KR20020013489A - 식물에서 조절성 형질전이 유전자 발현 및 특질 제거 방법 - Google Patents

식물에서 조절성 형질전이 유전자 발현 및 특질 제거 방법 Download PDF

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메리 이. 보울러
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Abstract

본 발명은 부위-특이적 리컴비나제계를 사용한 식물에서 형질전이 유전자의 조절성 또는 조절된 발현 또는 제거를 위한 작제물에 관한 것이다. 이 작제물은 형질전이 유전자 또는 부위-특이적 리컴비나제계의 하나 이상의 요소와 작동가능하게 연결된 다양한 구성적, 유도성, 조직 특이적 또는 성장 단계-특이적 프로모터를 포함한다. 다양한 인듀서에 응답하는 프로모터, 식물 조직 또는 식물 성장 단계를 리컴비나제계와 매치시킴으로써, 종결 단편 및 형질전이 유전자, 사실상 임의 특질이 임의 식물 성장 단계 또는 임의 식물 세대에서 발현 또는 제거될 수 있다.

Description

식물에서 조절성 형질전이 유전자 발현 및 특질 제거 방법 {Methods for Conditional Transgene Expression and Trait Removal in Plants}
이 출원은 1999년 11월 17일에 출원된 미국 특허출원 제09/442,021호의 CIP 출원이다.
유전자 변형 농작물의 출현으로 농작물 생산량의 증대뿐만 아니라 수확에 필요한 농약이나 다른 독성 화합물의 수를 줄일 수 있는 가능성이 열렸다. 이런 이점들은 성장에 유리하거나 질병 또는 병원체 내성을 보유하는 새로운 유전자로 경작 식물을 형질전환시킴으로써 달성된다. 그러나, 형질전환 처리가 원하는 특질의 발현에는 유용성이 없는 부수적 유전 물질을 흔히 발생시킨다. 이러한 부수적인 서열은 형질전환 과정에는 필요하지만 최종 재배종에 있어서는 긍정적으로 기여하지 못하며, 사실상 그 재배종에 대한 소비자의 선호도를 떨어뜨린다. 이러한 바람직하지 못한 서열들이 존재하면 해당 재배종을 시판하는 데까지 필요한 규제 절차가 복잡해 질 수 있다. 따라서 이런 원치않는 부수적 서열들을 제거하는 신뢰할 만한 방법이 있다면, 공공이 더 잘 받아들여 상업성이 개선되고, 규제 과정이 단순화될 것이다. 또한, 특정 특질을 중간 세대 동안에만 존재하게 한 후 수확되는 세대에게서는 제거되게 하는 것도 유용할 것이다. 종래 기술은 이러한 문제의 중요성을 인식하지 못했을 뿐만 아니라 해답을 제시하려는 연구를 한 바 없다.
식물은 점차, 식물계 외부의 물질을 생산하는 플랫폼으로 여겨지고 있다. 유전공학 기술이 진전되면서, 현재는 화학 합성 방법으로만 생산가능한 가지각색의 단량체와 중합체의 생산을 위해 식물을 조작하는 것이 가능하게 될 것이다. 이런 물질들이 여러 식물 조직에 축적되면 일정 수준에서는 독성이 될 것이므로, 부적절한 식물 조직에서의 발현을 방지하기 위해 관련된 유전자를 엄격하게 조절하는 것이 유용할 것이다.
현재는 형질전이 유전자(transgene)의 발현을 엄격하게 조절하는 방법이 거의 존재하지 않는다. 비표적 세포, 조직 또는 세대에서의 형질전이 유전자의 비특이적 발현은 식물 형질전환에 방해가 된다. 이것이 문제가 되는 것은, 형질전환 식물에게서 정상적인 식물 성장에 역효과를 주거나 식물독성을 띌 수 있을 정도로 높은 수준으로 물질을 생산하는 것이 목표인 경우이다. 형질전이 유전자의 조건적 발현에 의해, 원하는 화학물질, 단량체 및 중합체의 생산을 원하는 생성물의 추출에 사용되는 농작물의 수확 직전이나 직후에는 형질전환 식물의 생산 조직에서만 생산되도록 제한함으로써 원하는 생성물을 성장 중인 식물에게는 식물독성이 될 수 있는 수준으로도 경제적으로 생산할 수 있을 것이다. 따라서, 상업적으로 사용할수 있는 조건적 발현계가 없다는 점과 신뢰할 만한 높은 발현 수준을 얻는 데 존재하는 어려움은 둘 다 식물에게서 형질전이 유전자 발현의 개발을 제약하고 있다.
식물에서의 조건적 발현 또는 조절 발현은 보고된 바 있다 (De Veylder, L. et al., Plant Cell Physiol. 38:568-577 (1997), Gatz, C, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108 (1997), Hansen, G., et al., Mol. Gen. Genet. 254:337-343 (1997), Jepson, I., PCT 국제출원공개 WO9706269 A1 (1997), Jepson, I., et al., PCT 국제출원공개 WO9711189 A2 (1997) 및 본원에 언급된 기타 문헌 참조). 그러나 기초적인 비특이적 발현에 대해 엄격하게 시험했을 때, 엄밀하게 특이적인 것은 거의 없었다 (Odell J. T. et al., Plant Physiol. 106:447-458 (1994), van der Geest et al., Plant Physiol., 109(4), 1151-58 (1995), Ma et al., Aust. J. Plant Physiol., 25 (1), 53-59 (1998), Czako et al., Mol. Gen. Genet., 235 (1), 33-40 (1992)). 그러한 프로모터는 몇몇 응용 분야, 예컨대 신규 식물독성 단백질의 발현, 식물독성 생성물의 생합성을 이끄는 효소의 발현 및(또는) 유전자 침묵화 (silencing)를 위한 형질전이 유전자의 사용 등에 있어서는 적절하지 못하다. 식물에서의 부위 특이적 재조합 (Odell et al., Plant Physiol., 106: 447-458 (1994), Odell et al, PCT 국제출원공개 WO9109957 (1991), Surin et al., PCT 국제출원공개 WO9737012 (1997)) 및 돌연변이 lox P 부위에 의한Cre-매개 재조합 능력의 감소 및 Cre-lox에 기초한 인테그레이션 (integration) 빈도수의 증가에 있어서의 상기 P 부위의 사용이 보고된 바 있다 (Albert et al., Plant J. 7:649-59 (1995), Araki et al., Nucleic Acids Res.25: 868-872 (1997)). 그러나, 그런 돌연변이 부위를 사용하여, 가능한 조절 프로모터의 조절하에 있는 키메라Cre유전자와 함께 특이성Cre-매개 재조합을 개선하는 것은 증명된 바 없었다. 따라서 상업적으로 매력이 있는 조건적 부위 특이적 재조합을 위한 적절하게 엄격한 부위 특이적 재조합계가 필요하다.
리컴비나제 특이적 부위 및 리컴비나제를 이용한 식물 게놈으로부터의 형질전이 유전자의 특이적 제거 (directed excision) 방법이 보고되어 있다. 문헌 (Russel et al., Mol. Gen. Genet. 234:49-59 (1992))에서는 바람직한 비선택적 특질은 남겨두면서도 식물로부터 형질전환을 위한 선택적 마커는 제거하는 데 있어서 상기 기술의 유용성이 평가되어 있다. 여러 식물에서 형질전이 유전자 제거의 효율 차이를 검사하였으며, 재형질전환에 의한 cre 유전자의 도입과 교차 수분에 의한 cre 유전자의 도입사이의 비교가 이루어졌다. 그러나 조건적 또는 조절 발현을 위한 프로모터의 도입이 시도되지는 않았다.
문헌 (Ow et al., PCT 국제출원공개 WO 9301283 A1 (1992))에서는 고등 식물에게서 작동가능하게 연결되어 발현 시기에 영향을 줄 수 있는 서열을 조절하는 바람직한 비선택적 특질은 남겨두면서도 식물로부터 형질전환을 위한 선택적 마커는 특이적 제거하는 방법을 시험했다. 이 문헌에 공개된 기술은 제거를 위한 리컴비나제가 제2 형질전환 라운드를 통해 초기 형질전환 식물에 직접 도입되거나 또는 제1 및 제2 라운드 형질전환체로부터 독립적으로 재생된 식물의 교차 수분을 통해 도입되어야 한다는 요건 때문에 제약을 받는다.
US 5,9747,441호에서, 올리버(Oliver) 등은 식물 성장의 특정 단계, 특정 식물 조직, 특정 환경 조건, 또는 특정 시간 또는 위치에 따라 도입된 목적 유전자이 유전자도입 식물에서 제한적으로 발현됨을 입증하였다. 이는 1) 구조 유전자(이 유전자의 발현이 식물의 형질을 변화시키지만 특이적 절단 서열이 양측에 놓인 블로킹 서열이 사이에 놓여있음)와 기능적으로 관련된 일시 활성의 프로모터 삽입, 및 2) 부위 특이적 리컴비나제를 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 제2 DNA 서열을 통해 성취된다. 이러한 방법은 궁극적으로 특정 식물의 형질 발현이 교잡, 외부 자극 또는 식물에 리컴비나제의 직접 도입에 의해 외부적 조절하에 있도록 한다. 그러나, 올리버 등은 선별 마커와 같은 원하지 않는 부수적 서열의 제거에 대한 필요성을 고려하지 않았다.
수린(Surin) 등(PCT 국제 출원 WO 9737012 A1호 (1997))은 유전적으로 형질전환된 유기체로부터 선별가능 마커 유전자 또는 리포터 유전자와 같은 형질전이 유전자를 1단계에 절단해내는 방법을 개시하고 있다. 이는 리컴비나제 부위에 인접하도록 리컴비나제 유전자 단위(프로모터, 리컴비나제 유전자 및 종결자를 포함함) 및 형질전이 유전자 단위(프로모터, 형질전이 유전자 및 종결자를 포함함) 모두를 단일 발현 카세트에 포함시킴으로써 가능하다. 이 유전자 단위는 동일한 선별가능 마커 유전자를 이용하여 수회의 순차적 유전자 형질전환을 촉진하며, 유전자 조작된 식물에서 형질전이 유전자의 발현을 철저히 조절하는 수단을 제공한다. 또한, 이러한 방법이 차등적으로 활성화되는 프로모터를 이용하여 단일 세대에서 유전자 물질의 정확한 절단을 촉진하기 때문에, DNA 재조합 및 부위 특이적 리컴비나제에 대한 유전자 좌를 포함하는 단일 세포를 생성하기 위한 다중 형질전환 또는교배에 대한 필요성이 줄어들고 있다. 비록 수린 등의 방법에 별개의 제2 발현 카세트가 포함되긴 하지만, 이들의 기술은 2개의 형질전이 유전자 단위의 최대치가 다른 시간에 식물 내에서 발현될 수 있고 제2 발현 카세트의 발현 이전에 제1 발현 카세트가 제거되어야 한다는 점에서 제한적이다. 필요하다 하더라도, 제2 형질전이 유전자는 어떤 시점에서도 게놈으로부터 제거될 수 없다.
하지스(Hodges) 등(US 6,110,736호)은 특정한 길이의 DNA를 숙주 게놈의 특이적 비-치사 부위로 표적화할 수 있는 동형 재조합에 기초한 방법에 대해 기재하고 있으며, 이 방법은 부위 특이적 리컴비나제 부위 및 상응하는 리컴비나제 단백질을 이용하여 무작위적으로 삽입된 DNA 서열을 제거할 수 있게 해준다. 유전자 발현을 위한 부위 특이적 리컴비나제 시스템의 이용을 통해 부합되는 필요성은, 삽입된 DNA의 카피수 및 위치를 특이적으로 조절하도록 유지하는 것이다. 본 발명의 추가의 실시양태는 궁극적으로 원하는 DNA 서열만이 염색체에 통합되어 남아있게 하고 선별가능 마커는 염색체로부터 제거하기 위해 cre/lox 및 FLP/FRT를 이용하는 것을 포함한다. 그러나, 이러한 작업이 의존하는 것은 정확한 동형 재조합이 수행될 수 있는 사건에 한정되며, 이는 필수적으로 염색체 내의 서열과 조화를 이루도록 벡터 서열을 정확히 조작하는 것을 필요로 한다.
마지막으로, 페레즈 및 플라멘트(Perez and Flament; PCT 국제 출원 WO 9838323호 (1998))는 세포질성 또는 핵성 불임은 수컷 식물을 생성하기 위한 수컷 불임 유전자(AMS)의 삽입에 대해 논의하고 있다. 이 식물은 화분의 산포를 피하고, 따라서 필수적으로는 수컷 불임 유전자에 연결된 어떠한 형질전이 유전자의 산포도 예방한다. 본 발명의 추가 실시양태에서, AMS 유전자는 목적 형질전이 유전자가 통합된 식물을 스크리닝하기 위한 양성 마커로서 이용되거나, 또는 형질전이 유전자에 유전적으로 연결되는 경우에 이 유전자는 전위(transposition) 시스템(예를 들어, Cre/lox 또는 FLP/FRT와 같은 재조합 시스템)을 이용하여 절단될 수 있다. 이러한 기술의 제한점은 형질전이 유전자가 형질전이 유전자에 직접 연결되어야 하며, 따라서 연결된 상태로 발현되어야 한다는 점에 있다. 조건부 발현에 대해서는 이러한 것이 허용되지 않으며, 이에 의해 어떤 유전자의 발현은 세포 주기의 후기 단계에 다른 유전자를 활성화시키거나 절단할 수 있다.
상기 기재된 방법은 식물에서 형질전이 유전자 및 부속적인 유전 물질을 제거하는데 유용하지만, 식물의 세포 주기 및 하이브리드 자손에서 다양한 시간에 형질전이 유전자의 발현을 조절하는 능력이 제한된다. 따라서, 해결해야할 문제는 최초의 형질전환체 및 하이브리드에서 조건부 발현을 철저히 조절하고 식물의 유전적 형질을 제거하는 방법을 개발하는 것이다.
본 출원인은 선택적 발현 및(또는) 유전 형질의 제거를 위해 2개 이상의 상이한 리컴비나제를 이용하는, 성장에 따라 조절되는 생식세포-유사 프로모터를 제공함으로써 상기 기재된 문제점을 해결하였다.
<발명의 요약>
본 발명은 식물에서 형질전이 유전자의 조건부 발현 또는 조절된 발현을 위한 방법, 또는 일련의 구성적, 유도성, 조직 특이적 또는 성장 단계 특이적 프로모터를 1개 이상의 리컴비나제 시스템과 함께 이용하여 식물에서 형질 유전자 또는마커를 절단하기 위한 방법을 제공한다. 형질전이 유전자는 형질전환 마커를 비롯한 특이적 형질을 코딩할 수 있다. 프로모터를 적합한 리컴비나제 및(또는) 형질전이 유전자와 짝지어 사용함으로써, 사실상 어떠한 형질도 식물 생활환의 임의의 시간에 발현될 수 있다. 이와 유사하게, 유용성이 생활환의 일부에 제한된 형질 또는 단지 한 세대에만 제한된 형질은 이후의 세대에 선택적으로 제거될 수 있다.
예를 들어, 상이한 프로모터의 조절을 받는 상이한 부위 특이적 리컴비나제 시스템이 혼합되거나 연결되어, 조절된 발현에 대한 일련의 유전적 교체 뿐만 아니라 유기체의 단일 생활환 기간동안 발현 여부가 변하는 형질전이 유전자의 제거가 가능하다. 유전자도입 작물로부터의 형질전이 유전자 제거가 환경의 안전 및 보호, 개선된 품종 개량, 또는 한 세대에서만 형질전이 유전자의 조건부 발현(예를 들어, 수컷 불임성)을 위해 유용하다. 예를 들어, 2개 이상의 부위 특이적 재조합(SSR) 시스템을 포함하는 리컴비나제 요소의 조합이 조절된 발현 및(또는) 형질 유전자의 제거를 위해 고안될 수 있다. 조건부 프로모터 및 조직 특이적 프로모터의 2개 이상의 부위 특이적 재조합과의 이러한 커플링, 예를 들어 어떤 리컴비나제의 조건부 발현이 생활환 후기에 다른 리컴비나제를 활성화시키는 것은 일련의 유전적 교체로서 이용될 수 있게 한다.
SSR이 유전적 교체를 위해 단독으로 사용되어 오긴 했지만, 상이한 구성적 또는 조절된 프로모터의 조절을 받는 2개 (또는 그 이상)의 SSR이 식물의 생활환 내에서 일련의 유전적 교체를 위해 사용될 수 있다 (특정 단계에서 어떤 리컴비나제 요소의 조건부 발현이 동일한 세대 또는 이후 세대의 후기 단계에 다른 리컴비나제 요소를 활성화시킴). 따라서, 발아 단계와 같은 편리한 성장 단계에 상기 과정을 조건적으로 일으킬 수 있지만, 후기 단계에는 효과가 지연된다. 형질 유전자 제거는 형질 유전자 발현과 연결되지 않거나 연결될 수 있다. 연결되는 경우에는 형질 유전자의 발현이 더욱 엄격하게 조절된다. 본 발명의 중요한 측면 중 하나는 다양한 리컴비나제 효소가 리컴비나제 요소의 작용 가능 또는 프라이밍(즉, 종결 단편의 제거) 즉시 발현될 필요는 없으며, 그보다는 개개의 프로모터를 선택함으로써 단독으로 조절된다는 것이다.
따라서, 본 발명은
a) 일반 구조 P1-R의 제1 리컴비나제 요소; 및
b) K-TG 및 RS-K-TG-RS로 이루어진 일반 구조의 군으로부터 선택된 제2 리컴비나제 요소
[여기서,
(i) P1은 제1 프로모터;
(ii) R은 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
(iii) TG는 형질전이 유전자;
(iv) RS는 리컴비나제에 응답하는 리컴비나제 부위이고;
(v) K는 1) P2-RS-STP-RS 및 2) P2(여기서, P2는 제2 프로모터이고, RS는 리컴비나제에 응답하는 리컴비나제 부위이고 STP는 종결 단편임)로 이루어진 군으로부터 선택되며;
P1 및 P2는 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있는데, 여기서 P1은식물 생활환에서 P2 보다 먼저 활성화되고, 리컴비나제 발현에 의해 리컴비나제에 응답하는 리컴비나제 부위 사이에 포함되어 있는 임의 요소가 제거됨)]
를 포함하는 특질 제거 작제물을 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은
a) 일반 구조 P1-R1 및 P1-R2로 이루어진 일반 구조의 군으로부터 선택된 제1 리컴비나제 요소; 및
b) RS2-K-TG-RS2 구조를 갖는 제2 리컴비나제 요소
[여기서,
(i) P1은 제1 프로모터;
(ii) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
(iii) R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
(iv) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위이고;
(v) TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역이고;
(vi) K는 1) P2-RS1-STP-RS1 및 2) P2-RS1-TG(여기서, P2는 제2 프로모터이고, RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위이고 STP는 종결 단편이고 TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역임)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
P1 및 P2는 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있는데, 여기서 P1은 식물 생활환에서 P2보다 먼저 활성화되고, 제1 리컴비나제 발현에 의해 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위들 사이에 포함되어 있는 임의 요소가 절단되며 제2 리컴비나제 발현에 의해 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위사이에 포함되어 있는 임의 요소가 제거됨]
를 포함하는 특질 제거 작제물을 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은
a) P1-R1 및 RS2-P1-R1-RS2로 이루어진 구조의 군으로부터 선택된 제1 리컴비나제 요소;
b) Z-Y 및 RS2-Z-Y-RS2 구조의 군으로부터 선택된 제2 리컴비나제 요소; 및
c) 구조 Q-X 및 RS2-Q-X-RS2의 군으로부터 선택된 제3 리컴비나제 요소
[여기서,
(i) P1은 제1 프로모터;
(ii) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
(iii) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위;
(iv) Z는 P2-RS1-STP-RS1(여기서, P2는 제2 프로모터이고, RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위이고, STP는 종결 단편임);
(v) Y는 R2 및 TG로 이루어지 군으로부터 선택되고(여기서, R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역이고, TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역임);
(vi) Q는 식 P3-RS-STP-RS(여기서, P3은 제3 프로모터이고, RS는 RS1 및 RS2로 이루어진 군으로부터 선택된 리컴비나제 부위이며, STP는 종결 단편임);
(vii) X는 TG 및 R(여기서, TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역이고, R은 R1 및 R2로 이루어진 군으로부터 선택된 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역임)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서 P1, P2 및 P3은 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있는데, 여기서 P1은 식물 생활환에서 P2보다 먼저 활성화되고 P2는 식물 생활환에서 P3보다 먼저 활성화되며, 제1 리컴비나제 발현에 의해 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위들 사이에 포함되어 있는 임의 요소가 제거되며 제2 리컴비나제 발현에 의해 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위 사이에 포함되어 있는 임의 요소가 제거됨]
를 포함하는 특질 제거 작제물을 제공한다.
본 발명의 작제물은
a) 구성적 식물 프로모터;
b) 식물 조직-특이적 프로모터;
c) 식물 성장 단계-특이적 프로모터;
d) 유도성 식물 프로모터;
e) 바이러스성 프로모터;
f) 수컷 생식세포-특이적 프로모터;
g) 암컷 생식세포-특이적 프로모터;
h) 암컷/수컷 생식세포-특이적 프로모터;
i) 꽃의 공통 생식세포 프로모터; 및
j) 식물의 어린싹 끝 분열조직-특이적 프로모터
로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 프로모터를 포함한다.
여기서, 본 발명의 작제물은, 구성적 식물 프로모터; 식물 조직-특이적 프로모터; 식물 성장 단계-특이적 프로모터; 유도성 식물 프로모터; 및 바이러스성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 프로모터를 포함한다.
본 발명의 작제물이 발현을 위한 형질전이 유전자를 포함하는 경우, 형질전이 유전자는 형질전환 마커를 코딩하는 유전자; 형태적 특질을 코딩하는 유전자; 불임성을 도입하는 유전자; 식물 또는 식물 세포 상 특이적 형질을 도입하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가로, 본 발명의 다른 성분은 독립적으로 유전가능하며, 유전자도입 식물내에 함께 도입되거나 또는 예를 들어 탑크로스(TopCross, 등록상표) 고급유 옥수수 종자(미국 특허 제5,704,160호)를 생산하는 방법에 의해 별도의 성분들을 함유하는 유전자도입 식물을 교배시킴으로써 함께 운반할 수 있다. 또한, 발현 카세트를 만드는 방법 및 이들을 사용하여 변형된 인자형 및(또는) 형질을 지닌 형질전환된 식물 세포를 생산하는 방법이 제공된다.
<도면의 간단한 설명 및 서열에 대한 설명>
도 1은 1세대 식물의 형질전이 유전자의 조건적 발현을 위한 단일부위-특이적 리컴비나제 계의 사용을 예시하는 개략도.
도 2는 1세대 식물의 형질전이 유전자의 제거를 조절하기 위한 단일부위-특이적 리컴비나제 계의 사용을 예시하는 개략도.
도 3은 2세대 식물의 형질전이 유전자의 조건적 발현을 위한 이중 부위-특이적 리컴비나제 계의 사용을 예시하는 개략도.
도 4는 1세대 식물의 형질전이 유전자의 조건적 발현을 위한 이중 부위-특이적 리컴비나제 계의 사용 및 그의 후속 제거를 예시하는 개략도.
도 5는 1세대 식물의 조건적 수컷 불임에 영향을 미치는 이중 부위-특이적 리컴비나제 계의 사용을 예시하는 개략도.
도 6은 2세대 식물의 조건적 배우체 수컷 불임에 영향을 미치는 이중 부위-특이적 리컴비나제 계의 사용을 예시하는 개략도.
도 7은 톱 크로쓰 (Top Cross(등록상표)) 2세대의 조건성 수컷 불임에 영향을 미치는 이중 부위-특이적 리컴비나제 계의 사용을 예시하는 개략도.
도 8은 잡종 종자를 조건적으로 수컷 불임시키는 이중 부위-특이적 리컴비나제 계의 사용을 예시하는 개략도.
하기 서열에 대한 설명, 및 본 명세서에 첨부된 서열 목록은 37 C.F.R. §1.821-1.825에 나타낸 특허 출원의 뉴클레오티드 및(또는) 아미노산 서열 개시내용에 대한 규칙을 따른다. 하기 서열에 대한 설명은 본 명세서에 참고문헌으로 인용되는 문헌 [Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985)] 및 [Biochemical Journal 219 (No.2):345-272 (1984)]에 기재된 IUPAC-IYUB 표준과 일치하게 정의된 뉴클레오티드 서열 특성에 대한 하나의 문자 코드 및 아미노산에 대한 3개의 문자 코드를 포함한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 부호 및 포맷은 37 C.F.R. §1.822의 규칙에 따른다.
SEQ ID NO:1은 P298로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:2는 P299로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:3은 P192로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:4는 P194로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:5는 P198로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:6은 P227로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:7은 P228로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:8은 아라비도프시스 아페탈라 3 (AP3) 프로모터의 PCR 증폭용 PH785로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:9는 아라비도프시스 아페탈라 3 (AP3) 프로모터의 PCR 증폭용 PH786으로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:10은 BCP1 프로모터의 PCR 증폭용 PH783으로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:11은 BCP1 프로모터의 PCR 증폭용 PH784로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:12는 아라비도프시스 에렉타 (ER) 프로모터의 PCR 증폭용 PH788로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:13은 아라비도프시스 에렉타 (ER) 프로모터의 PCR 증폭용 PH790으로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:14는 플라스미드 pTZALG로부터의 TA29 프로모터의 PCR 증폭용 PH795로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:15는 플라스미드 pTZALG로부터의 TA29 프로모터의 PCR 증폭용 PH815로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:16은 아라비도프시스 피스틸라타 (PI) 프로모터의 PCR 증폭용 P321로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:17은 아라비도프시스 피스틸라타 (PI) 프로모터의 PCR 증폭용 P322로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:18은 아라비도프시스 열 충격 (HSP) 프로모터 18.2의 PCR 증폭용 PH806으로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:19는 아라비도프시스 열 충격 (HSP) 프로모터 18.2의 PCR 증폭용 PH807로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:20은 아라비도프시스 아페탈라 1 (AP1) 프로모터의 PCR 증폭용 P355로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:21은 아라비도프시스 아페탈라 1 (AP1) 프로모터의 PCR 증폭용 P356으로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:22는 아라비도프시스 아가모우스 (AG) 프로모터의 PCR 증폭용 P353으로 사용된 프라이머임.
