MXPA03010967A - Cromosomas artificiales de plantas, usos de los mismos y metodos para preparar cromosomas artificiales de plantas. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan metodos para preparar lineas celulares que contienen cromosomas artificiales de planta, metodos para la preparacion de cromosomas artificiales de planta, metodos para insercion objetivo de ADN heterologo en los cromosomas artificiales de planta, y metodos para suministro de cromosomas de planta para seleccionar celulas y tejidos. En particular, se proporcionan cromosomas de planta artificiales que se componen sustancialmente de unidades de acido nucleico de repeticion de cantidades variantes de heterocromatina y eucromatina. Tambien se proporcionan metodos para utilizar cromosomas artificiales de plantas y animales en la produccion de plantas transgenicas valiosas. Se proporcionan tambien metodos para identificar genes de plantas que codifican rasgos particulares que utilizan cromosomas artificiales y para producir un cromosoma de planta acrocentrico.

Description

CROMOSOMAS ARTIFICIALES PE PLANTAS, USOS PE LOS MISMOS Y MÉTOPOS PARA PREPARAR CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE PLANTAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan los cromosomas artificiales y métodos para producir cromosomas artificiales, particularmente para utilizar en el suministro de ácidos nucleicos y la expresión de los mismos en plantas. También se proporcionan métodos para utilizar en el suministro de ácidos nucleicos en células huésped, que incluyen células de plantas y la expresión de los ácidos nucleicos en las mismas. Se proporcionan las células de plantas resultantes, tejidos, órganos y plantas completas que contienen los cromosomas artificiales, métodos a base de células de plantas para la producción de proteínas heterólogas y métodos para producir organismos transgénicos. particularmente plantas, que utilizan los cromosomas artificiales. La transferencia estable de ácidos nucleicos en células de plantas y la expresión de los ácidos nucleicos en las mismas proponen muchos retos . Muchos esfuerzos en la introducción estable de ácidos nucleicos en células, de plantas han utilizado transformación mediada por Agrobacterium. Agrobacterium es una bacteria de la tierra Gram-negativa que vive libre. Las cepas virulentas de esta bacteria son capaces de infectar tejido de planta e inducen la producción de crecimiento neoplástico comúnmente mencionado como una agalla de corona. Las cepas virulentas de Agrobacterium contienen un ADN plásmido grande conocido como un plásmido Ti que contiene genes requeridos para transferencia de ADN (genes vir) y replicación asi como una región de ADN que se transfiere a células de planta llamadas ADN-T. La región de ADN-T se bordea por las secuencias de borde de ADN-T que son cruciales al proceso de transferencia de ADN. Estas secuencias de borde de ADN-T se reconocen por los genes vir' que codifican en el plásmido Ti y los genes vir son responsables para el proceso de transferencia de ADN. La mayoría de la Agrobacterii de tipo silvestre tienen un rango huésped de planta dicotiledónea relativamente amplio y son capaces de transferir regiones de ADN-T hasta 25 kilobases de ADN (por ejemplo, cepas nopalina) o más (por ejemplo cepas octopina) . Por consiguiente, numerosos métodos para utilizar Agrobacterium para transferir ADN en células de plantas han sido desarrollados con base en el diseño del plásmido Ti para no contener ya los genes responsables para morfología alterada y reemplazar estos genes con un gen recombinante que codifica un rasgo de interés. Existen dos tipos principales de sistemas de transformación de planta basada en Agrobacterium, métodos binarios [véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,940,838] y co-integrante [véase por ejemplo, Fraley et al. (1985) Biotechnology 3:629-635]. Las repeticiones de borde de ADN-T se mantienen en ambos sistemas y se utiliza el proceso de transferencia de ADN natural para transferir la porción de ADN ubicada entre los bordes de ADN-T en la célula de la planta. Otro sistema de transformación celular de planta, llamado biolisticos, implica el bombardeo de células de plantas con partículas microscópicas recubiertas con ADN que codifican un nuevo rasgo. Las partículas se aceleran rápidamente, normalmente por descarga de gas o eléctrica, a través de la pared celular y las membranas, por lo que el ADN se libera en la célula y se incorpora en el genoma de la célula. Este método se utiliza para la transformación de muchos cultivos, incluyendo maíz, trigo, cebada, arroz, especies de árboles de madera y otros. Un número significativo de especies de cultivo de interés comercial se ha transformado utilizando sistemas mediados por Agrobacterium o biolisticos. Sin embargo, estos métodos tienen muchas limitaciones que limitan su utilidad. Por ejemplo, existen límites al tamaño del ADN heterologo que puede ser transferidos utilizando estos métodos; normalmente, únicamente - uno de los dos genes pueden transferirse. Asi, aunque estos métodos pueden tener utilidad para producir productos de cultivo modificados para contener un único nuevo rasgo, tal como tolerancia a los insectos o herbicidas, estos no pueden ser suficientes para transferir el ADN que proporcionará para múltiples rasgos, o segmentos de ADN muy grandes que codifican una multiplicidad de rasgos. Además, las células de plantas genéticamente modificadas producidas por estos métodos tienden a contener el ADN transferido en regiones eucromaticas del ADN genomico. Normalmente, se identifica un gran número de casos de inserción transgénica independientes que deben seleccionarse antes de un episodio adecuado (tal como inserción de un gen en el ADN genomico huésped de manera que proporciona un nivel suficiente de expresión genética dentro de las expectativas temporales y espaciales y sin evidencia de redisposición genética) . Otra limitación de estos métodos es el esfuerzo requerido para utilizarlos en la modificación genética de muchos cultivos comercialmente importantes. Por ejemplo, la eficiencia de transformación puede variar con el cultivo y puede ser baja, notablemente en los cultivos de cereal tal como maíz y trigo. Con frecuencia los genes insertados son dispuestos de otra forma e inestables sobre generaciones. Además Agrobacterium tumefaciens se basa en interacción de parásitos huéspedes para ser exitosos. Esto tiene el efecto que la Agrrojbacterium tiene una preferencia para algunas dicotiledóneas, mientras que otras dicotiledóneas, monocotiledóneas y coniferas son resistentes a la transformación a través de Agrobacterium. Los vectores de auto-replicación se han utilizado también en la transferencia de ácidos nucleicos en células de plantas. Tales vectores episomales contienen secuencias de ADN que se requieren para la replicación de ADN y sustancialmente el vector en una célula viva. En plantas más altas, se han desarrollado muy pocos vectores episomales. Estos vectores episomales tienen la desventaja de tener una capacidad muy limitada para transportar información genética y son inestables. Un ejemplo de vector de planta episomal es el Cauliflower osaic Virus [Brisson et al. (1984) Nature 310:511] . Las limitaciones de estas tecnologías de suministro genético necesitan el desarrollo de sistemas de vector alternativo adecuados para transferir genes grandes (hasta tamaño Mb o más grande) , complejos genéticos, y genes múltiples junto con elementos regulatorios para expresión segura, controlada y persistente del material genético deseado en organismos más elevados, particularmente plantas, sin redisposición provocada por la inserción de mutagénesis. Por lo tanto, es un objeto en la presente proporcionar cromosomas artificiales para la introducción de ácidos nucleicos grandes en células eucarióticas y métodos utilizando los cromosomas artificiales, particularmente para la introducción y expresión de ácidos nucleicos en plantas. Se proporcionan en la presente cromosomas artificiales de plantas y métodos para producir cromosomas artificiales de plantas. Los cromosomas artificiales son cromosomas estables completamente funcionales. Los cromosomas artificiales de plantas provistos en la presente tienen una composición particular que los hace vectores ideales para expresión de nivel elevado, estables, controlados de ácidos nucleicos heterólogos en células de planta. Los cromosomas artificiales son capaces de mantenimiento genómico extra, independiente, replicación y segregación dentro de las células y pueden transportar genes heterólogos múltiples, grandes. Los cromosomas de plantas artificiales proporcionados en la presente son cromosomas no naturales que exhiben una segmentación ordenada que los distingue a partir de cromosomas de origen natural . La apariencia segmentada puede visualizarse utilizando una variedad de técnicas de análisis de cromosoma y se correlaciona con la única estructura de estos cromosomas artificiales, que, en métodos particulares para producir estos cromosomas, pueden elevarse a través de la amplificación de segmentos cromosomales (es decir, cromosomas artificiales basados en la amplificación) . Los cromosomas artificiales a través de toda la región o regiones de segmentación, son predominantemente hechos de una o más unidades de ácido nucleico que se repite o repiten en la región (mencionada como la región de repetición) y que tiene una estructura gruesa similar. Las repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienden a ser de un tamaño similar y comparten algunas secuencias de ácido nucleico comunes, por ejemplo, un sitio de replicación implicado en la amplificación de segmentos de cromosoma y/o algún ácido nucleico heterólogo. Aunque el tamaño de una unidad de ácido nucleico repetitiva puede variar, normalmente tienden a ser mayores de aproximadamente 100 kb, mayores que aproximadamente 500 kb, mayores que aproximadamente 1Mb, mayores de aproximadamente 5 mb o mayores que aproximadamente 10 mb. Normalmente, las repeticiones de una unidad de ácido nucleico son sustancialmente similares en composiciones de ácido nucleico y pueden ser casi idénticas . Las secuencias de ácido nucleico comunes pueden contener secuencias que representan ácido nucleico eucromático y heterocromático. La composición de los cromosomas artificiales basados en la amplificación puede ser que sustancialmente el cromosoma completo exhibe una apariencia segmentada o que únicamente una o más porciones que los hace menos que un cromosoma completo parece segmentado. La composición de los cromosomas artificiales de planta proporcionada en la presente puede variar. Por ejemplo, en algunos de los cromosomas artificiales proporcionados en la presente, la región o regiones de repetición pueden hacerse predominantemente de ADN heterocromático (es decir, la región de repetición o regiones contienen más ADN heterocromáticos que otros tipos de ADN, por ejemplo, ADN eucromático) . En otros cromosomas artificiales proporcionados en la presente, la región o regiones de repetición pueden hacerse predominantemente de ADN eucromático (es decir, la región o regiones de repetición contienen más ADN eucromático que otros tipos de ADN, por ejemplo, el ADN heterocromático) o pueden hacerse de cantidades sustancialmente equivalentes o ADN heterocromático y eucromático, por ejemplo, aproximadamente 40% a aproximadamente 50% de un tipo de ácido nucleico y aproximadamente 50% a aproximadamente 60% del otro tipo de ácido nucleico. La región o regiones de repetición pueden así ser completamente heterocromáticas (mientras aún contengan uno o más genes heterólogos) , o pueden contener cantidades incrementadas de ADN eucromático, tal como, por ejemplo, la región contiene aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de 90% del ADN eucromático. Las secuencias de ácido nucleico comunes dentro de las unidades del ácido nucleico de repetición en una región de repetición pueden contener el ADN que representa ácido nucleico eucromático y ADN que representa ácido nucleico heterocromático. Debido a que el cromosoma artificial completo puede hacerse predominantemente de una región o regiones de repetición (por ejemplo, la composición del cromosoma es tal que la región o regiones repetidas hechas de más de aproximadamente 50% o más de aproximadamente 60% del cromosoma) , esto es así posible para el cromosoma artificial para hacerse predominantemente de heterocromatina o eucromatina, o para hacerse de cantidades sustancialmente equivalentes de heterocromatina y eucromatina, por ejemplo, aproximadamente 40% a aproximadamente 50% de un tipo de ácido nucleico y aproximadamente 50% a aproximadamente 60% del otro tipo de ácido nucleico. Los cromosomas artificiales de plantas proporcionados en la presente pueden aislarse o contenerse dentro de las células o vejigas. También proporcionadas en la presente son células que contienen cromosomas artificiales de plantas como se describe en la presente, incluyendo células de plantas y células de animales. Incluidas entre las células que contienen los cromosomas artificiales de plantas son cualesquiera células que incluyen uno o más cromosomas de plantas. Incluidos, por ejemplo, son células de plantas, incluyendo protoplastos de planta, en el cultivo y dentro de los tejidos de planta, órganos, semillas, polen o plantas completas. Las células de planta que contienen los cromosomas artificiales de plantas pueden ser de cualquier tipo de planta, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas. Por ejemplo, las células de plantas pueden ser de Arabidopsis, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, Daucus, Hordeum, Zea mays, Brassica, Tritic m, Helianthus, Oryza, Glycine fsoya) , gossypium (algodón) . También contempladas son las células de mamíferos y otros animales que contienen los AC de planta. Las células de plantas que contienen cromosomas artificiales de cualquier especie se proporcionan también en la presente. Así, por ejemplo, tales células de plantas pueden contener un cromosoma artificial que contiene un animal, por ejemplo, un centrómero de mamífero o un centrómero de insecto o de ave . Incluidos entre los cromosomas artificiales contenidos dentro de las células de planta como se proporciona en' la presente son predominantemente heterocromáticos [antiguamente mencionados como cromosomas artificiales satélite (los SATAC) ; véase por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,077,697 y 6,025,155 y la Solicitud PCT Internacional Publicada No. WO 97/40183] , minicromosomas que contienen un centrómero de novo, cromosomas artificiales que contienen una o más regiones de unidades de ácido nucleico de repetición en donde la o las regiones de repetición contienen cantidades sustancialmente equivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromático y cromosomas artificiales integradas in vi tro, cada una de cualesquiera especies. Un cromosoma artificial ejemplar es un cromosoma artificial satélite de mamífero que contiene un centrómero de ratón. Incluidas entre las células de plantas que contienen cromosomas artificiales de cualquier especie son células de plantas, incluyendo protoplastos de plantas, en cultivo y dentro de los tejidos de planta, órganos, semillas, polen o plantas completas. Las células de plantas que contienen los cromosomas artificiales pueden ser de cualquier tipo de plantas, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas. Por ejemplo, las células de plantas pueden ser Arabidopsis, Nicotiana, Solanu, Lycopersicon, Daucus, Hordeum, Zea mays, Brassica, Triticum, Helianthus y Oryza. Se proporcionan adicionalmente en la presente métodos para producir cromosomas artificiales de planta. Una modalidad de estos métodos incluye las etapas de introducir ácido nucleico en una célula que contiene cromosomas de plantas y seleccionar una célula que contiene un cromosoma artificial que contiene una o más regiones de repetición en donde una o más unidades de ácido nucleico se repiten. Las repeticiones de una unidad de ácido nucleico en una región de repetición pueden contener secuencias de ácido nucleico comunes y pueden ser süstancialmente idénticas. En algunas modalidades de este método, la o las regiones de repetición del cromosoma artificial contienen cantidades süstancialmente equivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromático . El cromosoma artificial puede hacerse predominantemente de una o más regiones de repetición. En modalidades adicionales de este método, el cromosoma artificial se hace de cantidades süstancialmente equivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromatico. En modalidades adicionales de este método, las repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes que contienen secuencias que representan ácido nucleico eucromatico y heterocromatico. Puede utilizarse cualquier célula que contenga cromosomas de plantas en estas modalidades de métodos para producir cromosomas artificiales de plantas descritos en la presente. Por ejemplo, la célula puede ser cualquier célula que contenga cromosomas a partir de Arabidopsis, tabaco, Solanum, Lycopersicon, Daucus, Hordeum, Zea mays, Brassica, Triticum, Oryza, Capsicum, lenteja y/o Helianthus, incluyendo células o protoplastos de Arabidopsis, tabaco y/o Helianthus. El ácido nucleico se introduce en una célula que contiene cromosomas de plantas en métodos para producir un cromosoma artificial de plantas como se proporciona en la presente puede ser cualquier ácido nucleico, incluyendo pero no limitándose a, ADN satélite, ADNr y ADN de fago lambda. El ADN satélite y ADNr incluyen tales ADN a partir de plantas, tales como por ejemplo, Arabidopsis, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, Daucus, Hordeum, Zea mays, Brassica, Triticum y Oryza, y de animales, tales como mamíferos. El ADNr puede contener secuencias de una región espadadora intergénica, como puede obtenerse, por ejemplo, de ADN de Arabidopsis, Solanum, Lycopersicon, Hordeum, Zea, Oryza, centeno, trigo, rábano y judía de Lima. En algunas modalidades del método, el ácido nucleico contiene una secuencia de ácido nucleico que facilita la amplificación de una región de un cromosoma de planta o dirigirlo a una región amplificable de un cromosoma de planta. En modalidades adicionales de los métodos para producir cromosomas artificiales de planta proporcionadas en la presente, el ácido nucleico que se introduce en una célula que contiene uno más cromosomas de plantas incluye ácido nucleico para identificación de células que contienen el ácido nucleico. Tales ácidos nucleicos incluyen ácido nucleico que codifica una protexna fluorescente, tal como una proteína fluorescente verde, azul o roja, y ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable, tal como, por ejemplo proteínas que confieren resistencia a fosfinitricina, glufosinato de amonio, glifosato, kanamicina, higromicina, dihidrofolato o sulfonilurea . En modalidades de los métodos para producir cromosomas artificiales de plantas en donde el ácido nucleico se introduce en una célula que contiene uno o más cromosomas de plantas, la célula puede cultivarse a través de dos o más duplicaciones celulares, y normalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 60, o aproximadamente 5 a aproximadamente 55, o aproximadamente 10 a aproximadamente 55, o aproximadamente 25 a aproximadamente 55, o aproximadamente 35 a aproximadamente 55 duplicaciones celulares siguiendo la introducción del ácido nucleico en una célula. La etapa de seleccionar una célula que contiene un cromosoma artificial de planta puede incluir la clasificación de células en donde el ácido nucleico se introdujo. Por ejemplo, las células pueden clasificarse con base en la presencia de un marcador seleccionable , tal como una proteína reportera, o por crecimiento (cultivo) de las células bajo condiciones selectivas. La etapa de selección puede incluir análisis de hibridación in situ fluorescente (FISH) de células en donde el ácido nucleico se introduce. También proporcionados son métodos para producir una planta transgénica utilizando cromosomas artificiales que funcionan en plantas y plantas transgénicas que contienen cromosomas artificiales. Los cromosomas artificiales utilizados en los métodos para producir plantas transgénicas pueden ser de cualquier especie. Por ejemplo, los cromosomas artificiales pueden contener un centrómero de especies tales como animales, por ejemplo, mamíferos, aves, plantas, o insectos, que funcionan para segregar ácidos nucleicos a células hijas a través de división celular. En algunas modalidades de los métodos para producir una planta transgénica, los cromosomas artificiales contienen regiones repetidas predominantemente hechas de repeticiones de una o más unidades de ácido nucleico. Las repeticiones de una unidad de ácido nucleico pueden compartir algunas secuencias de ácido nucleico comunes, por ejemplo, un sitio de replicación implicado en la amplificación de segmentos de cromosoma y/o algún ácido nucleico heterólogo. Las repeticiones de una unidad de ácido nucleico pueden ser sustancialmente idénticas. Las secuencias de ácido nucleico comunes de repeticiones de una unidad de ácido nucleico pueden contener secuencias que representan ácido nucleico eucromático y heterocromático . Las regiones de repetición de los cromosomas artificiales que pueden utilizarse en los métodos para producir una planta transgénica pueden hacerse de cantidades sustancialmente equivalentes de ADN heterocromático y eucromático o pueden hacerse predominantemente de ADN heterocromático o pueden hacerse predominantemente de ADN eucromático. El cromosoma artificial puede hacerse predominantemente de ADN heterocromático o eucromático o pueden hacerse de cantidades sustancialmente equivalentes de heterocromatina y eucromatina. Tales cromosomas artificiales que contienen centrómeros de planta pueden contener un centrómero de planta a partir de cualquier especie de planta, incluyendo monocotiledoneas y dicotiledóneas. Por ejemplo, el centrómero puede hacerse de Arabidopsis, tabaco, Helianthus, Solanum, Lycopersicon, Daucus, Hordeum, Zea, Brassica, Tríticum, centeno, trigo, rábano, judía de Lima u Oryza. Los cromosomas artificiales pueden hacerse utilizando métodos descritos en la presente. En un método para producir una planta transgénica proporcionada en la presente, un cromosoma artificial, tal como aquellos descritos anteriormente y en otra parte en la presente, se introducen en una célula de planta. El cromosona artificial puede contener ácido nucleico heterólogo que codifica un producto genético tal como, por ejemplo, una enzima, un AN antisentido, AKNt, ADNr, una proteína estructural, un marcador o proteína reportera, un ligando, un receptor, una ribozina, una proteína terapéutica, una proteína biofarmacéutica, una vacuna, un factor sanguíneo, un antígeno, una hormona, una citocina, un factor de crecimiento o un anticuerpo. El producto puede ser uno que se proporciona para la resistencia a las enfermedades, insectos, herbicidas o tensión en la planta. El producto puede ser aquel que se proporciona para una cepa agronómicamente importante en la planta y/o que altera la utilización y/o mejora la calidad nutriente de la planta. El ácido nucleico heterólogo de un cromosoma artificial puede contenerse dentro de un cromosoma artificial bacterial (BAC) o un cromosoma artificial de levadura (YAC) . La célula de planta en la cual tales cromosomas artificiales pueden introducirse en métodos para producir una planta transgénica proporcionada en la presente puede ser cualquier especie de célula de planta, incluyendo, pero no limitándose a, Arabidopsis, tabaco, Helianthus, Solanum, Lycopersicon, Daucus, Hordeum, Zea, Brassica, Triticum, centeno, trigo, rábano, judia de Lima, Capsicum, lenteja y Oryza. Puede utilizarse cualquier célula que puede desarrollarse en una planta, incluyendo células de planta y protoplastos o embriones de planta, callos, tejidos, áreas de células en división, órganos, semillas, plantón, polen, conductos de polen, o plantas completas . Los cromosomas artificiales pueden introducirse en células de plantas en los métodos para producir una planta transgénica que utiliza cualquier proceso para la transferencia de ácidos nucleicos en células de plantas, incluyendo, pero no limitado a procesos químicos, físicos y eléctricos, y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, los cromosomas artificiales pueden transferirse en células de plantas a través de contacto directo en la ausencia o presencia de un fusógeno, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , fosfato de calcio y/o lípido o pueden encapsularse en una estructura de lípido (por ejemplo, un liposoma) o contenerse dentro de un protoplasto o microcélula que se permite fusionar entonces (en la presencia o ausencia de un fusógeno tal como PEG) con una célula de planta para la introducción del cromosoma artificial en la célula en un método para producir una planta transgénica. Los cromosomas artificiales pueden transferirse a células de plantas que se someten a pulsos eléctricos (por ejemplo, electroporación) y/o ultrasonido (por ejemplo, sonoporación) antes, durante y/o después de la exposición de las células a los cromosomas artificiales. El uso de pulsos eléctricos y/o ultrasonido puede ser en combinación con cualesquiera otros agentes, por ejemplo PEG y/o lípidos, utilizados en transferir ácidos nucleicos en las células de plantas . Los cromosomas artificiales pueden también inyectarse físicamente en las células de plantas a través de una micropipeta o aguja o introducirse en las células de plantas a través del bombardeo de las células con microproyectiles recubiertos con cromosomas. Para facilitar la transferencia de ácidos nucleicos en células de plantas las células receptoras o tejidos pueden someterse a lesión mecánica. Las células de plantas en donde los .cromosomas artificiales se han introducido para propósitos de producir una planta transgénica se cultivan bajo condiciones que permiten la generación de una planta completa de la misma. Las células transformadas pueden analizarse antes para utilizarse en la generación de plantas completas para determinar la adecuabilidad. Por ejemplo, las células pueden analizarse por la presencia de cromosomas artificiales y/o capacidad regenerativa . Las técnicas de regeneración de plantas, muchas de las cuales se conocen por aquellos con experiencia en la técnica, pueden utilizarse para generar plantas completas de, por ejemplo, células, embriones y callos que contienen cromosomas artificiales. Por ejemplo, las plantas pueden regenerarse a partir de células que contienen cromosomas artificiales por la siembra de raices transformadas, plántulas, semilla, plantones y cualquier estructura capaz de crecer en una planta completa. Se proporcionan en la presente además métodos para producir un cromosoma de planta acrocéntrica y métodos para producir cromosomas de planta que contienen regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina, en particular, heterocrornatina pericéntrica y/o satélite. Se proporcionan en la presente también métodos para generar cromosomas de planta acrocéntrica que contienen regiones adyacentes de heterocromatina, tales como heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite, y ADNr en el brazo corto del cromosoma. Una modalidad de estos métodos incluye etapas para introducir ácido nucleico que contiene dos sitios de recombinación sitio-específicos en una célula que contiene uno o más cromosomas de plantas, recombinando ácidos nucleicos de los sitios de recombinación sitio-específicos, y seleccionando una célula que contiene un cromosoma de planta acrocéntrico y/o un cromosoma de planta que contiene regiones adyacentes del ADNr y heterocromatina. Los dos sitios de recombinación sitio-específicos pueden contenerse en fragmentos de ácido nucleico separados que se introducen en la célula simultánea o secuencialmente . Otras modalidades de los métodos para producir un cromosoma de planta acrocéntrica y/o un cromosoma de planta que contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina incluye etapas para introducir un primer ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico en un primer cromosoma de planta, introduciendo un segundo ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico en un segundo cromosoma de planta, recombinando ácidos nucleicos del primer y segundo cromosomas y seleccionando un cromosoma de planta que es acrocéntrico o que contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina. Por ejemplo, para producir un cromosoma de planta acrocéntrico, el primer ácido nucleico puede introducirse en, o adyacente a la heterocromatina pericéntrica del primer cromosoma y/o el segundo ácido nucleico puede introducirse en el extremo distal del brazo del segundo cromosoma. Para producir un cromosoma de planta acrocéntrica que contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina, por ejemplo, el primer ácido nucleico puede introducirse en o adyacente a la heterocromatina pericéntrica o en el brazo corto de un cromosoma de planta acrocéntrica y el segundo ácido nucleico puede introducirse en o adyacente a ADNr. Para producir un cromosoma de planta que contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina, por ejemplo, el primer ácido nucleico puede introducirse en o adyacente a heterocromatina, tal como heterocromatina pericéntrica o ADN satélite, y el segundo ácido nucleico puede introducirse en o adyacente a ADNr. Cuando los cromosomas se ubican dentro de una célula, el método puede incluir seleccionar una célula que contiene un cromosoma de planta que es acrocéntrico y/o que contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina. Otra modalidad de los métodos para producir un cromosoma de planta acrocéntrica incluye etapas para introducir un primer ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico en la heterocromatina pericéntrica de un cromosoma de planta, introduciendo un segundo ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico en el extremo distal del cromosoma en donde el primer y segundo sitios de recombinación se ubican en el mismo brazo del cromosoma, recombinando ácidos nucleicos del primer y segundo sitios de recombinación en el cromosoma y seleccionando un cromosoma de planta que es acrocéntrico. Otro método para producir un cromosoma de planta acrocéntrica o un cromosoma de planta que contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina incluye etapas para introducir ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación adyacente a, o suficientemente cerca al ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable en una primera célula de planta para la recombinación e introducción del marcador en el cromosoma, generando una primera planta transgénica a partir de la primera célula de la planta introduciendo ácido nucleico que contiene un promotor funcional en una célula de planta y un sitio de recombinación en conexión operativa en una segunda célula de planta, generando una segunda planta transgénica a partir de la segunda célula de planta, atravesando la primera y segunda plantas, obteniendo plantas resistentes a un agente que selecciona para las células que contienen el ácido nucleico que codifica el marcador seleccionable, y seleccionando una planta resistente que contiene células que contienen un cromosoma de planta acrocéntrico o un cromosoma de planta que contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina . Los métodos de esta modalidad pueden opcionalmente incluir etapas para seleccionar primeras y segundas plantas transgénicas tales que una de las plantas contiene un cromosoma que contiene un sitio de recombinación en una región dentro o adyacente a la heterocromatina pericéntrica y las otras plantas que contienen un cromosoma que contiene un sitio de recombinación ubicado dentro o adyacente al ADNr del cromosoma. Estos métodos puede incluir además las etapas de seleccionar primeras y segundas plantas transgénicas en donde una de las plantas contiene un cromosoma que contiene un sitio de recombinación ubicado en un brazo corto del cromosoma en una región adyacente a la heterocromatina pericéntrica; y la otra planta contiene un cromosoma que contiene un sitio de recombinación ubicado en el ADNr del cromosoma. En una modalidad, los sitios de recombinación de los dos cromosomas son en la misma orientación. En los métodos para producir un cromosoma de planta acrocéntrico, uno o ambos de estos sitios de recombinación se ubican en un brazo corto del cromosoma. Por ejemplo una de las plantas contiene un cromosoma que contiene un sitio de recombinación en una región dentro o adyacente a la heterocromat na pericéntrica ubicada en el brazo corto del cromosoma. Las etapas de selección pueden además incluir seleccionar primeras y segundas plantas transgénicas tales que los sitios de recombinación en los dos cromosomas están en la misma orientación. En cualquiera de estos métodos para producir un cromosoma de planta acrocéntrica o un cromosoma de planta que contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina (en particular, heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite), la recombinación entre los primeros y segundos sitios de recombinación sitio-especificos pueden proporcionarse para un número de formas. Por ejemplo, una actividad de recombinasa puede introducirse en una célula que contiene uno o más cromosomas que contienen los sitios que catalizan la reacción de recombinación. La actividad de recombinasa puede codificarse por ácido nucleico que se introduce en la célula simultáneamente con ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico o que se introduce en la célula a un diferente tiempo. La actividad de recombinasa ocurre dentro de la célula hasta la expresión del ácido nucleico que codifica una actividad de recombinasa, que puede operativamente unirse a un promotor funcional en la célula. La actividad de recombinasa puede expresarse constitutivamente o puede inducirse, por ejemplo, uniendo el ácido nucleico que codifica la recombinasa a un promotor inducible . Es también posible que una célula en la cual el ácido nucleico que contiene sitios de recombinación sitio-específicos se introduce contenga una enzima de recombinasa que puede expresarse constitutiva o induciblemente . Alternativamente, una planta transgénica puede generarse a partir de células que contienen los sitios de recombinación y cruzarse con una planta transgénica que contiene ácido nucleico que codifica una recombinasa. Cualquier sistema de recombinasa sitio-específico conocido por aquellos con experiencia en la técnica se contempla para usarse en la presente. Se contempla que uno o una pluralidad de sitios que dirigen la recombinación por la recombinasa se introducen en los ACes (u otros AC) y luego genes heterólogos unidos al sitio análogo se introducen en unos ACes que produce los ACes de plataforma. Los ACes resultantes se introducen en las células con ácido nucleico que codifica la recombinasa análoga, normalmente en un vector, y ácido nucleico que codifica el ácido nucleico heterólogo de interés unido al sitio de recombinacion apropiado para inserción en el cromosoma de ACes. El ácido nucleico que codifica recombinasa puede introducirse en el AC, incluyendo los ACes, o en el mismo o diferente vector a partir del ácido nucleico heterólogo. Para los métodos en la presente, cualquier enzima recombinasa que cataliza recombinación sitio-especifica puede utilizarse para facilitar la recombinación entre el primer y segundo sitios de recombinación sitio-específicos. Una variedad de recombinasas y sitios de adherencia/recombinación de los mismos están disponibles y/o se conocen por aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a: el sistema de recombinación Cre/lox utilizando recombinasa CRE a partir de Escherichia coli fago Pl, el sistema FLP/FRT de levadura utilizando la recombinasa FLP a partir del episoma 2µ de S'aecha omyees cerevisiae, las resolvasas, incluyendo recombinasa Gin de fago Mu, Cin, Hin, ad Tn3 ; la recombinasa Pin de E. Coli, el sistema R/RS del plásmido pSRl de Zygosaccharomyces rouxii, recombinasas de sitio específicas a partir de Kluyveromyces drosophilarium y Kluyveromyces waltii y otros sistemas. También contemplado es el sistema de integrasa de fago lambda E. coli, que incluye 25 la integrasa de fago lambda y los sitios att análogos (véase también solicitud Norteamericana No. de Serie 10/161,403) . En cualquiera de estos métodos para producir cromosomas de planta acrocéntricos , el ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-especifico puede también contener ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable . Los ácidos nucleicos utilizados en los métodos pueden designarse de manera que la expresión del marcador seleccionable ocurra únicamente en el caso de recombinación deseada. Los cromosomas de planta acrocéntricos producidos por los método proporcionados en la presente pueden ser de cualquier composición. Por ejemplo, el ADN del brazo corto del cromosoma acrocéntrico puede contener menos de 5% o menos de 1% de ADN eucromático o no puede contener ADN eucromático. Se proporcionan cromosomas artificiales de planta acrocéntrica en donde el brazo corto del cromosoma acrocéntrico no contiene ADN eucromático. En otra modalidad, un método para producir un cromosoma artificial de planta, que incluye las etapas de introducir el ácido nucleico en un cromosoma acrocéntrico de célula de planta en donde el brazo corto no contiene ADN eucromático; cultivando la célula a través de al menos una división celular; y seleccionando una célula" que contiene un cromosoma artificial, tal como uno que es predominantemente heterocromático, se proporciona. El cromosoma acrocéntrico se produce por el método de cualquiera de los métodos descritos en la presente u otros métodos adecuados . En otra modalidad, un método para producir un cromosoma artificial, que incluye las etapas de introducir ácido nucleico en una célula de planta; y seleccionar una célula de planta que incluye un cromosoma artificial que contiene una o más regiones de repetición se proporciona. En este AC, una o más unidades de ácido nucleico se repiten en una región de repetición; la repetición de una unidad de ácido nucleico tiene secuencias de ácido nucleico comunes; y las secuencias comunes de nucleótidos incluyen secuencias que representan ácido nucleico eucromático y heterocromático. El ácido nucleico puede incluir ADNr de planta a partir de especies de plantas dicotiledóneas o ADNr de planta a partir de especies de plantas monocotiledóneas . La región espadadora intergénica puede ser de ADN de una planta Nicotiana u otra fuente adecuada de tal ADN. El ADNr puede ser ADNr de planta, y la planta puede ser una dicotiledónea o monocotiledónea . También se proporcionan cromosomas artificiales de plantas aisladas que contienen una o más regiones de repetición. En estos AC una o más unidades de ácido nucleico se repiten en una región de repetición; las repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y las secuencias comunes de los nucleótidos incluyen secuencias que representan ácido nucleico eucromático y heterocrómatico . El cromosoma artificial puede producirse por un método que incluye las etapas de: introducir ácido nucleico en una célula de planta; y seleccionar una célula de planta que contiene un cromosoma artificial que contiene una o más regiones de repetición. Las repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y las secuencias de ácido nucleico comunes contienen secuencias que representan ácido nucleico eucromático y heterocromático . En otra modalidad, se proporciona otro método para producir un cromosoma de planta acrocéntrico . El método incluye las etapas de: introducir ácido nucleico que contiene dos sitios de recombinación sitio-específicos en una célula que contiene uno o más cromosomas de planta; introduciendo en la célula una actividad de recombinasa que cataliza la recombinación entre los dos sitios de recombinación para producir un cromosoma acrocéntrico de planta. En la modalidad, los dos sitios de recombinación sitio-específicos pueden estar en fragmentos de ácido nucleico separados, que opcionalmente pueden introducirse en la célula simultánea o secuencialmente . El cromosoma artificial resultante puede ser uno que es predominantemente heterocromático. En otra modalidad, se proporciona un método para producir un cromosoma artificial de planta. El método incluye las etapas de : introducir ácido nucleico en un cromosoma de planta, tal como, pero sin limitarse a, un cromosoma acrocéntrico, en una célula que contiene regiones adyacentes del ADNr y ADN heterocromático; cultivando la célula a través de al menos una división celular; y seleccionando una célula que contiene un cromosoma artificial. El cromosoma artificial resultante puede ser predominantemente heterocromático. El cromosoma acrocéntrico puede ser uno en donde el brazo corto del cromosoma contiene regiones adyacentes de ADNr y ADN heterocromático, tal como, pero sin limitarse a, heterocromatina pericéntrica. También proporcionados son una variedad de vectores. Entre estos son vectores que contienen ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor, en donde el marcador seleccionable permite el crecimiento de células de animales en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células de animal; y en donde el agente no es tóxico a las células de plantas; un sitio de reconocimiento para la recombinación; y una secuencia de nucleótidos que facilitan la amplificación de una región de un cromosoma de planta o dirige el vector a una región amplificable de un cromosoma de planta. Ejemplar de tales vectores es pAglla y pAglIb. Otro vector proporcionado en la presente contiene ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor, en donde el marcador seleccionable permite el crecimiento de células de animales en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células de animal; y en donde el agente no es tóxico a las células de plantas; un sitio de reconocimiento para la recombinación; y el ácido nucleico que codifica una proteína operablemente unida a un promotor de planta. Ejemplar de estos vectores es pAgl y pAg2. Otro vector que se proporciona contiene: ácido nucleico que codifica un marcador estable que no se asocia operablemente con ningún promotor, en donde el marcador seleccionable permite el crecimiento de células en la planta en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células de la planta, pero no tóxico a las células de animales; un sitio de reconocimiento para la recombinación; y el ácido nucleico que codifica una proteína operablemente unida a un promotor de la planta. Otro vector es un vector de transformación de planta que contiene ácido nucleico que codifica un sitio de reconocimiento para la recombinación; una secuencia de nucleótidos que facilita o provoca la amplificación de una región de un cromosoma de planta; uno o más marcadores seleccionables que se expresan en las células de planta para permitir la selección de células que contienen el vector, y ácido nucleico Agrobacterium. El vector es para la transformación mediada por Agrojacfcerium de las plantas. Otro vector que se proporciona contiene un sitio de reconocimiento para la recombinación; y una secuencia de nucleótidos que facilita la amplificación de una región de un cromosoma de planta o dirige el vector en una región amplificable de un cromosoma de planta, en donde la planta se selecciona a partir del grupo que consiste de Arabidopsis, Nicotiana, Solanu, Lycopersicon, Daucus, Hordeum, Zea mays, Brassica, Triticum, Helianthus, soya, algodón y Oryza. En estos vectores, la región amplificable puede contener ácido nucleico heterocromático; la región amplificable puede contener ADNr. Secuencias ejemplares de nucleótidos que facilitan la amplificación de una región de un cromosoma de plantas o que dirige el vector a una región amplificable de un cromosoma de planta son cualquiera que contenga una porción suficiente de una región espadadora intergenica de ADNr para facilitar la amplificación o efecto en el objetivo. Tal porción suficiente puede ser al menos 14, 20, 30, 50, 100, 150, 300, 500, 1 kB, 2 kB, 3 kB, 5 kB, 10 kB o más nucleótidos contiguos a partir de una región espadadora intergénica y/u otra región de ADNr. Un marcador seleccionable ejemplar codifica un producto que confiere resistencia a zeomicina. La proteina en los vectores incluye una proteina que es un marcador seleccionable que permite el crecimiento de las células de planta en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células de planta; tal como, por ejemplo, resistencia a higromicina o a fosfinotricina . Otros marcadores de proteína incluyen, pero no se limitan a, proteínas fluorescentes, tales como, por ejemplo, proteínas fluorescentes verde, azul y roja. Un sitio de reconocimiento ejemplar que contiene un sitio att. Los promotores ejemplares para inclusión en los vectores, incluyen, pero no se limitan a, nopalina sintasa (NOS) o CaMV35S. Se proporcionan células que contienen cualquiera de los vectores o mezclas de las mismas. Las células incluyen cualesquiera células que tienen al menos un cromosoma de planta, tal como una célula de planta. Las células pueden ser protoplastos .. Se proporcionan métodos que utilizan estos vectores . Los métodos incluyen una etapa de introducción a uno de los vectores en una célula, tales como una célula que contiene al menos un cromosoma de planta. Tal vector es por ejemplo, un vector que contiene ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor, en donde el marcador seleccionable permite el crecimiento de células de animal en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células del animal pero no es tóxico a las células de la planta; un sitio de reconocimiento para la recombinación; y el ácido nucleico que codifica una proteína operablemente unida a un promotor de planta. En este método, la célula contiene un animal, tal como un mamífero, una plataforma de los ACes que contiene un sitio de reconocimiento, tal como, por ejemplo, un sitio att, que recombina con el sitio de reconocimiento en el vector en la presencia de la recombinasa, por lo que incorpora el marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor y el ácido nucleico que codifica una proteína operablemente unida a un promotor de planta en la plataforma de los ACes para producir una plataforma resultante de los ACes. La plataforma de los ACes puede contener un promotor que, hasta la recombinación se une operablemente al marcador seleccionable que en el vector no se asocia operablemente con un promotor. El método puede además incluir transferir la plataforma de los ACes resultante en una célula de planta para producir una célula de planta que contiene la plataforma de los ACes. El método opcionalmente incluye además cultivar la célula de planta que contiene la plataforma de los ACes bajo condiciones por lo cual la proteína que codifica por el ácido nucleico que se une operablemente a un promotor de planta se expresa. La plataforma de los ACes resultante opcionalmente se aisla antes de transferirse. Los ACes pueden introducirse en una célula de planta por cualquier método adecuado, tal como uno seleccionado de entre transíección de protoplasto, suministro mediado por lípido, liposomas, electroporación, sonoporación, microinyección, bombardeo de partículas, transformación mediada por filamento de carburo de silicio, incorporación de ADN mediado por (PEG) polietilenglicol , lipofección y sistemas portadores mediados por lipido. La plataforma de los ACes resultante puede transferirse por fusión de las células, que por ejemplo son protoplastos de planta. En otra modalidad, la célula puede ser una célula de animal, tal como un mamífero, incluyendo célula humana. En otro método, se introduce un vector en una célula de planta. Tal vector por ejemplo, puede ser un vector que incluye ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor, en donde el marcador seleccionable permite el crecimiento de las células de animales en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células de animales pero no es tóxico a las células de la planta; un sitio de reconocimiento para la recombinación; y una secuencia de nucleótidos que facilitan la amplificación de una región de un cromosoma de planta o dirige el vector a una región amplificable de un cromosoma de planta. Las células de la planta se cultivan y una o unas células de plantas que contienen un cromosoma artificial que contienen una o más regiones de repetición se seleccionan. En este método, una porción suficiente del vector puede integrarse en un cromosoma en la célula de la planta para resultar en la amplificación de ADN cromosomal . El cromosoma artificial seleccionado resultante puede ser uno en donde una o más unidades de ácido nucleico se repiten en una región de repetición; las repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y la o las regiones de repetición contienen sustancialmente cantidades equivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromático . El cromosoma artificial resultante producido en el método opcionalmente puede aislarse. Se proporciona también otro método. Este método incluye las etapas de introducir un vector en una célula, y cultivar la célula resultante bajo condiciones, por lo que la proteína codificada por el ácido nucleico unida operablemente a un promotor animal se expresa. En el método el vector puede contener: ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor, en donde el marcador seleccionable permite el crecimiento de células de animales en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células del animal pero no es tóxico a las células de la planta; un sitio de reconocimiento para la recombinación; y ácido nucleico que codifica una proteína unida operablemente a un promotor animal . La célula puede contener un cromosoma artificial de la planta plataforma (PAC) que contiene un sitio de recombinación y un promotor animal que hasta la recombinación se une operablemente al marcador seleccionable que en el vector no se asocia operablemente con un promotor. La introducción puede afectarse bajo condiciones por las cuales el vector recombina con el PAC para producir una plataforma de planta PAC que contenga el marcador seleccionable operablemente unido al promotor. En este método, el cromosoma artificial puede ser un ACes. Además, la plataforma de planta PAC puede ser un ACes . Los vectores, tales como aquellos que contienen ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor, en donde el marcador seleccionable permite el crecimiento de células de animales en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células del animal pero no es tóxico a las células de la planta; un sitio de reconocimiento para la recombinación; y una secuencia de nucleótidos que facilitan la amplificación de una región de un cromosoma de planta o dirige el vector a una región amplificable de un cromosoma de planta, y los vectores de transformación de planta que contienen el ácido nucleico por transformación mediada por Agrobacterium de plantas, pueden utilizarse para producir cromosomas artificiales. En un método ejemplar, tal vector se introduce en una célula que contiene uno o más cromosomas de planta; y se selecciona una célula que contiene un cromosoma artificial que contiene una o más regiones de repetición. El cromosoma artificial contiene una o más unidades de ácido nucleico que se repiten en una región de repetición; las repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y las secuencias de ácido nucleico comunes contienen secuencias que representan ácido nucleico eucromático y heterocromático . En otro método, una célula que contiene un cromosoma artificial que contiene una o más regiones de repetición se selecciona. El cromosoma artificial contiene una o más unidades nucleicas que se repiten en una región de repetición; repeticiones de una unidad de ácido nucleico tiene secuencias de ácido nucleico comunes ; y la o las regiones de repetición contienen sustancialmente cantidades equivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromático. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 proporciona un mapa del plásmido pAgl . La Figura 2 proporciona una representación esquemática de la construcción del plásmido pAgl . La Figura 3 proporciona un mapa del plásmido pAg2. La Figura 4 proporciona una representación esquemática de la construcción del plásmido pAg2. La Figura 5 proporciona una representación esquemática de la construcción de los plásmidos pAglIa y pAgllb. Las Figuras 6A-6B proporcionan mapas de restricción del ADN insertado en pAgl para formar plásmidos · pAglIa y pAgllb. La Figura 7 proporciona un mapa del plásmido pSV40193attPsensePUR. La Figura 8 describe un método para la formación de una plataforma de cromosoma con sitios de integración de recombinación múltiple, tales como sitios attP. La Figura 9 resume diagramáticamente la tecnología de plataforma; el marcador 1 permite la selección de cromosomas artificiales que contienen el sitio de integración, el marcador 2, que está sin promotor en el vector donador permite la selección de recombinantes . En la recombinación con el marcador 2 de plataforma, se expresa bajo el control de un residente promotor en la plataforma. Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien con experiencia en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes publicadas y otras publicaciones y secuencias de aminoácido y nucleótido publicadas (por ejemplo, secuencias disponibles en GenBank u otras bases de datos) , referidas en la presente se incorporan para referencia en su totalidad. Cuando la referencia se hace a un URL u otro identificador o dirección, se entiende que tales identificadores pueden cambiar y la particular información en la Internet puede ir y venir, pero la información equivalente puede encontrarse investigando en la Internet. La referencia a eso hace evidente la disponibilidad y diseminación pública de tal información. Como se utiliza en la presente, un cromosoma es una composición definida de ácido nucleico que es capaz de replicación y segregación dentro de una célula hasta la división celular. Normalmente, un cromosoma puede contener una región centromérica, regiones teloméricas y una región del ácido nucleico entre las regiones centroméricas y teloméricas . Como se utiliza en la presente, un centrómero es una composición molecular que incluye una secuencia de ácido nucleico que confiere una capacidad para segregar unas células hijas a través de la división celular. Un centrómero puede conferir segregación estable de una secuencia de ácido nucleico, incluyendo un cromosoma artificial que contiene el centrómero, a través de divisiones mitóticas y/o meióticas. Un centrómero de planta no se deriva necesariamente de las plantas, pero tiene la capacidad para promover la segregación de ADN en las células de la planta.

Como se utiliza en la presente, la eucromatina y heterocromatina tienen sus significados reconocidos. La eucromatina se refiere a cromatina que tiñe difusamente y que normalmente contiene genes, y la heterocromatina se refiere a cromatina que permanece inusualmente condensada y que se ha pensado que es transcripcionalmente inactiva o tiene baja actividad transcripcional en relación con la eucromatina. Las secuencias de ADN elevadamente repetitivas (ADN satélite) se ubican usualmente en regiones de la heterocromatina que rodea el centrómero (heterocromatina pericéntrica o pericentromérica) . La heterocromatina constitutiva se refiere a heterocromatina que contiene el ADN altamente repetitivo que se condensa constitutivamente e inactiva genéticamente. Como se utiliza en la presente, un cromosoma acrocéntrico se refiere a un cromosoma con brazos de longitud desigual . Como se utiliza en la presente, los cromosomas endógenos se refieren a cromosomas genómicos como se encuentran en la célula anterior para la generación o introducción de un cromosoma artificial. Como se utiliza en la presente, los cromosomas artificiales son moléculas de ácido nucleico, normalmente ADN, que replican establemente y segregan cromosomas endógenos al lado en células y tienen la capacidad para acomodar y expresar genes heterólogos contenidos en la presente . Un cromosoma artificial de mamífero (MAC) se refiere a un cromosoma que tiene uno o unos centromeros de mamífero activo o activos. Los cromosomas artificiales de planta (PAC) , cromosomas artificiales de insecto y cromosomas artificiales de aves se refieren a cromosomas que incluyen centromeros que funcionan en las células de la planta, insecto y aves, respectivamente. El cromosoma artificial humano (HAC) se refiere a cromosomas que incluyen centromeros que funcionan en células humanas. Para cromosomas artificiales ejemplares, véase, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,025,155; 6,077,697; 5,288,625; 5,712,134; 5,695,967; 5,869,294; 5,891,691 y 5,721,118 y solicitudes PCT Internacionales publicadas Nos. O 97/40183 y WO 98/08964. Como se utiliza en la presente, la amplificación, con referencia al ADN, es un proceso en donde los segmentos de ADN se duplican para producir dos o múltiples copias de segmentos de ADN sustancialmente similares o idénticos o casi idénticos que se unen normalmente como tándem sustancialmente o repeticiones sucesivas o repeticiones invertidas. Como se utiliza en la presente, los cromosomas artificiales basados en la amplificación son cromosomas artificiales derivados de cromosomas naturales o endógenos en virtud de un hecho de amplificación, tal como uno que puede iniciarse por la introducción de ácido nucleico heterólogo en heterocromatina, por ejemplo, heterocromatina pericéntrica, en un cromosoma. Como un resultado de tal hecho, los cromosomas y/o fragmentos del mismo exhiben patrones de repetición, o segmentados elevados. Los cromosomas artificiales pueden formarse a partir de estos cromosomas y fragmentos. Por lo tanto, los cromosomas artificiales basados en amplificación se refieren a cromosomas no naturales o aislados que exhiben una segmentación ordenada que no se observa normalmente en cromosomas de origen natural . Los cromosomas artificiales basados en la amplificación pueden también distinguirse de cromosomas de origen natural en virtud de su tamaño más pequeño típicamente y apariencia con frecuencia segmentada cuando se visualiza. La apariencia segmentada, la cual puede visualizarse utilizando una variedad de técnicas de análisis de cromosoma como se describe en la presente y conocen por aquellos con experiencia en la técnica, se correlaciona con la única estructura de estos cromosomas artificiales. Además para contener uno o más centrómeros, los cromosomas artificiales basados en amplificación, a través de toda la región o regiones de segmentación, se hacen predominantemente de una o más unidades de ácido nucleico, también referidas como "amplicones" que se repiten en la región y que tienen una estructura gruesa similar. Así, una región de segmentación puede referirse como una región de repetición. Las repeticiones de un amplicón tienden a ser de tamaño similar y comparten algunas secuencias de ácido nucleico comunes. Por ejemplo, cada repetición de un amplicón puede contener un sitio de replicación implicado en la amplificación de segmentos de cromosoma y/o algún ácido nucleico heterólogo que se utilizó en la producción inicial del cromosoma artificial. Normalmente, las unidades de repetición son sustancialmente similares en la composición del ácido nucleico y pueden ser casi idénticas. Las secuencias de ácido nucleico comunes pueden contener secuencias que representan ácido nucleico eucromático y heterocromático . Los tamaños de amplicón varían pero normalmente tienden a ser mayores de aproximadamente 100 kb, mayores que aproximadamente 500 kb, mayores que aproximadamente 1 Mb, mayores que aproximadamente 5 Mb o mayores que aproximadamente 10 Mb. La composición de los cromosomas artificiales basados en la amplificación pueden ser tales que sustancialmente el cromosoma completo exhibe una apariencia segmentada o tal que únicamente una o más porciones que realizan menos que el cromosoma entero parece segmentado. Los cromosomas artificiales basados en la amplificación pueden también diferirse dependiendo de la región cromosomal que tiene amplificación experimentada en el proceso de la formación de cromosoma artificial. Las estructuras de los cromosomas resultantes pueden variar dependiendo del caso de iniciación y/o las condiciones bajo las cuales se introduce el ácido nucleico heterólogo, incluyendo la modificación a los cromosomas endógenos. Por ejemplo, en algunos de los cromosomas artificiales proporcionados en la presente, la región o regiones de la segmentación puede hacerse predominantemente de ADN heterocromático . En otros cromosomas artificiales proporcionados en la presente, la región o regiones de la segmentación pueden hacerse predominantemente de ADN eucromático o pueden hacerse de cantidades similares de ADN heterocromático y eucromático. La región o regiones de segmentación pueden así ser completamente heterocromáticas (mientras que aún contengan una o más secuencias del ácido nucleico heterólogo) , o pueden contener incrementar cantidades de ADN eucromático, tales que por ejemplo, la región contenga aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de 90% del ADN eucromático. Debido a que el cromosoma artificial completo puede hacerse predominantemente de una región o regiones de segmentación, es posible así para el cromosoma artificial hacerse predominantemente de heterocromatina o eucromatina, o hacerse de cantidades sustancialmente equivalentes de heterocromatina y eucromatina, por ejemplo, aproximadamente 40% a aproximadamente 50% de un tipo de ácido nucleico y aproximadamente 50% a aproximadamente 60% del otro tipo de ácido nucleico.

