoR I断片を挿入し閉環
してpNB1を作成した。pNB1は、アクセプターベクターの
１種であるが、Ｔ−DNAやヴィルレンス領域由来のDNAな
どは含んでいない。
pNB3とpNB4の構築 pNB1をXho Iで切断し、pYS169のNPT遺伝子を含むＴ−
DNAを含む3.5kb Sal I断片を挿入し閉環してpNB3を作成
した。pNB3はアクセプターベクターの１種であり、NPT
遺伝子を含むＴ−DNAを含んでいる。
pNB1をXho Iで切断し、pSB22のHPT遺伝子を含むＴ−D
NAを含む3.0kb Sal I断片を挿入し閉環してpNB4を作成
した。pNB4はアクセプターベクターの１種であり、HPT
遺伝子を含むＴ−DNAを含んでいる。
pSB1、pSB3、および、pSB4の構築 pNB1、pNB3、および、pNB4をKpn Iで切断し、pTiBo54
2（American Type Culture Collection受託番号37349）
のヴィルレンス領域のvirBおよびvirG遺伝子を含む15.2
kb Kpn I断片を挿入して閉環して３種のプラスミドを作
成し、それぞれ、pSB1、pSB3、pSB4とした。
pSB1は、アクセプターベクターの一種であり、これ
に、Ｔ−DNAを含む中間ベクターを組込んだハイブリッ
ドベクターを作成した場合、ヘルパープラスミドと組合
わせることにより、スーパーバイナリーベクターを構成
することができる。
pSB3は選抜マーカー遺伝子としてNPT遺伝子を含むＴ
−DNAを含んでいるアクセプターベクターであり、この
Ｔ−DNAから、pTiBo542のヴィルレンス領域のvirBおよ
びvirG遺伝子を含む15.2kb Kpn I断片によって隔てられ
た部位に、中間ベクターを組込むことのできる部位を有
する。pSB3は、単独で、もしくは、中間ベクターを組込
んだハイブリッドベクターとして、ヘルパープラスミド
と組合わせることにより、スーパーバイナリーベクター
を構成することができる。Ｔ−DNAを含む中間ベクター
の組込によりハイブリッドベクターを作成した場合に
は、このハイブリッドベクターは、選抜マーカー遺伝子
としてNPT遺伝子を含む第１のＴ−DNAと、これから、1
5.2kb以上隔てられた、第２のＴ−DNAの、２つのＴ−DN
Aを含むことが特徴である。
pSB4は選抜マーカー遺伝子としHPT遺伝子を含むＴ−D
NAを含んでいるアクセプターベクターであり、このＴ−
DNAから、pTiBo542のヴィルレンス領域のvirBおよびvir
G遺伝子を含む15.2kb Kpn I断片によって隔てられた部
位に、中間ベクターを組込むことのできる部位を有す
る。pSB4は、単独で、もしくは、中間ベクターを組込ん
だハイブリッドベクターとして、ヘルパープラスミドと
組合わせることにより、スーパーバイナリーベクターを
構成することができる。Ｔ−DNAを含む中間ベクターの
組込によりハイブリッドベクターを作成した場合には、
このハイブリッドベクターは、選抜マーカー遺伝子とし
てNPT遺伝子を含む第１のＴ−DNAと、これから、15.2kb
以上隔てられた、第２のＴ−DNAの、２つのＴ−DNAを含
むことが特徴である。
pTOK253の作成 pVCK102（Knaufら、Plasmid 8:45−54、1982）をSal
Iで切断し、pSB21のＴ−DNAを含む4.1kb Sal I断片を挿
入し閉環することによりpTOK253を作成した。pTOK253
は、ヘルパープラスミドと組合わせてバイナリーベクタ
ーを構成することができるプラスミドであり、そのＴ−
DNAには植物細胞中で発現するGUS遺伝子が含まれ、薬剤
耐性遺伝子は含まれていない。
pGA482−GUSの構築 pGA482をHind IIIおよびEcoR Iで切断し、pBI221の2.
9kb Hind III−EcoR I断片を挿入しpGA482−GUSを作成
した。pGA482は、ヘルパープラスミドと組合わせてバイ
ナリーベクターを構成することができるプラスミドであ
り、そのＴ−DNAには植物細胞中で発現するカナマイシ
ン耐性遺伝子（NPT）が含まれている。また、pGA482−G
USは、ヘルパープラスミドと組合わせてバイナリーベク
ターを構成することができるプラスミドであり、そのＴ
−DNAには植物細胞中で発現するGUS遺伝子とカナマイシ
ン耐性遺伝子（NPT）が含まれている。
実施例２ ハイブリッドベクター等を含むアグロバクテ
リウム属細菌の作成 本実施例では、アグロバクテリウム属細菌の培養はAB
培地（Chiltonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71:3672−3
676、1974）を用いて、28℃で行った。また、必要に応
じ、テトラサイクリン（10μg/ml）、カナマイシン（10
0μg/ml）、ハイグロマイシン（50μg/ml）、スペクチ
ノマイシン（50μg/ml）を添加した培地を用いた。
pNB1、pSB1、pSB3、および、pSB4を、Dittaら（Proc.
Nat.Acad.Sci.USA 77:7347−7351、1980）の方法によ
り、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agroba
cterium tumefaciens）菌系LBA4404（Hoekemaら、Natur
e 303:179−180、1983）に導入した。LBA4404は、Ｔ−D
NAを除去したdisarmedのTiプラスミドpAL4404を含む菌
系である。pAL4404は完全なヴィルレンス領域を保持し
ており、バイナリーベクターのヘルパープラスミドとし
て頻用されている。以下、プラスミドを導入したアグロ
バクテリウム属細菌は、例えば、LBA4404（pNB1）のよ
うに、菌系名とこれに続く括弧内のプラスミド名によっ
て記載することとする。
テトラサイクリン耐性菌であるLBA4404（pNB1）に、D
ittaらの方法により、スペクチノマイシン耐性遺伝子を
有するpSB21を導入し、テトラサイクリン、スペクチノ
マイシン両薬剤に耐性の菌を選抜することにより、中間
ベクターpSB21がpNB1に導入されたハイブリッドベクタ
ーを含むLBA4404を得ることができた。このハイブリッ
ドベクターをpNB121と命名した。
以下同様の操作により、下記表１に示すハイブリッド
ベクターを含むLBA4404を作成した。
pGA482、pTOK253、および、pGA482−GUSを、Dittaら
の方法によりLBA4404に導入し、LBA4404（pGA482）、LB
A4404（pTOK253）とLBA4404（pGA482−GUS）を作成し
た。
実施例３ タバコの形質転換と共形質転換の効率 タバコ（品種BY4）を温室で栽培し、葉を採取し、エ
チルアルコールおよび次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌
した後、直径約6mmの葉片ディスクを調整した。この葉
片と下記のうちの一種のアグロバクテリウム属細菌約10
8個の細胞とをLinsmaier and Skoogの無機塩類と30g/
のショ糖より成る液体培地２〜3ml中で48時間共存培養
を行った。
