JPWO2019131426A1 - 電気穿孔法による植物組織への直接核酸導入法およびその成果物 - Google Patents
電気穿孔法による植物組織への直接核酸導入法およびその成果物 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2019131426A1 JPWO2019131426A1 JP2019561605A JP2019561605A JPWO2019131426A1 JP WO2019131426 A1 JPWO2019131426 A1 JP WO2019131426A1 JP 2019561605 A JP2019561605 A JP 2019561605A JP 2019561605 A JP2019561605 A JP 2019561605A JP WO2019131426 A1 JPWO2019131426 A1 JP WO2019131426A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- plant
- seed
- seedling
- electroporation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
Abstract
本発明は、目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、双子葉植物への遺伝子導入方法、目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、遺伝子導入双子葉植物の作製方法、ならびにゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、ゲノム編集双子葉植物の作製方法を提供する。
Description
本発明は、植物の育種に関する。詳細には、本発明は、植物細胞への遺伝子導入手段および方法、遺伝子導入植物の作製方法、ならびにゲノム編集植物の作製方法に関する。
植物細胞への遺伝子導入にはアグロバクテリウムを用いた方法が広く利用されているが、植物種によっては、アグロバクテリウムの感染が可能でない、あるいは可能であっても形質転換が行えないものがある。さらにアグロバクテリウムを利用する場合には、アグロバクテリウムの感染後に植物体の再生技術が必須であり、再生技術が確立されていない植物では、アグロバクテリウムによる遺伝子導入法は利用できなかった。ジーンガン法やウィスカー法による直接遺伝子導入法も同様に、組織培養による再生技術が必要である。
遺伝子の直接導入法として電気穿孔(エレクトロポレーション)法もあるが、この方法を実施するために植物プロトプラストを作成する必要がある(非特許文献1〜3)。遺伝子導入後にプロトプラストから植物体を再生させることも必要であり、再生が困難な場合もある。そのため、プロトプラストを用いた電気穿孔法は簡便な遺伝子導入法とはいえない。
Fromm M, Taylor LP, Walbot V (1985) Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc Natl Acad Sci USA, 82:5824-5828.
Riggs CD, Bates GW (1986) Stable transformation of tobacco by electroporation: evidence for plasmid concatenation. Proc Natl Acad Sci USA, 83(15):5602-5606.
Joersbo M, Brunstedt J (1990) Direct gene transfer to plant protoplasts by electroporation by alternating, rectangular and exponentially decaying pulses. Plant Cell Rep, 8:701-705.
アグロバクテリウムの感染によらず、しかも組織培養による植物個体への再生技術を必要としない、植物への直接遺伝子導入法およびその成果物の作製方法であって、しかも簡便かつ短時間で済む方法が望まれていた。また、特にゲノム編集技術との組み合わせにおいて、遺伝子組み換え体でない変異植物の作製も望まれていた。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により目的遺伝子を直接導入することに成功した。本発明者らは、かかる成功に基づいて本発明を完成させた。本発明は以下のものを提供する。
(1)目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、双子葉植物への遺伝子導入方法。
(2)目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである(1)記載の方法。
(3)目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、(1)または(2)記載の方法。
(4)目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、遺伝子導入双子葉植物の作製方法。
(6)目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである(5)記載の方法。
(7)目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、(5)または(6)記載の方法。
(8)目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである(5)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、ゲノム編集双子葉植物の作製方法。