SEQ ID NO:23은 아라비도프시스 아가모우스 (AG) 프로모터의 PCR 증폭용 P354로 사용된 프라이머임.
본 발명은 분자생물학 분야 및 외래 유전자 단편을 이용한 식물의 유전적 형질전환에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 부위 특이적 리컴비나제 작제물을 사용하여 식물 자손으로부터 유전 특질을 조건적으로 또는 조절하에 발현 또는 제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 각종 구성적, 유도성, 조직 특이성 또는 성장 특이성 프로모터의 조절 하에 1종 이상의 위치-특이적 리컴비나제계와 형질전이 유전자를 사용함으로써 식물에서 형질전이 유전자의 조건적 또는 조절된 발현 또는 제거를 위한 작제물과 그 방법을 제공한다. 유전 속성의 조절된 발현은 식물 육종과 농경 용도에 유용하다. 또한 생식세포(germline) (화분 및(또는) 종자)로부터 형질전이 유전자의제거 또는 제거는 경작지에서 그의 억제를 위해서 뿐만 아니라 마커가 없는 형질전이 유전자 얻기 위해 사용할 수 있다. 유전자도입 식물에서 형질전환 마커의 존속 (이는 드문 형질전환된 세포를 확인하기 위해 요구된다)은 조절 문제/요건, 유전자도입 식물에 대한 그의 유해한 효과 때문에 바람직하지 않을 수 있고(거나), 이는 속성 형질전이 유전자를 쌓기(stacking) 위한 마커의 반복적인 사용을 방지한다.
다음 용어와 정의는 본 명세서와 청구범위를 완전히 이해하기 위해 사용될 것이다.
"유전자"는 조절 서열을 포함한, mRNA, 기능성 RNA 또는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미한다. 용어 "천연 유전자"는 자연에서 발견되는 유전자를 의미한다. 용어 "키메릭 유전자"는 1) 자연에서 함께 발현되지 않는, 조절 서열과 코딩 서열을 포함한 DNA 서열, 또는 2) 자연적으로 인접하지 않는 단백질들의 부분들을 코딩하는 서열, 또는 3) 자연적으로 인접하지 않은 프로모터들의 부분들을 함유하는 임의의 유전자를 의미한다. 따라서, 키메릭 유전자는 상이한 기원으로부터 유래된 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 또는 동일한 기원으로부터 유래되지만 자연에서 발견된 것과는 상이한 방식으로 배열된 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수 있다. "형질전이 유전자"는 형질전환에 의해 게놈 내로 도입되어 안정하게 유지되는 유전자를 의미한다. 형질전이 유전자는 예를 들면 형질전환하고자 하는 특정 식물의 유전자에 이종성이거나 동종성인 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 형질전이 유전자는 비천연 유기체 내에 삽입된 천연 유전자, 또는 키메릭 유전자를 포함할 수 있다. 용어 "내생 유전자"는 유기체의 게놈 내에 그의 본래 위치에 있는 천연 유전자를 의미한다.
"코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하고 비코딩 서열을 배제시킨 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 용어 "개방 판독 프레임" 및 "ORF"는 코딩 서열의 번역 개시 코돈과 종결 코돈 사이에 코딩된 아미노산 서열을 의미한다. 용어 "개시 코돈" 및 "종결 코돈"은 각각 단백질 합성 (mRNA 번역)의 개시 및 사슬 종결을 지정하는 코딩 서열 내의 3개의 인접한 뉴클레오티드의 단위('코돈')을 의미한다.
"조절 서열" 및 "적합한 조절 서열"은 각각 관련 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 끼치는, 코딩 서열의 상류(5' 비코딩 서열), 내부 또는 하류(3' 비코딩 서열)에 위치한 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 조절 서열은 인헨서, 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. 이들은 천연 서열과 합성 서열 뿐 아니라 합성 서열과 천연 서열의 조합일 수 있는 서열을 포함한다. 상기한 바와 같이 용어 "적합한 조절 서열"은 프로모터로 한정되지 않지만, 본 발명에 유용한 몇몇 적합한 조절 서열은 구성적 식물 프로모터, 식물 조직 특이성 프로모터, 식물 성장 단계 특이성 프로모터, 유도성 식물 프로모터 및 바이러스성프로모터를 포함할 것이지만 이에 제한되지는 않는다.
"3' 구역"은 코딩 서열의 하류에 위치한 3' 비코딩 조절 서열을 의미한다. 이 DNA는 관련 코딩 서열 (예를 들면, 리컴비나제, 형질전이 유전자 등에 대해)의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 끼칠 수 있다.
"프로모터"는 RNA 폴리머라제에 대한 인지 및 적절한 전사에 요구되는 다른인자를 제공함으로써 코딩 서열의 발현을 제어하는, 일반적으로 그 코딩 서열의 상류(5')의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. "프로모터"는 TATA-박스와 전사 개시 위치를 특정하는 역할을 하는 다른 서열로 이루어진 짧은 DNA 서열인 최소 프로모터를 포함하며, 여기에 발현의 제어를 위해 조절 성분이 첨가된다. "프로모터"는 또한 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 최소 프로모터 + 조절 성분을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 유형의 프로모터 서열을 근접 상류 성분과 보다 말단 상류 성분으로 이루어지며, 후자 성분은 종종 인헨서로 불린다. 따라서, "인헨서"는 프로모터를 활성적으로 자극할 수 있고, 프로모터의 선천적인 성분 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위해 삽입된 이종성 성분일 수 있는 DNA 서열이다. 이는 두 배향 (정상 또는 플립(filpped))으로 모두 작동할 수 있고, 프로모터로부터 상류 또는 하류로 움직일 때조차 기능할 수 있다. 인헨서와 다른 상류 프로모터 성분들은 모두 그들의 효과를 매개하는 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 결합한다. 프로모터는 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 자연에서 발견된 상이한 프로모터들로부터 유래된 상이한 성분들로 이루어질 수 있거나, 심지어 합성 DNA 절편으로 이루어질 수도 있다. 프로모터는 또한 생리적 또는 성장 조건에 대한 반응으로 전사 개시의 유효성을 제어하는 단백질 인자의 결합에 관여하는 DNA 서열을 함유할 수 있다.
"조건적으로 활성화하는"은 정상적으로는 발현되지 않는 형질전이 유전자를 활성화하는 것을 의미한다. 본 발명의 문맥에서는 교배(cross)에 의한, 또는 또한 (유도성인 경우) 인듀서에 의한 리컴비나제 R1의 발현을 의미한다.
"구성적 발현"은 구성적 또는 조절된 프로모터를 사용하는 발현을 의미한다. "조건화" 및 "조절된 발현"은 조절된 프로모터에 의해 제어된 발현을 의미한다. 본 발명의 문맥에서 "침묵" 발현은 1 또는 2 세대에서 특정한 성장 단계 또는 조직에서만의 발현을 의미한다.
"구성적 프로모터"는 모든 조직 및 모든 시점에서 유전자 발현을 지정하는 프로모터를 의미한다. "조절 프로모터"는 유전자 발현을 구성적으로가 아닌 시간적으로 및(또는) 공간적으로 조절된 방식으로 지정하며, 조직 특이성, 성장 단계 특이성 및 유도성 프로모터를 포함하는 프로모터를 의미한다. 이는 천연 서열과 합성 서열 뿐 아니라 합성 서열과 천연 서열의 조합일 수 있는 서열을 포함한다. 상이한 프로모터들이 상이한 조직 또는 세포형에서, 또는 상이한 발단 단계에서, 또는 상이한 환경 조건에 대한 반응으로 유전자의 발현을 지정할 수 있다. 식물 세포에 유용한 다양한 유형의 신규 프로모터가 계속 발견되고 있으며 그 많은 예를 문헌[Okamuro 등,Biochemistry of Plants15:1-82, 1989]에서 찾아볼 수 있다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 규정되지 않았으므로, 상이한 길이의 DNA 단편들이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다. 식물에서 유용한 대표적인 조절된 프로모터로는 세이프너(safener)-유도성 프로모터, 테트라사이클린-유도계로부터 유래된 프로모터, 살리실레이트-유도계로부터 유래된 프로모터, 알코올-유도계로부터 유래된 프로모터, 글루코코르티코이드-유도계로부터 유래된 프로모터, 병원체-유도계로부터 유래된 프로모터, 및 엑디좀-유도계로부터 유래된 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
"조직-특이 프로모터"란 모든 식물 세포에서 발현되지는 않으며, 특이 기관 (예컨대 잎, 어린 어린싹 정단분열조직, 꽃 또는 씨), 특이 조직 (예컨대, 배아 또는 자엽), 또는 특이 세포 형태 (예컨대 잎 유조직, 꽃가루, 난세포, 소포자- 또는 대포자 모세포 또는 씨 저장 세포)의 1종 이상의 세포 형태에서만 발현되는 제어된 프로모터를 말한다. 이들은 또한 예컨대 초기 또는 말기 배형성시, 씨 또는 과일의 성장시, 과일이 익는 동안, 잎이 완전히 분화될 때, 또는 노쇠가 개시될 때 일시적으로 제어되는 "성장-상태 특이 프로모터"를 포함한다. 형질전이유전자에서 프로모터의 활성화, 따라서 코딩 서열의 그 조절하 발현의 성장 특이성은 그 내생성 발현과 관련하여 변경될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 꽃 프로모터의 조절 하에 형질전이유전자가 식물로 형질전환되는 경우, 그것이 프로모터가 분리되는 것과 동일한 유전자인 경우라도 형질전이유전자의 발현 특이성은 염색체의 상이한 위치에의 그것의 삽입 때문에 상이한 형질전이유전자 계통으로 다양해질 것이다.
"비특이성 발현"이란 구조성 발현 또는 원하지않는 세포, 조직 또는 세대의 낮은 수준의 기초("누출(leaky)") 발현을 말한다.
"유도성 프로모터"란 식물에 대한 외부 자극, 예컨대 화학, 빛, 호르몬, 스트레스 또는 병원균에 의해 1종 이상의 세포 형태에서 개시될 수 있는 제어된 프로모터를 말한다.
"프로모터 활성화"란 프로모터가 하류의 유전자 원소의 발현을 유도하기 위해 기능하도록 활성화(또는 개시)된 것을 의미한다. 구성적 프로모터는 계속해서활성화된다. 제어된 프로모터는 다양한 외부 자극 (유도성 프로모터), 또는 식물이 성장 또는 분화하는 동안 성장 신호, 예컨대 조직 특이성 (꽃 특이성, 꽃밥 특이성, 꽃가루 특이성, 씨 특이성 등) 및 성장-단계 특이성 (식물성 또는 꽃 어린 어린싹 정단분열조직 특이성, 수컷 생식세포, 자성 생식세포 등)에 대한 그 반응성으로 인해 활성화될 수 있다.
"작동가능하게 연결된"이란 그 기능이 다른 것에 의해 영향을 받기 위한 단일 핵산 단편에 대한 핵산 서열의 결합을 의미한다. 예를 들면, 프로모터는 그 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우(즉, 코딩 서열 또는 기능성 RNA는 프로모터의 전사 조절 하에 있음), 코딩 서열 또는 기능성 RNA와 작동가능하게 연결된다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 방향으로 제어 서열에 조작가능하게 연결될 수 있다. "연결되지 않은"이란 결합된 유전자 원소가 또다른 하나와 밀접하게 결합되지 않으며, 그 기능이 다른 것에 영향을 미치지 않는 것을 의미한다.
"발현"이란 센스(mRNA) 또는 기능성 RNA의 안정한 축적 및 전사를 말한다. 발현은 또한 단백질의 생성을 말할 수 있다. "과발현"이란 정상 또는 형질전환되지 않은 유기체에서 발현의 수준을 초과하는 형질전이유전자 유기체에서의 발현 수준을 말한다.
"변경된 수준"이란 정상 또는 형질전환되지 않은 유기체의 것과 상이한 형질전이유전자 유기체에서의 발현 수준을 말한다.
용어 "변경된 식물 특질"은 야생형 또는 비형질전이유전자 식물 숙주에 대한형질전이유전자 식물에서의 임의의 표현형 또는 유전자형 변화를 의미한다.
"전사 종결 단편"이란 전사를 종결할 수 있는 1종 이상의 제어 신호, 예컨대 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 예로서 노팔린 신테이즈(nopaline synthase)를 코딩하는 유전자의 3' 비제어 영역 및 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제의 소(small) 서브유니트가 있다.
"번역 종결 단편"이란 번역을 종결할 수 있는 1종 이상의 제어 신호, 예컨대 모든 세개의 프레임의 1종 이상의 종결 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 코딩 서열의 5' 말단에, 개시 코돈 또는 그 근처에 인접한 번역 종결 단편을 삽입하면 어떠한 번역 또는 부적절한 번역도 생성되지 않을 것이다. 부위-특이적 재조합에 의해 번역 종결 단편을 제거하면 개시 코돈을 사용한 적절한 번역을 간섭하지 않는 코딩 서열의 부위-특이적 서열이 남는다.
"종결 단편" 또는 "블록킹 단편"이란 비활성 형질전이유전자를 생성하는 코딩 서열의 적절한 번역 및(또는) 전사를 블록할 수 있는 부위-특이적 서열에 의해 측면에 위치하는 DNA 단편을 말한다. 블록킹 단편이 폴리아데닐화 신호 서열 및 전사를 종결할 수 있는 제어 신호를 코딩하는 다른 서열을 포함하면, 5' 비번역 영역, 즉 전사 개시 부위와 ORF 사이에 위치하는 경우 코딩 서열의 전사를 블록할 수 있다. 코딩 서열에 삽입시, 블록킹 단편은 그 오픈 리딩 프레임을 붕괴시킴으로써 적절한 번역을 블록할 수 있다. 부위-특이적 재조합에 의한 DNA 재배열은 전사 및(또는) 적절한 번역성을 회복시킬 수 있다. 예를 들면, 부위-특이적 재조합에 의해 블록킹 단편을 제거하면 전사 및(또는) 적절한 번역성을 가능하게하는 부위-특이적 서열이 남는다. 전사 또는 번역 종결 단편은 블록킹 단편으로 간주될 것이다. "종결 단편"은 또한 비전사된 영역에서 유전자를 붕괴시킴으로써, 예를 들면 업스트림 프로모터 원소와 "TATA" 박스 사이, 또는 TATA 박스와 전사 시작 부위 사이에서 프로모터 서열 내의 그것의 존재 및(또는) 배향에 의해 전사를 블록할 수 있다.
이러한 종결 단편 또는 블록킹 단편의 제거 과정을 본원에서는 "언블록킹"이라 할 것이다. 블록킹 단편이 부위-특이적 재조합에 의해 DNA로부터 제거되면, 부위-특이적 서열이 전사 및(또는) 적절히 번역될 수 있도록 남는다는 것이 당업자들에게 이해될 것이다.
"프라이밍(priming)" 또는 "가능(enabling)"이란 유전자가 적절한 환경 자극, 성장 단계 또는 특이 조직/세포 형태에서의 존재에 대해 반응하여 활성화될 수 있도록 프로모터 및(또는) 유전자의 상류 블록킹 서열을 제거하는 것을 의미한다. 유전자 원소가 블록킹 단편의 제거에 의해 가능 또는 프라이밍되는 경우, 프로모터 원소는 하류 원소의 발현을 유도하도록 자유롭거나 그렇지 않을 수 있다. 예를 들면, 작동가능하게 연결된 하류 유전자로부터 종결 단편에 의해 분리된 유도성 프로모터를 포함하는 유전자 작제물은, 종결 단편을 제거함으로써 프라이밍될 것이나, 그러나 활성화 또는 유도될 때까지 하류 원소를 발현하지는 않을 것이다. 따라서, 블록킹된 유전자의 활성화는 그것 및 유전자를 유도하는 프로모터의 활성화의 가능(enabling)을 요구할 것이다.
"리컴비나제 요소"은 부위특이적 리컴비나제를 코딩하는 유전자, 또는 부위특이적 리컴비나제 서열에 의해 양끝에 위치한 다른 유전자 성분에 작용가능하게 결합된 프로모터를 포함하는 DNA 성분을 의미한다. 본 발명의 리컴비나제 요소는 임의로는 유전자 발현을 보다 고도로 제한할 수 있는 차단 또는 종결 단편을 함유할 수 있다.
용어 "플록스드 (floxed)"는 유전자 성분이 직렬로 (즉, 직접적으로, 반복하여) 부위특이적 서열에 따라 양끝에 위치하는 것을 의미한다. 플록스드 성분은 리컴비나제 요소 또는 임의의 다른 유전자 성분일 수 있다.
용어 "리컴비나제"는 DNA 구조를 대체하고 트랜스포사제, 람다 삽입/절제 효소 뿐만 아니라 부위특이적 리컴비나제를 포함하는, 부위특이적 재조합을 수행하는 효소(들)을 의미한다. 잘 알려진 리컴비나제의 예는 Cre-lox, FLP/FRT, R/RS, Gin/gix, pSR1 계, cer 계 및 fim 계 (예를 들면, 크레이그 (N.L. Craig)의 문헌[Annu Rev. Genet., vol.22, p.17, 1988]; 오델 (Odell) 등의 문헌[Use of site-specific recombination systems in plants.Homologous Recomb. Gene Silencing Plants (1994), 219-70. Editor(s): Paszkowski, Jerzy. Publisher: Kluwer, Dordrecht, Germany])에서 찾을 수 있다. 또한, 부위특이적 재조합 계는 파게, 세균 (예를 들면, E. coli), 효모 등과 같은 미생물에서 확인되었다. 이러한 것에는 E. coli 람다 att P 계 (줍코 (Zubko) 등의 문헌[Nature Biotechnology 18:442 (2000)]) 삽입 및 절제 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 파게 C31 인테그라제 (그로스 (Groth) 등의 문헌[Proc. Natl Acad. Sci. USA 97:5995 (2000)]가 포함된다. P1 파게로부터 유도된 Cre/lox 계 (WO 93/01283)를 사용하여 상기 미생물로부터 분리된 부위특이적 재조합 계는, 이러한 계가 유도된 유기체와 상이한 유기체 (식물을 포함함)에 도입될 경우, 이들은 본래의 유기체에서와 동일한 방식으로 행동한다. 또한, 효모 (Zygosaccharomyces rouxii)의 부위특이적 재조합 계 (pSR1 계 (마쓰자끼 (H. Matsuzaki) 등의 문헌[J. Bacteriology, vol.172, p.610, 1990])도 본 발명에 따라서 사용할 수 있다. 또한, 이러한 pSR1 계는 보다 고급의 식물에서 그들의 고유한 기능을 유지한다 (오노우찌 (H. Onouchi) 등의 문헌[Nucleic Acid Res., vol.19, p.6373, 1991]).
"리컴비나제 부위" 또는 "부위특이적 리컴비나제 서열"은 리컴비나제가 인식하고 결합하게 되는 DNA 서열을 의미한다. 이는 기능성이 유지되고 리컴비나제 효소가 부위를 여전히 인식하고 DNA 서열과 결합하며 두 인접한 리컴비나제 부위사이의 재조합을 촉진하는 한 야생형또는돌연변이 리컴비나제 부위일 수 있다.
본 명세서에서 정의된 "특질 제거 작제물"은 (적어도) 리컴비나제 요소, 리컴비나제 요소에 응답하는 부위특이적 리컴비나제 부위, 및 형질전환유전자를 포함하는 임의의 DNA 작제물의 조립체이다. 형질 제거 작제물은 식물에서 동시형질전환, 순차적 형질전환 또는 단일 형질전환 이후 유전자 교잡에 의해 각 성분을 단일 유기체에 공급함으로써 기능화된다.
"생산 조직"은 비분할, 말단-분화된 세포로 이루어진 성숙하고 수확가능한 조직을 의미한다. 생산 조직에는 생식세포, 분열조직 및 완전히 분화되지 않은 세포로 이루어진 미성숙되고 성장하는 조직은 제외된다.
"생식세포"는 배우자가 될 세포를 의미한다. 따라서, 생식세포의 유전자 물질은 유전된다.
"공통 생식세포"는 수컷 및 암컷 생식세포로 분화하기 전의 모든 생식세포를 의미하며, 따라서 발생 배, 영양 SAM, 식물상 SAM 및 화초류의 생식세포가 포함된다. 따라서, 공통 생식세포의 부위특이적 절제는 수컷 및 암컷 배우자 모두로부터 절제되는 것이다.
"수컷 생식세포"는 수컷 배우자 (정자) 및 수컷 배우자 그 자체가 될 포자체 (꽃밥 원기, 꽃밥, 소포자 모세포) 또는 배우체 (소포자, 화분)의 세포를 의미한다.
"암컷 생식세포"는 암컷 배우자 (거대포자, 난세포) 및 암컷 배우자 그 자체가 될 포자체 (암술 원기, 암술, 배주, 거대포자 모세포)의 세포를 의미한다.
"체세포"는 유기체 중 생식세포가 아닌 모든 다른 세포이다.
"공통 생식세포" 프로모터는 수컷 및 암컷 생식세포로 분화되기 전의 생식세포에서 활성화되는 프로모터이다. 또한, 이들은 수컷 및 암컷 생식세포 모두에서 활성화되는 프로모터, 및 하나는 수컷 생식세포에 특이적이고 다른 하나는 암컷 생식세포에 특이적인 일단의 프로모터를 의미한다. 따라서, 공통 생식세포의 부위특이적 절제는 수컷 및 암컷 배우자 모두로부터 절제되는 것이다.
"식물상 공통 생식세포" 프로모터는 "공통 생식세포"에서 발현되는 화초 또는 화초 원기 유전자의 프로모터를 의미한다. 상기 프로모터에는 화초에서 발현되는 수컷 생식세포 또는 암컷 생식세포 프로모터는 포함되지 않는다.
"수컷 생식세포" 프로모터는 화초의 수컷 생식세포에서는 발현되나 암컷 생식세포에서는 발현되지 않는 프로모터를 의미한다.
"암컷 생식세포" 프로모터는 화초의 암컷 생식세포에서는 발현되나 수컷 생식세포에서는 발현되지 않는 프로모터를 의미한다.
"화초" 또는 "식물상" 특이적 프로모터는 화초 또는 화초 원기에서 발현되는 프로모터를 의미한다. 이들에는 식물상 공통 생식세포, 수컷 생식세포 및 암컷 생식세포 프로모터가 포함된다.
"유전적으로 결합된"은 후대에서 동시분리되는 형질전환유전자의 물리적 결합을 의미한다.
"유전적으로 결합되지 않은"은 후대에서 동시분리되지 않는 형질전환유전자의 물리적 결합의 결여를 의미한다.
"시드-특이적 프로모터"는 시드에서만 발현되는 프로모터를 의미한다.
"식물 발생 단계-특이 프로모터"란 본질적이 아닌 특이적 식물 발생 단계 또는 단계들에서 발현되는 프로모터를 말한다. 식물 발생은 상이한 단계를 거치며, 본 발명의 내용에서 생식세포는 상이한 발생 단계, 즉 수정으로부터 시작해서 배아의 발생, 영양 생장점 분열 조직의 발생, 꽃의 생장점 분열 조직의 발생, 꽃밥 및 암술 시원체의 발생, 꽃밥 및 암술의 발생, 소포자- 및 대포자 모세포의 발생, 및 대포자 (난) 및 소포자 (화분)의 발생까지의 단계를 말한다.
"영양 생장점 분열 조직"은 잎과 어린싹 끝으로 발생하는 식물의 어린싹 끝에서 발견되는 세포를 말한다.
"꽃의 생장점 분열 조직"은 꽃과 꽃차례로 발생하는 꽃의 분열 조직 어린싹끝에서 발견되는 세포를 말한다.
"형태학적 특질"은 어린싹, 뿌리, 유합조직, 종양, 꽃 또는 잎과 같은 형태의 특성을 말한다.
"종양발생" 유전자는 아그로박테륨 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 T-DNA 유전자와 같은 식물 종양을 일으키는 유전자를 말한다.
"뿌리 유래된" 유전자는 뿌리 형성을 야기하는, 아그로박테륨 리조진스 (Agrobacterium rhizogenes)의 rol A, B 및 C 유전자와 같은 유전자를 말한다.
용어 "발생을 차단하는 치사 유전자"는 디프테리아 독소, 바르나제 (barnase)의 알파 사슬과 같은 독소를 발현하거나 rolB와 같은 정상 식물 발생을 방해하는 유전자를 말한다 (Roder et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 243:32). 또한, 정상 발생에 필요한 사일런스 또는 보조 억제 식물 유전자는 형질전이 유전자를 유도한다 (문헌 [Chuang CF, Meyerowitz EM (2000) Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA inArabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci US A.97:4985-90] 참조).
"조건부 및 일시적 발현"은 선택된 세대에서만 또는 두 세대에서의 특질 유전자의 발현을 말한다. 본 발명의 내용에 있어서, 발현은 제1 세대에서 유용한 특질 발현에 유인되며, 특질 유전자는 생식세포로부터 제거된다.