Como se utiliza en la presente el término "predominantemente" con respecto a la composición generalmente se refiere a un estado de la composición en donde éste puede caracterizarse como, que es o que tiene más de la característica predominante que las otras características que no son predominantes. La característica predominante puede representar más de aproximadamente 50%, más de aproximadamente 60%, más de aproximadamente 70%, más de aproximadamente 80%, más de aproximadamente 90%, más de aproximadamente 95% o esencialmente 100% de la composición. Así, por ejemplo, una región de repetición que se hace predominantemente de ADN heterocromático contiene más ADN heterocromático que otros tipos, por ejemplo, eucromático, de ADN. La región de repetición puede ser más de aproximadamente 50%, más de aproximadamente 60%, más de aproximadamente 70%, más de aproximadamente 80%, más de aproximadamente 90%, o más de aproximadamente 95% de ADN heterocromático o puede ser esencialmente 100% del ADN heterocromático. Un cromosoma artificial predominantemente hecho de heterocromatina contiene más ADN heterocromático que otros tipos, por ejemplo, eucromático, del ADN y pueden ser más de aproximadamente 50%, más de aproximadamente 60%, más de aproximadamente 70%, más de aproximadamente 80%, más de aproximadamente 90% o más de aproximadamente 95% del ADN heterocromático -o puede ser esencialmente 100% del ADN heterocromático . Como se utiliza en la presente, un amplicón es una unidad de ácido nucleico repetida. En algunos de los cromosomas artificiales descritos en la presente, un amplicón puede contener un conjunto de repeticiones invertidas de un mega-replicón. Un mega-replicón representa una unidad de replicacion de orden más elevado. Por ejemplo, con referencia a algunos cromosomas artificiales predominantemente heterocromáticos , part cularmente cromosomas eucarióticos, descritos en la presente, la mega-replicación puede contener un conjunto de bloques de ADN tándem (por ejemplo, ~ 7.5 MB de bloques de ADN) cada uno contiene ADN satélite flanqueado por el ADN no satélite o puede sustancialmente hacerse de ADNr. Contenido dentro del mega-replicón está un sitio de replicón primario, referido como el mega-replicador, que puede implicarse en la organización y facilitación de la replicacion de segmentos de cromosomas, incluyendo por ejemplo, heterocromatina, heterocromatina pericéntrica, ADNr y/o posiblemente los centrómeros. Dentro del mega-replicón pueden haber replicones secundarios más pequeños (por ejemplo, 50-300 kb) . Como se utiliza en la presente, amplificable , cuando se utiliza en la referencia a un cromosoma, particularmente el método para generar cromosoma artificial proporcionado en la presente, se refiere a una región de un cromosoma que tiene tendencia a la amplificación. La amplificación normalmente ocurre durante la replicación y otros casos celulares implicando la recombinación (por ejemplo, reparación de ADN), incluidas entre tales regiones están regiones del cromosoma que contienen repeticiones tándem tales como ADN satélite, ADNr y otras secuencias. Entre los sistemas de cromosoma artificiales proporcionados en la presente están aquellos que son minicromosomas predominantemente heterocromáticos (formalmente referidos como cromosomas artificiales satélite (los SATAC) , véanse por e emplo las Patentes Norteamericanas Nos. 6,077,697 y 6,025,155 y la solicitud PCT Internacional publicada No. WO 97/40183) , que contienen un centromero de novo, cromosomas artificiales que contienen una o más regiones de unidades del ácido nucleico de repetición en donde la < o las regiones de repetición contienen cantidades sustancialmente equivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromático y cromosomas artificiales integrados in vi tro. De particular interés en la presente son cromosomas artificiales que introducen y expresan ácidos nucleicos heterólogos en plantas. Estos incluyen cromosomas artificiales que tienen un centromero derivado de una planta, y. también cromosomas artificiales que tienen centrómeros que pueden derivarse de otros organismos, pero que funcionan en plantas. Los métodos para la construcción, aislamiento y suministro a células objetivo de cada tipo de cromosoma artificial se proporcionan en la presente. Como se utiliza en la presente, el ácido nucleico objetivo a un lugar en un cromosoma significa que el ácido nucleico integra a, o cerca del lugar objetivo. Cualquier método o medio para efectuar tal integración, incluyendo, pero sin limitarse a, recombinación homologa, se contempla. Como se utiliza en la presente, un cromosoma dicéntrico es un cromosoma que contiene dos centrómeros. Un cromosoma multicéntrico contiene más de dos centrómeros. Como se utiliza en la presente, un cromosoma formalmente dicéntrico es un cromosoma que se produce cuando un cromosoma dicéntrico se fragmenta y adquiere nuevos telómeros de manera que dos cromosomas, cada uno teniendo uno de los centrómeros, se produce. Cada uno de los fragmentos son cromosomas replicables . Si uno de los cromosomas experimenta amplificación de ADN eucromático principalmente para producir un cromosoma completamente funcional que es predominantemente eucromatina (más de aproximadamente 50%, más de aproximadamente 70% o más de aproximadamente 90% de eucromatina) , esto es un minieromosoma. El cromosoma restante es un cromosoma formalmente dicéntrico. Si uno de los cromosomas experimenta amplificación, por lo que la heterocromatina (tal como, por ejemplo, ADN satélite) se amplifica y una porción eucromática permanece (tal como, por e emplo, un brazo) , se refiere como un cromosoma en chorizo. Un cromosoma que es sustancialmente todo heterocromatina, excepto para las porciones del ADN heterólogo, se llama un cromosoma artificial predominantemente heterocromático . Los cromosomas artificiales predominantemente heterocromáticos pueden producirse de otros cromosomas artificiales parcialmente heterocromáticos cultivando la célula que contiene tales cromosomas bajo condiciones que desestabilizan el cromosoma y/o bajo condiciones selectivas de manera que se produce un cromosoma artificial predominantemente heterocromático. Para propósitos de la presente, se entiende que los cromosomas artificiales pueden no ser producidos necesariamente en etapas múltiples, sino que pueden aparecer después de la introducción inicial del ADN heterólogo. Normalmente, los cromosomas artificiales aparecen después de aproximadamente 5 a aproximadamente 60, o aproximadamente 5 a aproximadamente 55, o aproximadamente 10 a aproximadamente 55 o aproximadamente 25 a aproximadamente 55 o aproximadamente 35 a aproximadamente 55 divisiones celulares siguiendo la introducción del ácido nucleico en una célula. Los cromosomas artificiales pueden, sin embargo, aparecer después de única y aproximadamente 5 a aproximadamente 15 o aproximadamente 10 a aproximadamente 15 divisiones celulares. Como se utiliza en la presente, el término "cromosoma artificial basado en ADN satélite (SATAC) " es intercambiable con el término "sistema de expresión de cromosoma artificial (ACes) " . Estos cromosomas artificiales (ACes) incluyen aquellos que son secuencias no codificadas sustancialmente todas neutrales (heterocromatina) excepto por heterólogos extraños, normalmente ácido nucleico que codifica un gen o proteína, que puede interesparcirse dentro de la hetercromatina para la expresión en la presente (véanse las Patentes Norteamericanas Nos. 6,025,155 y 6,077,697 y la solicitud PCT Internacional No. O 97/40183), o que está en un lugar solo como se proporciona en la presente. La característica estructural delineante es la presencia de unidades de repetición, que son en general predominantemente heterocromatina. La estructura precisa del ACes dependerá de la estructura del cromosoma en donde el hecho de amplificación inicial ocurre; todos comparten la característica común de incluir un patrón definido de unidades de repetición. Generalmente, el ACes tiene más heterocromatina que la eucromatina. Las moléculas de ácido nucleico ajenas (genes heterólogos) contenidas en estos sistemas de expresión de cromosoma artificial pueden incluir cualquier ácido nucleico cuya expresión es de interés en una célula huésped particular. Como se utiliza en la presente,' un cromosoma artificial que es predominantemente heterocromático (es decir, contiene más heterocromatina que eucromatina, normalmente más de aproximadamente 50%, más de aproximadamente 60%, más de aproximadamente 70%, más de aproximadamente 80% o más de aproximadamente 90% de heterocromatina) puede producirse introduciendo moléculas de ácido nucleico en las células, particularmente células de planta, y seleccionando células que contengan un cromosoma artificial predominantemente heterocromático . Cualquier' cido nucleico puede introducirse en las células en los métodos para producir los cromosomas artificiales. Por ejemplo, el ácido nucleico puede contener un marcador seleccionábale y/o una secuencia que dirige el ácido nucleico a una región heterocromática de un cromosoma, particularmente un cromosoma de planta, tal como en la heterocromatina pericéntrica, en el brazo corto de cromosomas acrocéntricos , ADNr o regiones de' organización nucleolar. Las secuencias objetivo incluyen, pero no se limitan a, ADN de fago lambda, y ADNr, (por ejemplo, una secuencia de un espaciador intergénico de ADNr) particularmente el ADNr de planta, para la producción de cromosomas artificiales predominantemente heterocromáticos en las células de planta. Después de introducir el ácido nucleico en las células, se selecciona una célula que contiene un cromosoma artificial predominantemente heterocromático. Tales células pueden identificarse utilizando una variedad de procedimientos. Por ejemplo, unidades de repetición de ADN heterocromático de estos cromosomas pueden discernirse por técnicas de agrupamiento G y/o C y/o hibridación de fluorescencia in situ (FISH) . Anterior a tales análisis, las células que van a analizarse pueden enriquecerse con células que contienen cromosoma artificial clasificando las células en la base de la presencia de un marcador seleccionable, tal como una proteina reportera, o cosechando (cultivando) las células bajo condiciones selectivas. La selección de las células que contienen ácidos nucleicos amplificados puede también facilitarse por el uso de técnicas tales como PCR y transferencia Southern para identificar líneas celulares con regiones amplificadas. Es también posible, después de la introducción de los ácidos nucleicos en las células, para seleccionar células que tienen un cromosoma multicéntrico , típicamente dicéntrico, un cromosoma formalmente multicéntrico (normalmente dicéntrico) y/o varias estructuras heterocromáticas y para tratarlos cuyos cromosomas artificiales deseados se producen. Las condiciones para la generación de una estructura deseada incluyen, pero no se limitan a, crecimiento adicional bajo condiciones selectivas, introducción de moléculas de ácido nucleico adicional y/o crecimiento bajo condiciones selectivas y tratamiento con agentes desestabilizantes, y otros de tales métodos (véase la solicitud PCT Internacional No. WO 97/40183 y las Patentes Norteamericanas Nos. 6,025,155 y 6,077,697).

Como se utiliza en la presente, los heterólogos y extraños se utilizan intercambiablemente con respecto al ácido nucleico y se refieren a cualquier ácido nucleico, incluyen el ADN y ARN que no son de origen natural como parte del genoma en donde se presentan o que se encuentra en una ubicación o ubicaciones en el genoma que difieren a partir de ese en donde se origina en la naturaleza. Así, el ácido nucleico heterologo o extraño que no se encuentra normalmente en el genoma huésped en un contexto idéntico. Este, es el ácido nucleico que no es endógeno a la célula y que se ha introducido exógenamente en la célula. Ejemplos de ADN heterologo incluyen, pero no se limitan a ADN, que codifica un producto genético o productos genéticos de interés, introducidos para propósitos de modificación de los genes endógenos o para la producción de una proteína codificada. Por ejemplo, un gen heterologo o extraño puede aislarse a partir de una especie diferente de aquella de un genoma huésped, o alternativamente, puede aislarse del genoma huésped pero operablemente unirse a una o más regiones reguladoras que difieren de aquellas encontradas en el gen nativo inalterado. Otros ejemplos de ADN heterologo incluyen, pero no se limitan a ADN que codifica las proteínas marcadoras trazables, y ADN que codifica una proteína que confiere un rasgo de entrada incluyendo, pero no limitándose a resistencia a herbicida, insectos o enfermedades o un rasgo de salida, incluyendo, pero no limitándose a, calidad de aceite o composición de carbohidrato. Los anticuerpos que se codifican por el ADN heterólogo pueden secretarse, secuestrarse, almacenarse en un órgano o tejido, acumularse en el citoplasma u organelos celulares o expresarse en la superficie de la célula en donde el ADN heterólogo se ha introducido . Como se utiliza en la presente, un "marcador seleccionable" es una composición que puede utilizarse para distinguir una célula a partir de otra célula. Por ejemplo, un marcador seleccionable puede ser un ácido nucleico que codifica una proteína fácilmente detectada que se ha introducido en algunas células pero no en otras. La detección de la proteína expresada en las . células facilita la identificación de células que contienen el ácido nucleico marcador distinguiéndolos de las células que no contienen el ácido nucleico. Así, por ejemplo, un marcador seleccionable puede ser una proteína fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP) , o ß-galactosidasa (o un ácido nucleico que codifica cualquiera de estas proteínas) . Los marcadores seleccionables tales como aquellos, que no se requieren para la supervivencia y/o proliferación celular en la presencia de un agente de selección, pueden también referirse como moléculas reporteras . Otros marcadores seleccionables, por ejemplo, el gen de neomicina fosfotransferasa, proporcionado para el aislamiento e identificación de células que los contienen confiriendo propiedades en las células que los hace resistentes a un agente, por ejemplo, un fármaco tal como un antibiótico, que inhibe la proliferación de células que no contienen el marcador . Como se utiliza en la presente, el crecimiento bajo condiciones selectivas significa crecimiento de una célula bajo condiciones que requieren expresión de un marcador seleccionable para supervivencia. Como se utiliza en la presente, un agente que desestabiliza un cromosoma es cualquier agente conocido por aquellos con experiencia en la técnica para mejorar los casos de amplificación, y/o mutaciones. Tales agentes, que incluyen BrdU, son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica . Para generar un cromosoma artificial que contiene un ácido nucleico heterólogo particular de interés, es posible incluir el ácido nucleico de interés en el ácido nucleico que se va a introducir en las células para iniciar la producción del cromosoma artificial. Asi, por ejemplo, un ácido nucleico de interés podría introducirse en una célula junto con el ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable y/o un ácido nucleico que dirige a una región heterocromática de un cromosoma. Por ejemplo, el ácido nucleico de interés puede unirse al o a los ácidos nucleicos objetivo. Alternativamente, el ácido nucleico heterólogo de interés puede introducirse en un cromosoma artificial en un tiempo más tarde después de la generación inicial del cromosoma artificial . Como se utiliza en la presente, el minicromosoma se refiere a un cromosoma derivado de un. cromosoma multicéntrico, normalmente dicéntrico, que contiene más ADN eucromático que heterocromático . Para propósitos en la presente, el minicromosoma contiene un centromero de novo, preferiblemente un centromero que replica en plantas, más preferiblemente un centromero de planta. Como se utiliza en la presente, de novo con referencia a un centromero, se refiere a la generación de un centromero en exceso en un cromosoma como un resultado de la incorporación de un fragmento de ácido nucleico heterólogo utilizando los métodos en la presente. Como se utiliza en la presente, los cromosomas artificiales integrados in vitro o cromosomas sintéticos son cromosomas artificiales producidos uniendo componentes esenciales de un cromosoma in vitro. Estos componentes incluyen al menos un centromero, un telómero y un origen de replicación. Un cromosoma artificial integrado in vitro puede incluir uno o más megareplicadores . En modalidades particulares, el megareplicador contiene secuencias de ADNr, particularmente ADNr de planta. Como se utiliza en la presente, los cromosomas artificiales de planta integrada in vitro se producen uniendo componentes (por ejemplo, el centrómero, el o los telómeros megareplicadores y un origen de replicación) que funcionan en plantas, y preferiblemente uno o más de los cuales se deriva de una planta. Los cromosomas artificiales integrados in vitro pueden contener cualquier cantidad de ácido nucleico heterocromático y/o eucromático. Por ejemplo, un cromosoma artificial integrado in vivo puede sustancialmente ser todo heterocromatina, o puede contener cantidades incrementadas de ADN eucromático, tales como, por ejemplo, éste contiene aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de aproximadamente 90% de ADN eucromático. Los cromosomas artificiales integrados in vitro pueden contener una o más regiones de segmentación como se describe con referencia a los cromosomas artificiales basados en amplificación. Como se utiliza en la presente, la plataforma de cromosoma artificial se refiere a un cromosoma artificial que se ha diseñado para incluir uno o más sitios para la integración dirigida de recombinación de sitio específico. Incluidos dentro de las plataformas de cromosoma artificial son ACes, particularmente ACes de planta, que se diseñan asi mismo. Cualesquiera sitios, incluyendo, pero no limitándose a cualquiera descrito en la presente, que son adecuados para tal Integración se contemplan. Entre los ACes contemplados en la presente son aquellos que son predominantemente heterocromáticos (formalmente referidos como cromosomas artificiales satélite (SATAC) ; véase, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 6,077,697 y 6,025,155 y solicitud de PCT Internacional publicada No. WO 97/40183), cromosomas artificiales predominantemente hechos de unidades de ácido nucleico repetidas y que contienen cantidades sustancialmente equivalentes de ADN eucromático y heterocromático o en donde las regiones de repetición de los cromosomas contienen cantidades sustancialmente equivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromático. Incluidos entre los ACes para utilizarse para generar plataformas están los cromosomas artificiales que introducen y expresan ácidos nucleicos heterólogos en plantas como se describe en la presente. Estos incluyen cromosomas artificiales que tienen un centrómero derivado de una planta, y también, cromosomas artificiales que tienen centrómeros que pueden derivarse de otros organismos pero que funcionan en plantas. Como se utiliza en la presente, las secuencias de reconocimiento son secuencias particulares de nucleótidos que una proteína, ADN o molécula de ARN, o combinaciones de los mismos, (tales como, pero no limitados a, endonucleasa de restricción una modificación de metilasa y una recombinasa) se reconocen y se unen. Por ejemplo, una secuencia de reconocimiento para la recombinasa Cre (véase por ejemplo, SEC. DE IDENT. No. 30) es una secuencia de 34 pares de bases que contienen repeticiones invertidas de 13 pares de bases (sirviendo como los sitios de unión de recombinasa) flanqueando un núcleo de 8 pares de bases y designado loxP (véase por ejemplo, Sauer (1994) Current Opinión in Biotechnology, 5: 521-527) . Otros ejemplos de secuencias de reconocimiento, incluyen, pero no se limitan a, attB y attP, attR y atth y otras (véase por ejemplo, las SEC. DE IDENT. Nos. 32-48) que se reconocen por la integrasa de enzima recombinasa (véase las SEC. DE IDENT. Nos. 49 y 50) para el nucleótido y secuencias de aminoácido codificadas de una integrasa de fago lambda ejemplar) . El sitio de recombinación designado attB está en una secuencia de aproximadamente 33 pares de bases que contienen dos sitios de unión Int de tipo de núcleo de 9 pares de bases y una región traslapante de 7 pares de bases; attP (SEC. DE IDENT. No. 48) es una secuencia de aproximadamente 240 pares de bases que contiene sitios de unión Int del tipo de núcleo y sitios de unión Int de tipo de brazo asi como sitios para auxiliar proteínas IHF, FIS y Xis (véase, por ejemplo, Landy (1993) Current Opinión in Biotechnology, 3 : 699-707 , véase, por ejemplo, las SEC. DE IDENT. Nos. 32 y 48) . Como se utiliza en la presente, una recombinasa es una enzima que cataliza el intercambio de segmentos de ADN en sitios de recombinación específicos. Una integrasa en la presente se refiere a una recombinasa que es un miembro de la familia de integrasa lambda (?) . Como se utiliza en la presente, las proteínas de recombinación incluyen proteínas excisivas, proteínas integra ivas , enzimas, co-factores y proteínas asociadas que se implican en reacciones de recombinación utilizando uno o más sitios de recombinación, (véase, Landy (1993) Current Opinión in Biotechnology 3:699-707) . Como se utiliza en la presente, la expresión "sitio lox" significa una secuencia de nucleótidos en donde el producto genético del gen ere, se refiere en la presente como Cre, puede catalizar un caso de recombinación sitio-específica. Un sitio LoxP es una secuencia de nucleótido de 34 pares de bases a partir de bacteriófago Pl (véase, por ejemplo, Hoess et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 79:3398-3402). El sitio LoxP contiene dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases separadas por una región espadadora de 8 pares de bases como sigue: (SEC. DE IDENT. NO. 51) : ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT E. coliDHSAlac y cepa de levadura BSY23 transformada con plásmido pBS44 llevando dos sitios loxP conectados con un gen LEU2 están disponibles del American Type Culture Collection (ATCC) bajo números de acceso ATCC 53254 y ATCC 20773, respectivamente. Los sitios lox pueden aislarse a partir del plásmido pBS44 con las enzimas de restricción EcoRI y Salí o Xhol y JBamHI . Además, un segmento de ADN pre-seleccionado puede insertarse en pBS44 en cualesquiera sitios de enzima de restricción Salí o BamHI . Otros sitios lox incluyen, pero no se limitan a sitios LoxB, LoxL, LoxC2 y LoxR, que son secuencias nucleótidas aisladas de E. coli (véase por ejemplo, Hoess et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3398). Los sitios lox pueden también producirse, por una variedad de técnicas sintéticas (véase por ejemplo, Ito et al. (1982) Nuc. Acid. Res. 20:1755 y Ogilvie et al. (1981) Science 270:270) . Como se utiliza en la presente, la expresión "gen ere" significa una secuencia de nucleótidos que codifica un producto genético que afecta la recombinación sitio-especifica del ADN en células eucarióticas a sitios lox. Un gen ere puede aislarse a partir de bacteriófago Pl (véase por ejemplo, Abremski et al. (1983) Cell 32:1301-1311). E. coli DH1 y la cepa de levadura BSY90 transformada con plásmido pBS39 transporta un gen ere aislado a partir del bacteriófago Pl y una secuencia de nucleótido reguladora GAL1 están disponible de American Type Culture Collection (ATCC) bajo los números de acceso ATCC 53255 y ATCC 20772, respectivamente. El gen ere puede aislarse a partir del plásmido pBS39 con enzimas de restricción Xhol y Salí. Como se utiliza en la presente, la recombinación sitio específica se refiere a recombinación sitio específica que se efectúa entre dos sitios específicos en una sola molécula de ácido nucleico o entre dos diferentes moléculas que requieren la presencia de una proteína exógena, tal como una integrase o recombinasa . Por ejemplo, la recombinación sitio-específica Cre-lox puede incluir los siguientes tres casos : a. eliminación de un segmento de ADN pre-seleccionado flanqueado por sitios lox; b. inversión de la secuencia de nucleótido de un segmento de ADN pre-seleccionado flanqueado por los sitios lox; y c. intercambio recíproco de segmentos de ADN próximos a sitios lox ubicados en diferentes moléculas de ADN. Este intercambio recíproco de segmentos de ADN pueden resultar en un caso de integración si una o ambas de las moléculas del ADN son circulares. El segmento de ADN se refiere a un fragmento lineal o ácido desoxiribonucleico (ADN) de una o doble hebra, que puede derivarse de cualquier fuente. Ya que el sitio lox es una secuencia de nucleótido asimétrica, dos sitios lox en la misma molécula de ADN pueden tener las mismas u opuestas orientaciones con respecto una entre otra. La recombinación entre sitios lox en la misma orientación resulta en una eliminación del segmento de ADN ubicado entre los dos sitios lox y una conexión entre los extremos resultantes de la molécula de ADN original . El segmento de ADN eliminado forma una molécula circular de ADN. La molécula de ADN original y la molécula circular resultante cada una contiene un sitio lox único. La recombinación entre los sitios lox en orientaciones opuestas en la misma molécula de ADN resulta en una inversión de la secuencia de nucleótido del segmento de ADN ubicado entre los dos sitios lox. Además, el intercambio reciproco de segmentos de ADN próximos a los sitios lox ubicados en dos diferentes moléculas de ADN puede ocurrir. Todos de estos casos de recombinación se catalizan por el producto genético del gen ere. Así, el sistema Cre-lox puede utilizarse para eliminar específicamente, invertir o insertar ADN. El caso preciso se controla por la orientación de secuencias de ADN lox, en cis las secuencias lox dirigen la recombinasa Cre a cualquier eliminación (secuencias lox en orientación directa) o inversión (secuencias lox en orientación invertida) ADN flanqueado por las secuencias, mientras in trans las secuencias lox pueden dirigirse un caso de recombinación homologa resultando en la inserción de un ADN recombinante . Como se utiliza en la presente, una planta se refiere a un organismo que es taxonómicamente clasificado como estando en el reino de las Plantas. Tales organismos incluyen organismos eucarióticos que contienen cloroplastos capaces de llevar a cabo la fotosíntesis. Una planta puede ser unicelular o multicelular y puede contener tejidos múltiples y/u órganos. Las plantas pueden reproducirse sexual y/o asexualmente e incluyen especies que son perennes o anuales en el hábito de crecimiento. Una planta puede encontrarse para existir en una variedad de hábitats, incluyendo ambientes terrestres y acuáticos. El término "planta" incluye una planta completa, célula de planta, protoplasto de planta, callo de planta, semilla de planta, órgano de planta, tejido de planta y otras partes de una planta completa. Como se utiliza en la presente, el modo reproductivo con referencia a una planta se refiere a cualquiera y todos los métodos por los cuales una planta produce progenie. Los modos reproductivos incluyen, pero no se limitan a, reproducción sexual y asexual. Las plantas pueden producir progenie por uno o múltiples modos reproductivos. La reproducción sexual puede incluir la unión de células derivadas de gametofitos haploides (por ejemplo, huevos producidos a partir de óvulos y esperma producidos a partir de polen en plantas de semilla) para formar zigotos diploides . Los zigotos pueden formarse de gametofitos a partir de diferentes plantas o de gametofitos de la misma planta (por ejemplo, a través de auto-fertilización) . La reproducción asexual puede ocurrir cuando la descendencia se produce a través de modificaciones del ciclo de vida sexual que no incluye meiosis y singamia. Por ejemplo, cuando las plantas vasculares se reproducen asexualmente, pueden hacerlo por reproducción vegetativa, tal como germinación, ramificación, y retoño, o produciendo esporas o semillas genéticamente idénticas a los esporofitos que los producen. Como se utiliza en la presente, el mantenimiento estable de cromosomas ocurre cuando al menos aproximadamente 85%, preferiblemente 90%, más preferiblemente 95% de las células retienen el cromosoma. La estabilidad se mide en la presencia de un agente selectivo. Preferiblemente estos cromosomas se mantienen también en la ausencia de un agente selectivo. Los cromosomas estables también retienen su estructura durante el cultivo celular, sufriendo redisposiciones no pretendidas intracromosomales no intercromosomales . Como se utiliza en la presente, BrdU se refiere a 5-bromodesoxiuridina, que durante la replicación se inserta en lugar de timidina. BrdU se utiliza como un mutangeno; éste también inhibe la condensación de cromosomas de metafase durante la división celular. Como se utiliza en la presente, el AR ribosomal (ARNr) es el ARN especializado que forma parte de la estructura de un ribosoma y participa en la síntesis de proteínas. El ARN ribosomal se produce por la transcripción de genes que, en las células eucarióticas , se presentan en copias múltiples. En células humanas, las aproximadamente 250 copias de genes ARNr (es decir, genes que codifican ARNr) por genoma haploide se dispersan en grupos o en al menos cinco diferentes cromosomas (cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22). En células de ratón, la presencia del ADN ribosomal (ADNr, que es ADN que contiene secuencias que codifican ARNr) se han verificado en al menos 11 pares fuera de 20 cromosomas de ratón (cromosomas 5, 6, 7, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 18 y 19) [véase por ejemplo, Rowe et al. (1996) Mama. Genome 7:886-889 y Johnson et al. (1993) Mamm. Genome 4:49-52). En Arabidopsis thaliana la presencia de ADNr se ha verificado en cromosomas 2 y 4 (18S, 5.8S y 25S de ADNr) y en cromosomas 3, 4 y 5 (5S de ADNr) [véase The Arabidopsis Genome Iniatitive (2000) Nature 408.-796-815] . En células eucarióticas, las múltiples copias de los genes de ARNr altamente conservados se ubican en una serie acopladamente dispuesta de unidades de ADNr, que son en general aproximadamente 40-45 kb en longitud y contiene una región transcrita y una región no transcrita conocida como ADN espaciador (es decir, espaciador intergénico) que puede variar en longitud y secuencia. En el humano y el ratón, estas disposiciones en tándem de las unidades de ADNr se ubican adyacentes a las secuencias de ADN satélite pericéntricas (heterocromatina) . Las regiones de estos cromosomas en donde el ADNr se ubica se refieren como regiones de organización nucleolares (ÑOR), que se atan en los nucléolos, el sitio de la producción de ribosoma dentro del núcleo celular. En plantas más elevadas, el ADNr se dispone en unidades de repetición de tándem, largas, similares a aquellas de otros eucariotes más elevados . Los genes de ARNr 18S, 5.8S y 25S se agrupan y se transcriben en una unidad, mientras que los genes 5S se ubican en otro sitio en el genoma. Entre el extremo 3' del gen 25S y el extremo 5' del gen 18S se ubica un espaciador ADN que varía de 1 kb a más de 12 kb en longitud para especies diferentes. Por lo tanto, los rangos de repetición de ADNr a partir de aproximadamente 4 kb a aproximadamente 15 kb para diferentes especies de plantas [véase por ejemplo, Rogers and Bendich (1987) Plant Mol. Biol. 9:509-520] . Como se utiliza en la presente, un megacromosoma se refiere a un cromosoma que, excepto para ADN heterólogo introducido, se compone sustancialmente de heterocromatina . Los megacromosomas se hacen de una disposición de amplicones de repetición que contienen dos megareplicones invertidos bordeados por ADN heterólogo introducido [véase por ejemplo, Figura 3 de la Patente Norteamericana No. 6,077,697 para un dibujo esquemático de un megacromosoma] . Para propósitos en la presente, un megacromosoma es aproximadamente 50 a 400 Mb, en general aproximadamente 250-400 Mb. Las variantes más cortas se refieren también como megacrosomas truncados [aproximadamente 90 a 120 o 150 Mb] , megacromosomas enanos [~150-200 Mb] y lineas celulares, y un miero-raegacroraosoma [~50-90 Mb, normalmente 50-60 Mb] . Para propósitos en la presente, el término megacrosoma se refiere a la estructura repetida total basada en una disposición de segmentos cromosomales repetidos (amplicones) que contienen dos megareplicones invertidos bordeados por cualquier ADN heterologo insertado. Como se utiliza en la presente, la transformación y transfección se utiliza intercambiablemente para referirse al proceso para introducir ácido nucleico en células. Los términos transfección y transformación se refieren a la ocupación de ácido nucleico exógeno, por ejemplo, un vector de expresión, por una célula huésped si cualesquier secuencias de codificación de hecho se expresan o no. Numerosos métodos para introducir ácidos nucleicos en células se conocen por el experto ordinario, por ejemplo, por la transformación mediada por Agrobacterium, transfección de protoplasto (incluyendo transfección mediada por polietilenglicol (PEG) , electroporación, fusión de protoplasto, y fusión microcelular) , suministro mediado por lípido, liposomas, electroporación, microinyección, bombardeo de partículas y transformación de filamento de carburo de silicio (véase por ejemplo, Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722; Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:169-177; Reich et al. (1986) Biotechnology 4:1001-1004; Klein et al. (1987) Nature 327:70-73 ; Patente Norteamericana No. 6,143,949; Paszkowski et al. (1989) in Cell Culture and So atic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear' Genes, eds . Schell, J and Vasil, L.K. Academic Publishers, San Diego, California, p. 52-68; y Frame et al. (1994) Plant J. 6: 941-948), incorporación directa utilizando fosfato de calcio [CaP04; véase, por ejemplo, igler et al. (1979) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 76:1312-1216], incorporación de ADN mediado por polietilenglicol [PEG] [véase por ejemplo, Strauss (1996) Meth. Mol. Biol. 54:307-327], fusión microcelular [véase Lambert (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 58:5907-5911; Patente Norteamericana No. 5,396,767, Sawford et al. (1987) Somatic Cell Mol. Genet. 13 :279-284 ; Dhar et al. (1984) Somatic Cell Mol. Genet. 10:547-559 ; y McNeill-Killary et al. (1995) et . Enzymol . 254:133-152] , sistemas portadores mediados por lípido [véase por ejemplo Teifel et al. (1995) Biotechniqu.es 15:79-80; Albrecht et al (1996) Ann. Hematol . 72:13-19; Holmen et al. (1995) In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31:347-351; Remy et al. (1994) Bioconjug. Chem. 5:647-654; Le Bolch et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36: 6681-6684 ; Loeffler et al. (1993) Meth Enzymol. 217:599-618] u otro método adecuado. La transfección exitosa se reconoce generalmente por la detección de la presencia de ácido nucleico heterólogo dentro de la célula transfectada, tal como, por ejemplo, cualquier visualización del ácido nucleico heterólogo o cualquier indicación de la operación de un vector dentro de la célula huésped. Como se utiliza en la presente, inyectado se refiere a la microinyección (uso de una pequeña jeringa, aguja, o pipeta) de ácido nucleico en una célula. Como se utiliza en la presente, la terapia genética implica la transferencia o inserción de moléculas de ácido nucleico en ciertas células, que se refieren también como células objetivo, para producir productos que se implican en prevenir, curar, corregir, controlar o modular enfermedades, trastornos y/o condiciones nocivas. El ácido nucleico se introduce en las células objetivo seleccionadas en una manera tal que el ácido nucleico se expresa y un producto se codifica por lo que se produce. Alternativamente, el ácido nucleico puede en alguna manera mediar la expresión del ADN que codifica un producto terapéutico. Este producto puede ser un compuesto terapéutico, el cual se produce en cantidades terapéuticamente efectivas o un tiempo terapéuticamente útil. Esto puede también codificar un producto, tal como un péptido o ARN, que en alguna manera media, directa o indirectamente la expresión de un producto terapéutico. La expresión del ácido nucleico por las células objetivo dentro de un organismo se afligen con una enfermedad o trastorno por lo que permite la modulación de la enfermedad o el trastorno. El ácido nucleico que codifica el producto terapéutico puede modificarse antes o en la introducción de las células del huésped dañado para mejorar o de otra manera alterar el producto o expresión del mismo. Para uso de terapia genética, las células pueden transfectarse in vitro, seguidas por la introducción de las células transfectadas en un organismo. Esto se refiere con frecuencia como terapia genética ex vivo. Alternativamente, las células pueden transfectarse directamente in vivo dentro de un organismo. Como se utiliza en la presente, un producto terapéuticamente efectivo es un producto que disminuye efectivamente o elimina los síntomas o manifestaciones de una enfermedad o trastorno heredado o adquirido o que cura tal enfermedad o trastorno en un organismo. Por ejemplo, los productos terapéuticamente efectivos incluyen un producto que se codifica por ADN heterólogo expresado en un organismo enfermo y un producto producido a partir del ADN heterólogo en una célula huésped y a la cual un organismo enfermo se expone . Como se utiliza en la presente, una planta transgénica se refiere a una planta (por ejemplo, una célula de planta, tejido, órgano o planta completa) conteniendo ácido nucleico extraño o en donde la expresión de un gen naturalmente presente en la planta se ha alterado. El ácido nucleico heterologo dentro de una planta transgénica puede mantenerse transiente o establemente dentro de la planta. El mantenimiento estable de ácido nucleico heterologo es el mantenimiento del ácido nucleico a través de uno o más, o dos o más, o cinco o más, o diez o más, o 25 ó mas, o 50 o más o 60 o más divisiones celulares. Una planta transgénica puede contener ácido nucleico heterologo en una célula, múltiples células o todas las células. Una planta transgénica puede producir progenie que contiene o no contiene el ácido nucleico heterologo . Como se utiliza en la presente, un promotor, con respecto a una región de ADN, se refiere a una secuencia de ADN que contiene una secuencia de bases que señala la polimerasa de ARN para asociarse con el ADN e iniciar la transcripción del ARN mensajero (ARNm) a partir de hebras templadas del ADN. Un promotor regula así generalmente la transcripción del ADN en ARNm. Como se utiliza en la presente, la conexión operativa de ADN heterologo a secuencias reguladoras y ejecutadoras de los nucleótidos, tales como promotores, mejoradores, sitios de detención transcripcional .y translacional , y otras secuencias de señal se refiere a la relación entre tal ADN y tales secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la conexión operativa de ADN heterólogo a un promotor se refiere a la relación física entre el ADN y el promotor de manera que la transcripción de tal ADN se inicia a partir del promotor por una polimerasa de ARN que reconoce específicamente, une a, y transcribe el ADN en un cuadro de lectura . Como se utiliza en la presente, el ácido nucleico aislado, sustancialmente puro, tal como, por ejemplo, ADN, se refiere a los fragmentos de ácido nucleico purificados de acuerdo a técnicas estándares empleadas por aquellos expertos en la técnica, tal como aquella encontrada en Maniatis et al [(1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] . Como se utiliza en la presente, la expresión se refiere a la transcripción y/o traducción del ácido nucleico. Por ejemplo, la expresión puede ser la transcripción del gen en una molécula de ARN, tal como una molécula de ARN mensajero (ARNm) . La expresión puede además incluir la traducción de una molécula de ARN en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico se deriva de ADN genómico, la expresión puede, si una célula huésped eucariótica apropiada u organismo se selecciona, incluir empalme del ARNm. Con respecto a una construcción antisentido, la expresión puede referirse a la transcripción del ADN antisentido. Como se utiliza en la presente, el vector o plásmido se refiere a elementos discretos que se utilizan para introducir ácidos nucleicos heterólogos en células para cualquier expresión del ácido nucleico heterologo o para la replicación del ácido nucleico heterologo. La selección y uso de tales vectores y plásmidos están bien dentro del nivel de experiencia de la técnica. Como se utiliza en la presente, ADN sustancialmente homólogo se refiere a ADN que incluye una secuencia de nucleótidos que es suficientemente similar a otra de tales secuencias para formar híbridos estables bajo condiciones específicas . Se sabe bien por aquellos expertos en esta técnica que los fragmentos de ácido nucleico con diferentes secuencias pueden, bajo las mismas condiciones, hibridizar detectablemente al mismo ácido nucleico "objetivo". Dos fragmentos de ácido nucleico hibridizan detectablemente, bajo condiciones rigurosas durante un periodo de hibridación suficientemente largo, debido a que un fragmento contiene un segmento de al menos aproximadamente 14 nucleótidos en una secuencia la cual es complementaria (o casi complementaria) a la secuencia de al menos un segmento en el otro fragmento de ácido nucleico. Si el tiempo durante el cual la hibridación se permite ocurrir se mantiene constante, a un valor durante el cual, bajo condiciones rigurosas pre-seleccionadas, dos fragmentos de ácido nucleico con segmentos de pares de bases exactamente complementarios hibridizan detectablemente entre sí, salidas de complementar!edad exacta pueden introducirse en los segmentos de pares de base, y pares de bases no obstante ocurrirá a una grado suficiente para hacer a la hibridación detectable. Como la salida a partir de la complementariedad entre los segmentos de pares de base de los dos ácidos nucleicos llega a ser más grande, y como las condiciones de la hibridación llegan a ser más rigurosas, la probabilidad disminuye en que los dos segmentos se hibridizará detectablemente entre sí. Dos segmentos de ácido nucleico de una sola hebra tienen "sustancialmente la misma secuencia", dentro del significado de la presente especificación, si (a) ambos forman un dúplex de pares de bases con el mismo segmento, y (b) las temperaturas de fusión de los dos dúplex en una solución de 0.5 X SSPE difieren por menos de 10°C. Si los segmentos que se comparan tienen el mismo número de bases, entonces para tener "sustancialmente la misma secuencia", normalmente diferirán en sus secuencias a poco más de 1 base en 10. Los métodos para determinar temperaturas de fusión de los dúplex de ácido nucleico se conocen bien en la técnica [véase por ejemplo, Meinkoth and Wahl (1984) anal Biochem. 138 : 267-284 y referencias citadas en la presente] . Como se utiliza en la presente, una sonda de ácido nucleico es un fragmento de ADN o 7A N que incluye un suficiente número de nucleótidos para hibridizar específicamente al ADN o ??? que incluye secuencias idénticas o estrechamente relacionadas de nucleótidos. Una sonda puede contener cualquier número de nucleótidos, a partir de tan pocos como aproximadamente 10 y tantos como cientos de miles de nucleótidos. Las condiciones y protocolos para tales reacciones de hibridación son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica como son los efectos de tamaño de sonda, temperatura, grado de incompatibilidad, concentración de sal y otros parámetros en la reacción de hibridación. Por ejemplo, la temperatura más baja y la concentración de sal más elevada en donde la reacción de hibridación se lleva a cabo, es el grado más grande de incompatibilidad que puede presentarse en las moléculas híbridas. Para utilizarse como una sonda de hibridación, el ácido nucleico se suministra generalmente detectable etiquetándolo en una porción detectable o marca, tal como 32P, 3H y 14C, o por otros medios, incluyendo marcado químico, tal como por traducción de muesca en la presencia de desoxiuridilato biotinilado en la posición ¾5 de la porción uracilo. La sonda resultante incluye el uridilato biotinilado en lugar de residuos de timidilato y puede detectarse (a través de porciones de biotina) por cualquiera de un número de sistemas de detección comercialmente disponibles basados en la unión de estreptavidina o la biotina. Tales sistemas de detección comercialmente disponibles pueden obtenerse, por ejemplo, de Enzo Biochemicals , Inc. (New York, NY) . Cualquier otra marca conocida por aquellos con experiencia en- la técnica, incluyendo marcas no radioactivas, pueden utilizarse siempre y cuando éstas suministren las sondas suficientemente detectables, que es una función de la sensibilidad del ensayo, el tiempo disponible (para cultivar células, extrayendo el ADN, y ensayos de hibridación) , la cantidad de ADN o ARN disponible como una fuente de la sonda, la marca particular y los medios utilizados para detectar la marca. Una vez que las secuencias con un grado suficientemente elevado de homología a la sonda se identifica, pueden fácilmente aislarse por técnicas estándares, que se describen, por ejemplo, Maniatis et al. [(1982) Molecular Cloning: ? Laboratoy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] . Como se utiliza en la presente, las condiciones bajo las cuales las moléculas de ADN forman híbridos estables y se consideran sustancialmente homólogos son tales que las moléculas de ADN con al menos aproximadamente 60% de complementariedad forman híbridos estables. Tales fragmentos de ADN son en la presente considerados para ser "sustancialmente homólogos". Por ejemplo, el ADN que codifica una proteína particular es sustancialmente homólogo a otro fragmento de ADN si el ADN forma híbridos estables de manera que las secuencias de los fragmentos son al menos aproximadamente 60% de complementariedad y si una proteína codificada por el ADN retiene su actividad. Para propósitos en la presente, se identifican las siguientes condiciones de severidad: 1) rigurosidad alta: 0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65°C 2) rigurosidad media: 0.2 x SSPE, 0.1% de SDS, 50°C 3) rigurosidad baja: 1.0 x SSPE, 0.1% de SDS, 50°C. o una combinación de sal y temperatura y otros reactivos que resultan en la selección del mismo grado de incompatibilidad o compatibilidad. Como se utiliza en la presente, todos los ensayos y procedimientos, tales como reacciones de hibridación y reacciones de anticuerpo-antígeno, a menos que se especifique de otra manera se conducen bajo condiciones reconocidas por aquellos con experiencia en la técnica como las condiciones estándares . A. Amplificación de Segmentos Cromosomales y Uso de los Mismos en la Generación de Cromosomas Artificiales Los métodos, células y cromosomas artificiales proporcionados en la presente se producen en virtud del descubrimiento de la existencia de una unidad de replicación de orden más elevado (megareplicón) de la región centromérica, incluyendo el ADN pericéntrico, de un cromosoma. Este megareplicón se delimita por un sitio de iniciación de replicacion primario (megareplicador) , y parece facilitar la replicación de la heterocromatxna centromérica, y más probablemente, centrómeros . La integración del ácido nucleico heterólogo en la región del megareplicador, o en proximidad cercana al mismo, inicia una amplificación a gran escala de segmentos cromosomales de tamaño megabase. Los productos de tal amplificación pueden utilizarse como cromosomas artificiales o en la generación de los cromosomas artificiales como se describe en la presente. Incluidos entre las secuencias de ADN que pueden proporcionar un megareplicador están las unidades de ADNr que dan lugar al ARN ribosomal (ARNr) . En las plantas y animales, particularmente mamíferos tales como ratones y humanos, estas unidades de ADNr pueden contener elementos especializados, tales como el origen de replicación (u origen de replicacion bidireccional , es decir, OBR, en ratón) y en secuencias que promueven la amplificación (APS) y elementos de control de amplificación (ACE) [véase, por ejemplo, con respecto al ADNr de planta, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,096,546 (para Raskin) y 6,100,092 (para Borysyuk et al.); la Publicación de Solicitud PCT Internacional No. WO99/66058; Genbank No. de Acceso Y084422 (conteniendo la región rica en AT central de un espaciador intergénico de ADNr de tabaco); Borysyuk et al. (1997) Plant. Mol. Biol . 35:655-660); Borysyuk et al., (2000) Nature Biotechnology 28:1303-1306; Hernández et al., (1993) EMBO J. 12: 1475-1485 ; Van't Hof and Lamm (1992) Plant Mol. Biol. 20:377-382 ; Hernández et al. (1988) Plant Mol. Biol. 10:413-322 ; y con respecto al ADNr de mamífero, Gogel et al. (1996) Chromosoma 104:511-518; Coffman et al. (1993) Exp. Cell. Res. 209 : 123-132 ; Little et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:6600-6613; Yoon et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 25:2482-2489; González and Sylvester (1995) Genomics 27:320-328; Miesfeld and Arn eim (1982) Nuc. Acids Res. 20:3933-3949; Maden et al. (1987) Biochem. J. 246:519-527) . Como se describe en la presente, sin estar unido por cualquier teoría, elementos especializados tales como estos pueden facilitar la replicación y/o amplificación de segmentos cromosomales de tamaño megabase en la formación de novo de cromosomas, tales como los cromosomas artificiales descritos en la presente, en células. Estos elementos especializados se ubican normalmente en la región espadadora intergénica no transcrita corriente arriba de la región transcrita del ADNr. La región espadadora intergénica puede por sí misma contener secuencias repetidas internamente que pueden clasificarse como bloques repetidos en tándem y bloques sin tándem (véase por ejemplo, González and Sylvester (1995) Genomics 27:320-328) . En ADNr de ratón, un origen de replicación bidireccional puede encontrarse dentro de una zona de iniciación 3-kb centrada aproximadamente 1.6 kb corriente arriba del sitio de inicio de transcripción (véase por ejemplo, Gogel et al. (1996) Chromosoma 104:511-518). Las secuencias de estos elementos especializados tienden a tener una estructura de cromatina alterada, que puede detectarse, por ejemplo, por hipersensibilidad de nucleasa o la presencia de regiones ricas en AT que pueden dar lugar a estructuras de ADN dobladas. Secuencias de regiones espadadoras intergénicas de ADNr de planta incluyen, pero no se limitan a, secuencias contenidas en números de acceso GenBank S70723 (a partir del ADNr 5S o cebada (Hordeum vulgare) ) , AFO13103 y X03989 (de maíz (Zea mays)) , X65849 (de papa (Solanum tuberosum) ) , X52265 (de tomate {Lycopersicon esculentum) ) , AF177418 (de Arabidopsis neglecta) , AF177421 y AF17422 (de Arabidopsis halleri) , A71562, X15550 y X52631 (de Arabidopsis thaliana; véase Gruendler et al. (1991) J. Mol. Biol . 221:1209-1222 y Gruendler et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6395-6396), X54194 (de arroz (Oryza sativa) ) y Y08422 y D76443 (de tabaco (Nicotiana tabacum) . Las secuencias de regiones espadadoras intergénicas del ADNr de planta incluyen además secuencias a partir de centeno (véase Appels et al. (1986) Can. J. Genet. Cytol. 28:673-685) , trigo (véase Barker et al. (1988) J". Mol. Biol. 201:1-17 y Sardana and Flavell (1996) Genome 39:288-292), rábano (véase Delcasso-Tremousaygue et al. (1988) Eur. J". Biochem. 172:161-116) , Vicia faba and Pisu sativum (véase Kato et al. (1990) Plant. Mol. Biol . 14:983-993), judía de Lima (véase Gerstner et al. (1988) Genome 30:723-733 ; y Schiebel et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218 : 302-307) , tomate (véase Schmidt-Puchta et al. (1989) Plant. Mol. Biol. 13:251-253), Hordeum bulbosum (véase Procunier et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:661-663) y Lens culinaris Medik, y otras especies leguminosas (véase Fernandez et al. (2000) Genome 43:597-603) . Los ácidos nucleicos que contienen secuencias espadadoras intergénicas a partir de plantas pueden obtenerse por amplificación del ácido nucleico de ADN a partir de las células de plantas utilizando cebadores oligonucleótidos correspondiendo al extremo 3' del ARNr 25S maduro conservado que codifica la región y el extremo 5' del ARNr 18S maduro conservado que codifica la región (véase por ejemplo, Publicación de Solicitud PCT No. WO98/13505) . Una secuencia ejemplar que abarca un origen mamífero de replicación se proporciona en GENBANK no. de acceso X82564 en posiciones aproximadas de 2430-5435. Las secuencias ejemplares que abarcan las secuencias de que promueven la amplificación de mamífero incluyen nucleótidos 690-1060 y 1105-1530 de GENBANK no. de acceso X82564 y se proporcionan también en la Publicación de Solicitud PCT No. WO 97/40183. Las secuencias ejemplares que abarcan secuencias que promueven la amplificación de plantas (APS) incluyen aquellas proporcionadas en la Patente Norteamericana No. 6,100,092. En ADNr humano, un sitio de iniciación de replicación primario puede encontrarse en pocos pares de kilobases corriente arriba de la región transcrita y sitios de iniciación secundarios pueden encontrarse a través de toda la región espadadora intergénica no transcrita (véase por ejemplo, Yoon et al. (1995) Mol. Cell . Biol. 25:2482-2489) . Una unidad de repetición de ADNr humano completo .se presenta en GENBANK como no. de acceso U13369. Otra secuencia ejemplar que abarca un sitio de iniciación de replicación puede encontrarse dentro de la secuencia de nucleótidos 35355-4248S en GENBANK no. de acceso U13369 particularmente dentro de la secuencia de nucleótidos 37912-42486 y más particularmente dentro de la secuencia de nucleótidos 37912-39288 de GENBANK no. de acceso U13369 (véase Coffman et al. (1993) Exp. Cell. Res. 209:123-132) . B. Preparación de Cromosomas Artificiales de Plantas Las líneas celulares que contienen cromosomas artificiales pueden prepararse por células de transformación, preferiblemente una linea celular estable, con el ácido nucleico heterólogo e identifican células que contienen un cromosoma artificial como se describe en la presente. El cromosoma artificial es una estructura cromosomal que es distinta a partir de cualquier cromosoma que existe en la célula anterior a la introducción del ácido nucleico heterólogo. Una célula que contiene un cromosoma artificial puede identificarse utilizando una variedad de procedimientos, solos o en combinación, como se describe en detalle en la presente. En las modalidades particulares de los métodos descritos en la presente, el ácido nucleico heterólogo contiene una secuencia que dirige el ácido nucleico a una región amplificable de un cromosoma en la célula, tal como por ejemplo, la heterocrornatina pericéntrica y/o ADNr. Una variedad de secuencias objetivo se proporcionan en la presente. Antes de analizar las células transformadas por la presencia de un cromosoma artificial, las células a analizarse pueden enriquecerse con células que contienen cromosoma artificial utilizando una variedad de técnicas dependiendo del ácido nucleico heterólogo que se introdujo en la célula huésped para iniciar la generación de cromosomas artificiales. Por ejemplo, si el ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se incluye en el ácido nucleico heterólogo, las células que contienen el marcador pueden seleccionarse para análisis. Si el marcador seleccionable es aquel que confiere resistencia a un agente citotóxico, por ejemplo, bialafos, higromicina o kanamicina, las células transformadas pueden cultivarse bajo condiciones selectivas que incluyen el agente. Las células que sobreviven al crecimiento bajo condiciones selectivas se analizan entonces por la presencia de cromosomas artificiales. Si el marcador seleccionable es una molécula reportera fácilmente detectable, tal como, por ejemplo, una proteína fluorescente, las células transformadas pueden seleccionarse en la base de las propiedades fluorescentes. Por ejemplo, las células que contienen la proteína fluorescente pueden aislarse a partir de células no transformadas utilizando un clasificador de célula que activa la fluorescencia (FACS) . Es también posible analizar células transformadas por la presencia de cromosomas artificiales, para identificar células que tienen un cromosoma multicéntrico, normalmente dicéntrico, cromosoma anteriormente multicéntrico (normalmente dicéntrico) , minicromosoma y/o estructuras heterocromáticas, tales como un megacromosoma y un cromosoma en chorizo. Si las células que contienen cromosomas multicéntricos o anteriormente cromosomas multicéntricos (de manera normal anteriormente dicéntrico) se seleccionan inicialmente , estas células pueden entonces manipularse, si es necesario, como se describe en la presente para producir los minicromosomas y otros cromosomas artificiales, particularmente los cromosomas artificiales heterocromáticos y otros cromosomas artificiales que contienen regiones de repetición, segmentadas, como se describe en la presente. 1. Células utilizadas en la generación de cromosomas artificiales de plantas Cualesquiera células que hospedan cromosomas que contienen centrómero de planta pueden utilizarse en la generación de cromosomas artificiales de planta (los PAC) . Tales células incluyen, pero no se limitan a, células de planta, protoplastos , y células que son células híbridas de una o más especies de plantas. Las células preferidas son aquellas que hospedan cromosomas que contienen centrómero de planta y son fácilmente susceptibles a la introducción de ácidos nucleicos heterologos en la presente. Las células para usarse en la generación de cromosomas artificiales de plantas incluyen células que hospedan cromosomas de planta acrocéntricos . Ejemplos de cromosomas de planta acrocéntricos incluyen cromosomas 2 y 4 de la planta Arabidopsis thaliana (véase por ejemplo, ayer et al. (1999) Nature 402:769-777 ; Murata et al. (1997) The Plant Journal 22:31-37; The Arabidopsis Geno e Initiative (2000) Nature 408:796-815), cuatro pares de cromosomas acrocéntricos en Helianthus annuus (girasol; véase Schrader et al. (1997) Chromosome Res. 5:451-456) , dos pares de cromosomas acrocéntricos en planta de pimiento domesticado {Capsicum annuum) y un cromosoma casi acrocéntrico en planta de lenteja. En particular, modalidades de los métodos descritos en la presente, células que hospedan cromosomas de planta acrocéntricos que contienen ADNr se utilizan para generar cromosomas artificiales de plantas. Las especies de plantas a partir de las cuales las células pueden obtenerse incluyen, pero no se limitan a, cultivos de vegetales, cultivos de frutas y vid, plantas del campo, plantas de jardín, árboles, arbustos, y otras reservas en viveros. Ejemplos de cultivos de vegetales incluyen alcachofa, colinabo, lechuga china, puerro, espárrago, lechuga, col china, tara, brócoli, melones (por ejemplo, melón almizclado, sandía, crenshaw, zumo dulce, cantalupo, coles de brúcelas, col, cardo, zanahorias, nabo, coliflor, quimbombo, cebollas, apio, perejil, garbanzo, chirivía, escarola, repollo chino, pimientos, repollo, papas, plantas de pepino, calabaza, calabacín, rábanos, cebollas de bulbo seco, colinabo, berenjena, salsifí, escarola, chalote, endibias, ajo, espinaca, cebolla verde, chayóte, verduras, acelga, batata, acelga suiza, rábano picante, tomates, col rizada, nabos y especias. Cultivos de fruta y vid incluyen manzanas, chabacanos, cerezas, nectarinas, duraznos, peras, ciruelas, ciruela pasa, membrillo, almendras, castañas, avellanas, pecanas, pistachos, nueces, cítricos, mora azul, bayas negras, arandino, grosellas, frambuesas norteamericanas, frambuesas, fresas, zarzamora, uvas, aguacates, plátanos, kiwi, caqui, granada, piña, frutas tropicales, pomos, melón, mango, papaya y lachee. Plantas de cultivo de campo incluyen primavera de la tarde, espuma silvestre, mazorca, maíz, lúpulo, jojoba, cacahuate, arroz, cártamo, pequeños granos (cebada, avena, centeno, trigo y otros) , sorgo, tabaco, capoc, plantas leguminosas (frijoles, lentejas, chícharo, soya) , plantas oleaginosas (cánola, colza, mostaza, adormidera, olivos, girasoles, coco, plantas de aceite de ricino, semilla de cacao, cacahuete) , plantas de fibra, (algodón, lino, cáñamo, yute) , lauráceas (canela, alcanfor) y plantas tales como café, caña de azúcar, té y plantas de caucho natural. Otros ejemplos de plantas incluyen plantas de jardín, tales como flores, cactus, plantas suculentas y ornamentales, así como también árboles tales como de selva (árboles de hojas amplias y encinas, tales como coniferas), fruta, árboles ornamentales y de nueces, arbustos, algas, musgos y lenteja acuática. 2. Acidos nucleicos heterólogos para usarse para generar cromosomas artificiales de plantas a. Marcadores seleccionables El ácido nucleico heterólogo que se introduce en una célula en la generación de cromosomas artificiales como se describe en la presente puede incluir ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable . Cualquier ácido nucleico que incluya una secuencia marcadora seleccionable puede introducirse en las células que hospedan cromosomas que contienen centrómero de planta para la generación de los cromosomas artificiales de la planta. Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, ADN que codifica un producto que confiere resistencia a un agente citotóxico o citostático y ADN que codifica un producto fácilmente detectable, tal como una proteína reportera. (1) Ácidos nucleicos que codifican productos que confieren resistencia a un agente de selección Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) , genes de higromicin fosfotransferasa, el gen de fosfinotricin acetil transferasa (gen bar) y genes de neomicin fosfotransferasa . Los marcadores seleccionables que pueden utilizarse en animales, por ejemplo, células de mamífero incluyen, pero no se limitan al gen de timidina cinasa y el gen de adenina-fosforibosiltransferasa celular. De particular interés para propósitos en la presente son marcadores seleccionables de ácido nucleico que, hasta la expresión en la célula huésped, confiere resistencia antibiótica o herbicida a la célula, suficiente para tolerar el mantenimiento de ácidos nucleicos heterólogos en la célula, y que facilita la transferencia de cromosomas artificiales que contienen el ADN marcador en nuevas células huésped. Ejemplos de tales marcadores incluyen ADN que codifica productos que confieren resistencia celular a higromicina, kanamicina, G418, bialafos, Basta, metotrexato, glifosato, y puromicina. Por ejemplo, neo (o nptJJ) proporciona resistencia a kanamicina y puede seleccionarse utilizando kanamicina, G418, paromomiciña y otros agentes [véase por ejemplo, Messing and Vierra (1982) Gene 19:259-268; y Bevan et al. (1983) Nature 304:184-187]; bar de Streptojnyces hygroscopic s, que codifica la enzima fosfinotricin acetil transferasa (PAT) confiere resistencia a bialafos, glufosinato, Basta o fosfinotricina [véase por ejemplo, White et al. (1990) Nuc. Acids Res. 18:1062; Spencer et al. (1990) Theor. Appl . Genet. 79:625-631; Vickers et al. (1996) Plant Mol. Biol . Repórter 14:363-368 ,- y Thompson et al. (1987) EMBO J. 6:2519-2523]; el gen hph que confiere resistencia al antibiótico higromicina (véase por ejemplo, Blochinger and Diggelmann, Mol. Cell. Biol. 4:2929-2931); una proteína sintasa EPSP imitante (véase Hinchee et al. (1988) Bio/technol 6':915-922] confiere resistencia a glifosato (véase también las Patentes Norteamericanas Nos. 4,940,935 y 5,188,642); y una nitrilasa tal como bxn de Lebsiella ozaenae confiere resistencia a bromoxinilo [véase Stalker et al. (1988) Science 242:419-42] . El ADN que codifica cistationina gamma-sintasa (CGS) puede utilizarse como un marcador que confiere resistencia a etionina (véase Publicación de Solicitud PCT No. WO 00/55303) . Ejemplos de marcadores que pueden utilizarse en animales, por ejemplo, células de mamífero, incluyen pero no se limitan al ADN que codifica productos que confieren resistencia celular a estreptomicina, zeocina, cloranfenicol y tetraciclina . (2) Moléculas Reporteras Los ácidos nucleicos que codifican las moléculas reporteras pueden también incluirse en el ácido nucleico que se introduce en una célula receptora en la generación de cromosomas artificiales. Los genes reporteros proporcionan un medio para identificar células y cromosomas en donde los ácidos nucleicos heterólogos se han transferido y además proporcionan un medio para evaluar si o no, y hasta qué punto, se expresa el ADN transferido. Los ácidos nucleicos que codifican moléculas reporteras que pueden utilizarse para verificar la transferencia y expresión de ácidos nucleicos heterólogos en células, particularmente células de planta incluyen, pero no se limitan a, ácido nucleico que codifica ß-glucuronidasa (GUS) o el producto genético uidA, que es una enzima para la cual varios sustratos cromogénicos se conocen [véase Novel and Novel (1973) Mol. Gen. Genet. 120:319-335 ; Jefferson et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 83:8447-8451; Patente Norteamericana No. 5,268,463, comercialmente disponible de Clontech Laboratories, Palo Alto, CA] , Adn de un gen R-locus, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos de planta [véase, por ejemplo, Dellaporta et al. (1988) en "Chromosome Str cture and Function : Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium" 21:263-282], ácido nucleico que codifica ß-lactamasa [Sutcliffe (1978) Proc . Nati. Acad. Sci, U.S.A. 75:3737-3741], que es una enzima para la cual varios sustratos cromogénicos se conocen (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica) , el ADN de un gen xy/E [véase, por ejemplo, Zukowsky et al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:1101-1105], que codifica ún catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; el ácido nucleico que codifica oc-amilasa [véase por ejemplo, Ikuta et al. (1990) Bio/technol . 8:241-242], ácido nucleico que codifica tirosinasa [véase por ejemplo, Katz et al. (1983) J\ Gen. Microbiol . 129:2703-2714], una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa para formar la melamina fácilmente detectable compuesta, el ácido nucleico que codifica ß-galactosidasa, una enzima para la cual existen sustratos cromogénicos, el ácido nucleico que codifica el gen luciferasa {lux) [véase, por ejemplo, Ow et al. (1986) Science 234 :.856-859] que permite para la detección bioluminiscente, el ácido nucleico que codifica aequorina [véase por ejemplo, Prasher et al. (1985) Biochem. Biophy. Res. Co mun. 126": 1259-1268] , que puede emplearse en detección de bioluminiscencia sensible al calcio, el ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente verde (GFP) [véase por ejemplo, Sheen et al. (1995) Plant J. 8:777-784; Haselhoff et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 34:2122-2127; Hasseloff and Amos (1995) Trends Genet 11:328-329; Reichel et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 53:5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep. 16:261-211; Prasher et al. (1992) Gene 111:229-233; Chalfie et al. (1994) Science 253:802; Publicaciones de Solicitud PCT Nos. W097/41228 y WO 95/07463; y comercialmente disponible de Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) , el ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente roja o azul (RFP o BFP, respectivamente) , o ácido nucleico que codifica cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) . La GFP mejorada (EGFP) es un mutante de GPF con un incremento de 35 veces en fluorescencia. Esta variante tiene mutaciones de Ser a Thr en el aminoácido 65 y Phe a Leu en la posición 64 y se codifica por un gen con codones humanos optimizados (véase por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,054,312), EGFP es una variante de cambio a rojo de GFP de tipo silvestre (Yang et al. (1996) Nucí. Acids Res. 24:4592-4593; Haas et al. (1996) Curr. Biol . 6: 315-324; Jackson et al. (1990) Trends Biochem. 15:477-483) que se ha optimizado para fluorescencia más brillante y expresión más elevada en células de mamífero (excitación máxima = 488 nm; emisión máxima = 507 nm) . EGFP codifica la variante GFPmutl (Jackson (1990) Trends Biochem. 15 :477-483) que contiene la sustitución de doble aminoácido de Phe- 64 y Leu y Ser-65 a Thr. Las secuencias que flanquean EGFP se han convertido a un sitio de iniciación de traducción de consenso Kozak. (Huang et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:937-947) para incrementar además la eficiencia de traducción en células eucarióticas . El ácido nucleico a partir del complejo de gen R de maíz puede también utilizarse como ácido nucleico que codifica una molécula reportera. El complejo de gen R en maíz codifica una proteína que actúa para regular la producción de pigmentos de antocianina en la mayoría de las semillas y tejidos de plantas. Las cepas del maíz pueden tener una o tantas como cuatro, alelos R que se combinan para regular la pigmentación en una manera de desarrollo y tejido específico. Así, un gen R introducido en tales células provocaría la expresión de un pigmento rojo y, si se incorpora establemente, puede clasificarse visualmente como un sector rojo. Si una línea de maíz transporta alelos dominantes para genes que codifican para los intermediarios enzimáticos en la trayectoria biosintética de la antocianina (C2, Al, A2 , Bzl y Bz2) , pero transporta un alelo recesivo en el locus R, la transformación de cualquier célula a partir de esa línea con R resultará en una formación de pigmento rojo. Las líneas ejemplares incluyen Wisconsin 22 que contiene el alelo rg-Stadler y TR112, un derivado K55 el cual es r-g, b, PI . Alternativamente, cualquier genotipo de maíz puede utilizarse si los alelos Cl y R se introducen juntos. b. Promotores y otras secuencias que influyen en la expresión genética La expresión del ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable (o cualquier ácido nucleico heterólogo) en una célula receptora puede regularse por una variedad de promotores. Los promotores para utilizarse para regular la transcripción del ADN en células, particularmente células de planta, incluye, pero no se limita a, los promotores de nopalina sintasa (NOS) y octopina sintasa (OCS) , promotores del virus del mosaico de coliflor (CaMV) 19S y 35S, el promotor inducible de luz a partir de la subunidad pequeña de ribulosa bis-fosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido de planta abundante) , el promotor de manopina sintasa (MAS) {véase por ejemplo, Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730; y Velten and Schell (1985) jVuc. Acids Res. 13:6981-6998), el promotor de actina de arroz, el promotor de ubiquitina, por ejemplo, de Z. mays (véase por ejemplo, Publicación de Solicitud PCT No. WO00/60061) , promotor Arabidopsis thaliana UBI 3 [véase por ejemplo, Norris et al. (1993) Plant Mol. Biol . 22:895-906] y el promotor PR-1 químicamente inducible de tabaco o Arabidopsis (véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,689,044). La selección de un promotor adecuado puede incluir diversas consideraciones, por ejemplo, tipo célula receptora (tal como, por ejemplo, células epidérmicas de las hojas, células mesófilas, células de corteza de raíz), expresión de tejido u órgano específico (por ejemplo, raíces, hojas o flores) de genes unidos al promotor, y tiempo y nivel de expresión (como puede influirse por promotores constitutivos contra regulables y la resistencia del promotor) . Las secuencias adicionales que pueden incluirse también en el ácido nucleico que contienen un marcador seleccionable incluyen, pero no se restringen a, terminadores de transcripción y secuencias extrañas para mejorar la expresión tales como intrones . Una variedad de terminadores de transcripción pueden utilizarse los cuales son responsables para la terminación de transcripción más allá de una región de codificación y poliadenilación correcta. Los terminadores de transcripción apropiados incluyen aquellos que se conocen para surtir efecto en plantas tales como, por ejemplo, el terminador CaMV 35S, el terminador tml, el terminador de nopalina sintasa y el terminador de chícharo rbcS E9, todos de los cuales pueden utilizarse en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Se han encontrado numerosas secuencias para mejorar la expresión genética dentro de la unidad transcripcional y estas secuencias pueden utilizarse junto con el marcador seleccionable y otros genes para incrementar la expresión de los genes en las células de las plantas. Por ejemplo, varias secuencias intron tales como intrones del gen Adhl de maíz se han mostrado para mejorar la expresión, particularmente en células monocotiledóneas . Además, un número de secuencias líderes no traducidas derivada de virus se conocen también para mejorar la expresión, y estas son particul rmente efectivas en células dicotiledóneas. c. Ácidos nucleicos que contienen secuencias objetivo El desarrollo de un cromosoma multicéntrico, particularmente dicéntrico, normalmente se efectúa a través de la integración de · ácido nucleico heterólogo en la heterocromatina, tal como la heterocromatina pericéntrica, cerca o dentro de las regiones centroméricas de los cromosomas y/o en las secuencias de ADNr. Asi, el desarrollo de cromosomas artificiales puede facilitarse dirigiendo el ácido nucleico heterólogo por la integración en estas regiones, tales como introduciendo ADN, incluyendo, pero no limitándose a ADNr (por ejemplo, secuencia espaciadora intergénica de ADNr) , ADN satélite, ADN pericéntrico y ADN de fago lambda, en la célula huésped receptora. La secuencia objetivo puede introducirse sola o con otros ácidos nucleicos, incluyendo pero no limitándose a marcadores seleccionables . Por ejemplo, una secuencia objetivo puede unirse a un marcador seleccionable . Ejemplos de ADN pericéntrico de plantas y ADN satélite incluyen, pero no se limitan a secuencias pericentroméricas en cromosoma 6 de tomate [véase, por ejemplo Weide et al. (1998.) Mol. Gen. Genet. 259 : 190-197] , ADN satélite de soya [véase, por ejemplo, Morgante et al. (1997) Chromosome Res. 5:363-373 ; y Vahedian et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29 : 857-862] , Adn pericentromérico de Arabidopsis thaliana [véase, por ejemplo, Tutois et al. (1999) Chromosome Res. 7:143-156], ADN satélite de arabidopsis thaliana (GenBank nos. de acceso AB033593 y X58104) , ADN pericéntrico del garbanzo [Cicer arietinum L. ; véase por ejemplo, Staginnus et al. (1999) Plant Mol. Biol. 35:1037-1050], ADN satélite en el cromosoma B de centeno [véase por ejemplo, Langdon et al. (2000) Genetics 154:869-884] , ADN satélite subtelomérico de Silene latifolia [véase por ejemplo, Garrido-Ramos et al. (1999) Genome 42:442-446] y ADN satélite en el complejo de Saccharum [véase por ejemplo, Alix et al. (1998) Genome 41:854-864] . Ejemplos de secuencias objetivo de ADNr incluyen ácidos nucleicos de ADNr de planta y animal. Las secuencias de ADNr de planta incluyen, pero no se limitan a, secuencias contenidas en GENBANK números de Acceso D16103 de ADNr a zanahoria {Daucus carota)], M23642 y M11585 [de ADNr que codifica 24S ARNr de arroz {Oryza sativa)], M26461 [de ADNr que codifica 18S ARNr de arroz {Oryza sativa)] , M16845 [de ADNr que codifica 17S, 5.8S y 25S de ARNr de arroz {Oryza sativa)], X82780 y X82781 [de ADNr que codifica 5S ARNr de papa {Solanum túberosum)] , AJ131161, AJ131162, AJ131163, AJ131164, AJ131165, AJ131166 y AJ131167 [de ADNr que codifica 5S de ARNr de tabaco (Nicotiana tabacum)] , L36494 y U31016 a U31030 [de ADNr que codifica 5S ARNr de cebada (Hordeum spontaneum) ] , U31004 a U31015 y U31031 [de ADNr que codifica 5S ARNr de cebada {Hordeum bulbosum) ] , Z11759 [de ADNr que codifica 5.8S ARNr de cebada (Hordeum vulgare) ] , X16077 (de ADNr que codifica 18S ARNr de Arabidopsis thaliana) , M65137 (ADNr que codifica 5S ARNr de Arabidopsis thaliana) , AJ232900 (de ADNr que codifica 5.8S ARNr de Arabidopsis thaliana) y X52320 (de genes Arabidopsis thaliana para 5.8S y 25S de ARNr con un fragmento de 18S ARNr) . Las regiones espaciadoras intergénicas del ADNr de planta incluyen, pero no se limitan a secuencias contenidas en GENBANK Números de Acceso S70723 (del ADNr 5S de cebada (Hordeum vulgare)), AF013103 y X03989 (de maíz (Zea mays) ) , X65489 (de papa (Solanum tuberosum) ) , X52265 (de tomate (Lycopersicon esculentum) ) , AF177418 (de Arabidopsis neglecta) , AF177421 y AF17422 (de Arabidopsis halleri) , A71562, X15550, X52631, U43224, X52320, X52636 y X52637 (de Arabidopsis thaliana, véase Gruendler et al. (1991) J\ Mol. Biol. 222:1209-1222 y Gruendler et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6395-6396) , X54194 [de arroz (Oryza sativa)] ?08422 y D76443 [de tabaco (Nicotiana tabacum)], AJ243073 [de trigo (Triticum boeoticum) ] y X07841 [de trigo (Triticum aestivu ) ] . Las secuencias de regiones espaciadoras intergénicas de ADNr de planta incluyen además secuencias de centeno [véase Appels et al. (1986) Can. J. Genet. Cytol 28: 673-685] trigo [véase Barrer et al. (1988) J. Mol. Biol. 201:1-17 y Sardana and Flavell (1996) Genome 35:288-292], rábano [véase Delcasso-Tremousaygue et al. (1988) Sur. J". Biochem. 272:767-776] , Vicia faba and Pisum sativum [véase Kato et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:983-993], frijol peruano [véase Gerstner ' e al. (1988) Genome 30 -.723-733 ,- y Schiebel et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218 -.302-307] , tomate [véase Schmidt-Puchta et al. (1989) Plant Mol. Biol. 23:251-253], Hordeum bulbosum [véase Procunier et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:661-663], Lens culinaris Medik., ? otras especies de legumbres [véase Fernandez et al. (2000) Genome 43:597-603] y tabaco {véase Patentes Norteamericanas Nos. 6,100,092 y 6,096,546 y Publicación de Solicitud PCT No. WO99/66058; Borysyuk et al. (1997) Plant Mol. Biol. 35:655-660); Borysyuk et al. (2000) Nature Biotechnology 28:1303-1306] . Las secuencias de ADNr mamíferas incluyen, pero no se limitan a, ADN de GENBANK no. de acceso X82564 y porciones de las mismas, el ADN de GENBANK no. de acceso U13369 y porciones de las mismas y secuencias de ADN proporcionadas en la Publicación de Solicitud PCT No. WO97/40183 (particularmente las SEC. DE IDENT. NOS. 18-24 de WO97/40183) . Un vector particular para usarse para dirigir la integración de ácido nucleico heterologo en ADNr cromosomal es pTERPUD (véase Publicación de Solicitud PCT No. WO97/40183) . Las secuencias de ADN satélite pueden también utilizarse para dirigir el ADN heterologo para integrarlo en la heterocromatina pericéntrica. Por ejemplo, los vectores pTEMPUD y pHASPUD, que contienen ADN satélite de ratón y humano, respectivamente (véase Publicación de Solicitud PCT No. W097/40183) son ejemplos de vectores que pueden utilizarse para la introducción de ácido nucleico heterologo en células para la formación de cromosoma de novo conduciendo a cromosomas artificiales. 3. Métodos para la introducción de ácidos nucleicos heterólogos en células huésped Cualesquiera métodos conocidos en la técnica para la introducción de ácidos nucleicos heterólogos en células huésped pueden utilizarse en los métodos para preparar cromosomas artificiales . El método particular utilizado puede depender del tipo de célula en la cual el ácido nucleico heterologo está siendo transferido. Por ejemplo, los métodos para la introducción física de los ácidos nucleicos en células de planta, por ejemplo, protoplastos y células de plantas en cultivo, incluyen, pero no se limitan a incorporación de ADN mediado por polietilenglicol (PEG) , electroporación, suministro mediado por lípido, incluyendo liposomas, incorporación de ADN mediado por fosfato de calcio, microinyección, bombardeo de partículas, transformación mediada por filamentos de carburo de silicio y combinaciones de estos métodos, por ejemplo métodos que utilizan combinaciones de fosfato de calcio y PEG para incorporación de ADN o métodos que utilizan una combinación de electroporación, PEG y choque de calor (por ejemplo, véase Patentes Norteamericanas Nos. 5,231,019 y 5,453,367). Los métodos físicos tales como esos se conocen en la técnica y son efectivos para introducir ADN en una variedad de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas [véase, por ejemplo, Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2111-2122; Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199 -.169-111 ; Reich et al. (1986) Biotechnology 4 ; 1001-1004 ; Klein et al. (1987) Nature 327:10-73; Patente Norteamericana No. 6,143,949; Paszkowski et al. (1989) in Ce.ll Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol . 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J and Vasil, L.K. Academic Publishers, San Diego, California, p. 52-68; y Frame et al. (1994) Plant J. 6:941-948] . Además de estos métodos para la introducción de ácidos nucleicos en células de plantas basadas en procesos mediados física, mecánica o químicamente, es posible introducir ácidos nucleicos en células de plantas por métodos biológicos, tales como aquellos que utilizan Agrobacterium. En este método, las secuencias de ácido nucleico ubicadas adyacentes a repeticiones de borde ADN-T pueden insertarse en el genoma de una célula de planta, normalmente células de planta dicotiledóneas, utilizando la función codificada para la transferencia de ADN encontrado en el género Agrobacterium. Este método también ha sido mostrado para trabajar por algunas células de planta monocotiledónea, tales como células de arroz . Cualquier método para introducir ácidos nucleicos en células de plantas pueden utilizarse en la generación de cromosomas artificiales, a condición de que el método sea capaz de introducir el ácido nucleico en una región amplificable de un cromosoma, por ejemplo, heterocromatina, y particularmente en proximidad cercana a una región de megareplicador de un cromosoma de planta. a. Introducción mediada por Agrobacterium de ácidos nucleicos en células de plantas La transformación mediada por Agrobacterium está particularmente bien adaptada para la transformación de dicotiledóneas debido a su alta eficiencia de transformación y su amplia utilidad con muchas diferentes especies, incluyendo tabaco, tomate (véase, por ejemplo, Solicitud de Patente Europea no. 0 249 432), girasol, algodón (véase por ejemplo, Solicitud de Patente Europea no. 0 317 511) , colza de semilla de aceite, papa, soya, alfalfa y tulipán (véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,795,855) (véase también la Publicación de la Solicitud PCT no. WO87/07299 con respecto a la transformación de Brassica) . La transformación mediada por Agrobacterium se ha utilizado también para transferir ácidos nucleicos en plantas monocotiledóneas . La transformación mediada por Agrobacterium de Chlorophytum capense y Narcissus cv "Paperwhite" [véase, por ejemplo, Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764], maíz y trigo [véase, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,164,310, 5,187,073 y 5,177,010 y Mooney et al. (1991) Plant Cell, Tissue, Organ Culture 25:209-218] , arroz [véase por ejemplo, Raineri et al. (1990) Bio/Technology 8:33-38 y Chan et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:491-506) y cebada [véase, por ejemplo Tingay et al. (1997) The Plant J. 11:1369-1376 y Qureshi et al. (1998) Proc . 42nd Conference of Australian Society for Biochemistry and Molecular Biology, September 28-October 1, 1998, Adelaide Australia] ha sido reportado . El suministro mediado por Agrobacterium de ácidos nucleicos se basa en la capacidad de ciertas cepas Agrobacterium para introducir una parte de su plásmido (inducido por tumor) Ti, es decir, el ADN transformantes o ADN-T, en células de plantas y para integrar este ADN-T en el genoma de las células . La parte del plásmido Ti que se transfiere e integra se delínea por secuencias de ADN específico, las secuencias de borde ADN-T izquierda y derecha. Las secuencias de ADN-T naturales entre estas secuencias de borde pueden reemplazarse por el ADN extraño [véase por ejemplo, Publicación de Patente Europea 116 718 y Deblaere et al. (1987) Meth. Enzymol 153 :277-293] . Cuando se utiliza Agrobacterium para la transformación, el ácido nucleico heterologo que se transfiere normalmente se clona en un plásmido que contiene regiones de borde de ADN-T y se replica independientemente del plásmido Ti (mencionadas como el sistema de vector binario) o el ácido nucleico heterologo se inserta entre los bordes ADN-T del plásmido Ti (mencionado como el método cointegrado) . En los métodos co-integrados , estos vectores se integran en el plásmido Ti o Ri por recombinación homologa debido a secuencias que son homologas a secuencias dentro de la región ADN-T del plásmido Ti o Ri . El plásmido Ti o Ri también contiene la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermediarios no pueden replicarse en Agrobacteria . El vector intermediario puede transferirse en Agrobacterium por medio de un plásmido asistente (conjugación, véase Fraley et al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 80:4803). Este método, normalmente mencionado como un apareamiento tripaternal, introduce la secuencia de ácido nucleico heterologo en la bacteria y le permite la selección de un acontecimiento de recombinación homólogo que produce el genotipo Agrobacterium deseado. El procedimiento de apareamiento tripaternal normalmente emplea Escherichia coli que transporta el vector intermediario recombinante y una cepa auxiliadora E. coli que transporta un plásmido que es capaz de movilizar el vector intermediario recombinante a la cepa Agrobacterium objetivo. Un plásmido Ti o Ri modificado se obtiene del proceso de transferencia y selección, que contiene una secuencia de ácido nucleico heteróloga ubicada dentro de la región de ADN-T. La cepa Agrobacterium resultante es capaz de transferir el ácido nucleico heterólogo a las células de la planta. Los vectores binarios pueden replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterium. Normalmente contienen un gen marcador de selección y un enlazador o polienlazador que se flanquea por las regiones de borde de ADN-T derecha e izquierda y pueden transformarse directamente en Agrobacterium [véase, por ejemplo, Hofgen and Wilmitzer (1988) Nuc. Acids. Res. 16:9817 y Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163: 181-187] o introducido a través del apareamiento tripaternal. La célula huésped Agrrojbacterium contiene un plásmido que transporta una región vir necesaria para transferir el ADN-T en una célula de planta [véase por ejemplo, White in Plant Biotechnology, eds . Kung, S. and Arntzen, C.J., Butterworth Publishers, Boston, Mass., (1989) p. 3-34 y Praley in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C.J., Butterworth Publishers, Boston, Mass., (1989) p. 395-407] . La transformación mediada por Agrobacterium normalmente implica la transferencia de un vector binario que transporta el ácido nucleico heterólogo de interés a una cepa Agrobacterium apropiada, que puede depender del complemento de genes vir transportados por la cepa Agrobacterium huésped ya sea en un plásmido co-residente Ti o cromosomalmente (véase por ejemplo, Uknes et al. (1993) Plant Cell 5:159-169) . La transferencia de un vector binario recombinante a Agrobacterium se logra por un procedimiento de apareamiento tripaternal utilizando Escherichia coli que transporta el vector binario recombinante, y una cepa auxiliadora E. coli que transporta un plásmido que es capaz de movilizar el vector binario recombinante a la cepa Agrobacterium objetivo. Alternativamente, el vector binario recombinante puede transferirse a Agrobacterium por la transformación del ADN (véase por ejemplo, Hofgen & Willmitzer (1988) Nuc. Acids. Res. 25:9877) . Muchos vectores están disponibles para transferir ácidos nucleicos en Agrobacterium tu efaciens [véase por ejemplo Rogers et al. (1987) Methods in Enzymol . 153:253-277] . Éstas normalmente transportan al menos una secuencia de borde de ADN-T e incluyen vectores tales como pBIN19 [véase por ejemplo, Bevan (1984) Nuc. Acids. Res. 12:8711-8721] . Los vectores típicos adecuados para transformación de Agrobacteriu incluyen los vectores binarios pCIB200 y pCIB2001, así como el vector binario pCIBlO y derivados de selección de higromicina de los mismos (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,639,949) . Otros vectores que pueden emplearse son los vectores pCambia (véase www.cambia.org), incluyendo por ejemplo, pCambia 3300 y pCambia 1302 (GenBank No. de Acceso AF234298) . Un vector de cásete de plásmido Ti particularmente útil para la transformación de plantas dicotiledóneas contiene el promotor CaMV35S mejorado (EN35S) y el extremo 3', incluyendo las señales de poliadenilación, de un gen de soya que codifica la subunidad de ß-conglicinina . Entre estos dos elementos es un multienlazador que contiene sitios de restricción múltiples para la inserción de genes de interés (véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,023,013). El vector puede contener un segmento de pBR322 que proporciona un origen de replicación en E. coli y una región de recombinación homologa con el ADN-T desarmado en ACO de cepa Agrobacterium; la región oriV a partir' del plásmido de rango huésped amplio RKl; el gen de resistencia a la estreptomicina/espectinomicina de Tn7 ; y gen NPTII quimérico, que contiene el promotor CaMV35S y el extremo 3 '· de nopalina sintasa (NOS) , que proporciona resistencia a la kanamicina en células de plantas transformadas.