(10)ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである(9)記載の方法。
(11)ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、(9)または(10)記載の方法。
(12)ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである(9)〜(11)のいずれかに記載の方法。
(1)目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、双子葉植物への遺伝子導入方法。
(2)目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである(1)記載の方法。
(3)目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、(1)または(2)記載の方法。
(4)目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、遺伝子導入双子葉植物の作製方法。
(6)目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである(5)記載の方法。
(7)目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、(5)または(6)記載の方法。
(8)目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである(5)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、ゲノム編集双子葉植物の作製方法。
(10)ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである(9)記載の方法。
(11)ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、(9)または(10)記載の方法。
(12)ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである(9)〜(11)のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、アグロバクテリウムの感染によらず、しかも組織培養による再生技術を必要としない、直接遺伝子導入法およびその成果物の作製方法が提供される。本発明の方法によれば、従来法に比べて簡便にかつ短期間で成果物を作出することができる。本発明の方法によれば、植物組織へ一過的に導入した遺伝子を細胞内で働かせることが可能になる。本発明の方法を用いて、ゲノム編集ツールを植物に導入し一過的に発現させることにより、遺伝子組換えとならない変異植物系統を得ることが可能である。
本発明は、1の態様において、目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、双子葉植物への遺伝子導入方法を提供する。
本発明は、もう1つの態様において、目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、遺伝子導入双子葉植物の作製方法を提供する。
本発明において、目的遺伝子は、双子葉植物の細胞に導入されるべき遺伝子である。目的遺伝子の種類は特に限定されず、いずれの種類であってもよい。例えば、目的遺伝子は、中性タンパク質、酸性タンパク質、塩基性タンパク質をコードしていてもよい。また例えば目的遺伝子は、病虫害に対する抵抗性を植物に付与するタンパク質をコードしていてもよい。目的遺伝子がコードするタンパク質のサイズや形態も特に限定されない。目的遺伝子がコードするタンパク質は天然のタンパク質であってもよく、遺伝子組換えや突然変異などにより改変されたものであってもよい。
双子葉植物は、被子植物のうち子葉が2枚のものである。膨大な種類の双子葉植物が知られており、いずれの種類の双子葉植物であっても本発明の方法にて遺伝子導入を行うことができる。本発明の方法は、とりわけ組織培養や植物体再生が困難な双子葉植物の遺伝子導入に好ましく用いられる。本発明はあらゆる双子葉植物に適用できる。組織培養や植物体再生が困難な双子葉植物の例としては、トマト、ダイズ、アズキ、ソバ、ダイコン、エンドウ、サツマイモ、ジャガイモなどが挙げられるが、これらに限定されない。
種子胚は、種子中にある発芽前の植物体をいう。
発芽種子は、幼根が出現した種子をいう。種子の発芽は、種子が吸水して、幼根が種皮を破って出現するまでの過程をいう。本明細書において、発芽種子は、上記発芽過程にある種子も包含するものとする。
幼植物体は、発根した若い植物体をいう。幼植物体は、幼根が出現した種子、ならびに子葉や第一葉および第二葉のある若い植物体を包含する。
本発明において、種子胚、発芽種子または幼植物体のいずれにも遺伝子導入できるが、好ましくは発芽種子に遺伝子導入する。
種子の発芽方法および条件は公知である。発芽方法および条件は、一般的には、種子を滅菌水に浸漬して吸水させた後、適切な培地にて適切な明暗周期のもと培養することにより発芽させることができる。これらの条件は、植物の種類や種子の状態、サイズ等に応じて選択することができる。
本発明において、目的遺伝子は電気穿孔法によって植物に直接導入される。電気穿孔法は公知の方法である。電気穿孔法を用いて、キュベットと呼ばれる容器中の細胞懸濁液に電気パルスをかけることで細胞膜に微小な穴を空け、遺伝子を細胞内部に送り込むことができる。キュベット体積、電極間距離、電圧、内部抵抗、キャパシタンス、パルス波形、パルス回数、バッファーの組成などの電気穿孔法の条件は、公知の条件であってもよく、当業者が簡単な予備試験を行って決定できるものであってもよい。これらの条件は、植物の種類、種子胚、発芽種子、幼植物体の状態やサイズ、装置の性能に応じて選択することができる。様々な電気穿孔装置が市販されており、キュベット等の部品も様々なものが用意されているので、当業者はこれらを適宜選択して用いることができ、あるいは電気穿孔装置やその部品を作製することもできる。