"자성 가임 회복"은 적출시키거나 문헌 [Michiels, F., and M. Williams, 1998, Improved barstar gene and its expression in male-sterile barnase-producing plants to restore fertility, PCT Int. Appl., WO, (Plant GeneticSystems, N.V., Belg.; Michiels, Frank; Williams, Mark)., p. 54 pp.]의 바르나제에 대한 바스타 (barstar)와 같은 자성 불임 유전자를 사일런스시키는 형질전이 유전자 또는 자성 불임 인자와 상호작용하는 단백질을 코딩하는 형질전이 유전자 중 하나일 수 있는 억제자의 발현에 의하여 반대작용시킴으로써 자성 불임 유전자를 제거하는 것을 말한다.
"합성 꽃밥 프로모터"는 G9/SGB6 잡종 프로모터를 말한다 (미국 특허 제5470359호; 동 제5837850호).
"화분-특이 프로모터"는 LAT52와 같은 화분에서만 발현되는 프로모터를 말한다 (Twell et al. (1998) Trends in Plant Sciences 3:305).
"불임"은 유성 생식을 하거나 또는 종자를 만드는 식물의 무능력을 의미한다. 타가 수분 식물에 있어서, 기능 화분을 형성하는 데 있어서의 무능력 뿐 아니라 종자를 만드는 데 있어서의 무능력을 포함한다. 또한, 불임은 꽃의 형성을 차단하는 비정상 식물 발생을 야기시킬 수 있다. "불임 유전자"는 식물에 대한 불임을 전달하는 임의의 유전자를 말하며, 화분 형성을 차단하는 유전자 및 꽃 형성을 차단하는 것과 같이 종자 형성 모두를 차단하는 유전자를 말한다. "수컷 불임"은 기계적 또는 수동 웅수제거, 유전적 수컷 불임의 혼성의 결과로서 또는 다른 수단에 의해서 기능 화분을 생산하는 식물의 무능력을 의미한다. "수컷 불임"은 종자를 만드는 식물의 무능력을 의미한다.
수컷 불임은 이배체 세포 (포자체), 반수체 (배우체) 세포, 또는 두 형태의 세포 모두에 있어서 자성 불임 유전자의 발현으로부터 야기된다. 배우체의 자성불임은 화분에서만 발생하는 발현 유전자, 예를 들어 바르나제 또는 화분 특이적 프로모터하에 디프테리아 독소의 알파 사슬의 발현 유전자를 말한다.
"배우체의 수컷 불임"은 화분에서만 발현되는 불임을 말한다.
"배우체의 수컷 가임 회복자"는 수컷 불임 유전자를 제거하거나 억제함으로써 가임을 회복시키는 형질전이 유전자를 말한다.
"바르나제" 및 "바스타"는 문헌 [Michiels, F., and M. Williams, 1998, Improved barstar gene and its expression in male-sterile barnase-producing plants to restore fertility, PCT Int. Appl., WO, (Plant Genetic Systems, N.V., Belg.; Michiels, Frank; Williams, Mark)., p. 54 pp.]에 기재된 바와 같이 RNase 독소 및 그의 해독제를 말한다.
"활성 형질전이 유전자"는 형질전이 유전자의 발현을 말한다. 본 발명의 내용에 있어서, 유전자를 차단시키거나 유전자를 차단시킨 후 그의 프로모터를 활성화시키는 것 모두를 말한다.
"형질전환"은 외래 유전자를 숙주 유기체의 게놈으로 도입시키는 것을 말한다. 식물 형질전환의 방법들의 예로는 아그로박테륨-매개된 형질전환 (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277) 및 입자 가속 또는 "유전자 총 (gene gun)" 형질전환 기술이 있다 (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73; 미국 특허 제4,945,050호). 용어 "형질전환된", "형질전환체" 및 "형질전환의"는 형질전환 과정을 거치고, 그들의 염샘체에 결합된 외래 유전자를 포함하는 식물 또는 유합조직을 말한다. 용어 "형질전환되지 않은"은 형질전환 방법을 거치지 않는 정상 식물을 말한다.
"안정하게 형질전환된"은 선별 배지 상에서 선택되고 재생된 후 형질전환된 세포를 말한다.
"유전적으로 안정한" 및 "유전가능한"은 식물에서 안정하게 유지되고, 연속적으로 세대를 통하여 자손에 의하여 안정하게 유전되는 염색체적으로 결합된 유전 요소를 말한다.
"야생형"은 임의의 공지된 돌연변이가 없이 자연적으로 발견되는 정상 유전자, 바이러스 또는 유기체를 말한다.
"게놈"은 유기체의 완전한 유전적 물질을 말한다.
"유전적 특질"은 한 세대 또는 다른 세대를 통하여 전달되는 유전적으로 결정된 특질 또는 상태를 말한다. "동형접합" 상태는 동일한 대립형질이 동형접합 염색체 상에 상응하는 부위에 체류할 때 존재하는 유전적 상태를 말한다. 이와는 반대로, "이형접합" 상태는 상이한 대립형질이 동형접합 염색체 상에 상응하는 부위에 체류할 때 존재하는 유전적 상태를 말한다. "잡종"은 두 개의 유전적으로 유사하지 않은 개체 사이의 교배에 의한 임의의 자손을 말한다. "근친교배" 또는 "근친교배계" 또는 "근친교배된 식물"은 실질적으로 동형접합 개체 또는 변종을 의미한다. 이는 밀접하게 상관된 개체들을 연속적으로 교배시키고, 가계상 필수적으로 원하는 특질을 차단함으로써 발생한다.
용어 "오르톨로그(ortholog)" 또는 "오르톨로그 유전자"는 공통적인 계통의 후손에 의해 관련되는 유전자를 가리킨다. 오르톨로그 유전자는 공통 조상의 종을통해 관련되는 한 종의 유전자(상동 유전자)에 상응하나 진화되어 다른 종의 유전자와 상이하게 된 또다른 종으로부터의 유전자이다.
"자가 수분" 또는 "자가 수정"은 하나의 식물의 꽃가루가 동일한 식물의 주두(stigma)(꽃)으로 이동하는 것을 가리킨다. 잡종(F1)의 자가 수분은 식물의 제2 세대(F2)를 생성한다.
"탑크로스(TopCross)(등록상표) 고급 오일 옥수수 종자 방법"은 예를 들어 미국 특허 제5,704,160호에 기재된 바와 같이 당 분야에서 잡종 옥수수 종자의 상업적인 제조 방법에 관한 것이다. 탑크로스(등록상표) 폴리네이터(pollinator)는 꽃가루를 제공하는 크로스의 모계를 가리킨다.
용어 "포자체"는 식물의 배수염색체 상 또는 세포를 의미한다.
용어 "배우체"는 식물의 반수체 상 또는 세포를 의미한다. 이는 감수분열과 수정사이의 식물의 생명 주기의 단계이다. 수컷 배우체는 꽃가루의 반수체 상 또는 세포를 포함하고, 암컷 배우체는 난자의 반수체 상 또는 세포를 포함한다.
용어 "식물 생활 환"은 수정으로부터 다른 수정까지 또는 한 세대의 꽃피는 것으로부터 다음 꽃피기까지와 같은 식물의 일생에서 성장 사건의 완전한 순서를 의미한다.
"1차 형질 전환체" 및 "T0세대"는 초기에 형질 전환된 조직과 동일한 유전적 세대인(즉, 형질 전환때문에 감수분열 및 수정을 거치지 않은) 유전자 전환 식물을 가킨다.
"2차 형질 전환체" 및 "T1, T2, T3등의 세대"는 하나 이상의 감수분열 및 수정 환을 통해 1차 형질 전환체로부터 유도된 유전자 전환 식물을 가리킨다. 이는 다른 형질 전환되거나 비형질 전환된 식물과 1차 또는 2차 형질 전환체의 1차 또는 2차 형질 전환체 또는 크로스의 자가 수정에 의해 유도될 수 있다.
용어 "세대"는 수정으로부터 출발하여 수정까지의 식물 생활 환을 의미한다. 본 발명에서, "제1 세대 식물"은 제1 재조합 사건이 일어나는 식물로서 정의되는 반면, "제2 세대 식물"은 제1 세대 식물의 자손 종자 및 식물이다.
본원 명세서에서 용어 "회복체 유전자"는 발현이 수정률을 회복시키는 유전자로서 정의된다. 배우체 수정률 회복체 유전자는 예를 들어 바스타(barstar) 유전자(Michiels, F. 및 M. Williams, 1998, "Improved barstar gene and its expression in mail-sterile barnase-producing plants to resotre fertility", PCT 국제 출원, WO(Plant Genetic Systems, N.V., Belg.; Michiels, Frank; Williams, Mark), P.54 pp)와 같이 발현이 배우체 불임을 극복하는 유전자를 가리킨다.
하기 약어가 본원 명세서에 사용될 것이다.
"STP"는 종결 단편 또는 차단 단편의 약어이다.
"AP1"은 아라비도프시스 아페탈라(Arabidopsis Apetala) 1 유전자(Liljegren 등, (1999)The Plant Cell11:1007)의 약어이다.
"AG"는 아라비도프시스 아가모우스(Arabidopsis agamous) 유전자(Yanofsky등, (1990)Nature346:35)의 약어이다.
"PI"는 아라비도프시스 피스틸라타(Arabidopsis Pistillata) 유전자(Goto 및 Meyerowitz (1994)Genes and development8:1548-1560)의 약어이다.
"LFY"는 아라비도프시스 리이피(Arabidopsis Leafy) 유전자(Nilsson 등 (1998)The Plant Journal15:799-804)의 약어이다.
"ANT"는 아라비도프시스 아인테구멘타(Arabidopsis Aintegumenta) 유전자(Mizukami 및 Fischer(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA97:942-947)의 약어이다.
"CLV3"은 아라비도프시스 클라바타(Arabidopsis Clavata) 3 유전자(Fletcher 등 (1999)Science283:1911-1914)의 약어이다.
"WUS"는 아라비도프시스 우셸(Arabidopsis Wushel) 유전자(Mayer 등 (1998)Cell95(6), 805-815)의 약어이다.
"STM"은 아라비도프시스 슈우트 메리스템레스(Arabidopsis Shoot Meristemless) 유전자(Long 등 (1996)Nature379:66-69)의 약어이다.
"rol C"는 뿌리를 형성하는 뿌리 위치(locus) C 유전자의 약어이다(Constantino 등 (1994)Genetics94:203 참조).
"IPT"는 이소펜틸 트랜스페라제(isopentyl transferase) 유전자(Ebumina 등 (1997)Proc. Natl Acad. Sci. USA94:2117-2121)의 약어이다.
"KNAT"는 크녹스(Knox) 계의 유전자의 약어이다(Reiser 등 (2000)Plant Mol. Biol.42:151-166 참조).
"Lec1"는 아라비도프시스 리이피 코틸레돈(Arabidopsis Leafy Cotyledon) 1(Lotan 등, (1998)Cell93:1195-1205) 유전자의 약어이다.
"OSHI"는 벼 호모박스 유전자(Sentoku 등 (2000)Developmental Biology220:358-364)의 약어이다.
"Kn1"은 옥수수 노티드(Knotted) 1 유전자(Vollbrecht, E 등 (1991)Nature350:241-243)의 약어이다.
"Gmf"는 배우체 수컷이 수정가능한 것을 의미한다.
"Gms"는 배우체 수컷이 불임인 것을 의미한다.
"TG"는 전환 유전자의 약어이다.
"SAM"은 발아 정상 분열조직의 약어이다. SAM은 식물 또는 꽃일 수 있다.
"SSR"은 부위 특이적 재조합의 약어이다.
"SAP"는 미국 특허 제5470359호, 제5837850호에 기재된 인조 꽃밥 프로모터의 약어이다.
"HSP"는 열충격 단백질의 약어이다.
본 발명은 하나 이상의 부위 특이적 리컴비나제 시스템 및 전환 유전자를 다양한 구성적인 유도가능한 조직 특이적 또는 발달 특이적 프로모터의 조절하에 사용함으로서 식물에서 전환 유전자의 조건적 또는 조절된 발현 또는 제거를 위한 작제물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 본원 명세서에서 리컴비나제 요소로서 언급되는 다양한 작제물을사용한다. 각각의 리컴비나제 요소는 식물 세포에서 작용하는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 이외에, 리컴비나제 요소는 부위 특이적 리컴비나제 또는 전환 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 많은 다른 성분을 포함하거나 리컴비나제에 반응하는 종결 단편 또는 부위 특이적 서열을 포함할 수 있다. 이 리컴비나제 요소는 다양한 조합으로 식물에 도입되어 전환 유전자에 의해 코딩되는 특이적 유전자 특질의 조건적 발현 또는 제거를 제공한다. 다양한 유도체, 식물 조직 또는 식물 발달 상태에 반응적인 프로모터를 리컴비나제 시스템, 종결 단편 및 전환 유전자와 조화시킴으로써, 실제로 임의의 특질이 임의의 식물 발달 단계 또는 임의의 식물 세대에서 발현되거나 제거될 수 있다.
본 유전자 발현 시스템은 현존하는 방법을 능가하는 몇 가지 장점이 있다. 예를 들면, 일부 현존하는 프로모터하에서 조절된 발현이 비특이적 또는 "누출" 발현을 일으킬 수 있다.
프로모터
본 발명은 리컴비나제 또는 본 발명의 리컴비나제의 일부로서의 형질전이 유전자의 발현을 유도하기 위해 다양한 식물 프로모터를 사용한다.
형질전이 유전자 발현의 조절된 발현은 형질전이 유전자 또는 리컴비나제 시스템을 조건부로 조절될 수 있는 프로모터의 조절 하에 둠으로써 가능하다. 식물에 기능하는 임의 프로모터로는 구조성 식물 프로모터, 식물 조직 특이 프로모터, 식물 발생 특이 프로모터, 유도가능 식물 프로모터, 바이러스 프로모터, 수컷 배 계열 특이 프로모터, 자성 종자 특이 프로모터, 꽃 특이 프로모터, 및 증식형 묘조 정단 분열조직 특이 프로모터를 들 수 있는데, 이들로 한정되는 것은 아니다.
몇 가지 조직 특이적인 조절된 유전자 및(또는) 프로모터가 식물에서 보고되었다. 이들은 종자 저장 단백질 (예, 나핀, 크루시페린, 베타-콘글리시닌 및 파세올린), 지인 또는 유성체 단백질 (예, 올레오신)을 코딩하는 유전자, 또는 지방산 생합성 (아실 운반체 단백질, 스테아로일-ACP 불포화효소, 및 지방산 불포화효소(fad 2-1))에 관계된 유전자, 및 배아 발생 동안에 발현된 다른 유전자 (예, Bce4, 예를 들어, EP 255378 및 문헌 [Kridl et al., Seed Science Research (1991) 1:209-219] 참조)를 포함한다. 종자 특이적 발현에 특히 유용한 것은 피 비실린 프로모터 (pea vicilin promoter)이다 [Czako et al., Mol. Gen. Genet. (1992), 235(1), 33-40]. 성숙한 잎의 발현에 유용한 다른 프로모터는 예를 들어, 아라비돕시스 (Arabidopsis)로부터의 SAG 프로모터와 같은 노화의 개시시에 작동하는 것이다 [Gan et al., "Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin", Science (Washington, D. C.) (1995), 270 (5244), 1986-8].
개화시 또는 개화 동안에, 적어도 열매가 익기 시작할 때까지 열매 발생을 통해 발현되는 일군의 열매 특이 프로모터가 U.S. 4,943,674에 논의되어 있으며, 그의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
목화 섬유에서 우선적으로 발현되는 cDNA 클론이 단리되었다 [John et al., Gene expression in cotton (Gossypium hirsutum L.) fiber: cloning of the mRNAs, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992), 89(13), 5769-73]. 열매 발생 동안에 차별적인 발현을 나타내는 토마토의 cDNA 클론이 단리되었으며 특질을 조사하였다 [Mansson et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 200:356-361; Slater et al.,Plant Mol Biol. (1985) 5:137-147]. 폴리칼락투로나제 유전자에 대한 프로모터는 열매가 익는 데 활성이다. 폴리갈락투로나제 유전자는 U.S. 4,535,060 (1985년 8월 13일에 특허 허여됨), U.S. 4,769,061 (1988년 9월 6일에 특허 허여됨), U.S. 4,801,590 (1989년 1월 31일에 특허 허여됨) 및 U.S. 5,107,065 (1992년 4월 21일에 특허 허여됨)에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참고로 인용된다.
psbA (광시스템 II의 성분 중 하나)에 대한 성숙 색소체 mRNA는 열매 발생에서 그의 최고치에 늦게 도달한 반면, 광시스템 I 및 II의 다른 성분에 대한 색소체 mRNAs는 열매가 익기 시작한 후 크로모플라스트에서 감지할 수 없는 정도로 감소한다 [Piechulla et al., Plant Mol. Biol. (1986) 7:367-376]. 최근, 토마토 화분 [McCormick et al., Tomato Biotechnology (1987), Alan R. Liss, Inc., New York]과 암술 [Gasser et al., Plant Cell (1989), 1:15-24]의 상호작용에 명백하게 관여된 유전자를 나타내는 cDNA 클론도 단리되었으며, 특질이 확인되었다.
조직 특이 프로모터의 다른 예로는 잎에 대한 손상 (예를 들어, 곤충의 갉아 먹음으로 인한)에 이은 잎 세포에서 직접 발현, 줄기 (예를 들어, 파라틴 유전자 프로모터) 및 섬유 세포 (발생적으로 조절된 섬유 세포 단백질의 일례는 E6임 [John et al., Gene expression in cotton (Gossypium hirsutum L.) fiber: cloning of the mRNAs, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992), 89(13), 5769-73])에서 직접 발현하는 것을 들 수 있다. 잎, 배주 및 꽃에서는 전사물의 수치가 적지만, E6 유전자는 섬유에서 활성이 가장 강하다.
일부 "조직 특이" 프로모터의 조직 특이성은 절대적이지 않을 수 있으며, 당업자가 디프테리아 독소 서열을 이용하여 시험할 수 있다. 또한 다른 조직 특이 프로모터들의 조합에 의해 "누출" 발현으로 조직 특이적 발현을 달성할 수 있다 [Beals et al., (1997) Plant Cell, vol. 9, 1527-1545]. 다른 조직 특이 프로모터는 당업자에 의해 단리될 수 있다 (U.S. 5,589,379 참조).
자, 웅, 또는 자웅 특이 세포 종족에 모두에 반응하는 배 계열 특이 프로모터도 본 발명에 유용하다. 예를 들어, 형질전이 유전자는 홀씨 꽃밥 조직 (예, Bcp I 및 TA29 프로모터 또는 배우체 화분)에서 꽃밥 프리모르디아 유전자, 예를 들어 아라비돕시스 아페탈라 3 (Arabidopsis Apetalla3) 및 피스틸라타 (Pistilata, PI) 중의 수컷 배 계열 특이 유전자, 또는 다른 식물종으로부터의 그의 오르토로그 (ortholog)의 조절하에, 부위 특이적 리컴비나제의 발현에 의해 화분으로부터 발현되거나 제거될 수 있다. 유사하게, 형질전이 유전자는 배주 프리모르디아 중의 자성 배 계열 특이 유전자의 조절하에 부위 특이 리컴비나제 발현에 의해 배주로부터 발현되거나 제거될 수 있다. 형질전이 유전자는 자웅 종족에 공통인 유전자, 꽃에서는 예를 들어 아라비돕시스 아가모우스 (Arabidopsis agamous) 유전자 또는 그의 다른 종의 오르토로그, 화분열조직에서는 예를 들어 아라비돕시스 아페탈라 1 (Arabidopsis Apetala1), 리피 (Leafy) 및 에렉타 (Erecta) 또는 다른 종으로부터의 그의 오르토로그, 및 증식성 묘조 정단 분열조직, 예를 들어 아라비돕시스 우쉘 (Arabidopsis WUSHEL (WUS)) 및SHOOT MERISTEMLESS (STM)또는 다른 종으로부터의 그의 오르토로그의 대한 프로모토의 조절하에 부위 특이적 리컴비나제 유전자의 발현에 의해 수컷 및 자성 특이 배 계열로부터 발현되거나 제거될수 있다. 묘조 정단 분열조직의 프로모터는 선택에 이은 조직 배향 또는 형질전환 표현형에 이은 플란타에서 초기 형질전환 마커 유전자의 발현 또는 제거에 특히 유용하다.
유사하게, 몇 가지 유도가능 프로모터 ("유전자 스위치")가 보고되었다. 여러가지가 가츠(Gatz)에 의해 재고되었다 [Current Opinion in Biotechnology, 1996, vol. 7, 168-172; Gatz, C. Chemical control of gene expression, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. (1997), 48, 89-108]. 이들은 테트라시클린 리프레서 시스템,Lac리프레서 시스템, 구리 유도가능 시스템, 살리실레이트 유도가능 시스템 (예를 들어, PR1a 시스템), 글루코코르티코이드- [Aoyama T. et al., N-H Plant Journal (1997), vol. 11:605-612] 및 에크디섬- 유도가능 시스템을 포함한다. 또한 벤젠 술폰아미드- (U.S. 5,364,780) 및 알코올- (WO 97/06269 및 WO 97/06268) 유도가능 시스템 및 글루타티온 S-트랜스페라제 프로모터도 포함된다. 다른 연구들은 증가된 염분, 결핍, 병원균 및 손상과 같은 환경적 스트레스 또는 자극에 대한 반응에 있어서 조절된 유전자 유도가능성에 초점이 맞추어졌다 [Graham et al., J. Biol. Chem. (1985) 260:6555-6560; Graham et al., J. Biol. Chem. (1985) 260:6561-6554; Smith et al., Planta (1986) 168:94-100]. 메탈로카르복시펩티다제-억제제 단백질의 축적이 상처난 감자 식물의 잎에서 보고되었다 [Graham et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1981) 101:1164-1170]. 다른 식물 유전자도 메틸 자스모네이트, 엘리시터, 열 쇼크, 혐기성 스트레스, 또는 제초제 안전제를 유도하는 것으로 보고되었다.
부위 특이적 리컴비나제 시스템
본 발명은 형질전이 유전자의 절단 또는 발현 조절에 사용하기 위한 부위 특이적 리컴비나제 시스템을 제공한다. 부위 특이적 재조합 시스템은 다음의 두 가지 요소로 구성된다: (1) 특징적인 DNA 서열이 있는 재조합 부위 (본 발명의 제거가능한 DNA 요소에 해당함), (2) 상기 DNA 서열에 특이적으로 결합하고, 2 개 이상의 상기 서열이 존재하는 경우, DNA 서열들 사이의 재조합을 촉매하는 효소 (리컴비나제). 2 개의 DNA 서열이 하나의 DNA 분자 (예를 들면, 플라스미드, 염색체 등)상에서 주어진 간격을 두고 동일 방향으로 배향되어 있는 경우, 이러한 DNA 서열들 사이의 영역은 이 DNA 분자에서 절단된다. 2 개의 DNA 서열이 하나의 DNA 분자 상에서 반대 방향으로 배향되어 있는 경우, 이러한 DNA 서열들 사이의 영역은 반전된다.
조건 형질전이 유전자를 발현시키기 위해서 발생 조절 프로모터 또는 화학적 유도 프로모터를 사용하는 것은 적용에 따라서 보통, 상기 프로모터가 "완전한 작동 (fully-on)" 단계일 때, 강도가 불충분하다든가, 또는 보다 빈번하게는 상기 프로모터가 "비작동 (off)" 단계일 때, 기본적인 비특이적 발현 (즉, "누출 (leaky)" 발현)에 의해 제한된다.
당해 유전자의 코딩 서열이 강한 구성적 프로모터 또는 조절 프로코터의 조절을 받도록하여, 생산 조직에서 부위 특이적 리컴비나제 동족체의 조건 발현을 통한 상기 유전자에서의 부위 특이적 재조합이 일어나지 않는 경우에는 상기 유전자가 전사적으로 불활성이 되도록 하는 방식으로 조건 발현의 수준 및 특이성 모두를증가시킬 수 있다. 그러므로, 당해 유전자의 조건 발현은 이제 리컴비나제의 조건 발현에 따라 달라지게 된다. 이러한 방식에서, 고수준 발현 및 특이성에 관한 결정 인자는 별개의 것이어서 리컴비나제의 기본적인 비특이적 발현 (즉, "누출 (leaky)" 발현)에 중점을 둘 수 있다. 부위 특이적 서열 및 이들의 리컴비나제 동족체는 임의의 천연 부위 특이적 재조합 시스템으로 부터 유래한 것일 수도 있다. 공지된 예로는 Cre-lox, FLP/FRT, R/RS, Gin/gix, pSR1 시스템, 써 (cer) 시스템, 및 핌 (fim) 시스템 등이 있다 (예를 들면, 문헌 (N.L.Craig, Annu Rev.Genet., vol.22, p.17, 1988; Odell et al., Use of site-specific recombination systems in plants. Homologous Recomb. Gene Silencing Plants (1994), 219-70. Editor(s): Paszkowski, Jerzy. Publisher: Kluwer, Dordrecht, Germany) 참조). 또한, 부위 특이적 재조합 시스템은 파지, 세균 (예를 들면, 대장균), 효모 등을 비롯한 미생물에서 확인되었다. P1 파지에서 유래한 Cre/lox 시스템을 사용하여 이러한 미생물로부터 분리한 부위 특이적 재조합 시스템 (WO 93/01283)을 이 시스템이 유래되었던 생물과는 상이한 생물 (예를 들면, 식물)에 도입하는 경우, 이 시스템은 원래의 생물에서와 동일한 방법으로 작용한다. 또한, 효모 (자이고사카로마이시즈 록시 (Zygosaccharomyces rouxii))의 부위 특이적 재조합 시스템 (pSR1 시스템 (H.Matsuzaki et al., J.Bacteriology, vol.172, p.610, 1990))도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한, 이 pSR1 시스템은 고등 식물에서 자신의 고유한 기능을 유지한다 (H.Onouchi et al., Nucleic Acid Res., vol.19, p.6373, 1991).