LBA4404（pSB324） LBA4404（pSB424） LBA4404（pSB124）とLBA4404（pGA482）の等量混合菌 LBA4404（pNB124）とLBA4404（pGA482）の等量混合菌 LBA4404（pTOK253）とLBA4404（pGA482）の等量混合菌 LBA4404（pGA482−GUS） LBA4404（pGA482） その後、葉片を滅菌水で洗浄し細菌を洗い落とした
後、Linsmaier and Skoogの無機塩類、インドール酢酸
0.3mg/、６−（γ、γ）−ジメチルアリルアミノプリ
ン10mg/ml、カナマイシン200mg/、セフォタキシム250
mg/mlおよび寒天0.9％を含む培地に置床した。ただし、
LBA4404（pSB424）を用いた場合には、カナマイシンに
代えてハイグロマイシン50mg/を添加した培地を用い
た。培養１カ月後、発根したカナマイシン耐性もしくは
ハイグロマイシン耐性の薬剤耐性の植物体について、以
下の方法によりGUSの発現を調査した後、温室で栽培し
た。
GUSの発現は、Jeffersonら（Plant Molecular Biolog
y Reporter 5:387−405、1987）の方法に準じ、小葉片
（２×2mmから10×10mm程度の間の大きさ）を植物から
切除し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグル
クロニド（Ｘ−Gluc）500mg/、50mM リン酸ナトリウ
ムpH7.0、10mMβ−メルカプトエタノール、10mMエチレ
ンジアミン４酢酸ナトリウム、0.1％ザルコシンラウリ
ルナトリウム、0.1％ Triton X−100の水溶液中に２時
間から一晩浸すことによって調査した。GUS活性を示す
場合には、葉片の特に切断面が濃青色を呈するが、GUS
活性を示さない場合にはそのような発色は認められな
い。
GUS発現調査結果は下記表２に示すとおりである。
薬剤耐性を示すことは、選抜マーカー遺伝子を含む第
１のＴ−DNAが当該植物に導入されていることを示して
おり、GUS活性を示すことはGUS遺伝子を含む第２のＴ−
DNAが当該植物に導入されていることを示している。
LBA4404（pGA482）はGUS遺伝子を含んでいない菌であ
るので、得られた薬剤耐性植物はすべてGUS活性を示さ
なかった。
LBA4404（pGA482−GUS）は、薬剤耐性遺伝子とGUS遺
伝子が接続されたＴ−DNAを含んでいるが、得られた薬
剤耐性植物の85％からGUS活性が検出されたのみであっ
た。これは、形質転換過程でGUS遺伝子が欠落する場
合、もしくは、GUS遺伝子が導入されていても発現が不
十分であるために検出されなかった場合があることを示
している。
LBA4404（pTOK253）とLBA4404（pGA482）の混合菌を
用いる方法は、従来技術（McKnightら、Plant Molecula
r Biology 8:439−445、1987）と同一の手法ということ
ができるが、この従来技術では、２種のＴ−DNAが導入
された植物は全く検出することができなかた。これは、
この従来技術の場合には、２種のＴ−DNAによる共形質
転換個体が全く得られない場合もありうることを示して
おり、このことが、この方法が広く用いられていない原
因のひとつであると考えられる。
LBA4404（pNB124）とLBA4404（pGA482）の混合菌を用
いる方法は、pNB124というハイブリッドベクターを用い
ている点以外は、上記McKnightらの従来技術に類似した
方法である。McKnightらの従来技術では、薬剤耐性の植
物の内19％に第２のＴ−DNAが含まれていたが、LBA4404
（pNB124）とLBA4404（pGA482）の混合菌ではその比は2
2％であり、よく似た結果が得られたといえる。
LBA4404（pSB124）とLBA4404（pGA482）の混合菌を用
いる方法は、LBA4404（pSB124）が、pSB124というハイ
ブリッドベクターを含む菌であり、スーパーバイナリー
ベクターを利用した手法であり、本発明で開発した方法
（２菌系法）である。この方法では、薬剤耐性の植物の
うち35％に第２のＴ−DNAが含まれることが確認され、L
BA4404（pNB124）とLBA4404（pGA482）の混合菌の場合
よりもはるかに共形質転換の効率が高いことが判明し
た。
なお、LBA4404（pSB124）とLBA4404（pGA482）の混合
菌の場合と、LBA4404（pNB124）とLBA4404（pGA482）の
混合菌の場合の結果の比較については、下記のように統
計学的分析を行うことができる。
両混合菌による共形質転換の確率が等しいという仮説
を設定すると、 X2＝6.5×6.5×（1/28.5＋1/28.5＋1/71.5＋1/71.5）＝4.15 と計算され、これは自由度１をもつ。自由度１のときX2
が4.15よりも大きい確率は５％以下であるので、上記仮
説は５％水準で棄却される。よって、両混合菌による共
形質転換の確率には統計学的に有意な差がある。
LB4404（pSB324）もしくはLBA4404（pSB424）を用い
る方法は、ハイブリッドベクタターpSB324もしくはpSB4
24を含む菌を用いる方法であり、スーパーバイナリーベ
クターを利用した方法であり、本発明で開発した方法
（１菌系法）である。これらの方法では、薬剤耐性の植
物のうち50〜52％に第２のＴ−DNAが含まれることが確
認され、LBA4404（pNB124）とLBA4404（pGA482）の混合
菌の場合や、LBA4404（pSB124）とLBA4404（pGA482）の
混合菌の場合よりもはるかに共形質転換の効率が高いこ
とが判明した。
なお、LB4404（pSB324）もしくはLBA4404（pSB424）
を用いる方法と、LBA4404（pNB124）とLBA4404（pGA48
2）の混合菌を用いる方法の結果の比較については、下
記のように統計学的分析を行うことができる。
両方法による共形質転換の確率が等しいという仮説を
設定すると、 X2＝19.9×19.9×（1/95.1＋1/41.9＋1/131.9＋1/58.1）＝23.43 と計算され、これは自由度１をもつ。自由度１のときX2
が23.43よりも大きい確率は１％以下であるので、上記
仮説は１％水準で棄却される。よって、両方法による共
形質転換の確率には１％水準で統計学的に有意な差があ
る。
また、LB4404（pSB324）もしくはLBA4404（pSB424）
を用いる方法と、LBA4404（pSB124）とLBA4404（pGA48
2）の混合菌を用いる方法の結果の比較については、下
記のように統計学的分析を行うことができる。
両方法による共形質転換の確率が等しいという仮説を
設定すると、 X2＝10.9×10.9×（1/104.1＋1/45.9＋1/122.9＋1/54.1）＝6.89 と計算され、これは自由度１をもつ。自由度１のときX2
が6.89よりも大きい確率は１％以下であるので、上記仮
説は１％水準で棄却される。よって、両方法による共形
質転換の確率には１％水準で統計学的に有意な差があ
る。
実施例４ タバコに導入したＴ−DNAの遺伝 温室で栽培した形質転換植物より種子を採取した。一
部の個体の種子について、エチルアルコールおよび次亜
塩素酸ナトリウムで表面殺菌した後、Linsmaier and Sk