Opcionalmente, el promotor CaMV35S mejorado puede reemplazarse con el promotor de manopina sintasa (MAS) 1.5 kb (véase por ejemplo, Velton et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730) . Después de la incorporación de una construcción de ADN en el vector, éste se introdujo en una cepa ACO A. tumefaciens que contiene un plásmido Ti desarmado. Los vectores de plásmido Ti co-integrados se seleccionan y subsecuentemente pueden utilizarse para transformar una planta dicotiledónea. La transformación de la especie de planta objetivo por Agrobacteri m recombinante usualmente implican co-cultivación del Agrobacterium con explantas a partir de la planta y sigue los protocolos publicados. Los métodos de inoculación del tejido de planta varían dependiendo de la especie de planta y el sistema de suministro Agrobacterium. El tejido de planta puede ser ya sea protoplasto, callo o tejido de órgano, dependiendo de la especie de planta. Un enfoque ampliamente utilizado en el procedimiento de disco de hojas, que puede realizarse con cualquier explanta de tejido que proporciona una buena fuente de iniciación de la diferenciación de la planta entera (véase, por ejemplo, Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9 y Patente Norteamericana No. 6,136,320). La adición de tejido cuidador puede ser deseable bajo ciertas condiciones. Existen múltiples elecciones de cepas Agrobacterium (incluyendo, pero sin limitación a A. tu efaciens y A. rhizogenes) y estrategias de construcción de plasmido que pueden utilizarse para optimizar la transformación genética de las plantas. El tejido transformado transporta un marcador resistente a antibiótico o herbicida presente entre el plásmido binario y bordes de ADN-T pueden regenerarse en un medio seleccionable . A. tumefaciens ACO es una cepa desarmada similar a pTiB6SE (véase Fraley et al. (1985) Bio/Technology 3:629-635) . Para la construcción de ACO, la cepa Agrobacterium de partida fue A208 que contiene un plásmido Ti del tipo de nopalina. El plásmido Ti se desarmó en una manera similar a aquella descrita por Fraley et al. (1985) Bio/Technology 3:629-635) de manera que esencialmente todo el ADN-T nativo se removió, excepto para el borde izquierdo y unos cuantos cientos de pares de bases del ADN-T interior del borde izquierdo. El resto del ADN-T que se extiende a un punto justo más allá del borde derecho se reemplazó con una pieza de ADN que incluye un segmento (de izquierda a derecha) de pB 322, la región oriV del plásmido RK2 , y el gen de resistencia a la kanamicina de Tn601. Los segmentos pBR322 y oriV son similares a estos segmentos y proporcionan una región de homología para formación co-integrada (véase Patente Norteamericana No. 6,023,013) . Otra cepa útil de Agrobacterium es la cepa A. tumefaciens GV310l/pMP90 [véase por ejemplo, oncz and Schell (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396] . Avances en la introducción que permite la transferencia mediada por Agrobacterium de segmentos más grandes de ácidos nucleicos [véase por ejemplo, Hamilton (1997) Gene 4 : 200 (1-2) : 107-116 ; Hamilton et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 93 : 9975-9979 ; Liu et al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 55.6535-6540]. Los vectores utilizados en estos métodos se . designan por tener las características tanto de cromosomas artificiales bacteriales (los BAC) como los vectores binarios para la transformación mediada por Agrobacterium. Por lo tanto, los fragmentos de ADN un poco más grandes clonados en la región ADN-T pueden transferirse en un genoma de planta por Agrobacterium. El vector de cromosoma artificial bacterial binario (BIBAC) BIBAC2 (véase Patente Norteamericana No. 5,733,744; disponible de Plant Science Center, Cornell University) y el vector de cromosoma artificial bacterial competente con la transformación (TAC) pYLTAC7 (disponible de Plant Cell Bank of the RIKEN Gene Bank, Tsukuba, Japan) son ejemplos de tipos de vectores que pueden utilizarse para transferir grandes segmentos de ácidos nucleicos, particularmente ácidos nucleicos ¦ heterólogos que contienen secuencias marcadoras objetivo y/o seleccionables como se describe en la presente, en plantas a través de procesos de transferencia de ADN mediados por Agrobacterium. La introducción de ácidos nucleicos heterólogos en las células de planta sin el uso de Agrobacterium que evade los requerimientos de las secuencias de ADN-T en el vector de transformación y consecuentemente vectores que carecen de estas secuencias pueden utilizarse además de vectores que contienen secuencias de ADN-T. Las técnicas para la transferencia de ácido nucleico que no se basan en Agrobacterium incluyen la transformación a través de bombardeo de partículas, incorporación de ADN directa (por ejemplo, PEG, lípidos, electroporación) y métodos mecánicos tales como microinyección o "filamentos" de silicio. Esta elección del vector que puede utilizarse en la introducción de ácidos nucleicos heterólogos en las células de planta pueden involucrarse en gran medida en la selección preferida para las especies que se transforman. Los vectores típicos adecuados para la transformación sin Agrobacterium incluyen pCIB3064, pSOG19 y pSOG35 (véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,639,949), o vectores de plásmido común, fago o cósmido . b. Incorporación Directa de ADN La introducción de ácidos nucleicos heterólogos en células de plantas puede lograrse utilizando una variedad de métodos que facilitan la incorporación directa del ADN, incluyendo precipitación de fosfato de calcio, tratamiento con polietilenglicol (PEG) , electroporación, y combinación de los mismos [véase, por ejemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183; Lorz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:178; Fromm et al. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 82:5824-5828; Uchimiya et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 204:204; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-2000; Callis et al. (1987) Nuc. Acids Res. 15:5823-5831; Marcotte et al. (1988) Nature 355:454, Toriyama et al. (1988) Bio/Technology 6.-1072-1074 ; Haim et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161-168; Deshayes et al. (1985) EMBO J. 4:2731-2737 ; Krens et al. (1982) JVature 296: 72-74; Crossway et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 20:179] . Normalmente, los protoplastos de planta se utilizan para incorporación directa del ADN, o en algunos casos tejidos de planta que se han tratado para remover una porción o la mayoría de la pared celular (véase por ejemplo, Publicación PCT No. W093/21335 y Patente Norteamericana No. 5,472,869). La remoción de la pared celular se cree facilita la entrada de ADN en las células de la planta, aunque en algunos casos la electroporación puede utilizarse para introducir el ADN en células de planta especializada, por ejemplo, electroporación de polen, sin remover primero la pared celular. Las técnicas para la preparación de callos y protoplastos a partir del maiz, la transformación de protoplastos utilizando PEG o electroporación, y la regeneración de plantas de maíz a partir de protoplastos transformados se encuentra por ejemplo, en las Solicitudes de Patente Europea Nos. 0 292 435 y 0 392 225 y Publicación de Solicitud PCT no. WO93/07278. La transformación de arroz puede también incorporarse por técnicas de transferencia genética directa utilizando protoplastos [véase, por ejemplo, Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep. 7:379-384; Shimamoto et al. (1989) Nature 338:274-277 ; Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740] . La regeneración de cebada transgénica fértil por transferencia de ADN directa a protoplastos se describe, por ejemplo, por Funatsuki et al. [(1995) Theor. Appl . Genet. 51:707-712] . Otras especies de plantas, incluyendo tabaco y Arabidopsis, pueden también servir como fuentes de protoplastos para usarse en la introducción de ácidos nucleicos heterólogos en células de plantas . c. Introducción mediada por bombardeo de partículas de ácidos nucleicos en células de plantas El bombardeo de microproyectil de las células de planta puede ser un método efectivo para la introducción de ácidos nucleicos en las células de plantas. En estos métodos, los ácidos nucleicos se transportan a través de la pared celular y en el citoplasma en la superficie de partículas pequeñas, normalmente metálicas [véase por ejemplo, Klein et al. (1987) Nature 327:70; Klein et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sel. U.S.A. 85:8502-8505, Klein et al. in Progrese in Plant Cellular and Molecular Biology, eds. Nijkamp, H.J.J., Van der Pías, J.H.W., and Van Aartrijk, J. , Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, (1988), p. 56-66; Seki et al. (1999) Mol. Biotechnol, 11:251-255; y McCabe et al. (1988) Bio/Technology 5:923-926]. Las partículas pueden recubrirse con ácidos nucleicos y suministrarse en las células por una fuerza propulsora. Partículas ejemplares incluyen aquellas que contienen tungsteno, oro o platino, así como cristales de sulfato de magnesio. Las partículas metálicas pueden penetrar a través de varias capas de células y así permitir la transformación de las células dentro de las explantas del te ido . En una modalidad ilustrativa [véase por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,023,013] de un método para suministrar ácidos nucleicos en células de plantas, por ejemplo, células de maíz, por aceleración, puede utilizarse un Sistema de Suministro de Partícula Biolístico para propulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o Nytex, en una superficie de filtro cubierta con células de planta (por ejemplo, maíz) cultivadas en suspensión. El tamiz dispersa las partículas de manera que no se suministren a las células receptoras en agregados grandes. El tamiz intermedio entre el aparato proyectil y las células a ser bombardeadas puede reducir el tamaño de agregados proyectiles y puede contribuir a una frecuencia más elevada de transformación reduciendo el daño infligido en las células receptoras por proyectiles que son muy grandes. Para el bombardeo, las células en suspensión pueden concentrarse en filtros o medios de cultivo sólidos. Alternativamente, los embriones inmaduros u otras células objetivo pueden disponerse en un medio de cultivo sólido. Las células a ser bombardeadas se colocan normalmente en una distancia apropiada debajo de la placa de detención de macroproyectil . Si se desea, uno más tamices pueden también colocarse entre la disposición de aceleración y las células a ser bombardeadas . Las condiciones de cultivo pre-bombardeo y los parámetros de bombardeo pueden optimizarse para producir los números máximos de transformantes estables. Tanto los parámetros físicos como biológicos para el bombardeo pueden ser importantes en esta tecnología. Los factores físicos incluyen aquellos que implican la manipulación de precipitado de ADN/microproyectil o aquellos que afectan el vuelo y la velocidad de cualquiera de los macro- o microproyectiles . Los factores biológicos incluyen todas las etapas implicadas en la manipulación de células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de células objetivo para ayudar a aliviar el trauma asociado con el bombardeo, y también la naturaleza del ácido nucleico transformante, tal como ADN linearizado o plásmidos supercoloides intactos. Los parámetros físicos que pueden ajustarse incluyen distancia de abertura, distancia de vuelo, distancia de tejido y presión de helio. Además, la transformación puede optimizarse ajustando el estado osmótico, hidratación de tejido y etapa de subcultivo o ciclo celular de las células receptoras . Las técnicas para la transformación de la línea de maíz derivada de A188, que utiliza bombardeo de partículas se describen en Gordon-Kamm et al. [(1990) Plant Cell 2:603-618] y Fromm et al. [(1990) Biotechnology 8:833-839]. La transformación de arroz puede también lograrse a través de bombardeo de partículas [véase por ejemplo, Christou et al. (1991) Biotechnology 3:957-962] . El bombardeo de partículas puede también utilizarse para transformar trigo [véase por ejemplo, Vasil et al. (1992) Biotechnology 10:667-674 para la transformación de células del tipo de callo regenerable de término largo C; y Weeks et al. (1993) Plant Physiol. 102:1077-1084 para transformación de trigo utilizando bombardeo de partículas de embriones inmaduros y callos derivados de embriones inmaduros] . Se describe la producción de cebada trasngénica que utiliza métodos de bombardeo, por ejemplo, por Koprek et al. [(1996) Plant Sci. 119:19-91] . d. Introducción mediada por electroporacion de ácidos nucleicos en células de plantas. La aplicación de pulsos eléctricos de alto voltaje cortos a una variedad de células de animal y planta conduce a la formación de poros de tamaño de nanómetro en la membrana de plasma. Los ácidos nucleicos se toman directamente en el citoplasma celular ya sea a través de esos poros, o como una consecuencia de redistribución de componentes de membrana que abarca el cierre de los poros. La electroporacion puede ser extremadamente eficiente y puede utilizarse tanto para la expresión transiente de genes clonados y para el establecimiento de líneas celulares que transportan copias integradas del gen de interés. Ciertas enzimas que degradan la pared celular, tales como enzimas que degradan pectina, pueden emplearse para suministrar las células receptoras objetivo más susceptibles a la transformación por electroporacion que las células no tratadas. Alternativamente, las células receptoras pueden ser más susceptibles a la transformación por lesión mecánica. Para efectuar la transformación por electroporacion, los tejidos desintegrables tales como un cultivo de suspensión de células o callos embriónicos pueden utilizarse o embriones inmaduros u otros tejidos organizados pueden transformarse directamente [véase por ejemplo, Fromm et al. (1986) Nature 315:791-793; and Neuman et al. (1982) EMBO J. 1:841-845] . e. Introducción mediada por microinyección de ácidos nucleicos en células de plantas En técnicas de microinyección, se inyectan mecánicamente ácidos nucleicos directamente en células que utilizan micropipetas muy pequeñas. Por ejemplo, microinyección de células de protoplasto con ADN extraño para la transformación de células de plantas se ha reportado para la cebada y el tabaco [véase por ejemplo, Holm et al. (2000) Transgenic Res. 5:21-32 and Schnorf et al. Transgenic Res. 1:23-30] . f. Introducción mediada por lípido de ácidos nucleicos en células de plantas En la transferencia mediada por lípido, se ponen en contacto los ácidos nucleicos con lípidos y/o encapsulan en estructuras que contienen lipidos, incluyendo pero no limitándose a liposomas, y los ácidos nucleicos que contienen liposomas se combinan con protoplastos de planta. La fusión puede ocurrir en la presencia o ausencia de un fusógeno, tal como PEG. Se ha reportado la transformación mediada por lípido de protoplastos de planta [véase por ejemplo, Fraley and Papahadj opoulos (1982) Curr. Top. Microbiol . Immunol . 96:111-191; Deshayes et al. (1985) EMBO J. 4:2731-2737 y Spoerlein and Koop (1991) Theor. Appl . Genetics 83:1-5] g. Otros métodos de introducción de ácidos nucleicos en células de plantas Pueden utilizarse otros métodos para introducir físicamente ácido nucleico en células de plantas, incluyendo fibras de carburo de silicio ("filamentos") que se utilizan para perforar paredes celulares de plantas por lo que facilita la incorporación del ácido nucleico, el uso de ondas de sonido para introducir orificios en membranas celulares de plantas para facilitar la incorporación del ácido nucleico (por ejemplo, sonoporación) y el uso de haces de láser para abrir los agujeros en las membranas celulares que facilitan la entrada de ácidos nucleicos (por ejemplo, poración láser). Los ácidos nucleicos pueden también embeberse hidratando tejido de plantas, proporcionando otro método para la incorporación del ácido nucleico en células de plantas [véase por ejemplo, Simón (1974) New Phytologis 37:377-420] . Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser tomados en embriones de semillas de cereales y legumbres por inhibición [véase por ejemplo, Toepfer et al. (1989) The Plant Cell 1:133-139] . 4. Tratamiento de células en donde los ácidos nucleicos heterologos han sido introducidos Las células en las cuales los ácidos nucleicos heterologos se han introducido pueden analizarse para formación de novo de cromosomas artificiales descritos en la presente tales como pueden resultar a partir de la amplificación de segmentos cromosomales que ocurren junto con la integración de ácidos nucleicos heterologos en cromosomas. Normalmente, la amplificación ocurre sobre generaciones múltiples de división celular que conduce a la formación de cambios detectables en estructura de cromosoma. Por lo tanto, las células transíectadas se cultivan normalmente a través de divisiones celulares múltiples, a partir de aproximadamente 5 a aproximadamente 60, o aproximadamente 5 a aproximadamente 55, o aproximadamente 10 a aproximadamente 55, o aproximadamente 25 a aproximadamente 55, o aproximadamente 35 a aproximadamente 55 divisiones celulares siguiendo la introducción del ácido nucleico en una célula. Los cromosomas artificiales pueden, sin embargo, aparecer después de únicamente solo 5 a aproximadamente 15 o aproximadamente 10 a aproximadamente 15 divisiones celulares. Las células en donde el ácido nucleico heterólogo ha sido introducido pueden tratarse en una variedad de formas antes a, o durante el análisis de las mismas por la presencia de cromosomas artificiales . Por ejemplo, las células en donde el ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable requerido para el crecimiento en la presencia de un agente de selección ha sido transferido puede tratarse como las células ejemplificadas en la presente para facilitar la generación de cromosomas multicéntricos , y fragmentación de los mismos, y/o la generación de cromosomas artificiales. Las células pueden cultivarse en la presencia de una concentración apropiada de agente de selección, que pueden determinarse empíricamente cultivando células no transíectadas en concentraciones variantes del agente y concentración de identificación suficientes para evitar el crecimiento celular y/o facilitar la amplificación de segmentos cromosórnales . Las células transfectadas pueden cosecharse en medios selectivos para numerosas generaciones, y líneas celulares pueden establecerse las cuales contienen el ácido nucleico introducido. La concentración del agente de selección puede también incrementarse sobre varias generaciones para promover la amplificación de una región de un cromosoma en donde se integró el ácido nucleico heterólogo. Las células transfectadas pueden también tratarse para desestabilizar los cromosomas para facilitar la generación y fragmentación de un cromosoma multicéntrico, normalmente dicéntrico. Ácido nucleico de heterólogos adicionales, por ejemplo ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable , puede también introducirse en las células transfectadas para facilitar la amplificación de segmentos cromosomales , tales como la heterocromatina pericéntrica, contenida en, por ejemplo un fragmento liberado de un cromosoma multicéntrico, (por ejemplo, cromosoma formalmente dicéntrico) y la generación de un cromosoma artificial heterocromático . Las células transformadas resultantes pueden entonces cultivarse en la presencia de un agente de selección, el cual puede ser un segundo agente (si el ácido nucleico heterólogo introducido en las células transfectadas codifica un marcador seleccionable diferente de cualquier marcador seleccionable codificado por el ácido nucleico heterólogo inicialíñente transferido en las células huésped originales) , con o sin el primer agente de selección. Las células en donde los ácidos nucleicos se han introducido pueden también someterse a clasificación celular. Por ejemplo, los protoplastos pueden prepararse a partir de células de plantas transfectadas o callos y someterse a clasificación. Si la clasificación se conduce antes del análisis cromosomal de las células por la presencia de cromosomas artificiales, esto proporciona una población de células transfectadas que pueden enriquecerse por cromosomas artificiales y así facilita el análisis cromosomal subsecuente de las células . La clasificación se basa en la presencia de un marcador detectable en las células, como se proporciona por el ácido nucleico introducido, el cual puede proporcionar las bases para el aislamiento de tales células a partir de células que no contienen el ácido nucleico heterólogo . Por ejemplo, el ácido nucleico introducido en las células de plantas puede contener ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente, tal como una proteína fluorescente verde, roja o azul, la cual puede utilizarse para selección, por citometría de flujo y otros métodos, de células receptoras que han ocupado y expresado el ácido nucleico a niveles fácilmente detectados . En un protocolo ejemplar, la fluorescencia GFP de cultivos celulares transfectados puede verificarse visualmente durante el cultivo utilizando un microscopio invertido equipado con iluminación epifluorescente (Axiovert 25; Zeiss, (North York ON) y #41017 Endow GFP filter set (Chroma Technologies, Brattleboro, VT) . El enriquecimiento de poblaciones que expresan GFP puede llevarse a cabo como sigue. La clasificación celular puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando un citómetro de flujo FACS Vantage (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San José, CA) , equipado con opción de tipo turbo y 2 láseres Innova 306 (Coherent, Palo Alto CA) . Para la clasificación celular puede utilizarse una boquilla de 70 µt?. El regulador puede cambiarse a PBS (mantenido a 20 p.s.i.). El GFP puede excitarse con un haz de láser 488 nm y la excitación detectada en FL1 utilizando un filtro 500 EFLP. Puede ajustarse el esparcimiento hacia delante y de lado para seleccionarse por células viables. Los parámetros de control pueden ajustarse utilizando células no transfectadas como control negativo y células GFP CHO como control positivo.