필요한 리컴비나제 수준이 높을 것이라 기대되지 않기 때문에, 너무 약하여당해 유전자를 발현하지 못할 수 있는 "특이적" 프로모터를 여러 개 사용할 수 있다. 또한, 부위 특이적 재조합은 리컴비나제의 역치 수준에 따라 달라지기 때문에, 리컴비나제의 서브 한계 수준을 초래하는 누출 (leaky) 전사를 허용할 수 있다.
또한, 야생형 Cre 매개 재조합의 효율을 떨어뜨리고, 부위 특이적 재조합을 위한 돌연변이 부위를 사용하고(거나) 재조합에 충분치 못한 리컴비나제 돌연변이체를 사용하여, 리컴비나제의 필요한 역치 수준을 높이면, 조절 가능한 프로모터에 대한 "조직 선택성"이 증가된다. 상기 돌연변이체들은 적어도 Cre-lox 시스템과 관련하여 잘 공지되어 있다. 본 출원인들은 완화제 (safener) 유도가능한 Cre 발현을 이용하여 형질전이 유전자 (35S:루시퍼라제)의 발현을 활성화하는 경우, 형질전이 유전자 Cre 매개 활성화에 돌연변이 lox 부위 (lox 72) 및 야생형 lox P 부위를 사용하는 것이 둘다 야생형 lox P 부위를 사용하는 경우에 비해 프로모터의 기본 활성을 감소시킴을 알아냈다.
다음과 같은 기타의 전사후 접근법을 사용하면, 리컴비나제 발현의 비특이성은 더욱 감소될 수 있다 (즉, 효소 발현의 특이성이 더욱 증가함): 1) 거의 번역되지 않는 키메라 리컴비나제 유전자 (예를 들면, 코작 규칙 (Kozak's rule)에 따라 개시 코돈 주위에 비이상적인 콘텍스트 (context) 서열을 갖거나 효모 GCN4 mRNA에서와 같이 5' 비번역 영역에 추가의 짧은 ORF를 갖거나, 또는 문헌 (Palmela Green, Department of Biochemistry, Michigan State University, East Lansing, MI 48824-1312, U.S.A.)에 기재된 바와 같이 mRNA를 불안정하게 만드는 3' UTR을갖는 유전자)의 사용; 2) 세포내 안정성이 떨어지는 (즉, 반감기가 더 짧은) 리컴비나제 돌연변이체의 사용. 상기 돌연변이체들은 PEST 서열을 첨가하여 제조될 수 있다 (Sekhar et al., Jrl. Receptor Signal Transduction Res. 18 (2-3), 113-132 (1998)).
일단 시스템이 주어진 작물에서 구축되면, 여러 표적 형질 유전자의 조건 발현을 위해 쉽게 변형될 수 있다.
형질전이 유전자
본 발명의 형질전이 유전자는 형질전환된 식물에 바람직한 표현형을 전달하는 유전자이거나, 또는 번식에 유용한 마커를 코딩하는 유전자일 것이다. 특히 유용한 형질전이 유전자에는 식물 또는 식물 세포에 특정 표현형을 전달하는 유전자, 형질전환 마커를 코딩하는 유전자, 형태학적 형질을 코딩하는 유전자, 불임성을 전달하는 유전자, 및 호르몬 생합성 유전자 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.
형질전이 유전자는 기능성 RNA 또는 외래 단백질을 코딩할 수 있다. 외래 단백질은 전형적으로 식물 숙주에 외래의 것일 수 있는 단백질을 코딩할 것이다. 이러한 외래 단백질에는 예를 들어, 식물의 1 차 또는 2 차 대사 과정의 효소, 질병 또는 제초제 내성을 부여하는 단백질, 상업적으로 유용한 비식물 효소, 및 동물 먹이 또는 사람의 식량에 유용한, 원하는 특질을 갖는 단백질 등이 포함될 것이다. 또한, 형질전이 유전자가 코딩하는 외래 단백질에는 영양 특질이 개선된 종자 저장 단백질 (예를 들면, 황 함량이 높은 10 kD 옥수수 종자 단백질 또는 황 함량이 높은 제인 단백질)이 포함될 것이다. 본 발명에 사용하기 적합한 형질전이 유전자의추가의 예로는 질병 내성 유전자 (예를 들면, 바실루스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis), WO 92/20802), 제초제 내성 유전자 (아세토락트산 신타제 돌연변이체 유전자, WO 92/08794), 종자 저장 단백질 유전자 (예를 들면, 글루텔린 유전자, WO 93/18643), 지방산 합성 유전자 (예를 들면, 아실-ACP 티오에스테라제 유전자, WO 92/20236), 세포벽 가수분해 유전자 (예를 들면, 폴리갈락투로나제 유전자 (D.Grierson et al., Nucl.Acids Res., vol.14, p.8595, 1986), 안토시아닌 생합성 유전자 (예를 들면, 칼콘 신타제 유전자 (H.J.Reif et al., Mol.Gen.Genet., vol.199, p.208, 1985), 에틸렌 생합성 유전자 (예를 들면, ACC 옥시다제 유전자 (A.Slater et al., Plant Mol.Biol., vol.5, p.137, 1985), 활성 산소 제거 시스템 유전자 (예를 들면, 글루타티온 리덕타제 유전자 (S.Greer & R.N.Perham, Biochemistry, vol.25, p.2736, 1986), 및 리그닌 생합성 유전자 (예를 들면, 페닐알라닌 암모니아 분해효소 유전자, 신나밀 알콜 디히드로게나제 유전자, o-메틸트랜스퍼라제 유전자, 신남산 4-히드록실라제 유전자, 4-쿠마르산-CoA 연결효소 유전자, 신나모일 CoA 리덕타제 유전자 (A.M.Boudet et al., New Phytol., vol. 129, p.203, 1995)) 등이 있다.
형질전이 유전자 (transgene)는 형질전환 마커 (marker)로서 작용할 수 있다. 형질전환 마커는 선택가능한 유전자, 예를 들어 조직 배양에서 형질전환된 세포를 선택하는데 사용되는 항생제 또는 제초제 내성 유전자, 비파괴성 스크리닝가능한 리포터 (reporter), 예를 들어 녹색 형광성 및 발광효소 유전자, 또는 형태학상 마커, 예를 들어 "슈티 (shooty)", "루티 (rooty)" 또는 "종양상 (tumorous)"표현형을 포함한다.
추가적으로 형질전이 유전자는 식물 형태학에 영향을 끼치는 단백질을 코팅할 수 있으므로, 마커로서도 사용될 수 있다. 형태학상 형질전환 마커 유전자는 시토키닌 생합성 유전자, 예를 들어 박테리아성 유전자 코딩 이소펜테닐 전이효소 (IPT)를 포함한다. IPT 유전자는 문헌 [Ebumina et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2117-2121] 및 문헌 [Kunkel et al. Nat. Biotechnol. (1999), 17(9), 916-919]에서 형질전환을 위한 마커로서 제안되었다. 전자의 경우, IPT 유전자는 전이가능한 요소의 내부에 삽입되었고, 이를 형질전환 후 절단하여 전이가능한 요소 및 IPT 유전자가 손실되었다. 그러나, 이 방법은 특히 손실의 빈도가 낮기 (1 % 이하) 때문에 효과가 없다 (상기 쿤켈 (Kunkel)의 문헌 참조). 상기 쿤켈의 문헌은 유도가능한 IPT 유전자의 사용을 제안하고 있다. 이는 역시 바람직하지 않니만, 형질전환 후 박테리아성 IPT 유전자가 손실되지 않기 때문에 조절의 면에서 중요할 수 있다. 또한, 형질 스태킹 (trait stacking)에서 재형질전환에서 그를 사용하는 것은 허용되지 않는다. 따라서, 형태학상 마커를 효과적으로 조절하여 제거하는 것이 필요하다. 다른 형태학상 마커는 아라비돕시스 (Arabidopsis) STM, KNAT 1, 또는 아인데구만타 (AINTEGUMANTA), Lec 1, 브라시카 (Brassica) "베이비붐 (Babyboom)" 유전자, 쌀 OSH1 유전자, 또는 옥수수 노티트 (Knotted) (Kn1) 유전자와 같은 전위성 어린싹 (shoot)을 유도할 수 있는 발생 (developmental) 유전자를 포함한다. 그러나 다른 형태학상 마커는 종양 또는 털뿌리를 유도하는 애그로박태리엄 (Agrobacterium)의 Ti 및 Ri 플라즈미드의 야생형 T-DNA, 또는 슈티 (예, 시토키닌 생합성 유전자) 또는 루티 표현형 (예, rol C 유전자)와 같은 별개의 형태학상 표현형에 대한 이들의 구성 T-DNA 유전자이다. 형질전환된 조직/장기 및 그의 후속 제거 (흥미있는 형질전이 유전자는 남김)를 확인하기 위한 형태학상 형질전환 마커의 용도는 정상 형태학 및 형질전환 조직으로의 발달을 복원한다. 이는 특히 식물내 (in planta) 형질전환에서 유용하고, 여기서 형태학상 마커는 비정상 형질전환 장기를 얻는데 사용되고, 이어서 비정상 형질전환 잔기는 자리-특이성 재조합에 의해 교정되어 (correct) 형질전환을 위한 시간 및 노동 집약적인 조직 배양 방법을 거치지 않고도 형태학상 및 발달상 정상 형질전환 식물을 형성한다.
식물 숙주
본 발명은 본 작제물을 가진 형질전환을 위한 식물 숙주를 추가적으로 제공한다. 또한, 본 발명에 사용하기 위한 숙주 식물은 특히 제한되지 않는다. 숙주 식물로서 사용되는 초본성 식물의 예에는 담배 (Tabacum), 토마토 (Lycopersicom), 고구마 (Impoea), 감자 (Solanum), 당근 (Dacus), 양상추 (Lactuca), 컬리플라워 (Brassica), 캐비지 (Brassica), 오일종자 평지 (Brassica), 해바라기 (Helianthus), 사탕무 (Bela), 아스파라거스 (Asparagus), 바나나 (Musa), 목화 (Gossypium), 아라비돕시스 (Arabidopsis), 알파파 (Medicago), 완두콩 (Pisum), 대두 (Glycine), 쌀 (Oryza), 옥수수 (Zea), 및 호밀 (Secale)이 있다. 숙주 식물로 사용할 수 있는 수목 식물의 예에는 포플라나무 (Populus), 유칼리나무 (Eucalyptus), 아카시아 (Acacia), 배나무 (Pyrus), 사과나무 (Malus), 포도나무 (Vitis), 호두나무 (Juglans), 서양자두나무 (Prunus), 장미 (Rosa), 및 가문비나무 (Picea)가 있다. 그러나, 본 발명에 사용하기 위한 숙주 식물은 이에 제한되지 않는다.
식물 형질전환
당업자는 식물에서 형질전이 유전자의 발현 수준 및 조절이 계통 (line)마다 명백하게 변화될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 목적하는 발현 수준 및 조절을 갖는 것을 찾기 위해 몇몇 계통을 실험해야만 한다. 일단 한 계통이 목적하는 키메라 Cre 형질전이 유전자의 조절 특이성을 갖는 것으로 확인되면, 활성을 위해 상이한 비활성 레플리콘 (replicon) 또는 비활성 형질전이 유전자를 갖는 계통과 교배시킬 수 있다.
식물 세포 숙주로 작제물의 도입하기 위한 다양한 기술을 이용할 수 있고, 이들은 당업자들에게 공지되어 있다. 이러한 기술은 애그로박테리엄 투메파시엔스 (A. tumefaciens) 또는 애그로박테리엄 리조진 (A. rhizogene)을 형질전환제로서 사용한 DNA를 사용하는 형질전환법, 전기천공법, 입자 가속법 등을 포함한다 (예를 들어, EP 제295959호 및 동 제138341호 참조). 애그로박테리엄 종의 Ti 및 Ri 플라즈미드의 이성분형 벡터를 사용하는 것이 특히 바람직하다. Ti-유도된 백터는 외떡잎식물 및 쌍떡잎식물, 예를 들어 대두, 목화, 평지, 담배 및 쌀을 포함하는 다양한 고등식물을 형질전환시킨다 (문헌 [Pacciotti et al. (1985) Bio/Technology 3:241; Byrne et al. (1987) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 8:3, Sukhapinda et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8:209-216; Lorz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:178; Potrykus (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183;Park et al., J. Plant Biol. (1995), 38(4), 365-71; Hiei et al., Plant J. (1994), 6:271-282]). 식물 세포를 형질전환시키기 위한 T-DNA의 용도는 광범위하게 연구되었고, 이는 EP 제120516호, 문헌 [Hoekema, In:The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V.; Alblasserdam (1985), Chapter V, Knauf, et al., Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium In:Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction, Puhler, A. ed., Springer-Verlag, New York, 1983, p. 245; 및 An, et al., EMBO J. (1985) 4:277-284]에 충분히 기재되어 있다. 식물로의 도입을 위해, 본 발명의 키메라 유전자는 실시예에 기재된 바와 같이 이성분 벡터로 삽입될 수있다.
외래 DNA 작제물의 직접 흡수 (EP 제295959호 참조), 전기천공 기술 (문헌 [Fromm et al. (1986) Nature (London) 319:791]) 또는 핵산 작제물로 코팅된 금속 입자를 사용한 높은 속도의 발리즘성 (ballistic) 충격법 (문헌 [Kline et al. (1987) Nature (London) 327:70] 및 U.S. 특허 제4,945,050호)과 같은 다른 형질전환 방법을 당업자들이 사용할 수 있다. 일단 형질변환되면, 당업자들은 세포를 증식시킬 수 있다. 외래 유전자를 상업상 중요한 농작물, 예를 들어 평지씨 (문헌 [De Block et al. (1989) Plant Physiol. 91:694-701] 참조), 해바라기 (문헌 [Everett et al. (1987) Bio/Technology 5:1201]), 대두 (문헌 [MaCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923; Hinchee et al. (1988) Bio/Technology 6:915; Chee et al. (1989) Plant Physiol. 91:1212-1218; Christou et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:7500-7504]; EP 제301749호), 쌀 (문헌 [Hiei et al., Plant J.(1994), 6:271-282]), 및 옥수수 (문헌 [Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618; Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839])로 형질전환시키는 최근에 기재된 방법이 특히 타탕하다.
그 후, 유전자도입 식물 세포는 유전자도입 세포 선택을 위한 선택 배지에 배치된 후, 캘러스(callus)로부터 지맥이 성장하였고, 이를 루팅 배지중에서 성장시킴으로써 지맥으로부터 묘목이 생성되었다. 여러가지 작제물이 식물 세포 선택을 위해 마커에 결합할 것이다. 통상적으로, 마커는 살생제(특히 카나마이신, G418, 블레오마이신, 히그로마이신, 클로램페니콜, 제초제 등)에 내성일 수 있다. 사용되는 특정 마커는 도입된 DNA가 없는 세포에 비하여 형질전환된 세포의 선택을 가능케 할 것이다. 본 발명의 전사 카세트를 포함하는 DNA 작제물의 성분은 숙주에 대해 자연적(내생적)이거나 이질적(외생적)이다. "이질적"이란 작제물이 도입되는 야생형 숙주내에서 발견되지 않는 서열을 의미한다. 이종 작제물은 전사 개시 부위가 유도되는 유전자에 대해 자연적이지 않은 1 종 이상의 영역을 포함할 것이다.
유전자도입 세포 및 식물내의 형질전환 유전자의 존재를 확인하기 위하여, 당 업계의 숙련자에게 공지된 방법을 사용하여 서던 블롯팅 분석이 수행될 수 있다. 형질전환 유전자의 발현 생성물은 생성물의 형질에 따라, 웨스턴 블롯팅 및 효소 분석을 포함하는 임의의 여러가지 방법으로 탐지될 수 있다. 단백질 발현을 측량하고 상이한 식물 조직에서의 복제를 탐지하는 데 특히 유용한 방법은 GUS와 같은 리포터 유전자를 사용하는 것이다. 일단 유전자도입 식물이 수득되면, 이들은 성장하여 원하는 표현형을 지닌 식물 조직 또는 부분을 생성할 수 있다. 식물 조직 또는 식물 부분은 수확되고(되거나) 종자 채집될 수 있다. 이 종자는 원하는 형질을 지닌 조직 또는 부분을 포함하는 식물을 추가로 재배하는 데 원천으로 사용될 수 있다.
<바람직한 실시양태의 상세한 설명>
본 발명은 식물 생활환의 특정 기간 동안의 식물, 특정 식물 조직 또는 특정 세대의 여러가지 유전 형질을 조절 프로모터에 구속시킴으로써 이들 형질의 조건 발현의 문제를 해결하고, 또한 부위 특이 리컴비나제 시스템을 적절히 사용함으로써 발현의 개시를 조절할 것이다. 본 발명의 작제물은 재조합 요소로 칭한다. 각각의 재조합 요소는 1 개 이상의 식물 프로모터를 포함한다. 프로모터는 구성적, 유도가능하고 조직 특이 또는 성장 단계 특이 프로모터일 수 있다. 성장단계적으로 조절되는 생식세포 프로모터의 조합이 특히 유용하다. 하나의 리컴비나제 요소는 통상적으로, 실시 가능하게 결합된 단일 프로모터로 구성될 것이다. 두 번째로, 제3 및 제4의 리컴비나제 요소는 제2 또는 제3의 리컴비나제의 발현 또는 형질전환 유전자의 발현을 유도할 상이한 프로모터들로 구성될 것이다. 본 발명의 형질전환 유전자는 유전적 형질, 또는 여러가지 형질전환 또는 형태학상의 마커를 코딩할 것이다. 리컴비나제 요소를 배열하고 상이한 조(祖)식물에 배치함으로서, 형질전환 유전자가 특정 조직 또는 식물 생활환의 특정 기간 또는 특정 세대에서 발현하게 한 후, 바람직하다면, 더 이상 필요가 없을때 형질전환 유전자를 선택적으로 절제하는 것이 가능하다. 임의의 수의 리컴비나제 요소와 이러한 필수 성분을결합하여 발현 및 형질전환 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명은 식물 시스템내의 형질전환 유전자의 조건 또는, 조절 발현 또는 제거를 위한 방법 및 작제물을 제공한다. 가장 기초의 형태로 이는 단일 부위 특이 리컴비나제 시스템 및 한 쌍의 조절 프로모터를 이용하여 성취될 수 있다. 이러한 설계는 도 1에 도시되어 있다. 도 1에서, 리컴비나제 (R1) 코딩 서열에 실시 가능하게 결합된 프로모터 (P1)를 포함하는 제1 리컴비나제 요소가 제공된다. 이와 유사하게, 제2 리컴비나제 요소는, 형질을 코딩하는 형질전환 유전자 (TG)의 상류에 위치한 종결 단편 (STP)의 상류에 배치된 제2의 상이한 프로모터 (P2)를 포함한다. 종결 단편 (STP)은 리컴비나제, 또는 리컴비나제 서열 (RS1)에 반응하는 부위 특정 서열이 결합되어 있다. 유도가능한 P1 프로모터의 경우에, 단일 식물이 제1 및 제2 리컴비나제 요소 모두에 의해 공-형질변환이 될 수 있다는 것이 이해될 것이지만, 통상적으로 제1 및 제2 리컴비나제 요소는 상이한 식물들에 제공된다. 제1 및 제2 리컴비나제 요소가 동일한 조직내에 존재하는 경우에 교차 또는 공-형질전환 후, 제1 프로모터 (P1)는 리컴비나제 (R1)를 발현시키고 이는 제2 리컴비나제 요소로부터 종결 단편 (STP)을 절제한다. 제2 프로모터의 활성화는 형질을 코딩하는 형질전환 유전자 (TG)를 발현시킨다. 이러한 설계의 한 활용은 제1 세대에서만 일반적인 식물 성장에 해로운 발현을 나타내는 형질전환 유전자를 활성화시키는 것이다. 이러한 형질전환 유전자는 식물에게 해롭기에는 너무 높은 수준의 원하는 생성물을 재배 동안을 제외한 수확가능한 세대에서만 초래하는 형질전환 유전자를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태는 제1 또는 제2 세대의 식물 생활환의 어느 특정 성장 단계에서, 형질을 코딩하는 전이유전를 제거 또는 절제하는 방법 및 작제물을 제공한다. 이 방법의 간단한 실시예는 도 2에 도시되어 있다. 도 2에서, 2 종의 리컴비나제 요소가 다시 제공된다. 생식세포계열 프로모터 (P1)를 포함하는 제1 리컴비나제 요소가 리컴비나제 코딩 서열 (R1)에 실시 가능하게 결합된다. 제2 리컴비나제 요소는, 형질을 코딩하는 형질전환 유전자 (TG)에 실시가능하게 결합된 프로모터 (P2)를 포함하고, 이 때 전체 리컴비나제 요소는 이에 반응하는 리컴비나제 서열 (RS1)이 결합되어 있다. 유도가능한 P1 프로모터의 경우에, 단일 식물이 제1 및 제2 리컴비나제 요소 모두에 의해 공-형질변환이 될 수 있다는 것이 이해될 것이지만, 통상적으로 제1 리컴비나제 요소는 제1 식물에 제공되는 반면에 제2 리컴비나제 요소는 제2 식물에 제공된다. P1이 성장 조절된 생식세포계열 프로모터이면, 제1 및 제2 식물의 이종교배는 P1을 활성화시키고 제1 세대의 리컴비나제 (R1)를 발현시킨다. TG가 무성 조직에서 발현되고 P1이 공통이거나 남성 생식세포계열 프로모터일 때, TG는 식물 생활환의 후반기에 활성화되어 리컴비나제 (R1)을 발현하고 제1 세대의 종자 또는 화분으로부터 각각 P2-TG 키메라 요소의 절제를 초래한다. 이 설계의 한 활용은 화분으로부터 형질전환 유전자를 제거하여 형질전환 유전자가 환경적으로 영향을 미치고 야생형 관계물 및 이웃 작물로 벗어나는 것을 예방하는 것이다. 다른 활용은 자손 종자로부터 형질 유전자를 제거하여, 다음 재배 시기의 잔류 또는 자생 식물을 방지하고, 조절에 관한 걱정을 줄이며 원치않는유전자에 대한 보다 엄격한 조절을 제공하는 것이다.
또다른 유용성은 마커 절단을 위한 것인데, 즉, 보다 용이한 조절 허가를 위해, 또 재형질전환을 위한 마커를 재사용하기 위해 형질전환 마커를 제거하기 위한 것이다. 항생 유전자나 제초제 내성 유전자가 식물 형질전환에서의 선택성 마커로 사용되어 비유전자도입 세포로부터 희귀 유전자도입 세포를 선택한다. 그러나, 유전자도입 식물에서의 이러한 마커의 존재는 조절상의 문제/요건 때문에, 또 이것이 스태킹 형질 형질전이 유전자를 위한 선택성 마커의 반복 사용을 막기 때문에 바람직하지 않다. 형질전환에 대한 마커로서 박테리아성 IPT 유전자의 사용이 에부미나 (Ebumina) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2117-2121 (1997)] 및 쿤켈 (Kunkel) 등의 문헌 [Nat. Biotechnol. 17(9), 916-919 (1999)]에서 제안되었다. 전자의 경우, IPT 유전자가 전위유전단위 내에 삽입되고, 형질전환 후 그의 랜덤 절단으로 인해 전위유전단위와 IPT 유전자가 손실되었다. 그러나, 이러한 방법은 비효율적인데 (상기 쿤켈의 문헌 참조), 특히 낮은 손실 회수 (1% 미만) 때문에 비효율적이다. 쿤켈 (상기 문헌 참조)은 화학 유도성 IPT 유전자의 사용을 제안하였다. 그러나, 이 방법은 박테리아성 IPT 유전자가 형질전환 후 손실되지 않아 조절 측면에서 문제가 될 수 있기 때문에 역시 바람직하지 않다. 더우기, 이 방법은 형질 스태킹을 위한 재형질전환을 위해 사용될 수가 없다. 따라서, 구조적으로 발현된 형질전환 마커 유전자의 효율적이며 조절가능한 절단이 필요하다. 본 발명자들은 형질전환 후의 조절된 프로모터 또는 유도성 프로모터의 조절하에 키메릭 리컴비나제 유전자의 발현시 형질전환 마커 유전자가 효율적으로 절단되도록 부위 특이적 서열 내에 형질전환 마커 유전자를 삽입하는 방법을 제안한다. SAM-특이적 유전자가 그들의 프로모터가 미분화 세포/칼리의 형질전환 후 줄기끝에서 Cre를 발현시키고 SSR을 일으킬 수 있다는 점에서 특히 유용할 수 있다. 이는 조직 배양 초기에, 그러나 선택 후 선택성 유전자를 제거하는 데 유용할 것이다. 이는 담배 (리프디스크(leafdisc) 방법) 또는 아라비돕시스(Arabidopsis)의 아그로박테리아 매개된 형질전환에서, 또는 대두나 옥수수의 배아 배양에서의 바이오리스틱 충격에 의해 GFP 또는 루시페라제와 같은 비파괴성 절단 리포터로 시험할 수 있다. 본 발명은 이러한 프로모터 (AP3, BCP1, HSP18.2)를 제공한다.