oogの無菌塩類と30g/のショ糖と寒天0.9％より成る培
地に播種した。発芽した植物について、上記の手法によ
りGUS活性を調査するとともに、下記の手法により薬剤
耐性を調査した。
小葉片（３×3mm程度）を切り取り、Linsmaier and S
koogの無菌塩類、ショ糖30g/、インドール酢酸3mg/
、ナフタレン酢酸3mg/、カイネチン0.1mg/、カナ
マイシン200mg/、寒天0.9％より成る培地に置床し
た。なお、LBA4404（pSB424）によって形質転換された
植物の種子由来の植物については、カナマイシンに代え
てハイグロマイシン50mg/mlを添加した培地を用いた。
薬剤耐性植物の葉片はこの培地上でカルスを形成した
が、薬剤感受性植物の葉片はカルスを形成せず枯死し
た。
LBA4404（pSB324）、LBA4404（pSB424）、または、LB
A4404（pSB124）とLBA4404（pGA482）の混合菌によって
形質転換され、GUS活性を示した植物の種子由来の植物
については下記表３に示す結果が得られた。
以上の結果がしめすように、これらの植物には、薬剤
耐性遺伝子を含むＴ−DNAやGUS遺伝子を含むＴ−DNAが
複数因子以上導入されていた場合もあった。
LBA4404（pSB324）によって形質転換され、GUS活性を
示した植物については、調査した９個体中５個体につい
て、少なくとも１因子のGUS遺伝子を含むＴ−DNAが、薬
剤耐性遺伝子を含むＴ−DNAとは独立に遺伝し、次世代
において薬剤耐性遺伝子を含まず、GUS遺伝子を含む植
物を得ることができた。
LBA4404（pSB424）によって形質転換され、GUS活性を
示した植物については、調査した10個体中10個体につい
て、少なくとも１因子のGUS遺伝子を含むＴ−DNAが、薬
剤耐性遺伝子を含むＴ−DNAとは独立に遺伝し、次世代
において薬剤耐性遺伝子を含まず、GUS遺伝子を含む植
物を得ることができた。
LBA4404（pSB124）とLBA4404（pGA482）の混合菌によ
って形質転換され、GUS活性を示した植物については、
調査した14個体中10個体について、少なくとも１因子の
GUS遺伝子を含むＴ−DNAが、薬剤耐性遺伝子を含むＴ−
DNAとは独立に遺伝し、次世代において薬剤耐性遺伝子
を含まず、GUS遺伝子を含む植物を得ることができた。
なお、LBA4404（pGA482−GUS）によって形質転換さ
れ、GUS活性を示した植物の次世代には、薬剤耐性遺伝
子を含まず、GUS遺伝子を含む植物はなかった。また、L
BA4404（pGA482）によって形質転換された植物の次世代
にはGUS活性を示す植物はなかった。
表３の系統番号324−28、424−４、424−30の形質転
換体並びにその次世代の植物の葉より、Komariら（Theo
r.Appl.Genet.77;547−552,1989）の方法に従いDNAを抽
出し、制限酵素Hind IIIで処理後、Sambrookら（Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edn.Cold Sprin
g Harbor,NY）の方法に従いサザン分析を行った。その
結果、薬剤耐性かつGUS活性を示す植物には両遺伝子が
検出された。薬剤耐性を示し、GUS活性を示さない植物
には薬剤耐性遺伝子のみが検出された。薬剤耐性を示さ
ず、GUS活性を示す植物にはGUS遺伝子のみが検出され
た。また、薬剤耐性とGUS活性を共に示さない植物には
どちらの遺伝子も検出されなかった。
実施例５ イネの形質転換と共形質転換効率 イネ（品種月の光）の完熟種子を70％エタノールに１
分間、１％次亜塩素酸ナトリウムに30分間浸漬すること
によって消毒した後、2N6固体培地（N6の無機塩類およ
びビタミン類（Chu C.C.Proc.Symp.Plant Tissue Cultu
re,Science Press Peking,pP.43−55、1978）、カザミ
ノ酸1g/、2,4−D 2mg/、ショ糖30g/、ゲルライト
2g/）に置床した。約３週間培養後、形成された胚盤
由来のカルスを2N6固体培地に移植し、４〜７日経過し
たカルスを胚盤カルスとして用いた。
AB培地上で３〜10日間28℃で培養したLBA4404（pSB42
4）のコロニーを白金耳でかきとり、修正AA培地（AA主
要無機塩類、AAアミノ酸およびビタミン類（Toriyama
ら、Plant Science 41:179−183、1985）、MS微量塩類
（Murashigeら、Physiol.Plant.15:473−497、1962）、
カザミノ酸0.5g/、ショ糖0.2M、グルコース0.2M、ア
セトシリンゴン100μＭ、pH5.2）に懸濁し、菌濃度を１
×109細胞/mlに調整し接種に用いた。
胚盤カルスを滅菌水で洗浄後、上述の菌液に３〜10分
間浸漬した。浸漬処理後、アセトシリンゴン、グルコー
スとショ糖を、修正AA培地と同濃度で含む2N6固体培地
に移植し、25℃、暗黒下で３日間培養した。その後、胚
盤カルスをセフォタキシム250mg/を含む滅菌水で洗浄
した。
カルスをハイグロマイシン50mg/とセフォタキシム2
50mg/を含む2N6固体培地に移し、３週間培養してハイ
グロマイシン耐性のカルスを選抜した。得られた耐性カ
ルスを、さらに、ハイグロマイシン100mg/とセフォタ
キシム250mg/を含むN6−７培地（N6無機塩類、N6ビタ
ミン類、カザミノ酸2g/、2,4−D 1mg/、6BA 0.5mg/
、ソルビトール30g/、ショ糖20g/、ゲルライト2g
/）で２〜３週間培養した。この培地で増殖したカル
スをハイグロマイシン50mg/とセフォタキシム250mg/
を含む個体再生用培地N6S3（1/2 N6主要無機塩類、N6
微量塩類、N6ビタミン類（Chu 1978）、AAアミノ酸（To
riyamaら、1985）、カザミノ酸1g/、ナフタレン酢酸
0.2mg/、カイネチン1.0mg/、ゲルライト3g/）に
移し、ハイグロマイシン耐性植物を再生させた。
ハイグロマイシン耐性植物について、上記の手法によ
りGUS活性を検定した後、閉鎖系温室で栽培した。
ハイグロマイシン耐性植物は、下記表４に示すように
供試したカルスの12.3〜44.0％から得られた。また、下
記表５に示すように、ハイグロマイシン耐性植物のうち
42〜51％がGUS活性を示した。
ハイグロマイシン耐性かつGUS活性を示した個体の葉
よりKomariら（Theor.Appl.Genet.77:547−552,1989）
の方法に従いDNAを抽出し、制限酵素Hind IIIで処理
後、Sambrookら（Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual,2nd Edn.Cold Spring Harbor,NY）の方法に従いサ
ザン分析を行った。その結果、各個体ともハイグロマイ
シン耐性遺伝子、GUS遺伝子の存在が確認された（表
６）。
実施例６ イネに導入したＴ−DNAの遺伝 温室で栽培した形質転換植物より種子を採取した。一
部の個体の種子について、エチルアルコール及び次亜塩
素酸ナトリウムで表面殺菌した後、N6ホルモンフリーの
培地に播種した。発芽発根した種子について、上記の手
法によりGUS活性を調査すると共に、下記の手法により