Para el primer ciclo de clasificación, las células transfectadas pueden cosecharse pos-transfección (por ejemplo, aproximadamente 7-14 días pos-transfección) convertirse a protoplastos , resuspenderse en aproximadamente 10 mi de medio de crecimiento y clasificarse por poblaciones que expresan GFP utilizando parámetros descritos anteriormente. Las células positivas GFP pueden dispersarse en un volumen de aproximadamente 5-10 mi de medio de protoplasto mientras que las células sin expresión se dirigen a la basura. Las células de expresión pueden cultivarse. Las células o callos de las plantas pueden entonces analizarse, para tamización de hibridación in situ de fluorescencia. 5. Análisis de células transformadas e identificación y manipulación de cromosomas artificiales Las células en donde los ácidos nucleicos se han introducido y que pueden o no pueden haber sido tratadas además como se describe en la presente, pueden analizarse por indicaciones de amplificación de segmentos cromosomales, la presencia de estructuras que pueden surgir junto con la amplificación y formación de cromosoma artificial de novo y/o la presencia de cromosomas artificiales deseados como se describe en la presente. El análisis de las células normalmente implica los métodos para visualizar la estructura del cromosoma, incluyendo, pero no limitándose a agrupamiento G y C, PCR, transferencia Southern y análisis FISH, utilizando técnicas descritas en la presente y/o conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Tales análisis pueden emplear etiquetado específico de ácidos nucleicos particulares, tales como secuencias de ADN satélite, heterocromatina, secuencias de ADNr y secuencias de ácido nucleico heterólogo, que pueden someterse a amplificación. Durante el análisis de células transfectadas, un cambio en el número de cromosoma y/o la apariencia del atributo, por ejemplo, por segmentación incrementada surgida de la amplificación de unidades de repetición, las estructuras cromosomales también ayudarán en la identificación de células que contienen cromosomas artificiales. La siguiente descripción de acontecimientos y estructuras que pueden observarse en células de análisis para evidencia de amplificación cromosomal y/o la presencia de cromosomas artificiales se pretende para ser ilustrativa de las observaciones y consideraciones que pueden ocurrir en el análisis de células de cualquier tipo, incluyendo células de mamífero y plantas. Se debe reconocer que numerosos tipos de estructuras pueden formarse durante la amplificación de segmentos cromosomales y tratamiento de las células. Estructuras adicionales, aún relacionadas y variaciones de estas estructuras se contemplan en la presente y son reconocibles basadas en las descripciones y enseñanzas de la generación de identificación de cromosomas artificiales presentados en la presente. Cada estructura puede manipularse además, por ejemplo utilizando procedimientos descritos en la presente, para derivar estructuras y composiciones cromosomales adicionales. Normalmente, la formación de centrómero de novo ocurre en células hasta la integración de ácidos nucleicos heterólogos en los cromosomas celulares y amplificación de ácidos nucleicos cromosomales y heterólogos. La integración y amplificación que da lugar a la formación de centrómero de novo normalmente ocurre en la región centromérica del brazo corto de un cromosoma, normalmente un cromosoma acrocéntrico . Al emplear métodos tales como métodos de tinción' de cromosoma, incluyendo FISH y agrupamiento G y C, puede ser posible identificar un cromosoma en donde el proceso ocurre. La amplificación puede conducir a la formación de cromosomas muíticéntricos normalmente dicéntricos. Debido a la presencia de dos o más centrómeros funcionalmente activos en el mismo cromosoma, el fraccionamiento regular ocurre entre los centrómeros. Tales fraccionamientos de cromosomas específicos pueden dar lugar a la apariencia de un fragmento de cromosoma que transporta un neo-centrómero . El neo-centrómero puede encontrarse en un minicromosoma (neo-minicromosoma) , mientras que un cromosoma anteriormente dicéntrico puede transportar trazas de ácido nucleico heterólogo . a. El neo-minicromosoma El fraccionamiento de un cromosoma dicéntrico entre los dos centrómeros funcionales puede formar al menos dos cromosomas, por ejemplo, un minicromosoma asi llamado, y un cromosoma anteriormente dicéntrico. El tratamiento de células que contienen un cromosoma dicéntrico, tal como por ejemplo, reclonación, tratamiento con agentes que desestabilizan los cromosomas, por ejemplo, BrdU, y/o cultivando bajo condiciones selectivas, puede facilitar el fraccionamiento del cromosoma dicéntrico. La selección de las células transformadas puede conducir a líneas celulares que contienen un neo-minicromosoma estable. El fraccionamiento de un cromosoma multicéntrico, normalmente dicéntrico, en células transformadas, que separan el neo-centromero a partir del resto del cromosoma endógeno, puede ocurrir, por ejemplo en la región de ácido nucleico eteróloga positiva de banda G como se sugiere si las trazas de las secuencias de ácido nucleico heterólogas en el extremo roto del cromosoma anteriormente dicéntrico se observa. La amplificación de tipo E múltiple (amplificación de eucromatina) puede formar un neo-cromosoma, el cual se separa del resto del cromosoma dicéntrico a través de un fraccionamiento especifico entre los centrómeros del cromosoma dicéntrico. La duplicación invertida del fragmento que soporta el neo-centrómero puede resultar en la formación de un neo-minicromosoma estable. El minicromosoma es en general aproximadamente al menos 20-30 Mb en tamaño. La presencia de segmentos de cromosoma invertido pueden asociarse con los cromosomas formados de novo en la región centromérica de un cromosoma. Durante la formación del neo-minicromosoma, el acontecimiento que conduce a la estabilización del segmento distal del cromosoma que soporta el neo-centrómero duplicado puede ser la formación de su duplicado invertido. Aunque el neo-minicromosoma normalmente transporta únicamente un centrómero funcional, ambos extremos del minicromosoma pueden ser heterocromáticos , que transportan por ejemplo, secuencias de ADN satélites tan discernibles por hibridación in situ. La comparación del patrón de banda G de un fragmento de cromosoma que transporta el neo-centrómero con aquel de un neo-minicromosoma estable, puede indicar que el neo-minicromosoma es un duplicado invertido del fragmento de cromosoma que soporta el neo-centrómero. Las células que contienen un minicromosoma formado de novo, que contiene múltiples repeticiones de los ácidos nucleicos heterólogos , pueden utilizarse como células receptoras en la transfección celular. Los ácidos nucleicos donantes, tales como ácidos nucleicos heterólogos que contienen ADN que codifica una proteína deseada y ADN que codifica un segundo marcador seleccionable, puede introducirse en las células e integrarse en los minicromosomas formados de novo. Para facilitar la integración en los minicromosomas formados de novo, el ADN heterólogo puede también contener secuencias que son homologas a ácidos nucleidos ya presentes en los minicromosomas, que pueden, a través de recombinación homologa, proporcionar integración objetivo en el minicromosoma . Los ácidos nucleicos pueden también integrarse en el minicromosoma a través del uso de recombinasas sitio-específicas produciendo minicromosomas que contienen sitios de recombinación sitio-específicos como se describe en la presente. La integración puede verificarse por hibridación in si tu y análisis de transferencia Souther. La transcripción y traducción de ADN heterólogo puede confirmarse por extensión cebadora, análisis de inmunotransferencia y ensayos de gen reportero, si un gen reportero ha sido incluido en el ADN heterólogo, utilizando, por ejemplo, sondas de ácido nucleico apropiadas y/o anticuerpos específicos del producto. El minicromosoma diseñado resultante que contiene el ADN heterólogo puede también transferirse, por ejemplo, por fusión celular, en una línea celular receptora para verificar además expresión correcta del ADN heterólogo. Siguiendo la producción de las células, los cromosomas de metafase pueden obtenerse, tal como por la adición de colquicina, y los minicromosom s purificados utilizando métodos como se describe en la presente . Los minicromosomas resultantes pueden utilizarse para suministrar células especificas de interés utilizando cualquier método conocido o métodos para transferir ácidos nucleicos heterólogos en las células, particularmente en células de plantas, y/o métodos descritos en la presente. Así, el neo-minicromosoma se mantiene establemente en células, replica autónomamente, y permite la persistencia, expresión a largo tiempo de genes bajo condiciones de cultivo no selectivas, y en una planta regenerada, intacta, entera. También puede contener megabases de ADN conocido heterólogo que puede servir como sitios objetivo para recombinación e integración homologa del ADN de interés . El neo-minicromosoma es, asi, un vector para el suministro y expresión de ácidos nucleicos en células . Las lineas celulares que contienen cromosomas artificiales, tales como el minicromosoma, el neo-cromosoma, y los cromosomas artificiales heterocromáticos , son una fuente conveniente de estos cromosomas y pueden manipularse, tal como por una fusión celular o producción de microcélulas por fusión con líneas celulares seleccionadas, para suministrar el cromosoma de interés en una multiplicidad de líneas celulares, incluyendo células a partir de una variedad de diferentes especies de plantas. b. Cromosomas artificiales predominantemente heterocromaticos y que contienen heterocromatina La manipulación de las células que contienen un fragmento liberado en el fraccionamiento del cromosoma dicéntrico (por ejemplo, un cromosoma anteriormente dicéntrico) , por ejemplo, introduciendo ácidos nucleicos heterólogos adicionales, incluyendo, por ejemplo, ADN que codifica un segundo marcador seleccionable y crecimiento bajo condiciones selectivas, puede producir estructuras heterocromáticas . Incluidas entre tales estructuras son composiciones referidas como cromosomas en chorizo y megacromosomas . Por ejemplo, un cromosoma anteriormente dicéntrico puede translocar al extremo de otro cromosoma, tal como un cromosoma acrocéntrico . Ácidos nucleicos heterólogos adicionales agregados a las células que contienen un cromosoma anteriormente dicéntrico pueden integrarse en la heterocromatina pericéntrica del cromosoma anteriormente dicéntrico y amplificarse varias veces con megabases de secuencias de ADN satélites heterocromáticas pericéntricas que forman un cromosoma "en chorizo" que transporta un brazo de cromosoma heterocromático nuevamente formado. El tamaño de este brazo heterocromático puede variar, por ejemplo entre -150 y ~800 Mb en metafases individuales. El brazo de cromosoma puede contener cuatro a cinco segmentos de satélites ricos en ADN satélite, y secuencias de ADN "extrañas" heterólogas integradas uniformemente espaciadas. En el final del brazo heterocromático compacto del cromosoma en chorizo, un segmento terminal eucromático menos condensado puede observarse . Al detener un segmento de terminal eucromática, este brazo de cromosoma nuevo se estabiliza en la forma del cromosoma "en chorizo" . En los subclones de las líneas celulares que contienen cromosoma en chorizo, el brazo heterocromático del cromosoma en chorizo puede llegar a ser inestable y muestra crecimiento intracromosomal continuo, particularmente después del tratamiento con BrdU y/o selección de fármaco para inducir además amplificación del tipo H. En casos extremos, el brazo de cromosoma amplificado puede exceder 500 Mb o aún 1000 Mb en tamaño (gigacromosoma) . Así, el gigacromosoma es una estructura en la cual un brazo heterocromático se ha amplificado pero no separado de un brazo eucromático. La hibridación in situ con, por ejemplo subfragmentos etiquetados de biotina de los ácidos nucleicos heterólogos agregados puede mostrar una señal de hibridación únicamente en el brazo heterocromático del cromosoma en chorizo, indicando que las secuencias de ácido nucleico heterólogas se ubican en la heterocromatina pericéntrica. La expresión de gen, sin embargo, puede ser posible en el ambiente heterocromático de un cromosoma en chorizo. El nivel de la expresión de gen heteróloga puede determinarse por hibridación Northern con un subfragmento del gen marcador seleccionable . Los genes reporteros incluidos en ácidos nucleicos heterólogos proporcionan también un producto fácilmente detectable para usarse en evaluar la expresión genética en un cromosoma en chorizo, u otros heterocromáticos o predominantemente heterocromáticos . La hibridación Souther del ADN aislado a partir de los subclones de células que contienen cromosoma en chorizo con subfragmentos de los genes reporteros (y marcador seleccionable) pueden mostrar una correlación cercana entre la intensidad de la hibridación y la longitud del cromosoma en chorizo. Las líneas celulares que contienen cromosomas en chorizo pueden manipularse para producir estructuras heterocromáticas adicionales y cromosomas artificiales, incluyendo, por ejemplo, un cromosoma artificial referido como un megacromosoma . Tal manipulación incluye fusión de la linea celular con otras células y crecimiento en la presencia de uno o más agentes de selección y/o BrdU. Las células con estructura, tales como el cromosoma en chorizo, puede seleccionarse y combinarse con una segunda línea celular, incluyendo otras especies de plantas y no plantas [véase por ejemplo, Dudits et al. (1976) Heriditas 52:121-123 por la fusión de células humanas con protoplastos de zanahoria y Wiegand et al. (1987) J. Cell. Sci . (Pt. 2^:145-149 para la fusión inducida por láser de protoplastos de plantas con células de mamífero] para eliminar otros cromosomas que no son de interés . Las estructuras tales como cromosomas en chorizo formadas durante este proceso pueden manipularse además, por ejemplo, tratando las células con agentes que desestabilizan los cromosomas, por ejemplo, BrdU, de manera que el brazo heterocromático forma un cromosoma que es sustancialmente heterocromático (por ejemplo, un megacromosoma) . Las estructuras tales como el gigacromosoma en donde el brazo heterocromático se ha amplificado pero no separado del brazo eucromático, puede también observarse. La manipulación adicional, tal como fusiones y crecimiento en condiciones selectivas y/o tratamiento con BrdU u otro de tal tratamiento, puede conducir a fragmentación del megacromosoma para formar cromosomas más pequeños que tienen el amplicón como la unidad de repetición básica. Si una célula con un cromosoma en chorizo se selecciona, ésta puede tratarse con un agente, tal como BrdU, que desestabiliza el cromosoma de manera que el brazo heterocromático forma un cromosoma que es sustancialmente heterocromático (por ejemplo, un megacromosoma). Antes de tratar la célula con BrdU, ésta puede fundirse con otra linea celular que transporta cromosomas de otra especie, para eliminar cromosomas de la célula huésped original y obtener una célula en donde el único cromosoma de la célula huésped es el cromosoma en chorizo. Las células híbridas resultantes pueden cultivarse en la presencia de agentes de selección múltiples para seleccionarse por aquellos que transportan el cromosoma en chorizo. La hibridación in situ con cromosoma que pinta sondas que detectan cromosomas tanto de especies celulares huésped como las especies de la célula a las cuales la célula huésped se combina pueden proporciona una indicación de la estructura cromosomal de las células híbridas . Las líneas celulares que contienen un cromosoma en chorizo pueden tratarse con un agente de desestabilización, tales como BrdU, seguido por el crecimiento en el medio selectivo y re-tratamiento con BrdU. Los tratamientos con BrdU aparecen para desestabilizar el genoma, resultando en un cambio en el cromosoma de chorizo también. Una población celular en donde una amplificación adicional ha ocurrido se originará. Además del brazo heterocromático (que puede, por ejemplo, ser ~100-150 Mb) del cromosoma en chorizo, un centrómero extra y otro (por ejemplo, ~150-250 Mb) brazo de cromosoma heterocromático puede formarse. Por la adquisición de otro segmento terminal eucromático, un nuevo cromosoma submetacéntrico (por ejemplo, megacromosoma) puede formarse. Los megacromosomas pueden también producirse a través del crecimiento nuevo y establecimiento de células que contienen cromosoma en chorizo en un medio selectivo. El tratamiento BrdU repetido puede producir líneas celulares que tienen un megacroraosoma enano (por ejemplo, aproximadamente 150-200 Mb) , un megacromosoma truncado (por ejemplo, aproximadamente 90-120 Mb) , o un miero-megacromosoma (por ejemplo, aproximadamente 50-90 Mb) . Las lineas celulares que contienen megacromosomas truncados más pequeños pueden utilizarse para generar megacromosomas aún más pequeños, por ejemplo, ~10-30 Mb en tamaño. Esto puede lograrse, por ejemplo, por fraccionamiento y fragmentación de un micro-megacromosoma a través de la exposición de células a irradiación de rayos X, BrdU o fragmentación de cromosoma in vivo dirigido a telómero. Aparte de los segmentos eucromáticos terminales y el ácido nucleico extraño integrado, el megacromosoma entero, así como otros tipos relacionados de cromosomas artificiales predominantemente heterocromáticos , es heterocromatina constitutiva. Esto puede demostrarse por agrupamiento C del megacromosoma, que resulta en característica de tinción positiva de heterocromatina constitutiva. Esto puede contener disposiciones tándem de ADN satélite. En un ejemplo particular, los bloques de ADN satélite se organizan en un palíndromo gigante (amplicón) que transportan secuencias de ácido nucleico exógeno integrado en cada extremo. Es por supuesto entendido que la organización específica y tamaño de cada componente pueden variar entre especies, y también el cromosoma en donde el acontecimiento de amplificación inicia.

En general , una segmentación clara puede observarse en uno o más brazos de un cromosoma basado en amplificación. Por ejemplo, un megacromosoma puede contener unidades de construcción que son amplicones de, por ejemplo, ~30 Mb que contienen ADN satélite con las secuencias de ADN "extrañas" integradas en ambos extremos. Los amplicones ~30 Mb pueden componerse de dos dobletes invertidos de ~15 Mb de bloques de ADN satélites de ~7.5 Mb, que se separan entre sí por una banda estrecha de secuencias no satélites. Las regiones no satélites más anchas en los bordes amplicón pueden contener ácido nucleico (heterólogo) exógeno, integrado, mientras que cualesquiera bandas anchas de secuencias de ADN no satélite dentro de los amplicones pueden ser partes integrales de la heterocromatina pericéntrica de los cromosomas huésped. Los tamaños de las unidades de construcción de un megacromosoma u otro cromosoma basado en amplificación pueden variar dependiendo de las especies del cromosoma huésped a partir del cual el cromosoma artificial se generó. El tratamiento de BrdU adicional puede producir célula y/o callo que incluye células con un megacromosoma truncado . El megacromosoma puede fragmentarse adicionalmente in vivo utilizando un vector de fragmentación de cromosoma o finalmente producir un cromosoma que comprende una unidad replicable más pequeña, por ejemplo, aproximadamente 15 Mb-60 Mb, conteniendo uno a cuatro megareplicones .

Aparte de los segmentos terminales eucromaticos, el megacromosoma entero es heterocromático, y tiene homogeneidad estructural. Por lo tanto, los cromosomas artificiales tales como el megacromosoma ofrecen una única posibilidad para obtener información acerca del proceso de amplificación, y para analizar algunas características básica de la heterocromatina constitutiva pericéntrica, como un vector para el ADN heterólogo, y como un objetivo para fragmentación adicional . C. Aislamiento de Cromosomas Artificiales Los cromosomas artificiales proporcionados en la presente pueden aislarse por cualquier método adecuado conocido por aquellos expertos en la técnica. También, los métodos se proporcionan en la presente para efectuar purificación sustancial, particularmente de los cromosomas artificiales . Los cromosomas artificiales pueden clasificarse a partir de cromosomas endógenos utilizando cualesquiera procedimientos adecuados, y normalmente implican aislar cromosomas de metafase, diferenciar los cromosomas artificiales a partir de los cromosomas endógenos, y separar los cromosomas artificiales a partir de los cromosomas endógenos . Tales procedimientos generalmente incluirán las siguientes etapas básicas para células animales y protoplastos : (1) cultivo de un número suficiente de células (de manera normal aproximadamente 2 x 107 células mitóticas) para producir, preferiblemente en el orden de 1 x 106 cromosomas artificiales, (2) detención del ciclo celular de las células en una etapa de mitosis, preferiblemente metafase, utilizando un agente de detención mitótico tal como colquicina, (3) tratamiento de las células, particularmente por disolución de pared celular para células de plantas y/o hinchazón de las células en regulador hipotónico para incrementar la susceptibilidad de las células a la interrupción, (4) aplicación de fuerza física para interrumpir las células en la presencia de reguladores de ¦ aislamiento para la estabilización de los cromosomas liberados, (5) dispersión de cromosomas en la presencia de reguladores de aislamiento para estabilización de cromosomas! libres, (6) separación de cromosomas artificiales a partir de cromosomas endógenos y (7) almacenar (y enviar si se desea) de los cromosomas artificiales aislados en reguladores apropiados. Las modificaciones y variaciones del procedimiento general para aislamiento de cromosomas artificiales, por ejemplo, para acomodar diferentes tipos celulares con características y requerimientos de crecimiento diferentes y para optimizar la duración del bloque mitótico con agentes de detención para obtener el balance deseado de la producción de cromosoma y nivel de los restos, puede empíricamente determinarse (véase Ejemplos) .

Las etapas 1-5 se relacionan al aislamiento de cromosomas de metafase. La separación de artificialidad a partir de cromosomas endógenos (etapa 6) puede lograrse en una variedad de formas. Por ejemplo, los cromosomas pueden teñirse con tintes específicos de ADN tales como Hoechst 33258 y cromomicina A3 y clasificarse en cromosomas artificiales y cromosomas endógenos en la base del contenido de tinte empleando una clasificación de célula activada fluorescente (FACS) . Los cromosomas artificiales se han aislado por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) . Este método toma ventaja del contenido de base nucleótido de los cromosomas artificiales. En el caso de cromosomas artificiales predominantemente heterocromáticos, por virtud de su alto contenido de ADN heterocromático, estos diferirán a partir de cualesquiera otros cromosomas en una célula. En una modalidad particular, los cromosomas de metafase se aislan y tiñen con tintes de base específicos, tales como Hoechst 33258 y cromomicina A3. La clasificación celular activada por fluorescencia separará los cromosomas artificiales a partir de los cromosomas endógenos. Un clasificador celular de láser dual (tal como, por ejemplo, un FACS Vantage Becton Dickinson Immunocytometry Systems) en donde dos láseres se establecen para excitar los tintes separadamente, permitiendo un análisis bivariable de los cromosomas por la composición de pares de bases y tamaño. Las células que contienen tales cromosomas artificiales pueden clasificarse similármente . Las cantidades preparativas de cromosomas artificiales (por ejemplo, 5 x 104- 5 x 107 cromosomas/ml) en una pureza de 95% o más elevada pueden obtenerse. Los cromosomas artificiales resultantes se utilizan para suministrarse a células por métodos tales como, por ejemplo, microinyección, transferencia mediada por liposoma y electroporación. Métodos adicionales proporcionados en la presente para aislamiento de cromosomas artificiales a partir de cromosomas endógenos incluyen procedimientos que están particularmente bien adaptados para aislamiento a gran escala de cromosomas artificiales. En estos métodos, las diferencias de tamaño y densidad entre cromosomas artificiales y cromosomas endógenos se explotan para efectuar la separación de estos dos tipos de cromosomas. Para facilitar el aislamiento a gran escala de los cromosomas artificiales, diferentes técnicas de separación pueden emplearse tales como centrifugación de posición de balanceo (para efectuar la separación basada en el tamaño y densidad del cromosoma) [véase por ejemplo, Mendelsohn et al . (1968) J. Mol. Biol . 32 : 101-108] centrifugación de rotor de zona (para efecto de separación en la base del tamaño y densidad del cromosoma) [véase por ejemplo Burky et al . (1973) Prep. Biochem. 3:157-182; Stubblefield et al . (1978) Biochem. Biophys . Res. Commun. 83:1404-1414, y velocidad de sedimentación (para efectuar la separación en la base del tamaño y forma del cromosoma) [véase por ejemplo, Collard et al . (1984) Cytometry 5:9-19] . Los métodos basados en afinidad, particularmente inmunoafinidad, para la separación de los AC a partir de cromosomas endógenos se proporcionan también en la presente . Por ejemplo, los cromosomas artificiales que son predominantemente heterocromatina pueden separarse a partir de cromosomas endógenos a través de procedimientos de inmunoafinidad que implican anticuerpos que específicamente reconocen heterocromatina, y/o las proteínas asociadas en la misma,' cuando los cromosomas endógenos contienen relativamente poca heterocromatina. La purificación de inmunoafinidad puede también emplearse en procedimientos de aislamiento de cromosomas artificiales a gran escala. En este proceso, las poblaciones grandes de células que contienen cromosoma artificiales (asincronos o mitóticamente enriquecidos) se cosechan en masa y los cromosomas mitóticos (que pueden liberarse de las células que utilizan procedimientos estándares tales como por la incubación de las células, tales como protoplastos recientemente aislados, en regulador hipotónico y/o tratamiento de detergente de las células junto con interrupción física de las células tratadas) se enriquece por la unión de anticuerpos que se unen a matrices en estado sólido (por ejemplo, resinas en columna o cuentas magnéticas) . Los anticuerpos adecuados para utilizarse en , este procedimiento se unen a proteínas centroméricas condensadas o condensadas y proteínas de histona unidas a ADN. Por ejemplo, el auto-anticuerpo LU851 (véase Hadlackzy et al . (1989) Chromosoma 97:282-288) , que reconoce los centrómeros de mamífero, pueden utilizarse para aislamiento a gran escala de cromosomas anteriores a separación subsecuente de cromosomas artificiales a partir de los cromosomas endógenos utilizando métodos tales como FACS. Los cromosomas de unión se lavarían y eventualmente extraerían a partir de la clasificación. La purificación de inmunoafinidad puede también utilizarse directamente para separar cromosomas artificiales a partir de cromosomas endógenos. Por ejemplo, en el caso de cromosomas artificiales que son predominantemente heterocromáticos, los cromosomas artificiales pueden generarse en, o transferirse a (por ejemplo, microinyección o fusión microcelular como se describe en la presente) una línea celular que tiene cromosomas que contienen cantidades relativamente pequeñas de heterocromatina, tales como células de hámster (por ejemplo, células V79 o células CHO-K1) . Los cromosomas predominantemente heterocromáticos se separan entonces a partir de los cromosomas endógenos utilizando anticuerpo de proteína de unión anti-heterocromatina (Drosoph.ila HP-1) conjugado a una matriz sólida. Tal matriz preferiblemente une los cromosomas artificiales en relación con cromosomas de hámster. Los cromosomas de hámster no unidos se lavan fuera de la matriz y los cromosomas artificiales se extraen por técnicas estándares. Similarmente, los cromosomas artificiales de una especie, por ejemplo, un cromosoma artificial derivado de planta, pueden separarse a partir de un antecedente de cromosomas endógenos de otra especie, por ejemplo, cromosomas de animal, tal como mamífero, basados en diferencias inmunológicas de las dos especies, a fin de que los anticuerpos que reconocen específicamente una especie no la otra están disponibles o pueden generarse . D. Generación de Cromosomas Artificiales a Través del Ensamble de Elementos Componentes Los cromosomas artificiales pueden construirse in vitro ensamblando los elementos estructurales y funcionales que contribuyen a un cromosoma completo capaz de replicación estable y segregación al lado del cromosoma endógeno en células. La identificación de los elementos discretos que en combinación producen un cromosoma funcional ha hecho posible el ensamble in vitro de cromosomas artificiales. El proceso del ensamble in vitro de los cromosomas artificiales, que pueden controlarse rígidamente, proporciona ventajas que pueden desearse en la generación de cromosomas que, por ejemplo, se requieren en grandes cantidades o que se pretenden para uso específico en sistemas de organismo transgénico . Por ejemplo, el ensamble in vitro puede ser ventajoso cuando la eficiencia de tiempo y escala son consideraciones importantes en la preparación de cromosomas artificiales. Debido a que los métodos de ensamble in vitro no implican procedimientos de cultivo celular extensivo, pueden utilizarse cuando el tiempo y labor requeridos para células transformadas para alimento, cultivadas y cosechadas utilizadas en sistemas de producción basado en célula de novo no está disponible. Proporcionados en la presente son métodos de ensamble in vitro que incluyen la unión de componentes esenciales, tales como un centrómero, telómero y un origen de replicación, para producir un cromosoma artificial, en particular, un cromosoma artificial que funciona en plantas y que puede contener componentes derivados de cromosomas de plantas. También proporcionados son cromosomas artificiales producidos por los métodos. Las modalidades particulares de los métodos y cromosomas incluyen un megareplicador . El megareplicador puede contener ADNr, por ejemplo, ADNr de mamífero o planta. Los cromosomas artificiales ensamblados in vi tro pueden contener cualquier cantidad de ácido nucleico heterocromático y/o eucromático. Por ejemplo, un cromosoma artificial ensamblado in vi tro puede ser sustancialmente todo heterocromatina, conteniendo mientras el ADN que codifica la proteína, o puede contener cantidades incrementadas de ADN eucromático, tal como por ejemplo, éste contiene aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de aproximadamente 90% de ADN eucromático. El ensamble in vi tro puede también ser rigurosamente controlado con respecto a la manera exacta en donde los diversos elementos del cromosoma artificial deseado se combinan y en donde la secuencia y proporciones se ensamblan para producir un cromosoma de especificaciones precisas. Esta característica es de particular significado en la generación de cromosomas artificiales de planta que contienen una o más regiones de segmentación como se describe en la presente con referencia a los cromosomas artificiales basados en la amplificación. Por ejemplo, ciertas estructuras de cromosoma de planta (tales como cromosomas acrocéntricos y/o cromosomas que contienen regiones adyacentes de heterocromatina y ADNr) que pueden ser deseables para usarse en la generación de tipos particulares de cromosomas artificiales de planta a través de los métodos basados en la amplificación como se describe en la presente pueden limitarse en número o pueden no existir. Estos tipos particulares de cromosomas artificiales de planta, por ejemplo, ciertos cromosomas artificiales de planta predominantemente heterocromática, puede también generarse a través de ensamble in vitro de cromosomas artificiales como se describe en la presente. Por ejemplo, los cromosomas artificiales de planta que contienen regiones de unidades de ácido nucleico repetidas que son predominantemente heterocromáticas pueden ensamblarse uniendo componentes cromosomales esenciales y regiones de repetición, o pueden generarse a partir de un cromosoma artificial ensamblado in vitro a través de amplificación de ADN heterocromático contenido dentro de un cromosoma artificial ensamblado in vitro. Para la generación de tales cromosomas a través de la amplificación de ADN heterocromático contenido dentro de un cromosoma artificial ensamblado in vitro, los ácidos nucleicos se introducen en una célula que contiene un cromosoma artificial ensamblado in vitro y una célula resultante se selecciona que contiene un cromosoma artificial que contiene una o más regiones de unidades de ácido nucleico repetidas que son predominantemente heterocromáticas. El cromosoma artificial ensamblado in vitro contiene ya sea un megareplicador para facilitar la amplificación de ADN cromosomal junto con la integración de ácido nucleico en el cromosoma o megareplicador que contiene el ADN se incluye en el ácido nucleico que se integra en el cromosoma artificial ensamblado in vi tro . Lo siguiente describe el proceso implicado en el ensamble de cromosomas artificiales in vi tro, utilizando un megacromosoma como material de partida ejemplar. 1. Identificación y aislamiento de los componentes del cromosoma artificial Los cromosomas proporcionados en la presente son cromosomas espléndidamente simples, para usarse en la identificación y aislamiento de componentes para utilizarse en ensamble in vitro de sistemas de expresión de cromosomas artificiales. La capacidad para purificar cromosomas artificiales a un nivel muy elevado de pureza, como se describe en la presente, facilita su uso para estos propósitos. Por ejemplo, el megacromosoma, particularmente formas truncadas del mismo, sirven como materiales de partida. Con respecto a la construcción de un cromosoma artificial que contiene al menos algunos componentes derivados de la célula de mamífero, posibles materiales de partida pueden obtenerse a partir de, por ejemplo, líneas celulares tales como 1B3 y m 2Cl, que se derivan de H1D3 (depositadas en European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) bajo el No. de Acceso 96040929) . Con respecto a la construcción de un cromosoma artificial que contiene al menos algunos componentes derivados de la célula de plantas, los posibles materiales de partida incluyen células que contienen los PAC, por ejemplo, megacromosomas , generados como se describe en la presente. Por ejemplo, la línea celular mM2Cl contiene un micro-megacromosorna (~50-60 kB) , que contiene ventajosamente únicamente un centrómero, dos regiones de ADN heterólogo integrado con secuencias de ADNr adyacentes, con el resto del ADN cromosomal que es ADN satélite mayor de ratón. Otros megacrosomas truncados pueden servir como una fuente de telomeros, o pueden proporcionarse telomeros. El centrómero de la línea celular mM2Cl contiene ADN satélite menor de ratón, que proporciona una etiqueta útil para el aislamiento del ADN centromérico . Las características adicionales de los AC particular proporcionadas en la presente, tales como micro-megacromosoma de la línea celular mM2Cl, que los hace únicamente adecuados para servir como materiales de partida en el aislamiento e identificación de componentes cromosomales incluyen el hecho que los centrómeros de cada megacromosoma dentro de una línea celular específica única son idénticas. La capacidad para iniciar con una fuente de centrómero homogénea (tan opuesta a una mezcla de cromosomas diferentes que tiene secuencias centroméricas diferentes) facilita en gran medida la clonación del ADN centrómero. Al digerir los megacromosomas purificados, particularmente megacromosomas truncados, tales como el micro-megacromosoma, con endonucleasas de restricción apropiadas y clonando los fragmentos en los "vectores YAC corriereialmente disponibles y bien conocidos (véase, por ej emplo , Burke et al. , (1987) Science 236:806-812), vectores BAC (véase, por ejemplo, Shizuya et al (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89: 8794-8797 cromosomas artificiales bacteriales que tienen una capacidad para incorporar 0.9-1 Mb de ADN) o vectores PAC (el vector de cromosoma artificial Pl que es un derivado de plásmido Pl que tiene una capacidad para incorporar 300 kb de ADN y que se suministra a las células huésped E. coli por electroporación en lugar de por empaquetado bacteriófago; véase por ejemplo, loannou et al . (1994) Nature Genetics 6 : 84-89; Pierce et al . (1992) Meth. Enzymol . 216:549-574; Pierce et al . (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89:2056-2060; Patente Norteamericana No. 5,300,431 y la solicitud Internacional PCT No. WO 92/14819) , es posible para tan poco como 50 clones para representar el micro-megacromosoma entero. a. Centrómeros Un centrómero ejemplar para uso en la construcción de un cromosoma artificial es aquel contenido dentro de un megacromosoma, tal como aquellos descritos en la presente. Un ejemplo de una línea celular que contiene megacromosoma particular se proporciona, por ejemplo, H1D3 y derivado del mismo, tal como células mM2Cl. El megacromosoma se aisla a partir de tales líneas celulares que utilizan por ejemplo, los procedimientos descritos en la presente, y la secuencia centromérica se extrae a partir de los megacromosomas aislados. Por ejemplo, los megacromosomas pueden separarse en fragmentos utilizando endonucleasas de restricción seleccionadas que reconocen y cortan en sitios que, por ejemplo, están principalmente ubicados en los sitios de integración de ADN heterólogos y de replicación en el ADN satélite. Basados en los tamaños de los fragmentos resultantes, ciertos elementos indeseados pueden separarse a partir de las secuencias que contienen centrómero. El ADN que contiene centrómero podría ser tan grande como 1 Mb. Las sondas que especialmente reconocen secuencias centroméricas , tales como sondas basadas en ADN satélite menor de ratón [véase, por ejemplo. Wong et al . (1988) Nucí . Acids Res. 16: 11645-11661], sonda pCT4.2 , un fragmento de 3.5 kb de ADNr 5S Arabidopsis (Campbell et al. (1992) Gene 112:225-228), E4.11 cósmidos Arabidopsis (30 kb) y E4.6 (33 kb, Bent et al. (1994) Science 265:1856-1860; y secuencia de repetición de 180 pb pALl (Maluzynska et al. (1991) Plant. J. 1:159-166; y Martínez-Zapater et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 204.-417-423) puede utilizarse para aislar un clon YAC, BAC o PAG que contiene centrómero, derivado del megacromosoma.

Alternativamente, o junto con la identificación directa de ADN megacromosomal que contiene centrómero, sondas que reconocen específicamente los elementos no centroméricos , tales como sondas específicas para el ADN satélite mayor de ratón, el ADN satélite de planta, el ADN heterólogo y/o ADNr, pueden utilizarse para identificar y eliminar los clones que contienen ADN no centromérico . Adicionalmente, los métodos que clonan centrómero descritos en la presente pueden utilizarse para aislar la secuencia que contiene centrómero del megacromosoma . Una vez que el fragmento de centrómeros se ha aislado, puede secuenciarse y la información de secuencia puede a su vez utilizarse en amplificación PCR de secuencias de centrómero a partir de megacromosomas u otras fuentes de centrómeros. Los centrómeros aislados pueden también probarse por la función in vivo transfiriendo el ADN en una célula huésped. El análisis funcional puede incluir, por ejemplo, examinar la capacidad de la secuencia del centrómero para unir las proteínas de unión del centrómero. El centrómero clonado se transferirá a células con un gen marcador seleccionable y la unión de una proteína específica de centrómero, tal como anticuerpos anti-centrómero (por ejemplo, LU851, véase, Hadlaczky et al . (1'986) Exp. Cell Res. 167 : 1-15) pueden utilizarse para evaluar la función de los centrómeros. b. Telómeros Los telómeros que pueden utilizarse en ensamblar un cromosoma artificial incluyen un telómero sintético 1 kB (véase por ejemplo, Publicación de Solicitud PCT No. WO 97/40183) . Una construcción de telómero sintética doble, la cual contiene 1 telómero sintético kB enlazado a un gen marcador seleccionable dominante que continúa en una orientación invertida puede utilizarse para facilidad de manipulación. Tal construcción doble contiene una serie de repeticiones TTAGGG 3' del gen marcador y una serie de repeticiones de la secuencia invertida, es decir, GGGATT, 5' del gen marcador como sigue. (GGGATT) n gen marcador dominante (TTAGGG) n. El utilizar un marcador invertido proporciona un medio fácil para la inserción, tal como por despuntado y ligación, ya que únicamente serán seleccionados fragmentos orientados propiamente . Las secuencias de telómero también incluyen secuencias descritas en las plantas, por ejemplo, una secuencia Arabidopsis que contiene disposiciones de cabeza a rabo de la repetición de monómero CCCTAAA totalizando un poco, por ejemplo 3-4 kb, de longitud. Las secuencias de telómero varía en longitud y no parecen tener un requerimiento de longitud estricto. Un ejemplo de un telómero clonado se encuentra en GenBank no. de acceso M20158 (Richards and Ausubel (1988) Cell 53:127-136) y en la Patente Norteamericana No. 5,270,201. Las secuencias de telómero de levadura incluyen aquellas proporcionadas en GenBank no. de acceso S70807 (Louis et al. (1994) Yeast 10:271-274) . Adicionalmente, un método para aislar un telómero eucariótico más elevado a partir de A. thaliana se ha reportado (Richards and Ausubel (1988) Cell 53:127-136; y Patente Norteamericana No. 5,270,201) . c. Megareplicador Las secuencias del megareplicador, tales como aquellas que contienen ADNr, proporcionadas en la presente se prefieren para usarse en cromosomas artificiales generados por el ensamble de elementos componentes in vi tro. El ADNr proporciona un origen de replicación y también proporciona secuencias que facilitan la amplificación del cromosoma artificial in vivo para incrementar el tamaño del cromosoma a, por ejemplo, acomodar las copias incrementadas de un gen heterólogo de interés así como niveles elevados continuos de expresión de los genes heterologos. d. Heterocromatina rellena La heterocromatina rellena, particularmente ADN satélite, se incluye para mantener la integridad y estabilidad estructural del cromosoma artificial y proporcionar una base estructural para transportar genes dentro del cromosoma. El ADN satélite es normalmente la secuencia de ADN rica en A/T, tal como ADN satélite mayor de ratón, o secuencia de ADN rica en G/C, tal como ADN satélite natural de hámster. Las fuentes de tal ADN incluyen cualesquiera organismos eucarióticos que transportan ADN satélite sin código con suficiente composición A/T o G/C para promover la separación fácil por secuencia, tal como por FACS, o por gradientes de densidad.' Ejemplos de ADN satélite de planta incluyen, pero no se limitan a, ADN satélite de soya (véase, por ejemplo, Morgante et al. (1997) Chromosome Res. 5:363-373; y Vahedian et al. (1995) Plant Mol. Biol. 25:857-862), ADN satélite en el cromosoma B de centeno (véase, por ejemplo, Langdon et al. (2000) Genetics 154:869-884) y ADN satélite en el complejo Saccharum (véase, por ejemplo, Alix et al. (1998) Genome 42:854-864) . El ADN satélite puede también sintetizarse generando secuencia que contiene repeticiones de tándem monótonas de unidades de ADN ricas en A/T o G/C. La cantidad más adecuada de heterocromatina rellena para usarse en la construcción del cromosoma artificial puede empíricamente determinarse por, por ejemplo, incluyendo segmentos de varias longitudes, incrementado en tamaño, en el proceso de construcción. Los fragmentos que son tan pequeños para ser adecuados para usarse no se proporcionarán para un cromosoma funcional , el cual puede evaluarse en estudios de expresión basados en célula, o resultarán en un cromosoma de tiempo de vida funcional limitado o estabilidad estructural o mitótica . e. Marcador seleccionable Cualquier marcador seleccionado conveniente incluyendo ejemplos específicos descritos en la presente, puede utilizarse y en cualquier lugar conveniente en el sistema de expresión. 2. Combinación de los elementos cromosomales aislados Una vez que se obtienen los elementos aislados, pueden combinarse para generar el sistema de expresión de cromosoma artificial funcional completo. Este ensamble puede lograrse por ejemplo, por ligación in vi tro ya sea en solución, LMP agarosa o en microperlas. La ligación se conduce de manera que un extremo del centromero se une directamente a un telómero. El otro extremo del centrómero, el cual sirve como el brazo de cromosoma que transporta el gen, se construye a partir de una combinación de ADN satélite y secuencias de megareplicador, por ejemplo, secuencia de ADNr y puede también contener un gen marcador seleccionable. Otro telómero se une al extremo del brazo de cromosoma que transporta el gen. El brazo que transporta el gen es el sitio en el cual cualesquiera genes heterólogos de interés, por ejemplo, en expresión de proteínas deseadas codificadas por lo que, se incorporan ya sea durante ensamble in vivo del cromosoma o algunas veces después. 3. Análisis y prueba de los sistemas de expresión de cromosoma artificial Los cromosomas artificiales ensamblados in vitro pueden probarse por la funcionalidad en sistemas celulares, tales como células de plantas y animales, utilizando cualquiera de los métodos descritos en la presente por los cromosomas artificiales, minicromosomas , o conocidos por aquellos expertos en la técnica. 4. Introducción de ADN heterólogo deseado en el cromosoma ensamblado in vitro El ADN heterólogo puede introducirse en el cromosoma sintetizado in vitro utilizando métodos de rutina de biología molecular, puede introducirse utilizando los métodos descritos en la presente para cromosomas artificiales, o pueden incorporarse en el cromosoma ensamblado in vitro como parte de uno de los elementos sintéticos, tales como la heterocromatina . El ADN heterólogo puede enlazarse a un fragmento de repetición seleccionado, y luego la construcción resultante puede amplificarse in vitro utilizando los métodos para tal amplificación in vitro proporcionada en la presente. En una modalidad particular de estos métodos de ensamble in vitro, un sitio de recombinación sitio-específico se incluye en el ADN de ensamble o se agrega en el cromosoma ensamblado, tal como un cromosoma artificial de ensamble in vitro de planta, después de iniciar el ensamble. La presencia de un sitio de recombinación en el cromosoma artificial ensamblado in vitro facilita la introducción catalizada de recombinasa del fácido nucleico heterólogo en el cromosoma si el ácido nucleico heterólogo también contiene un sitio de recombinación complementario. Tales sistemas de recombinación incluyen, pero no se limitan a, Cre/lox [véase, por ejemplo, Dale and Ow (1995) Gene 91:79-85], FLP/F.RT [véase por ejemplo, Nigel et al. (1995) The Plant Journal 8:637-652], R/RS [véase, por ejemplo, Onouchi et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19: 6373-6378] , Gin/gix [véase, por ejemplo, aeser and Kahman (1991) mol. Gen. Genet. 230:170-176] e int/att. La introducción de sitios de recombinación att en un cromosoma y el uso de integrasa-recombinasa de fago lambda junto con la misma para permitir el diseño de cromosomas naturales y artificiales se describe en la solicitud provisional Norteamericana copendiente No. de Serie 60/294,758, para Perkins et al, intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFOR S" presentado el 30 de mayo del 2001, la solicitud provisional Norteamericana No. de Serie 60/366,891, para Perkins et al. intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFORMS" presentado el 21 de marzo del 2002, solicitud de patente Norteamericana No. de Serie 10/161,403, para Perkins et al intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFORMS" presentada el 30 de mayo del 2002, y Solicitud Internacional PCT No. PCT/US02/17452 , para Perkins et al., intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFORMS" presentada el 30 de mayo del 2002) , cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad para referencia a la misma. Así, también contemplados en la presente son los cromosomas artificiales ensamblados in vi tro, en particular tales cromosomas que contienen componentes derivados de cromosoma de planta, que contienen uno o más sitios de recombinación, tal como un sitio att. E. Métodos para la Producción de Cromosomas Acrocéntricos de Planta y Cromosomas de Planta que Contienen Regiones Adyacentes de ADNr y Heterocrornatina Los cromosomas humano y de ratón acrocéntricos en donde el brazo corto contiene únicamente heterocromatina pericéntrica, una disposición de ADNr, y telómeros pueden utilizarse en la formación de novo de un cromosoma artificial basado en ADN satélite (SATAC, también mencionado como ACes) . En algunas modalidades de los métodos para producir un cromosoma artificial de planta proporcionado en la presente, puede ser deseable introducir ácidos nucleicos heterólogos en un cromosoma de planta con brazos de longitud desigual (por ejemplo, el brazo corto de un cromosoma acrocéntrico) y/o que contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina, tal como heterocromatina pericéntrica o ADN satélite. De particular interés en tales métodos son cromosomas acrocéntricos de planta que contienen ADNr ubicados adyacentes en la heterocromatina pericéntrica o ADN satélite, y en particular, en el brazo corto del cromosoma con poco a ningún ADN eucromático entre el ADNr y la heterocromatina pericéntrica. Al utilizar tales estructuras como la composición inicial en la generación de los cromosomas artificiales de planta puede facilitar la generación de cromosomas artificiales de planta que son predominantemente heterocromáticos . Por ejemplo, la introducción de ácido nucleico heterólogo en una célula que contiene tal cromosoma de planta acrocéntrica de manera que el ácido nucleico se integra en la heterocromatina pericéntrica y/o ADNr del brazo corto del cromosoma puede asociarse con amplificación (posiblemente a través de las secuencias de ADN "megareplicadoras" tales como pueden residir en disposiciones de ADNr de planta, también conocida como las regiones de organización nucleolar ( OR) ) de la heterocromatina que conduce a la formación de un cromosoma artificial de planta heterocromática . Los cromosomas de planta acrocéntrica de origen natural se limitan en número, y los cromosomas de planta con una estructura que incluye regiones adyacentes de heterocromatina y ADNr pueden no existir o pueden no existir para una variedad de especies de plantas. Se proporcionan en la presente métodos para generar cromosomas de planta acrocéntricos y cromosomas de planta que contienen regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina, en particular, heterocromatina satélite y/o pericéntrica. Se proporcionan además en la presente método para generar cromosomas de planta acrocéntricos que contienen regiones adyacentes de heterocromatina, tales como heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite, y ADNr en el brazo corto del cromosoma. Se proporcionan también en la presente cromosomas acrocéntricos de planta en donde el ácido nucleico de uno o ambos brazos del cromosoma contienen menos de aproximadamente 50% o menos de aproximadamente 40%, o menos de aproximadamente 30%, o menos de aproximadamente 20%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1%, o menos de aproximadamente 0.5% o menos de aproximadamente 0.1% de eucromatina. En algunas modalidades de estos cromosomas, el ácido nucleico de únicamente un brazo, ya sea el brazo corto o el brazo largo, contiene menos de estas cantidades específicas de eucromatina. En una modalidad particular de estos cromosomas, el ácido nucleico del brazo corto contiene menos de estas cantidades específicas de eucromatina. Se proporcionan además en la presente cromosomas de planta que contienen regiones adyacentes de heterocromatina, en particular heterocromatina o ADN satélite pericéntrica, y ADNr con poca o ninguna eucromatina entre las dos regiones. Con referencia a tales cromosomas de planta, "poca o ninguna" significa que la cantidad de ADN eucromático, si lo hay, ubicado entre el ADNr y la heterocromatina (tal como heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite) , generalmente no se tiñe difusa y reconociblemente como la eucromatina y/o no contiene genes que codifican la proteína. Así, en estos cromosomas, entre la heteroromatina (tal como heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite) y el ADNr, no existe sustancialmente ninguna cromatina que sea menos condensada que la heterocromatina (por ejemplo, heterocromatina pericéntrica) . Los cromosomas de planta que contienen regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina (tales como heterocromatina pericéntrica) proporcionados en la presente pueden ser cromosomas acrocéntricos . En una modalidad particular de estos cromosomas de planta, las regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina, en particular heterocromatina pericéntrica, se contienen en el brazo corto de1 crornosorna . Se proporcionan además métodos para utilizar tales cromosomas de planta en la generación de cromosomas artificiales de planta, y, en particular, cromosomas artificiales de planta predominantemente heterocromáticos, tales como los ACes (también mencionados como los SATAC) . En métodos particulares para producir cromosomas artificiales de planta proporcionados en la presente, los ácidos nucleicos se introducen en una célula que contienen un cromosoma de planta que es acrocéntrica y/o contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina, tales como heterocromatina pericéntrica, las células se cultivan a través de al menos una división celular y una célula que comprende un cromosoma artificial, se selecciona tal como el cromosoma artificial predominantemente heterocromático . En estos métodos, el cromosoma de planta en donde el ácido nucleico se introduce puede ser un cromosoma acrocéntrico que contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina en el brazo corto o largo, y en particular, en el brazo corto. Los cromosomas de planta proporcionados en la presente pueden generarse utilizando recombinación sitio-específica entre las regiones de cromosoma de planta. Las regiones pueden estar en el mismo cromosoma o cromosomas separados. A través de la recombinación sitio-específica, las secciones de cromosomas de planta pueden alterarse para remover, invertir y/o insertar secuencias de manera que resulte un cromosoma de planta deseado. El cromosoma de planta resultante es acrocéntrico y/o contiene regiones adyacentes de ADN y ADNr heterocromático, que puede o no puede estar en el brazo corto de un cromosoma acrocéntrico. Así, el cromosoma de partida en estos métodos puede ser un cromosoma de planta o puede ser un cromosoma acrocéntrico de planta que no contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina tal como heterocromatina pericéntrica o ADN satélite. Si el cromosoma de partida es acrocéntrico, entonces puede utilizarse en la generación de un cromosoma acrocéntrico de planta que contiene regiones adyacentes de ADN eterocromático (por ejemplo, heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite) y ADNr, particularmente en el brazo corto del cromosoma o para generar un cromosoma acrocéntrico de planta en donde el ácido nucleico de uno o ambos brazos contiene menos de aproximadamente 50% o menos de aproximadamente 40%, o menos de aproximadamente 30%, o menos de aproximadamente 20%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1%, o menos de aproximadamente 0.5% o menos de aproximadamente 0.1% de eucromatina. En uno de los métodos proporcionados en la presente para producir un cromosoma de planta que es acrocéntrico y/o contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina, el ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico y ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico complementario se introduce en una célula que contiene uno o más cromosomas de planta. Los ácidos nucleicos pueden introducirse en la célula secuencial o simult neamente. Los ácidos nucleicos pueden también dirigirse a cromosomas particulares y/o secuencias particulares de un cromosoma. Tal objetivo puede lograrse incluyendo en los ácidos nucleicos secuencias homologas a secuencias particulares en el o los cromosomas. La célula se expone entonces a una actividad de recombinasa. La actividad de la recombinasa puede proporcionarse por la introducción de ácido nucleico que codifica la actividad en la célula para expresión de la' actividad en la presente, o puede agregarse a la célula a partir de una fuente exógena. La actividad de la recombinasa es aquella que cataliza la recombinación entre secuencias a dos sitios de recombinación. Un acontecimiento de recombinación apropiado produce un cromosoma de planta que es acrocéntrico y/o contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina (tal como heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite) que pueden fácilmente identificarse en la presente basados en su estructura particular (por ejemplo, brazos de longitud desigual si el cromosoma es acrocéntrico) y/u otras características, por ejemplo, la presencia de secuencias agregadas particulares, tales como los sitios de recombinación y ADN que codifica un marcador seleccionable, la ausencia de secuencias particulares, tales como ADN eucrom tico removido por incisión, y la disposición de secuencias, tales como la colocación de los segmentos de ADNr adyacentes a la heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite. Tales atributos pueden detectarse utilizando técnicas conocidas en el arte para el análisis de los ácidos nucleicos y cromosomas, tales como, por ejemplo, hibridación in si tu. Un número de sistemas de recombinación sitio-específicas pueden utilizarse en la producción de cromosomas de planta que son acrocéntricos y/o contienen ADNr adyacentes a la heterocromatina, tales como heterocromatina pericéntrica, como se describe en la presente. Tales sistemas incluyen, pero no se limitan a, Cre/lox [véase, por ejemplo, Dale and Ow (1995) Gene 51:79-85] , FLP/ .RT [véase por ejemplo, Nigel et al. (1995) The Plant Journal 8:637-652] , R/RS [véase por ejemplo, Onouchi et al. (1991) Nuc. Acids Res. 15:6373-6378] , Gin/gdx [véase, por ejemplo, Maeser and Kahman (1991) Mol. Gen. Genet. 230:170-176] e int/att. La introducción de sitios de recombinación att en un cromosoma y el uso de integrasa-recombinasa de fago lambda junto con la misma para permitir el diseño de cromosomas naturales se describe en la solicitud provisional Norteamericana co-pendiente No. de Serie 60/294,758 para Perkins et al. intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFORMS" presentada el 30 de mayo del 2001, solicitud provisional Norteamericana No. de Serie 60/366,891, para Perkins et al. intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFORMS" presentada el 21 de marzo del 2002, solicitud de patente Norteamericana No. de Serie 10/161,403, para Perkins et al. intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFORMS" presentada el 30 de mayo del 2002, y Solicitud Internacional PCT No. PCT/US02/17452 , para Perkins et al. intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFORMS" presentada el 30 de mayo del 2002, cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad para referencia a esto. Estos sistemas, así como otros conocidos en la técnica, pueden utilizarse para remover por incisión o invertir específicamente ADN (por ejemplo, en una recombinación intracromosomal) , regiones de intercambio de ADN (por ejemplo, en una recombinación inter-cromosomal) o insertar ADN (por ejemplo, a través de la recombinación entre las secuencias homologas en un sitio de recombinación y el ADN para insertarse) . El acontecimiento preciso se controla por la orientación de las secuencias de ADN del sitio de recombinació . En modalidades particulares de los métodos para producir un cromosoma de planta acrocéntrica proporcionados en la presente, el ácido nucleico que contiene sitios de reconocimiento de recombinasa complementaria para una recombinación sitio-específica se introduce una célula que contiene uno o más cromosomas de planta en donde uno de los sitios se integra en, o cerca de, la heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite (en particular, ADN satélite próximo) de un. cromosoma de planta en la célula. En una modalidad adicional, el ácido nucleico que contiene sitios de reconocimiento de recombinasa complementaria para recombinación sitio-específica se introduce en una célula que contiene uno o más cromosomas de planta en donde uno de los sitios se integra en el extremo distal de un brazo de un cromosoma de planta en la célula. En estas modalidades, la recombinación entre los sitios en la presencia de una recombinasa que reconoce los sitios puede resultar en la eliminación de una porción de un brazo de cromosoma, translocación recíproca entre una porción distal de un brazo de cromosoma y una porción más distal de otro brazo de cromosoma o translocación recíproca entre la heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite de un brazo cromosomal y una porción más distal de otro brazo de cromosoma. Cada uno de estos acontecimientos de recombinación puede servir para reducir la longitud de un brazo de cromosoma y dar lugar a un cromosoma acrocéntrico . En otra modalidad, un ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico se introduce en una célula que contiene cromosomas de planta en donde ésta se integra en la heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite de un cromosoma de planta en la célula y el ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico complementario se introduce en la célula en donde ésta se integra en el extremo distal de un brazo de otro cromosoma de planta en la célula. En esta modalidad, la recombinación entre los sitios en la presencia de una recombinasa que reconoce los sitios puede resultar en la translocación recíproca entre la heterocromatina pericéntrica y/o el ADN satélite de un cromosoma y la porción distal de otro brazo de cromosoma por lo que trae estas dos regiones en proximidad cercana en un brazo cromosomal y reduce la cantidad de ADN entre la región pericéntrica del brazo y el extremo del brazo para generar un cromosoma de planta acrocéntrico . Estos métodos para producir un cromosoma de planta acrocéntrico pueden también conducirse de manera que el ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico se introduce en una célula que contiene un cromosoma de planta en donde ésta se integra en, o cerca de, la heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite de un cromosoma de planta en la célula y el ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico complementario se introduce en la célula en donde ésta se integra en el extremo distal del mismo brazo del mismo cromosoma. En esta modalidad, la recombinación entre los sitios en orientación directa (es decir, los mismos, o de cabeza a rabo) en la presencia de una recombinasa que reconoce los sitios, puede resultar en recombinación intracromosomal entre la heterocromatina pericéntrica (y/o ADN satélite) y la porción distal del brazo cromosomal por lo que extirpa el ADN entre estas dos regiones y reduce la cantidad de ADN entre' ellos para generar un cromosoma de planta acrocéntrico . En modalidades particulares de los métodos proporcionados en la presente para producir un cromosoma de planta que contiene regiones adyacentes de ADNr y heterocromatina, tal como heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite, el ácido nucleico que contiene sitios de reconocimiento de recombinasa complementarios para recombinación sitio-específica se introduce en una célula que contiene uno o más cromosomas de planta en donde uno de los sitios se integra en la heterocromatina de un cromosoma de planta en la célula. En una modalidad adicional, el ácido nucleico que contiene sitios de reconocimiento de recombinasa complementaria para recombinación sitio-específica se introduce en una célula que contiene uno o más cromosomas de planta en donde uno de los sitios se integra en el ADNr o una región de organización nucleolar (ÑOR) de un cromosoma de planta en la célula. En estas modalidades, la recombinación entre los sitios en la presencia de una recombinasa que reconoce los sitios puede resultar en la eliminación de ADN entre una región heterocromática, tal como la heterocromatina pericéntrica (y/o ADN satélite) , y ADNr, inversión de ADN que incluye heterocromatina o ADNr de un cromosoma de planta o translocación recíproca entre la heterocromatina de un brazo cromosomal y ADNr de otro brazo cromosomal . Cada uno de estos acontecimientos de recombinación puede servir para disponer el ADN cromosomal de manera que una región de ADN heterocromático, tal como heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite, sea adyacente a una región de ADNr en un cromosoma de planta. En otra modalidad, el ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico se introduce en una célula que contiene cromosomas de planta en donde se integra en la heterocromatina, tales como, por ejemplo, heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite, de un cromosoma de planta en la célula y ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico complementario se introduce en la célula en donde se integra en ADNr de otro cromosoma de planta en la célula. En esta modalidad, la recombinación entre los sitios puede resultar en translocación recíproca entre la heterocromatina de un cromosoma y el ADNr de otro cromosoma por lo que trae estas dos regiones en proximidad cercana en un cromosoma de planta con poca o ninguna eucromatina entre ellas. Estos métodos para producir un cromosoma de planta que contiene regiones adyacentes de ADN y ADNr heterocromático pueden también conducirse de manera que el ácido nucleico que contiene los sitios de recombinación sitio-específicos se introduce en una célula que contiene un cromosoma de planta en donde se integra en la heterocromatina, por ejemplo, heterocromatina pericéntrica y/o ADN satélite, de un cromosoma' de planta y ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-especifico complementario se introduce en la célula en donde se integra en ADNr del mismo cromosoma. En esta modalidad, la recombinación entre los sitios en orientación directa en la presencia de una recombinación que. reconoce los sitios puede resultar en recombinación intracromosomal entre la heterocromatina, tal como heterocromatina pericéntrica (y/o ADN satélite) , y ADNr por lo que extirpa el ADN, incluyendo el ADN eucromático, entre estas dos regiones. La recombinación de los sitios en orientación indirecta (es decir, cabeza a cabeza) en la presencia de una recombinasa puede resultar en la inversión de ADN entre los sitios por lo que reemplaza el ADN, tal como eucromatina, ubicada entre la heterocromatina pericéntrica (y/o ADN satélite) y ADNr en el cromosoma con ADNr. Así, en el cromosoma de planta resultante, ADNr se ubica adyacente a la heterocromatina pericéntrica (y/o ADN satélite) y ADN que se presentó entre la heterocromatina pericéntrica (y/o ADN satélite) y el ADNr se ubica distal al ADNr en una posición previamente ocupada por el ADNr. En modalidades particulares para producir un cromosoma de planta acrocéntrico que contiene regiones adyacentes de heterocromatina, tales como heterocromatina pericéntrica (y/o ADN satélite) , y ADNr, el brazo corto del cromosoma acrocéntrico puede generarse en el mismo episodio de recombinación que coloca la heterocromatina y regiones de ADNr adyacentes entre sí o en un episodio de recombinación separado. Por ejemplo, el ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico puede introducirse en una célula que contiene uno o más cromosomas de planta en donde se integra . en la heterocromatina pericéntrica de un cromosoma de planta y el ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico complementario puede introducirse en la célula en donde se integra en el ADNr que se ubica en una porción distal de otro cromosoma de planta, o el mismo brazo del mismo cromosoma. La recombinación de los sitios en la presencia de un recombinasa puede resultar en recombinación intra o inter-cromosomal que no únicamente trae la heterocromatina pericéntrica (y/o ADN satélite) y ADNr en proximidad cercana en un brazo cromosomal , sino también reduce suficientemente la longitud de ese brazo cuando el cromosoma resultante es acrocéntrico. Si un episodio de recombinación único tal como este no genera un cromosoma de planta acrocéntrico, los episodios de recombinación múltiples pueden utilizarse para producir un cromosoma de planta acrocéntrico que contiene regiones adyacentes de ADN y ADNr heterocromático . Por ejemplo, el ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico puede introducirse en una célula que contiene uno o más cromosomas de planta en donde se integra en la heterocromatina pericéntrica (y/o ADN satélite) de un cromosoma de planta y ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico complementario puede introducirse en la célula en donde se integra en el ADNr del mismo o diferente cromosoma de planta. Como se describe anteriormente, la recombinación entre los sitios en la presencia de una recombinasa puede resultar en la eliminación, inversión o translocación recíproca del ADN para disponer ADN cromosomal de manera que la heterocromatina pericéntrica (y/o ADN satélite) sea adyacente a una región de ADNr en un cromosoma de planta. Para reducir la longitud del brazo del cromosoma en donde las regiones adyacentes de la heterocromatina y el ADNr se ubican, un episodio de recombinación adicional puede inducirse introduciendo ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico en una célula que contiene este cromosoma de planta en donde se integra en una región del cromosoma distal al ADNr y el ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación sitio-específico complementario en la célula en donde se .integra en el extremo distal del mismo brazo de cromosoma o de otro brazo de cromosoma de la planta. La recombinación entre los sitios de reconocimiento puede resultar en eliminación o translocación recíproca del ADN para reducir la longitud del brazo de cromosoma distal al ¾DNr y dar lugar a un cromosoma de planta acrocéntrica que contiene regiones adyacentes de heterocromatxna y ADNr en el brazo corto del cromosoma. En cada uno de los métodos antes mencionados para producir un cromosoma de planta que es acrocéntrico y/o contiene regiones adyacentes de heterocromatxna y ADNr, el ácido nucleico que contiene los dos o más sitios de recombinación pueden introducirse simultánea o secuencialmente en una célula o células utilizando métodos de transferencia de ácido nucleico descritos en la presente o conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden integrarse aleatoriamente en cromosomas de planta o pueden dirigirse para la integración en una región o sitio particular en un cromosoma de planta a través de la recombinación homologa entre las secuencias en el ácido nucleico y las secuencias dentro del cromosoma. La actividad de recombinasa puede proporcionarse por la introducción de ácido nucleico que codifica una recombinasa apropiada en la célula para la expresión en la presente. El ácido nucleico que codifica la recombinasa puede introducirse en la célula antes de, durante o después de la introducción de ácidos nucleicos que codifican sitios de recombinación. Para facilitar la identificación de células que contienen los ácidos nucleicos transferidos y/o en donde ha ocurrido un episodio de recombinación, el ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede introducirse en la célula. Por ejemplo, uno o ambos de los ácidos nucleicos que contienen un sitio de recombinación pueden también contener ADN que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, un marcador que codifica resistencia o una molécula reportera) operativamente enlazada a un promotor el cual se orienta de manera que la integración del ácido nucleico en un cromosoma coloca el ADN marcador entre dos sitios de recombinación directamente orientados en un brazo de un cromosoma. Una célula que contiene el ácido nucleico será así resistente a un agente de selección o expresará detectablemente una molécula reportera. La exposición de la célula a la recombinasa apropiada puede resultar en un episodio de recombinación que extirpa el ADN entre los dos sitios de recombinación, que incluyen ADN que codifica un marcador seleccionable. Asi, la recombinación podría detectarse como la pérdida de la expresión de molécula reportera o disminuir resistencia a un agente de selección. Después de la exposición a una recombinasa, las células en donde el ácido nucleico que contiene los sitios de recombinación se ha transferido puede analizarse por la presencia de cromosomas de planta acrocéntricos utilizando por ejemplo, análisis FISH y otras técnicas de visualizacion dé cromosoma. En otro método proporcionado en la presente para producir un cromosoma de planta que es acrocéntrico y/o contiene regiones adyacentes de heterocromatina y ADNr, el episodio o episodios de recombinación que conducen a la formación del cromosoma ocurre a través del cruce de plantas transgénicas que contienen cromosomas los cuales contienen sitios de recombinación sitio-específicos complementarios. Así, en una modalidad de estos métodos, el ácido nucleico que contiene un sitio de recombinación adyacente al ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se introduce en una primera célula de planta y una primera planta transgénica se genera a partir de la primera célula de planta. El ácido nucleico que contiene un promotor funcional en una célula de planta, un sitio de recombinación y una región de codificación de recombxnasa en enlace operativo se introduce en una segunda célula de planta a partir de la cual se genera una segunda planta transgénica. La primera y segunda plantas transgénicas se cruzan para obtener una o más plantas resistentes a un agente que se selecciona para células que contienen el ácido nucleico que codifica el marcador seleccionable, y se selecciona una planta resistente que contiene células que comprenden un cromosoma de planta que es acrocéntrico y/o contiene regiones adyacentes de heterocromatina y el ADNr. En un ejemplo de este método, los ácidos nucleicos que contiene los sitios de recombinación sitio-específicos se introducen en las células de Nicotiana tabacu . Los ácidos nucleicos se introducen separadamente infectando explantas de hojas con Agrobacterium tumefaciens que porta el gen de resistencia a la kanamicina (KanR) . Las plantas transgénicas resistentes a la kanamicina se generan de explantas de hojas infectadas. Una planta transgénica contiene ácido nucleico que codifica un gen resistente a higromicina menos promotor precedido por una secuencia de recombinación sitio-específica lox {lox-hpt) , la otra planta contiene un virus de mosaico de coliflor 35S promotor enlazado a una secuencia lox y la región de codificación de recombinación de ADN ere (35S lox-cre) . Las plantas transgénicas KanR resultantes se cruzan (por ejemplo, protocolos de Qin et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sel. U.S.A. 52:1706-1710, 1994). Las plantas en las cuales el episodio de recombinación de ADN apropiado ha ocurrido se identifican por resistencia a la higromicina. Los cultivos KanR pueden tamizarse inicialmente, tal como por FISH, para identificar dos conjuntos de plantas transgénicas candidatas. Un conjunto tiene una construcción integrada en regiones adyacentes a la heterocromatina pericéntrica (y/o ADN satélite) en el brazo corto de cualquier cromosoma. El segundo conjunto de plantas candidatas tiene la otra construcción integrada en ADNr, tal como la región OR, de cromosomas apropiados. Para obtener translocación recíproca ambos sitios deben estar en la misma orientación. Por lo tanto, una serie de cruces pueden requerirse, plantas resistentes al marcador generadas, y análisis FISH realizado para identificar un cromosoma o cromosomas de planta "acrocéntrico" que contiene regiones adyacentes de eterocromatina . Como se describe anteriormente, tal cromosoma acrocéntrico puede utilizarse para formación de cromosoma artificial de planta de novo, particularmente cromosomas artificiales de planta predominantemente heterocromática. La selección de líneas de planta apropiada puede hacerse, por ejemplo, utilizando selección asistida por marcador. F. Incorporación de Ácidos Nucleicos Heterólogos en Cromosomas Artificiales Los ácidos nucleicos heterólogos pueden introducirse en cromosomas artificiales durante o después de la formación. La incorporación de ácidos nucleicos particulares deseados en un cromosoma artificial durante la generación de los mismos puede lograrse incluyendo los ácidos nucleicos deseados junto con el ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable y cualesquiera otros ácidos nucleicos utilizados en la generación de cromosoma artificial (por ejemplo, secuencias objetivo que dirigen el ácido nucleico heterólogo a la región pericéntrica de un cromosoma) en la transformación de una célula para iniciar la amplificación y formación de cromosomas artificiales. Alternativamente, los ácidos nucleicos heterólogos pueden incorporarse en un cromosoma artificial siguiendo la formación de los mismos a través de la transfección de una célula que contiene el cromosoma artificial con los ácidos nucleicos heterólogos . En general, la incorporación de tales ácidos nucleicos en el cromosoma artificial se asegura a través de la integración sitio-dirigida, tal como puede lograrse incluyendo ácidos nucleicos homólogos o idénticos a ADN contenidos dentro del cromosoma artificial entre el ácido nucleico heterólogo cuando se transfiere en el cromosoma artificial . Un gen marcado† selectivo adicional puede también incluirse . Adicionalmente , la introducción de ácidos nucleicos, particularmente moléculas de ADN a un cromosoma artificial puede lograrse por el uso de recombinasas sitio-especificas como se describe en la presente (véase, también solicitud provisional Norteamericana copendiente No. de Serie 60/294,758 para Perkins et al, intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFORMS" presentado el 30 de mayo del 2001, solicitud provisional Norteamericana No. de Serie 60/366,891, para Perkins et al. intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFORMS", presentada el 21 de marzo, 2002, solicitud de patente Norteamericana No. de Serie 10/161,403, para Perkins et al. intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFORMS", presentada el 30 de mayo del 2002, y Solicitud Internacional PCT No. PCT/US02/17452 , para Perkins et al., intitulada "CHROMOSOME-BASED PLATFORMS" presentada el 30 de mayo del 2002; cada una de las cuales se incorpora en su totalidad para referencia en la misma) . Los cromosomas artificiales pueden producirse conteniendo secuencias de reconocimiento de recombinasa, para permitir la introducción sitio-especifica de moléculas de ADN en las mismas . Otro uso para un sitio de recombinasa' introducido es proporcionar una región para integración sitio-específica de un nuevo atributo por el uso de inserción de gen mediado por recombinasa. G. Introducción de Cromosomas Artificiales en Células de Plantas y Recuperación de Plantas que Contienen Cromosomas Artificiales Los cromosomas artificiales pueden introducirse en células de plantas por una variedad de métodos familiares a aquellos expertos en la técnica. Estos métodos incluyen métodos químicos y físicos para la introducción de ADN extraño, así como métodos de cultivo celular para transferir cromosomas a partir de una célula a otra célula. Cualquier tipo de cromosoma artificial puede utilizarse. Los cromosomas artificiales de plantas (los PAC) pueden prepararse por los métodos in vivo e in vitro descritos en la presente. Los PAC pueden prepararse en el interior de los protoplastos de la planta y luego transferirse a otras especies de plantas y tejidos, en particular a otros protoplastos de planta, a través de la fusión en la presencia o ausencia de PEG como se describe en la presente (Draper et al. (1982) Plant Cell Physiol . 23:451-458; Krens et al. (1982) Nature 72-74) . Los PAC pueden aislarse a partir de los protoplastos en donde se prepararon, encapsularon en liposomas y suministraron a otros protoplastos de planta (Deshayes et al. (1985) EMBO, J. 4:2731-2737). Alternativamente, los PAC pueden aislarse y suministrarse directamente a protoplastos de planta, células de planta u otros objetivos de planta a través de un proceso mediado por PEG, procesos mediados por fosfato de calcio, electroporación, microinyección, (bombardeo de partículas) , método mediado por lípido con o sin sonoporación, sonoporación sola, o cualquier método conocido en la técnica como se describe en la presente (Haim et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161-168; Fromm et al. (1986) Nature 319-791-793; Fromm et al. (1985) Proc. Nat . Acad. Sci . USA 82:5824-5828; Klein et al. (1987) Nature 327:70; Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:8502-8505; y publicación de solicitud PCT internacional no. WO 91/00358) . Los cromosomas artificiales de planta pueden también transferirse a otras especies de plantas por la preparación de microcélulas de planta derivadas de protoplastos, y la fusión de las microcélulas que contienen el cromosoma artificial de planta con células de planta de otras especies de plantas. Los cromosomas artificiales de mamífero (los MAC) pueden transferirse a células de plantas. Los cromosomas artificiales de mamífero se preparan por los métodos in vivo o in vi tro descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,025,155 y 6,077,697 y solicitud Internacional PCT No. WO 97/40183. Los MAC pueden prepararse como microcélulas , y las microcélulas pueden fusionarse con protoplastos de planta en la presencia o ausencia de PEG (Dudits et al. (1976) Hereditas 82:121-123; iegland et al. (1987) J. Cell . Sci. Pt . 2 145-149) . Alternativamente, los MAC pueden aislarse y suministrarse directamente a células de plantas, protoplastos, otros objetivos de planta utilizando un proceso mediado por PEG, proceso mediado por fosfato de calcio, electroporación, microinyección, métodos mediado por lípido con o sin sonoporación, sonoporación sola, o cualquier método conocido en la técnica como se describe en la presente y en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,025,155 y 6,077,697 y publicación de solicitud PCT Internacional No. WO 97/40183. Después que se introducen los PAC o los MAC en objetivos de plantas y los objetivos de plantas se cultivan y analizan para transíección, los objetivos de planta transformados de planta pueden desarrollarse utilizando condiciones estándares en raíces, brotes, plántulas o cualquier estructura capaz de cosecharse en una planta. Por consiguiente, los métodos para la introducción de cromosomas artificiales representan la primera etapa en la producción de células de plantas y plantas enteras que contienen cromosomas artificiales a partir de una variedad de fuentes . La capacidad para introducir genes en plantas, de manera que se expresan establemente y son transmisibles de generación a generación, han revolucionado la biología de la planta y abierto nuevas posibilidades para utilizar plantas como en la industria del campo para la producción de productos comercialmente útiles así como para otras aplicaciones descritas en la presente. Existen varios enfoques para la generación de plantas establemente transformadas, y el enfoque adoptado varía de acuerdo a las metas del proyecto. Para la introducción de cromosomas artificiales en plantas, una variedad de métodos puede emplearse, plantas transgénicas , el proceso de transformación implica los métodos de suministro de ADN extraño a células huésped de planta, el crecimiento y análisis de células de huésped de plantas transformadas, y la generación y regeneración de plantas transgénicas a partir de células huésped de plantas transformadas. 1. Introducción de cromosomas artificiales en células huésped de plantas Numerosos métodos para producir o desarrollar plantas transgénicas están disponibles por aquellos expertos en la técnica. El método utilizado es principalmente una función de las especies de plantas. Los cromosomas artificiales que contienen ADN heterólogo, tal como cromosomas artificiales preparados por los métodos descritos en la presente, pueden introducirse en células huésped de plantas, incluyendo, pero no limitándose a, células de plantas y protoplastos , por, por e emplo, procesos de transferencia de ADN mediados sin vector (véase, también solicitud Norteamericana copendiente No. 09/815,979, que describe métodos para suministrar que pueden adaptarse para uso con células de plantas y utilizados con protoplastos de planta) . Los sistemas de transferencia de gen directo o mediado sin vector, implican la introducción de ADN heterólogo, en particular cromosomas artificiales particulares, en células huésped, incluyendo, pero no limitándose a células de plantas y protoplastos, sin el uso de un vector biológico. El cromosoma artificial que se introduce en estas células huésped de plantas puede conducir al desarrollo de plantas transgénicas regenerables, transformadas. Los sistemas de transferencia de gen directo para plantas transgénicas se designan para superar la barrera de la incorporación de ADN provocada por la pared celular y la membrana de plasma de células de plantas. Los enfoques para transferencia de gen directo incluyen, pero no se limitan a, métodos químicos, eléctricos y físicos, que pueden también adaptarse para optimizar la transferencia de cromosomas artificiales (véase por ejemplo, Uchimiya et al . (1989) J. of Biotech. 12: 1-20 para una revisión de tales procedimientos, véase también por e emplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,436,392; 5,489,520; Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183; Lorz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:178; Fromm et al. (1985) Proc . Nati. Acad. Sel. U.S.A. 82:5824-5828; Uchimiya et al. (1986) Mol. Gen. Genet.' 204:204; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-2000; Callis et al. (1987) Nuc . Acids Res. 15:5823-5831; Marcotte et al. (1988) Nature 355:454 and Toriyama et al. (1988) Bio/Technology 6: 1072-1074) . a. Métodos Químicos La incorporación de cromosomas artificiales en células de plantas, tales como protoplastos, puede lograrse en la ausencia o presencia de polietilenglicol (PEG) , que es un fusógeno, o por cualesquiera variaciones de tales métodos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica [véase, por ej emplo , Patente Norteamericana No. 4,684,611 para Schilperoot et al . ; Paskowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722; Patentes Norteamericanas Nos. 5,231,019 y 5,453,367]. En un enfoque, los protoplastos de planta se incuban con una solución del ADN extraño, en particular cromosomas artificiales, y PEG a una concentración que permita la supervivencia celular elevada y la alta eficiencia de incorporación del cromosoma. Los protoplastos se lavan y cultivan entonces [Datta and Datta (1999) Meth in Molecular Biol. 111:335-348]. En un enfoque alternativo, los protoplastos de planta se incuban con cromosomas artificiales en la presencia de fosfato de calcio para dirigir la incorporación del cromosoma artificial (Haim et al. (1985) Mol. Gen. Genet . 199:161-168). Alternativamente, el cromosoma artificial, en particular cromosoma artificial de planta (PAC) , se forma en un protoplasto de planta que es, a su vez, combinado con otro protoplasto de planta en la presencia o ausencia de PEG para transferir el PAC al protoplasto huésped de la planta. Tales métodos para tratar protoplastos con PEG y ADN extraño son bien conocidos en la técnica (Draper et al. (1982) Plant Cell Physiol. 23:451-458; Krens et al. (1982) Nature 72-74) . Otro método para transferir el gen directo químico implica suministro mediado por lípido de cromosomas artificiales a protoplastos de planta. En este proceso, los liposomas con cromosomas artificiales encapsulados se permiten fundir con protoplastos solos o en la presencia de PEG como el fusógeno para transferir el ADN extraño, en particular cromosoma artificial, al protoplasto huésped de la planta (Deshayes et al. (1985) EMBO J. 4:2731-2737; Fraley and Paphadj opoulos (1982) Curr top icrobiol Immunol 96:171- Otro método de transferencia de gen directo implica el uso de microcélulas. Los cromosomas pueden transferirse preparando microcélulas que contienen cromosomas artificiales y luego funden las microcélulas con protoplastos de plantas. Los métodos para la preparación y fusión de microcélulas con •otras células son bien conocidos en la técnica (véase Ejemplo No. 4 y véase también por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,240,840; 4,806,476; 5,298,429; 5,396,767; Fournier (1981) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 78:6349-6353; y Lambert et al . (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. . 88:5907-59; Dudits et al. (1976) Hereditas 82:121-123; iegland et al. (1987) J. Cell. Sci. Pt . 2 145-149). b. Métodos eléctricos La electroporación, la cual implica pulsos eléctricos de alto voltaje a una solución que contiene una mezcla de protoplastos o células de plantas y ADN extraño, en particular cromosomas artificiales, para crear poros reversibles, de tamaño de nanómetro creados, es un método común para introducir ADN en células de plantas o protoplastos. El ADN exógeno puede agregarse a los protoplastos en cualquier forma tal como, por ejemplo, ADN circular o supercoloide, desnudo lineal, cromosomas artificiales encapsulados en liposomas, ADN en esferoplastos, cromosomas artificiales en otros protoplastos de planta, cromosomas artificiales compuestos con sales, y otros métodos. El ADN extraño, en particular cromosoma artificial, pueden también incluir un marcador fenotípico para identificar las células de plantas que se transforman exitosamente . Cuando las células de plantas o protoplastos se someten a pulsos DC eléctricos cortos (corriente directa) , pueden experimentar un incremento en la permeabilidad de la membrana de plasma y/o pared celular a moléculas hidrofílicas tales como ácidos nucleicos, que son normalmente incapaces para entrar a la célula de la planta directamente. Los ácidos nucleicos se toman directamente en el citoplasma celular ya sea a través de esos poros o como una consecuencia de la redistribución de componentes de membrana que acompañan el cierre de los poros. Ciertas enzimas que degradan la pared celular, tales como enzimas que degradan pectina, pueden emplearse para suministrar las células receptoras objetivo de planta más susceptibles a ADN o incorporación de cromosoma artificial por electroporacion que las células no tratadas. Las células receptoras de planta pueden también ser susceptibles a la transformación por lesión mecánica. Para efectuar la transformación por electroporacion, los tejidos desintegrables tales como un cultivo de suspensión de células o callos embriónicos pueden utilizarse o embriones inmaduros u otros tejidos organizados pueden transformarse directamente (véase por ejemplo, From et al. (1986) Nature 319:791-793) .