本発明において、目的遺伝子は種子胚、発芽種子または幼植物体のいずれの組織に導入されてもよいが、好ましくはそれらの植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入される。したがって、本発明において、植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに目的遺伝子を挿入して、植物に導入することが好ましい。植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織は、例えば茎頂や側芽があげられる。植物体への再生が可能なシュート頂として、組織培養により得られる不定芽を用いることもできる。
植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターとして、シロイヌナズナ翻訳伸長因子遺伝子プロモーター、シロイヌナズナWUSCHEL遺伝子プロモーター、あるいはリボソームタンパク質P16遺伝子プロモーターなどが挙げられるが、これらのプロモーター配列に限定されない。このようなプロモーターは、当業者が容易に作製できるものであり、また市販もされている。
本発明において、植物中で導入遺伝子を恒常的に発現させてもよく、一過的に発現させてもよい。恒常的発現に用いるベクター、および一過的発現に用いるベクターは公知であり、適宜選択して使用することができる。
電気穿孔を行った後、種子胚、発芽種子または幼植物体を培養して、植物を成長させてもよい。これらの方法や条件は公知である。一般的には、電気穿孔を行った後、種子胚、発芽種子または幼植物体を暗所で培養し、次いで、適切な培地中、適切な明暗周期のもとで培養して植物体を成長させることができる。これらの条件は、植物の種類や種子胚、発芽種子または幼植物体の状態に応じて選択することができる。
遺伝子導入の結果、発現するタンパク質の確認方法は公知であり、様々な方法が知られている。例えば、目的タンパク質にGFPなどの蛍光タンパク質が融合している場合は、蛍光顕微鏡を用いて行うことができる。また例えば、薬剤耐性遺伝子とともに目的遺伝子を導入する場合は、当該薬剤耐性を指標にしてタンパク質の発現を確認することができる。
本発明における植物組織への目的遺伝子の導入効率は極めて高く、例えば数%〜約20%あるいは約20%以上であり得る。これらの値は、従来法を用いた場合よりも遙かに高い。
本発明は、さらにもう1つの態様において、ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、ゲノム編集双子葉植物の作製方法を提供する。
本発明の方法を用いて、ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を植物に一過的に導入することにより、遺伝子組み換え体でないゲノム編集双子葉植物を得ることができる。このことは、作物植物の育種や品種改良により好ましい。ゲノム編集に用いられるタンパク質としてはCas9、ZNF、TALENなどが例示されるが、これらに限定されない。Cas9をコードする遺伝子を本発明の方法を用いて植物に導入する場合は、ガイドRNAをとともに導入する。Cas9をコードする遺伝子とガイドRNAを1つのベクターに挿入して植物に導入してもよく、これらを別々のベクターに挿入して植物に導入してもよい。好ましくは、Cas9をコードする遺伝子とガイドRNAを1つのベクターに挿入して植物に導入する。
本発明の双子葉植物への遺伝子導入方法および遺伝子導入双子葉植物の作製方法に関する本明細書中の説明は、ゲノム編集双子葉植物の作製方法にもあてはまる。
本発明は、さらなる態様において、上で説明したいずれかの本発明の方法を実施するために用いられるキットであって、植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターを含むキットを提供する。目的遺伝子を該ベクターに挿入して、上記のいずれかの本発明の方法を実施することができる。目的遺伝子はいずれの遺伝子であってもよく、例えばゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。通常、キットには取り扱い説明書が添付される。
本明細書中の用語は、特に断らないかぎり、植物学、遺伝学および生化学等の分野において一般的に理解されている意味に解される。
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例によって限定されるものではない。
実施例1.シロイヌナズナ幼植物体組織への直接遺伝子導入
(1)シロイヌナズナ幼植物体の育成
植物組織への電気穿孔法による直接遺伝子導入の実施例として、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)幼植物体への導入実験を行った。次亜塩素酸を用いて表面殺菌を行ったシロイヌナズナの種子を滅菌水に浸漬し、4℃、暗所にて一晩静置した後、1%スクロースを含むMS液体培地に再懸濁し、照度10,000ルクス、温度23℃、および光周期:16時間明期/8時間暗期の条件で24−36時間培養し、発芽を行った。発芽種子は再び滅菌水で数回の洗浄を行った後、電気穿孔実験に用いた。
(1)シロイヌナズナ幼植物体の育成
植物組織への電気穿孔法による直接遺伝子導入の実施例として、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)幼植物体への導入実験を行った。次亜塩素酸を用いて表面殺菌を行ったシロイヌナズナの種子を滅菌水に浸漬し、4℃、暗所にて一晩静置した後、1%スクロースを含むMS液体培地に再懸濁し、照度10,000ルクス、温度23℃、および光周期:16時間明期/8時間暗期の条件で24−36時間培養し、発芽を行った。発芽種子は再び滅菌水で数回の洗浄を行った後、電気穿孔実験に用いた。