특히 유용한 실시태양에서, 본 발명은 시간 소비적이고 노동 집약적인 형질전환의 식물 조직 배양 방법을 되풀이할 필요를 없애기 위해 식물내에서의 형질전환을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 어린 어린싹 및(또는) 뿌리와 같은 유전자도입 조직에서의 형태학상 또는 외관상 변화를 유도하는 이득이 되는 (비선택성) 마커 형질전이 유전자의 사용에 좌우된다. 이러한 유전자의 예는 STM, KNAT 1 호메오박스 유전자, Lec 1 또는 ANT 유전자, 또는 심지어 식물내에서의 분열 증식 및 재생을 유도할 수 있는 아그로박테리아 T-DNA이다. (상기한) 조절된 부위 특이적 리컴비나제의 조절 하에 생식세포으로부터의 이들 마커의 후속적인 손실이 식물에서 형태학적으로 정상적인 형질전환체를 회복시킬 수 있을 것이다. 조절된 리컴비나제 유전자는 부위 특이적 서열 안에 또는 밖에 있을 수 있다. 리컴비나제 유전자에 대한 프로모터는 성장상 조절된 생식세포 특이적 유전자, 예컨대 분열조직 동일성, 기관의 원기 또는 꽃밥/암술과 관련된 유전자들로부터 얻을 수 있다. 이는또한 완화제 (예, IB2 프로모터)와 같은 화학물질에 의해, 또는 아라비돕시스 HSP18.2 유전자와 같은 열쇼크에 의해 유도될 수 있다. 본 발명은 이러한 프로모터 (AP3, BCP1, HSP)를 제공한다.
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 2가지 이상의 성장상 교차되는 부위 특이적 재조합 시스템을 사용할 것이다. SSR들이 유전 스위치로 단독 사용되어 왔지만, 여러가지 구조적 또는 조절된 프로터모의 조절 하에 2가지 (또는 그 이상)의 SSR들을 식물의 생활환 내에세 일련의 유전 스위치로 사용하여 한 단계에서의 하나의 리컴비나제 (R1)의 조절성 발현이 이후 단계에서의 또다른 리컴비나제 (R2)를 활성화시킨다. 따라서, 편리한 성장 단계에서, 예컨대 발아 단계에서 이 프로세스를 조건부로 일으킬 수는 있지만, 효과는 이후 단계에서 지연되어 얻어진다.
제1 SSR에 대한 조건부는 화학물질의 사용에 의해, 또는 그의 리컴비나제 유전자를 그의 코그네이트 표적 유전자/유전자들과 조합하는 유전적 크로스에 의해 제공된다. 혼성 작물에 대해서는 후자 방법이 보다 용이하다. 화학물질을 종자에 사용하거나 발아 중에 사용하는 것이 화학물질의 비용 및 표적 세포로의 생동력학과 관련된 문제점을 극복하기 쉽다. 화학물질의 사용은 또한 2가지의 부위 특이적 재조합 시스템 대신 3가지의 시스템을 사용하여 이전 세대에서 수행될 수도 있다. 즉, 또다른 유형의 SSR을 얻게 하는 한가지 형태의 SSR를 유도하기 위해 종자 생산의 마지막 세대에, 즉 후대 종자의 말기 종자 생장에, 또한 형질 유전자를 제거하기 위해 초기 종자에서 발현시키기 위한 제3 형태의 SSR에 있는 발아 종자에 화학물질을 사용할 수 있다. 또다른 실시태양에서, R1은 화학물질의 사용이 SSR I(R1)을 억제하여 유전자도입 형질을 갖는 종자가 생산될 수 있도록 화학적으로 억제할 수 있다. 여기서, 농장에서와 같이 화학물질의 없는 곳에서 농작물은 유전적으로 자극되어 형질 유전자 발현 및(또는) 시기 적절한 그의 후속적인 제거가 가능하다.
연결여부에 상관 없이 2가지 이상의 상이한 부위 특이적 재조합의 이러한 조합은 현재로서는 농업상의 생물공학에서 이용할 수 없는 유전자 발현 및(또는) 제1, 제2 또는 제3 세대에서의 제거를 조절할 수 있는 신규하고 유용한 도구를 제공한다. 따라서, 성장상 교차되는 한쌍의 SSR을 ON-ON 또는 ON-OFF (형질전이 유전자 제거) 스위치로서 사용할 수 있다. 두 구성에서의 두드러지는 특징은 R2 및(또는) 형질 유전자의 발현이 R1에 의한 허가시 (즉, 종결 단편의 제거시) 동시에 일어날 필요가 없고, P2 및 P3 프로모터의 선택에 의해 단독으로 조절된다. 다음의 실시태양은 두가지 부위 특이적 재조합과 관련이 있지만, 이 방법은 제2 세대를 넘어서 조차도 형질전이 유전자 발현을 조절하기 위한 부가 부위 특이적 재조합을 포함하거나, 또는 보다 정확한 형질전이 유전자 활성화 또는 제거를 포함하는 데까지 확장될 수 있다.
한 실시태양에서, 두개의 SSR이 ON-ON 스위치로서 회선되어 하나의 SSR을 가진 것보다 가능한한 늦게 형질 발현을 일으킬 수 있다. 이의 한가지 유용성은 제2 세대에서만 형질 발현을 가능하게 한다는 것이다. 이는 형질 발현을 종자 발아 또는 종자 성장과 같은 정상 식물 발달에 대해 실험하는 경우에 중요하며, 육종 동안 또는 농장에서의 형질 발현은 바람직하지 않으나, 수확되고 가공된 세대에서는 바람직하다. 따라서, 대안적인 바람직한 실시태양에서는, 본 발명은 도 3에 도시한 바와 같이 3개 이상의 별도의 리컴비나제 요소을 이용할 것이다. 도 3을 참고하여, 제1 리컴비나제 요소는 제1 리컴비나제 코딩 서열 (R1)에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터 (P1)으로 구성되는 것으로 제공된다. 제2 리컴비나제 요소는 제2 리컴비나제 코딩 서열 (R2)의 상류에 있는 종결 단편 (STP)의 상류에 위치한 상이한 제2 프로모터 (P2)로 구성되는 것으로 제공되며, 이 종결 단편 (STP)는 제1 리컴비나제 (RS2)에 반응하는 리컴비나제 서열에 결합되어 있다. 제3 리컴비나제 요소는 형질 형질전이 유전자 (TG)의 상류에 있는 정지 코돈 (STP)의 상류에 위치한 제3 프로모터 (P3)으로 구성되는 것으로 제공되며, 이 종결 단편 (STP)는 제2 리컴비나제에 반응하는 리컴비나제 서열 (RS2)에 결합되어 있다. P1이 유도가능한 프로모터인 경우에는 제1, 제2 및 제3 리컴비나제 요소가 교배 또는 동시-형질전환을 비롯한 임의의 수단을 통해 식물에 결합될 수 있으며, P1이 유도가능한 프로모터가 아닌 경우에는 제1 및 제2 요소가 교배에 의해 제1 세대에서 함께 나타날 수 있다는 것을 이해할 것이다. 한 특별히 유용한 실시태양에서, 제1 식물은 제1 및 제3 리컴비나제 요소를 갖는 반면, 제2 식물은 제2 및 제3 리컴비나제 요소를 갖는 것으로 제공된다. 제1 및 제2 식물을 교배시키면 제1 세대 식물이 생산될 것이며, 이 제1 세대 식물에서는 제1 리컴비나제가 발현됨으로써 제2 리컴비나제 요소로부터 종결 단편 (STP)가 절단되어 P2 프로모터의 조절하에 리컴비나제 R2의 발현이 가능해지고, 이어서 이 리컴비나제는 제3 리컴비나제 요소로부터 종결 단편을 절단하여 제2 세대 이후에서는 P3 프로모터의 조절하에 형질 유전자의 발현을 가능하게한다. 여기서, P1, P2 및 P3 프로모터가 모두 동시에 활성화되는 것은 아니다. 그들은 상이한 단계에서 각각 활성화된다: 먼저 제1 세대에서 P1, 다음으로 제1 또는 제2 세대에서 P2, 마지막으로 제2 세대에서 P3이 활성화되며; 대안적으로는 P1 및 P2가 제1 세대에서 함께 활성화되고 제2 세대에서 P3이 활성화되며; 대안적으로는 P1이 제1 세대에서 활성화되고 P2 및 P3이 제2 세대에서 함께 활성화된다. 또한, 제1 세대에서의 발현을 위한 프로모터들은 공통된 생식세포주에서 발현되는 반면, 프로모터 P2 및 P3이 제2 세대에서 나타나는 경우 이들은 제2 세대 생식세포주 또는 체세포에서 발현될 수 있으며, 발달 단계 특이적이거나 화학적으로 유도가능할 수 있다. 이의 한가지 유용성은 발달 형질과 같은 형질을 제2 세대 이후에서만 발현시킨다는 것이다. 이러한 발달 형질에는 단위 생식 (apomixes), 단위 결실, 개화 (닐슨 (Nilsson) 등의 문헌[1998, The Plant Journal 15:799-804]), 자가-부접합 (self-incompatibility, 스톤 (Stone) 등의 문헌[1999, Science 286:1729]), 변경된 개화 시기 (만델 (Mandel) 및 야노프스키 (Yanofsky)의 문헌[Nature (1995) 377:522], 와이겔 (Weigel) 및 닐슨의 문헌[Nature (1995) 377:495]), 수분작용 (pollination)의 유형 (자체 수분 vs 교배 수분), 및 수분의 교배를 위한 배리어, 수분작용의 조절, 자가-부접합, 생식 불능 등이 포함된다. 이들 형질 중 일부는 독소, 또는 내생 유전자를 조절하는 전사 인자와 같은 형질전이 유전자 코딩된 폴리펩티드의 발현을 필요할 것이며, 나머지는 특질 형질전이 유전자가 내생 유전자를 동시-억제하거나 또는 발현을 중단시키는 경우에는 필요로 하지 않을 것이다 (챠웅 (Chuang CF), 메이어로위츠 (Meyerowitz EM)의 문헌[2000, Specific andheritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA. 97:4985-4990] 참조).
이러한 적용의 또다른 유용성은 함유된 생체 반응로에서 수확한 후에 제2 세대의 발아 종자 또는 묘목에서 형질 유전자의 발현을 가능하게 한다는 것이다. 이는 독소 물질의 형질 발현이 이 분야에서 바람직하지 않은 경우에 중요하다. 이러한 개념을 확장하여, 또다른 형질전이 유전자를 활성화시킨 결과, 제2 세대에서 형질 유전자가 제거되거나, 또는 제2 세대가 발달을 차단하는 치명적인 유전자 또는 개화를 막는 생식 불능 유전자를 가지며, 나아가 종자가 형질 유전자를 유전적으로 함유하도록 설정된다.
본 발명의 또다른 실시태양에서는, 2가지 이상의 부위-특이적 재조합이 형질 활성화와 형질 제거를 연관시킴으로써 조건부의 일시적인 형질전이 유전자 발현을 가능하게할 수 있다.
여기서, 2개의 SSR은 R2 리컴비나제가 형질전이 유전자를 제거하도록 발달 과정에서 회선시킨다. 이 결과, ON-OFF (형질전이 유전자 제거에 의함) 스위치에 의해 일시적인 형질 발현이 나타날 것이다. 형질 유전자 제거는 형질 유전자 발현과 비연관 (도 2, 8) 또는 연관 (도 4, 5, 6)되어 있을 수 있다. 후자의 경우는 형질 유전자 발현의 보다 엄격한 조절을 제공한다. 비록 모든 형질전이 유전자가 적절한 리컴비나제 부위에 의해 그들을 플랭킹시킴으로써 제거될 수 있지만, 이들 도면은 형질 유전자만이 제거된 것을 도시한다.
예를 들어, 어떤 상황에서는 식물 생활환 중 한 시점에서만 형질을 발현시키고 이후 세대에서는 형질이 제거시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 것이 도 4에 도시되어 있다. 도 4를 참고하여, 두개의 식물이 제공된다. 제1 식물은 제1 리컴비나제 코딩 서열 (R1)에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터 (P1)을 포함하는 제1 리컴비나제 요소를 함유할 것이다. 제2 식물은 제2 및 제3 리컴비나제 요소 둘다를 함유할 것이다. 제2 요소는 형질 코딩 형질전이 유전자 (TG)의 상류에 있는 종결 단편 (STP)의 상류에 위치한 상이한 제2 프로모터 (P2)로 구성될 것이다. 전체 제2 리컴비나제 요소는 제2 리컴비나제 (RS2)에 반응하는 리컴비나제 서열에 의해 플랭킹되어 있다. 제3 리컴비나제 요소는 제2 (R1과는 상이함) 리컴비나제 코딩 서열 (R2)의 상류에 있는 정지 코돈 (STP)의 상류에 위치한 제3 프로모터 (P3)으로 구성된다. 제2 및 제3 리컴비나제 요소 둘다에서, 종결 단편 (STP)는 제1 리컴비나제에 반응하는 리컴비나제 서열에 의해 플랭킹되어 있다.
P1이 유도가능한 프로모터인 경우에는 제1, 제2 및 제3 리컴비나제 요소가 교배 또는 동시-형질전환을 비롯한 임의의 수단을 통해 식물에 결합될 수 있으며, P1이 유도가능한 프로모터가 아닌 경우에는 제1 및 제2 요소가 교배에 의해 제1 세대에서 함께 나타날 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 제1 프로모터 (P1)이 발달 과정에서 조절된 생식세포주 프로모터인 경우에는, 제1 및 제2 식물을 교배시키면 P1이 활성화되고 제1 리컴비나제 (R1)이 발현될 것이다. 제1 리컴비나제 (R1)이 발현되면 정지 코돈 (STP)를 각각 절단함으로써 제2 및 제3 리컴비나제 요소 둘다도 발현될 수 있게 한다. 제2 프로모터 (P2)가 제3 프로모터 (P3)보다 먼저 활성화되는 경우에는 형질전이 유전자가 발현된다. 제3 프로모터 (P3)은 공통된 또는 수컷 생식세포주 프로모터이고, 그의 활성에 의해 R2가 발현되고, 제2 세대의 자손 종자 또는 제1 세대의 화분으로부터 형질 유전자가 제거될 것이다. 따라서, 본 발명은 형질의 조건부 발현 및 더이상 유용하지 않을 때 후속적인 그의 절단 둘다를 제공한다.
여기에 P1, P2 및 P3 프로모터는 동시에 모두 활성화되지 않고, P3 프로모터는 언제나 P2 프로모터하에서 특질 유전자가 유용하게 발현된 후에 활성화된다. 프로모터 P1은 제1 세대의 생식 세포에서 활성화되고, P2 프로모터는 제1 또는 제2 세대의 생식세포 또는 체세포에서 활성화되고, P3 프로모터는 P2하에서 유용한 특질이 발현된 후에 제1 또는 제2 세대의 공통 또는 수컷 생식세포에서 활성화된다. 세개의 프로모터는 각각 상이한 발생 단계에서 활성화될 수 있다. 예를 들어, 프로모터 P1은 우선 제1 세대의 공통 생식세포에서 먼저 활성화된 후 제1 또는 제2 세대의 체세포 또는 체세포 및 생식세포 세포에서 활성화되고, 마지막 P3은 유용한 특질이 발현된 후에 제1 또는 제2 세대의 공통 또는 수컷 생식 세포에서 활성화된다. 또한, P1 및 P2는 제1 세대에서 함께 활성화될 수 있고, 이후에 P3는 제1 세대 또는 제2 세대에서 활성화될 수 있다. 또는, P1은 제 1 세대의 공통 생식세포에서 먼저 활성화되고, 제1 또는 제2 세대에서 P2는 체세포에서 P3는 생식 세포에서 활성화될 수 있다. 이러한 방법은 두가지 용도를 결합시킨다. 첫째, 특히 표적 생성물이 식물독성인 경우에 유용한 특질 유전자를 원하는 세대에서만 활성화시키고 발현시킬 수 있다. 둘째로, 특질 유전자가 효과적으로 기능을 한 후에, 이들을 유전적으로 더 잘 억제하고 원하지 유전자의 흐름을 방지하기 위해 수분 또는종자로부터 제거할 수 있다.
다른 용도로는 발생 특질, 예를 들어 개화 [Nilsson et al. (1998) The Plant Journal 15:799-804], 자가부적합성 [Stone et al. (1999) Science 286:1729], 개화 시기의 변화 [Mandel and Yanofsky (1995) Nature 377:522, Weigel and Nilsson (1995) Nature 377:495], 단위생식, 단위 결실, 수분 형태 (자가 vs. 타가) 및 타가 수분 등에 대한 장벽을 조절하기 위한 분자적 연구를 들 수 있다.
특히 유용한 특질은 잡종 종자 생산에 중요한, 조건부 수컷 불임성이다. 본 발명은 조건부 수컷 불임성에 대한 간단한 분자 생물학적 방법을 제공함으로써 수컷 불임성을 조절하는 데 특히 유용하다. 수컷 불임성은 포자체 또는 배우체일 수 있다. 예를 들어 도 5를 참고로 하여, 2종의 수컷 임성 식물체를 제공한다. 제1 식물체는 제1 리컴비나제 코딩 서열 (R1)에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터 (P1)로 구성된 제1 리컴비나제 인자를 포함한다. 제2 식물체는 제2 및 제3 리컴비나제 인자 모두를 포함한다. 제2 인자는 차례로 수컷 불임 특질 (MS)을 코딩하는 형질전이 유전자의 상류에 존재하는 종결 단편 (STP)의 상류에 존재하는 제2 프로모터 (P2)로 구성되어 있다. 전체 제2 리컴비나제 인자는 제2 리컴비나제 (RS2)에 반응성인 리컴비나제 서열에 인접해 있다. 제3 리컴비나제 인자는 차례로 제3 리컴비나제 코딩 서열 (R2)의 상류에 존재하는 종결 단편 (STP)의 제3 프로모터 (P3)로 구성되어 있다. 제2 및 제3 리컴비나제 인자 모두에서 종결 단편 (STP)는 제1 리컴비나제 (RS1)에 반응성인 리컴비나제 서열에 인접해 있다.
P1이 유도성 프로모터인 경우, 제1, 제2 및 제3 리컴비나제 인자는 교배 또는 동시 형질전환을 포함한 임의의 방법에 의해 식물체로 조합될 수 있고, P1이 유도성 프로모터가 아닌 경우에, 제1 및 제2 인자는 교배에 의해 제1 세대에 함께 전달되는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 제1 프로모터 (P1)가 구성적이거나 발생적으로 조절되는 공통 생식세포 프로모터인 경우, 제1 및 제2 식물체를 교배하여 제1 리컴비나제 (R1)를 발현시키고 종결 단편 (STP)을 제거하여 제2 및 제3 리컴비나제 인자 모두를 프라이밍시킨다. 제2 프로모터 (P2)가 꽃밥 특이적인 경우, 수컷 불임 유전자는 꽃밥의 포자체 세포에서 발현되어 제1 세대를 수컷 불임으로 만든다. 제3 프로모터 (P3)가 종자 특이적 프로모터인 경우, 수컷 불임성 형질전이 유전자는 F1 잡종 종자에서 절단되어 수컷 임성을 만든다.
우성의 수컷 불임 유전자는 독소 (예, 바나제, 아비딘, RIP) 유전자 또는 가임성 유전자 (예, 옥수수 MS45 유전자)의 보조 억제자를 코딩할 수 있다. 이 인자는 또한 꽃밥 특이적 가임성 유전자 (예, 옥수수 MS45 유전자)의 보조 억제자를 발현하는 구성적인 프로모터일 수 있다.
본 발명은 구체적으로 탑크로스 (TopCross) (등록상표)의 교배 방법에 따라 옥수수에서 수컷 불임성의 조건부 조절에 적용할 수 있다. 옥수수 탑크로스 (등록상표)에서와 같이 다음 세대에서도 수컷 불임성이 필요한 경우, 상기의 방법을 변형하여 임성 회복을 제거하고 제2 조건부 수컷 불임성 시스템을 도입할 수 있다. 예를 들면 도 7을 참고로 하여, 2종의 수컷 임성 식물체를 제공한다. 제1 식물체는 제1 및 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 반면, 제2 식물체는 제2 및 제3 요소를포함한다. 제1 리컴비나제 요소는 제1 리컴비나제 코딩 서열 (R1)에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터 (P1)를 포함한다. 제2 리컴비나제 인자는 수컷 불임성 (MS)을 코딩하는 형질전이 유전자의 상류에 존재하는 종결 단편 (STP)의 상류에 제2 프로모터 (P2)를 포함하며, 여기서 종결 단편 (STP)는 제1 리컴비나제 (RS1)에 반응성인 위치 특이적 리컴비나제 서열에 접해있다. 제3 리컴비나제 인자는 수컷 불임성 (MS)을 코딩하는 형질전이 유전자의 상류에 존재하는 종결 단편 (STP)의 상류에 제2 프로모터 (P2)를 포함하고, 여기서 종결 단편 (STP)는 제2 (R1과 상이한) 리컴비나제 (RS2)에 반응성인 위치 특이적 리컴비나제 서열에 의해 접해있다. 또한, 제2 리컴비나제 코딩 서열 (R2)에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터 (P1)를 포함하는 제 4 리컴비나제 인자를 갖는 제3 수컷 임성 식물체를 제공한다.
제1 및 제2 식물체를 교배하여 제1 세대의 식물체를 생산한다. 제 1 프로모터가 구성적이거나 생식세포 특이적인 경우, P1이 활성화되어 R1이 발현된다. R1이 발현되어 제2 리컴비나제 인자로부터 종결 단편 (STP)을 절단한다. P2가 제1 세대에서 활성화되어 MS 형질전이 유전자가 발현되어 수컷 불임 식물체가 생성된다. 제3 식물체와 수컷 불임 식물체를 교배하여 F1 잡종 불임 식물을 생산한다. P1이 잡종체에서 활성화되고 R2가 발현되어 제3 리컴비나제 인자로부터 종결 단편 (STP)을 절단하여 P2가 활성화되어 제2 MS 유전자를 발현하기 때문에 식물체가 불임성이 된다. 이 수컷 불임 F1 잡종체를 탑크로스 (TopCross)(등록상표) 폴리네이터와 교배하여 탑크로스 (등록상표) 잡종체를 생성한다.
본 발명의 방법은 또한 종자에서 조건 수컷 불임성을 제공하는데 사용할 수있다. 예를 들면, 도 8에서 3가지 식물이 제공된다. 제1 식물은 제1 리컴비나제 요소를 포함하고, 제2 식물은 제2 리컴비나제 요소를 포함하며 제3 식물은 제3 요소를 포함한다. 제1 요소는 제1 리컴비나제 코딩 서열 (R1)에 작동 가능하도록 결합된 제1 프로모터 (P1)를 포함한다. 제2 요소는 유전자를 코딩하는 수컷 불임성 (MS)의 회전 상류에 있는 종결 단편 (STP)의 다른 프로모터 상류를 포함한다. 종결 단편 (STP)은 제1 리컴비나제 (RS1)에 반응하는 자리 특이성 리컴비나제 서열에 결합되고 전체 요소는 제2 리컴비나제 (RS2)에 반응하는 자리 특이성 리컴비나제 서열에 결합된다. 제3 요소는 제2 리컴비나제 코딩 서열 (R2)에 작동 가능하도록 결합된 제1 프로모터 (P1)를 포함한다.
P1이 유도 프로모터인 경우, 제1 및 제2 리컴비나제 요소가 교차 또는 공전환을 포함하는 임의의 수단을 통해 식물로 결합될 수 있음을 인정할 것이다. P1이 구성적 또는 발생적으로 조절된 통상의 생식세포 프로모터인 경우, 제1 및 제2 식물의 교차로 인해 R1이 발현되고 종결 단편이 제2 리컴비나제 요소로부터 절제된 제1 발생 식물이 생성된다. 또다른 프로모터가 활성화되면 수컷 불임성 트란스젠 (MS)이 발현되고 식물은 수컷 불임이 된다. 이 수컷 불임성 식물과 제3 식물의 교차로 인해 MS 유전자가 제거되고 연속되는 발생에서 수정능이 회복된다.
본 발명은 또한 교차의 2개의 모선 중 하나에서 이형 상태에 존재하는 형질 트란스젠이 모든 제2 발생 (F2) 곡물에서 발현을 확실하게 하는 수배우체 불임성의 조건 조절을 고려할 것이다. 예를 들면, 도 6에서 2개의 수컷 가임 식물이 제공된다. 제1 식물은 제2 및 제3 리컴비나제 요소를 포함한다. 제2 식물은 제1 및 제3리컴비나제 요소 및 수배우체 가임 회복 유전자에 물리적으로 결합된 트란스젠을 포함한다. 제1 리컴비나제 요소는 제1 리컴비나제 코딩 서열 (R1)에 작동 가능하도록 결합된 제1 프로모터 (P1)를 포함한다. 제2 리컴비나제 요소는 제2 리컴비나제 코딩 서열 (R2)의 회전 상류에 있는 종결 단편 (STP)의 제1 프로모터 (P1) 상류를 포함하며, 여기서 종결 단편 (STP)은 제1 리컴비나제 (RS1)에 반응하는 자리 특이성 리컴비나제 서열에 결합한다. 제3 리컴비나제 요소는 수배우체 불임 (gms) 코딩 서열을 코딩하는 트란스젠의 회전 상류에 있는 종결 단편 (STP)의 화분 특정 프로모터 상류를 포함하며, 여기서 종결 단편 (STP)은 제2 리컴비나제 (RS2)에 반응하는 자리 특이성 리컴비나제 서열에 결합한다. 수컷 불임성 유전자는 바나제(barnase)를 코딩할 수 있다. 네번째 요소는 형질 유전자 (TG) 및 수배우체 가임 (gmf) 복구 유전자에 결합한다. gmf 복구 유전자는 바스타(barstar)일 수 없고, 이 때 불임 유전자는 바나제이다.