Los métodos para efectuar electroporación son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 4,784,737; 4,970,154; 5,304,486; 5,501,967; 5,501,662; 5,019,034, 5,503,999; véase también Fromm et al. (1985) Proc . Nati. Acad. Sci . U.S.A. 82:5824-5828; Zimmerman et al. (1981) Biophys Biochem Acta 641:160-165; Neuman et al. (1982) EMBO J. 1:841-845; Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606; Lurquin (1997) Mol. Biotechnol . 7:5-35; Bates (1999) Methods in Molecular Biology 111:359-366). La electroporación puede utilizarse para introducir ácidos nucleicos en células mesofílicas de tabaco (Morikawa et al. (1986) Gene 41:121-124; bases de hojas de arroz (Dekeyser et al. (1990) Plant Cell 2:591-602; embriones de maíz inmaduros (Songstad et al. (1993) Plant Cell Tiss. Orgn. Cultiv. 40:1-15; embriones de maíz- inmaduro macerado (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505; células de maíz cultivado en suspensión (Laursen et al. (1994) Plant Mol. Biol . 24: 51-61; y caña de azúcar (Arencibia et al. (1995) Plant Cell Rep. 14 :305-309) . Los cromosomas artificiales pueden suministrarse a células de plantas, en particular semillas de plantas, por el uso de electroporación y polen para derivar polen que comprende un cromosoma artificial. Los métodos que pueden utilizarse para suministrar cromosomas artificiales en polen incluyen, por ejemplo, técnicas descritas en la Patente Norteamericana No. 5,049,500 y por Negrutiu et al. [en Biotechnology and Ecology of Pollen, Mulcahy et al. eds . (1986) Springer "Verlag, N.Y., pp . 65-59] y Fromm et al. [(1986) Nature 319:791; incluyendo métodos para introducir ADN en polen maduro utilizando varios procedimientos tales como choque de calor, PEG y electroporación] . El polen es capaz de germina y fertilizar una célula-huevo, conduciendo a la formación de una semilla de planta que comprende un cromosoma artificial . c. Métodos físicos Los métodos físicos se enfocan para introducir ADN extraño, en particular cromosomas artificiales, en células de plantas que vencen la barrera de pared celular al movimiento de ADN. Los medios físicos o mecánicos, se utilizan para introducir transgenes directamente en protoplastos o células de plantas e incluye, pero no se limitan a, microinyeccion, bombardeo de partículas, y sonoporación. (1) Microinyeccion La microinyeccion implica la inyección mecánica de ADN heterólogo, en particular cromosomas artificiales, en células de plantas, incluyendo células cultivadas y células en organismos de planta y embrioides intactos en cultivo de tejido a través de micropipetas muy pequeñas, agujas, o jeringas (Neuhaus et al. (1987) Theor, Appl Genet . 75:30-36; eich et al. (1985) Can. J. Bot . 64:1255-1258; Crossway et al. (1986) BioTechniques 4:320-334; Crossway et al. (1986) Mol. Gen. Genet . 20:179; Patente Norteamericana No. 4,743,548; filamentos de carburo de silicio (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:415-418; Frame et al. (1994) . Por ejemplo, la microinyección o células de protoplastos con ADN extraño para la transformación de células de planta se ha reportado para cebada y tabaco (véase por ejemplo, Holm et al. (2000) Transgenic Res. 5:21-32 y Schnorf et al. Transgenic Res. 1:23-30) . Los cromosomas artificiales únicos pueden ser cargados en frente en agujas para microinyección y luego inyectarse en células ("elegir e inyectar") siguiendo los procedimientos como se describió por Co et al [ (2000) Chromosome Res. 8:183-191] . (2) Bombardeo de partículas El bombardeo por microproyectil (aceleración de partículas de densidad menos elevada, que contiene el ADN, a velocidad elevada con un aparato tirador de partícula, que fuerza a las partículas a penetrar las paredes de la célula de la planta y las membranas) , se ha utilizado también para introducir el ADN heterólogo en las células de la planta. Las técnicas de bombardeo por microproyectil para la introducción de ácidos nucleicos en células de plantas, además de ser un medio efectivo para transformar establemente, de manera reproducible células de la planta, particularmente monocotiledóneas , no requieren aislamiento de protoplastos o susceptibilidad de la célula huésped a infección por Agrobacterium. En estos métodos, los ácidos nucleicos se transportan a través de la pared celular y en el citoplasma en la superficie de partículas normalmente metálicas, pequeñas (véase por ejemplo, Klein et al. (1987) Nature 327:70; Klein et al. (1988) Proc . Nati. Ac&d. Sci. U.S.A. 85:8502-8505, Klein et al. in Progrese in Plant Cellular and Molecular Biology, eds . Nijkamp, H.J.J. Van der Pías, J.H. . and Van Aartrijk, J. , Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, (1988), p. 56-66 y McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926; Sautter et al. (1991) Biol Technol . 9:1080-1085; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618; Finer et al. (1999) Curr. Top. Microbiol . Immunol . 240:59-80; Vasil and Vasil (1999) Methods in Molecular Biology 111:349-358; Seki et al. (1999) Mol. Biotechnol . 11:251-255) . Las partículas pueden recubrirse con ácidos nucleicos y suministrarse en células por una fuerza propulsora. Partículas ejemplares incluyen aquellas que contienen tungsteno, oro o platino, así como cristales de sulfato de magnesio. Las partículas metálicas pueden penetrar a través de varias capas de células y así permitir la transformación de células dentro de las explantas del tejido. En una modalidad ilustrativa (véase por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,023,013) de un método para suministrar ácidos nucleicos extraños en células de plantas, por ejemplo, células de maíz, por aceleración, un Sistema de Suministro de Partícula Biolístico puede utilizare para impeler partículas recubiertas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o Nytex, en una superficie de filtro cubierta con células de la planta (por ejemplo, maíz) cultivadas en suspensión. El tamiz dispersa las partículas de manera que no se suministren a las células receptoras en grandes agregados . La intervención del tamiz entre el aparato proyectil y las células a ser bombardeadas puede reducir el tamaño de los agregados del proyectil y puede contribuir a una frecuencia más elevada de transformación reduciendo el daño producido en las células receptoras por proyectiles, que son muy grandes. Para el bombardeo, las células en suspensión pueden concentrarse en filtros o medios de cultivo sólido. Alternativamente, los embriones inmaduros u otras células objetivo de planta pueden disponerse en un medio de cultivo sólido. Las células a bombardearse se colocan normalmente a una distancia apropiada debajo de la placa de detección de microproyectil . Si se desea, uno o más tamices pueden también colocarse entre el dispositivo de aceleración y las células a bombardearse . Las condiciones de cultivo de pre-bombardeo y parámetros de bombardeo pueden optimizarse para producir los números máximos de transformantes estables. Tanto los parámetros físicos como biológicos para el bombardeo son importantes en esta tecnología. Los factores físicos incluyen aquellos que implican la manipulación del precipitado de ADN/microproyectil o aquellos que afectan el vuelo y velocidad de los macro o microproyectiles . Los factores biológicos incluyen todas las etapas implicadas en la manipulación de células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de las células objetivo para ayudar a aliviar el trauma asociado con el bombardeo, y también la naturaleza del ácido nucleico transformante, tal como el ADN linearizado, plásmidos supercoloides intactos o cromosomas artificiales.' Los parámetros físicos que pueden ajustarse incluyen distancia de espacio, distancia de vuelo, distancia de tejido y presión de helio. Además, la transformación puede optimizarse ajustando el estado osmótico, hidratación de tejido y etapa de subcultivo o ciclo celular de las células receptoras. Los dispositivos de aceleración de partícula balística están disponibles de Agracetus, Inc. (Madison, I) y BioRad (Hercules, CA) . Las técnicas para la transformación de línea de maíz derivada de Al88 que utiliza bombardeo de partícula se describen en Gordon- amm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618 y Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839. La transformación de arroz puede también lograrse a través, de bombardeo de partículas (véase por ejemplo, Christou et al. (1991) Biotechnology 9:957-962). El bombardeo de partículas puede también utilizarse para transformar trigo (véase, por ejemplo Vasil et al. (1992) Biotechnology 10:661-675 para la transformación de células del tipo de callo regenerable de plazo largo C; y Weeks et al. (1993) Plant Physiol. 102:1077-1084 para la transformación de trigo utilizando bombardeo de partículas de embriones inmaduros y callos derivados de embriones inmaduros) . Se describe la producción de cebada transgénica que utiliza métodos de bombardeo, por ejemplo, por Koprek et al. (1996) Plant Sci . 119:79-91. 3. Sonoporacion El ADN extraño, en particular cromosomas artificiales, pueden introducirse en los protoplastos de planta utilizando tratamiento de ultrasonido, en particular tratamiento de ultrasonido suave (10-100kHz) , para crear poros para la incorporación de 7ADN (véase, por ejemplo, publicación de solicitud PCT Internacional No. WO 91/00358) o puede introducirse en protoplastos de planta a través de máquina de sonoporacion (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ) . Alternativamente, el suministro de cromosomas artificiales en las células huésped de planta se realiza por cualquier método descrito en la presente o bien conocido en la técnica. Por ejemplo, filamentos como agujas (US 5,302,523, 1994, US 5,464,765) se han -utilizado para suministrar ADN extraño. Los objetivos de planta adecuados en donde el ADN extraño, en particular cromosomas artificiales, se transfieren, incluyen, pero no se limitan a, protoplastos , células de cultivos celulares, células en tejido de planta, células de área de división celular, microsporas, callos, polen, conductos del polen, microesporas , células-huevo, embriones-bolsa, zigotos o embriones en diferentes etapas de desarrollo, semillas, plantones, raíces, tallos, hojas, plantas enteras, algas o cualquier parte de la planta capaz de proliferación y regeneración de las plantas (véase, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,990,390; 6,037,526 y 5,990,390). El crecimiento de los objetivos de planta transformados descritos en la presente puede hacerse con métodos de cultivo de tejido o cultivo sin tejido, con los métodos preferidos que son métodos de cultivo de tejido. Todas las plantas en donde el ADN extraño, en particular cromosomas artificiales, se introducen y que se regeneran a partir de las células transformadas se utilizan directamente- para expresar propósitos (por ejemplo, resistencia al herbicida, resistencia a insectos/plagas, resistencia a la enfermedad, resistencia al ambiente/tensión, utilización de nutrientes, esterilidad macho, contenido nutricional mejorado, producción de productos químicos o biológicos, secuencias que no expresan proteína, y preparación y selección de bibliotecas) como se describe en la presente o se utilizan para producir plantas enteras transformadas para las aplicaciones y usos descritos en la presente. El protocolo particular y medios para la introducción del cromosoma artificial en la planta huésped se adapta o refina para situar la especie de planta particular o forraj era . Los cromosomas pueden transferirse a células por cromosoma mediado por microcélula transferido (MMCT) (Telenius et al. Chromosome Research 7:3-7, 1999; Ramulu et al., Method in Molecular Biology 111:227-242, 1999). En general, los cultivos de planta donadores o cultivos de célula de mamífero donador se incuban en un medio suplementado con reactivos que inhiben síntesis de ADN (por ejemplo, hidroxiurea, afidicolin) , y/o reactivos que inhiben la unión de cromosomas al eje mitótico (por ejemplo, colcemida, colquicinas, amiprofosmetilo, cremart) . Las paredes celulares de las células de plantas se digieren con enzimas (por ejemplo, celulasa, maceroenzima) produciendo protoplastos . Los protoplastos de planta donadora o células de mamífero donadoras se cargan en un gradiente Percoll en la presencia de critocalasina-B (que provoca el citoesqueleto celular para despolimerizarse en las subunidades de proteína monomérica) y centrifugarse a 105 x g. Durante la centrifugación los cromosomas de metafase se forman por extrusión a través de la membrana de plasma que forma los "microprotoplastos" de la planta o microcél-ulas mamíferas . Los microprotoplastos/microcélulas se filtran a través de tamices de nylon de tamaño de poro disminuido (3-8 µp?) para aislarlos más pequeños los cuales contienen predominantemente 1 cromosoma de metafase. Los microprotoplastos/microcélulas se combinan a protoplastos de planta receptores o células de mamífero por tratamiento por polietilenglicol (peg) . La mezcla de fusión se cultiva en medios apropiados. Si el cromosoma de interés que expresa un gen marcador de selección de las mezclas de fusión puede cultivarse en un medio apropiado suplementado con el fármaco de selección apropiado (por ejemplo, higromicina, kanamicina) . 2. El crecimiento de células huésped de plantas transformadas En métodos de cultivo de tejido, las células de las plantas o protoplastos transformados por los métodos químicos, físicos, eléctricos descritos en la presente se cosechan o cultivan bajo condiciones selectivas. Los marcadores selectivos se integran en el ADN heterólogo, en particular cromosoma artificial, antes de su introducción a plantas huésped o se integran en la planta huésped después de la transfección . Un marcador adicional puede utilizarse para doble selección. Generalmente, las células de la planta o protoplastos se cosechan por numerosas generaciones, después de lo cual las células transformadas se identifican. Las células transformadas se someten a condiciones conocidas en la técnica para la iniciación del callo. El tejido que se desarrolla durante el periodo de iniciación se coloca en un medio de regeneración o selección en donde el desarrollo de brotes y raices ocurre. Las plántulas se analizan por la determinación de la transformación (publicación de solicitud PCT Internacional No. WO 00/60061). En el caso del maíz, los cultivos de callo embriónico se inician a partir de embriones de maíz inmaduros, bombardeo con genes, y transformados en plántulas por los métodos descritos en la publicación de solicitud PCT Internacional No. WO 00/60061. En los métodos de cultivo de tejido, el callo de Arroz se transforma con el ADN que codifica las proteínas insecticidas CrylA(b) y CrylA(c) para resistencia a los insectos. Los métodos de cultivo de tejido común pueden también utilizarse para transformar tabaco y tomate (véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,136,320), callo de maíz embriogénico (las Patentes Norteamericanas Nos. 5,508,468; 5,538,877; 5,538,880, 5,780,708; 6,013,863; 5,554,798; 5,990,390; y 5,484,956) y otras especies de cultivo, por ejemplo, papa y tabaco (Sijmons et al. (1990) Bio/Technol 8:217-221; tabaco (Vanderkerckhove et al. (1989) Bio/Technol 7:929-932 y Owen and Pen eds . Transgenic Plants: A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, John Wiley & Sons, Chichester, 1996) y arroz (Zhu et al. (1994) Plant Cell Tiss Org Cult 36:197-204). 3. Análisis de células huésped de plantas transformadas Una vez que el ADN extraño, en cromosomas artificiales particulares se introduce en los huéspedes de la planta y las células o protoplastos se cosechan y desarrollan bajo las condiciones descritas en la presente, las células de las plantas o protoplastos que se transforman con los cromosomas artificiales se identifican. La célula de la planta, protoplastos, callo, disco de hoja, u otro objetivo de planta se seleccionan por la presencia de cromosomas artificiales por varios métodos bien conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitándose a, ensayos para la expresión de genes reporteros, PCR de los cromosomas de planta aislados o ADN, microscopía de electrón, métodos de visualización, e hibridación in situ de cromosoma que pinta la sonda como se describe en la presente. Además, las células tratadas con cromosomas , artificiales se aislan durante la metafase utilizando un agente de detención mitótico, tal como colquicina, y los cromosomas artificiales se distinguen de cromosomas endógenos por clasificación de célula activada por fluorescencia, diferencias de tamaño y densidad, o por cualquier método bien conocido en la técnica. Alternativamente, cuando un gen marcador seleccionable se transmite con o como parte del cromosoma artificial, los agentes selectivos se utilizan para detectar la expresión del marcador seleccionable (publicación de solicitud PCT Internacional No. WO 00/60061; Patente Norteamericana No. 6,136,320; Owen and Pen Eds . Transgenics Plants : A Productxon Systems for Industrial and Pharmaceutical Proteins) . Los ensayos enzimáticos, ensayos inmunológicos , bioensayos, ensayos de terminación, o ensayos químicos se utilizan para evaluar los efectos fenotípicos de cromosomas artificiales tales como resistencia a insectos u hongos o cualquier otra expresión de genes en cromosomas artificiales (Cheng et al. (1998) 95:2767-2772) ; Patente Norteamericana No. 6,126,320; publicación de solicitud PCT Internacional No. WO 00/600061; Owen and Pen eds. Transgenic Plants: A Productxon System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, John Wiley & Sons, Chichester, 1996) . Las células de las plantas, protoplastos , u otros huéspedes de planta que se transforman exitosamente con cromosomas artificiales se utilizan directamente para expresar el gen de interés o se utilizan para generar las plantas transgénicas . La hibridación in situ fluorescente (FISH) puede utilizarse para seleccionar la transferencia de cromosomas artificiales en células de plantas que utilizan sondas de ADN específicas para el cromosoma artificial (por ejemplo, sonda de ADN satélite mayor de ratón para ADN satélite murino basado en cromosomas artificiales; o una kanamicina, higromicina o sonda de ADN del gen GUS para un cromosoma artificial de planta que transporta tal gen) . Las técnicas FISH estándares para células de planta han sido descritas (de Jong et al., Trends in Plant Science 4 :258-263 , 1999) . Puede utilizarse etiquetado IdU para determinar las condiciones óptimas para transferir cromosoma (microcélulas) de cromosomas artificiales aislados. El IdU incorporado incrementa la fragilidad del cromosoma e incrementará la probabilidad de mutación celular. Por lo tanto, las células se fijan dentro de 48 horas después de la transfección/fusión y analizan para incorporación de cromosoma utilizando varios procedimientos. Una vez que las condiciones de transferencia óptima se han determinado, los experimentos de expresión a largo plazo se realizan con cromosomas artificiales no marcados o microcélulas. H. Regeneración de plantas transgénicas Las plantas que contienen cromosomas artificiales se generan de células de plantas, protoplastos , callos u otros objetivos de tejido de planta en los cuales el ADN extraño, en particular cromosomas artificiales, se han introducido. Las técnicas de regeneración para muchas especies de planta comercialmente importantes se conocen bien en la técnica. El cromosoma artificial que se inserta en los huéspedes de la planta para producir plantas transgénicas son los PAC o los MAC.