ハイグロマイシン耐性を調査した。
幼根を５〜10mmの長さで切り取り、ハイグロマイシン
50mg/を含む2N6培地に置床した。ハイグロマイシン耐
性の個体の幼根断片はカルスを形成したが、ハイグロマ
イシンに感受性の個体の根はカルスを形成せず座死し
た。
LBA4404（pSB424）で形質転換され、GUS活性及びハイ
グロマイシン耐性を示した植物の種子由来の次世代植物
について表６に示す結果が得られた。
以上の結果が示すように、これらの植物には、タバコ
におけるのと同様に、薬剤耐性遺伝子を含むＴ−DNAやG
US遺伝子を含むＴ−DNAが複数因子以上導入されていた
場合もあった。また、遺伝因子数はサザン分析により得
られた導入遺伝子のコピー数と一致するものと、少ない
ものが認められた。遺伝因子数が、サザン分析によるコ
ピー数より少ないものについては、複数の遺伝子が同一
遺伝子座に導入されたことを示すものと考えられる。
LBA4404（pSB424）によって形質転換され、GUS活性及
びハイグロマイシン耐性を示した植物については、調査
した12個体中８個体について、少なくとも１因子のGUS
遺伝子を含むＴ−DNAが、薬剤耐性遺伝子を含むＴ−DNA
とは独立に遺伝し、次世代において薬剤耐性遺伝子を含
まず、GUS遺伝子を含む植物を得ることができた。
形質転換体の次世代植物における導入遺伝子の存在を
確認するため、表６の各系統の個体の次世代の植物を各
表現型（GUS＋かつハイグロマイシン耐性、GUS＋かつハ
イグロマイシン感受性、GUS−かつハイグロマイシン耐
性、GUS−かつハイグロマイシン感受性）に分けてサザ
ン分析を行った。その結果、ハイグロマイシン耐性遺伝
子及びGUS遺伝子が表現型と一致するかたちで存在して
いることが確認された。
産業上の利用可能性 上述のように、本発明によれば、高い効率で所望の遺
伝子が導入された再生した形質転換植物を作成し、次世
代において該所望の遺伝子を含むが、選抜マーカー遺伝
子を含まない形質転換植物を得ることが可能になるの
で、本発明は、所望の形質を有する有用な新規植物を作
出する上で有用であり、農業上有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−222527（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−296882（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．338（1989) ｐ．274−276 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01H 1/00 C12N 15/84 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (25)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記第１のＴ−DNA（１）と下記第２のＴ
    −DNA（２）によって植物細胞を共形質転換し、選抜マ
    ーカー遺伝子により細胞を選択することを特徴とする、
    アグロバクテリウム属細菌を介する植物の形質転換方
    法。 （１）植物中で機能する、上記選抜マーカー遺伝子を含
    む第１のＴ−DNA。 （２）下記ハイブリッドベクター中に含まれ、植物に導
    入すべき所望のDNA断片が内部に挿入された第２のＴ−D
    NA。 上記ハイブリッドベクターは、下記アクセプターベクタ
    ーと下記中間ベクターとの、アグロバクテリウム属細菌
    中での相同組換えによって調製されたものである。 上記アクセプターベクターは、少なくとも、 （ａ）アグロバクテリウム属細菌中および大腸菌中で有
    効なプラスミド複製機能を有するDNA領域と、 （ｂ）アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agro
    bacterium tumefaciens）のTiプラスミドpTiBo542のヴ
    ィルレンス領域のvirBおよびvirG遺伝子を含むDNA領域
    と、 （ｃ）下記中間ベクターの一部と相同であり、この部分
    を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組換えの可
    能なDNA領域 を含むものである。 上記中間ベクターは、少なくとも、 （ｉ）大腸菌中では機能するが、アグロバクテリウム属
    細菌中では機能しないプラスミド複製機能を有するDNA
    領域と、 （ii）上記アクセプターベクターの一部と相同であり、
    この部分を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組
    換えの可能なDNA領域と、 （iii）上記第２のＴ−DNAの少なくとも一部を構成する
    DNA領域 を含むものである。
  2. 【請求項２】上記選抜マーカーが薬剤耐性遺伝子である
    請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】上記第１のＴ−DNAと上記第２のＴ−DNAと
    は単一の上記ハイブリッドベクター中に含まれる請求項
    １又は２記載の方法。
  4. 【請求項４】上記第１のＴ−DNAは、上記アクセプター
    ベクター中に含まれる請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】上記第１のＴ−DNAと、上記第２のＴ−DNA
    は、上記ハイブリッドベクター上で、 （１）アグロバクテリウム属細菌中および大腸菌中で有
    効なプラスミド複製機能を有するDNA領域と、 （２）アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agro
    bacterium tumefaciens）のTiプラスミドpTiBo542のヴ
    ィルレンス領域のvirBおよびvirG遺伝子を含むDNA断
    片、 によって互いに隔てられている請求項１ないし４のいず
    れか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】上記第１のＴ−DNAと、上記ハイブリッド
    ベクターは異なるアグロバクテリウム属細菌に含まれて
    おり、この２種のアグロバクテリウム属細菌を混合して
    上記植物を形質転換することを特徴とする請求項１記載
    の方法。
  7. 【請求項７】上記第１のＴ−DNAが、少なくともアグロ
    バクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tu
    mefaciens）のTiプラスミドpTiBo542のヴィルレンス領
    域のvirB及びvirG遺伝子を含まないベクター中に含まれ
    ることを特徴とする請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】上記pTiBo542のヴィルレンス領域のvirBお
    よびvirG遺伝子を含むDNA領域は、pTiBo542の15.2kb Kp