제1 및 제2 식물이 교차될 때 제1 발생 식물이 생성된다. 제1 프로모터 (P1)가 구성적 또는 발생적으로 조절된 통상의 생식세포 프로모터인 경우; 제1 프로모터가 활성화되어 제1 리컴비나제 (R1)의 발현을 일으킨다. R1의 발현으로 인해 제2 리컴비나제 요소로부터 종결 단편 (STP)이 제거되고 제2 리컴비나제 (R2)가 발현된다. R2의 발현으로 인해 제3 리컴비나제 요소로부터 종결 단편 (STP)이 제거되고 화분 프로모터의 조절 하에서 수배우체 불임 (gms) 유전자의 발현을 위한 요소의 초회항원자극이 발생된다. 이 시스템은 화분에서 형질 유전자-gmf 유전자 없이 또는 화분에서 형질 유전자-gmf 유전자와 함께 수배우체 불임 유전자의 발현을 고려한다.
상기한 실시태양을 달성하기 위하여 본 발명에서는 수컷 생식세포, 통상의 꽃 생식세포 및 통상의 식물성 SAM 생식세포 SSR의 프로모터의 용도를 기재하고 있다. 또한 당업계의 숙련자가 목적하는 활성 특이성으로 프로모터를 스트린할 수 있는 절제 정보제공 구성을 제공한다.
생식세포에서 자리 특이성 재조합은 생식세포 특이성 유전자 프로모터로부터 프로모터를 사용하여 Cre의 조절 발현에 의해 달성될 수 있다. 이러한 SSRs는 수컷, 자성 또는 통상의 생식세포에 특이적일 수 있다. 생식세포 프로모터용 유전자의 예는 하기와 같다.
a) AP3 및 PI 동질 유전자, 및 LAT52와 같은 수컷 생식세포 또는 수배우체 프로모터를 위한 다른 유전자 (SAP, Bcp1, 등) (또한 Twell et al., (1998) Trends in Plant Sciences 3:305 참조)
b) 배주 원기 형성과 관련된 페투니아 FBP7 및 FBP11, 자성 생식세포를 위한 배주 돌출의 개시와 관련된 아라비도프시스 ANT 및 HLL 유전자; 및
(i) 통상의 생식세포를 위한 AG, LFY 및 ER과 같은 전격 첨단 분열조직 (SAM) 유전자, 기관 원기 특이 유전자 및 꽃 동질 유전자. 이 범주는 조직 배양에서 선택 후 조직 배양에서 초기에 선택 가능한 유전자를 제거하는데 특히 유용하다. 이러한 동질 유전자의 예로는 WUS 및 STM을 포함하는 전격 첨단 분열조직 (SAM) 유전자, 옥수수 KN1, 쌀 OSH1 및 UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO) 유전자가 있다.
생식세포 프로모터의 특이성이 프로모터가 유도된 내생성 유전자에서 예상했던 것과 동일할 수 있거나 또는 구성을 수행하는 유전자도입 라인에 따라 유도될 수 있다. 따라서, AP3는 라인에 따라 통상의 식물성 SAM 생식세포, 통상의 꽃 SAM 생식세포 및 꽃 수컷 생식세포 절제를 주는 것으로 나타난다. 유전자도입 발현에서 이러한 변이는 흔한 것이고 당업계의 숙련자는 목적하는 생식세포 특이성과 함께 라인을 스크린하고 확인할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 더 자세히 기재되어 있다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내지만 설명에 의해서만 제공된다. 당업자는 상기 논의 및 이들 실시예로부터 본 발명의 필수 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 범주 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 용도 및 조건에 맞게 본 발명을 다양하게 바꾸고 변형시킬 수 있다.
일반적인 방법
실시예에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 공지되어 있고 문헌 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis) and by T. J. Silhavy, M. L. Bennan, and Enquist, L. W. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1984) and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987))에 기재되어 있다.
제한 효소 절단, 인산화, 결찰 (ligation) 및 형질전환은 상기 문헌 (Sambrook et al.)에 기재되어 있는 바와 같이 수행하였다. 제한 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩 (Boston, MA), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) 또는 프로메가 (Madison, WI)로부터 구입하였다. 택 폴리머라제 (taq polymerase)는 퍼킨 엘머 (Branchburg, NJ)로부터 구입하였다. 증식 배지는 GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD)로부터 구입하였다.
아그로박테리움 튜메파시엔스균주 LBA4404 (Agrobacterium tumefaciensstrain LBA 4404)는 레이든 박사 (Dr. R. Schilperoot, Leiden, Hoekema et al., Nature 303:179-180, 1983)로부터 입수하였다.
형질전환 프로토콜
생물학적 형질전환은 본질적으로 미국 특허 제4,945,050호에 기재되어 있는 바와 같이 수행하였고, 상기 미국 특허의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다. 간단히 말해서, 하기 기술을 이용하여 금 입자 (직경 1 mm)를 DNA로 피막하였다. 10 ㎍의 플라스미드 DNA를 금 입자의 현탁액 (㎕ 당 60 ㎍) 50 ㎕에 첨가하였다. 염화칼슘 (50 ㎕의 2.5 M 용액) 및 스퍼미딘 유리 염기 (20 ㎕의 1.0 M 용액)를 상기 입자에 첨가하였다. 이들 용액을 첨가하면서 상기 현탁액을 교반하였다. 10분 후, 튜브를 (15,000 rpm에서 5초 동안) 단시간 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 상기 입자를 200 ㎕의 무수 에탄올에 재현탁시키고, 다시 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 에탄올 린스를 다시 수행하고, 상기 입자를 최종 부피가 30㎕가 되도록 에탄올에 재현탁시켰다. DNA로 피막한 금 입자의 분취액 (5 ml)을 플라잉 디스크 (Bio-Rad Labs, 861 Ridgeview Dr, Medina, OH)의 중심에 배치할 수 있었다. 그 다음으로, 1000 psi의 헬륨 압력을 사용하며 겝 거리가 0.5 cm이고 플라잉 거리가 1.0 cm인 PDS-1000/He (Bio-Rad Labs, 861 Ridgeview Dr, Medina, OH)으로 상기 입자를 옥수소 조직 내에 도입시켰다.
아그로박테리움 형질전환을 수행하는 경우, 상기 형질전환 과정은 본질적으로 문헌 (Park et al., J. Plant Biol., 1995, 38 (4), 365-71)에 기재된 것과 같이 수행하였다.
실시예 1
프로모터의 생식세포 특이성을 시험하기 위한, 이원성 벡터 (pBE894)의 절단 레포터 제작
수컷 생식세포 및 공통 생식세포 프로모터를 확인하기 위해 절단 레포터를 제작하였다. 이 레포터에서 lox 부위에 의해 플랭킨된 식물 가나마이신 내성 유전자는 구성 프로모터와 루시퍼라제 코딩 영역 사이에 블로킹 단편으로서 삽입시켰다. 상기 블로킹 단편은 루시퍼라제 코딩 서열을 단절시켜 루시퍼라제의 번역을 블로킹함으로써, 단일 카피의 lox 부위가 있는 Cre-lox 절단시 루시퍼라제 발현을 허용하는 루시퍼라제 ORF와의 번역 융합체으로서 남아 있게 된다. Cre 유전자는 조절가능한 생식세포 프로모터의 조절 하에 lox 부위의 외부 즉, lox 부위에 의해 플랭킹되지 않은 채로 유지된다.
pBE894라 불리는 이원성 플라스미드 내의 절단 레포터는 하기 중간체 플라스미드를 통해 제작하였다.
pGV853은 35S : Lox : 효모 2u : Lox : Luc (번역 융합체)이다. 루시퍼라제의 코딩 서열은 P298 및 P299 프라이머를 사용한 PCR을 통해 35S : 루시퍼라제 유전자 (Promega)로부터 단리하고, 효모에서 생체내 재조합 (PCT WO 99/22003에 기재된 바와 같음)으로 클로닝하여 앞서 EcoRI 및 SmaI으로 절단한 pGV796의 GUS 코딩 서열을 대체함으로써 35S : Lox : 효모 2u : Lox : Luc를 수반하는 플라스미드 pGV853을 얻었다. 루시퍼라제의 N 말단은 Lox 서열에 번역가능하게 융합시켰다.
pGV789는 GUS 유전자 내의 번역 중단 단편으로서의 플록스 (flox) Lox 66' : Avr II : Lox 71'이다. 이는 하기와 같이 제작되었다: 프라이머 쌍 P192, P194 및 P192, P198을 사용하여 35S 프로모터 : GUS 유전자를 수반하는 pML63로부터 PCR 생성물 A 및 B를 얻고, 상기 두 PCR 생성물 각각을 AvrII로 절단하고 결찰시킨 후, 프라이머 P192 및 P198을 사용한 제2 PCR을 위한 주형으로 사용하여 PCR 생성물 C를 얻고, 이어서 이 PCR 생성물 C를 BglII 및 BclI으로 절단하여 BglII - Bcl 절단 pML63 내에 클로닝하였다. 당업자는 사용된 PCR 프라이머의 서열로부터 번역 융합을 유추할 수 있다.
pGV796은 GUS 유전자 내의 번역 중단 단편으로서의 플록스 WT Lox P : AvrII : WT Lox P이다. 이는 PCR 프라이머 P227과 P228 (양 말단에 도입된 야생형 lox P 부위)를 사용한 PCR을 통해 2 μm의 효모 trp 단편 서열을 함유하는 플라스미드로부터 얻고, 효모 상동 재조합을 통해 AvrII 절단 pGV789 내에 클로닝시켰는데, 상기 pGV789는 GUS 유전자 내의 번역 중단 단편으로서의 돌연변이 Lox 부위 : 35S 프로모터 : Lox 66'-AvrII-Lox71' 사이에 단일 AvrII 부위를 포함하고 있다.
pGV890은 Lox 부위에 의해 플랭킹된 효모 2 μm 단편에 의해 블로킹된 35S : Luc이다. 이는 pGV853의 BamHI 부위를 EcoRI 부위로 전환하여 제작하였다. 이를 위해, pGV853을 BamHI으로 절단하여 채우고 EcoRI 링커 (New England Biolab. #1020)에 결찰시킨 후 EcoRI으로 절단하고 자가 재결찰시켰다.
pGV891은 Lox 부위에 의해 플랭킨된 효모 NPT II 유전자 (PCT WO 99/22003에 기재된 바와 같음)에 의해 블로킹된 35S : Luc이다. 이는 식물 형질전환을 위한, 가나마이신 내성 유전자 (nos : NPT II; 3' nos 유전자)를 함유하는 pGV801의 1781 bp AvrII 단편을 원하는 방향, 즉 Luc 코딩 서열과 동일한 방향으로 pGV890의 AvrII 부위 내에 삽입시켜 제작하였다.
pBE892는 플록스 (floxed) NPT Ⅱ 유전자 및 "외부(outside)" SCP:Cre를 포함하는 막대형 이원체 (bar binary)이다. SCP 프로모터는 문헌 [Bowen, Benjamin A.; Bruce, Wesley B.; Lu, Guihua; Sims, Lynne E.; Tagliani, Laura A. Synthetic constitutive promoters for high-level expression of foreign genes in plant. U.S. (2000), 31 pp.] (포기된 미국 출원 제661,601호의 부분 계속 출원)에 기재되어 있다. CODEN: USXXAM US 6072050 A 20000606. pGV891의 Eco RI/Xba I 단편을 막대형 이원체 pBE673의 Eco RI/Xba I으로 클로닝하여 제조하였다 (PCT WO 99/22003호에 기재되어 있음).
pGV895는 SCP:mCre이다. 세균 Cre 서열을 포함하는 pHP15254의 Bam HI/Eco RI 단편을 (WO 9925840에 기재되어 있는) 옥수수 코돈 최적화(optimized) Cre w/감자 ST-LS1 인트론을 포함하는 pHP16072의 Bam HI/Eco RI 단편으로 대체하였다.
pGV897는 SCP:mCre이다. 연결(ligating) Hind Ⅲ 링커 (NEB #1050)에 의해 pGV895의 Eco RI 부위에 Hind Ⅲ 부위를 도입하고, Hind Ⅲ으로 분해하고 재연결시켜 제조하였다.
pBE894는 플록스 NPT Ⅱ 유전자 및 "외부" SCP:Cre를 포함하는 막대형 이원체이다. Xba I/Hind Ⅲ으로 pBE892'를 분해하고, SCP:Cre 유전자를 포함하는 pGV897로부터 2159 bp Xba I/Hind Ⅲ 단편에 클로닝시켜 제조하였다.
벡터를 시험하기 위해Agrobacterium tumefaciens균주 C58을 형질전환시키고, 생성된 균주 CA894를 당분야에 공지된 바와 같이 100개의 담배잎 디스크를 형질전환시키는데 사용하였다. 하기 표 1은 90개의 디스크중 오직 3개만이 4주 후 칸(Kan)상에 생존한다는 것을 나타낸다. 이들 세개중 오직 하나만이 영상화(imaging)에 의한 발광효소(luciferase) 발현을 나타내었다. 또 한편으로는 132개의 디스크 중 114개 (86%)가 막대에 대한 저항성이 있었으며, 대부분은 발광효소 발현을 나타내었다. 그러므로, 절제(excision) 리포터가 양호하게 작용한다.
4주 후 담배잎 디스크에서의 저항성
아그로박테리움 (Agrobacterium) 막대 선택 칸(Kan) 선택
없음 0/6 저항 0/6 저항
CA894 114/132 저항 3/90 저항
실시예 2
아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)에서 수컷 및 공통 생식세포 발현에 대한 프로모터 확인
SCP1 프로모터를 포함하는 pBE894의 Xba I-Bam HI 단편을 여러 다른 발생-조절 프로모터중 하나를 포함하는 Xba I-Bam HI 단편으로 대체하였다. 이들 프로모터 영역, 아라비도프시스 (Arabidopsis)의 게놈 DNA로부터 이를 단리하는데 사용한 PCR 프라이머 및 생성된 이원체 플라스미드는 아래와 같다.
아라비도프시스 탈리아나 ( Arabidopsis thaliana )콜(Col.)로부터의Apetala3 (AP3)에 대한 프로모터 (pBE913).
아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 콜(Col.)로부터의Bcp1 (BCP 1)에 대한 프로모터 (pBE914).
아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 콜(Col.)로부터의Erecta(ER) 유전자에 대한 프로모터 (pBE915).
합성 꽃밥 프로모터 (Synthetic anther promoter, SAP) (pBE928) G9/SGB6 혼성 프로모터 (미국 특허 제5470359호; 제5837850호).
아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 콜(Col.)로부터의Pistilata(PI) 유전자에 대한 프로모터 (pBE929).
pTZALG에서 담배로부터의 TA 29 (Hsu, Francis C.; Odell, Joan Tellefsen; Shen, Jennie Bih Jien. Induction of male sterility in crop plants with heterologous genes expressed from tissue-specific promoters. PCT Int. Appl. (1992), 92 pp. CODEN: PIXXD2 WO 9204454 A1, 19920319 CAN 117:209112)에 대한프로모터 (pBE855).
프로모터 길이 뉴클레오티드 위치(진뱅크(Genbank) 접수번호) PCR 프라이머
UP LP
Apetala 3 (AP3)BCP 1 (BCP 1)Erecta (ER)TA 29Pistilata(PI) 605 bp579 bp1187 bp1525 bp299 bp 1151-1755 (U30729)48943-49528 (U30729)616-1802 (D83257)(플라스미드 pTZALG로부터)2997 3296 (AB035137) PH785PH783PH788PH795P321 PH786PH784PH790PH815P322
아라비도프시스(Arabidopsis) 게놈 DNA로부터의 프로모터의 PCR에 사용된 올리고.
AP3 PCR 프라이머
PH785:
5'-AGT CTA GAC CCG GGA TGG AAG TGA CGA TTA-3' (서열 8)
PH786:
5'-GAG GAT CCC GGG TCT TCT CTC TTT GTT T-3' (서열 9)
BCP1 PCR 프라이머
PH783:
5'-TAT CTA GAC CCG GGT CTC GAT CCG ATC GAA-3' (서열 10)
PH784:
5'-TTG GAT CCC GGG TTC TCT CTC TCC TTC TTA-3' (서열 11)
ER PCR 프라이머
PH788:
5'-GGT CTA GAC CCG GGA CTT TTT GAG AAA AG-3' (서열 12)
PH790:
5'-ATG GAT CCC GGG TTC TCA CAC ACA GTC TTA-3' (서열 13)
PI PCR 프라이머
P321:
5'-CGT CTA GAC CCG GGA TGT TGT CTT CAA GGC-3' (서열 16)
P322:
5'-ATG GAT CCC GGG TTC TCA CAC ACA GTC TTA-3' (서열 17)
PCR에서, 다른 지시가 없다면 아라비도프시스 탈라니아 바르. 콜럼비아 (Arabidopsis thalaniavar. Columbia)로부터 단리된 게놈 DNA (각 50 ㎕ 반응물에 대하여 50 내지 200 ng)를 PCR 반응 주형으로 사용하였다. 반응 혼합물은 원하는 프로모터를 증폭시키도록 고안된 5' 및 3' 프라이머 각 1 μM, 4개의 뉴클레오티드 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각 200 μM, Amplitaq (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 피이 어플라이드 바이로시스템스(PE Applied Biosystems)) 1.25 μM의 최종 농도를 함유하였다. PCR 반응을 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer) 9600 열순환기 (thermocycler) (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 피이 어플라이드 바이로시스템스)에서 수행하였다. 열순환기를 아래와 같이 프로그래밍하였다. 96℃에서 2분 동안의 초기 변성 단계 후 94℃에서 45초; 55℃에서 45초; 72℃에서 90초를 25회 순환시키고, 72℃에서 8분 동안의 최종 확장 주기로 끝냈다. 원하는 PCR 생성물을 제조자의 프로토콜에 따라 PCR 클로닝 벡터 pGEM-T (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corp.))로 클로닝하였다. 클로닝된 삽입물의존재를 확인한 후, 삽입물의 말단을 서열화하여 원하는 프로모터가 증폭되고 클로닝된 것을 확인하였다. 클로닝된 프로모터 단편을 Xba I-Bam HI 단편으로서 단리하고, 이원체 플라스미드 pBE894로 클로닝하였다.
TA29 프로모터를 Xba I-Nco I 단편으로 단리하고, 인트론이 없는 세균(옥수수에는 최적화되지 않음) Cre ORF의 전방에서 35S 프로모터를 대체하는데 사용하였다. 이어서, 키메라 유전자를 국제 공개 제 99/22003호에 기재된 바형 양방향 벡터(bar binary vector) pBE673으로 클로닝하였다.
양방향 플라스미드 pBE913, pBE914, pBE915, pBE928, pBE929 및 pBE855를 국제 공개 제 99/22003호에 기재된 바와 같이 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 C58로 클로닝하였다.
100 mg/L 카나미이신을 함유하는 LB 배지에서 형질전환체를 선택하였다. 이어서, 형질전환된 세균을 사용하여 문헌[Clough SJ, Bent AF (1998) Floral Dip: A Simplified Method for Agrobacterium-Mediated Transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16:735-743]의 플로랄 딥(floral dip) 방법으로 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 변이체 콜로니를 형질전환시켰다. 특히, 다수 화분의 건강한 아라비돕시스(Arabidopsis) 식물을 장시간의 명 조건하에서 성장시켰다. 4 내지 6주 후에 제1 볼트(bolt)를 절단하였다. 이로 인해 4 내지 6일내에 제2 볼트가 분아되었다. 양방향 벡터상에 해당 유전자를 갖는 C58 아그로박테리움 균주의 발아 배양액(항생제가 함유된 LB 약 200 mL)에서 20 ℃에서 2 일 동안 교반시키면서 성장시켰다. 발아 배지를 사용하여 밤새 배양된 2 L 배양액을 접종하였다. 배양액을 실온에서 5,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하였다. OD600이 0.8이 되도록 세포를 0.05% 실웨트(Silwet) L-77(Lehle Seeds)와 5% 수크로스에 재현탁시켰다. 상기 아라비돕시스 식물의 지표부를 아그로/수크로스 용액에 2 내지 3 초 동안 교반시키면서 침지시켰다. 화분을 양쪽에 두고, 플라스틱 뚜겅으로 덮고, 저조도 조건하에 수일 동안 둔 후, 직립시키고, 전면광 뒤로 두었다. 6 주 후에 식물을 건조시키고, 종자를 모았다. 0.01% Triton X-100을 함유하는 80% 에탄올을 사용하여 교반시키면서 10 분 동안 종자를 멸균시키고, 0.01% Triton X-100을 함유하는 33% 표백제로 10 분 동안 교반시키면서 멸균시킨 후 멸균수로 5 회 헹구었다. 이어서, 종자를 0.1% 멸균 아가 8 mL에 현탁시키고, 플레이트에 스프레딩하였다. 플레이트는 1 x MS, 1% 수크로스, 0.8% 아가, 100 mg/L 티메틴 (Smith Kline Beecham), 10 mg/L 베노밀 (DuPont) 및 선별 항생제를 포함한다. 카나마이신 술페이트(Kan)는 50 mg/L로, 글루포시네이트 암모늄(Bar)은 20 mg/L로 사용하였다. 내성 묘목을 플레이트로부터 제거하고, 비-파괴적으로 발현된 루시퍼라제를 상화하였다(표 2 내지 7). 루시퍼라제가 거의 발현되지 않았거나 악간 발현된 식물주(Luc+)를 화분에 담고 자가공급시켰다. 자손 T2 종자의 Kan 또는 Bar에 대한 내성을 분석하였다.
AP3, Bcp 1, PI, ER 및 SAP를 사용한 결과는 다음과 같다.
(i) 이들 모든 프로모터는 개화중인 배/종자에서 활성화되지 않았는데, 이는 Kan 및 Bar 플레이트(가능한 ER:Cre 형질전환체는 제외, 표 5)에서의 형질전환 효율에는 큰 차이가 없다는 것이며, 이는 종자내에 중대한 절단이 없음을 나타내는것이다.
(ii) 이들 모든 포로모터는 몇몇 식물주에서 비특이적 발현을 하였는데, 이는 Kan 또는 Bar에 내성인 모든 묘목에서 루시퍼라제가 없음, 매우 약함(Luc+), 중간(Luc++) 및 높음(Luc++++)을 비롯하여 다양한 정도로 발현되었기 때문일 것으로 여겨진다. AP3 및 PI 구성물은 Luc 발현 분포가 유사하였는데, 이는 발현 특이성에서의 프로필이 유사하기 때문이다. AP3 및 PI는 발현이 가장 불량한 식물주인 반면, Bcp 1 및 SAP 포로모터는 가장 양호하였다. 예를 들어, Kan 내성이 40%인 묘목은 높은 Luc 발현 정도를 보인다. 이들 프로모터를 갖는 식물주에서 AP3는 명백하게 성장 SAM 프로모터로 작용한다.
(iii) 상기 식물주에서 Cre 발현에 독성은 없었다.
(iv) ER은 가장 적은 수의 형질전환체(표 4)를 발생시켰고, 다시 플레이팅하였다(표 5). 2차 플레이팅한 결과 ER:Cre가 독성을 나타낼 수도 있음을 가리킨다. 실직적으로 이 독성이 Cre 또는 ER 프로모터로부터 발생한 것인지의 여부는 알려지지 않았다.
루시퍼라제 발현(Luc+)이 전혀 되지 않았거나 약간만 발현된 식물주를 화분에 심고, 자가공급하였다. 자손 T2 종자의 Kan 또는 Bar(표 8 및 9)에 대한 내성에 대해 분석하였다. 분석 결과 AP3:Cre가 성장 SAM 절단뿐만 아니라 꽃 공동의 생식선 및 수컷 생식선 절단에 양호한 프로모터인 것으로 나타났다. 즉, 17 개의 AP3주를 T2 단계에서 분석한 것중, 9 개는 공동(암수) 생식선으로부터 100% 절단되었으며, 4 개는 98% 절단되었으며, 1 개는 92% 절단되었으며, AB07는 수컷 생식선절단을 보여주었다. Bcp 1을 사용하면 몇몇 식물주는 Bar 또는 Kan 내성을 전혀 보이지 않으며, 이는 T1 선택 동안 사라졌다는 것을 가리킬 수 있다. Kan이 3:1로 분리되고, Bar가 15:1(두 지점)로 분리되었기 때문에 수컷 생식선 절단을 보여주는 식물주(BK21)가 있었다. 공동 또는 수컷 생식선 절단이 있는 식물주가 리포터 구성물용 지점을 1 개 지점 갖는 경우, 절단은 모든 지점에서 발생한다.