Las plantas se regeneran plantando raíces transformadas, plántulas, semillas, plantones y estructuras capaces de cultivarse en una planta entera capaz de reproducción (véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,136,320 y la solicitud PCT Internacional No. O 00/60061) . La regeneración de plantas de maiz a partir de protoplastos transformados se encuentra por ejemplo, en las Solicitudes de Patente Europea Nos. 0 292 435 y 0 392 225 y la Publicación de Solicitud PCT Internacional No. WO 93/07278; la regeneración del arroz siguiendo la transferencia del gen se encuentra en Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep. 7:379-384; Shimamoto et al. (1989) Nature 338:274-277 ; Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740; y la regeneración de cebada transgénica fértil por la transferencia de ADN directa a protoplastos se describe por Funatsuki et al. (1995) Theor. Appl . Genet. 51:707-712. Alternativamente, las plantas que contienen cromosomas artificiales se obtienen cruzando una planta que contiene un cromosoma artificial con otra planta para producir plantas que tienen un cromosoma artificial en sus genomas (véase por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,150,585). Las plantas que contienen un cromosoma artificial se propagan a través de las semillas, por labrado o vegetativamente. La semilla de las plantas que contienen un cromosoma artificial se cultivan en el campo, en vasijas, bajo techo, en el exterior, en invernaderos, en vasos, o en cualquier medio adecuado, y las plantas transgénicas resultantes sexualmente maduras se auto-polinizan para generar plantas de auténtica reproducción. La progenie a partir de estas plantas transgénicas llegan a ser líneas de auténtica reproducción (publicaciones de solicitud de PCT Internacional Nos. WO 00/60061 y EP 1017268; las Patentes Norteamericanas Nos. 5,631,152; 5,955,362; 6,015,940; 6,013,523; 6,096,546; 6,037,527; 6,153,812; Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Inc.; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833-839; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-608; Koziel et al. (1993) Bio/Technology 11:194-200; y Golovkin et al. (1993) Plant Sci . 90:41-52). 1. Los PAC Los cromosomas artificiales de planta (los PAC) se preparan por los métodos in vivo e in vi tro descritos en la presente . Los PAC pueden prepararse en los protoplastos de planta interiores y luego transferirse a objetivos de planta, en particular a otros protoplastos de la planta a través de la fusión en la presencia o ausencia de PEG como se describe en la presente (Draper et al. (1982) Plant Cell Physiol . 23:451-458; Krens et al. (1982) Nature 72-74). Los PAC se aislan a partir de los protoplastos en donde se prepararon, encapsularon en liposomas y suministraron a otros protoplastos de planta (Deshayes et al. (1985) E BO J. 4:2731-2737) . Alternativamente, los PAC se aislan y se suministran directamente a los protoplastos de la planta, células de la planta, u otros objetivos de planta a través del proceso mediado por PEG, proceso mediado por fosfato de calcio, electroporacion, microinyección, sonoporación, o cualquier método conocido en la técnica como se describe en la presente (Haim et al. (1985) Mol. Gen. Genet . 199:161-168; Fromm et al. (1986) Nature 319:791-793; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci . USA 82:5824-5828; Klein et al. (1987) Nature 327-70; Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:8502-8505; y publicación de solicitud PCT Internacional No. WO 91/00358) . 2. Los MAC Los cromosomas artificiales de mamífero (los MAC) se preparan por los métodos in vivo e in vitro descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,025,155 y 6,077,697, y solicitud PCT Internacional no. WO 97/40183. Los MAC se preparan como microcélulas , y las microcélulas se combinan con protoplastos de planta en la presencia o ausencia de PEG (Dudits et al. (1976) Hereditas 82:121-123; Wiegland et al. (1987) J. Cell. Sci. Pt . 2 145-149) . Alternativamente, los MAC se aislan y suministran directamente a células de plantas, protoplastos, y otra planta dirigida a un proceso mediado por PEG, proceso mediado por fosfato de calcio, electroporación, microinyección, sonoporación, o cualquier método conocido en la técnica como se describe en la presente y las Patentes Norteamericanas Nos. 6,025,155 y 6,077,697, y publicación de solicitud PCT Internacional No. WO 97/40183. Después que los PAC o los MAC se introducen en los objetivos de la planta y los objetivos de la planta se cultivan y analizan para transfección, los objetivos de planta transformados se desarrollan utilizando condiciones estándares en raíces, brotes, plántulas, o cualquier estructura capaz de cultivarse en una planta. Las plantas transgénicas pueden, a su vez, generarse por la plantación de raices transformadas, plántulas, semillas, plantones y estructuras capaces de cultivarse en una planta. Las plantas transgénicas pueden propagarse, por ejemplo, a través de semilla, por labrado o propagación vegetativa. I. Aplicaciones y Usos de Cromosomas Artificiales Los cromosomas artificiales proporcionan vectores convenientes y útiles, y en algunos casos (por ejemplo, en el caso de genes heterologos muy grandes) los únicos vectores, para introducción de genes heterologos en huéspedes. Virtualmente cualquier gen de interés es sensible a la introducción en un huésped a través de cromosomas artificiales . Como se describe en la presente, existen numerosos métodos para utilizar cromosomas artificiales para introducir secuencias de codificación en células de plantas. Estos incluyen métodos para utilizar cromosomas artificiales para expresar genes que codifican enzimas comercialmente valiosas y compuestos terapéuticos en células de plantas, introducción de atributos agronómicamente importantes o aplicaciones relacionadas a la manipulación de las regiones grandes del ADN. Los cromosomas artificiales provistos en la presente pueden utilizarse en métodos para la producción del producto de proteína y genético, particularmente utilizando células de plantas como células huésped para la producción de tales productos, y en sistemas de producción celular en donde los cromosomas artificiales proporcionan un medio confiable, estable y eficiente para optimizar la biof bricación de compuestos importantes para la medicina e industria. Se pretenden también para utilizarse en métodos de terapia genética y para la producción de organismos transgénicos, particularmente plantas (discutidas anteriormente, después y en los EJEMPLOS) . 1. Producción de productos en plantas Los métodos para la expresión de proteínas heterólogas en células de plantas ("cultivo molecular") se proporcionan. En la presente, muchas proteínas extrañas se han expresado en plantas enteras o se han seleccionado organismos de plantas . Las plantas pueden ofrecer un medio altamente efectivo y económico para producir proteínas recombinantes como puede cultivarse a una gran escala a costo modesto. La producción de proteínas heterologas en plantas ha incluido genes que se combinan a promotores de planta fuertes, constitutivos (por ejemplo, 35S del virus de mosaico de coliflor (Sijmons et al., 1990, Bio/Technology, 8:217-221, Benfey and Chua, US 5,110,732, Fraley et al., US 5,858,742, McPherson and Kay, US 5,359,142); promotores específicos de semilla (Hall et al., US 5,504,200, Knauf et al., US 5,530,194, Thomas et al., US 5,905,186, Moloney, US 5,792,922, US 5,948,682) o promotores activos en otros organismos de plantas tales como fruta (Radke et al., 1988, Theoret, Appl . Genet . , 75:685-694, Bestwick et al., US 5,783,394, Houck and Pear, US 4,943,674) u organismos de almacenamiento tales como tubérculos (Rocha-Sosa et al., US 5,436,393, US 5,723,757). Los genes bajo el control de estos promotores pueden ser cualquier proteína e incluyen, por ejemplo, genes que codifican receptores, citocinas, enzimas, proteasas, hormonas, factores de crecimiento, anticuerpos, genes supresores de tumor, vacunas, productos terapéuticos y trayectorias de genes múltiples. Por ejemplo, las enzimas industriales que pueden producirse incluyen, por ejemplo, a-amilasa, glucanasa, fitasa y xilanasa (véase, Goddijn and Pen (1995) Trends Biotechnol, 13:379-387 ; Pen et al. (1992) Bio/Technology 10:292-296; Horvath et al. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 57:1914-1919; y por ejemplo, Herbers and Sonnewald (1995) in Transgenic Plants: A Production System fox Industrial and Pharmaceutical Proteins" O en and Pen Eds, John Wiley & Sons, West Sussex, England) , proteasas tales como subtilisina y otras enzimas industrialmente importantes. Las proteínas adicionales que pueden producirse en cultivos por cultivo molecular incluyen otras enzimas industriales, por ejemplo, proteasas, enzimas que modifican el carbohidrato tales como oxidasa de glucosa, celulasas, hemicelulasas , xilanasas, mananasas o pectinasas, (por ejemplo, Baszcynski et al., US 5,824,870, US 5,767,379, Bruce et al., US 5,804,694). Adicionalmente , la producción de enzimas particularmente valiosas en la industria de la pulpa y el papel tales como ligninasas o xilanasas también pueden expresarse, (Austin-Philips et al., US 5,981,835). Otros ejemplos de enzimas incluyen fosfatasas, oxidoreductasas y fitasas. (van Ooijen et al., US, 5,714,474). Adicionalmente, se ha propuesto la expresión y suministro de vacunas en plantas (Arntzen and Lam, US 6,136,320, US, 5,914,123, Curtiss and Cardineau, US 5,679,880, US 5,679,880, US 5,654,184, Lam and Arntzen, US 5,612,487, US 6,034,298, Rymerson et al., WO 9937784A1, así como anticuerpos (Conrad et al. WO 972900A1, Hein et al., US 5,959,177, Hiatt and Hein, US 5,202,422, US 5,639,947, Hiatt et al., US 6,046,037), hormonas peptídicas (Vandekerckhove, J.S., US 5,487,991, Brandle et al., W09967401A2 ) , factores sanguíneos y moléculas terapéuticas similares. La expresión de vacunas en plantas comestibles puede proporcionar un medio para suministro de fármaco el cual es de costo efectivo y particularmente adecuado para la administración de agentes terapéuticos en países rurales o subdesarrollados . El material de planta que contiene los agentes terapéuticos podría cultivarse e incorporarse en la dieta (Lam, D.M., and Arntzen, C.J., US 5,484,719). Similarmente , las plantas utilizadas para el alimento de animales puede diseñarse para expresar biológicos veterinarios que pueden proporcionar protección contra enfermedades de animales, (Rymerson et al., WO 9937784A1) . Los anticuerpos también pueden producirse en plantas, incluyendo, por ejemplo, una fusión genética que codifica una proteína Fv de cadena única de unión de antígeno (scFv) que reconoce la haptén oxazolona (Fiedler and Conrad (1995) Bio/Technology 13:1090-1093) e IgG (Ma et al. (1995) Science 268:716-719) . Los anticuerpos monoclonales para aplicaciones terapéuticas y diagnósticas son de particular interés . Ejemplos de biofarmacéuticos humanos que pueden expresarse en plantas incluyen, pero no se limitan a albúmina (Sijmons et al. (1990)), encefalinas (Vandekerckhove et al. (1989), lnterferon-a (Zhu et al. (1994) y G -CSF (Ganz et al. (1996) en Transgenic Plants : A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, Owen and Pen Eds . , John Wiley & Sons, West Sussex, England, pp. 281-297; y Sardana et al. (1998) in Methods in Biotechnology, Vol. 3: Reconibinant Proteins from Plants: Production and Isolation of Clinically Useful Co pounds', Cunningham and Porter Eds., Humana Press, New Jersey pp. 77-87) . Las células que contienen los cromosomas artificiales proporcionados en la presente pueden utilizarse ventajosamente en sistemas basados en células de plantas in vi tro para la producción de proteínas, particularmente varias proteínas a partir de una línea celular, tal como proteínas múltiples implicadas en una trayectoria bioquímica o vacunas multivalentes . Los genes que codifican las proteínas se introducen en los cromosomas artificiales que se introducen entonces en células de la planta. Las células de la planta útiles para este propósito son aquellas que crecen bien en el cultivo, o más preferiblemente, células de plantas capaces de ser regeneradas a plantas enteras . Las plantas pueden cultivarse entonces por métodos comunes para producir material de planta que comprende las proteínas heterólogas. Las proteínas heterólogas pueden someterse a purificación o el tejido de la planta o extractos de la misma pueden utilizarse directamente para vacunación, disminución de enfermedad, o procesamiento del material tal como blanqueado durante el procesamiento de pulpa y papel o conversión enzimática de materiales industriales de las materias primas. Alternativamente, los genes heterólogos de interés se transfieren en una producción de línea celular o en la línea de planta que ya contiene cromosomas artificiales en una manera que dirige el o los genes a los cromosomas artificiales. Las células o plantas se cultivan bajo condiciones por las que las proteínas heterólogas se expresan. Debido a que las proteínas se expresan a niveles elevados en un sistema cromosomal extra-genómico permanente estable, las condiciones selectivas no se requieren. La selección de las líneas huésped para usarse en sistemas de producción de proteína basados en cromosoma artificial está dentro de la habilidad de la técnica, pero con frecuencia dependerá de una variedad de factores, incluyendo las propiedades de la proteína heteróloga a producirse, la toxicidad potencial de la proteína en la célula huésped, cualesquiera requerimientos para modificación pos-translacional (por ejemplo, glicosilación, aminación, fosforilación) de la proteína, factores de transcripción disponibles en las células, el tipo del o de los elementos promotores que se utilizan para conducir la expresión del gen heterólogo, ya sea si la producción es completamente intracelular o la proteína heteróloga preferiblemente será secretada a partir de la célula, o será retirada o ubicada, y los tipos de enzimas de procesamiento en la célula. Los cromosomas artificiales pueden diseñarse como plataformas para la producción de moléculas específicas en las células de plantas. Por ejemplo, la producción de moléculas de mamífero complejas, tales como anticuerpos de cadena múltiple, requieren un número de actividades de proteína no encontrados normalmente en especies de plantas . Es posible producir un cromosoma artificial que comprenda todas las actividades de mamífero necesarias para producir anticuerpos humanos, correctamente modificados y procesados, introduciendo en el cromosoma artificial los genes necesarios para llevar a cabos estas actividades. Tales genes serían modificados, por ejemplo, colocando cada gen bajo el control de un promotor de planta, o colocando el gen control maestro, es decir, un gen que controla la expresión de varios genes, bajo el control de un promotor de planta. Alternativamente, los factores de control transcripcional de mamífero podrían introducirse, bajo el control de los promotores activos, para expresarse en una célula de planta y provocar la expresión de tales proteínas objetivo, por ejemplo, anticuerpos de cadena múltiple . En esta forma, se desarrollan los cromosomas artificiales de planta, cada uno capaz de soportar la producción eficiente de una clase específica de productos valiosos, por ejemplo, anticuerpos, factores de coagulación de sangre, etc. Asi, la producción de productos dentro de una clase, por ejemplo, anticuerpos humanos simplemente implicaría la introducción de secuencia que codifica el anticuerpo específico, sin la modificación en el cromosoma artificial diseñado específicamente para la producción de anticuerpos humanos. El cromosoma artificial comprendería todas las actividades genéticas requeridas para la propia expresión, traducción y modificación pos-translacional de anticuerpos humanos. Tales cromosomas artificiales pueden utilizarse en una variedad de aplicaciones, tales como, pero no limitadas a, la producción a gran escala de numerosos anticuerpos humanos específicos. Ventajas de células de plantas como líneas celulares huésped en la producción de proteínas recombinantes incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente: (1) las proteínas son modificadas pos-translacionalmente similares a los sistemas de mamífero, (2) las plantas pueden dirigirse a proteínas secretadas en compartimientos estables, secos, intracelulares de semillas llamados cuerpos de proteína de endosperma, que 'pueden fácilmente recolectarse, (3) la cantidad del producto recombinante que puede producirse enfoca niveles de escala industriales y (4) riesgos de salud debidos a la contaminación con patógenos/toxinas potenciales se minimizan. El sistema basado en cromosoma artificial para producción de proteína heteróloga tiene muchas características ventajosas. Por ejemplo, como se describe anteriormente, debido a que el ADN heterólogo se ubica en un cromosoma artificial extra-genómico, independiente (tan opuesto para insertarse aleatoriamente en un área desconocida del genóma de célula huésped o ubicado como el o los elementos extracromosomales proporcionando únicamente expresión transiente) , se mantiene establemente en una unidad de transcripción activa y no es sujeto a expulsión a través de la recombinación o eliminación durante la división celular. Por consiguiente, no es necesario incluir un gen de selección en las células huésped y así cultivar bajo condiciones selectivas es también innecesario. Además, debido a que los cromosomas artificiales son capaces dé incorporar grandes segmentos de ADN, copias múltiples del gen heterólogo y el o los elementos de promotor enlazados pueden retenerse en estos cromosomas, por lo que se proporcionan para expresión de alto nivel de las proteínas extrañas. Alternativamente, copias múltiples del gen pueden enlazarse a un elemento promotor único y varios genes diferentes pueden enlazarse a un complejo de polígeno combinado a un único promotor para la expresión de, por ejemplo, todas las proteínas claves que constituyen una trayectoria metabólica completa (véase, por ejemplo, Beck von Bodman et al . (1995) Biotechnology 13:587-591). Alternativamente, las copias múltiples de un solo gen pueden enlazarse operativamente a un solo promotor, o cada uno o una o varias copias pueden enlazarse a diferentes promotores o copias múltiples del mismo promotor. Adicionalmente, debido a que los cromosomas artificiales tienen una capacidad al menos no limitada para la integración y expresión de genes extraños, pueden utilizarse no únicamente para la expresión de genes que codifican productos finales de interés, sino también para la expresión de genes asociados con mantenimiento óptimo y manejo metabólico de la célula huésped, por ejemplo, genes que codifican factores de crecimiento, así como genes que facilitan la rápida síntesis de forma correcta del producto de proteína heteróloga deseada, por ejemplo, genes que codifican las enzimas de procesamiento y factores de transcripción como se describe anteriormente . Los cromosomas artificiales son adecuados para la expresión de cualesquiera proteínas o péptidos, incluyendo proteínas y péptidos que requieren modificación pos-translacional in vivo para su actividad biológica. Tales proteínas incluyen, pero .no se limitan a fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de longitud completa, y anticuerpos multiméricos , proteínas supresoras de tumor, anticuerpos y enzimas de origen natural o artificiales, proteínas de choque de calor, y otras. Así, tales "fábricas de proteínas" basadas en célula que emplean cromosomas artificiales pueden generarse utilizando cromosomas artificiales construidos con copias múltiples (teóricamente un número no limitado o al menos hasta un número ' de manera que el cromosoma artificial resultante es aproximadamente hasta del tamaño de un cromosoma genómico (es decir, endógeno) ) de genes que codifican proteina con promotores apropiados, o genes múltiples dirigidos por un promotor único, es decir, un complejo genético combinado (tal como una trayectoria metabólica completa en el sistema de expresión de planta; véase, por ejemplo, Beck von Bodman (1995) Biotechnology 33:587-591). Una vez que un cromosoma artificial se construye, puede transferirse a una especie de planta adecuada capaz de propagarse bajo condiciones de campo, o bajo condiciones que permitan la recuperación del producto pretendido. Los cultivos celulares de planta tales como algas pueden utilizarse en un sistema análogo a sistemas de cultivo celular de mamífero. La ventaja de los sistemas basados en plantas tales como éste incluye bajos costos de producción para crecimiento, relaciones de crecimiento rápidas y capacidad para producir económicamente una biomasa grande. Se demuestra la capacidad de los cromosomas artificiales para proporcionar expresión de elevado nivel de proteínas heterólogas en células huésped, por ejemplo, por análisis de células de mamífero que contienen un cromosoma artificial de mamífero, líneas celulares H1D3 y G3D5 descritas en la presente. El análisis de transferencia Northern del ARNm obtenido a partir de estas células revela que la expresión de genes resistentes a la higromicina y ß-galactosidasa en las células se correlacionan con el número de amplicones del o de los megacromosomas contenidos en la presente . Las plantas transgénicas que producen estos compuestos se hacen por la introducción y expresión de uno o potencialmente muchos genes utilizando los cromosomas artificiales proporcionados en la presente. La vasta disposición de posibilidades incluye, pero no se limita a, cualquier compuesto biológico el cual se produce actualmente por cualquier organismo tal como proteínas, ácidos nucleicos, metabolitos primarios e intermediarios, polímeros de carbohidrato, enzimas para uso en bioremediación, enzimas para modificar trayectorias que producen metabolitos de planta secundarias tales como flavonoides o vitaminas, enzimas que podría producir farmacéuticos y para introducir enzimas que podrían producir compuestos de interés a la industria de fabricación tal como al campo de los químicos y plásticos. Los compuestos se producen por la planta, se extraen en la cosecha y/o procesan, y utilizan para cualquier propósito útil actualmente reconocido tal como farmacéuticos, fragancias y enzimas industriales. Alternativamente, las plantas producidas de acuerdo con los métodos y composiciones proporcionados en la presente pueden hacerse para metabolizar ciertos compuestos, tales como desperdicios peligrosos, por lo que permite la bioremediacion de estos compuestos . Los cromosomas artificiales proporcionados en la presente pueden utilizarse en métodos de proteína y producción de producto genético, particularmente utilizando células de plantas como células huésped para la producción de tales productos, y en sistemas de producción celular en donde los cromosomas artificiales proporcionan un medio confiable, estable y eficiente para optimizar la biofabricación de compuestos importantes para la medicina e industria. 2. Alteración genética de organismos que poseen atributos deseados Los cromosomas artificiales se sitúan idealmente para preparar organismos, tales como plantas, que poseen ciertos atributos deseados, tales como, por ejemplo, resistencia a enfermedades, resistencia a condiciones ambientales rudas, patrones de crecimiento alterado y características físicas mejoradas. Con respecto a plantas, la elección de ácido nucleico particular que se suministrará a las células receptoras a través de cromosomas artificiales con frecuencia dependerá del propósito de la transformación. Uno de los mayores propósitos de transformación de cultivo y especies de árbol es agregar algunos atributos comercialmente deseables, agronómicamente importantes a la planta. Tales atributos incluyen, pero no se limitan a, atributos de entrada y salida tales como resistencia o tolerancia a herbicida, resistencia o tolerancia a insectos, resistencia o tolerancia a enfermedades (viral, bacterial, fúngico o nemátodo) , tolerancia y/o resistencia a la tensión, como se ejemplifica por la resistencia o tolerancia a sequía, calor, frió, hielo, humedad excesiva, tensión salina y tensión oxidativa, producción incrementada, contenido alimenticio y compaginación, apariencia física, esterilidad macho, deshidratación, resistencia, fecundidad, cantidad y calidad de almidón, cantidad y calidad de aceite, cantidad y calidad de proteína y composición de aminoácido. Puede ser deseable incorporar uno o más genes que confieran tales atributos deseables en plantas huésped. a. Resistencia a herbicida Los genes que codifican fosfinotricin acetiltransferasa [bar and pat) , genes de sintasa EPSP tolerantes a glifosato, el gen de enzima degradada glifosato gox que codifica glifosato oxidoreductasa, deh (que codifica una enzima deshalogenasa que inactiva dalapon) , resistencia a herbicida (por ejemplo, sulfonilurea e imidazolinona) acetolactato sintasa, y genes bxn (que codifican una enzima nitrilasa que degrada bromoxinil) son todos ejemplos de genes resistentes a herbicidas para usarse en la transformación de planta. Los genes bar y pat codifican para una enzima, fosfinotricin acetiltransferasa (PAT) , la cual inactiva el herbicida fosfinotricina y evita este compuesto a partir de inhibir enzimas de glutamina sintetasa. La enzima 5-enolpiruvilshikimato 3 -fosfato sintasa (EPSP sintasa) se inhibe normalmente por el herbicida N- (fosfonometil) glicina (glifosato) . Sin embargo, los genes se sabe que codifican enzimas sintasa EPSP resistentes a glifosato. El gen deh codifica la enzima dalapon deshalogenasa y confiere resistencia al herbicida dalapon. El gen bxn codifica para una enzima nitrilasa específica que convierte bromoxinilo a un producto de degradación no herbicida. b. Resistencia a insectos y otras plagas Los organismos resistentes a insectos pueden prepararse en donde la resistencia o susceptibilidad disminuida a enfermedades inducidas por insectos se confiere por la introducción en el organismo huésped o embrión o cromosomas artificiales que contienen ADN que codifica productos genéticos (por ejemplo, ribozomas y proteínas que son tóxicas a ciertos patógenos) que destruyen o atenúan patógenos o limitan el acceso de patógenos al huésped. Los genes resistentes a insectos potenciales que pueden introducirse en plantas a través de cromosomas artificiales incluyen genes de toxinas cristal Bacillus thuringiensis o genes Bt (véase, por ejemplo, Watrud et al. (1985) en Engineered Organis s and the Environment) . Los genes Bt pueden proporcionar resistencia a plagas lepidópteras o coleópteras tales como el Barrenador de Maíz Europeo (ECB) . Tales genes de toxina Bx incluyen los genes CryIA (b) y CrylA(c) . Los genes de endotoxina a partir de otras especies de B. thurlngiensis que afectan el crecimiento o desarrollo de insectos también pueden emplearse a este respecto. Las secuencias de gen Bt pueden modificarse para efectuar la expresión incrementada en plantas, y particularmente plantas monocotiledóneas . Los medios para preparar genes sintéticos se conocen bien en la técnica y se describen en, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,500,365 y 5,689,052. Ejemplos de tales genes de toxina Bt modificados incluyen un gen Bt CryIA (b) sintético (véase por ejemplo, Perlak et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 88:3324-3328) y el gen CrylA(c) sintético llamado 1800b (véase la publicación de Solicitud PCT No. WO 95/06128) . Ejemplos de los tipos de genes que pueden transferirse en plantas a través de cromosomas artificiales para generar plantas transgénicas resistentes a enfermedades ' y/o insectos incluyen, pero no se limitan a, los genes crylA(b) y crylA(c) que producen productos que son altamente tóxicos a dos plagas de insectos de arroz principales (barrenador de despojo y barrenador amarillo) (véase por ejemplo, Cheng et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95:2767-2772), genes cry3 que codifican productos que son tóxicos a insectos Coleópteros que atacan una variedad de plantas, incluyendo genes de granos y legumbres (véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,023,013), (por ejemplo, ADN que codifica tricotecen 3-0-acetiltransferasa) que confiere resistencia a tricotecenos tales como aquellos producidos por hongo de planta (por ejemplo, Fusarium) en plantas particularmente susceptibles a hongo (por ejemplo, trigo, centeno, cebada, avenas y maíz) (véase por ejemplo, publicación de solicitud PCT No. WO 00/60061) , y genes que implican trayectorias biosintéticas multi-genéticas que producen sustancias antipatogénicas que tienen un efecto nocivo en el crecimiento de patógenos de planta (véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,639,949). Los inhibidores de proteasa pueden también proporcionan resistencia a insectos (véase por ejemplo, Johnson et al. (1989) y tendrán asi utilidad en la transformación de la planta. El uso del gen II inhibidor de proteasa, pinll, a partir de tomate o papa puede ser particularmente útil. El efecto combinado del uso del gen pinll con un gen de toxina Bt puede producir actividad insecticida sinergística . Otros genes que codifican inhibidores del sistema digestivo de insecto, o aquellos que codifican enzimas o co-factores que facilitan la producción de inhibidores, también pueden ser útiles. Este grupo puede ejemplificarse por orizacistatina e inhibidores de amilasa tales como aquellos a partir de trigo y cebada. Los genes que codifican lectinas pueden conferir propiedades insecticidas adicionales o alternativas. Las lectinas (originalmente llamadas fitohemaglutininas) son proteínas que unen carbohidrato multivalente que tienen la capacidad para aglutinar glóbulos rojos a partir de un rango de especies. Las lectinas se han identificado como agentes insecticidas con actividad contra gorgojo, ECB y gusano de raíz (véase por ejemplo, Murdock et al. (1990) Phytochemistry 23:85-89; Czapla & Lang (1990) J. Econ. Entomol . 83:2480-2485) . Los genes de lectina que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, aglutinina de germen de cebada y trigo (WGA) y lectinas de arroz (Gatehouse et al. (1984) J. Sci . Food. Agrie. 35:373-380) . Los genes que controlan la producción de polipéptidos activos grandes y pequeños contra insectos cuando se introducen en las plagas de insectos, tales como por ejemplo péptidos lítico, hormonas peptídicas y toxinas y venenos, pueden también utilizarse en generar plantas resistentes a plagas. Por ejemplo, la expresión de estearasa de hormona juvenil, dirigida hacia las plagas de insectos específicas, pueden también resultar en actividad insecticida, o provocar discontinuación de metamorfosis (véase por ejemplo, Hammock et al. (1990) Nature 344:458-461) . Las plantas transgénicas que expresan genes que codifican enzimas que afectan la integridad de la cutícula del insecto son ejemplos adicionales de genes que pueden transferirse a plantas a través de cromosomas artificiales para conferir resistencia a insectos. Tales genes incluyen aquellos que codifican, por ejemplo, quitinasa, proteasas, lipasas y también genes para la producción de nicomicina, un compuesto que inhibe la síntesis de quitina, la introducción de cualquiera puede utilizarse para producir plantas resistentes a insectos. Los genes que afectan el cambio de piel de insectos, tales como aquellos que afectan la producción de ecdiesteroide UDP-glucosil transferasa, pueden también ser transgenes útiles. Los genes que codifican enzimas que facilitan la producción de compuestos que reducen la calidad nutricional de la planta huésped a plagas de insectos pueden también utilizarse para conferir resistencia a insectos en plantas. Puede ser posible, por ejemplo, conferir actividad insecticida en una planta alterando su composición de esterol . Los esteróles se obtienen por insectos a partir de su dieta y se utilizan para síntesis de hormona y estabilidad de membrana. Por lo tanto, las alteraciones en la composición de esterol de planta por expresión de genes que promueven directamente la producción de esteróles indeseables o aquellos que convierten esteróles deseables en formas indeseadas, podrían tener un efecto negativo en el crecimiento y/o desarrollo de insectos y por lo tanto dotar a la planta con actividad insecticida. Las lipoxigenasas son enzimas de plantas de origen natural que han mostrado exhibir efectos anti-nutricionales en insectos y para reducir la calidad nutricional de su dieta. Por lo tanto, las plantas transgénicas con actividad de lipoxigenasa mejorada pueden ser resistentes a la alimentación de insectos. Tripsacum dactyloides es una especie de pasto que es resistente a ciertos insectos, incluyendo el gusano de raíz de maíz. Tripsacum puede así incluir genes que codifican proteínas que son tóxicas a insectos o se implican en la biosíntesis de compuestos tóxicos a insectos. Tales genes pueden ser útiles para conferir resistencia a insectos. Se sabe que las bases de la resistencia a insectos en Tripsacum es genética, debido a que su resistencia ha sido transferida a Zea mays a través de cruces sexuales (Branson and Guss, 1972) . Se anticipa además que otro cereal, especie de planta monocotiledónea o dicotiledónea pueden tener genes que codifican proteínas que son tóxicas a insectos que podrían ser útiles para producir plantas resistentes a insectos. Las proteínas que codifican genes adicionales caracterizadas como teniendo actividad insecticida potencial también pueden utilizarse como transgenes de acuerdo con esto. Tales genes incluyen, por ejemplo, el inhibidor de tripsina capui (cpTl: Hilder et al., 1987) que puede utilizarse como un factor disuasivo del gusano de raíz, genes que codifican averraectina {Averrnectin and Abamectin, Campbell, W.C., Ed. , 1989; Ikeda et al., 1987) que pueden demostrar particular utilidad como un factor disuasivo del gusano de raiz del maíz, genes de proteína que inactivan el ribosoma y aún genes que regulan las estructuras de las plantas. Las plantas transgénicas que incluyen genes de anticuerpo de anti-insecto y genes que codifican las enzimas que pueden convertir un insecticida no tóxico (proinsecticida) aplicado en el exterior de la planta en un insecticida dentro de la planta también se contemplan, c. Resistencia a enfermedades Los organismos transgénicos , tales como plantas, que expresan genes que confieren resistencia o susceptibilidad reducida a enfermedades son de particular interés. Por ejemplo, el transgen puede codifican una proteína que es tóxica a un patógeno, tal como un virus, hongo, organismo que produce micotoxina, nemátodo o bacteria, pero que no es tóxico al huésped transgénico. Debido a que los múltiples genes pueden introducirse en un cromosoma artificial, una serie de genes que codifican una trayectoria genética implicados en la resistencia o tolerancia a la enfermedad pueden introducirse en plantas forrajeras. Por ejemplo, se sabe que con frecuencia numerosos genes se expresan en la invasión patogénica, normalmente uno o más "PR" o patógeno relacionado, proteínas que se expresan en respuesta a la invasión de un patógeno bacterial o fúngico de planta. Una o más de las proteínas implicadas para conferir resistencia a patógenos puede contenerse dentro de un cromosoma artificial y por lo tanto expresarse en una célula de planta, en particular una planta transgénica entera como se describe en la presente. Además, la producción de anticuerpos recombinantes Fv de una cadena en plantas puede extender el rango de posibilidades para la introducción de protección patogénica en plantas forrajeras (véase por ejemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature 366:469-472) . Se ha demostrado que la expresión de una proteína recubierta viral en una planta transgénica puede impartir resistencia a la infección de la planta por ese virus y quizás otros virus cercanamente relacionados (Cuozzo et al., 1988. Hemen ay et al., 1988, Abel et al., 1986). La expresión de los genes antisentido dirigidos en funciones virales esenciales puede también impartir resistencia a virus. Por ejemplo, un gen antisentido dirigido al gen responsable para la replicación de ácido nucleico viral puede inhibir la replicación y conducir a la resistencia a virus. La interferencia con otras funciones virales a través del uso de genes antisentido también pueden incrementar resistencia a virus. Además, puede ser posible conseguir resistencia a virus a través de otros enfoques, incluyendo, pero sin limitarse al uso de virus satélite. Los cromosomas artificiales se sitúan adecuadamente para transportar una multiplicidad de estos genes y secuencias de ADN que son útiles para conferir un rango amplio de resistencia a muchos patógenos . Los genes que codifican los "antibióticos peptidicos" asi llamados, patogénesis relacionada a proteínas (PR) , resistencia a toxina, y proteínas que afectan las interacciones de patógeno huésped tales como morfológicas pueden también ser útiles, particularmente para, conferir resistencia incrementada a enfermedades provocadas por bacterias y hongos. Los antibióticos peptidicos son secuencias polipeptídicas que son inhibidoras para cultivar bacterias y otros microorganismos. Por ejemplo, la clases de péptidos referidos como cepropinas y magaininas inhiben el crecimiento de especies may de bacterias y hongos. La expresión de proteínas PR en plantas monocotiledóneas tales como maíz pueden ser útiles para conferir resistencia a enfermedades bacteriales. Estos genes se inducen siguiendo el ataque patogénico en una planta huésped y han sido divididos en al menos cinco clases de proteínas (Bio, Linthorst, and Cornelissen, 1990) . Incluidas entre las proteínas PR son ß-1, 3-glucanasas , quitinasas, y osmotina y otras proteínas que se cree funcionan en la resistencia a la planta a organismos enfermos. Se han identificado otros genes que tienen propiedades anti-fúngicas, por ejemplo UDA (lectina de la ortiga urticante) y hevea (Broakaert et al., 1989; Barkai-Golan et al., 1978) . Se sabe que ciertas enfermedades de plantas son causadas por la producción de fitotoxinas. La resistencia a estas enfermedades puede lograrse a través de la expresión de un gen que codifica una enzima capaz de degradar o de otra manera inactivar la fitotoxina. Se contempla también que la expresión de genes que altera las interacciones entre la planta huésped y el patógeno puede ser útil en reducir la capacidad del organismo enfermo para invadir los tejidos de la planta huésped, por ejemplo, un incremento en el encerado de la cutícula de hojas u otras características morfológicas. d. Resistencia al ambiente o tensión La mejora de una estabilidad de planta para tolerar varias tensiones ambientales tales como, pero no limitados a, sequía, humedad en exceso, hielo, congelamiento, alta temperatura, sal y tensión oxidativa, también pueden efectuarse a través de la expresión de genes en la presente. Se propone que los beneficios puedan realizarse en términos de resistencia incrementada para congelar temperaturas a través de la introducción de una proteína "anticongelamiento" tal como aquella de los derivados Winter Flounder (Cutler et al., 1989) o del gen sintético de los mismos. La tolerancia al hielo mejorada puede también conferirse a través de expresión incrementada de glicerol-3-fosfato acetiltransferasa en cloroplastos (Wolter et al., 1992). La resistencia a la tensión oxidativa en algunas especies de cultivos (con frecuencia exacerbada por condiciones tales como temperaturas de heladas en combinación con intensidades de luz elevadas) pueden conferirse por la expresión de superóxido dismutasa (Gupta et al., 1993) , y pueden mejorarse por glutatión reductasa (Bowler et al., 1992). Tales estrategias pueden permitirse para tolerancia de congelamiento en campos recién emergidos así como extendiendo después la madurez superior que produce variedad a zonas de madurez relativa temprana. Se contempla que la expresión de genes que favorablemente afectan el contenido de agua de la planta, potencial total de agua, potencial osmótico, y rigidez, mejorará la capacidad de la planta para tolerar sequías. Como se utiliza en la presente, los términos "resistencia a la sequía" y "tolerancia a la sequía" se utilizan para referirse a una resistencia o tolerancia incrementada de la planta a la tensión inducida por una reducción en la disponibilidad de agua, cuando se compara a circunstancias normales, y la capacidad de la planta para funcionar y sobrevivir en ambientes de poca agua. La expresión de genes que codifican la biosintesis de solutos osmóticamente activos, tales como compuestos poliol, puede impartir protección contra sequía. Dentro de esta clase están los genes que codifican para manitol-L-fosfato deshidrogenasa (Lee and Saier, 1982) y trehalosa-6-fosfato sintasa (Keasen et al., 1992) . A través de la acción subsecuente de fosfatasas nativas en la célula o por la introducción y co-expresión de una fosfatasa especifica, estos genes introducidos resultarán en la acumulación de manitol o trehalosa, respectivamente, ambos de los cuales han sido bien documentados como compuestos protectores capaces de mitigar los efectos de la tensión. La acumulación del manitol en tabaco transgénico se ha verificado y los resultados preeliminares indican que las plantas que expresan altos niveles de este metabolito son capaces de tolerar una tensión osmótica aplicada (Tarczynski, et al. , 1992, 1993) . Similármente , la eficacia de otros metabolitos para proteger la función de enzima (por ejemplo, alanopina o ácido propiónico) o integridad de membrana (por ejemplo, alanopina) se ha documentado (Loomis et al., 1989) y por lo tanto la expresión de genes que codifican la biosintesis de estos compuestos podrían conferir resistencia a la sequía en una manera similar a, o complementaria a manitol. Otros ejemplos de metabolitos de origen natural que son osmóticamente activos y/o proporcionan algún efecto protector directo durante la sequía y/o desecación incluyen fructosa, eritritol (Coxson et al., 1992), sorbitol, dulcitol (Karsten et al., 1992), glucosilglicerol (Reed et al., 1984; ErdMann et al., 1992), sucrosa, estaquiosa (Koster and Leopold, 1988; Blackman, et al., 1992), rafinosa (Bernal-Lugo and Leopold, 1992), prolina (Rensburg et al., 1993), glicin betaína, ononitol y pinitol (Vernon and Bohnert, 1992) . El crecimiento del dosel continuo y la adaptabilidad reproductiva incrementada durante los momentos de tensión aumentará mediante la introducción y expresión de genes tales como aquellos que controlan los compuestos osmóticamente activos discutidos anteriormente y otros compuestos. Los genes que promueven la síntesis de un compuesto poliol osmóticamente activo incluyen genes que codifican las enzimas manitol-1-fosfato deshidrogenasa , trehalose-6-fosfatasa sintasa y mioinositol de O-metiltransferasa . Los cromosomas artificiales pueden transportar una multiplicidad de genes para proporcionar tolerancia a la tensión durable, por ejemplo, expresión concomitante de prolina y quetano y/o polioles . Se contempla que la expresión de proteínas específicas también puede incrementar la tolerancia a la sequía bajo ciertas condiciones o en ciertas especies de cultivo. Estas pueden incluir proteínas tales como Proteínas Embriogénicas Tardías (véase Dure et al., 1989). Todas las tres clases de las LEA se han demostrado en semillas maduras (es decir, desecamiento) . Dentro de las proteínas LEA, el Tipo II (tipo dehidrina) ha sido generalmente implicado en tolerancia a la sequía y/o desecación en partes de plantas vegetativas (es decir, Mundy and Chua, 1988; Piatkowski et al., 1990: Yamaguchi-Shinozaki et al., 1992). Recientemente, la expresión de un LEA de Tipo III (HVA-1) en tabaco se encontró que influye en la altura de la planta, madurez y tolerancia a la sequía (Fitzpatrick, 1993) . En el arroz, la expresión del gen HVA-1 influye en la tolerancia del déficit de agua y salinidad (Xu et al., 1996) . La expresión de genes estructurales a partir de todos los tres grupos LEA puede por lo tanto conferir tolerancia a la sequía. Otros tipos de proteínas inducidas durante la tensión acuosa incluyen proteasas tiol, aldolasas y transportadores de transmembrana (Guerrero et al., 1999), que pueden conferir varias funciones protectoras y/o de tipo de reparación durante la tensión por sequía. Se contempla también que genes que efectúan biosíntesis lipida y consecuentemente composición de membrana podría también ser útil en conferir resistencia a la sequía en la planta. Muchos de estos genes para mejorar resistencia a la ' sequía tienen modos complementarios de acción. Así, las combinaciones de estos genes podrían tener efectos aditivos y/o sinergísticos en mejorar la resistencia a la sequía en plantas. Muchos de estos genes también mejoran la tolerancia al congelamiento (o resistencia) : las tensiones físicas incurridas durante el congelamiento y sequía son similares en la naturaleza y pueden mitigarse en forma similar. El beneficio puede conferirse a través de expresión constitutiva de estos genes, pero los medios preferidos para expresar estos genes puede ser a través del uso de un promotor inducido por rigidez (tal como los promotores para los genes inducidos por rigidez descritos en Guerrero et al., 1990 y Shagan et al., 1993 que se incorporan en la presente para referencia) . Los patrones de expresión espacial y temporal de estos genes pueden facilitar a las plantas a resistir mejor la tensión. Se propone que la expresión de los genes que se implican con atributos morfológicos específicos que se permiten para las extracciones acuosas incrementadas a partir de secar el suelo sería benéfico. Por ejemplo, la introducción y expresión de genes que alteran las características de raíz puede mejorar la incorporación del agua. Se contempla también que la expresión de genes que mejoran la adaptabilidad reproductiva durante tiempos de tensión sería de valor significativo. Por ejemplo, la expresión de genes que mejoran la sincronía del derramamiento y receptividad de polen de las partes de la flor hembra, es decir, sedas, sería de beneficio. Además se propone que la expresión de genes que minimiza el aborto de granos durante tiempos de tensión incrementaría la cantidad de grano a cosecharse y consecuentemente ser de valor. Dado el papel global del agua en determinar el rendimiento, se contempla que permitir a las plantas utilizar agua más eficientemente, a través de la introducción y expresión de genes, mejorará el rendimiento global aún cuando la disponibilidad acuosa del suelo no se limite. Al introducir genes que mejoran la capacidad de las plantas para maximizar el uso del agua a través de un rango amplio de tensión en relación con la disponibilidad del agua, estabilidad de producción o consistencia de rendimiento puede realizarse . e. Características agronómicas de la planta Las plantas poseen atributos deseados que podrían, por ejemplo mejorar la utilidad, procesabilidad y valor comercial de los organismos en áreas tales como industrias, de planta agrícola u ornamental pueden también generarse utilizando cromosomas artificiales en la misma manera como se describe anteriormente para la producción de organismos resistentes a enfermedades. En tales casos, los cromosomas artificiales que se introducen en el organismo o productos genéticos que codifican ADN que contiene embrión que sirven para conferir el rasgo deseado en el organismo .

Por ejemplo, las plantas transgénicas que tienen propiedades de sabor mejoradas, estabilidad y/o calidad son de comercial interés. Un posible método para generar tales plantas puede incluir la expresión de transgenes, por ejemplo genes que codifican cistationina gamma sintasa (CGS) , que resulta en niveles de metionina libre incrementados (véase por ejemplo, publicación de Solicitud PCT no. O 00/55303) . Dos de los factores que determinan en donde las plantas forrajeras pueden cosecharse son la temperatura promedio diaria durante la estación de crecimiento y la longitud del tiempo entre las heladas . Dentro de las áreas en donde es posible cultivar un cultivo particular, existen limitaciones variantes en el tiempo máximo que se permite cultivar para madurar y cosecharse. Por ejemplo, una variedad para cultivarse en un área particular se selecciona por su capacidad para madurar y deshidratación al contenido de humedad cosechable dentro del periodo requerido de tiempo con máximo rendimiento posible. Por lo tanto, los cultivos de madurez variable se desarrollan para diferentes ubicaciones de crecimiento. Aparte de la necesidad para la deshidratación suficientemente para permitir la cosecha; es deseable tener máximo secamiento que toma lugar en el campo para minimizar la cantidad de energía requerida para el secado adicional pos-cosecha. También, entre más fácilmente un producto tal como grano puede deshidratarse, más tiempo está disponible para cultivar y rellenar el grano. Los genes que influyen la madurez y/o la deshidratación pueden identificarse e introducirse en las líneas de plantas utilizando técnicas de transformación para crear nuevas variedades adaptadas a diferentes ubicaciones de crecimiento o la misma ubicación de crecimiento, pero teniendo rendimiento mejorado a relación de humedad a cosecha. La expresión de genes que se implican en la regulación del desarrollo de planta puede ser especialmente útil . Los genes que mejorarían la resistencia y otras características de crecimiento de la planta pueden también introducirse en las plantas. La expresión de nuevos genes en plantas que confieren tallos más fuertes, sistemas de raíz mejorados, o evitan o reducen la disminución de espiga sería de gran valor al granjero. La introducción y expresión de genes que incrementan la cantidad total de fotoasimilato disponible por, por ejemplo, incrementando la distribución y/o intercepción de luz sería ventajoso. Además, la expresión de genes que incrementa la eficiencia de fotosíntesis y/o el dosel de las hojas incrementarla además ganancias en productividad. La expresión del gen fitocromo en plantas forrajeras puede ser ventajosa. La expresión de tal gen puede reducir el dominio apical, que confiere semi enanismo en una planta, e incrementa la tolerancia a la sombra (Patente Norteamericana No. 5,268,526). Tales enfoques permitirían el incremento de poblaciones de planta en el campo, f. Utilización de nutrientes La capacidad para utilizar nutrientes disponibles puede ser un factor limitantes en el crecimiento de plantas forrajeras. Puede ser posible alterar la incorporación de nutrientes, tolerar pH extremos, movilización a través de la planta, agrupaciones de almacenamiento, y disponibilidad para actividades metabólicas por la introducción de nuevos agentes. Estas modificaciones permitirían a una planta tal como maíz utilizar más eficientemente nutrientes disponibles. Un incremento en la actividad de, por ejemplo, una enzima que se presenta normalmente en la planta y está implicada en la utilización de nutriente puede incrementar la disponibilidad de un nutriente. Un ejemplo de tal enzima sería fitasa. Se contempla además que la utilización de nitrógeno mejorado por una planta es deseable. La expresión de un gen de glutamato deshidrogenasa en plantas, por ejemplo, genes E. coli gdhA puede conducir a resistencia mejorada al- herbicida glufosinato por la incorporación de amoniaco en exceso en glutamato, desintoxificando consecuentemente el amoniaco. La expresión genética puede realizar una fuente nutriente disponible que no fue previamente accesible, por ejemplo, una enzima que libera un componente de valor nutriente de una molécula más compleja, tal vez una macromolécula . Alternativamente los cromosomas artificiales pueden transportar la multiplicidad de genes que gobiernan la nodulación y fijación del nitrógeno en leguminosas. Los cromosomas artificiales podrían utilizarse para promover la nodulación en especies no leguminosas . g. Esterilidad macho La esterilidad macho es útil en la producción de semillas híbridas. La esterilidad macho puede producirse a través de la expresión genética. Por ejemplo, se ha mostrado que la expresión de genes que codifican proteínas que interfieren con el desarrollo de la inflorescencia macho y/o gametofito resulta en esterilidad macho. Los genes de ribonucleasa quiméricos que expresan en las anteras del tabaco transgénico y colza de semilla de aceite se han demostrado para conducir a esterilidad macho ( ariani et al., 1990) . Otros métodos para conferir esterilidad macho se han descrito, incluyendo un ARN antisentido que codifica el gen capaz de provocar esterilidad macho (Patentes Norteamericanas Nos. 6,184,439, 6,191,343 y 5,728,926) y métodos que utilizan dos genes para conferir esterilidad, véase por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,426,041. Se descubrieron un número de mutaciones en maíz que confieren esterilidad macho citoplásmica . Una mutación en particular, se refiere como citoplasma T, también se correlaciona con la sensibilidad a quemadura de hoja de maíz Southern. Una secuencia de ADN, designada TURF-13 (Levings, 1990) , se identificó que se correlaciona con el citoplasma T. Se propone que sería posible a través de la introducción de TURF-13 a través de la transformación, separar la esterilidad macho de la sensibilidad de enfermedad. A medida que sea necesario ser capaz de restaurar la fertilidad macho para propósitos de reproducción y para la producción de grano, se propone que los genes que codifican la restauración de la fertilidad macho pueden también introducirse. h. Contenido nutricional mejorado Los genes pueden introducirse en plantas para mejorar la calidad o contenido de nutriente de un cultivo particular. La introducción de genes que alteran la composición de nutriente de un cultivo puede mejorar en gran medida el forraje o el valor alimenticio. Por ejemplo, la proteína de muchos granos es subóptima para forraje o propósitos alimenticios especialmente cuando se alimenta a puercos, aves de corral y humanos. La proteína es deficiente en varios aminoácidos que son esenciales en la dieta de estas especies, requiriendo la adición de suplementos al grano. Los aminoácidos esenciales limitantes pueden incluir lisina, metionina, triptofano, treonina, valina, arginina, e histidina. Algunos aminoácidos llegan a ser limitantes únicamente después que se suplementa el maíz con otras ingestiones para formulaciones alimenticias. Los niveles de estos aminoácidos esenciales en semillas y granos pueden elevarse por mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, la introducción de genes para incrementar la biosíntesis de los aminoácidos, incrementar el almacenamiento de los aminoácidos en proteínas, o incrementar el transporte de los aminoácidos a las semillas o grano. La composición de proteína de un cultivo puede alterarse o mejorar el balance de aminoácidos en una variedad de maneras que incluyen elevar la expresión de proteínas nativas, disminuyendo la expresión de aquella con composición deficiente, cambiando la composición de proteínas nativas, o introduciendo genes que codifican completamente nuevas proteínas que poseen composición superior. La introducción de genes que alteran el contenido oleoso de una planta forrajera puede también ser de valor. Los incrementos en contenido oleoso pueden resultar en incrementos en contenido de energía metabolizable y densidad de semillas para usarse en forraje y alimentos. Los genes introducidos pueden codificar enzimas que remueven o reducen las limitaciones de proporción o etapas reguladas en ácido graso o biosíntesis de lípido. Tales genes pueden incluir, pero no se limitan a, aquellas que codifican acetil-CoA carboxilasa, ACP-aciltransferasa, ß-ketoacil-ACP sintasa, más otras actividades biosintéticas de ácido graso bien conocidas. Otras posibilidades son los genes que codifican proteínas que no poseen actividad enzimática tal como proteínas portadoras de acilo. Pueden introducirse genes que alteran el balance de ácidos grasos presentes en el aceite proporcionando un forraje más saludable o nutritivo. El ADN introducido también puede codificar secuencias que bloquean la expresión de enzimas implicadas en biosíntesis de ácido graso, alterando las proporciones de ácido graso presentes en los cultivos. Pueden introducirse genes que mejoran el valor nutritivo del componente de almidón de los cultivos, por ejemplo, incrementando, o en algunos casos disminuyendo, el grado de ramificación, resultando en utilización mejorada del almidón en ganado retardando su metabolismo. Adicionalmente, otros constituyentes principales de un cultivo pueden alterarse, incluyendo genes que afectan una variedad de otros procesamientos nutritivos u otros aspectos de calidad. Por ejemplo, la pigmentación puede incrementarse o disminuirse. El forraje o cultivos alimenticios pueden también poseer cantidades insuficientes de vitaminas, requiriendo suplemento para proporcionar el valor nutritivo adecuado. La introducción de genes que mejoran la biosíntesis de vitamina puede visualizarse incluyendo, por ejemplo, vitaminas A (por ejemplo arroz con Vitamina A o arroz dorado) , E, B12 colina, y similares . El contenido mineral puede también ser sub-óptimo. Estos genes que afectan la acumulación o disponibilidad de compuestos que contienen fósforo, azufre, calcio, manganeso, zinc y hierro entre otros serían valiosos. Otros numerosos ejemplos de mejoras de cultivos pueden efectuarse utilizando los cromosomas artificiales, con genes heterólogos apropiados contenidos en la presente, de acuerdo con los métodos y composiciones proporcionados en la presente. Las mejoras pueden no implicar necesariamente el grano, pero pueden, por e emplo, mejorar el valor de un cultivo para ensilaje. La introducción de ADN para lograr esto podrían incluir secuencias que alteran la producción de lignina de manera que aquellos que resultan en el fenotipo de "arteria central café" asociado con valor alimenticio superior para ganado. Además para dirigir mejoras en forraje o valor alimenticio, los genes también pueden introducirse los cuales mejoran el procesamiento de cultivos y mejoran el valor de los productos que resultan a partir del procesamiento. Un uso de los cultivos es a través de molienda en húmedo. Así, los genes que incrementan la eficiencia y reducen el costo de tal procesamiento, por ejemplo, disminuyendo el tiempo de impregnación pueden también encontrar uso. Al mejorar el valor de productos de molienda en húmedo puede incluir alterar la cantidad o calidad de almidón, aceite, harina de gluten de maíz, o los componentes de forraje de gluten. La elevación del almidón puede lograrse a través de la identificación y eliminación de las etapas que limitan la velocidad en la biosíntesis de almidón o disminuyendo los niveles de otros componentes de cultivos que resultan en incrementos proporcionales en almidón. El aceite es otro producto de molienda en húmedo, el valor del cual puede mejorarse por la introducción y expresión de genes. Las propiedades oleosas pueden alterarse para mejorar su rendimiento en la producción y uso de aceite para cocinar, materia grasa, lubricantes u otros productos derivados de aceite o mejoras de sus atributos, saludables cuando se utiliza en las aplicaciones relacionadas a alimentos. Los ácidos grasos también pueden sintetizarse los cuales a la extracción pueden servir como materiales de partida para síntesis química. Los cambios en las propiedades oleosas pueden lograrse alterando el tipo, nivel o disposición de lípido de los ácidos grasos presentes en el aceite. Esto a su vez puede lograrse por la adición de genes que codifican enzimas que catalizan la síntesis de nuevos ácidos grasos y los lípidos que los poseen o incrementando los niveles de ácidos grasos nativos mientras posiblemente reduce niveles de los precursores. Alternativamente, las secuencias de ADN pueden introducirse en etapas lentas o de bloque en biosíntesis de ácido graso que resultan en el incremento de los intermediarios de ácido graso precursores. Los genes que podría agregarse incluyen desaturasas, epoxidasas, hidratasas, deshidratasas y otras enzimas que catalizan las reacciones que implican los intermedios de ácido graso. Los ejemplos representativos de las etapas catalíticas que podrían bloquearse incluyen las desaturaciones a partir del ácido esteárico u oleico y el ácido oleico a linolénico que resulta en las acumulaciones respectivas de ácidos esteárico y oleico. Otro ejemplo es el bloqueo de etapas de alargamiento que resultan en la acumulación de ácidos grasos saturados de C8 a C12. i. Producción de productos químicos y biológicos Las plantas transgénicas pueden utilizarse como sistemas de producción de proteína para generar productos recombinantes que varían de enzimas industriales, antígenos virales, vacunas, anticuerpos, proteínas sanguíneas humanas, citocinas, factores de . crecimiento , encefalinas, albúmina de suero y otras proteínas de relevancia clínica y productos farmacéuticos. Por ejemplo, las enzimas que incluyen a-amilasa, glucanasa, fitasa y xilanasa (véase Goddjin and Pen (1995) Trends Biotechnol. 13 : 379-387 ; Pen et al. (1992) Bio/Technology 10:292-296; Horvath et al. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 57:1914-1919 ; y por ejemplo, Herbers and Sonnewald (1996) en Transgenic Plants : A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins" Owen and Pen Eds . , John Wiley & Sons, West Sussex, England) . Ejemplos de proteínas médicamente relevantes que pueden producirse en plantas incluyen antígenos de superficie de patógenos virales, tales como virus de la hepatitis B y proteína de espiga del virus de gastroenteritis transmisible, para uso en vacunas . Las proteínas así producidas pueden aislarse y administrarse a través de métodos de introducción de vacuna estándar o a través del consumo de planta transgénica comestible como alimento la cual puede tomarse oralmente (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,136,320 y Masón et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 85:11745-11749) . Los antígenos de VIH, rinovirus, malaria y virus de rabia son ejemplos adicionales ¦ de que puede expresarse en plantas como vacunas candidatas (véase, por ejemplo, Porta et al. (1994) Virol, 202:949-955; Turpén et al. (1995) Bio/Technology 13:53-57; y McGarvey et al. (1995) Bio/Technology 13:1484-1487) . Los anticuerpos pueden también producirse en plantas, incluyendo por ejemplo, una fusión genética que codifica una proteína Fv de cadena única que une antígeno (scFv) que reconoce la hapten oxazolona (Fiedler and Conrad (1995) Bio/Technology 13:1090-1093) e IgG (Ma et al. (1995) Science 268:716-719) . Ejemplos de biofarmacéuticos humanos que pueden expresarse en plantas incluyen, pero no se limitan a, albúmina (Sijmons et al. (1990)), encefaliñas (Vandekerckhove et al. (1989), interferon-a (Zhu et al. (1994) y GM-CSF (Ganz et al. (1996) in Transgenic Plant: A Production system for Industrial and Pharmaceutical Proteins, Owen and Pen Eds . , John Wiley & Sons, West Sussex, England, p . 281-297; and Sardana et al. (1998) en Methods in Biotechnology, Vol . 3: Recombinant Proteins from Plants: Production and Isolation of Clinically Useful Co pounds, Cunningham and Porter, Eds . , Humana Press, New Jersey; pp. 77-87) . Las plantas transgénicas que producen estos compuestos se hacen posibles por la introducción y expresión de uno o potencialmente muchos genes utilizando los cromosomas artificiales proporcionados en la presente. La vasta disposición de posibilidades incluye, pero no se limita a, cualquier compuesto biológico que se produce actualmente por cualquier organismo tal como proteínas, ácidos nucleicos, metabolitos primarios e intermediarios, polímeros carbohidratos, enzimas para usos en bioremediación, enzimas para modificar trayectorias que producen metabolitos de planta secundarios tales como flavonoides o vitaminas, enzimas que podrían producir farmacéuticos y para introducir enzimas que podrían producir compuestos de interés a la industria de la fabricación tales como químicos de especialidad y plásticos. Los compuestos pueden producirse por la planta, extraerse en la cosecha y/o procesamiento, y utilizando para cualquier propósito útil actualmente reconocido tal como farmacéuticos, fragancias y enzimas industriales por nombrar unos cuantos. Alternativamente, las plantas producidas de acuerdo con los métodos y composiciones proporcionados en la presente pueden hacerse para metabolizar ciertos compuestos, tales como desperdicios peligrosos, permitiendo consiguientemente la bioremediación de estos compuestos . j . Secuencias que no expresan proteína Los ácidos nucleicos pueden introducirse en las plantas que se designan para desregular o suprimir un gen que codifica la planta. Un número de diferentes medios para lograr la desregulación se han demostrado en la técnica, incluyendo ARN antisentido, ribozimas y co- supresión . Se describe el uso de ARN antisentido para suprimir los genes de planta, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,801,540, 5,107,065 y 5,453,566. En tales métodos, un gen "antisentido" se construye, el cual codifica un ARN que es complementario al ARNm de un gen de planta residente, de manera que la expresión del gen antisentido inhibe la traducción del ARNm del gen de planta residente. Así, la actividad del gen residente se desregula. Un método adicional para desregular actividades genéticas implica ribozimas, o estructuras de ARN de horquilla de cabeza de martillo catalítica. El uso de ribozimas se describe por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,987,071, 5,037,746, 5,116,742 y 5,354,855. Estos métodos se basan en la expresión de moléculas de ARN "de cabeza de martillo" pequeñas catalíticas que son capaces de unirse a y desdoblar las secuencias de ARN especificas. Las ribozimas designadas para reconocer específicamente un ARNm de planta residente puede utilizarse para desdoblar el ARNm y evitar su propia expresión. Esencialmente, un control de desregulación más o menos equivalente de actividades genéticas por ribozimas y antisentido pueden lograrse agregando copias adicionales del gen para ser regulado. El proceso se refiere como co-supresión y se describe en, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,034,323, 5,283,184 y 5,231,020. Numerosos genes de planta pueden dirigirse para desregulación. Por ejemplo, un gen puede desregularse el cual codifica una enzima que cataliza una reacción en una planta. La reducción de la actividad enzimáti'ca puede reducir o eliminar productos de la reacción los cuales incluyen cualesquier compuestos enzimáticamente sintetizados en la planta tal como ácidos grasos, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y similares. Alternativamente, la proteína puede ser una proteína de almacenamiento, tal como zeina, o una proteina estructural, la expresión disminuida de la cual puede conducirse a cambios en la composición de aminoácido de semilla o cambios morfológicos de planta, respectivamente. Las posibilidades citadas anteriormente se proporcionan únicamente a manera de ejemplo y no representan el rango completo de aplicaciones. (1) . ARN Antisentido Pueden construirse genes, los cuales cuando se transcriben, producen ARN antisentido que es complementario a toda o todas las partes de uno o unos ARN mensajeros objetivo. El ARN antisentido reduce la producción del producto polipeptídico del ARN mensajero. El producto de polipéptido puede ser cualquier proteína codificada por el genoma de planta. Los genes antes mencionados se referirán como genes antisentido. Un gen antisentido puede asi introducirse en una planta por los métodos de transformación para producir una planta transgénica con expresión reducida de una proteína seleccionada de interés. Por ejemplo, la proteína puede ser una enzima que cataliza una reacción en la planta. La reducción de la actividad enzimática puede reducir o eliminar productos de la reacción que incluyen cualquier compuestos enzimáticamente sintetizado en la planta tal como ácidos grasos, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y similares. Alternativamente, la proteína puede ser una proteína de almacenamiento, tal como zeína, o una proteína estructural, la expresión disminuida la cual puede conducir a cambios en composición de aminoácido de semilla o cambios morfológicos de planta respectivamente. Las posibilidades citadas anteriormente se proporcionan únicamente a manera de ejemplo y no representan el rango total de aplicaciones. (2) Ribozimas Pueden construirse o aislarse también genes, que cuando se transcriben, producen enzimas de ARN (ribozimas) que pueden actuar como endoribonucleasas y catalizar el desdoblamiento de moléculas de ARN con secuencias seleccionadas. El desdoblamiento de los ARN mensajeros seleccionados puede resultar en la producción reducida de sus productos polipéptidos codificados. Estos genes pueden utilizarse para preparar plantas transgénicas que las poseen. Las plantas transgénicas pueden poseer niveles reducidos de polipéptidos que incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos citados anteriormente. Las ribozimas son complejos de proteína de ARN que desdoblan los ácidos nucleicos en una forma sitio-específica. Las ribozimas tienen dominios catalíticos específicos que poseen actividad de endonucleasa (Kim and Cech, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster and Symons , 1987) . Por ejemplo, un gran ¦ número de ribozimas aceleran las reacciones de transferencia de fosfoéster con un grado elevado de especificidad, con frecuencia desdoblando únicamente uno de los varios fosfoésteres en un sustrato oligonucleótido (Cech et al., 1981; Michel and esthof , 1990) ; Reinhold-Hurek and Shub, 1992) . Esta especificidad se ha atribuido al requerimiento que el sustrato une a través de interacciones de pares de bases específicas a la secuencia guía interna ("IGS") del ribozima anterior a la reacción química.