(2)直接遺伝子導入用ベクター
シロイヌナズナ幼植物体への直接遺伝子導入実験の実証例としてGFP遺伝子(配列番号:3)の導入を行った。用いたベクターを図1に示す。GFP遺伝子の発現制御には、2Xカリフラワーモザイクウィルス35S遺伝子プロモーター(配列番号:1)、オメガ翻訳エンハンサー配列(配列番号:2)およびシロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2kDa遺伝子ターミネーター(Ter 18.2)(配列番号:4)により発現制御を行った。GFP遺伝子発現カセットをpCR8TOPO(登録商標)ベクター(Thermofisher Scientific社製)に組込んだpCR8_P35sGFPを構築した(図1a)。この他に、GFP遺伝子の発現制御プロモーターとしてシロイヌナズナ翻訳伸長因子1A遺伝子プロモーター(Pro aef1)(配列番号:5)を用いたpCR8_Paef1GFPを構築した(図1b)。この実験では、2Xカリフラワーモザイクウィルス35S遺伝子プロモーターおよびシロイヌナズナ翻訳伸長因子1A遺伝子プロモーターを使用したが、本発明の使用形態の一例であり、これらのプロモーターに限定されるものではない。構築したプラスミドは、EndoFree Plasmid Mega kit(QIAGEN社製)により大量プラスミドDNA調製を行い、電気穿孔法に用いた。
シロイヌナズナ幼植物体への直接遺伝子導入実験の実証例としてGFP遺伝子(配列番号:3)の導入を行った。用いたベクターを図1に示す。GFP遺伝子の発現制御には、2Xカリフラワーモザイクウィルス35S遺伝子プロモーター(配列番号:1)、オメガ翻訳エンハンサー配列(配列番号:2)およびシロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2kDa遺伝子ターミネーター(Ter 18.2)(配列番号:4)により発現制御を行った。GFP遺伝子発現カセットをpCR8TOPO(登録商標)ベクター(Thermofisher Scientific社製)に組込んだpCR8_P35sGFPを構築した(図1a)。この他に、GFP遺伝子の発現制御プロモーターとしてシロイヌナズナ翻訳伸長因子1A遺伝子プロモーター(Pro aef1)(配列番号:5)を用いたpCR8_Paef1GFPを構築した(図1b)。この実験では、2Xカリフラワーモザイクウィルス35S遺伝子プロモーターおよびシロイヌナズナ翻訳伸長因子1A遺伝子プロモーターを使用したが、本発明の使用形態の一例であり、これらのプロモーターに限定されるものではない。構築したプラスミドは、EndoFree Plasmid Mega kit(QIAGEN社製)により大量プラスミドDNA調製を行い、電気穿孔法に用いた。
(3)シロイヌナズナ発芽幼植物体への電気穿孔法によるGFP遺伝子導入
30−40粒シロイヌナズナ発芽種子を500μLの電気穿孔用バッファーに懸濁した。電気穿孔用バッファーは、100μgのプラスミドDNAの他、塩化カルシウム、細胞壁分解酵素、浸透圧調整剤などを含んでいた。
30−40粒シロイヌナズナ発芽種子を500μLの電気穿孔用バッファーに懸濁した。電気穿孔用バッファーは、100μgのプラスミドDNAの他、塩化カルシウム、細胞壁分解酵素、浸透圧調整剤などを含んでいた。
電気穿孔用バッファーに懸濁した種子は、減圧処理を行った後、直ちにNEPA21(ネッパジーン社製)を用い、100−300Vのポアリングパルスおよび10−25Vのトランスファーパルスの印加を行った。
電気穿孔処理を行った種子は滅菌水にて数回洗浄を行った後、1%スクロースを含むMS液体培地に懸濁し、暗所、温度23℃の条件で一晩培養を行った後、照度10,000ルクス、温度23℃、および光周期:16時間明期/8時間暗期の条件で移し、培養を続けた。遺伝子導入後24時間から72時間の間に蛍光実体顕微鏡により導入されたGFP遺伝子の一過的発現を観察した。pCR8_P35sGFPおよびpCR8_Paef1GFPのいずれのプラスミド導入においても、導入48時間程度で明確なGFP発現による蛍光が観察され、電気穿孔法処理した種子の約20%においてGFP蛍光が認められた(図2)。またpCR8_Paef1GFPでは、シロイヌナズナ茎頂部分において特異的なGFP発現が観察された(図2b)。
実施例2. シロイヌナズナ幼植物体組織への一過的直接遺伝子導入によるゲノム編集
シロイヌナズナ幼植物体への直接遺伝子導入実施例の一形態として、ゲノム編集ベクターを直接遺伝子導入し一過的な遺伝子発現により導入した遺伝子が有効に機能することを実証した。
シロイヌナズナ幼植物体への直接遺伝子導入実施例の一形態として、ゲノム編集ベクターを直接遺伝子導入し一過的な遺伝子発現により導入した遺伝子が有効に機能することを実証した。
(1)ゲノム編集ベクターの構造
ゲノム編集としてCRISPR/Cas9システムを用い、ゲノム編集ベクターを構築した。Cas9遺伝子(配列番号:6)およびGFP遺伝子をThosea asigna由来自己開裂ペプチド2A配列(配列番号:7)により連結し、シロイヌナズナ翻訳伸長因子1A遺伝子プロモーターおよびシロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2kDa遺伝子ターミネーターにより発現制御を行った。また標的配列認識を行なうgRNA(配列番号:9)の発現には、シロイヌナズナU6 snRNA遺伝子プロモーター(配列番号:8)を用いた。標的としてシロイヌナズナOST2遺伝子を選び、CRISPR/Cas9の標的配列として5’−CAGTGCCGAAACCATTCGTAggg−3’(配列番号:10)(小文字はSpCas9のPAM配列を示す)を設計した。構築したゲノム編集ベクターpDgPqef037を図3に示す。