루시페라제 발현 및 칸(Kan) 또는 바(Bar)의 선별에 대한 형질전환된 아라비돕시스 묘목(AP3:Cre를 포함하는 CA913으로 형질전환된 식물의 T1 자손)의 분석
선별 Luc OFF Luc ON+ Luc ON++ Luc ON++++ 전체 TE(%)
칸(Kan) 3 5 6 10 24 0.26
바(Bar) 9 5 10 8 32 0.35
전체 12 10 16 18 56
% 21 18 29 32
루시페라제 발현 및 칸(Kan) 또는 바(Bar)의 선별에 대한 형질전환된 아라비돕시스 묘목(Bcp 1:Cre를 포함하는 CA914로 형질전환된 식물의 T1 자손)의 분석
선별 Luc OFF Luc ON+ Luc ON++ Luc ON++++ 전체 TE(%)
칸(Kan) 18 9 0 3 30 0.33
바(Bar) 2 0 0 0 2 0.09
전체 20 9 0 3 32
% 63 28 0 9
루시페라제 발현 및 칸(Kan) 또는 바(Bar)의 선별에 대한 형질전환된 아라비돕시스 묘목(ER:Cre를 포함하는 CA915로 형질전환된 식물의 T1 자손)의 분석
선별 Luc OFF Luc ON+ Luc ON++ Luc ON++++ 전체 TE(%)
칸(Kan) 4 2 0 2 8 0.07
바(Bar) 0 1 0 1 2 0.09
전체 4 3 0 3 10
% 40 30 0 30
루시페라제 발현 및 칸(Kan) 또는 바(Bar)의 선별에 대한 형질전환된 아라비돕시스 묘목(ER:Cre를 포함하는 CA915로 형질전환된 식물의 T1 자손)의 분석
선별 Luc OFF Luc ON+ Luc ON++ Luc ON++++ 전체 TE(%)
칸(Kan) 0 3 0 1 4 0.02
바(Bar) 2 1 1 6 10 0.24
전체 2 4 1 7 14
% 14 29 7 50
루시페라제 발현 및 칸(Kan) 또는 바(Bar)의 선별에 대한 형질전환된 아라비돕시스 묘목(SAP:Cre를 포함하는 CA928로 형질전환된 식물의 T1 자손)의 분석
선별 Luc OFF Luc ON+ Luc ON++ Luc ON++++ 전체 TE(%)
칸(Kan) 20 6 2 1 29 0.22
바(Bar) 5 5 0 0 10 0.39
전체 25 11 2 1 39
% 64 28 5 3
루시페라제 발현 및 칸(Kan) 또는 바(Bar)의 선별에 대한 형질전환된 아라비돕시스 묘목(PI:Cre를 포함하는 CA929로 형질전환된 식물의 T1 자손)의 분석
선별 Luc OFF Luc ON+ Luc ON++ Luc ON++++ 전체 TE(%)
칸(Kan) 22 23 34 17 96 1.00
바(Bar) ND ND ND ND ND 0.84
전체 22 23 34 17 96
% 23 24 35 18
바(Bar) 및 칸(Kan)의 내성에 대한 CA913(AP3:Cre)으로의 아라비돕시스 형질전환체로부터의 T2 자손 종자의 분석
T1 T2 카나미신 감수성 T2 바(Bar) 감수성
I.D. Luc R S R:S 비 X2P-수치 (적합 비) R S R:S 비 X2P-수치 (적합 비)
AB01 Off 0 130 0.00 156 0 NA
AB02 Off 0 137 0.00 137 0 NA
AB03 Off 0 130 0.00 168 0 NA
AB04 Off 0 142 0.00 175 0 NA
AB05 On+ 2 136 0.01 97 40 2.43 0.26(3:1의 경우)
AB06 On+ 0 104 0.00 116 29 4.00 0.16(3:1의 경우)
AB07 On+ 77 59 1.31 0.12(1:1의 경우) 102 39 2.62 0.47(3:1의 경우)
AB08 Off 0 137 0.00 96 44 2.18 0.08(3:1의 경우)
AB09 On+ 8 122 0.07 72 49 1.47
AB12 Off 0 133 0.00 133 0 NA
AB14 Off 0 131 0.00 139 0 NA
AK02 On+++ 2 152 0.01 115 49 2.35 0.15(3:1의 경우)
AK03 On+ 3 158 0.02 153 10 NA 0.95(15:1의 경우)
AK05 Off 163 0 NA 0 179 NA
AK06 On+++ 2 53 0.04 54 9 6.00
AK08 On+ 2 181 0.01 142 38 3.74 0.23(3:1의 경우)
AK10 On+ 0 150 0.00 114 31 3.68 0.31(3:1의 경우)
바(Bar) 및 칸(Kan)의 내성에 대한 CA914(Bcp 1:Cre)로의 아라비돕시스 형질전환체로부터의 T2 자손 종자의 분석
T1 T2 카나미신 감수성 T2 바(Bar) 감수성
I.D. Luc R S R:S 비 X2P-수치 (적합 비) R S R:S 비 X2P-수치 (적합 비)
BB03 On+ 105 39 2.69 0.56(3:1의 경우) 84 13 6.46
BB04 On+ 56 98 0.57 39 84 0.46
BK01 Off 0 157 0.00 1 163 0.01
BK02 Off 0 155 0.00 0 174 0.00
BK04 Off 94 57 1.65 107 46 2.33 0.15(3:1의 경우)
BK05 On+ 69 96 0.72 51 96 0.53
BK06 Off 0 159 0.00 0 158 0.00
BK07 Off 106 53 2.00 0 151 0.00
BK08 Off 8 148 0.05 8 152 0.05
BK09 On+ 66 84 0.79 0.14(1.1의 경우) 68 78 0.87 0.41(1:1의 경우)
BK11 On+ 77 37 2.08 0.07(3:1의 경우) 118 25 4.72
BK17 On+ 89 41 2.17 0.09(3:1의 경우) 77 16 4.81 0.48(3:1의 경우)
BK18 Off 83 53 1.57 90 46 1.96
BK19 Off 83 52 1.60 94 45 2.09
BK20 On+ 110 32 3.44 0.50(3:1의 경우) 91 14 6.50
BK21 Off 101 39 2.59 0.43(3:1의 경우) 124 14 8.86 0.06(15:1의 경우)
BK22 Off 51 82 0.62 73 72 1.01 0.93(1:1의 경우)
BK23 Off 0 132 0.00 0 137 0.00
BK24 Off 0 139 0.00 0 144 0.00
TA29:Cre (pBE855)로 형질전환된아라비돕시스 (Arabidopsis)를 바 (bar)상에서 선별하고 자가배양시켰다. T2 중 3:1 분리에 의한 단일 인서트를 나타내는 몇몇 균주들을 동정하고, 이들을 리포터 균주와 교배하여 생식세포주 제거 특이성을 시험하였다. 중요하게도 이들 결과는 TA29:Cre 발현에 관련하는 어떠한 독성도없다는 것을 나타내었다.
실시예 3
담배 중 일반적 생식세포주에서 마커 제거를 위한 프로모터 동정
SCP1 프로모터를 운반하는 pBE894의 Xba I-Bam HI 단편을 여러 상이한 발생적으로-조절된 프로모터들 중 하나를 운반하는 Xba I-Bam HI 단편으로 대체시켰다. 이들 프로모터 및 결과로서 생기는 이원성 플라스미드는:
아라비돕시스 탈리아나콜. (Arabidopsis thalianaCol.) (pBE917)로부터의 열충격 유전자의 프로모터 (HSP);
PCT 출원 제 WO 99/22003호에 기술된 세이프너 (safener) 유도성 프로모터, IN 2 (pBE927) 및아라비돕시스 탈리아나콜. (Arabidopsis thalianaCol.) (pBE913)로부터의아페탈라 (Apetala)1 (AP 1) 유전자의 프로모터이다.
프로모터 길이 뉴클레오티드 위치 (유전자은행 승인 번호) (플라스미드 pTZALG로부터) PCR 프라이머
UP LP
TA29 1525 bpPH815 PH795
HSP18.2 (HSP) 926 bpPH807 50050-50975 (AB006705) PH806
아페탈라 1 (AP 1) 1850 bp 27937 29807 (AC008262) P355 P356
아가모스 (AG) 2999 bp 48943-49528 (AL021711) P355 P354
리피 (LFY) 2287 bp 465-2752 (M91208)
올리고를 아라비돕시스 유전자 DNA로부터의 프로모터의 PCR에 이용하였다.
AP1 PCR 프라이머
P355:
5'-CGT CTA GAC CCG GGA TGT TGT CTT CAA GGC-3' (서열 20)
P356:
5'-ATG GAT CCC GGG TTC TCA CAC ACA GTC TTA-3' (서열 21)
TA29 PCR 프라이머
PH795:
5'-CCT CTA GAC CCG GGA-TTA TAT TAG GGA TTT-3' (서열 14)
PH815:
5'-GCG GAT CCC GGG TAG CTA ATT TCT TTA AC-3' (서열 15)
AG PCR 프라이머
P353:
5'-CTG CCT AGG TTT CTT CTT CTT CTC GTG CTC TG-3' (서열 22)
P354:
5'-GAC CCT AGG CAA TAA TTT TTT TAA AGG AAT TAA TAA GT-3' (서열 23)
상기 기술한 바와 같이 PCR을 수행하고, 목적하는 PCR 생성물을 제조업자의 프로토콜에 따라 PCR 클로닝 벡터 pGEM-T (미국 위스콘신주 매디슨 소재 프로메가 코포레이션사 (Promega Corp.))로 클로닝하였다. 클로닝된 인서트의 존재가 확립된 후, 목적하는 프로모터가 증폭되고 클로닝되는 것을 확인하기 위해 인서트의 말단을 시퀀싱하였다. 클로닝한 프로모터 단편을 Xba I-Bam HI 단편으로서 단리하고, 이원성 플라스미드 pBE894로 클로닝하였다.
이원성 플라스미드를아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacteriumtumefaciens)균주 C58로 형진전환시키고, 생성된 형질전환된 아크로박테리움을 아라비돕시스를 형질전환시키는데 사용되는 AP3:Cre, Bcp1:Cre, ER:Cre로 먼저 형질전환시킨 것과 함께 PCT 출원 제 WO 99/22003호에 기술된 바와 같은 잎-디스크 (leaf-disc) 방법으로 담배 (니코티아나 타바쿰바르. 잔티 (Nicotiana tabacumvar. Xanthi)를 형질전환시키는데 사용하였다.
pBE894 (pBE917) 중 HSP:Cre:형질전환된 잎 디스크를 카나마이신 (kanamycin) 300 상에서 선별하였다. 6주 후, 24 병소를 제거하고, 10 mg/ℓ바를 함유하는 배지에 배양했다. 병소는 배양 배지로 이동시키자마자, 그리고 2시간 내지 7일동안 40 ℃에서 공기 배양기에 병소를 함유하는 페트리 플레이트를 위치시키는 열 충격 처리 후 즉시 루시페라제 발현으로 확인하였다. 루시페라제 발현을 표 10에 나타내었다.
열처리 전후에 담배 병소에서 루시페라제 발현
열 충격 처리 전 루시페라제를 발현하는 병소 8/24 (33%)
열 충격 처리 후 루시페라제를 발현하는 병소 22/24 (91%)
열 충격시 루시페라제가 증가하는 병소 19/24 (79%)
AP3:Cre (pBE913)k:여러가지 병소를 카나마이신 상에서 선별하고, 이어서 배양하였다. 이들 중 몇몇은 제거용 리포터로서 luc 발현 시험을 하였다. 몇몇 배양된 식물은 어떠한 루시페라제도 발현하지 않았고, 몇몇은 매우 높은 루시페라제 발현 수준으로 발현되었다. 이들 식물 모두는 자가배양하고, 자손은 통상의 또는 수컷 생식세포주 제거를 확인하는데 사용하였다.
Bcp 1:Cre 및 ER:Cre:여러가지 담배 병소는 칸 (Kan) 상에서 선별하였다. Bcp 1 병소를 배양하는 동안, ER이 있는 것들은 배양하지 않았다. 후자는 ER:Cre 발현이 배양 전개에 손해가 될 수 있음을 암시할 수 있다. 모든 배양된 식물은 자가배양하고, 제거하여 분석하였다.
<서열 목록>

Claims (73)

  1. a) 일반 구조 P1-R의 제1 리컴비나제 요소; 및
    b) K-TG 및 RS-K-TG-RS로 이루어진 일반 구조의 군으로부터 선택된 제2 리컴비나제 요소
    [여기서,
    (i) P1은 제1 프로모터;
    (ii) R은 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (iii) TG는 형질전이 유전자;
    (iv) RS는 리컴비나제에 응답하는 리컴비나제 부위이고;
    (v) K는 1) P2-RS-STP-RS 및 2) P2(여기서, P2는 제2 프로모터이고, RS는 리컴비나제에 응답하는 리컴비나제 부위이고 STP는 종결 단편임)로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    P1 및 P2는 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있는데, 여기서 P1은 식물 생활환에서 P2 보다 먼저 활성화되고, 리컴비나제 발현에 의해 리컴비나제에 응답하는 리컴비나제 부위 사이에 포함되어 있는 임의 요소가 제거됨)]
    를 포함하는 특질 제거 작제물.
  2. a) 구조 P1-R1 및 P1-R2로 이루어진 일반 구조의 군으로부터 선택된 제1 리컴비나제 요소; 및
    b) RS2-K-TG-RS2 일반 구조를 갖는 제2 리컴비나제 요소
    [여기서,
    (i) P1은 제1 프로모터;
    (ii) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (iii) R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (iv) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위이고;
    (v) TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역이고;
    (vi) K는 1) P2-RS1-STP-RS1 및 2) P2-RS1-TG(여기서, P2는 제2 프로모터이고, RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위이고 STP는 종결 단편이고 TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역임)로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    P1 및 P2는 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있는데, 여기서 P1은 식물 생활환에서 P2보다 먼저 활성화되고, 제1 리컴비나제 발현에 의해 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위들 사이에 포함되어 있는 임의 요소가 제거되며 제2 리컴비나제 발현에 의해 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위 사이에 포함되어 있는 임의 요소가 제거됨)]
    를 포함하는 특질 제거 작제물.
  3. a) P1-R1 및 RS2-P1-R1-RS2로 이루어진 일반 구조의 군으로부터 선택된 제1 리컴비나제 요소;
    b) Z-Y 및 RS2-Z-Y-RS2 일반 구조의 군으로부터 선택된 제2 리컴비나제 요소; 및
    c) 일반 구조 Q-X 및 RS2-Q-X-RS2의 군으로부터 선택된 제3 리컴비나제 요소를 포함하며,
    여기서, (i) P1은 제1 프로모터;
    (ii) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (iii) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위;
    (iv) Z는 P2-RS1-STP-RS1(여기서, P2는 제2 프로모터이고, RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위이고, STP는 종결 단편임);
    (v) Y는 R2 및 TG로 이루어진 군으로부터 선택되고(여기서, R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역이고, TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역임);
    (vi) Q는 일반 식 P3-RS-STP-RS(여기서, P3은 제3 프로모터이고, RS는 RS1 및 RS2로 이루어진 군으로부터 선택된 리컴비나제 부위이며, STP는 종결 단편임);
    (vii) X는 TG 및 R(여기서, TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역이고, R은 R1 및 R2로 이루어진 군으로부터 선택된 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역임)로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    여기서 P1, P2 및 P3은 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있는데, 여기서 P1은 식물 생활환에서 P2보다 먼저 활성화되고 P2는 식물 생활환에서 P3보다 먼저 활성화되며, 제1 리컴비나제 발현에 의해 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위들 사이에 포함되어 있는 임의 요소가 제거되며 제2 리컴비나제 발현에 의해 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위 사이에 포함되어 있는임의 요소가 제거됨)]
    를 포함하는 특질 제거 작제물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프로모터가 생식세포 프로모터인 특질 제거 작제물.
  5. 제4항에 있어서, 생식세포 프로모터가
    a) 구성적 식물 프로모터;
    b) 식물 조직-특이적 프로모터;
    c) 식물 성장 단계-특이적 프로모터;
    d) 유도성 식물 프로모터;
    e) 바이러스성 프로모터;
    f) 수컷 생식세포 프로모터;
    g) 암컷 생식세포 프로모터;
    h) 공통 생식세포 프로모터;
    i) 꽃의 공통 생식세포 프로모터;
    j) 식물의 어린싹 끝 분열조직 프로모터; 및
    k) 꽃의 어린싹 끝 분열조직 프로모터
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 특질 제거 작제물.
  6. 제5항에 있어서, 수컷 생식세포 프로모터가 꽃밥 원기 및 꽃밥 포자체 및 화분 배우체에 대해 특이적인 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래된 것인 특질 제거 작제물.
  7. 제5항에 있어서, 공통 생식세포 프로모터가 아페탈라3(Apetala, AP3), 피스틸라타(Pistillata, PI), 합성 꽃밥 프로모터, TA29 및 BCP1, 및 이들의 오르토로그로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래된 것인 특질 제거 작제물.
  8. 제5항에 있어서, 공통 생식세포 프로모터가 식물 및 꽃의 어린싹 끝 분열조직 으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래된 것인 특질 제거 작제물.
  9. 제8항에 있어서, 공통 생식세포 프로모터가 리피(Leafy, LFY), 아페탈라3(AP3), 피스틸라타(PI), 아페탈라1(AP1), 아가모스(Agamous, AG) 및 피스틸라타, 및 이들의 오르토로그로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래된 것인 특질 제거 작제물.
  10. 제5항에 있어서, 꽃의 공통 생식세포 프로모터가 아가모스(AG), 아페탈라1(AP1), 아페탈라3(AP3), 리피(LFY) 및 이들의 오르토로그로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래된 것인 특질 제거 작제물.
  11. 제5항에 있어서, 식물의 어린싹 끝 분열조직 프로모터가 아가모스(AG), 아페탈라1(AP1), 아페탈라3(AP3), 리피(LFY), 아인테구멘타(Aintegumenta, ANT), 클라바타3(Clavata3, CLV3), 부셀(Wushel, WUS) 및 메리스템리스(Meristemless), 및 이들의 오르토로그로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 특질 제거 작제물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프로모터가
    a) 구성적 식물 프로모터;
    b) 식물 조직-특이적 프로모터;
    c) 식물 성장 단계-특이적 프로모터;
    d) 유도성 식물 프로모터; 및
    e) 바이러스성 프로모터
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 특질 제거 작제물.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전이 유전자가
    a) 형질전환 마커를 코딩하는 유전자;
    b) 형태 특질을 코딩하는 유전자;
    c) 불임성을 도입하는 유전자;
    d) 식물 또는 식물 세포에 특이적 형질을 도입하는 유전자; 및
    e) 호르몬 생합성 유전자
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 특질 제거 작제물.
  14. 제13항에 있어서, 형질전환 마커를 코딩하는 유전자가
    a) 항생제 내성 유전자;
    b) 제초제 내성 유전자;
    c) 녹색 형광 단백질 유전자;
    d) 루시퍼라제 유전자;
    e) 종양발생 유전자;
    f) 어린싹 유도 유전자;
    g) 뿌리 유도 유전자; 및
    h) 선택성 유전자
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 특질 제거 작제물.
  15. 제13항에 있어서, 형태적 특질을 코딩하는 유전자가
    a) rolC;
    b) IPT;
    c) Ti 플라스미드 유전자;
    d) Ri 플라스미드 유전자;
    e) STM;
    f) KNAT;
    g) AINTEGUMATA;
    h) Lec1;
    i) 브라시카(Brassica) "베이비붐(Babyboom)";
    j) OSHI; 및
    k) Kn1;
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 특질 제거 작제물.
  16. 제13항에 있어서, 호르몬 생합성 유전자를 코딩하는 유전자가 시토키닌 생합성 유전자인 특질 제거 작제물.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역 R1 및 R2가 Cre 및 F1p로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 것인 특질 제거 작제물.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 리컴비나제 부위가 Lox 및 Frt로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 것인 특질 제거 작제물.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 리컴비나제 요소가 유전적으로 연결될 수도 있고 연결되지 않을 수도 있는 특질 제거 작제물.
  20. 제19항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 리컴비나제 요소가 유전적으로 연결되지않을 수도 있고 다른 식물에 존재할 수도 있는 특질 제거 작제물.
  21. 리컴비나제의 발현에 의해 리컴비나제에 응답하는 리컴비나제 부위 사이에 포함되어 있는 임의 요소가 제거되는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 특질 제거 작제물을 식물 세포에 도입하는 것을 포함하는 유전적 특질을 코딩하는 형질전이 유전자를 식물 세포로부터 제거하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, P1 및 P2가
    a) 구성적 식물 프로모터;
    b) 식물 조직-특이적 프로모터;
    c) 식물 성장 단계-특이적 프로모터;
    d) 유도성 식물 프로모터; 및
    e) 바이러스성 프로모터
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, P1이
    a) 수컷 생식세포-특이적 프로모터;
    b) 암컷 생식세포-특이적 프로모터;
    c) 공통 생식세포-특이적 프로모터;
    d) 꽃-특이적 프로모터;
    e) 식물 어린싹 끝 분열조직-특이적 프로모터; 및
    f) 꽃의 어린싹 끝 분열조직 프로모터
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, P1이 수컷 생식세포-특이적 프로모터이고, 형질전이 유전자는 형질전이 유전자 없이 화분을 만드는 수컷 생식세포에서만 제거되는 방법.
  25. 제23항에 있어서, P1이 암컷 생식세포-특이적 프로모터이고, 형질전이 유전자는 형질전이 유전자 없이 난세포를 만드는 암컷 생식세포에서만 제거되는 방법.
  26. 제23항에 있어서, P1이 공통 생식세포 프로모터이고, 형질전이 유전자는 형질전이 유전자 없이 자손 종자를 만드는 수컷 및 암컷 생식세포에서만 제거되는 방법.
  27. 제23항에 있어서, P1이 꽃의 SAM 또는 꽃의 프로모터인 방법.
  28. 제23항에 있어서, P1은 식물 SAM 프로모터이며, 형질전이 유전자는 생식세포 및 체세포로부터 제거되거나 또는 식물 SAM으로부터 유래된 조직에서 제거되는 방법.
  29. 제22항에 있어서, P1은 열 충격에 응답하는 유도성 프로모터인 방법.
  30. 제22항에 있어서, P1은 화학적 완화제에 응답하는 유도성 프로모터인 방법.
  31. 제21항에 있어서, 제1, 제2 리컴비나제 및 제3 요소가 유전적으로 연결되지 않을 수도 있고 다른 식물에 존재할 수도 있는 방법.
  32. 리컴비나제의 발현에 의해 리컴비나제에 응답하는 리컴비나제 부위 사이에 포함되어 있는 임의 요소가 제거되는 제3항의 특질 제거 작제물을 식물 세포에 도입하는 것을 포함하는 유전적 특질을 코딩하는 형질전이 유전자를 식물 세포로부터 제거하는 방법.
  33. 제21항에 있어서, TG가
    a) 형질전환 마커를 코딩하는 유전자;
    b) 형태적 특질을 코딩하는 유전자;
    c) 불임성을 도입하는 유전자;
    d) 식물 또는 식물 세포에 특이적 형질을 도입하는 유전자; 및
    e) 호르몬 생합성 유전자
    로 이루어진 군으로부터 선택된 형질전이 유전자인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 형질전이 유전자가
    a) 항생제 내성 유전자;
    b) 제초제 내성 유전자;
    c) 녹색 형광 단백질 유전자;
    d) 루시퍼라제 유전자;
    e) 종양발생 유전자;
    f) 뿌리 유도 유전자; 및
    g) 선택성 유전자
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 형질전이 유전자가
    a) IPT;
    b) Ti 플라스미드 유전자; 및
    c) Ri 플라스미드 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  36. 1) a) P1-R1 일반 구조를 갖는 제1 리컴비나제 요소; b) 일반 구조 P2-RS1-STP-RS1-R2를 갖는 제2 리컴비나제 요소; 및 c) 일반 구조 P3-RS2-STP-RS2-TG를 갖는 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 작제물을 제공하는 단계
    [여기서,
    (i) P1은 제1 프로모터;
    (ii) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (iii) RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위;
    (iv) P2는 제2 프로모터;
    (v) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위;
    (vi) STP는 종결 단편;
    (vii) R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (viii) TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역이고;
    (ix) P3은 제3 프로모터이며;
    P1, P2 및 P3은 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있음];
    2) 제1, 제2 및 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 유전자도입 식물을 제공하는 단계;
    3) P1을 활성화하여 R1 리컴비나제 코딩 서열이 제1 세대 식물의 공통 생식세포에서 발현되도록 하는 단계(여기서, R1의 발현에 의해 제2 리컴비나제 요소로부터 종결 단편이 제거됨)
    4) P2를 활성화하여 R2를 제1 세대 식물의 공통 생식세포 또는 제2 세대 식물에서 발현시키는 단계(여기서, R2의 발현에 의해 제2 세대 및 이후의 모든 세대의 식물에서 형질전이 유전자를 발현시키는 제3 리컴비나제 요소로부터 종결 단편이 제거됨)
    를 포함하는, 제2 세대 식물에서 형질전이 유전자를 조건적으로 활성화하는 방법.
  37. 1) a) 구조 P1-R1을 갖는 제1 리컴비나제 요소; b) 구조 P2-RS1-STP-RS1-R2를 갖는 제2 리컴비나제 요소; 및 c) 구조 P3-RS2-STP-RS2-TG를 갖는 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 작제물을 제공하는 단계
    [여기서,
    (i) P1은 제1 프로모터;
    (ii) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (iii) RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위;
    (iv) P2는 제2 프로모터;
    (v) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위;
    (vi) STP는 종결 단편;
    (vii) R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (viii) TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역이고;
    (ix) P3은 제3 프로모터이며;
    P1, P2 및 P3은 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있음];
    2) 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 유전자도입 식물을 제공하는 단계;
    3) 상기 (2)의 유전자도입 식물을, 제2 리컴비나제 요소로 형질전환시켜 제1 식물을 생성하거나 또는 제3 리컴비나제 요소로 형질전환시켜 제2 식물을 생성하는 단계;
    4) 제1 세대의 공통 생식세포에서 P1 조절하의 R1 발현에 의해 제2 리컴비나제 요소로부터 종결 단편이 제거되 P2 조절하에 R2를 발현시키고, 이어서 제3 리컴비나제 요소로부터 종결 단편이 제거되어 제2 세대 및 이후의 세대에서 특질 유전자가 P3의 조절하에 발현되도록 제1 식물과 제2 식물을 교배하는 단계
    를 포함하는, 제2 세대 식물에서 형질전이 유전자를 조건적으로 활성화하는 방법.