La catálisis de ribozima ha sido principalmente observada como parte de reacciones de desdoblamiento/ligación específica de secuencia que implican los ácidos nucleicos (Joyce, 1989; Cech et al., 1981) . Por ejemplo, la Patente Norteamericana 5,354,855 reporta que ciertos ribozxmas pueden actuar como endonucleasas con una especificidad de secuencia mayor que aquella de las rxbonucleasas conocidas y enfocando aquella de las enzimas de restricción de ADN. Varias causas de ribozima diferentes han sido descritas con actividad de desdoblamiento de ARN (Symons, 1992) . Ejemplos incluyen secuencias a partir del Grupo I auto empalmando intrones que incluyen Virus de Mosaico en Anillo del Tabaco (Prody et al., 1986), Virus de Mancha Solar del Aguacate (Palukaitis et al., 1979; Symons, 1981) y Virus Veteado Transitorio de la Alfalfa (Forster and Symons, 1987) . Las secuencias a partir de estos y los virus relacionados se refieren como ribozima de cabeza de martillo basadas en una estructura secundaria doblada predicha. Otras ribozxmas adecuadas incluyen secuencias a partir de RNasa P con actividad de desdoblamiento de ARN (Yuan et al., 1992; Yuan and Altman, 1994; las Patentes Norteamericanas Nos. 5,168,053 y 5,624,824), estructuras de ribozima de horquilla (Berzal-Herranz et al., 1992; Chowrira et al., 1993) y ribozxmas basadas en el virus de Hepatitis Delta (Patente Norteamericana 5,625,047). El diseño general y optimización de la actividad que desdobla el AR dirigido a ribozima se ha discutido en detalle (HaselhofZf and Gerlach, 1988 ; Symons, 1992; Chowrira et al., 1994; Traornpson et al., 1995) . La otra variable en el diseño de ibozima es la selección de un sitio de desdoblamiento en u_n ARN objetivo dado . Las ribozimas se dirigen a una secuencia dada en virtud de endurecer a un sitio por interacciones de pares de bases complementarias. ¡Dos estiramientos de homología se requieren para este objetivo. Estos estiramientos de secuencias homologas flanquean la estructura de riboz; ima catalítica definida anteriormente. Cada estiramiento de secuencia homologa puede variar en longitud de 7 a 15 nucleótidos. El único requerimiento para definir las secuencias homologas es ese, en el ARN objetivo, estas se separan por una secuencia específica la cual es el sitio de desdoblam ento. Para una ribozima de cabeza de martillo, el sitio de desdoblamiento es una secuencia dinucleótido en el ARN objetivo que consiste de uracilo (U) seguido ya sea por adenina, citosina o uracilo (A, C o U) (Perriman et al., 1992; Thompson et al., 1995) . La frecuencia de este dinucleótido que ocurre en cualquier ARN dado es estadísticamente 3 de entre 16. Por lo tanto, para un ARN mensajero objetivo dado de 1,000 bases, 187..sitios de desdoblamiento de dinucleótido son estadísticamente posibles. El diseño y experimentación de ribozimas para desdoblamiento eficiente de ARN objetivo es un proceso bien conocido por aquellos expertos en la técnica. Ejemplos de métodos científicos para diseñar y probar ribozimas se describe por Chowrira et al. (1994) and Lietser and Strauss (1995) / cada uno incorporado para referencia. La identificación de secuencias operativas y preferidas para uso en la desregulación de un gen dado es simplemente una sustancia para preparar y probar una secuencia dada, y es un método de "selección" rutinariamente practicado conocido por aquellos expertos en la técnica. (3) Inducción del silenciador genético Es también posible que los genes puedan introducirse para producir plantas transgénicas que tienen expresión reducida de un producto genético . nativo por el mecanismo de co-supresión. Se ha demostrado en el tabaco, tomate Y la petunia (Goring et al., 1991; Smith et al., 1990; Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 1990) que la expresión del sentido de la transcripción de un gen nativo reducirá o eliminará la expresión del gen nativo en una manera similar a aquella observada para genes antisentido. El gen introducido puede codificar toda o parte de la proteína nativa objetivo, pero su traducción puede no requerirse para la reducción de niveles de esa proteína nativa . (4) . Secuencias que no expresan ARN Los elementos de ADN que incluyen aquellos elementos trasladables tales como Ds, Ac o MU, pueden insertarse en un gen para provocar mutaciones. Estos elementos de ADN pueden insertarse para inacti~var (o activar) un gen y consecuentemente "etiqueta" un rasgo particular. En este caso el elemento transladable no provoca inestabilidad de la mutación etiquetada, debido a que la utilidad del elemento no depende de su capacidad para moverse en el genoma . Una vez que un rasgo deseado se etiqueta, la secuencia de ADN introducida puede utilizarse para clonar el gen correspondiente, por ejemplo, utilizando la secuencia de ADN introducida como un cebador de PCR junto con el gen PCR que clona técnicas (Shapiro, 1983; Dellaporta et al., 1988). Una vez identificados, los genes completos para el rasgo particular, incluyendo regiones control o reguladoras, cuando se desee, pueden aislarse, clonarse y manipularse como se desee. La utilidad de los elementos de ADN introducidos en un organismo para propósitos del objetivo del gen es independiente de la secuencia de ADN y no depende de cualquier actividad biológica de la secuencia de ADN, es decir, transcripción en el ARN o traducción en la proteina. La única función del elemento ADN es interrumpir la secuencia de ADN de un gen. Se contempla que las secuencias de ADN no expresadas, incluyendo secuencias sintéticas, podrían introducirse en células como "marcas" de propiedad de aquellas células y plantas y semillas de las mismas. No sería necesario para un elemento de ADN de marca interrumpir la función de un gen endógeno al organismo huésped, 'ya que la única función de este ADN sería identificar el origen del organismo- P°r ejemplo, se podría introducir una secuencia de ADN única en una planta y este elemento de ADN identificaría todas las células, plantas y progenie de estas células como habiéndose elevado de esa fuente marcada. Se propone que la inclusión de los ADN marcados permitiría distinguir el plasma germina-i ° plasma germinal propietario derivado de los mismos, a partir de plasma germinal no marcado - Otro posible elemento el cual puede introducirse en un elemento de región de unión de. matriz (MAR) , tal como el elemento A de lisozima de pollo (Stief , 1989) , que puede colocarse alrededor de un gen expresable de interés para efectuar uri incremento en la expresión total del gen y disminuir los efectos dependientes de la posición de la incorporación del genoma de planta (Stief et al., 1989; Phi-Van et al., 1990) . Las secuencias tales como las MAR pueden incluirse en el cromosoma artificial para mejorar la expresión genética. 3. Modelos transgénicos para evaluación de genes y descubrimiento de nuevos atributos De interés significativo es el uso de plantas y células de plantas que contienen cromosomas artificiales para la valuación de nuevas combinaciones genéticas y descubiertos de nuevos atributos. Los cromosomas artificiales, en virtud del hecho que pueden contener cantidades significativas de ADN pueden también por lo tanto codificar numerosos genes y por consiguiente una multi lici ad de atributos. Se contempla aquí que los cromosomas artificiales, cuando se forman de una especie de planta, pueden evaluarse en una segunda especie de planta. Los cambios fenotípicos resultantes observados por ejemplo, pueden indicar la naturaleza de los genes contenidos dentro del .ADN que contiene el cromosoma artificial, y por lo tanto permitir la identificación de nuevas actividades genéticas. Los cromosomas artificiales que contienen ADN eucromático o que contienen parcialmente ADN eucromático pueden servir como una fuente valiosa de nuevos atributos cuando se transfieren a un ambiente de célula de planta externa. Por ejemplo, se contempla- que los cromosomas artificiales derivados de especies de plantas dicotiledóneas pueden introducirse en especies de plantas monocotiledóneas transfiriendo un cromosoma artificial de dicotiledónea, el cromosoma artificial de dicotiledónea que contiene una región de ADN eucromático conteniendo genes expresados . Los cromosomas artificiales pueden generarse o manipularse en una forma que una región grande de ADN de planta de origen natural llega a incorporarse en el cromostnoma artificial. Esto permite al cromosoma artificial contener nuevas actividades genéticas y por lo tanto llevar nuevos atributos. Por ejemplo, un cromosoma artificial puede introducirse en un congénere silvestre de una planta de cultivo bajo condiciones por lo que una porción del ADN presente en los cromosomas del congénere silvestre se transfiere al cromosoma artificial. Después del aislamiento del cromosoma artificial, esta región de origen natural del ADN a partir del congénere silvestre, ahora ubicado en el cromosoma artificial puede introducirse en las especies de cultivo domesticadas y los genes que codifican dentro del ADN transferido expresados y evaluados para utilidad. Nuevos atributos y sistemas genéticos pueden descubrirse en esta forma . Los cromosomas artificiales modificados para recombinarse con el ADN de planta ofrecen muchas ventajas para el descubrimiento y evaluación de atributos en diferentes especies de plantas. Cuando el cromosoma artificial que contiene ADN a partir de una especie de planta se introduce en una nueva especie de planta, nuevos atributos y genes pueden introducirse. Este uso de un cromosoma artificial permitido para la capacidad para superar la barrera sexual que evita la transferencia de genes a partir de una especié de planta a otra especie. Utilizar cromosomas artificiales en esta forma permite para muchos atributos potencialmente -valiosos identificarse incluyendo atributos que se encuentra normalmente en especies silvestres. Otras aplicaciones valiosas para cromosomas artificiales incluyen la capacidad para transferir grandes regiones ele ADM a partir de una especie de planta a otra, el ADN" que codifica atributos potencialmente valiosos tales como aceite alterado, composición de carbohidrato o proteína,- genes múltiples que codifican enzimas capaces de producir metaboli os secundarios de planta valiosos, sistemas genéticos que codifican atributos agronómicos valiosos tales como enfermedades y resistencia a insectos, genes que codifican funciones que permiten la asociación con bacterias de suelo tal como bacterias que promueven el crecimiento o bacterias que fijan nitrógeno, o genes que codifican atributos que confieren tolerancias al hielo, sequía u otras tensiones. En esta forma, los cromosomas artificiales pueden U-tilizarse para descubrir regiones del ADN de planta que codifica los atributos valiosos. Los cromosomas artificiales pueden también diseñarse para permitir la transferencia e incorporación subsecuente de estos atributos valiosos ahora ubicados en el cromosoma artificial en los cromosomas naturales de una especie de planta. En esta forma, los cromosomas artificiales pueden utilizarse para transferir grandes regiones de ADN que codifican atributos normalmente encontrados en una especie de planta, dentro de otra especie de planta. En esta forma, es posible derivan una célula de planta que no necesita ya llevar" un cromosoma artificial para poseer el nuevo atributo. Así, el cromosoma artificial serviría como el mecanismo de transf rencia para permitir la formación de plantas con mayor grado de diversidad genética. Un cromosoma artificial puede diseñarse en una variedad de formas para lograr los propósitos mencionados anteriormente. Un cromosoma artificial puede modificarse para contener secuencias que promuevan la recombinación homologa dentro de células de planta, o modificarse para contener un sistema genético que funciona como un sistema de recombinación sitio-específica. Por ejemplo, la secuencia de ADN de Arabidopsis se conoce ahora. Para construir un cromosoma artificial capaz de recombinarse con una región específica de ADN Arbadiopsís, una secuencia de ADN Arabidopsis, normalmente ubicada cerca de una ubicación cromosomal que codifica genes de interés potencial puede introducirse en . un cromosoma artificial por métodos proporcionados en la presente. Puede ser desea-ble incluir una segunda región de ADN dentro del cromosoma artificial que proporciona una segunda secuencia de flanqueo a la región que codifica genes de interés potencial, para promover un doble evento de recombinación que aseguraría la transferencia de la región cromosomal entera que codifica genes de interés potencial al cromosoma artificial . El cromosoma artificial modificado, que contiene la secuencia de ADN capaz de la recombinación homologa de la región que puede entonces introducirse en células Arabidopsis y el acontecimiento de recombinación homologa se selecciona. Es conveniente incluir un gen marcador para permitir la selección de un acontecimiento de recombinación homologa. El gen marcador es preferiblemente inactivo a menos que se active por un acontecimiento de recombinación homologa apropiado. Por ejemplo, la US 5,272,071 descrifce un método en donde un- gen de planta inactivo se activa por un acontecimiento de recombinación de manera que los acontecimientos de recombinación homólogos deseados puedan clasificarse fácilmente. Similarmente , la US 5,501,967 describe un método para la selección de acontecimientos de recombinación homólogos por la activación de un gen de selección silente introducido primero en el ADIST de planta, el gen se activa por un acontecimiento de recombinación homólogo apropiado. Ambos de estos métodos pueden aplicarse para permitir un proceso selectivo para incluir para seleccionar la recombinación entre un cromosoma artificial y un cromosoma de planta. Una vez que el acontecimiento de recombinación homologa se detecta, el cromosoma artificial, una vez seleccionado, se aisla e introduce en una célula receptora, por ejemplo, tabaco, maíz, trigo o arroz, y la expresión de las secuencias de ADN recientemente introducidas se evalúan. La selección, de los acontecimientos recombinantes puede tomar lugar en el cultivo celular, o siguiendo la formación de semilla y selección de plantas de semillas o semillas mismas. Los cambios fenotípicos en las células de planta receptora- que contienen el cromosoma artificial, o en plantas regeneradas que contienen el cromosoma artificial, permiten la evaluación de la naturaleza de los atributos codificados por los genes de interés, por ejemplo, el ADN de Arabidopsis, bajo circunstancias encontradas naturalmente en las células de plantas, incluyendo la disposición de origen natural de las secuencias de ADN responsables por el control para el desarr/ollo de los atributos en el -ambiente cromosomal normal. Los rasgos tales como resistencia a enfermedades fúngicas o bacterias durables, aceite nuevo y composiciones de carbohidrato, metabolitos secundarios valiosos tales como fitoesteroles, flavonoides, fijación eficiente del nitrógeno o utilización mineral, resistencia a extremos de sequía, calor o frío son todos encontrados dentro de poblaciones diferentes de especies de planta y son con frecuencia gobernadas por múltiples genes. El uso de tecnologías de transformación de genes únicos no permite la evaluación de la multiplicidad de genes que controlan muchos atributos valiosos. Así, la incorporación de estos genes en los cromosomas artificiales permite la rápida evaluación de la utilid-SLcl de estas combinaciones genéticas en especies de planta- heterólogas. La orden a gran escala y estructura, del cromosoma artificial proporciona un número de ventajas únicas en la selección de nuevas utilidades o nuevos fenotipos dentro de la espec:Í-e cte plantas heterólogas. El tamaño del ADN nuevo que pusde llevarse por un cromosoma artificial puede ser de millones de pares de bases de ADN, representando genes otencialLro^te numerosos que pueden tener diferente o nueva utilida-d en una célula de planta heteróloga.. El cromosoma artificial es un ambiente "natural" para la expresión genética, los problemas de expresión genética variable y el silencio visto por genes transferidos por la inserción aleatoria en un genoma no debe observarse. S imilarmente , no existe necesidad para diseñar los genes para la expresión, y los genes insertados no necesitarían ser genes recombinantes . Así, l°s genes transferidos se espera que expresen completamente en la forma temporal y espacial típica como se observa en las especies de donde los genes se aislaron inicialmente . Una característica valiosa de estas utilidades es la capacidad para aislar los cromosomas artificiales y para aislar además, manipular e introducir en otros cromosomas artificiales de células llevando composiciones genéticas únicas. Así, el uso de cromosomas artificiales y recoiabinación homologa en las células de plantas pueden utilizarse para aislar e identificar muchos rasgos de cultivo valiosos. Además, el uso de cromosomas artif-Leíales para el aislamiento y prueba de regiones grandes de ADN de origen natura.1 métodos para el uso de cromosomas artificiales y ADN clonado se contemplan también. Similar a aquellos descritos anteriormente, los cromosomas artificiales pueden utilizarse para transportar grandes regiones de ADN clonado, incluyendo aquel derivado de otra especie de plantas. La capacidad para incorporar elementos de ADN en cromosomas artificiales como se forman permiten el desarrollo de cromosomas artificiales específicamente diseñados como una plataforma para probar nuevas combinaciones genéticas, o descubrimientos "genómicos" para especies modelo tales como Arabídopsis. Los sistemas de "recombinasa" específicos pueden utilizarse en células de plantas para remover o re-disponer genes; estos mismos sistemas pueden utilizarse para derivar nuevas combinaciones genéticas contenidas en un cromosoma artificial. A este respecto, se contempla que el uso de secuencias de recombinación sitio-específicas pueden tener considerable utilidad en desarrollar cromosomas artificiales que contienen secuencias de ADN reconocidas por enzimas de recombinasa y capaces de aceptar secuencias de ADN que contienen las mismas. El uso de recorafoinación sitio-específica como un medio para llevar a. cabo un ADN introducido a un lugar específico se ha demostrado en la técnica y tales métodos pueden emplearse. Los sistemas de recomióinasa pueden también utilizarse para transferir las regiones de ADN clonadas contenidas dentro del cromosoma artificial a los cromosomas de planta de origen natural. Muchas recombinadas sitio especificas se han descrito en la literatura (Kilby et al., Trends in Genetics, 9(12):' 413-418, 1993). Entre estos son: una actividad identificada como R codificada por el plásmido pSRl de Zygosaccharomyes rouxii, FLP codificado por el plásmido circular 2µta a partir de Saccharo yces cerevisiae y Cre-lox a partir del fago Pl . La función de integración de recombinasas- sitio-específicas se contempla como un medio para, ayudar en la derivación de combinaciones genéticas en cromosomas artificiales. Para lograr esto, se contempla que una primera etapa de introducción de sitios de recombinasa sitio-específicos en el genoma de una célula de planta en una manera esencialmente aleatoria se conduce, de manera que la célula de planta tiene una o más secuencias de reconocimiento de recombinasa sitio-específicas en uno o más de lo cromosomas de planta. Un cromosoma artificial se introduce entonces en la célula de la planta, el cromosoma artificial diseñado para contener un sitio de reconocimiento de recombinasa capaz de reconocerse por recombinasa- sitio-especi fic ¦ Opcionalmente, un gen que codifica una enzima de recombinasa se incluye también, preferiblernente bajo el control de un promotor inducible . La expresión de enzima recombinasa sitio-específica en la célula de la planta, ya sea por inducción de un gen de recombinasa. inducible, o expresión transiente de una secuencia de recombinasa provoca un acontecimiento de recombinación sitio-específica para tomar lugar, llevando a la inserción de una región del ADN cromosoraal de planta que contiene el sitio de reconocimiento de recombinasa en el sitio de reconocimiento de recombinasa del cromosoma artificial, formando un cromosoma artificial que contiene el ADN cromosomal de planta - El cromosoma artificial puede aislarse e introducirse en un huésped heterólogo, preferiblernente un huésped de planta, y expresión del ADN cromosomal recientemente introducido puede verificarse y evaluarse para los cambios deseables fenotipicos. Por consiguiente, se lleva a cabo esta recombinación con una población de células de planta en donde el sitio de reconocimiento de recombinasa ubicado cromosomalmente se esparce aleatoriamente a través de todos los cromosomas de la planta que conducen a la formación de una población de cromosomas artificiales, cada uno con una diferente región de ADN cromosomal de planta, cada uno representando una nueva combinación genética . Este método particular implica la inserción sitio-especifica precisa del ADN cromosomal en el cromosoma artificial. Esta precisión se ha demostrado en la técnica. Por ejemplo, Gukushige and Sauer (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:7905-7909, 1992) demostró que el sistema de recombinación homólogo podría ser exitosamente empleado para introducir ADN en un lugar pre-definido en un cromosoma de células de mamífero. En esta demostración' un gen de resistencia al antibiótico menos promotor modificado para incluir una secuencia lox en el extremo 5' de la región de codificación se introdujo en las células CHO. Las células se volvieron a transformar por electrporacion con un plásmiclo que contiene un promotor con una secuencia lox y un gen de recombinasa expresado transientemente . Bajo las condiciones empleadas, la expresión de la enzima Cre catalizó la recombinación homologa entre el sitio lox en el gen de resistencia al antibiótico menos promotor cromosomalmente ubicado y el sitio lox en la secuencia de promotor introducida que conduce a la formación de un gen de resistencia al antibiótico funcional . Se demostró el objetivo eficiente y correcto de la secuencia introducida, 54 de 56 líneas analizadas corresponden a la inserción de una copia predicha del ADN debido a la recombinación homologa sitio-específica de Cre catalizada entre las secuencias lox. El uso del mismo sistema Cre-lox se ha demostrado en plantas (Dale and Ow, Gene 91:79-85, 1995) para remover es ecíficamente, eliminar o insertar ADN. El acontecimiento recis0 se controla por la orientación de secuencias de ADN lox, en cis las secuencias lox dirigen la rrecombinasa Cre para eliminar (secuencias lox en orientación directa) o invertir (secuencias lox en orientación invertida) ADN flanqu-eado por las secuencias, mientras en trans las secuencias lox pueden dirigir . un acontecimiento de recoribinación homologa resultando en la inserción de un ADN recora inante . Por consiguiente, una secuencia lox puede agregarse primero a un genoma de una especie de planta capaz de transformarse y regenerarse a una planta entera para servir como una secuencia de ADN objetivo de recombinasa para la recombinación con un cromosoma artificial . La secuencia lox puede opcionalmente modificarse para contener además un marcador seleccionable el cual es inactivo, pero puede activarse por la inserción de la secuencia de recombinación de recombinasa lox en el cromosoma artificial . Un gen marcador menos promotor o gen marcador seleccionable enlazado a la secuencia de reconocimiento de recombinasa, que se inserta primero en los cromosomas de una célula de planta puede utilizarse para diseñar un cromosoma de plataforma. Un promotor se enlaza a un sitio de reconocimiento de recombinasa, en una orientación que permite al promotor controlar la expresión del marcador o gen marcador seleccionable a la recombinación dentro del cromosoma artificial. En el acontecimiento de recombinación sitio— específica entre un sitio de reconocimiento de recorabinasa en un cromosoma de planta y el ' sitio de reconocimiento de recombinasa dentro del cromosoma artificial introducido, una célula se deriva con un cromosoma artificial reecornbinado, el cromosoma artificial que contiene un marcador activo o actividad de marcador seleccionable que permite la- identificación o selección de la célula. Los cromosomas artificiales pueden transferirse a otras especies de plantas y la funcionalidad, de las nuevas combinaciones probadas . La capacidad para conducir tal transferencia inter-cromosomal de secuencias se ha demostrado en. la técnica. Por ejemplo, el uso del sistema de recombinasa Cre-lox para provocar un acontecimiento de recombinación de cromosoma entre dos cromatidos de diferentes cromosomas se ha mostrado . Cualquier número de sistemas de recombinación puede emplearse (véase, la solicitud provisional Norteamericana No. de Serie 10/161,403 presentada el mismo día adjunta) . Tales sistemas incluyen, pero no se limitara a, sistemas bacterialmente derivados tales como el sistema Int/att de fago lambda y el sistema G n/gix. Más de un sistema de recombinación puede emplearse, incluyendo por ejemplo, un sistema recombinasa para la íntrodicción de ADN en un cromosoma artificial. , y un segundo sistema de recombinasa para la transferencia subsecuente del ADN crecientemente introducido contenido dentro de un cromosoma artificial en el cromosoma de origen natural de una segunda especie de planta. La elección del sistema de recorríbinación específico utilizado será dependiente de la naturaleza de la modificación contemplada. Al tener la capacidad para aislar un cromosoma artificial y en cromosomas artificiales particulares que contienen ADN cromosomal de planta introducido a través de recombinación sitio-específ ca y - volver a introducir el cromosoma en otras células, particularmente células de plantas, estas nuevas combinaciones pueden evaluarse en diferentes especies de cultivos sin la necesidad de aislar primero y modificar los genes, o llevar a cabo transformaciones múltiples o transferencias genéticas para lograr el mismo aislamiento de combinación y combinaciones de prueba de genes en plantas. El uso de una recombinasa sitio-específica y cromosomas artificiales también permiten la recuperación conveniente de la región cromosomal de planta en otros vectores de ADN recombinantes y sistemas para manipulación y estudio. Los cromosomas artificiales pueden diseñarse como plataformas para aceptar regiones grandes de ADN clonado, tal como agüella contenida en Cromosomas Arti iciales Bacteriales (los B.AC) o Cromosomas Artificiales de Levadura, (los YAC) . Se contempla además, que un resultado de la estructura normal de cromosomas artificiales basado en la amplifficación, tales como, por ejemplo, SATACS (o ACes) , que contienen bloques de ' ADN de repetición en serie, que más de la secuencia de ADN clonada- pueden introducirse por procesos de re combinación . En particular, la recombinación dentro de una región predefinida del D en repeticiones en serie dentro del cromosoma artificial proporciona un mecanismo a regiones numerosas "apiladas" de ADN clonado, incluyendo regiones grandes de ADN contenidas dentro de los clones BAC o "YAC. Asi, las combinaciones múltiples de genes pueden introducirse en cromosomas artificiales y estas combinaciones probarse para funcionalidad. En particular, se contempla que los YAC o los BAC múltiples pueden apilarse en un cromosoma artificial, los BAC o los YAC contienen genes múltiples de trayectorias complejas o trayectorias genéticas múltiples- Los BAC o los YAC se seleccionan normalmente con base en la información genética disponible dentro del dominio público, por ejemplo a partir del Sistema de Dirección de Información de Arabidopsis (htt : //aims . cps .msu . edu/aims/índex, html) o la información relacionada a las secuencias de ADN de planta disponibles del Institute for Genomic Research (http://wvrw.tigr.org) y otros sitios conocidos por aquellos expertos en la técnica. Alternativamente, los clones pueden elegirse aleatoriamente1 y evaluarse para funcionalidad. Se contempla que las combinaciones que proporcionan un fenotipo deseado pueden identi fricarse por el aislamiento del cromosoma artificial que contiene la combinación y analiza la naturaleza · del ADN clonado insertado. En otra modalidad de los métodos proporcionados en la presente para descubrir genes asociados con los atributos de la- planta, el cromosoma . artificial utilizado para transferir ADN de planta a una célula huésped para evaluación a la misrna contendrá regiones grandes de ADN" de planta, en particular eucromatina de planta, como un resultado del proceso al cual el cromosoma artificial se produce. En particular, el cromosoma artificial puede ser un cromosoma artificial basado en la amplificación, incluyendo, pero no limitándose a: (1) un minicromosoma que se origina a partir de la ruptura de un cromosoma dicéntrico, (2) un cromosoma artificial que contiene una o más regiones de unidades de ácido nucleico de repetición en donde la o las regiones de repetición contienen cantidades sustancialmente equivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromático, (3) un cromosoma artificial que contiene una o más regiones de unidades de ácido nucleico de repetición en donde la o las regiones de repetición se hacen predominantemente de ADN eucromático o contienen aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de 90% del ADN eucromático, (4) un cr-otnosoma artificial que contiene una o más regiones de las -unidades del ácido nucleico de repetición en donde el cromosoma artificial se hace de cantidades sustahcialmente equivalentes de heterocromatina y eucromatina, (5) un cromosoma artificial que contiene una o más regiones de unidades de ácido nucleico de repetición que tienen secuencias de ácido nucleico común que representan ácido nucleico eucromático y heterocromático y (6) una estructura, semejante a chorizo que contiene una porción o todas de un brazo que contiene eucromatina de un cromosoma de planta. En estos métodos para descubrir genes asociados con atributos de la planta, debido a que el cromosoma artificial utilizado para transferir el ADN de planta a una- célula huésped para la evaluación en la presente se genera para contener ya grandes cantidades de ADN de planta, en particular eucromatina de planta, no existe la necesidad para introducir eucromatina de planta en los cromosomas artificiales, por recombinación homologa o sitio-especifica. 4. Uso de cromosomas artificiales para la preparación y selección de bibliotecas Ya que grandes fragmentos de ADN pueden incorporarse en los cromosomas artificiales (los AC) , son bien adecuados para usarse como vehículos de clonación que puedan acomodar genomas completos en la preparación de bibliotecas de ADN genómicas, que luego pueden seleccionarse fácilmente por funcionalidad como se describe anteriormente o para secuencias de gen específicas para naodificación y estudio adicional. Por ejemplo, es posible utilizar cromosomas artificiales para preparar bibliotecas de cromosoma artificiales que contienen una biblioteca de ADN genómica de planta útil en la identificación y aislamiento de componentes de 7ADN funcionales tales como genes, ADN centromérico y ADN telomérico a partir de una variedad de diferentes especies de plantas. Se incluyen los siguientes ejemplos para propósitos ilustrativos únicamente y no se pretenden limitar el alcance de la invención. Ejemplo 1 Generación de protoplastos Arabidopsls Los protoplastos de planta se generan normalmente a partir de células de plantas siguiendo técnicas estándares (por ejemplo, Maheshwari et al., Crlt. J¾ev. Plant. Sci. 14:149-178 , 1995; Ramulu et al., Methods in Molecular Biology 111 227-242, 1999). Se preparan normalmente protoplastos de planta a partir de tejido de plantas recientes, por ejemplo, hojas, o pueden prepararse convirtiendo los cultivos de suspensión celular a protoplastos para remover las paredes celulares enzimáticamente . Para la producción de protoplastos Arabidopsls, los métodos de Karesh et al. {PlSLnt Cell Reports 5:575-578, 1991) y Mathur et al. (Plant Cell Reports 14.-21-226, 1995) se utilizaron para generar cultivos de suspensión Arabidops'is por modificaciones de la misma como se describe posteriormente. Estas células se mantuvieron en cultivo líquido y subcultivo como se requiere, usualmente entre 7 y 10 días en cultivo. Establecimiento de cultivos de suspensión Los cultivos de suspensión celulares derivados de callos de raíz de Arabidopsis thaliana cv. Columbia, RLD and Landsfovrrg I erecta' se utilizaron. Los callos se indujeron a partir" de raices de plántulas de 3 semanas en un medio de inducción' de callos que contienen medios básicos MS ( urashige and Skoog (1962) Physiol . Plant 15:473-497) con 3% de sacarosa, 0.5 mg/1 de ácido naftalenacético (???) , 0.05 mg/1 inetin (Sigma Aldrich Canadá) . Los cultivos de suspensión celular se cosecharon a partir del callo en un medio ¿le inducción de callo líquido a 22 °C con agitación a 120 rpm- Se subcultivaron cada 7 días. Generación de protoplastos Se incubó un gramo de cultivo de suspensión de 4-5 días en 6 mi de solución de enzima que contiene 1% de Celulasa * Onozuka' R-10 y 0.25% de Macerozyma R-io en 35 g/1 de CaCl2-2H20 (Hartmann et al. (1998) Plant Mol. Biol . 35:741-754) e incubó a 22 °C en la oscuridad con agitación a 70 rpm durante 15 horas. La mezcla de protoplasto se vertió a través de un tamiz de malla de nylon de 100 µt? y se centrifugó a 250xg por 5 minutos. Los protoplastos se lavaron con 35 g/1 de Ca.Cl2- ¾0 y se resuspendieron en 10 mi de un medio flotante conteniendo un medio B5 (Gamborg et <al . (1968) Exp.. Cell Res. 50:151-158) con 144 g/1 de sacarosa y 1. mg/1 de ácido (2,4-D) 2 , 4 -diclorofenilacético . Los protoplastos se centrifugaron a '8xg durante 10 minutos, se recolectaron a la interfase y se utilizaron inmediatamente para transfeccion. Ejemplo 2 Generación de Protoplastos de Mesofilo de Tabaco Los protoplastos mes'ofílieos se generaron a partir de hojas de plántulas estériles de N-ta±>acum cv. Xanthi . Las plántulas se cultivaron asépticamente en un medio MSO (medios básales MS, 3% de sacarosa, 0.05% de ácido morfolinoetansulfónico (MES), 1.0 mg/1 de benc iladenina (BA) , 0.1 mg/1 de NAA y 0.8% de agar, pH 5.8) a. 22 °C bajo un fotoperiodo de 16/8 horas (véase también Bilang et al., (1994) Plant Molecular Biology Manual Al: 1-6) . Las hojas completamente expandidas (2 cm) se cortaron a la mitad, la vena principal removida y la epidermis superior clasificada con cortes en paralelo. Las piezas de la hoja se sumergieron en 6 mi de solución de enzima conteniendo 1.2% de Celulasa 'Onozuka' R-10 y 0.4% de Macerozima R-10 en un medio K4 (Nagy and Maliga (1976) Z. Pflanzepysiol 78:453-455) e incubaron a 22 °C durante 15 horas sin agitación. Los protoplastos se purificaron vertiendo a través de un tamiz de malla de nylon de 100 µ??. La suspensión de los protoplastos se sotoxecubrió cuidadosamente con 1 mi de solución W5 (Bilang et al- (1994) Plant Molecular Biology Manual Al ¿1-6) y se centrifugó a 80 xg durante 10 minutos. Los protoplastos se resuspendieron entonces en solución W5 a una densidad de 1 x 106 de protoplastos/ml y se almacenó a 4°C durante 1 a 2 horas antes del tratamiento, por ejemplo, incorporación de ADN o transferencia de cromosoma. Ejemplo 3 Producción de Protoplastos de Tabaco a partir de los Cultivos de Suspensión Se preparan protoplastos BY-2 de tabaco a partir de cultivos de suspensión de acuerdo con el método de Nagata et al. [(1981) Molecular and General Genetics, 184:161-165]'. Ejemplo 4 Generación de Protoplastos de Brassica Hypocotyl Los genotipos de Brassica napus, B. olerácea, B. júncea y B. carinata pueden utilizarse para generar protoplastos. Las semillas de Brassica napus se esterilizaron en la superficie (durante 2 minutos con 70% de etanol , luego durante 20 minutos con 2.4% de hipoclorito de sodio conteniendo una gota de Tween 20 por 100 mi) . Las semillas se enjuagaron completamente con agua destilada estéril y se cultivaron asépticamente en un medio de germinación de autoclave (resistencia media basal Muras ige y medio Skoog ( S) , 1% de sacarosa, 0.5% de agar, pH 5.8). A menos que se indique de otra manera, los procedimientos de= generación de protoplasto se realizaron asépticamente y las soluciones y. medios se esterilizaron por filtro. Alternativamente, los protopl-astos pueden generarse y cultivarse exitosamente a partir: de diferentes explantas utili-zando varias modificaciones de protocolo (por ejemplo, Kao et al. (1991) Plant Science 75:63-72; Kao et al. (1990) Plant Cell Rep. 5:311-315 ; Kao and Seguin-S artz (1987) Plant Cell Tiss. Org. Cult. 10:79-90; Kao (1977) Mol. Gen. Genet. 150:225-230) . Generación de Protoplastos de Hipocotilo Los hipocotilos se removieron a partir de plántulas de 4 6 5 dias cultivadas asépticamente en la oscuridad con o sin exposición a luz durante unas cuantas horas antes del uso. Las explantas se cortaron trans ersalmente en piezas de 2-5 ttim e incubaron en solución de enzima (sales, vitaminas y ácidos orgánicos de medio Kao (Kao (1977) Mol. Gen. Genet. 250:225-230) , 0.4 g/1 de CaCl2.2H20, 13% de sacarosa, 1% de Celulasa 0nozuka RIO', 0.1% de Pectoliasa ?23, pH 5.6) en platillos petri, en la oscuridad, sin agitación durante 14-18 horas, luego con agitación en un agitador giratorio (aproximadamente 50 rpm) durante 15-30 minutos. La mezcla se filtró a través de un tamiz de malla de nylon de 63 µ?? en tubos centrifugadores , y un volumen igual de 17.5% de sacarosa se agregó a cada tubo. Siguiendo la ceritrifligación (aproximadamente 100 xg S minutos) , la banda ¿le protoplastos que se formó en la paróte superior de cada tubo se recolectó. Los protoplastos se lavaron 3 veces por resuspensión en solución de lavado [s olución W5 de Menczel and Wolfe (1984, Plant Cell Rep 3:196-198) en una resistencia reducida (0.8X)] seguida por centrif gación a 100 xg durante 3-5 minutos y descargando el sobrenadante. Los protoplastos se cultivaron en un medio Kao conteniendo las sales, vitaminas y ácidos orgánicos con 30 g/1 de sacarosa, 68.4 g/1 de glucosa, 0.5 mgYl de ???, 0.5 mg/1 de ??, 0.5 mg/1 de 2,4-D, pH 5.7 , en una densidad de 1 x 105 por mi e incubaron a 25°C, 16 h de fotoperiodo, en luz fluorescente pálida (25 ?p?"2 s'1) . Después de 5-8 días en cultivo, se agregaron el medio alimentador de 1-1.5 mi que contiene el medio anterior, excepto con 55.8 g/1 de glucosa en lugar de 68.4 g/1, a cada platillo, y los platillos se colocaron bajo luz fluorescente brillante (50 µ?t?'2 s'1) . En aproximadamente 14 días, se removieron 1-2 mi de un medio de cada platillo, y 'se agregaron 2-3 mi de un medio alimentador conteniendo un medio B5 basal (Gamborg et al. (1968) Exp. Cell Res. 50:151-158) , 3% de sacarosa, 3.8% de glucosa, 0.5 mg/1 de BA, 0.5 mg/1 de ???, y 0.5 mg/1 de 2,4-D, pH 5.7. En aproxim damente 21 días, si las microcolonias aún no se han forma lo todavía, los cultivos pueden alimentarse con el último me «dio alimentador, excepto con 2.2% de glucosa en lugar de 3.8%. los cultivos de protoplasto pueden lavarse cuando sea necesario agregando un nuevo medio alimentador, platillos petri arremolinándose suavemente,' permitiendo a las células establecerse, removiendo la mayoría del sobrenadante y agregando medio reciente a los platillos. En 3-5 semanas, se incrustraron raicrocolonias con medio conteniendo una mezcla, de 1:1 del último medio alimentador y el medio de proliferación -el cual contiene los componentes del medio alimentador con 0.9% de glucosa y 1.6% de agarosa para realizar una concentración de 0.8% en la mezcla final. Los cultivos se incubaron corno se describe anteriormente en luz fluorescente brillante (80-100 µ?G?~2?_1) . Después de 10 días-2 semanas, se colocaron en placas colonias verdes en el medio de regeneración. Ejemplo 5 Preparación de un Vector de Transformación Útil para la Inducción de Formación de Cromosoma Artificial de Planta Los cromosomas artificiales de planta (los PAC) pueden generarse introduciendo ácido nucleico, tal como ADN, el cual puede incluir un ADN que induce amplificación y/o un ADN objetivo, por ejemplo, ADNr o ADN lambda , en una célula de la planta, permitiendo a la célula crecer, y luego identificar de entre las células resultantes aquellas que incluyen un cromosoma con una estructura que es distinta de aquella de cualquier cromosoma que existe en la célula anterior a la introducción del ácido nucleico - La estructura de un PAC refleja amplificación de ADN c romosomal , por ejemplo estructuras heterocromáticas y que contienen región de repetición/ segmentadas. Es también posible seleccionar células que contienen estructuras que son precursores a los PAC, por ejemplo, cromosomas que contienen más de un centrómero y/o fragmentos de las mismas, y cultivar y/o manipularlas para generar finalmente un PAC dentro de la célula. •En el método para generar los PAC, el ácido nucleico puede introducirse en una variedad de células de la planta. El ácido nucleico puede incluir ADN objetivo y/o un ADN expresable de planta que · codifica uno o más marcadores seleccionables múltiples (por ejemplo, ADN que codifica resistencia a bialofos (bar) ) o marcadores clasificables (por ejemplo, ADN que codifica GFP) . Ejemplos de ADN objetivo incluyen, pero no se limitan a, la secuencia espadadora intergénica de ADNr de N. Tabacum (IGS) y ADNr Arabidopsis tal como ADNr 18S, 5.8S, 26S, y/o la secuencia espaciadora intergénica. El ADN puede introducirse utilizando una variedad de métodos, incluyendo, pero no limitándose a métodos mediados por Agrobacterium, la incorporación de ADN mediada por PEG y electroporación utilizando, por ejemplo, procedimientos estándares de acuerdo a Hartmann et al. [(1998) Plant Molecular Biology 36:741]. La célula en donde tal ADN se . introduce puede cultivarse bajo condiciones selectivas y puede ínicialmente cultivarse bajo condiciones no selectivas y luego transferirse a un medio selectivo. Las células o protoplastos pueden colocarse en placas conteniendo un agente de selección para cultivar, por ejemplo, callos individuales. Los callos resistentes pueden clasificarse por expresión marcadora clasificable . Puede prepararse la propagación de metafase de cultivos de resistencia, y los cromosomas de metafase examinados por análisis FISH utilizando sondas específicas para detectar la amplificación de regiones de los cromosomas. Las células que tienen cromosomas artificiales con centrómeros de funcionamiento o estructuras intermediarias cromosomales, incluyendo, pero no limitándose a, cromosomas dicéntricos, formalmente cromosomas dicéntricos, minicromosomas , estructuras de heterocromatina (por ejemplo, cromosomas en chorizo), e intermediarios cromosomas artificiales de auto-replicación estable como se describe en la presente, se identifican y cultivan. En particular, se identifican células que contienen cromosomas artificiales de auto-replicación. El ADN introducido en una célula de planta para la generación de PAC puede ser en cualquier forma , incluyendo la forma de un vector. Un vector ejemplar para ufarse en métodos para generar Los PAC puede prepararse como sigue .

Para la producción de cromosomas artificiales, los vectores de transformación de planta, como se ejemplifica por pAglIa y pAglIb, que contienen un marcador selecciohable, una secuencia objetivo, y un marcador cleisificable se construyeron utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica para combinar los diversos fragmentos . Los vectores pueden prepararse utilizando el vector pAGl como un vector base e insertando los siguientes fragmentos de ADN en pAgl : el ADN que codifica ß-glucoronidasa bajo el control del promotor de la nopalina sintasa (NOS) y flanqueado en el extremo 3' por el fragmento terminador NOS, u.n fragmento de ADN satélite de ratón y una secuencia espadadora intergénica de ADNr de N. tabacu (IGS) . En la construcción de los vectores de transformación de planta, el vector pAG2 puede también utilizarse como el vector base. 1. Construcción de pAGl El vector pAgl (SEC. DE IDENT. NO: 1 ; véase Figura 1) es un derivado del vector CAMBIA nombrado pCambia 3300 (Centro para la Aplicación de Biología Molecular de Agricultura Internacional, es decir, CAMBIA, Canberra, Australia; www.cambia.org) ' que es una versión' modificada del vector pCambia 1300 al cual el ADN a partir clel gen bar que confiere resistencia a fosfinotricina se Ira. agregado. La secuencia nucleótida de pCambia 3300 se proporciona en la SEC. DE IDENT. NO: 2. pCambia 3300 también contiene una secuencia alfa lacZ que contiene una región poi ienlazadora . pAgl se construyó insertando dos nuevos fragmentos de ADN funcionales en el polienlazador de pCambia 3300: una secuencia que contiene un sitio attB y un ADN que codifica la resistencia a zeomicina menos promotora flanqueado en el extremo 3' por una secuencia de señal SV40 polyA, y una segunda, secuencia que contiene ADN a partir del gen de resistencia a higromicina (higromicin fo sfotransferasa) confiriendo resistencia a higromicina para la selección en plantas- Aunque la fusión de señal de zeomicin-SV40 polyA no se es era que proporcione la base para la selección de zeomicina en células de planta, puede activarse en células de mamífero por la inserción de un elemento promotor funcional en el sitio attB por recombinación sitio-especifica catalizada por la Lambda att integrasa. Asi, la inclusión de las secuencias attB- zeomicina permite la - evaluación de funcionalidad de los cromosomas artificiales de planta en células de mamífero por la activación del AD que codifica resistencia a · zeomicina, y proporciona un sitio att para inserción adicional de nuevas secuencias de ADN en cromosomas artificiales de planta formados como un resultado de utilizar pAgl para la transformación de planta. El segundo fragmento de ADN funcional permite la selección de células de planta con higromicina. Así, el pAgl contiene ADN a. partir del gen bar confiriendo resistencia a fosfinotricins- , ADN a partir del gen de resistencia a higromicina, los MM que codifican resistencia bajo el control de un promotor del virus de mosaico de coliflor (CaMV) 35S separado, y el ADN que codifica resistencia a zeomicina att menos promotor. PAgl es un vector binario que contiene secuencias de ADN-T de borde izquierdo y derecho Agrc>jbacterium para usarse en transformación mediada por Agrobacterlum de células de planta o protoplastos con el ADN ubicado entre las secuencias de borde. pAgl también contiene el pBR322 Ori para la ?-eplicación en E. col! . PAgl se construyó ligando p3300attBZeo digerido con HíndIIl/PstX con pBSCaMV35SHyg digerido con Híndlll/Pstl como sigue (véase Figura 2) . a. Generación de p33 OOattBZeo Se digirió el plásmido pCambia 3300 con PstI/Ec/136 II y ligó con pLITattBZeo digerido con PstI/StuI (la secuencia nucleotida de pLITattBZeo se proporciona en la SEC. DE IDENT. NO: 19 para generar p33 OOattBZeo la cual contiene un sitio attB, un ADN que codifica resistencia a zeomicina menos promotor flanqueado en el extremo 3 ' por una señal de SV40 polyA, y un sitio PstI reconstruido. b. Generación de pBSCaMV35SHyg Un fragmento de ADN que contiene ADN que codifica higromicina fosfotransferasa flanqueada por el promotor CaMV 35S y la secuencia de señal CaMV 35S polyA- se obtuvo por amplificación PCR de plásmido pCambia 1302 (GenBank No. de Acceso AF234298 y SEC . DE IDENT, NO: 3). Los' cebadores utilizados en la reacción de amplificación fuerron como sigue: CaMV35SpolyA: 5' -CTGAATTAÁCGCCGAATTAATTCGGGGGATCTG-3' SEC. DE IDENT. NO: 4 CaMV35 Spr : 5 ' CTAGAGCAGCTTGC'CAACATGGTGGAGCA- 3 ' SEC. DE IDENT. NO: 5 El fragmento 2100-pb PCR se ligó con pBluescript II SK + digerido con EcoRV (Stratagene, La Jolla, CA, U.S. A.) para generar pBSCaMV35SHyg. c. Generación de pAgl Para generar pAgl, se digirió pBS CaMV35SHyg con HindJ.1 /Psti y se ligó con p3300attBZeo digerido con Hindl 11 / stí . Así, el pAgl contiene la estructura principal de pCambia 3300 con ADN confiriendo resistencia a fosfinotricina e higromicina bajo el control de promotores CaMV 35S separados, y cásete de recombinación de ADN que codifica resistencia a zeomicina menor promotora att-B y sitios únicos para agregar marcadores adicionales, por ejemplo, ADN que codifica GFP. El sitio attB facilita la adición de nuevas secuencias de ADN a la planta o animal, por ejemplo, cromosomas artificiales, de mamífero, incluyendo los PAC formados como un resultado de utilizar el vector pAgl , o derivados de los mismos, en la producción de los PAC. El sitio attB proporciona un sitio conveniente paia la inserción mediada por recombinasa de los ADN que contienen un sitio att homól go. 2. Ag-2 El vector pAg2 (SEC. DE IDEN . NO: 6, véase Figura. 3) es un derivado del vector pAgl formado agregando ADN que codifica una proteína fluorescente verde (GPP), bajo el control de un promotor NOS y flanqueado en el extremo 3' por una señal NOS polyA, a pAGl . Se construyó un pAcj2 como sigue (véase Figura 4) . Un fragmento de ADN que contiene el promotor NOS se obtuvo por digestión de pGEM-T-NOS , o pGEMEasyNOS · (SEC. DE IDENT. NO: 7) conteniendo el promotor NOS en el vector de clonación pGEM-T-Easy (P:romega Biotech, Madison, WI . U.S.A.), con Xbal/Ncol y se ligó a un fragmento de Xh&l/Ncol de pCambia 1302 conteniendo ADN qxie codifica GFP (sin el promotor CaMV 35S) para generar pl302NOS (SEC. DE IDENT. NO: 8) conteniendo ADN que codifica GFP en asociación operable con el promotor NOS. Se digirió el plásmido pl302NOS con Smal/JBs/WI para producir un fragmento que contiene el promotor NOS y ADN que codifica GFP. El fragmento se ligó con pAgl digerido con Pmel/Bs/¥¡I para generar Ag2. Así, el pAg2 contiene el ADN a partir del gen bar confiriendo resistencia a fosfinotricina, el ADN que confiere resistencia a higromícina, los ADN que codifican resistencia bajo el control de un promotor 35S de virus de mosaico de coliflor, el ADN que codifica resistencia a la kanamícina, un gen GFP bajo el control de un promotor NOS y el AI N que codifica resistencia a attB-zeomicina . Alguien con experiencia en la técnica, apreciará que otros fragmentos pueden " -tilizarse para generax los derivados de pAgl y pAg2 y que otros ADN heterólogos pueden incorporarse en derivados pAgl y pAg2 utilizando métodos bien conocidos en la técnica. 3. Vectores de transformación pAglla y pAglIb Los vectores pAglla y pAglIb se construyeron insertando los siguientes fragmentos de ADN en pAgl : el ADN que codifica ß-glucoronidasa,, el fragmento terminador de nopalina sintasa, el fragmento del promotor nopalina sintasa (NOS) , un fragmento de ADN satélite de ratón una secuencia espadadora intergénica de ADNr N. Tabacu (IGS) . La construcción del pAglla y pAglIb fue como sigue (véase Figura 5) . Una secuencia espadadora intergénica. ' de ADNr de N.

Tabacum (IGS) (SEC. DE IDENT . NO: 9); véase también GenBank No. de Acceso Y08422, véase también Borysyu et al. (2000) Nature Biotechnology 28:1303-1306; Borysyuk et al. (1997) Plant Mol. Bíol . 35:655-660; Patentes Norteamericanas Nos. 6,100,092 y 6,355,860) se obtuvo por amplifica.ción PCR de ADN genómico de tabaco. La IGS puede utilizarse como una secuencia objetivo en virtud de su homología a genes de ADNr de tabaco; la secuencia es también una secuencia promotora de amplificación en plantas. Este fragmento se amplificó utilizando condiciones PCR estándares (por ejemplo, como se describe por Promega Biotech, Madison, WI, U.S. A.) a partir del genómico del tabaco utilizando los cebadores mostrados posteriormente: NTIGS-FI 5'-GTG CTA GCC AAT GTT TAA CAA GAT G-3 ' (SEC- DE IDENT . NO: 10) y NTIGS-RI 5'.-ATG TCT TAA AAA AAA ??? CCC AAG TGA C-3' (SEC. DE IDENT. NO: 11) Después de la amplificación, el fragmento se clonó en pGBM-T Easy para dar pIGS-1. Se amplificó un fragmento del ADN satélite de ratón (fragmento Msat 1; GenBank No. de Acceso V00846; y SEC . DE IDENT. NO: 12) a través de PCR a partir de pSAT-l utilizando los siguientes cebadores: MSAT-F1 5 ' -AAT ACC GCG GAA GCT TGA CCT GGA ATA TCG C-3' (SEC. DE IDENT. NO: 13) y MSAT-Ri 5 ' -ATA ACC GCG GAG TCC TTC AGT GTG CA T-3' (SEC. DE IDENT. NO: 14) ¦ Esta amplificación agregó un sitio SacII y fíIncZIII en el extremo 5' y un sitio SacII en el extremo 3' del fragmento PCR. Este fragmento se clonó entonces en el sitio SacII en pIGS-1 para dar p IGS-1, proporcionando un ADN específico de centrómero eucariótico y una secuencia de ADN conveniente para la detección de FISH. Un gen marcador funcional que contiene un promotor NOS: fusión terminadora GUS:NOS se construyó entonces conteniendo el promotor NOS (GenBank No. de Acceso U09365; SEC. DE IDENT. NO: 15) , la secuencia que codifica ß~ glucoronidasa E. coli (a partir del gen GUS; GenBank No. de Acceso S69414; y SEC. DE IDENT. NO: 16), y la secuencia terminadora nopalina sintasa (GenBank No. de Acceso U09365; SEC. DE IDENT. NO: 18) . El promotor NOS en pGEM-T-NÓS se agregó a un gen GUS menos promotor en pBlueScript (Stratagene, La Jolla, CA, U.S.A.) utilizando Notl/Spel para formar pNGN-1, que tiene el promotor NOS en la orientación opuesta en relación al gen GUS. pMIGS-1 se digirió con Notl/Spel para producir un fragmento que contiene el ADN satélite mayor de ratón y la IGS de tabaco que se agregó entonces a pNGN-1 digerida con Notl para producir pNGN-2. El promotor NOS se volvió a orientar entonces para proporcionar un gen GUS funcional, produciendo pNGN-3 por digestión y religación con Spel . El plásmido pNGN-3. se digirió entonces con HindIII , y el fragmento de HindIII que contiene la secuencia que codifica ß-glucoronidasa y el espaciador intergénico de ADNr, junto con la secuencia Msat, se agregó a pAG-1 para- formar pAglIa, utilizando el único sitio HindIII en pAgl ub cado cerca del borde de ADN-T derecho de pAgl , dentro de la región ADN-T.

Otro vector plásmido, referido como pAglIb, se recuperó también, el cual contenía el fragmento HindIIl insertado en la orientación opuesta en relación a aquella observada en pAglIa. Así, pAglIa y pAglIb difieren únicamente en la orientación del fragmento HindIIl conteniendo la secuencia - satélite' principal de ratón, la secuencia de ADN GUS y la secuencia IGS (véase Figura 6) . La. secuencia de nucleótido de pAglIa se proporciona en la SEC. DE IDENT. NO: 21. Los vectores pAgl , pAg2 , pAglIa y pAglIb, así como vectores designados similarmente que contienen un sitio de recom inación y un promotor (por ejemplo, promotor de planta o animal), y posiblemente otras secuencias rreguladoras , en asociación operable con ADN que codifica una proteína u otro producto para la expresión en una célula huésped, tal como una célula de planta o animal, pueden utilizarse en la transferencia de cualquier proteína (u otro producto) que codifica el ácido nucleico de interés en una célula para la expresión del mismo. Por ejemplo, cualquier proteína (u otro producto) que codifica el ácido nucleico de interés (en asociación operable con el regulador transcri cional adecuado para utilizarse en una célula huésped particular) puede insertarse en cualquiera de los vectores pAgl, pAg2 , pAglIa y pAglIb y por consiguiente se incorpora en una planta, animal u otro cromosoma artificial, par icularmente un cromosoma ACes artificial de plataforma, como se describe en la presente · Ej emplo 6 Transformación Mediada por Agrohacterium de Células de Plantas Las células de las plantas se transformaron a través de transformación mediada por AgrobacteJ ium de acuerdo a procedimientos estándares (véase, por ejemplo, Horsch et al. (1988) Plant Molecular Biology Manual, A5-.1-9, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht , Belgium) . Brevemente, la cepa de Agrohacterium GV3101/p P90 (véase Koncz and Schell (1986) Molecular and General Genetics 204:383-396) se transformó con pAglla y pAglIb (véase Ejemplo 5) por choque por calor, y la integridad del plásmido de pAglla y pAglIb después de la transformación se verificó por patrón de digestión Hindi. pAgIla/pMP90 o pAgIIb/pMP90 se cultivaron en 5 mi de medio mínimo AB (Horsch et al. (1988) Plant Molecular Biology Manual/ A5-.1-9, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, Belgium) conteniendo 25 /g/ml de kanamicina y 25 µg/ml de gentatnicina a 28 °C durante dos días. Los discos de hojas de tabaco y Arabidopsis y segmentos de raíz de Arabidopsis se prepararon como sigue: hojas de tabaco de explantas de 3 a 4 semanas se cortaron en 1 cm de diámetro, y las hojas de Arabidopsis se tomaron de 3 plántulas de 2 semanas y se cortaron transverrsalmente en dos mitades. Las raíces de Arabídopsis de 3 semanas se removieron en segmen os de 1 cm de largo. La co-cultivac ión se llevó a cabo sumergiendo los discos de hoja o segmentos de raíz en cultivo bacterial durante 2 minutos y luego transfirieron los tejidos infectados a un medio de cultivo sin antibióticos durante 2 días 'a 22°C durante 16-horas/dla bajo luz fluorescente blanca fría. Los discos de hoja de tabaco y Arabídopsis se cultivaron en un medio MS104 (MS, 3% de sacarosa, 0.05% de MES, 1.0 mg/l de BA, 0.1 mg/l de NAA y 0.8% de agar, pH 5.8) y segmentos de raíz en un medio inducido por callo, CIM 0.5/0.05 (B5, 2% de glucosa, 0.05% de MES, 0-5 mg/l de 2,4-D, 0.05 mg/l de quinetina y 0.8% de agar, pH 5.8 ) . Los discos de hojas transformados y segmentos de raíz se transfirieron entonces a un medio de selección de MS104 o CIM 0.5/0.05, respectivamente, conteniendo 20 mg/l de higromicina y 300 mg/l de Timentina para la eliminación de Agrobacterium. .El medio de selección se refrescó cada dos semanas y se regeneraron los retoños verdes . Las plantas se analizaron para la expresión del ADN que ¦ codifica GUS mediante ensayos fluorescentes e histoquímica. estándar y se evidenció la amplificación del ADN insertado por PCR cuantitativo. Numerosas plantas se obtuvieron las cuales expresan niveles elevados de GUS, y copias múltiples del gen GUS se observaron por Hibridación In situ por fluorescencia (FISH) Y análisis PCR. Así, la amplificación ¿le las regiones cromosomales que contiene el ADN insertado se observó. Alguien con experiencia en la técnica apreciará que la expresión GUS, o la expresión de cualquier otro gen, puede evaluarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Ejemplo 7 Transfección y cultivo de protoplastos Az~abldopsis La cepa E. coli Stbl4 (Gibco Life Sciences) se transformó con pAglla, pAglIb, y uno de dos. plásmidos objetivo conteniendo la secuencia de repetición de ADNr a partir de Arabidopsis (plásmido pJHD-14A o 26SrADN de .plásmido Arabidopsis pJHD2-19A, como se describe por Doelling et al- [(1983) Proc . Nati. Acad. Sci . U. s'.A. 90:7528-7532]) a través de electroporación de acuerdo a procedimientos estándares. Una sola colonia se cultivó en 250 mi de medio LB conteniendo 50 ug/ml de kanamicina (para selección basada en el ADN que codifica la resistencia a la kanamicina en pAglla y pAglIb) o 50 /¿g/ml de ampicilina (para selección basada en el ADN que codifica la resistencia a la ampicilina en pJHD-14A & pJHD2-19A) y se cultivó a 30°C con agitación a 225 rpm durante 16 horas. Los plásmiáos se aislaron de acuerdo a procedimientos estándares bien conocidos en la técnica. La integridad estructural de los plásmidos se verificó por un patrón de digestión de restricción, y los plásmidos se linearizaron con enzimas de restricción. Los plásmi-dos se esterilizaron con cloroformo y 70% de etanol antes del uso para transfección . Los protoplastos de Arabidopsis se resuspendieron en el medio de cultivo (véase Ejemplo 1). , en una densidad de 2 x lO6 protoplastos/ml . Una suspensión de protoplasto de 300 µ? se pipeteó en un tubo de 15 mi, y 30 ¿ul del plásmido (pAglIs*- ° pAglIb) y ADN objetivo (pJHD-14A o pJHD2-19A) se agregó conteniendo 10 µ de plásmido y 100 µ ele la secuencia objeti"1^0 seguida inmediatamente agregando lentamente 300 µ? de 10% de PEG. Los plásm dos objetivo se incluyeron en el procedimiento de transfección para asegurar que la cantidad del ADN objetivo de ADNr (es decir, el ADNr de tabaco a partir de pAglla o b y ADN Arabidopsis a partir de los vectores objetivo) fue suficiente para efectuar recornbinación del DN introducido en un sitio homólogo en un cromosoma Arabidopsis. El ADN se utilizó normalmente en una relación de 10:1 de ADN objetivo (pJHD-14A, o pJDH2-19A, o ADN Lambda) al ADN plásmido (pAglla o pAglIb, o un plásmido marcador Seleccionable) , o en una relación de 5:1. Generalmente, el número de pares de bases del ADN objetivo para, ser suficiente para la inserción en un cromosoma de planta es al menos aproximadamente 50 pb, o aproximadamente 60 pb, o aproximadamente 70 pb, o aproximadamente 80 pb, o aproximadamente 90 pb, o aproximadament e 100 pb, o aproximadamente 150 pb, o aproximadamen e 200 pb, o aproximadamente 300 pb, o aproximadamente 400 pb, o aproximadamente 500 pb, o aproximadamente: 600 pb, o aproximadamente 700 pb; o aproximadamente 800 pb, o aproximadamente 900 pb, o aproximadamente 1 kb, o aproximadamente 2 kb o aproximadamente: 3 kb, o aproximadamente 4 kb, o aproximadamente 5 kb, o aproximadamente 6 kb, o aproximadamente 7 kb, o aproximadamente 8 kb, o . aproximadamente 9 kb, o aproximadamente 10 kb o más . La cantidad y Longitud de ADN objetivo suficiente para efectuar introducción en un cromosoma puede determinarse empíricamente ? puede variar para iferentes especies de plantas. La mezcla se agitó suavemente, e inmediatamen e se agregó 300 µ? de solución PEG 10% lentamente con agitación suave. La mezcla de protoplasto se incubó a 22°C durante 10-15 minutos, con varios ciclos de agitación suave. La incorporación de ADN se extinguió bruscamente por la adición de 5 mi de 72.4 g/1 de Ca(N03)2- Los protoplastos se centrifugaron entonces a 80xg durante 7 minutos y se volvieron a suspender en un medio de cultivo. Para la sección, se agregó 10 a 40 mg/1 de higrotnicina a cultivos de protoplastos 14 días después de la transfecc ión, y el medio de cultivo se refrescó cada 7 días. Los cultivos de protoplastos podían también seleccionarse después de incrustrarse en 0.6% de agarosa transfiriencLo a un medio de cultivo que contiene 20 mg/1 de higromicina . Los cultivos se incuba. "on durante 14 días o más a 22 °C. Se analizaron los protoplastos de Arabidopsis por la presencia y expresión del ADN que codifica . GUS . Se recuperó el microcallo de GUS fuertemente expresado y fueron resistentes a agentes selectivos, indicando amplificación del ADN insertado. Alternativamente, la transfección de protoplastos Arabidopsis puede conducirse sin utilizar las secuencias de ADN objetivo ya que el pAglIa y pAjIIb incluyen una región de ADNr (es decir la IGS de ADNr de tabaco) que puede actuar como una secuencia objetivo siempre y cuando una cantidad suficiente de plásmido pAgIIa/b se utilice en el procedimiento de transfección . Ej emplo 8 Transfección y Cultivo de Protoplastos de Tabaco Como se describe en el Ejemplo 7, la cepa de E. coli Stbl4 se transformó con pAglIa, pAglIb, pJHD-14A (ADN objetivo) y pJHD2-l9A (ADN objetivo) a través de electroporación, y el ADN plásmido se recuperó y linearizó con enzima de restricción. Los plásmidos se esterilizaron con. cloroformo y 70% de etanol antes de usarse parra transfección. Los protoplastos de tabaco (véanse Ejemplos 2 y 3) se resuspendieron en el medio de cultivo (véase Ejemplo 2) a una densidad de 2 x 106 protoplastos/ml . Se pipeteo una' suspensión de protoplasto de 300 µ? en un fuabo de 15 mi, y 30 µ del plásmido y ADN objetivo se agregaron como se desc ibe en el Ejemplo 7. La mezcla se agitó suavemente, e inmedi atamente 300 µ? de 10% de solución ??6 se agregó lentamente con agitación suave. La mezcla de protoplasto de tabaco se incubó a 22°C durante 10-15 minutos con varios ciclos de agitación suave. La incorporación de ADN se exting-U-ió bruscamente por la adición de 5 mi de 72.4 g/1 de Ca(NC>3)2- Los protoplastos se centrifugaron entonces a 80xg durante 7 minutos y se volvieron a suspender en un medio de cultivo. La recuperación de protoplastos de tabaco viables que si9uen la incorporación del ADN variaron de 65-75% después del tratamiento. Normalmente-, más de 35% de los protoplastos iniciaron la división celular dentro de los 7 días del tratamiento. Las células de protoplastos se analizaron para la expresión genética (en este caso para la expresión del GUS de ADN reportero, pero alternativamente, la expresión de otros genes puede verificarse) . Entre 4% y 6% de las células recuperadas exhibieron expresión GUS . Los protoplastos se sometieron a procedimientos de selección para recuperar las células transformadas. Para la selección de células de tabaco, se agregó 10 a 40 mg/1 de higromicina a cultivos de protoplasto 10-14 dias después de la transfección, y el medio de cultivo se refrescó cada 7 días. La selección de disco de hoja se realizó en la presencia de 40 mg/1 de higromicina. El microcallo transformado se recuperó y se analizó por la expresión del gen reportero GUS . Los callos positivos GUS.se aislaron y se sometieron a análisis FISH (véase Ejemplo 13) . Se identificaron las células de plantas C£ue exhibieron amplificación del ADN insertado. E emplo 9 Transfección y Cultivo de Protoplastos Brassica Los protoplastos de Brassica (véase Ejemplo 4) , siguiendo la etapa de lavado final, después de filtrar a través de un tamiz de nylon de 63 µta y centrifugación, se recolectan y utilizan para transfección de ADN como se describe en el Ejemplo 8. Los cultivos de protoplasto de Brassica que siguen la incorporación del ADN o transformación por Agrobacterium pueden seleccionarse con higromicina o glufosinato amonio en cultivo líquido o en cultivos semi-sólidos embebidos . La concentración efectiva de higromicina es 10 a 40 mg/1 durante 2 a 4 semanas o continuamente, mientras que para el glufosinato amonio es de 2 a 60 mg/1 durante 5 días a 2 semanas . La selección puede impedir el crecimiento, y pueden requerirse transferencias adicionales a medios similares. E emplo 10 Regeneración de Planta a partir de Protoplastos de Brassica Las colonias de protoplastos de Brassica. (1 mm o más g-_-rand.es en diámetro) se colocaron en placas en un medio de regeneración ¡medio Murashige y Skoog basal, 1% de sacarosa, 2 mg/1 de BA, 0.01 mg/1 de ???, 0.8% de agarosa, pH 5.6) . Los cultivos se incubaron bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 4. Los cultivos se transfirieron en un medio de regeneración reciente cada 2 semanas . Los retoños regenerados se transfirieron en un medio de enraizado de autoclave (medio Murashige y Skoog basal, 1% de sacarosa, 0.1 mg/1 de NAA, 0.8% de agar, pH 5.8), e incubaron bajo luz fluorescente opaca (25 µ?p'2 s'1) . Las plántulas se plantaron en una maceta en una mezcla sin tierra (por ejemplo, Terra-lite Redi-Earth, W. . Grace & Co . , Ca adá Ltd., Ajax, Ontario) , conteniendo fertilizante (Nutricote 1414-14 tipo 100, Plant Products Co., Ltd., Brampton, Ontario) y se cultivaron en un cuarto de cultivo (20°C/15°C, fotoperiodo de 16 horas, 100-140 µ??tG2 s"1) con luz fluorescente e incandescente al nivel del suelo. Las plántulas se cubrieron con cubiertas de plástico transparentes durante una semana para permitir la aclimatación. Ejemplo 11 Aislamiento del Núcleo a partir de Protoplastos Para facilitar el análisis, las. células de plantas se sometieron a aislamiento nucleico, y el núcleo aislado puede analizarse por FISH o PCR. Para aislar el núcleo, los callos del protoplasto se convirtieron a protoplasto de acuerdo al procedimiento de Mathur et al. con modificaciones (véase Mathur et al. Plant Cell Report (1995) 14:221-226) . Los callos del protoplasto se digirieron con 1.2% de Celulasa Onoz-uka' R-io y 0.4% p/v de Macerozima R-10 en regulador de aislamiento del núcleo (10 mM de MES-pH 5.5, 0.2 M de sacarosa, 2.5 mM de EDTA, 2.5 mM de DTT, 0.1 mM de espermina, 10 mM de NaCl, 10 mM de C1 y 0.15% de Tritón X-100) durante 3 horas. Después de la centrifugación a 80xg durante 10 minutos, los gránulos de los protoplastos se volvieron a suspender en regulador hipertónico de solución W5 al 12.5% (Hinnisdaels et al. (1994) Plant Molecular Biology Manual G2:l-13, Klu er Academic Publisher, Belgiuim) durante 10 minutos. Para promover la interrupción de protoplastos, la suspensión de protoplasto se forzó a través ele una aguja de jeringa cuatro veces. Los protoplastos interrumpidos se filtraron a través de mallas de 5 µt? para remover restos y se centrifugaron a 200xg durante 10 minutos. Se repitió el lavado del gránulo en un regulador de aislamiento de núcleo conteniendo fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) y una centrifugación a 200xg durante 10 minutos, el núcleo se recolectó como un gránulo blanco liberado de 1 a contaminación citoplásmica y restos celulares. Las muestras se fijaron en 3:1 de metanol : ácido acético glacial y se analizaron por FISH.