    n I断片である請求項１ないし７のいずれか１項に記載
    の方法。
  9. 【請求項９】植物に導入すべき上記所望のDNA断片は、
    上記中間ベクター中の、上記第２のＴ−DNAの少なくと
    も一部を構成するDNA領域中に制限酵素認識部位を利用
    して挿入されている請求項１ないし８のいずれか１項に
    記載の方法。
  10. 【請求項１０】上記中間ベクターは、上記第２のＴ−DN
    Aの全域を含む請求項１ないし９のいずれか１項に記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】Ｔ−DNAを含まないが、Ｔ−DNAの植物へ
    の転移に必要なヴィルレンス領域を含むTiプラスミド又
    はRiプラスミドに由来するプラスミドとともに上記ハイ
    ブリッドベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を上
    記植物に感染させることを含む請求項１ないし10のいず
    れか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】上記薬剤耐性遺伝子は、カナマイシン耐
    性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子である請求
    項２ないし11のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】上記第１のＴ−DNAはプラスミド上にあ
    り、Ｔ−DNAを含まないがＴ−DNAの植物への転移に必要
    なヴィルレンス領域を含むことを特徴とするTiまたはRi
    プラスミドに由来する第２のプラスミドとともに上記第
    １のＴ−DNAを含むアグロバクテリウム属細菌を感染さ
    せることを含む請求項６記載の方法。
  14. 【請求項１４】上記アクセプターベクターはpSB3または
    pSB4である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】上記アクセプターベクターはpSB1である
    請求項６又は12記載の方法。
  16. 【請求項１６】上記中間ベクターは、pSB21、pSB22、pS
    B24、pTOK170、pYS151、pTOK235、pTOK245、pTOK246又
    はこれらの誘導体である請求項１ないし14のいずれか１
    項記載の方法。
  17. 【請求項１７】請求項１ないし16のいずれか１項に記載
    の方法により形質転換し、該形質転換した植物を栽培
    し、次世代において、植物に導入すべき上記所望のDNA
    断片を有するが上記薬剤耐性遺伝子を有さない植物を得
    る、形質転換植物の取得方法。
  18. 【請求項１８】（１）植物中で機能する選抜マーカー遺
    伝子を含む第１のＴ−DNAと、 （２）制限酵素認識部位を有する第２のＴ−DNAとを含
    むハイブリッドベクター。 該ハイブリッドベクターは、下記アクセプターベクター
    と下記中間ベクターとの、アグロバクテリウム属細菌中
    での相同組換えによって調製されたものである。 上記アクセプターベクターは、少なくとも、 （ａ）アグロバクテリウム属細菌中および大腸菌中で有
    効なプラスミド複製機能を有するDNA領域と、 （ｂ）アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agro
    bacterium tumefaciens）のTiプラスミドpTiBo542のヴ
    ィルレンス領域のvirBおよびvirG遺伝子を含むDNA領域
    と、 （ｃ）下記中間ベクターの一部と相同であり、この部分
    を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組換えの可
    能なDNA領域 を含むものである。 上記中間ベクターは、少なくとも、 （ｉ）大腸菌中では機能するが、アグロバクテリウム属
    細菌中では機能しないプラスミド複製機能を有するDNA
    領域と、 （ii）上記アクセプターベクターの一部と相同であり、
    この部分を介してアグロバクテリウム属細菌中で相同組
    換えの可能なDNA領域と、 （iii）上記第２のＴ−DNAの少なくとも一部を構成する
    DNA領域 を含むものである。
  19. 【請求項１９】上記選抜マーカーが薬剤耐性遺伝子であ
    る請求項18記載のハイブリッドベクター。
  20. 【請求項２０】上記第１のＴ−DNAは、上記アクセプタ
    ーベクター中に含まれる請求項18又は19記載のハイブリ
    ッドベクター。
  21. 【請求項２１】上記第１のＴ−DNAと、上記第２のＴ−D
    NAは、上記ハイブリッドベクター上で、 （１）アグロバクテリウム属細菌中および大腸菌中で有
    効なプラスミド複製機能を有するDNA領域と、 （２）アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agro
    bacterium tumefaciens）のTiプラスミドpTiBo542のヴ
    ィルレンス領域のvirBおよびvirG遺伝子を含むDNA断
    片、 によって互いに隔てられている請求項18ないし20のいず
    れか１項に記載のハイブリッドベクター。
  22. 【請求項２２】上記pTiBo542のヴィルレンス領域のvirB
    およびvirG遺伝子を含むDNA領域は、pTiBo542の15.2kb
    Kpn I断片である請求項18ないし21のいずれか１項に記
    載のハイブリッドベクター。
  23. 【請求項２３】上記薬剤耐性遺伝子は、カナマイシン耐
    性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子である請求
    項18ないし22のいずれか１項に記載のハイブリッドベク
    ター。
  24. 【請求項２４】上記アクセプターベクターはpSB3または
    pSB4である請求項18ないし23のいずれか１項に記載のハ
    イブリッドベクター。
  25. 【請求項２５】上記中間ベクターは、pSB21、pSB22、pS
    B24、pTOK170、pYS151、pTOK235、pTOK245、pTOK246又
    はこれらの誘導体である請求項18ないし24のいずれか１
    項記載のハイブリッドベクター。
JP07516092A 1993-12-08 1994-12-06 植物の形質転換方法及びそのためのベクター Expired - Fee Related JP3102888B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP5-340657 1993-12-08
JP34065793 1993-12-08
PCT/JP1994/002049 WO1995016031A1 (fr) 1993-12-08 1994-12-06 Procede de transformation de plantes et vecteur necessaire