ゲノム編集としてCRISPR/Cas9システムを用い、ゲノム編集ベクターを構築した。Cas9遺伝子(配列番号:6)およびGFP遺伝子をThosea asigna由来自己開裂ペプチド2A配列(配列番号:7)により連結し、シロイヌナズナ翻訳伸長因子1A遺伝子プロモーターおよびシロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2kDa遺伝子ターミネーターにより発現制御を行った。また標的配列認識を行なうgRNA(配列番号:9)の発現には、シロイヌナズナU6 snRNA遺伝子プロモーター(配列番号:8)を用いた。標的としてシロイヌナズナOST2遺伝子を選び、CRISPR/Cas9の標的配列として5’−CAGTGCCGAAACCATTCGTAggg−3’(配列番号:10)(小文字はSpCas9のPAM配列を示す)を設計した。構築したゲノム編集ベクターpDgPqef037を図3に示す。
(2)電気穿孔法およびシロイヌナズナ植物体の育成
電気穿孔法およびシロイヌナズナ植物体の育成は、実施例1と同様に行った。
電気穿孔法およびシロイヌナズナ植物体の育成は、実施例1と同様に行った。
(3)pDgPaef037導入植物体の変異解析
前述、電気穿孔法によりpDgPaef037を導入した植物体のうち、茎頂部分においてGFP蛍光が観察された植物体の本葉からゲノムDNAを調製した。ゲノ
ムDNAは、NucleoSpin(登録商標)Plant IIキット(タカラバイオ社製)を用いて、メーカーの提供するプロトコールに従って行った。OST2遺伝子の標的配列近傍を、TaKaRa Ex Taq(登録商標)Hot Start Version(タカラバイオ社製)を用いて増幅した。得られたPCR産物を用いてCel−1解析あるいはヘテロ二本鎖移動度分析により変異解析を行い、変異導入が確認された植物体については、さらにシーケンス解析により変異配列を解析した。茎頂部分においてGFP蛍光が観察された植物体から発生した本葉を用いてシーケンス解析を行った結果、図4aに示すOST2遺伝子の標的配列部に変異が導入されており、変異導入効率は約20%であった。次に変異導入が確認された植物体の次世代種子を得、次世代における変異と導入プラスミドのゲノムへの組込みを解析した。電気穿孔処理当代においてOST2遺伝子の標的に変異が生じた植物体から得られた次世代植物体では、変異が伝搬しており、変異はbi−allelicに生じた次世代個体が得られた。また、次世代植物体ゲノムにおける電気穿孔法導入したプラスミドDNAの組込みをPCR法により解析したところ、pDgPaef1のCas9遺伝子およびgRNA配列はゲノムに組み込まれていないと考えられた(図5)。
前述、電気穿孔法によりpDgPaef037を導入した植物体のうち、茎頂部分においてGFP蛍光が観察された植物体の本葉からゲノムDNAを調製した。ゲノ
ムDNAは、NucleoSpin(登録商標)Plant IIキット(タカラバイオ社製)を用いて、メーカーの提供するプロトコールに従って行った。OST2遺伝子の標的配列近傍を、TaKaRa Ex Taq(登録商標)Hot Start Version(タカラバイオ社製)を用いて増幅した。得られたPCR産物を用いてCel−1解析あるいはヘテロ二本鎖移動度分析により変異解析を行い、変異導入が確認された植物体については、さらにシーケンス解析により変異配列を解析した。茎頂部分においてGFP蛍光が観察された植物体から発生した本葉を用いてシーケンス解析を行った結果、図4aに示すOST2遺伝子の標的配列部に変異が導入されており、変異導入効率は約20%であった。次に変異導入が確認された植物体の次世代種子を得、次世代における変異と導入プラスミドのゲノムへの組込みを解析した。電気穿孔処理当代においてOST2遺伝子の標的に変異が生じた植物体から得られた次世代植物体では、変異が伝搬しており、変異はbi−allelicに生じた次世代個体が得られた。また、次世代植物体ゲノムにおける電気穿孔法導入したプラスミドDNAの組込みをPCR法により解析したところ、pDgPaef1のCas9遺伝子およびgRNA配列はゲノムに組み込まれていないと考えられた(図5)。
実施例3. ダイコン幼植物体組織への一過的直接遺伝子導入によるゲノム編集
(1)植物組織への電気穿孔法による直接遺伝子導入の実験例として、ダイコン(Raphanus sativus)幼植物体の茎頂組織への導入実験を行った。次亜塩素酸を用いて表面殺菌を行ったダイコンの種子を滅菌水に浸漬し、4℃、暗所にて一晩静置した後、1%スクロースを含むMS液体培地に再懸濁し、照度10,000ルクス、温度23℃、および光周期:16時間明期/8時間暗期の条件で24−36時間培養し、発芽を行った。発芽種子は再び滅菌水で数回の洗浄を行った後、電気穿孔実験に用いた。
(1)植物組織への電気穿孔法による直接遺伝子導入の実験例として、ダイコン(Raphanus sativus)幼植物体の茎頂組織への導入実験を行った。次亜塩素酸を用いて表面殺菌を行ったダイコンの種子を滅菌水に浸漬し、4℃、暗所にて一晩静置した後、1%スクロースを含むMS液体培地に再懸濁し、照度10,000ルクス、温度23℃、および光周期:16時間明期/8時間暗期の条件で24−36時間培養し、発芽を行った。発芽種子は再び滅菌水で数回の洗浄を行った後、電気穿孔実験に用いた。
(2)直接遺伝子導入用ベクター
実施例2のシロイヌナズナ幼植物体組織への一過的直接遺伝子導入によるゲノム編集に使用したpDgPaef037を用いた。
実施例2のシロイヌナズナ幼植物体組織への一過的直接遺伝子導入によるゲノム編集に使用したpDgPaef037を用いた。
(3)ダイコン発芽幼植物体への電気穿孔法による遺伝子導入
実施例1のシロイヌナズナ幼植物体組織への直接遺伝子導入で実施した方法に従って、電気穿孔処理を行った。