Ejemplo 12 Detención Mitótica de Células de Planta para la. Detección de .Amplificación y Formación de Cromosoma Aartificial En general, las células de planta o protoplastos se cultivaron normalmente para dos o más generaciones antes de la detención mítótica. Normalmente, se agrega 5 /ig/ml de colquicina a los cultivos durante 12 horas pa:tra acumular las células de plantas mitóticas.. Las células mitóticas se cosechan por centrifugación suave. Alternativamente, las células- de planta (cosechadas en plástico o en suspensión) pueden detenerse en diferentes etapas del ciclo celular con agentes químicos diferentes de colquicina, tales como, pero no limitados a, hidroxiurea, vinblastina, colcemida o afidicolina o a través de deprivación de nutrientes, hormonas, o factores de crecimiento. Los agentes químicos que detienen las células en etapas diferentes de la mitosis, tales como, pero no limitadas a, hidroxiurea y afidicolina, se utilizan para sincronizar los ciclos de todas las células en la población y se remueven entonces a partir del medio celular para permitir a las células proseguir, más o menos simultáneamente, a mitosis a cuyo tiempo pueden cosecharse para dispersar los cromosomas. Ejemplo 13 Detección de Formación de Cromosoma Artificial y de Amplificación por hibridización in situ por Fluorescencia (FISH) Una variedad de células de planta pueden analizarse por métodos de hibridación in situ por fluorescencia (FISH) (Fransz et al. (1996) Plant. J. 5:421-430; Fransz et al. (1998) Plant J. 13:867-876; Wilkes et al. (1995) Cñromosome Research 3:466-472; Busch et al. (1994) Chromosome Research 2:15-20; Nkongolo (1993) Genome 36:701-705; Leitch et al. (1994) Methods in Molecular Biology 28:177-185; urata et al. (1997) Plant J. 12:31-37) para identificar ' los acontecimientos de amplificación y formación de cromosoma artificial. Se utiliza la FISH para detectar las secuencias de ADN especificas en cromosomas, en particular para detectar regiones de cromosomas de planta que tienen amplificación experimentada como un resultado de la introducción de ADN heterólogo como se describe en la presente, o para detectar formación de cromosoma artificial en células de planta. El cromosoma FISH se dispersa de células de planta Arabidopsis y tabaco en donde el ADN heterólogo que se ha introducido se genera utilizando colquicina o agentes de detección de ciclo celular similar y varias sondas de ADN (por ejemplo, sonda ADNr, sonda ADN lambda, sonda marcadora sele ccionable) . Las células se analizan por la presencia de regiones amplificadas de cromosomas, en particular la amplificación de las regiones de ADNr, y aquellas células que exhiben amplificación se cultivan además y analizan por la formación ele cromosomas artifi cíales . Los cromosomas de las células de plantas que se somete^1 a la introducción de ADN heterólogo y se cultivan para generar cromosomas artificiales pueden también analizarse por microscopio de electrón explorador. La preparación de cromosomas . mitóticos del microscopio de electrón explorador puede realizarse utilizando métodos conocidos en la- técnica (véase por ejemplo, Sumner (1991) Chromosome 100:410-418) . Los cromosomas pueden observarse, por ejemplo, con un microscopio de electrón explorador de emisión de campo Hitachi S-800 operado con un voltaje de-aceleración de 25 kv. Ej emplo 14 Detección de la Formación del Cromosoma Artificial y de Amplificación Etiquetando con Idu de Cromosomas La estructura de los cromosomas en las células de planta puede analizarse etiquetando los cromosomas con yododesoxiuridina (IdU), u otro análogo nucleótido, y utilizando un anticuerpo específico de IdU para visualizar la estructura del cromosoma. Los cultivos de célula de planta seleccionados siguiendo la introducción del ADN heterólogo se marcaron con IdU siguiendo los protocolos estándares (Fujishige and Taniguchi (1998) Chromosome Research 6:611-619; Yanpaisan et al. (1998) Biol echnology and bioeng-d-neering, 58:515-528; Trick and Bates (1996) Plant Cell Report S, 15:986-990; Binarova et al . (1993) Theoretical and Applied. Genetics, 87:9-16; Wang et al . (1991) Journal of Plant Physiology, 138:200-203) . Se utilizan células de plantas en el cultivo, normalmente cultivo de suspensión. Una serie de sub-cultivos se inician, y la etiqueta de IdU se realiza, como se describe anteriormente. Las células se permiten incorporan al IdU hasta una semana, dependiendo del tiempo doble del cultivo. Los cromosomas marcados pueden detectarse en las células de la planta (Fujishige and Taniguichi (1998) Chromosome Research 6: 611-619; Binarova et al. (1993) Theoretical 'and Applied Genetics 87:9-16) y en células de mamífero (Gratzner and Leif (1981) Cytometry 1:385-393) utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica- Los cromosomas marcados con IdU se detectan por técnicas inmunocitoquímicas . Un anticuerpo de clon B44 conjugado con (FITC) de fluoresceina isotiocianato anti-IdU (Becton Dickinson) se utiliza para unir el adticto de ADN-IdU en el ADN y se detecta por microscopía de fluorescencia (excitación 490 nm, 519 nm de emisión) . El análisis de los cromosomas marcados revela la presencia de las regiones de ADN amplificadas y la formación de cromosomas artificiales. Ejemplo 1S Aislamiento de Cromosomas de Metafase a partir de Protoplastos Los cromosomas artificiales, una vez detectados en las células de las plantas pueden aislarse por transferencia a otros organismos y en particular otra especie de planta. Varios procedimientos pueden utilizarse para aislar cromosomas de metafase a partir de células de plantas mitóticas detenidas, incluyendo, pero no limitándose a, un sistema regulador basado en poliamina (Cram et al. (1990) Methods in Cell Biology 33:377-3821), un sistema regulador de hexilenglicol modificado (Hadlaczky et al. (1982) Chromosoma 86:643-65) , un sistema regulador de sulfato de magnesio (Van den Engh et al. (1988) Cytometry 9:266-270 y Van den Engh et al. (1984 ) Cytometry 5:108), un sistema regulador de fijación del ácido acético (Stoehr et al. (1982) Histochewistry 74:51 -61) , y una técnica que utiliza KC1 ipotónico y yoduro de propidio (Cram et al. (1994) XVII meeting of the International Society for Analytical Cytology, october 16-21, Tutorial IV Chromosome Analysis and Sorting wit Cowmercia'l Flow Cytometers; Cram et al., (1990) Methods in Cell Biology 33:376; de Jon et al. (1999) Cytometry .35:129-133) · En un procedimiento e emplar, se ¦ utiliza un regulador de Hexilenglicol para aislar los cromosomas de la planta a partir de células de planta detenidas mitóticas que se han convertido en protoplastos (Hadlaczky et SLI. (1982) Chromosoma 86: 643-659) . Los cromosomas se aislan a partir de aproximadamente 10s células mitóticas, se re'suspenden en un regulador de glicina-hexílenglicol (100 mM de glicina, 1% de hexilenglicol, pH 8.4-8.6, se ajustan con una solución de Ca(OH)2) saturado suplementado con 0.1% de Tritón X-100 (regulador GHT) . Las células se incuban durante 10 minutos a 37 °C y los cromosomas se purifican por centrifugación diferencial para granular el núcleo (200xg durante 20 minutos) y centrifugación por gradiente de sacarosa (5-30% de sacarosa, 5600xg durante 60 minutos, 0~4°C) . Para evitar la degradación proteolítica de las proteínas cromosomales , se utiliza. lmM de PMSF ( fenilmetíIsulfonilfluoruro) en la presencia de 1% de alcohol ísopropílico . Las proteínas pueden extraerse de los cromosomas aislados utilizando extracción de heparina de sulfato de dextrano (DSH) y los cromosomas pueden visualizarse a través de microscopía de electrón utilizando técnicas conocidas en el arte (Hadlaczky et (1982) Chromosoma (Berl . ) 86 : 643-659 ; Hadlaczky et al. (1981) Chro osoma (Berl.) 81:537-555) . Adicionalmente , las modificaciones de estos procedimientos, incluyendo · pero no limitándose a la modificación de la composición reguladora (Carrano et al. (1979) Proc. Nati. Acad. Sel. ?.? 76·:1382-1384) y variación del tiempo o velocidad de centrifugación, para. acomodar diferentes especies de plantas puede implementarse por cualquier experto en la técnica - Ejemplo 16 Transferencia de Cromosomas Artificiales en cé§ lulas de Plantas: Transferencia de Cromosomas Artificiales de Mamífero en una Planta Dicotiledónea: Arabidopsis Un método para suministrar cromosomas artificiales de mamífero (los MAC) en células de plantas es la formación de microcélulas que contienen los MAC murinos y la incorporación ' mediada por CaP0 o la fusión mediada por PEG de estas microcélulas con protoplastos de planta. En este-ejemplo, las microcélulas y protoplastos de planta, tales como, pero no limitadas a protoplastos de tabaco y Arabidopsis, se mezclaron (en una serie de 25:1, 10:1, 5:1 o 2:1 en relación a microcélulas :protoplastos) y se observó la fusión. Los protocolos para la formación de microcélulas se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,240,840, 4,806,476, y 5,298,429 y en Fournier Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (1981) 78:6349-6353 y Lambert et al. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (1991) 88:5907-5912.. Las microcélulas murinas pueden marcarse con Idu o los IVIAC teñidos con un tinte específico tal como, pero no limitado a, por ejemplo, yoduro de propidio o DAPI, antes de la fusión con protoplastos de planta incluyendo, pero no limitándose a, protoplastos de Arabidopsis y tabaco, para facilitar la detección de la presencia de los IVIAC en los protoplastos. En este ejemplo, los MAC se introdujeron en células Arabidopsis utilizando fusión mediada por mic-trocélula-PEG.

Las microcélulas se formaron a partir de células de murino que contienen un cromosoma artificial (véase Patente Norteamericana No. .6,077,697), y se combinaron con protoplastos de Arabidopsis ¦ recientemente preparados en una relación de 10:1, microcélulas a protoplastos. La fusión ocurrió en la presencia de 25% de PEG 6000, 204 imM de CaCl2, pH 6.9 dentro de los primeros 5 minutos de mezclado. Normalmente menos de aproximadamente un minuto de mezclado se requirió para observar la fusión entre las microcélulas y los protoplastos. Las células combinadas se lavaron con 240 mM de CaCl2, luego flotaron en la parte superior de una solución de 204 mM de sacarosa en sales B5. Las células se transfirieron a medios de cultivo celulares (MS, 87 mM de sacarosa, 2.7 µ? de ácido naftalenacético, 0.23 µ? de quinetina, pH 5.8). Pueden utilizarse observaciones empíricas para determinar la concentración ópcima y la composición del PEG y la concentración de calcio que proporciona el más alto grado de fusión con la mínima toxicidad. Los protoplastos combinados se permitieron cultivar por una o más generaciones. La presencia de una secuencia cromosomal de ratón, incluyendo los MAC, se demostró por hibridación southern con sondas MAC, por análisis FISH y por análisis de PCR utilizando, por ejemplo, secuencias satélite conocidas para existir en el cromosoma MAC - Así, las · secuencias de ratón se detectaron en los protoplastos de Arabidopsis. Para demostrar además la transferencia de la secuencia cromosomal de ratón para protoplastos Arabidopsis, los núcleos celulares de planta Arabidopsis se aislaron de acuerdo con el Ejemplo 11 y se sometieron a análisis FISH de acuerdo al Ejemplo 13, utilizando el ADM satélite principal de ratón (SEC. DE IDENT. NO: 12). Una porción del núcleo-contuvo una señal significativa utilizando el ADN satélite principal , indicando transferencia exitosa de al menos un cromosoma de ratón y/o MAC al núcleo de Arabidopsis. Similarmente, los PAC pueden introducirse en protoplastos de Arabidopsis utilizando procedimientos de fusión mediados por PEG y/o calcio. La generación de mxcroplastos y protoplastos puede conducirse cotno se describe por ejemplo, en el Ejemplo 1. Los microplastos formados a partir de las células de planta que contienen un cromosoma artificial de planta se combinan con protoplastos Arabidopsis recientemente preparados, por ejemplo en una relación de 10:1 de microprotoplastos a protoplastos. Los protoplastos, a partir de otras plantas, que incluyen, pero no se limitan a tabaco, trigo, maíz y arroz, pueden también utilizarse como el receptor de los MAC y/o los PAC. Los protoplastos combinados se recuperan y se permite cultivar d-i-irante una o más generaciones. La presencia de los PAC transferidos puede analizarse utilizando métodos tales como,- por ejemplo, aquellos descritos en la presente (incluyendo hibridación Southern con sondas PAC , análisis FISH y análisis PCR utilizando secuencias de ADN específicas al PAC) . Ejemplo 17 Transferencia de Cromosomas Artificiales en Células de Plantas: Transferencia de Cromosomas Artificiales de Mamífero en una Segunda Planta Dicotiledónea: Tabaco Se introdujeron los MAC en células de tabaco utilizando fusión mediada por microcélula-PEG utilizando las mismas microcélulas, MAC, y el protocolo como se describe en el Ejemplo 16. Las microcélulas se formaron a partir de células de murino conteniendo un cromosoma artificial y se combinaron con protoplastos BY-2 de tabaco recientemente preparado en una relación de 10:1, microcélulas a protoplastos. La fusión ocurrió en la presencia de 20% de PEG 4000 y 100-200 mM de cloruro de calcio. Las observaciones empíricas se utilizaron para determinar la concentración óptima y composición de PEG y la concentración de calcio que proporciona el grado más elevado de fusión con la mínima toxicidad . La tinción DAPI de las microcélulas (por ejemplo, por preincubación de las microcélulas con DAPI agregando DAPI a las microcélulas a una concentración final de 1 /xg/ml) permitió la visualización de la fusión y transferencia de los cromosomas a los protoplastos de tabaco. Los protoplastos combinados se recuperaron y se permitieron cultivar por una o más generaciones. Los protoplastos combinados pueden analizarse por la presencia de una MAC en un número de formas, incluyendo aquellas descritas en la presente. Se aislaron los núcleos de célula de tabaco combinados a partir de protoplastos de tabaco que habían sido combinados con microcélulas de acuerdo al Ejemplo 11 y se sometieron a análisis FISH de acuerdo al Ejemplo 13, utilizando el ADN satélite principal de ratón (SEC. DE IDENT . NO: 12) . Numerosos núcleos se encontró que habían incorporado un cromosoma de ratón. Ejemplo 18 Transferencia de Cromosomas Artificiales aislados por Transferencia Mediada por Lípido en una Planta Monocotiledónea : Arroz Los cromosomas artificiales de murino aislados (los MAC) preparados clasificando a través de un aparato FACS (de Jong et al. Cytometry (1999) 35:129-133) se transfirieron en protoplastos de planta de arroz por transfección mediada por lípido catiónico del MAC purificado. Los MAC purificados (véase Ejemplo 15 y la Patente Norteamericana No. 6,077,697) se mezclaron con LipofectAMINE 2000 (Gibco, Mci, USA) como sigue . Normalmente, se agregaron 15 µ? de LipofectAMINE 2000 a 1 X 106 cromosomas artificiales en regulador líquido, la solución se dejó complejar por hasta tres horas, y luego la soluc ón se agregó a protoplastos de arroz 1 X 105 recientemente preparados utilizando métodos de protoplasto estándares bien conocidos en la técnica. La incorporación del 5 cromosoma artificial se complejo por lípido se verificó agregando a ' la mezcla de protoplastos y cromosomas artificia-Ies purificados un tinte fluorescente que tiñe el ADN. La examinación por microscopio de la mezcla de cromosoma de protoplasto/artificial sobre las siguientes varias horas permitió · la visualización del cromosoma artificial que se transporta a través de la membrana celular de protoplasto y la presencia del MAC fácilmente identificable en el citoplasma de la célula de planta de arroz. El mismo procedimiento como se describe en este Ejemplo para transferencia mediada por lípido de un MAC aislado en los protoplastos de arroz puede utilizarse para transferir los MAC aislados, así como los PAC, en arroz y otros protoplastos de planta, incluyendo pero no limitándose a, tabaco, trigo, maíz y Arabidopsis . Los protoplastos combinados se recuperaron y permitieron cultivar por una o más generaciones . La presencia de los MAC los PAC transferidos puede analizarse utilizando métodos tales como, por ejemplo, aquellos descritos en la presente, (incluyendo, pero no limitándose a hibridación Southern con. sondas PAC, • •25 análisis FISH y análisis de PCR utilizando secuencias de ADN específicas al PAC) . Ejemplo 19 Suministro de Planta Reguladora y Secuencias de Codificación a Través el Gen Marcador attBZeo menos Promotor en pAg2 en un MAC de plataforma Como se describe en los Ejemplos 6-15, el plásmido. pAg2 , que comprende la planta reguladora y los genes marcadores seleccionadle (SEC. DE IDENT. NO: 6; preparado como se establece en el Ejemplo 5) puede utilizarse para la producción de un MAC que contiene tales genes expresables de planta. En este e emplo, pAg2 , en virtud de las secuencias de ADN attBZeo contenidas en el plásmido, se utiliza para cargar la planta reguladora y genes marcadores seleccionables en los MAC en células de mamífero utilizando las secuencias attB para recombinar con las secuencias attP en un MAC de plataforma. En este ejemplo, los . MAC se producen con secuencias attP y el plásmido pAg2 se carga entonces en la plataforma MAC. Nuevos MAC así producidos son útiles para la introducción en células de plantas, en virtud de los marcadores expresables de planta contenidos en La presente. A. Construcción de MAC de Plataforma que contienen pSV40attPsensePUR (Figura 7; SEC. DE IDENT. NO: 26). Un ejemplo de un sistema marcador gseleccionable para la creación de plataforma basada en MAC e donde el plásmido pAg2 puede llevar a cabo la planta ^reguladora y secuencias de codificación se muestra en la Figura 7. Este sistema incluye un vector que contiene un primer promotor SV40 inmediatamente seguido por (1) una secuencia de 282 pares de bases (pb) conteniendo el sitio attP lamba bacteriófago y (2) el marcador de resistencia a puromicina. Inicialmente , un fragmento de Pvu.il/Stul que contiene el primer promotor SV40 a partir del plásmido pUR (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, GA; SEC . DE IDENT . NO: 22) se subclonó en el sitio EcoRI/ Rl de pNEB193 (un derivado PUC19 obtenido de New England Biolabs, Beverly, MA; SEC. DE IDENT. NO: 23) generando el plásmido pSV40193. El sitio attP fue PCR amplificado a partir del genoma lambda (GenBank No. de Acceso NC 001416) utilizando los siguientes cebadores : AttPUP: CCTTGCGCTAATGCTCTGTTACAGG SEC. DE IDENT. NO: 24 AttPDW : CAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTG SEC. DE IDENT. NO: 25 Después de la amplificación y purificación del fragmento resultante, el sitio attP se clonó en el sitio Smal de pSV40193 y la orientación del sitio attP se determinó por análisis de secuencia de ADN (plásmido pSV40193attP) . El gen que codifica la resistencia a la puromicina (Puro) se aisló digiriendo el plásmido pUR (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) con Agel/BamHI seguido llenando las salientes con Klenow y clonando . subsecuentemente en el sitio Asci corriente abajo del sitio attP de pSV40193attP generando el plásmido pSV40193eittPsensePUR (Figura 7; SEC. DE IDENT. NO: 26)). El plásmido pSV40193attPsensePUR se digirió con Seal y co-transfectó con el plásmido pFK161 en células LMtk de ' ratón y los cromosomas artificiales de platforma se identificaron y aislaron como se describe en la presente. Brevemente, las colonias resistentes a puromicina se aislaron, y subsecuentemente se probaron para la formación de cromosoma artificial a través de hibridizacion in situ fluorescente (FISH) (-Utilizando secuencias de repetición de ADN mayor y menor, el gen de puromicina y secuencias teloméricas como sondas) , y la célula que activa la fluorescencia clasificada (FACS) . A partir de este tipo, un subclon se aisló conteniendo un cromosoma artificial, designado B19-38. El análisis FISH del subclón B19-38 demostró la presencia de telómeros y ratón menor en el MAC. DOT PCR se ha hecho revelando la ausencia de regiones eucromáticas no caracterizadas en el MAC. El proceso para generar esta plataforma MAC ejemplar que contiene múltiples sitios de recombinación sitio-específicos se resume en la Figura 5. Este cromosoma de MAC puede subsecuentemente diseñarse para contener los ácidos nucleicos de expresión , genética objetivo utilizando el sistema de recombinación sitio-específica mediado por integrasa como se describe posteriormente. B. Construcción del Vector Objetivo La construcción del vector objetivo pAg2 se establece en el Ejemplo 5 en la presente. C. Transfeccion de Marcador menos Promotor y Selección con Fármaco (Véase Figura 9) La línea celular LMtk de ratón que contiene el MAC B19-38 (construido como se establece anteriormente y también referido como un ACE de plataforma de 2a generación) , se colocan en placas de cuatro platillos de 10 cm en aproximadamente 5 millones de células por platillo. Las células se incuban durante la noche en DMEM con 10% de suero de bovino fetal a 37°C y 5% de C02 - El siguiente día las células se transfectaron con 5 µ, del vector pAg2 (preparado como se describe en el Ejemplo 5 anterior) Y 5 M9 de pCXLamlntR (que codifica una integrasa lambda que tiene una sustitución de aminoácido E a R en la posición 174) , para un total de 10 /¿g por disco de 10 cm. El reactivo de Lipofectamina Plus se utilizó para transfectar las. células de acuerdo al protocolo de los fabricantes. Se agrega dos dias después de la transfeccion al medio a 500 /zg/ml - Las células se mantienen en medio selectivo hasta que se forman las colonias. Las colonias se clonan en el anillo y se analiza el ADN genómico. D. Análisis de Clones (SECUENCIA, PCR) El ADN genómico (incluyendo los MAC) se aisla a partir de cada uno de los clones candidatos c n el equipo Wizard (Promega) y siguiendo el protocolo de los fabricantes.

El siguiente conjunto cebador se utiliza para analizar el ADN genómico aislado a partir de los clones resistentes a zeocina: 5PacSV40 - CTGTTAATTAACTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTG (SEC. DE IDENT. NO: 28); Zeo - Antisentido TGAACAGGGTCACGTCGTCC (SEC . DE IDENT. NO: 29) . La amplificación de PCR que utiliza los cebadores anteriores y ADN genómico, que incluyen los MAC a partir de los clones-candidatos resulta en un producto PCR que indica la secuencia correcta para el acontecimiento de integración sitióespecífico deseado. Los MAC que contienen el vector pAg2 se identifican y utilizan para transferir en la planta (tal como se describe en los Ejemplos 16 y 17) o células de animal para la expresión de las secuencias de codificación deseadas contenidas en la presente. Los MAC que contienen pAg2 transportan . dos marcadores seleccionables de planta (resistencia a higromi'cina, resistencia a fosfinotricina) y un marcador seleccionable visual (proteína fluorescente verde) . Ejemplo 20 Construcción de Cromosoma Artificial de Propulsión derivado de Planta En otra modalidad, los cromosomas, artificiales de planta proporcionados en la presente son útiles como vectores de propulsión seleccionables que son capaces' de mover uno o más genes deseados de un lado a otro entre las células de planta y de mamífero. En esta modalidad particular, el cromosoma artificial de planta es bi-funcional en que la integración propia del ácido nucleico donador puede seleccionarse tanto en las células de planta y de mamífero. Por ejemplo, un cromosoma artificial se prepara como se describe en los Ejemplos 6-15 anteriores utilizando el plásmido pAg2 (Ejemplo 5; SEC. DE IDENT . NO: 6) que se ha modificado para incluir la región de codificación SV40attPsensePur a partir del plásmido pSV40l93attPsensePur (descrito anteriormente en el Ejemplo 19.A.) · Así, el cromosoma artificial de propulsión derivado de planta resultante contiene ADN a partir del gen bar confiriendo resistencia a fosfinotricina en las células de la planta, ADN del gen de resistencia a la higromicina confiriendo resistencia a higromicina en las células de la planta, los ADN que codifican resistencia bajo el control de un promotor 35S de virus de mosaico de coliflor separados (Ca V) , el ADN que codifica la resistencia a zeomicina menos promotora attB, y el ADN que confiere resistencia a puromicina bajo el control de un promotor SV40 de mamífero. Por consiguiente, la presencia del PAC de impulso en ya sea una célula de planta o de mamífero puede seleccionarse por el tratamiento con, por ejemplo, ya sea higromicina (planta) o puromicina. (mamífero) . Debido a que el cromosoma artificial de impulso derivado de planta resultante contiene al menos un sitio SV40attP en la presente similar al MAC de plataforma prepardo en el Ejemplo 19.A. anterior, un vector donador que contiene una secuencia marcadora seleccionable de attB, tal como un plásmido que comprende un attBzeo (por ejemplo, pAg2) puede utilizarse para introducir selectivamente ácidos nucleicos heterólogfos deseados a partir de cualquier especie (tal como plantas, animales, insectos y similares) en el cromosoma artificial de impulso que se presenta en una célula de mamífero . Asi mismo, una región promotora de planta, tal como CaMV35S, puede utilizarse para reemplazar el promotor SV40 en la región SV40attPPur del plásmido pAg2 modificado descrito anteriormente. En esta modalidad, debido a que el cromosoma artificial de impulso derivado de planta resultante contiene al menos un sitio CaMV35SattP en la presente los análogos del MAC de plataforma preparados en el Ejemplo 19.A. anterior, un vector donador que contiene una secuencia marcadora seleccionable de attB, tal como un plásmido que tiene attBkanamicina, u otro marcador seleccionable o clasificable de planta puede utilizarse para introducir selectivamente ácidos nucleicos heterólogos deseados a partir de cualquier especie (tales como plantas, animales, insectos y similares) en el cromosoma artificial de impulso que se presenta en una célula de planta.

Ya que las modificaciones serán aparentes por aquellos expertos en la técnica, se pretende que esta invención se limite por únicamente el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (132)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para producir un cromosoma artificial, caracterizado porque comprende: introducir ácido nucleico en una célula que comprende uno o más cromosomas de planta; y seleccionar una célula que comprende u cromosoma artificial que comprende una o más regiones de repetición en donde : una o más unidades del ácido nucleico se repiten en una región de repetición; repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y la o las regiones de repetición contienen cantidades sustancialmente equivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromá ico .
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cromosoma artificial se hace predominantemente de hasta una o más regiones de repetición.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico introducido en la célula comprende una secuencia de ácido nucleico cgue facilita la amplificación de una región de un cromosoma ele planta o que dirige al ácido nucleico a una región amplif icable de un cromosoma de planta.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico introducido en la célula comprende uno o más ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste de ADNr, ADN de fago lambda y ADN satélite .
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el ácido nucleico comprende el ADN de planta .
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el ADNr es de una planta seleccionada del grupo que consiste de Arabidopsis, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, Daucus, Hordeum, Zea mays, Brassica, Triticum y Oryza .
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el ácido nucleico 'Comprende el ADNr de animal .
8. 8. El método de conformidad con la re vindicación 7, caracterizado porque el ADNr es ADNr de mamífero.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el ácido nucleico comprende el ADNr que comprende una secuencia de una región espadadora intergénica.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la región espadadora intergénica es de ADN de una planta seleccionada del grupo 'que consiste de Arabidopsis, Solanum, Lycopersicon, Hordeu , Zea., Oryza, centeno, trigo, rábano y judia de Lima.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque el ácido nucleico introducido en la célula comprende una secuencia de ácido nucleico que facilita la identificación de células que contienen el ácido nucleico.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína fluorescente.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la proteina es una proteína fluorescente verde.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de seleccionar una célula que comprende un cromosoma artificial comprende clasificar células en donde se introdujo el ácido nucleico.
15. 15. El método de conformidad con la re vindicación 1, caracterizado porque la etapa de seleccionar: una célula que comprende un cromosoma artificial comprende análisis de hibridación in si tu fluorescente (FISH) de las células en donde se introdujo el ácido nucleico.
16. 16. El método de conformidad con la r ivindicación 1, caracterizado porque uno o - más cromosomas de planta contenidos en la célula se seleccionan a partir del grupo que consiste de Arabidopsis, tabaco y cromosomas de Helianthus .
17. 17. El ¦ método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la célula es un protoplasto de planta.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico introducido en la célula comprende ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el marcador seleccionable confiere resistencia a fosfinotricina, glufosinato de amonio, glifosato, kanamicina, higromicina, dihidrofolato o sulfonilurea.
20. 20. Un cromosoma artificial de planta aislado, caracterizado porque comprende una o más regiones de repetición, en donde: una o más unidades del ácido nucleico se repiten en una región de repetición; las repeticiones de la unidad del ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y la o las regiones de repetición contienen cantidades sustancialmente equivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromático.
21. 21. El cromosoma artificial de planta de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el cromosoma artificial se hace predominantemente ele una o más regiones ole repetición.
22. 22. La célula de planta, caracterizada porque comprende un cromosoma artificial, en donde el cromosoma artificial se produce por el método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
23. 23. El método para producir una planta transgénica, caracterizado porque comprende introducir el cromosoma artificial de conformidad con la reivindicación 20 o la reivindicación 21 en una célula de planta.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el cromosoma artificial comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica un producto genético.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico heterólogo codifica un producto seleccionado del grupo que consiste de enzimas, AR antisentido, A Nt, ADNr, pr..teínas estructurales, proteínas marcadoras, ligandos, receptores, ribozimas , proteínas terapéuticas y proteínas biofarmacéuticas .
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico heterólogo codifica un producto seleccionado del grupo que consiste de vacunas, factores sanguíneos, antígenos, hormonas, citocinas, factores de crecimiento y anticuerpos.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico heterólogo codifica un producto que proporciona la resistencia a enfermedades, insectos, herbicidas o tensión en la planta.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico heterólogo codifica un producto que proporciona un rasgo agronómicamente importante en la planta.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico heterólogo codifica un producto que altera la utilización del nutriente y/o mejor-a la calidad del nutriente de la planta.
30. 30. El ' método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico heterólogo se contiene dentro de un cromosoma artificial bacterial (BAC) o un cromosoma artificial de levadura (YAC) .
31. 31. ün método para identificar genes ¿le planta que codifican rasgos particulares, caracterizado porque comprende : generar un cromosoma artificial que comprende ADN eucromático a partir de una primera especie de planta; introducir el cromosoma artificial en una célula de planta de una segunda especie de planta; y detectar los cambios fenotípicos en la célula de planta que comprende el cromosoma artificial y/ una planta generada a partir de la célula de planta que comprende el cromosoma, artificial .
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el cromosoma artificial es un cromosoma, artificial de planta o un cromosoma artificial de mamífero.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el cromosoma artificial se produce por un método, que comprende: introducir el ácido nucleico en una célula que comprende uno o más cromosomas de planta; y seleccionar una célula de planta que comprende un cromosoma artificial que comprende una o más regiones de repetición, en donde: las repeticiones de la unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y la o las regiones de repetición contienen cantidades sustancxalmente equivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromático .
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el cromosoma artificial s produce por un método que comprende: introducir el ácido nucleico en una célula de planta; y seleccionar una célula de planta que comprende un SATAC .
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el cromosoma artificial es un minicrocomsoma producido por un método, que comprende: introducir el ácido nucleico en una célula de planta; y seleccionar una célula que comprende un minicromosoma que comprende un neo-centrómero y eucromatina .
36. 36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-35, caracterizado porque el ácido nucleico Introducido en la célula de planta comprende ADN que codifica un marcador seleccionable .
37. 37. El 'método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el marcador seleccionable confiere resistencia a fosfinotricina, glufosinato de amonio, glifosato, kanamicina, higromicina, dihidrofolato o sulfonilurea .
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el cromosoma artificial que comprende ADN eucromático a partir de una primera especie de planta se produce por un método que comprende: introducir en una célula de planta una primera especie de planta un cromosoma artificial capaz de experimentar recombinación homologa con el ADN de la primera especie de planta; seleccionar para un acontecimiento' de rrecombinación entre el cromosoma artificial y el ADN de la primera especie de planta. ; y seleccionar un cromosoma artificial que comprende ADN eucromática a partir de la primera especie de planta.
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el cromosoma artificial que comprende ADN eucromático a partir de una primera especie de planta se produce por el método que comprende: introducir en una célula de planta de una primera especie un cromosoma artificial capaz de experimentar recombinación sitio-específica con el ADN de la primera especie de planta; seleccionar para un acontecimiento de recombinación sitio-specifica entre el cromosoma artificial y el ADN de la . primera especie de planta; y seleccionar un cromosoma artificial que comprende el ADN eucromático a partir de la primera especie de planta.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el ADN de la célula de planta de una primera especie se modifica para comprender una secuencia de recombinación sitio-específica.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el cromosoma artificial comprende una secuencia de recombinación sitio-específica.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el ADN de la célula de planta de una primera especie se modifica para comprender una secuencia de recombinación sitio-especifica y el cromosoma artificial comprende una secuencia de recombinación sitio-especifica.
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el ADN de la célula de planta de una primera especie se modifica para comprender una secuencia de recombinación sitio-especifica y el cromosoma artificial comprende una secuencia de recombinación sitio-especifica que es complementaria a la secuencia de recombinación sitio-especifica de la célula de. la planta de una primera especie de planta .
44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la recombinación sitio-especifica se cataliza por una enzima recombinasa.
45. 45. Un método para producir un cromosoma de planta acrócéntrico, caracterizado porque comprende: introducir un primer ácido nucleico que comprende un sitio de recombinación sitio-especifico en un primer cromosoma de una célula de planta; introducir un segundo ácido nucleico que comprende un sitio de recombinación sitio-especifico en un segundo cromosoma de la célula de planta; introducir una actividad de recombinasa en la célula de la planta; en donde la actividad cataliza la recombinación entre el primer y segundo cromosomas y por lo que se produce un cromosoma de planta acrocéntrico .
46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el primer ácido nucleico se introduce en la heteroromatina pericéntrica del primer cromosoma .
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el segundo ácido nucleico se introduce en el extremo distal del brazo del segundo cromosoma .
48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el primer ácido nucleico se introduce en la heterocromatina pericéntrica del primer cromosoma y el segundo ácido nucleico se introduce en el extremo distal del brazo del segundo cromosoma.
49. 49. Un método para producir un cromosoma de planta acrocéntrica, caracterizado porque comprende: introducir un primer ácido nucleico que comprende un sitio de recombinación sitio-específico en la heterocromatina pericéntrica de un cromosoma en una célula, de planta; introducir un segundo ácido nucleico que comprende un sitio de recombinación sitio-específico en el extremo distal del cromosoma, en donde el primer y segundo sitios de recombinación se ubican en el mismo brazo del . cromosoma ; introducir una actividad de recombinasa en la célula, en donde la actividad cataliza la recombinación entre el primer y segundo sitios de recombinación en el cromosoma y por lo que un cromosoma de planta acrocéntrico se produce.
50. 50. Un método para producir un cromosoma de planta acrocéntrica , que comprende: introducir un ácido nucleico que comprende un sitio de recombinación adyacente al ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable en una primera célula de planta; generar una primera planta transgénica a partir de la célula de la planta; introducir el ácido nucleico que comprende un promotor funcional en una célula de planta, un sitio de recombinación, y una región que codifica la recombinasa en enlace operativo en una segunda célula de planta; generar una segunda planta transgénica a partir de la segunda célula de planta; cruzando la primera y segunda plantas; obtener plantas resistentes a un agente que selecciona para células que contienen el ácido nucleico que codifica el marcador seleccionable; y seleccionar una planta resistente que contiene células que comprenden un cromosoma de planta acrocéntrico.
51. 51. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-50, caracterizado porque el ADN del brazo corto del cromosoma acrocéntrico contiene menos de 5% de ADN eucromático .
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el ADN del brazo corto del cromosoma acrocéntrico contiene menos de 1% de ADN eucromático.
53. 53. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-50, caracterizado porque el brazo corto del cromosoma acrocéntrico no contiene ADN eucromático.
54. 54. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-49 caracterizado porque el ácido nucleico introducido en un cromosoma comprende el ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable .
55. 55. Un cromosoma artificial de planta acrocéntrico, en donde el brazo corto del cromosoma acrocéntrico no contiene el ADN eucromático.
56. 56. Un método para producir un cromosoma artificial de planta, caracterizado porque comprende: introducir ácido nucleico en un cromosoma acrocéntrico de planta en una célula, en donde el brazo corto del cromosoma acrocéntrico no contiene el ADN eucromático; cultivar la célula a través de al menos una división celular; y seleccionar una célula que comprende un cromosoma artificial que es predominantemente heterocromático .
57. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el cromosoma acrocéntrico se produce por el método de cualquiera de las reivindicaciones 45-49.
58. 58. Un método para producir un cromosoma artificial, caracterizado porque comprende: introducir el ácido nucleico en una célula de planta; y seleccionar una célula de planta que comprende un cromosoma artificial que comprende una o más regiones de repetición en donde : una o más unidades de ácido nucleico se repiten en una región repetida; repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico; y las secuencias de ácido nucleico comunes comprenden secuencias que representan ácido nucleico eucromático y heterocromático .
59. 59. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el ácido nucleico comprende ADNr de planta a partir de una especie de planta dicotiledónea.
60. 60. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el ácido nucleico comprende ADNr de planta a partir de una especie de planta monocotiledónea .
61. 61. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la región espadadora intergénica es de ADN a partir de una planta Nicotiana.
62. 62. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el ANDr es ADNr de planta.
63. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la planta es una especie de planta dicotiledónea .
64. 64. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la planta es una especie de planta monocotiledonea .
65. 65. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula es una célula de planta dicotiledónea .
66. 66. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula es una célula de planta monocotiledonea .
67. 67. Un cromosoma artificial de planta aislada, caracterizado porque comprende una o más regiones de repetición, en donde: una o más unidades de ácido nucleico se repiten en una región de repetición; repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y las secuencias de ácido nucleico comunes comprenden secuencias que representan ácido nucleico eucromático y heterocromático .
68. 68. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el cromosoma artificial se produce por un método que comprende: introducir el ácido nucleico en una célula de planta; y seleccionar una célula de planta que comprende un cromosoma artificial que comprende una o más regiones de repetición, en donde: las repeticiones de la unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y las secuencias de ácido nucleico comunes comprenden secuencias que representan ácido nucleico eucromático y heterocromático .
69. 69. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la recombinasa se selecciona del grupo que consiste de recombinasa Cre Pl bacteriófago, una recombinasa de R de levadura y una recombinasa de FLP de levadura .
70. 70. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque comprende seleccionar la primera y segunda plantas transgénicas en donde: una de las plantas comprende un cromosoma que comprende un sitio de recombinación ubicado en un brazo corto del cromosoma en una región adyacente a la heterocromatina pericéntrica; y la otra planta · comprende un cromosoma que comprende un sitio de recombinación ubicado en el ADNr del cromosoma.
71. 71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque los sitios de recombinación en los dos cromosomas están en la misma orientación.
72. 72. Un método para producir un cromosoma de planta acrocéntrico, caracterizado porque comprende: introducir el ácido nucleico que comprende dos sitios de recombinación sitio-especificos en una célula que comprende uno o más cromosomas de planta; introducir una actividad de recombinasa en la célula, -en donde la actividad cataliza la recombinación entre los dos sitios de recombinación, por lo que se produce un cromosoma acrocéntrico de planta.
73. 73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque los dos sitios de recombinación sitio-específicos se contienen en fragmentos de ácido nucleico separados.
74. 74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque los fragmentos de ácido nucleico separados se introducen en la célula simultánea o secuencialmente .
75. 75. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el cromosoma artificial es predominantemente heterocromático .
76. 76. Un método para producir un cromosoma artificial de planta, caracterizado porque comprende: introducir el ácido nucleico en un cromosoma de planta en una célula, en donde el cromosoma contiene regiones adyacentes de ADNr y ADN heterocromático; cultivar la célula a través de al menos una división celular; y seleccionar una célula que comprende un cromosoma artificial . •
77. 77. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el cromosoma artificial es predominantemente heterocromático .
78. 78. El método de conformidad con la reivindicación 76, o la reivindicación 77, caracterizado porque el cromosoma de planta en donde el ácido nucleico se introduce es un cromosoma acrocéntrico .
79. 79. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el brazo corto del cromosoma contiene regiones adyacentes de ADNr y ADN heterocromático.
80. 80. El método de conformidad con la reivindicación 76, 77 ó 79, caracterizado porque el ADN heterocromático es heterocromatina pericéntrica.
81. 81. Un vector, caracterizado porque comprende: ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor, en donde el marcador selecciónatele permite el crecimiento de células de animal en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células del animal; y en donde el agente no es tóxico a las células de la planta ; un sitio de reconocimiento para la recombinación; y una secuencia de nucleótidos que facilita la amplificación de una región de un cromosoma de planta o que dirige el vector a una región amplificable de un cromosoma de planta .
82. 82. El vector de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque la región amplificable comprende ácido nucleico heterocromático .
83. 83. El vector de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque la región amplificable comprende ADNr.
84. 84. El vector de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que facilita amplificación de una región de un cromosoma de planta o dirige el vector a una región amplificable de un cromosoma de planta comprende una porción suficiente de una región espadadora intergénica del ADNr para facilitar la amplificación o efectuar el objetivo.
85. 85. El vector de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la porción suficiente contiene al menos 14, 20, 3C, 50, 100, 150, 300 ó 500 nucleótidos contiguos a partir de una región espaciadora intergénica.
86. 86. El vector de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el marcador seleccionable codifica un producto que confiere resistencia a la zeomicina.
87. 87. .Un vector de transformación de planta, caracterizado porque comprende: un sitio de reconocimiento para la recombinación; una secuencia de nucleótidos que facilita la amplificación de una región de un cromosoma de planta o dirige el vector a una región amplificable de un cromosoma de planta; y uno o más marcadores seleccionables que cuando se expresan en una célula de planta permiten la selección de la célula; en donde el vector de transformación de planta es para la transformación mediada por Agrobacterium de plantas.
88. 88. El vector de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el sitio de reconocimiento comprende un sitio att.
89. 89. El vector de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque es pAglla o pAglIb.
90. 90. Un vector, caracterizado porque comprende: ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor, en donde el marcador seleccionable permite el crecimiento de células de animal en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células del animal; y en donde el agente no es tóxico a las células de planta; un sitio de reconocimiento para la recombinación; y ácido nucleico que codifica una proteina enlazada operablemente a un promotor de planta.
91. 91. El vector de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el sitio de reconocimiento comprende un sitio att.
92. 92. El vector de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque comprende además una secuencia de nucleótidos que facilita la amplificación de una región de un cromosoma de planta o dirige el vector a una región amplificable de un cromosoma de planta.
93. 93. El vector de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el promotor es nopalina sintasa (NOS) o CAMV35S.
94. 94. El vector de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque es pAgl o pAg2.
95. 95. El vector de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque la región amplificable comprende ácido nucleico eterocromático .
96. 96. El vector de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque la región amplificable comprende ADNr .
97. 97. El vector de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la secuencia de los nucleótidos que facilita la amplificación de una región de un cromosoma de planta o dirige el vector a una región amplificable de un cromosoma de planta comprende una porción suficiente de una región espadadora intergénica de ADNr para efectuar la amplificación o el objetivo.
98. 98. El vector de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque la proteina es un marcador seleccionable que permite el crecimiento de células de planta en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células de la planta.
99. 99. El vector de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque el marcador seleccionable confiere resistencia a higromicina o a fosfotricina .
100. 100. El vector de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque la proteina es una proteina fluorescente .
101. 101. El vector de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la proteina fluorescente se selecciona del grupo que consiste de proteínas fluorescentes verdes, azules y rojas.
102. 102. Un vector, caracterizado porque comprende: ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor, en donde el marcador selecciónatele permite el crecimiento de células de planta en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células de la planta; y en donde el agente no es tóxico a células de animal; un sitio de reconocimiento para la recombinación; y ácido nucleico que codifica una proteina enlazada operablemente a un promotor de planta.
103. 103. Un vector, caracterizado porque comprende: un sitio de reconocimiento para la recombinación; y una secuencia de nucleótidos que ' facilita la amplificación de una región de un cromosoma de planta o dirige el vector a una región amplificable de un cromosoma de planta, en donde la planta se selecciona a partir del grupo que consiste de Arabidopsis, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, Daucus, Hordeum, Zea mays, Brassica, Triticum, Helianthus, Glycine, soya, Gossypium, algodón, Helianthus, girasol y Oryza.
104. 104. El vector de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el sitio de reconocimiento comprende un sitio att.
105. 105. La célula, caracterizada porque comprende un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 81-86 y 88-104.
106. 106. La célula de conformidad con la reivindicación 105, caracterizada porque es una célula de planta.
107. 107. Un método, caracterizado porque comprende: introducir un vector de conformidad con la reivindicación 90, en una célula, en donde: la célula comprende un ACes de plataforma animal que contiene un sitio de reconocimiento que recombina con el sitio de reconocimiento en el vector en la presencia de la recombinasa por esto, por lo que incorpora el marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor y el ácido nucleico que codifica una proteina operablemente enlazada a un promotor de planta en la plataforma ACes para producir un ACes de plataforma resultante.
108. 108. El método de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado porque los sitios de recombinación son sitios att .
109. 109. El método de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado porque el animal es un mamífero.
110. 110. El método de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado porque el ACes de plataforma comprende un promotor que hasta la recombinación se enlaza operablemente al marcador seleccionable que en el vector no se asocia operablemente con un promotor.
111. 111. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 107-110, caracterizado además porque comprende, transferir el ACes de plataforma resultante en una célula de planta para producir una célula de planta que comprende el Aces de plataforma.
112. 112. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque el ACes de plataforma resultante se aisla antes de la transferencia.
113. 113. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque el ACes aislado se introduce en una célula de planta por un método seleccionado del grupo que consiste de transfección de protoplasto, suministro mediado por lipido, liposomas, electroporación, sonoporación, microinyección, bombardeo de partícula, transformación mediada por filamento de carburo de silicio, incorporación de ADN mediada por polietilenglicol (PEG) , lipofección y sistemas portadores mediados por lipido.
114. 114. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque el ACes de plataforma resultante se transfiere por fusión de las células.
115. 115. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque las células son protoplastos de planta .
116. 116. El método de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado porque la célula es una célula de animal.
117. 117. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque la célula de animal es una célula de mamífero.
118. 118. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque comprende además cultivar la célula de planta que comprende el ACes de plataforma bajo condiciones por las que la proteina codifica por el ácido nucleico que se enlaza operablemente a un promotor de planta se expresa.
119. 119. Un método, caracterizado porque comprende: introducir un vector de conformidad con la reivindicación 81, en una célula de planta; cultivar las células de planta; y seleccionar una célula de planta que comprende un cromosoma artificial que comprende una o más regiones de repetición .
120. 120. El método de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque la porción suficiente del vector se integra en un cromosoma en la célula de planta para resultar en una amplificación de ADN cromosomal.
121. 121. El método de conformidad con la reivindicación 119 o la reivindicación 120, caracterizado porque: una o más unidades de ácido nucleico se repiten en una región de repetición, repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y la o las regiones de repetición contienen cantidades sustancialmente eguivalentes de ácido nucleico eucromático y heterocromático .
122. 122. El método de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque comprende además aislar el cromosoma artificial.
123. 123. Un método, caracterizado porque comprende: introducir un vector en una célula; en donde: i) el vector comprende: a) ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable que no se asocia operablemente con ningún promotor, en donde el marcador seleccionable permite el crecimiento de células de animal en la presencia de un agente normalmente tóxico a las células del animal; y en donde el agente no es tóxico a las células de planta; b) un sitio de reconocimiento para la recombinación; y c) ácido nucleico que codifica una proteina enlazada operablemente a un promotor animal; ii) la célula comprende: una plataforma del cromosoma artificial de planta (PAC) que comprende un sitio de recombinación y un promotor animal que hasta la recombinación se enlaza operablemente al marcador seleccionable que, en el vector, no se asocia operablemente con un promotor; iii) la introducción se efectúa bajo condiciones por las que el vector recombina con el PAC para producir una plataforma PAC de planta que contiene el marcador seleccionable enlazado operablemente al promotor; y cultivar la célula resultante bajo condiciones, por las que la proteina codifica por el ácido nucleico enlazada operablemente a un promotor animal se expresa.
124. 124. El método de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque el cromosoma artificial es un ACes.
125. 125. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque el PAC de plataforma de planta es un ACes.
126. 126. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico introducido en la célula comprende ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable .
127. 127. El vector de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque comprende uno o más marcadores seleccionables que cuando se expresan en la célula de planta permiten la selección de la célula.
128. 128. El método para producir un cromosoma artificial de planta, caracterizado porque comprende: introducir el vector de conformidad con la reivindicación 81, 87 ó 127 en una célula que comprende uno o más cromosomas de planta; y seleccionar una célula que comprende un cromosoma artificial que comprende una o más regiones de repetición, en donde una o más unidades' de ácido nucleico se repiten en una región de repetición; repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y las secuencias de ácido nucleico comunes comprenden secuencias que representan ácido nucleico eucromático y heterocromático .
129. 129. El método para producir un cromosoma artificial de planta, caracterizado porque comprende: introducir el vector de conformidad con la reivindicación 81, 87 ó 127 en una célula que comprende uno o más cromosomasm de planta; y seleccionar una célula que comprende un cromosoma artificial que comprende una o más regiones de repetición; en donde una o más unidades de ácido nucleico se repiten en una región de repetición, repeticiones de una unidad de ácido nucleico tienen secuencias de ácido nucleico comunes; y la o las regiones de repetición contienen cantidades sustancialmente equivalentes de ácido nucleico eucromáticas y heterocromáticas .
130. 130. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque la célula en donde el vector se introduce es una célula de animal.
131. 131. El método de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque la célula es una célula de mamífero .
132. 132. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el ADN heterocromático es heterocromatina pericéntrica.