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP3102888B2 true JP3102888B2 (ja) 2000-10-23

Family

ID=18339075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP07516092A Expired - Fee Related JP3102888B2 (ja) 1993-12-08 1994-12-06 植物の形質転換方法及びそのためのベクター

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5731179A (ja)
EP (1) EP0687730B1 (ja)
JP (1) JP3102888B2 (ja)
AT (1) ATE362527T1 (ja)
AU (1) AU1121395A (ja)
CA (1) CA2155570C (ja)
DE (1) DE69434972T2 (ja)
DK (1) DK0687730T3 (ja)
ES (1) ES2287933T3 (ja)
PT (1) PT687730E (ja)
WO (1) WO1995016031A1 (ja)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5981840A (en) * 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US6369298B1 (en) * 1997-04-30 2002-04-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Agrobacterium mediated transformation of sorghum
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
DK1009842T3 (da) 1997-06-30 2004-09-27 Syngenta Mogen Bv Plasmider til plantetransformation samt fremgangsmåde til anvendelse heraf
US7087420B1 (en) 1997-07-17 2006-08-08 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6391547B1 (en) * 1997-09-09 2002-05-21 Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US7161064B2 (en) * 1997-08-12 2007-01-09 North Carolina State University Method for producing stably transformed duckweed using microprojectile bombardment
US7057090B1 (en) 1998-07-17 2006-06-06 Rutgers, The State University Of New Jersey Agrobacterium-mediated transformation of turfgrass
FR2784393B1 (fr) * 1998-10-09 2002-02-22 Biogemma Fr Procede d'obtention de plantes transgeniques exprimant une proteine a activite productrice de peroxyde d'hydrogene par transformation par agrobacterium rhizogenes
DE19926216A1 (de) * 1999-06-09 2001-02-22 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur Herstellung von Bariumsulfat, Bariumsulfat und Verwendung des Bariumsulfats
WO2001033944A1 (en) 1999-11-10 2001-05-17 University Of Washington Compositions and methods for modulation of plant cell division
US7749751B2 (en) 1999-12-16 2010-07-06 Cropdesign N.V. Optimized T-DNA transfer and vectors therefor
AU785287B2 (en) * 2000-08-03 2006-12-21 Japan Tobacco Inc. Method of improving gene transfer efficiency into plant cells
ATE417933T1 (de) 2000-08-03 2009-01-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur verbesserung der gentransfer- effizienz in pflanzenzellen
JP2004507250A (ja) * 2000-08-30 2004-03-11 ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ タンパク質含量を変化させる分子デコイを含有するトランスジェニック植物
EP1368467B1 (en) * 2000-11-07 2007-04-25 North Carolina State University Putrescine-n-methyltransferase promoter
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
KR20040019301A (ko) * 2001-06-08 2004-03-05 벡터 토바코 리미티드 담배에서 니코틴 및 니트로사민 수준의 조절
EP2239332A3 (en) 2001-07-06 2011-01-19 Monsanto Technology LLC Methods for enhancing segregation of transgenes in plants and compositions thereof
EP1279737A1 (en) * 2001-07-27 2003-01-29 Coöperatieve Verkoop- en Productievereniging, van Aardappelmeel en Derivaten AVEBE B.A. Transformation method for obtaining marker-free plants
NZ571718A (en) 2002-02-20 2010-09-30 Simplot Co J R Precise breeding by modification of an R1, phosphorylase-L and polyphenol oxidase genes in a plant
US7534934B2 (en) 2002-02-20 2009-05-19 J.R. Simplot Company Precise breeding
CA2481167A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-23 Vector Tobacco Ltd. Tobacco having reduced nicotine and nitrosamines
US7150993B2 (en) * 2003-08-05 2006-12-19 Monsanto Technology Llc Method for excision of plant embryos for transformation
US7560611B2 (en) * 2003-08-05 2009-07-14 Monsanto Technology Llc Method and apparatus for substantially isolating plant tissues
BRPI0614695A2 (pt) 2005-07-29 2011-04-12 Targeted Growth Inc proteção de proteìna krp mutante negativa dominante de inibição de complexo ciclina-cdk ativo por krp do tipo silvestre
CN101374408A (zh) 2005-12-15 2009-02-25 目标栽培公司 通过在早期胚胎发育期间生长和/或发育相关基因的转基因过量表达来增加种子大小和种子数目
CA2653231C (en) 2006-05-12 2016-04-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for obtaining marker-free transgenic plants
MX2009002250A (es) 2006-08-31 2009-03-16 Monsanto Technology Llc Metodos para transformar monocotiledoneas rapidamente.
EP2121935B1 (en) 2006-09-25 2011-07-13 Freie Universität Berlin Transcriptional repressors of cytokinin signaling and their use
EP1949785A1 (en) 2007-01-26 2008-07-30 Coöperatie AVEBE U.A. Use of R-genes as a selection marker in plant transformation and use of cisgenes in plant transformation
EP2450448B1 (en) 2007-03-09 2014-09-17 Monsanto Technology LLC Methods for plant transformation using spectinomycin selection
CN104450640A (zh) 2007-03-23 2015-03-25 巴斯福植物科学有限公司 具有提高的胁迫耐受性和产量的转基因植物
US8609936B2 (en) 2007-04-27 2013-12-17 Monsanto Technology Llc Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis
UA100692C2 (ru) 2007-05-02 2013-01-25 Мериал Лимитед Днк-плазмиды, имеющие повышенную экспрессию и стабильность
EP2152888A2 (en) 2007-05-04 2010-02-17 BASF Plant Science GmbH Enhancement of seed oil / amino acid content by combinations of pyruvate kinase subunits
BRPI0812060A2 (pt) 2007-05-29 2014-10-07 Basf Plant Science Gmbh Planta transgênica, polinucleotídeo isolado, polipeptídeo isolado, e, métodos para produzir uma planta transgênica e para aumentar o crescimento e/ou rendimento de planta sob condições normais ou de água limitada e/ou aumentar a tolerância da planta a um estresse ambiental
AU2008277735A1 (en) 2007-07-13 2009-01-22 Basf Plant Science Gmbh Transgenic plants with increased stress tolerance and yield