電気穿孔処理を行った種子は滅菌水にて数回洗浄を行った後、1%スクロースを含むMS液体培地に懸濁し、暗所、温度23℃の条件で一晩培養を行った後、照度10,000ルクス、温度23℃、および光周期:16時間明期/8時間暗期の条件で移し、培養を続けた。遺伝子導入後24時間から72時間の間に蛍光実体顕微鏡により導入されたGFP遺伝子の一過的発現を観察した。pDgPaef037プラスミドを導入していない野生型ダイコン幼植物体ではGFP蛍光は認められなかったが(図6a)、一方、pDgPaef037プラスミドを導入したダイコン幼植物体においては、導入48時間程度で明確なGFP発現による蛍光が全身的に観察された(図6b)。
実施例1のシロイヌナズナ幼植物体組織への直接遺伝子導入で実施した方法に従って、電気穿孔処理を行った。
電気穿孔処理を行った種子は滅菌水にて数回洗浄を行った後、1%スクロースを含むMS液体培地に懸濁し、暗所、温度23℃の条件で一晩培養を行った後、照度10,000ルクス、温度23℃、および光周期:16時間明期/8時間暗期の条件で移し、培養を続けた。遺伝子導入後24時間から72時間の間に蛍光実体顕微鏡により導入されたGFP遺伝子の一過的発現を観察した。pDgPaef037プラスミドを導入していない野生型ダイコン幼植物体ではGFP蛍光は認められなかったが(図6a)、一方、pDgPaef037プラスミドを導入したダイコン幼植物体においては、導入48時間程度で明確なGFP発現による蛍光が全身的に観察された(図6b)。
以上の結果から、本発明によって、特別な組織培養を用いずに、一過的に導入した遺伝子を効果的に機能させる直接遺伝子導入法が提供されることが確認された。
本発明は、植物の育種や遺伝学的研究などの分野において利用可能である。
配列番号:1は、2Xカリフラワーモザイクウィルス35S遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号:2は、タバコモザイクウィルスオメガ翻訳エンハンサーの塩基配列を示す。
配列番号:3は、GFP遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子の融合遺伝子の塩基配列を示す。
配列番号:4は、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2kDa遺伝子ターミネーターの塩基配列を示す。
配列番号:5は、シロイヌナズナ翻訳伸長因子遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号:6は、Streptococcus pyogenesのCas9(核移行シグナルを含む)の塩基配列を示す。
配列番号:7は、Thosea asigna由来自己開裂ペプチド2Aペプチドの塩基配列を示す。
配列番号:8は、シロイヌナズナU6 snRNA遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号:9は、Streptococcus pyogenesのCRISPR/Cas9に用いられるgRNAの塩基配列を示す。
配列番号:10は、シロイヌナズナOST2遺伝子の標的配列を示す。
配列番号:2は、タバコモザイクウィルスオメガ翻訳エンハンサーの塩基配列を示す。
配列番号:3は、GFP遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子の融合遺伝子の塩基配列を示す。
配列番号:4は、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2kDa遺伝子ターミネーターの塩基配列を示す。
配列番号:5は、シロイヌナズナ翻訳伸長因子遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号:6は、Streptococcus pyogenesのCas9(核移行シグナルを含む)の塩基配列を示す。
配列番号:7は、Thosea asigna由来自己開裂ペプチド2Aペプチドの塩基配列を示す。
配列番号:8は、シロイヌナズナU6 snRNA遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号:9は、Streptococcus pyogenesのCRISPR/Cas9に用いられるgRNAの塩基配列を示す。
配列番号:10は、シロイヌナズナOST2遺伝子の標的配列を示す。
Claims (12)
- 目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、双子葉植物への遺伝子導入方法。
- 目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである請求項1記載の方法。
- 目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、請求項1または2記載の方法。
- 目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、遺伝子導入双子葉植物の作製方法。
- 目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである請求項5記載の方法。
- 目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、請求項5または6記載の方法。
- 目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである請求項5〜7のいずれか1項記載の方法。
- ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、ゲノム編集双子葉植物の作製方法。
- ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである請求項9記載の方法。
- 植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターにゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を挿入して、植物に導入する、請求項9または10記載の方法。
- ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである請求項9〜11のいずれか1項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017249694 | 2017-12-26 | ||
JP2017249694 | 2017-12-26 | ||
PCT/JP2018/046960 WO2019131426A1 (ja) | 2017-12-26 | 2018-12-20 | 電気穿孔法による植物組織への直接核酸導入法およびその成果物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2019131426A1 true JPWO2019131426A1 (ja) | 2021-02-18 |
Family
ID=67063688
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019561605A Pending JPWO2019131426A1 (ja) | 2017-12-26 | 2018-12-20 | 電気穿孔法による植物組織への直接核酸導入法およびその成果物 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2019131426A1 (ja) |
WO (1) | WO2019131426A1 (ja) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003514521A (ja) * | 1999-11-17 | 2003-04-22 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 植物における条件導入遺伝子の発現および形質除去のための方法 |
JP2005534299A (ja) * | 2002-07-16 | 2005-11-17 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 減圧処理/加圧処理の使用を含むエレクトロポーレーション方法 |
JP2009538137A (ja) * | 2006-05-25 | 2009-11-05 | モンサント テクノロジー エルエルシー | ダイズの病害耐性量的形質遺伝子座を同定する方法およびその組成物 |
JP2011234648A (ja) * | 2010-05-07 | 2011-11-24 | National Institute Of Biomedical Innovation | 植物形質転換体の作出方法、及び、植物形質転換体 |
WO2017046772A1 (en) * | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Cellectis | Modifying messenger rna stability in plant transformations |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019129705A (ja) * | 2016-03-31 | 2019-08-08 | 日本たばこ産業株式会社 | 植物に物質を導入する方法 |
CN109153988B (zh) * | 2016-05-13 | 2023-04-18 | 株式会社钟化 | 植物的基因组编辑方法 |
-
2018
- 2018-12-20 JP JP2019561605A patent/JPWO2019131426A1/ja active Pending
- 2018-12-20 WO PCT/JP2018/046960 patent/WO2019131426A1/ja active Application Filing
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003514521A (ja) * | 1999-11-17 | 2003-04-22 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 植物における条件導入遺伝子の発現および形質除去のための方法 |
JP2005534299A (ja) * | 2002-07-16 | 2005-11-17 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 減圧処理/加圧処理の使用を含むエレクトロポーレーション方法 |
JP2009538137A (ja) * | 2006-05-25 | 2009-11-05 | モンサント テクノロジー エルエルシー | ダイズの病害耐性量的形質遺伝子座を同定する方法およびその組成物 |
JP2011234648A (ja) * | 2010-05-07 | 2011-11-24 | National Institute Of Biomedical Innovation | 植物形質転換体の作出方法、及び、植物形質転換体 |
WO2017046772A1 (en) * | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Cellectis | Modifying messenger rna stability in plant transformations |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
"升岡繁ほか,接ぎ木法を用いたサツマイモの種子生産とエレクトロポレーションによる種子への直接遺伝子導入", 南九州大学研報, vol. 46A, JPN6019005689, 2016, pages 41 - 48, ISSN: 0004920424 * |