  38. 1) a) 일반 구조 P1-R1을 갖는 제1 리컴비나제 요소; b) 일반 구조 P2-RS1-STP-RS1-R2를 갖는 제2 리컴비나제 요소; 및 c) 일반 구조 P3-RS2-STP-RS2-TG를 갖는 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 작제물을 제공하는 단계
    [여기서,
    (i) P1은 제1 프로모터;
    (ii) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (iii) RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위;
    (iv) P2는 제2 프로모터;
    (v) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위;
    (vi) STP는 종결 단편;
    (vii) R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (viii) TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역이고;
    (ix) P3은 제3 프로모터이며;
    P1, P2 및 P3은 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있고, P1은 식물 생활환의 제1 세대에서 유도될 수 있는 생식세포 프로모터임];
    2) 제1, 제2 및 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 유전자도입 식물을 제공하는 단계;
    3) 제1 세대의 공통 생식세포에서 P1 조절하의 R1 발현에 의해 제2 리컴비나제 요소로부터 종결 단편이 제거되어, P2 조절하에 R2를 발현시키고 이어서 제3 리컴비나제 요소로부터 종결 단편이 제거되어 제2 세대 및 이후의 세대에서 특질 유전자가 P3 프로모터의 조절하에 발현되도록 제1 프로모터를 유도하는 단계
    를 포함하는, 제2 세대 식물에서 형질전이 유전자를 조건적으로 활성화하는 방법.
  39. (1) (a) 일반 구조가 P1-R1인 제1 리컴비나제 요소,
    (b) 일반 구조가 P2-RS1-STP-RS1-R2인 제2 리컴비나제 요소,
    (c) 일반 구조가 P3-RS2-STP-RS2-TG1 및 P4-RS2-STP-RS2-TG2로 구성된 군에서 선택된 것인 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 작제물을 제공하는 단계,
    (여기서, (i) P1은 제1 프로모터이고,
    (ⅱ) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역이고,
    (ⅲ) RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위이며,
    (ⅳ) P2는 제2 프로모터이고,
    (v) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위이며,
    (ⅵ) STP는 종결 단편이고,
    (ⅶ) R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역이고,
    (ⅷ) TG1은 제1 형질전이 유전자 및 3' 영역이고,
    (ⅸ) TG2는 제2 형질전이 유전자 및 3' 영역이고,
    (x) P3는 제3 프로모터이고,
    (xi) P4는 제4 프로모터이며,
    P1, P2, P3 및 P4는 이들의 하류 요소들에 작동가능하게 연결되어 있고, TG1 및 TG2는 상이한 특질의 형질전이 유전자이며, P3 및 P4는 제2 세대 식물에서 활성화됨)
    (2) 제1 및 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 제1 식물을 제공하는 단계,
    (3) 제2 및 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 제2 식물을 제공하는 단계,
    (4) 제1 식물과 제2 식물을 교배하여, 이 제1 세대의 공통 생식세포에서 P1 프로모터의 조절하에 제1 리컴비나제 코딩 서열 (R1)의 조건적 발현에 의해 제2 리컴비나제 요소로부터 종결 단편이 제거되어 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역 (R2)가 P2 프로모터의 조절하에 발현되고, 그 다음 이 리컴비나제에 의해 두 개의 제3 리컴비나제 요소로부터 종결 단편이 제거되어 제2 세대에서 특질 TG1 및 TG2를 각각 P3 및 P4 프로모터의 조절하에 발현되도록 하는 제1 세대 식물을 제조하는 단계를 포함하는,
    제2 세대 식물에서 형질전이 유전자를 조건적으로 활성화하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, TG1가 특질 유전자이며, TG2가 식물 성장을 차단하는 치사 유전자이며, 제3 프로모터 (P3)가 제2 세대에서 제4 프로모터 (P4)보다 식물 생활환에 있어서 먼저 발현되는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, TG1이 특질 유전자이며, TG2는 화분 형성 및 결실을 방해하는 불임성 유전자이고, 제3 프로모터 (P3)가 다음 세대에서 P4보다 먼저 발현되는 것인 방법.
  42. 제36항에 있어서, 제1 프로모터가 구성적 공통 생식세포 프로모터이고, 제2 프로모터가 꽃의 공통 생식세포 프로모터이며, 제3 프로모터가 종자 특이적이며, 공통 생식세포에서 제1 프로모터의 조절을 받는 제1 리컴비나제 코딩 서열의 조건적 발현이 꽃의 공통 생식세포에서 제2 프로모터의 조절을 받는 제2 리컴비나제 코딩 서열의 발현을 유발하고, 제2 리컴비나제의 발현이 자손 종자에서의 형질 발현을 유발하는 것인 방법.
  43. 제37항에 있어서, 제1 프로모터가 유도성이며, 유도제에 응답성이 있는 것인 방법.
  44. (1) (a) 일반 구조가 P1-R1인 제1 리컴비나제 요소,
    (b) 일반 구조가 S2-P2-RS1-STP-TG-RS2인 제2 리컴비나제 요소,
    (c) 일반 구조가 P3-RS1-STP-RS1-R2인 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 작제물을 제공하는 단계,
    (여기서, (i) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역이고,
    (ⅱ) RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위이며,
    (ⅲ) R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역이고,
    (ⅳ) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위이며,
    (v) STP는 종결 단편이고,
    (ⅵ) TG는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역이고,
    (ⅶ) P1은 제1 세대 생식세포에서 활성화될 제1 프로모터이고,
    (ⅷ) P2는 체세포 및(또는) 생식세포에서 활성화되며 P3와 동시에 또는 그 전에 활성화될 수 있는 제2 프로모터이고,
    (ⅸ) P3는 생식세포에서 활성화되는 제3 프로모터이고,
    P1, P2 및 P3는 이들의 하류 요소들에 작동가능하게 연결됨)
    (2) 3개의 리컴비나제 요소 전부를 포함하는 제1 세대 유전자도입 식물을 제공하는 단계,
    (3) 제1 리컴비나제 코딩 서열이 발현되는 상기 (2)의 제1 세대 식물에서 제1 프로모터 (P1)을 활성화하여 제2 및 제3 리컴비나제 요소 둘 다를 프라이밍하는 단계,
    (4) 제2 프로모터를 활성화하여 형질전이 유전자를 발현시키는 단계,
    (5) 제3 프로모터를 활성화하여 제2 리컴비나제 코딩 서열을 발현시켜 제2 리컴비나제 요소를 제거하는 것을 포함하는,
    형질 전이 유전자의 조건적 및 일시적 발현 방법.
  45. (1) (a) 일반 구조가 P1-R1인 제1 리컴비나제 요소,
    (b) 일반 구조가 RS2-P2-RS1-STP-RS1-TG-RS2인 제2 리컴비나제 요소,
    (c) 일반 구조가 P3-RS1-STP-RS1-R2인 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 작제물을 제공하는 단계,
    (여기서, (i) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역이고,
    (ⅱ) RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위이며,
    (ⅲ) R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역이고,
    (ⅳ) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위이며,
    (v) STP는 종결 단편이고,
    (ⅵ) TG는 형질전이 유전자 및 3' 영역이고,
    (ⅶ) P1은 제1 세대 생식세포에서 활성화될 제1 프로모터이고,
    (ⅷ) P2는 체세포 및(또는) 생식세포에서 활성화되며 P3와 동시에 또는 그 전에 활성화될 수 있는 제2 프로모터이고,
    (ⅸ) P3는 생식세포에서 활성화되는 제3 프로모터이고,
    P1, P2 및 P3는 이들의 하류 요소들에 작동가능하게 연결됨)
    (2) 제1 리컴비나제 요소를 포함하는 제1 식물을 제공하고,
    (3) 제2 및 제3 리컴비나제 요소를 포함하며 이들 요소에 대해 동형접합형인 제2 식물을 제공하고,
    (4) 제1 식물과 제2 식물을 교배하여, 제1 프로모터 (P1)이 활성화되어 제1 리컴비나제 코딩 서열 (R1)을 발현하고, 이에 의해 제2 및 제3 리컴비나제 요소로부터 종결 단편이 제거되고, 이어서 형질 (TG) 유전자 및 제2 (R2) 리컴비나제 코딩 서열이 활성화되고, 이어서 염색체로부터 제2 리컴비나제 요소가 제거되어 형질전이 유전자가 일시적으로 발현되는 제1 세대 식물을 제조하는 것을 포함하는, 형질 전이 유전자의 조건적 및 일시적 발현 방법.
  46. 제44항에 있어서, P1이 식물 생활환의 제1 세대에서 유도되는 제1 생식세포 프로모터이고, 3개의 리컴비나제 요소 모두가 동시형질전환, 순차적 형질전환, 또는 식물에게서 단일 형질전환 후 유전적 교배에 의해 식물로 도입되는 것인 방법.
  47. 제44 내지 46항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프로모터 (P1)이 구성적 프로모터, 종자 프로모터, 영양성 또는 꽃의 어린싹 끝 분열조직 프로모터, 및 꽃 공통 생식세포 프로모터로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, P3 프로모터가 수컷 생식세포 특이적 프로모터여서 TG가 제1 세대의 화분으로부터만 제거되는 것인 방법.
  49. 제47항에 있어서, P3 프로모터가 꽃의 공통 생식세포에서 발현되어 제1 세대의 화분 및 자손 종자 모두로부터 TG가 제거되는 것인 방법.
  50. 제44항에 있어서,
    a) P1이, 제1 세대의 공통 생식세포에는 제1 리컴비나제 코딩 서열(R1)을 발현하며 종자 또는 발아중인 종자에서는 발현되지 않는 꽃의 공통 생식세포 프로모터이고,
    b) P2가 제2 세대의 종자에서 형질전이 유전자(TG)를 발현하며,
    c) P3이 제2 세대의 발아중인 종자의 공통 생식세포에서 제2 리컴비나제 코딩 서열(R2)을 발현하여 제2 세대의 화분 및 종자 모두로부터 형질전이 유전자 (TG)가 제거되는 것인 방법.
  51. 1) a) 구조 P1-R1을 갖는 제1 리컴비나제 요소; b) 구조 RS2-P2-RS1-STP-RS1-TG-RS2를 갖는 제2 리컴비나제 요소; 및 c) 구조 P3-RS1-STP-RS1-R2를 갖는 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 작제물을 제공하는 단계
    [여기서,
    (i) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (ii) RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위;
    (iii) R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (iv) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위;
    (v) STP는 종결 단편;
    (vi) TG는 수컷 불임성을 코딩하는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역;
    (vii) P1 프로모터는 식물 SAM, 꽃의 SAM, 또는 제1 세대 꽃에서 활성화되며, 종자에서는 발현되지 않는 공통 생식세포 프로모터;
    (viii) P2는 꽃밥 포자체 또는 꽃밥 원기 프로모터이고;
    (ix) P3는 제2 세대의 생식세포에서 활성화되는 제3 종자 특이적 프로모터임
    (여기서, P1, P2 및 P3는 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있음)];
    2) 제1 리컴비나제 요소를 포함하는 제1 유전자도입 식물을 제공하는 단계;
    3) 동질접합체 단계에서 제2 및 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 제2 유전자도입 식물을 제공하는 단계;
    4) 제1 및 제2 식물을 교배하여, 제1 프로모터의 조절을 받는 제1 리컴비나제의 발현이 제2 및 제3 리컴비나제 요소 모두로부터 종결 단편을 제거하여 수컷 불임성 형질전이 유전자가 발현되는 제1 세대 식물을 생성하는 단계; 및
    5) 단계 4)의 제1 세대 식물을 수컷 번식체와 교배하여, 종자 특이적 제3 프로모터의 활성화에 의해 제2 리컴비나제를 발현함으로써 수컷 불임성 형질전이 유전자가 제거되고 수컷 번식력이 복구된 제2 세대 식물을 생성하는 단계
    를 포함하는, 제1 세대 식물에서 수컷 불임성을 조건적으로 발현하는 방법.
  52. 1) a) 구조 P1-R1을 갖는 제1 리컴비나제 요소; b) 구조 P2-RS1-STP-RS1-MS를 갖는 제2 리컴비나제 요소; c) 구조 P2-RS2-STP-RS2-MS를 갖는 제3 리컴비나제 요소; 및 d) 구조 P1-R2를 갖는 제4 리컴비나제 요소를 포함하는 작제물을 제공하는 단계
    [여기서,
    (i) R1은 제1 리컴비나제;
    (ii) RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위;
    (iii) R2는 제2 리컴비나제;
    (iv) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위;
    (v) STP는 종결 단편;
    (vi) TG는 3' 영역과 함께 수컷 불임성을 코딩하는 형질전이 유전자;
    (vii) P1은, 식물 생활환에서 P2보다 먼저 또는 P2와 동일한 시간에 활성화되며, 구성적 프로모터, 종자 특이적 프로모터 및 식물 어린싹 끝 분열조직 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 생식세포 프로모터이고;
    (viii) P2는 형질전이 유전자를 발현하는 프로모터이며;
    P1 및 P2는 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있음];
    2) 제1 및 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 제1 식물을 제공하는 단계;
    3) 제2 및 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 제2 식물을 제공하는 단계;
    4) 제4 리컴비나제 요소를 포함하는 제3 식물을 제공하는 단계;
    5) 제1 및 제2 식물을 교배하여, 제1 리컴비나제 요소의 P1 프로모터의 조절을 받는 제1 리컴비나제의 발현이 제2 리컴비나제 요소로부터 종결 단편을 제거하여 수컷 불임성을 코딩하는 형질전이 유전자가 발현되는 제1 자손을 수득하는 단계; 및
    6) 단계 5)의 자손을 제3 식물과 교배하여, 제4 리컴비나제 요소의 P1 프로모터의 조절을 받는 제2 리컴비나제의 발현이 제3 리컴비나제 요소로부터 종결 단편을 제거하는 제2 자손을 수득함으로써 수컷 불임성 유전자가 발현되는 단계
    를 포함하는, 제1 세대 및 제2 세대에서 조건부 수컷 불임성을 발현하는 방법.
  53. 제49항에 있어서, P2 프로모터가 융단층(絨緞層) 특이적 프로모터 및 수컷 생식세포 특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 꽃밥- 또는 꽃밥 원기-특이적 프로모터인 방법.
  54. 1) a) 구조 P1-R1을 갖는 제1 리컴비나제 요소; b) 구조 RS2-P2-RS1-STP-RS1-TG-RS2-SG를 갖는 제2 리컴비나제 요소; 및 c) 구조 P1-R2를 갖는 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 작제물을 제공하는 단계
    [여기서,
    (i) R1은 제1 리컴비나제;
    (ii) RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위;
    (iii) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 부위;
    (iv) STP는 종결 단편;
    (v) SG는 식물 선택성 유전자;
    (vi) TG는 수컷 불임성을 코딩하는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역;
    (vii) P1은, 식물 생활환에서 P2 프로모터보다 먼저 또는 P2와 동일한 시간에 활성화되며 구성적 프로모터, 종자 특이적 프로모터, 및 식물 또는 꽃의 어린싹 끝 분열조직 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 공통 생식세포 프로모터이고;
    (viii) P2는, 생활환에서 P1 프로모터보다 후기에 또는 P1과 동일한 시간에 활성화되고 융단층 특이적 프로모터 및 수컷 생식세포 특이적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 꽃밥- 또는 꽃밥 원기-특이적 프로모터이며;
    P1 및 P2는 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있음];
    2) 제1 리컴비나제 요소를 포함하는 제1 식물을 제공하는 단계;
    3) 제2 리컴비나제 요소를 포함하는 제2 식물을 제공하는 단계;
    4) 제3 리컴비나제 요소를 포함하는 제3 식물을 제공하는 단계;
    5) 제1 및 제2 식물을 교배하여, P1 프로모터의 조절을 받는 제1 리컴비나제의 발현이 제2 리컴비나제 요소로부터 종결 단편을 제거하여 P2 프로모터의 조절하에 수컷 불임성 유전자가 발현되는 자손을 생성하는 단계;
    6) 단계 5)의 자손을 수컷 번식성 식물과 교배하여 자손 종자를 생성하는 단계;
    7) 수컷 불임성을 보증하는 선택성 유전자의 유전자 산물에 기초하여 단계 6)의 자손 종자를 선별하는 단계; 및
    8) 단계 7)의 수컷 불임성 자손을 단계 4)의 제3 식물과 교배하여, P1 프로모터의 조절을 받는 제2 리컴비나제의 발현이 제3 리컴비나제 요소로부터 수컷 불임성 특질을 제거하는 자손을 생성함으로써 교잡 자손에서 수컷 번식력을 회복하는 단계
    를 포함하는, 식물에서 조건적으로 수컷 불임성을 발현하는 방법.
  55. 1) a) 구조 P1-R1을 갖는 제1 리컴비나제 요소; 및 b) 구조 RS1-P2-TG-RS1을 갖는 제2 리컴비나제 요소를 포함하는 작제물을 제공하는 단계
    [여기서,
    (i) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (ii) RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 부위;
    (iii) TG는 형질 또는 형질전환 마커를 코딩하는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역;
    (iv) P1 프로모터는 제1 세대의 생식세포에서 R1을 발현하는 제1 프로모터이고;
    (v) P2는 P1 이전에 또는 동일한 시간에 활성화되는 제2 프로모터이며,
    P1 및 P2는 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있음];
    2) 제1 리컴비나제 요소를 포함하는 제1 식물을 제공하는 단계;
    3) 제2 리컴비나제 요소를 포함하는 제2 식물을 제공하는 단계;
    4) 제1 및 제2 식물을 교배하여, 제1 프로모터(P2)가 활성화되는 제1 세대 식물을 생성함으로써 형질전이 유전자가 발현되는 단계; 및
    5) 리컴비나제가 발현되는 제1 프로모터(P1)를 활성화시켜 염색체로부터 형질전이 유전자가 제거되도록 하는 단계
    를 포함하는 형질전이 유전자의 제거 방법.
  56. 제55항에 있어서, P1이 아페탈라 3, 피스틸라타, Bcp I, 아페탈라 1, 리피및 아가모스로 이루어진 군으로부터 선택되는 공통 생식세포 프로모터인 방법.
  57. 제55항에 있어서, P1이 화분으로부터 형질전이 유전자를 제거하는 수컷 생식세포 프로모터인 방법.
  58. 제55항에 있어서, P1이 리컴비나제를 발현하여 자손 종자로부터 형질전이 유전자를 제거하는 꽃의 공통 생식세포 프로모터인 방법.
  59. 제57항에 있어서, P1이 아페탈라 3(AP3), 피스틸라타(PI), Bcp I 유전자 또는 합성 꽃밥 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 아라비돕시스 (Arabidopsis)로부터 유래된 프로모터인 방법.
  60. 제58항에 있어서, P1이 아페탈라 3(AP3), 피스틸라타(PI), 리피, 아가모스 및 아페탈라 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터 유래된 프로모터인 방법.
  61. 1) 구조 RS1-P1-R1-P2-TG1-RS1-P3-TG2를 갖는 리컴비나제 요소를 포함하는 작제물을 제공하는 단계
    [여기서,
    (i) R1은 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (ii) RS1은 리컴비나제 R1에 응답하는 리컴비나제 부위;
    (iii) TG1은 형질전환 마커 및 3' 영역을 코딩하는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역;
    (iv) TG2는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역;
    (v) P1은 제1 형질전환체의 생식세포에서 활성화되는 제1 프로모터;
    (vi) P2는 제1 형질전환체에서 활성화되는 제2 프로모터이고;
    (vii) P3는 제3 프로모터이며,
    P1, P2 및 P3는 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있음];
    2) 리컴비나제 요소를 포함하는 유전자도입 식물을 제공하는 단계;
    3) 제2 프로모터(P2)를 활성화시켜, 마커를 코딩하는 형질전이 유전자(TG1)가 발현되는 단계;
    4) 제1 프로모터(P1)를 활성화시켜, 리컴비나제(R1)를 발현함으로써 마커를 코딩하는 형질전이 유전자(TG1)가 제거되는 단계; 및
    5) 제3 프로모터(P3)를 활성화시켜, 형질전이 유전자(TG2)가 발현되는 단계
    를 포함하는 형질전환 마커의 제거 방법.
  62. 제61항에 있어서, P1이 유도가능한 공통 생식세포 프로모터인 방법.
  63. 제61항에 있어서, P1이 아라비돕시스 열 충격 프로모터 기원의 공통 생식세포 프로모터인 방법.
  64. 제61항에 있어서, P1이 완화제 유도가능한 프로모터 IN-2로부터 유래한 공통 생식세포 프로모터인 방법.
  65. 제61항에 있어서, P1이 어린싹 끝 분열조직, 꽃의 생식세포 또는 수컷 생식세포의 성장 단계적으로 조절되는 유전자로부터 유래한 공통 생식세포 프로모터인 방법.
  66. 제61항에 있어서, P1이 식물 및 꽃의 어린싹 끝 분열조직 프로모터(리피, 아페탈라 1, 아페탈라 3(AP3), 피스틸라타(PI), 또는 다른 종으로부터의 이들의 오르톨로그로 이루어진 군으로부터 선택됨), 꽃 프로모터(합성 꽃밥 프로모터 및 Bcp I 유전자, 또는 다른 종으로부터의 이들의 오르톨로그로 이루어진 군으로부터 선택됨) 또는 수컷 생식세포(아페탈라 3(AP3), 피스틸라타(PI), 또는 다른 종으로부터의 이들의 오르톨로그로 이루어진 군으로부터 선택됨)로부터 유래된 공통 생식세포 프로모터인 방법.
  67. 제57항에 있어서, 형질전환 마커가 형태학적 특질, 호르몬 생합성 유전자 및 선택성 유전자인 방법.
  68. 1) a) 구조 P1-R1을 갖는 제1 리컴비나제 요소; b) 구조 P1-RS1-STP-RS1-R2를 갖는 제2 리컴비나제 요소; c) 구조 P2-RS1-STP-RS2-TG1을 갖는 제3 리컴비나제 요소; 및 d) 구조 TG2-TG3를 갖는 연결된 유전자 작제물을 포함하는 작제물을 제공하는 단계
    [여기서,
    (i) P1은 제1 프로모터;
    (ii) R1은 제1 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (iii) RS1은 제1 리컴비나제에 응답하는 제1 리컴비나제 서열;
    (iv) P2는 제2 화분 특이적 프로모터;
    (v) RS2는 제2 리컴비나제에 응답하는 제2 리컴비나제 서열;
    (vi) STP는 종결 단편;
    (vii) R2는 제2 리컴비나제 코딩 서열 및 3' 영역;
    (viii) TG1은 수컷 배우체의 불임성을 코딩하는 형질전이 유전자 서열 및 3' 영역;
    (ix) TG2는 식물 형질을 코딩하는 형질전이 유전자 및 3' 영역이고;
    (x) TG3는 수컷 배우체의 번식력 복구 유전자이며,
    P1 및 P2는 이들의 하류 요소와 작동가능하게 연결되어 있음];
    2) 단계 (1)의 작제물을 포함하는 유전자도입 식물을 제공하는 단계;
    3) 제1 프로모터(P1)을 활성화시켜, 리컴비나제(R1)의 발현에 의해 제2 리컴비나제 요소로부터 종결 단편(STP)이 제거되고, 제2 리컴비나제의 발현에 의해 제3 리컴비나제 요소로부터 종결 단편(STP)이 제거되는 단계;
    4) 수컷 번식력 형질전이 유전자(TG1)이 화분에서 발현되는 화분 특이적 프로모터(P2)를 활성화시키는 단계; 및
    5) 단계 (4)의 식물을 자가수분시켜 결과의 제2 세대 식물에서 TG2 및 TG3가 발현되는 단계
    를 포함하는, 수컷 배우체 번식력의 조건적 발현 방법.
  69. 제68항에 있어서, TG1이 바르나제(barnase)이고, TG3가 바르나제 억제제 (barnstar)인 방법.
  70. (i) 각 리컴비나제 요소가 a) 1개 이상의 프로모터; 및 b) 리컴비나제 코딩 서열, 리컴비나제에 응답하는 부위 특이적 리컴비나제 서열, 종결 단편 및 형질전이 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 요소를 포함하는 DNA 단편을 포함하는 다수의 리컴비나제 요소를 제공하는 단계;
    (ii) 2개 이상의 리컴비나제 요소가 a) 프로모터 조절하의 제1 리컴비나제를 갖는 리컴비나제 요소; 및 b) 제1 리컴비나제의 발현에 의해 그 발현이 결정되는, 프로모터 조절하의 제2 리컴비나제를 갖는 리컴비나제 요소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 1종 이상의 식물에 단계 (i)의 리컴비나제 요소를 2개 이상 도입하는 단계;
    (iii) 리컴비나제의 발현이 제1 리컴비나제의 발현에 의해 수행되는, 단계 (ii)(a)의 프로모터를 활성화시키는 단계
    를 포함하는, 식물에서 형질전이 유전자를 조건적으로 발현 또는 제거하는 방법.
  71. (i) 형질전이 유전자에 작동가능하게 연결된 호메오틱 프로모터를 포함하는 작제물을 제공하는 단계;
    (ii) 단계 (i)의 작제물을 1종 이상의 식물에 도입하는 단계; 및
    (iii) 프로모터를 활성화시켜 형질도입 유전자를 발현하는 단계
    를 포함하는, 형질전이 유전자의 생식세포 특이적 발현 방법.
  72. 제71항에 있어서, 호메오틱 프로모터가 AP3, BCP1, PI, SAP 및 TA29로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  73. a) 제1 리컴비나제를 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 리컴비나제 요소;
    b) 제2 프로모터, 제1 리컴비나제에 응답하는 부위 특이적 서열에 의해 결합된 종결 단편, 및 제2 리컴비나제를 코딩하는 서열(종결 단편의 존재는 제2 리컴비나제의 발현을 억제하며, 제1 및 제2 리컴비나제는 상이함)을 포함하는 제2 리컴비나제 요소; 및
    c) 제2 리컴비나제에 응답하는 부위 특이적 서열에 의해 결합된 DNA 분자
    (여기서, 제1 리컴비나제의 발현은 제2 프로모터 및 제2 리컴비나제 코딩 서열을 작동가능하게 연결하는 제2 리컴비나제 요소로부터 종결 단편을 제거하며,제2 리컴비나제의 발현은 제2 리컴비나제에 응답하는 부위 특이적 서열에 의해 결합된 DNA 분자 내에서 부위 특이적 재조합을 초래함)
    를 포함하는 특질 제거 작제물.
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