BRPI0814379A2 (pt) 2007-08-02 2017-05-09 Basf Plant Science Gmbh planta transgênica transformada com um cassete de expressão, polinucleotídeo isolado, polipeptídeo isolado, e, métodos para produzir uma planta transgênica, e para aumentar o crescimento e/ou a produção de uma planta sob condições normais ou limitadas de água, e/ou aumentar a tolerância de uma planta e um estresse ambiental
AU2008328818A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Basf Plant Science Gmbh Transgenic plants with increased stress tolerance and yield
EP3023499A1 (en) 2008-07-16 2016-05-25 Monsanto Technology LLC Methods and vectors for producing transgenic plants
AU2009284260A1 (en) 2008-08-20 2010-02-25 Basf Plant Science Gmbh Transgenic plants comprising as transgene a phosphatidate cytidylyltransferase
BRPI0919399A2 (pt) 2008-09-23 2016-01-05 Basf Plant Science Gmbh célula de planta transgênica, métodos para aumentar rendimento de uma planta, e para produzir uma planta transgênica, cassete de expressão, vetor de expressão recombinate, produto agrícola, e, usos.
US20120004114A1 (en) 2008-12-22 2012-01-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company And Pioneer Hi-Bred International Nucleotide sequences encoding gsh1 polypeptides and methods of use
US7868688B2 (en) * 2008-12-30 2011-01-11 Cosmic Circuits Private Limited Leakage independent very low bandwith current filter
CN102300992A (zh) 2009-01-28 2011-12-28 巴斯夫植物科学有限公司 为增强转基因植物的干旱抗性和提高其产量而工程化nf-yb转录因子
AU2010209874A1 (en) 2009-01-28 2011-08-18 Basf Plant Science Company Gmbh Transgenic plants having altered nitrogen metabolism
US8507754B2 (en) 2009-01-31 2013-08-13 University Of North Texas Engineering lipids in vegetative tissues of plants
MX2011009550A (es) 2009-03-23 2011-10-12 Basf Plant Science Co Gmbh Plantas transgenicas con mecanismos redox alterados y mayor rendimiento.
WO2011049587A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Monsanto Technology Llc Transgenic soybean plants and chromosomes
US20120311743A1 (en) 2010-02-02 2012-12-06 Bayer Cropscience Ag Soybean transformation using hppd inhibitors as selection agents
CN103269577B (zh) * 2010-07-29 2017-12-26 陶氏益农公司 经修饰以增加植物转化频率的土壤杆菌属的菌株
RU2017129844A (ru) 2011-04-11 2019-02-06 Таргетед Гроус, Инк. Идентификация и применение мутантных krp у растений
AU2013254857B2 (en) 2012-04-23 2018-04-26 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in plants
US10253325B2 (en) 2012-12-19 2019-04-09 Boston Medical Center Corporation Methods for elevating fat/oil content in plants
US10231397B2 (en) 2013-01-29 2019-03-19 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal resistant plants expressing EIN2
CA2897482A1 (en) 2013-01-29 2014-08-07 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal resistant plants expressing hcp7
WO2014117990A1 (en) 2013-01-29 2014-08-07 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal resistant plants expressing hcp6
AR096014A1 (es) 2013-03-08 2015-12-02 Basf Plant Science Co Gmbh PLANTAS RESISTENTES A HONGOS QUE EXPRESAN EL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN Myb (MybTF)
CN103173488B (zh) * 2013-03-14 2014-09-03 浙江省农业科学院 新的融合标签进行水稻转基因快速筛选的方法
WO2014153032A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Evolutionary Genomics, Inc. Identification and use of tomato genes controlling salt/drought tolerance and fruit sweetness
EP3552482B1 (en) 2013-10-29 2022-06-29 Biotech Institute, LLC Breeding, production, processing and use of specialty cannabis
CN107429259A (zh) 2015-02-04 2017-12-01 巴斯夫植物科学有限公司 通过增加莨菪亭含量，增加转基因植物中大豆锈病抗性的方法
US11732269B2 (en) 2015-10-02 2023-08-22 Monsanto Technology Llc Recombinant maize B chromosome sequence and uses thereof
EP3054014A3 (en) 2016-05-10 2016-11-23 BASF Plant Science Company GmbH Use of a fungicide on transgenic plants
US11732268B2 (en) 2016-06-28 2023-08-22 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for use in genome modification in plants
US11530419B2 (en) 2020-10-30 2022-12-20 Fortiphyte, Inc. Pathogen resistance in plants
US20240093220A1 (en) 2022-09-09 2024-03-21 Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Plant regulatory elements and uses thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0116718B2 (en) * 1983-01-13 1996-05-08 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Process for the introduction of expressible genes into plant cell genomes and agrobacterium strains carrying hybrid Ti plasmid vectors useful for this process
NL8300698A (nl) * 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8401048A (nl) * 1984-04-03 1985-11-01 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van eenzaadlobbige planten.
US5149645A (en) * 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
US5177010A (en) * 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
US5187073A (en) * 1986-06-30 1993-02-16 The University Of Toledo Process for transforming gramineae and the products thereof
AU3756889A (en) * 1988-06-01 1990-01-05 The Texas A & M University System Method for transforming plants via the shoot apex
JPH04222527A (ja) * 1990-12-19 1992-08-12 Japan Tobacco Inc トマトの形質転換方法
JPH04330234A (ja) * 1991-03-20 1992-11-18 Japan Tobacco Inc キュウリモザイクウィルス抵抗性トマト及びその作出方法
ATE398679T1 (de) * 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
ES2220913T3 (es) * 1993-09-03 2004-12-16 Japan Tobacco Inc. Procedimiento para la transformacion de monocotiledonas utilizando el escutelo de un embrio inmaduro.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３８（１９８９）ｐ．２７４−２７６