"坂本秀樹ほか,電気穿孔を用いた直接導入法およびin-planta法による植物ゲノム編集技術の開発", 第39回日本分子生物学会年会要旨集, JPN6019005691, 2016, pages 1233 - 1, ISSN: 0004920425 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2019131426A1 (ja) | 2019-07-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7321477B2 (ja) | 植物のゲノム編集方法 | |
CN109642235A (zh) | 用于植物中的基因组修饰的方法和组合物 | |
Zhang et al. | A simple and efficient in planta transformation method for pommelo (Citrus maxima) using Agrobacterium tumefaciens | |
JP2011507505A (ja) | 植物プロトプラストへの変異原性核酸塩基のポリエチレングリコール介在導入を用いる改良された突然変異誘発法 | |
Collado et al. | Agrobacterium-mediated transformation of Phaseolus vulgaris L. using indirect organogenesis | |
JP7282382B2 (ja) | ゲノム編集植物の生産方法 | |
Xiao et al. | High efficient transformation of auxin reporter gene into trifoliate orange via Agrobacterium rhizogenes-mediated co-transformation | |
JPWO2019131426A1 (ja) | 電気穿孔法による植物組織への直接核酸導入法およびその成果物 | |
JP4754968B2 (ja) | 植物のインプランタ形質転換法 | |
CN116368230A (zh) | 基因组编辑过的植物的生产方法 | |
Shysha et al. | Genetic transformation of flax (Linum usaitatissimum L.) with the chimeric GFP-TUA6 gene for the visualization of microtubules | |
CN107058382A (zh) | 转基因针叶树植株的制备方法 | |
JP3565284B2 (ja) | 形質転換されたユーカリ属植物の作出方法 | |
CN108424911B (zh) | 种子特异性双向启动子及其应用 | |
WO2019172278A1 (ja) | 受精を介さず種子植物の果実の生長を誘導する核酸及びベクター、並びに受精を介さず果実の生長が誘導される組換え種子植物及びその製造方法 | |
US10047369B2 (en) | Citrus derived transcription and translation regulatory elements for tissue specific expression | |
Krens et al. | Oriental lily hybrids engineered to resist aphid attack | |
Fritze et al. | Gene activation by T-DNA tagging | |
WO2022186295A1 (ja) | 受精を介さず種子植物の胚発生を誘導する方法、それに用いられるタンパク質、核酸、及びベクター、並びに受精を介さず胚を発生しうる組換え種子植物 | |
JP2010130926A (ja) | ミヤコグサ由来のレトロトランスポゾンlore1を用いた変異体植物の作製方法 | |
JPH07203790A (ja) | 形質転換されたユーカリ属植物を作出する方法 | |
Limera | Development of efficient regeneration and genetic engineering methods through organogenesis and somatic embryogenesis in prunus spp and vitis spp. | |
Borissova et al. | Agrobacterium-mediated transformation of secondary somatic embryos from Rosa hybrida L. and recovery of transgenic plants | |
JP2015208256A (ja) | 植物の脱分化細胞製造方法及び植物細胞の脱分化誘導剤 | |
da Silva¹ et al. | Efficient method for Agrobacterium-mediated genetic transformation of tobacco nodal segments |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A529 | Written submission of copy of amendment under article 34 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A5211 Effective date: 20200604 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211201 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221115 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230509 |