Also Published As

Publication number Publication date
AU1121395A (en) 1995-06-27
CA2155570A1 (en) 1995-06-15
DE69434972D1 (de) 2007-06-28
US5731179A (en) 1998-03-24
EP0687730A4 (en) 2000-11-22
DE69434972T2 (de) 2008-01-24
EP0687730A1 (en) 1995-12-20
WO1995016031A1 (fr) 1995-06-15
PT687730E (pt) 2007-07-02
DK0687730T3 (da) 2007-09-17
CA2155570C (en) 2007-06-26
ATE362527T1 (de) 2007-06-15
ES2287933T3 (es) 2007-12-16
EP0687730B1 (en) 2007-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3102888B2 (ja) 植物の形質転換方法及びそのためのベクター
JP3329819B2 (ja) 未熟胚の胚盤を用いた単子葉植物の形質転換方法
CA2121545C (en) Method for transforming monocotyledons
Cocking et al. Gene transfer in cereals
US7060876B2 (en) Method for transforming monocotyledons
Chowrira et al. Transgenic grain legumes obtained by in planta electroporation-mediated gene transfer
US20060253934A1 (en) Methods for conditional transgene expression and trait removal in plants
MXPA03010967A (es) Cromosomas artificiales de plantas, usos de los mismos y metodos para preparar cromosomas artificiales de plantas.
US20060101540A1 (en) Methods of transforming corn
US20240002870A1 (en) Rapid transformation of monocot leaf explants
JP2002521072A (ja) 高等植物のプラスチド中にて高レベルの蛋白を発現するための翻訳調節エレメントおよびその使用法
EA001039B1 (ru) Способ интеграции экзогенной днк в геном растительной клетки и способ получения фертильного трансгенного растения с интегрированной в геном экзогенной днк
JPH01160489A (ja) 植物ゲノム内への遺伝子の指示された組込みを可能にする組換えｄｎａ分子
Bond et al. Soybean transformation to study molecular physiology
JP2649287B2 (ja) 単子葉植物の形質転換方法
CN112867794A (zh) 用于植物的基因组编辑的dna构建物
JPH03187381A (ja) グルタミンシンテターゼインヒビター耐性に関するダイズ植物の遺伝子操作方法
AU733623B2 (en) Method for transforming plants and vector therefor
AU771116B2 (en) Agrobacterium mediated method of plant transformation
KR100740694B1 (ko) 색소체 게놈 내에 삽입된 외래유전자의 이차 재조합을방지하기 위한 벡터개발
RU2149187C1 (ru) Вектор для введения желаемого гена в растение (варианты), способ получения трансгенного растения и способ введения, по крайней мере, двух желаемых генов в растение
Joubert Development of an Agrobacterium vitis transformation system for grapevine

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080825

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090825

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100825

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110825

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110825

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120825

Year of fee payment: 12

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120825

Year of fee payment: 12

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130825

Year of fee payment: 13

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees