CN107058382A - 转基因针叶树植株的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种转基因针叶树植株的制备方法，具体地，本发明提供的首次以针叶树植物的下胚轴为起始外植体，使用根癌农杆菌转化方法，并结合梯度筛选，可得到非常高的转化效率，高效获得针叶树转基因植株。
Description
技术领域
本发明涉及针叶树植株的栽培，具体地，涉及转基因针叶树植株的制备方法。
背景技术
在全球森林资源中，针叶树占世界总林分面积的60％(Narender et al，2005)，主要分属南洋杉科(Araucariaceae)、松科(Pinaceae)、杉科(Taxodiaceae)、柏科(Cupressaceae)、罗汉松科(Podocarpaceae)、三尖杉科(Cephalotaxaceae)和红豆杉科(Taxaceae)等，多为高大乔木；在我国森林资源中，针叶树占全国林分总蓄积面积的56.2％，大多分属松科、杉科、柏科等，常形成单纯针叶林或针阔叶混交林。
长期以来，林木遗传转化技术的发展一直滞后于主要农作物及其它草本植物，主要原因是林木生长周期长，受外界环境影响大，再生困难，生根更难。相对于阔叶树来说，针叶树遗传转化难度更大，难点在：⑴组织培养进展缓慢，高效再生系统匮缺；⑵抗生素敏感性高，转化外植体分化频率低；⑶抗性芽生根困难；⑷选择压低，假阳性率高。这些困难严重阻碍了针叶树基因工程研究进展。近年来，尽管不断涌现出有关针叶树遗传转化的报道，但大多数物种尚停留在瞬时表达阶段(Ellis et al.,1991；Hey et al.,1994；Hagman etal.,1997；Hamara et al.,1999；Fernando et al.,2000)。
因此，本领域迫切需要开发一种可有效制备转基因针叶树植株的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可有效制备转基因针叶树植株的方法。
本发明第一方面提供了一种针叶树植物的转基因方法，包括步骤：
(a)对针叶树植物的种子进行萌发处理，从而获得幼苗；
(b)对所述幼苗进行去根处理，从而获得经去根的幼苗；
(c)将所述经去根的幼苗进行培养，获得经培养的幼苗；
(d)对所述经培养的幼苗的下胚轴进行切取，获得下胚轴切段；
(e)将所述的下胚轴切段作为转基因受体材料，进行转基因处理，从而获得转入外源基因的下胚轴切段；和
(f)任选地，对所述转入外源基因的下胚轴切段进行再生，从而获得转基因的针叶树植物植株。
在另一优选例中，在步骤(f)中，包括以下一个或多个独立的子步骤：
(f1)对所述转入外源基因的下胚轴切段，在递增的筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织；
(f2)对愈伤组织进行出芽处理，从而获得抗性不定芽；
(f3)对抗性不定芽进行生根处理，从而获得转基因的针叶树植物植株。
在另一优选例中，所述的筛选压力是针对抗性基因的筛选压力。
在另一优选例中，在步骤(f1)中，所述的递增的筛选压力包括2、3、4、5、6级的递增筛选压力。
在另一优选例中，所述递增的筛选压力包括3级或4级。
在另一优选例中，在步骤(f1)中，在针对所述述抗性筛选基因的第一(级)筛选压力条件、第二(级)筛选压力条件、第三(级)筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织。
在另一优选例中，在步骤(f2)中，在单级或递增的筛选压力进行出芽处理。
在另一优选例中，在步骤(f2)中，所述的递增的筛选压力包括2、3、4、5、6级的递增筛选压力。
在另一优选例中，所述递增的筛选压力包括2级、3级或4级。
在另一优选例中，在步骤(f2)中，在针对所述述抗性筛选基因的第一(级)筛选压力条件、第二(级)筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织。
在另一优选例中，在步骤(f2)中的第一(级)筛选压力与步骤(f1)中的最后一级的筛选压力相当(或相近)或相同。
在另一优选例中，在步骤(f2)中所述单级的筛选压力等同于或高于步骤(f1)中的最后一级的筛选压力(即按抗生素浓度计算，单级的筛选压力与步骤(f1)中的最后一级的筛选压力的比值为0.9-1.3，较佳地0.9-1.2，更佳地1.0-1.2)。
在另一优选例中，在步骤(f3)中，在单级或递增的筛选压力进行生根处理。
在另一优选例中，在步骤(f3)中，所述的递增的筛选压力包括2级的递增筛选压力。
在另一优选例中，在步骤(f3)，在单级的筛选压力进行生根处理。
在另一优选例中，在步骤(f3)中所述单级的筛选压力等同于或高于步骤(f2)中的最后一级的筛选压力(即按抗生素浓度计算，所述单级的筛选压力与步骤(f2)中的最后一级的筛选压力的比值为0.9-1.3，较佳地0.9-1.2，更佳地1.0-1.2)。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，所述种子进行萌发出苗5-15天，优选6-10天。
在另一优选例中，所述步骤(c)还包括对所述去根的幼苗进行消毒的步骤。
在另一优选例中，所述步骤(c)还包括将所述去根的幼苗转入无激素的培养基中培养的步骤。
在另一优选例中，所述培养基为MS培养基。
在另一优选例中，所述下胚轴切段为紧贴顶芽的下胚轴切段。
在另一优选例中，所述下胚轴切段为1-3段。
在另一优选例中，所述下胚轴切段的长度为1-5mm，较佳地，2-4mm。
在另一优选例中，所述的外源基因选自下组：抗性基因、标记基因、新霉素转移酶基因、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗性基因包括卡娜霉素。
在另一优选例中，所述的标记基因选自下组：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、gfp(绿色荧光蛋白)基因、或其组合。
在另一优选例中，转入外源基因的方法选自下组：农杆菌法、电穿孔法、基因枪法、或其组合。
在另一优选例中，所述步骤(e)中，用农杆菌进行转基因处理。
在另一优选例中，所述步骤(e)中，用含有乙酰丁香酮(AS)的感染液进行转基因处理。
在另一优选例中，所述感染液中，所述乙酰丁香酮的浓度为20-500μmol/1，较佳地，50-400μmol/1，更佳地，100-300μmol/1。
在另一优选例中，所述步骤(e)，还包括步骤：
(e1)构建带有β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因和新霉素转移酶(nptⅡ)基因的质粒pCAMBIA2301；
(e2)将步骤(e1)的质粒pCAMBIA2301转入所述外胚轴切段中，从而获得所述转入外源基因的下胚轴切段。
在另一优选例中，所述步骤(e)，包括步骤：
(i)从含头孢霉素(cef)和利福平(rif)的LB培养平板上挑取含有质粒pCAMBIA2301的根癌农杆菌单菌落接种于含有头孢霉素(cef)和利福平(rif)的LBy培养基培养，经活化后离心分离，收集菌体，重悬于液体共培养(DCR+10g/L葡萄糖)基本培养基中，其中，
所述质粒pCAMBIA2301带有35S启动的β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因和35S启动的新霉素转移酶(nptⅡ)基因；
(ii)将所述下胚轴切段接种于含有30-500mg/l(较佳地，50-450mg/l，更佳地，100-400mg/l)头孢霉素(Cef，Cefotaxime)、3-100mg/l(较佳地，5-80mg/l，更佳地，10-60mg/l)卡那霉素(Kan，Kanamycin)、0.2-20mg/l(较佳地，0.5-10mg/l，更佳地，0.8-6mg/l)BA、0.02-2mg/l(较佳地，0.06-1.5mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA和0.0008-0.08mg/l(较佳地，0.001-0.05mg/l，更佳地，0.005-0.02mg/l)TDZ的DCR培养基上进行筛选培养；
(iii)将步骤(ii)筛选获得的下胚轴切段接种于含有30-500mg/l(较佳地，50-450mg/l，更佳地，100-400mg/l)头孢霉素(Cef，Cefotaxime)、0.2-20mg/l(较佳地，0.5-10mg/l，更佳地，0.8-6mg/l)BA、0.02-2mg/l(较佳地，0.06-1.5mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA和0.0008-0.08mg/l(较佳地，0.001-0.05mg/l，更佳地，0.005-0.02mg/l)TDZ的DCR培养基上，于光照(80μmol.m-2.s-1)16h/d，培养温度25±2℃，0.5-3周(较佳地，0.8-2周)后进行筛选培养；
(iv)将筛选获得的下胚轴置于含有乙酰丁香酮的感染液中，之后置于共培养培养基(MS培养基)中，在室温下，黑暗条件下共培养1-6天。
在另一优选例中，所述针叶树选自下组的属：松属、柏属、杉属、或其组合。
在另一优选例中，所述针叶树选自下组：杂交松、油松、日本落叶松、长白落叶松、松柏、杉木、马尾松、台湾杉、福建融水杉、贵州融水杉、或其组合。
在另一优选例中，所述抗性筛选基因选自下组：卡那霉素抗性基因、头孢霉素抗性基因、或其组合。
在另一优选例中，所述的递增的筛选压力为4级，分别为第一筛选压力、第二筛选压力、第三筛选压力和第四筛选压力。
在另一优选例中，所述第一筛选压力≤第二筛选压力。
在另一优选例中，所述第二筛选压力≤第三筛选压力。
在另一优选例中，所述第三筛选压力≤第四筛选压力。
在另一优选例中，所述第四筛选压力≥第三筛选压力≥第二筛选压力≥第一筛选压力。
在另一优选例中，所述的外源目的基因和抗性筛选基因位于同一质粒上。
在另一优选例中，所述的外源目的基因和抗性筛选基因位于农杆菌质粒上。
在另一优选例中，所述的农杆菌质粒为pCAMBIA2301。
在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因，所述第一筛选压力为5-50mg/l的卡那霉素浓度。
在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因，所述第二筛选压力为10-70mg/l的卡那霉素浓度。
在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因，所述第三筛选压力为15-80mg/l的卡那霉素浓度。
在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因，所述第四筛选压力为20-100mg/l的卡那霉素浓度。
在另一优选例中，所述步骤(f)中，将所述转入外源基因的下胚轴切段置于含有5-50mg/l的卡那霉素、10-70mg/l的卡那霉素、15-80mg/l的卡那霉素的筛选培养基中筛选培养2-4周，从而获得抗性愈伤组织。
在另一优选例中，所述步骤(f)中，将获得的抗性愈伤组织置于含有15-80mg/l的卡那霉素、20-100mg/l的卡那霉素的筛选培养基中筛选培养2-6周，从而获得抗性不定芽。
在另一优选例中，所述步骤(f)包括步骤：
(f1)对获得的抗性不定芽进行培养，获得抗性芽；
(f2)将获得的抗性芽进行生根培养，获得转基因的针叶树植物植株。
在另一优选例中，所述步骤(f1)中，将获得的抗性不定芽置于含有20-100mg/l的卡那霉素的筛选培养基中筛选培养4周，获得抗性芽。
在另一优选例中，所述步骤(f2)中，将获得的抗性芽置于含有20-100mg/l的卡那霉素的生根培养基中筛选培养4-6周，获得转基因的针叶树植物植株。
本发明第二方面提供了一种针叶树植物繁殖的方法，所述方法包括步骤：
(a)将所述针叶树植物的种子萌发获得幼苗；
(b)将步骤(a)获得的幼苗进行培养，获得幼苗的下胚轴；
(c)以步骤(b)所述的下胚轴作为受体，转入外源基因，从而获得转基因的下胚轴；
(d)分别在针对所述述抗性筛选基因的第一筛选压力条件、第二筛选压力条件、第三筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织；
(e)将步骤(d)获得的所述抗性愈伤组织，分别在针对所述抗性筛选基因的第三筛选压力条件、第四筛选压力条件下，进行筛选培养，获得获得抗性不定芽；
(f)将步骤(e)获得的所述抗性不定芽在第四筛选压力调节下进行培养，生根获得植株。
在另一优选例中，所述步骤(a)包括对所述幼苗苗去根，进行消毒的步骤。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，所述种子出苗5-15天，优选6-10天后，进行去根、消毒。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，将所述无菌苗置于无激素的MS培养基培养2-8天，优选3-7天。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述下胚轴为切段的下胚轴。
在另一优选例中，所述下胚轴为紧贴顶芽的下胚轴切段。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述下胚轴为1-3段。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述下胚轴的长度为1-5mm，较佳地，2-4mm。
在另一优选例中，所述步骤(c)，包括步骤：
(c1)构建带有β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因和新霉素转移酶(nptⅡ)基因的质粒pCAMBIA2301；
(c2)将步骤(c1)的质粒pCAMBIA2301转入所述外胚轴中，从而获得所述转基因的下胚轴。
在另一优选例中，所述步骤(c)，包括步骤：
(c1)从含头孢霉素(cef)和利福平(rif)的LB培养平板上挑取含有质粒pCAMBIA2301的根癌农杆菌单菌落接种于含有头孢霉素(cef)和利福平(rif)的LBy培养基培养，经活化后离心分离，收集菌体，重悬于液体共培养(DCR+10g/L葡萄糖)基本培养基中，其中，
所述质粒pCAMBIA2301带有35S启动的β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因和35S启动的新霉素转移酶(nptⅡ)基因；
(c2)将所述下胚轴接种于含有30-500mg/l(较佳地，50-450mg/l，更佳地，100-400mg/l)头孢霉素(Cef，Cefotaxime)、3-100mg/l(较佳地，5-80mg/l，更佳地，10-60mg/l)卡那霉素(Kan，Kanamycin)、0.2-20mg/l(较佳地，0.5-10mg/l，更佳地，0.8-6mg/l)BA、0.02-2mg/l(较佳地，0.06-1.5mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA和0.0008-0.08mg/l(较佳地，0.001-0.05mg/l，更佳地，0.005-0.02mg/l)TDZ的DCR培养基上进行筛选培养；
(c3)将步骤(c2)筛选获得的下胚轴接种于含有30-500mg/l(较佳地，50-450mg/l，更佳地，100-400mg/l)头孢霉素(Cef，Cefotaxime)、0.2-20mg/l(较佳地，0.5-10mg/l，更佳地，0.8-6mg/l)BA、0.02-2mg/l(较佳地，0.06-1.5mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA和0.0008-0.08mg/l(较佳地，0.001-0.05mg/l，更佳地，0.005-0.02mg/l)TDZ的DCR培养基上，于光照(80μmol.m-2.s-1)16h/d，培养温度25±2℃，1周后进行筛选培养；
(c4)将筛选获得的下胚轴置于含有乙酰丁香酮的感染液中，之后置于共培养培养基中，在室温下，黑暗条件下共培养1-6天。
在另一优选例中，所述步骤(c4)中，所述感染液中，所述乙酰丁香酮的浓度为20-500μmol/1，较佳地，50-400μmol/1，更佳地，100-300μmol/1。
在另一优选例中，所述步骤(d)中，将所述转基因外胚轴置于含有5-50mg/l的卡那霉素、10-70mg/l的卡那霉素、15-80mg/l的卡那霉素的筛选培养基中筛选培养2-4周，从而获得抗性愈伤组织。
在另一优选例中，所述步骤(e)中，将步骤(d)获得的抗性愈伤组织置于含有15-80mg/l的卡那霉素、20-100mg/l的卡那霉素的筛选培养基中筛选培养2-6周，从而获得抗性不定芽。
在另一优选例中，所述步骤(f)包括步骤：
(f1)对步骤(e)的抗性不定芽进行培养，获得抗性芽；
(f2)将步骤(f1)获得的抗性芽进行生根培养，获得转基因植株。
在另一优选例中，所述步骤(f1)中，将步骤(e)获得抗性不定芽置于含有20-100mg/l的卡那霉素的筛选培养基中筛选培养4周，获得抗性芽。
在另一优选例中，所述步骤(f2)中，将步骤(f1)获得的抗性芽置于含有20-100mg/l的卡那霉素的生根培养基中筛选培养4-6周，获得转基因植株。
本发明第三方面提供了一种转基因材料，所述转基因材料由本发明第一方面中步骤(a)-(e)制得。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了农杆菌介导的杉木遗传转化体系，其中，图A共培养1d的下胚轴切段；图B共培养2d的下胚轴切段的GUS染色(左为对照)；图C抗性愈伤组织(15mg/l Kan)；图D抗性愈伤组织的GUS染色(20mg/l Kan，右为对照)；图E抗性愈伤组织(25mg/l Kan)；图F抗性愈伤组织起始分化(25mg/l Kan)；图G抗性愈伤组织分化(30mg/l Kan)；图H抗性不定芽(30mg/l Kan)；图I抗性芽伸长(30mg/l Kan)；图J抗性芽生根(30mg/l Kan)；图K转化植株针叶的GUS染色(左为对照)；图L稳定的转基因植株。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次以针叶树植物的下胚轴为起始外植体，使用根癌农杆菌转化方法，并结合梯度筛选，可得到非常高的转化效率，获得大量抗性芽，高效获得针叶树转基因植株。在此基础上，完成了本发明。
DCR培养基
本文所用的DCR培养基(Gupta&Durzan,1985)是指常规的针叶树专性培养基，用于不定芽的诱导和伸长。采用本领域已知的配方配制DCR培养基即可。
无激素的MS培养基
本文所用的无激素的MS培养基(Murashige&Skoog,1962)是指常规的通用培养基，适用物种宽泛，用于消毒处理后的起始外植体材料(带下胚轴的针叶树实生苗)。采用本领域已知的配方配制无激素的MS培养基即可。
根癌农杆菌及其工程菌
农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，与植物基因转化有关的有2种类型：根癌农杆菌(Agrobacteriumtum efaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrh izogenes)，分别含有Ti质粒和Ri质粒。由于根瘤农杆菌具有趋化性，侵染受体时，在植物受伤组织产生的一些糖类和酚类物质诱导下，向受伤组织集中，通过供体和受体特异互作，农杆菌细胞识别并附着到植物细胞表面，将Ti质粒上的一段T2DNA片段导入植物细胞基因组中。农杆菌介导的遗传转化，通常以单拷贝或者低拷贝的形式将外源基因插入到植物基因组，转育周期短、重复性好、基因沉默现象少、组织培养简单，但是转化和再生受材料基因型限制。
根癌农杆菌(农杆菌，Agrobacterium tumefaciens)是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌。农杆菌普遍存在于土壤中，为革兰氏阴性细菌，能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导长生冠瘿瘤或法状根。
本发明的一优选例中，对农杆菌进行改造，将带有35S启动的β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因和35S启动的新霉素转移酶(nptⅡ)基因的质粒pCAMBIA2301导入到农杆菌中，经筛选得到根癌农杆菌工程菌，用以浸染胚尖。其中，质粒pCAMBIA-2301是常用于植物表达的载体(如参见CN102337291A)，可在在农杆菌里复制，该载体特性有大肠杆菌卡那霉素抗性；植物卡那霉素选择标记；含有报告基因GUS。
基因枪法
基因枪法是DNA吸附在微载体(钨粉或金粉粒子)表面，然后以高压气体或高压放电为动力，金属微粒被射入受体植物细胞，实施转化。基因枪法技术主要以大豆幼胚的胚轴、茎尖、胚性悬浮细胞和未成熟胚茎尖为转化受体，通过潮霉素筛选转化植株。基因枪转化法不受基因型的限制、产生的微创有利于基因转移、具有较高的转化率、能够转移多拷贝的重组DNA或者DNA片段。但比农杆菌介导法耗资大，技术难，在植物基因组中拷贝数高，易引起基因沉默。
针叶树植物的转基因方法
本发明还提供了一种针叶树植物的转基因方法，包括步骤：
(a)对针叶树植物的种子进行萌发处理，从而获得幼苗；
(b)对所述幼苗进行去根处理，从而获得经去根的幼苗；
(c)将所述经去根的幼苗进行培养，获得经培养的幼苗；
(d)对所述经培养的幼苗的下胚轴进行切取，获得下胚轴切段；
(e)将所述的下胚轴切段作为转基因受体材料，进行转基因处理，从而获得转入外源基因的下胚轴切段；和
(f)任选地，对所述转入外源基因的下胚轴切段进行再生，从而获得转基因的针叶树植物植株。
本发明的主要优点包括：
1.本发明首次以温室萌发7-15天的针叶树(如杉木)实生苗下胚轴为起始材料，经过农杆菌介导的遗传转化，获得转基因植株，并通过PCR、Southern blot分析等方法检测，证实成功获得转基因苗，本发明为针叶树的遗传转化提供了一种行之有效的方法。
2.本发明的方法能够实现针叶树的性状改良，获得优良的针叶树种苗，而且这种种苗的发生不受季节限制，可以常年生产。通过本发明可以实现优良针叶树种苗的大量种植，从而起到对于该物种的保护作用。
3.本发明首次使用针叶树植物(如杉木)的下胚轴成功培育针叶树植物的转基因植株，为改良针叶树性状提供了简易可行的方法。
4.本发明方法快速高效，重复性好。
5.利用本发明方法能获得大量的再生植株。
6.获得的植株遗传稳定，产量高。
7.明显缩短针叶树遗传育种周期，省时省力。
8.加速新优品种(系)培养进程。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
如无特殊说明，本发明说明书中所用的材料和试剂均为市售产品。
通用方法
(1)转化植株的GUS基因的组织化学检测(GUS检测)
按照Jefferson等(1987)的方法，取共培养1-5d的下胚轴切段、在筛选培养基上生长的抗性愈伤组织和抗性植株的针叶，分别浸入到X-G1uc溶液(含Na2EDTA 10mmol/l，磷酸缓冲液100mmol/l，pH7.0，亚铁氰化钾0.5mmol/l，高铁氰化钾0.5mmol/l，20％甲醇(V/V)和0.1％X-Gluc(W/V))中，37℃保温过夜。洗涤后组织转入95％乙醇中脱色，观察染色情况。
(2)PCR检测
PCR扩增nptⅡ基因的引物为：P1和P2，可扩增出710bp的PCR产物。PCR扩增gus基因的引物为：P3和P4，可扩增出900bp的PCR产物(引物P1、P2、P3和P4序列同CN201310210870.7)。每个反应体积为50μl，其中上下游引物各0.4μM，4种dNTP各200μM，10×buffer 5μl，Taq DNA聚合酶2U，最后加水至50μl。PCR反应条件：94℃预变性5min；然后94℃变性1min，54℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后，72℃延伸7min。5-10μl PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，观察拍照。
(3)转化植株的Southern blot分析
DNA片段向杂交膜的转移(碱法转移)和固定
对PCR阳性的转化植株和未转化植株每个样品各取40μg DNA经HindⅢ完全消化后，在含EB的0.8％琼脂糖凝胶上，小于1V/cm电泳过夜。在紫外下观察酶切及电泳效果，拍照记录。凝胶切去无用部分，切去一角作为标记。在数倍体积碱性转移液(0.4M NaOH，1MNaCl)中浸泡1h，不断温和振，其间更换碱性转移液一次。通过毛细管作用把DNA片段转移到Hybond-N+上，转移缓冲液为上述碱性转移液。
DNA转移完全后，在数倍体积中和缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH7.2)，1M NaCl)中轻摇中和30min，其间更换一次中和液。将尼龙膜在80℃烤箱中烘烤2h，固定DNA。尼龙膜冷至室温，用保鲜膜包裹，4℃保存备用。
探针DNA的标记
以常规的pCAMBIA2301为模板，经PCR扩增的nptⅡ基因片段(710bp)和gus基因片段(910bp)。采用随机引物法(Takara试剂盒)用[α-32P]dCTP进行探针标记。
Southern blot
用2×SSC溶液(上海宝曼生物科技)湿润尼龙膜。将尼龙膜装入盛有适量(200μl/cm2)预杂交液(6×SSC，5×Denhardt's，0.5％SDS，100μg/ml变性鲑鱼精子DNA，50％甲酰胺)的杂交管中，使尼龙膜展开紧贴于管壁，盖紧杂交管，42℃预杂交4h。
将探针置于加热平台95℃加热5min，迅速置冰浴中5min。
取下杂交管，更换预杂交液，将变性后的探针加入预杂交液中，杂交炉内65℃旋转杂交24h。
倒出放射性杂交液，取出尼龙膜，迅速置洗膜液Ⅰ(2×SSC，0.5％SDS)中，室温下漂洗5min。
将膜转入洗膜液Ⅱ(2×SSC，0.1％SDS)中，室温下漂洗15min。
将膜转入洗膜液Ⅲ(0.1×SSC，0.5％SDS)中，杂交炉中37℃旋转洗膜30min。
将膜转入新鲜洗膜液Ⅲ中，杂交炉中68℃旋转洗膜30min。
从杂交管中取出尼龙膜，用0.1×SSC室温短暂漂洗尼龙膜，滴尽多余液体后用保鲜膜包好。
压X-光片，-70℃放射自显影3d。
实施例1
(1)基本培养基为DCR(Gupta&Durzan,1985)培养基，pH5.8，121℃灭菌15-25分钟。不定芽的诱导和伸长均使用该培养基。
(2)选取成熟饱满的杉木种子，用自来水浸泡24h，播种于温室(25±2℃)，播种基质为泥炭、蛭石和珍珠岩等【2:2:1(v/v)】。种子出苗7d后，选取生长健壮的幼苗，用自来水清洗干净，去根后用70％酒精消毒30s,0.1％升汞浸泡4min，无菌水冲洗5次，再将无菌苗转入无激素的MS(Murashige&Skoog,1962)培养5d后取下胚轴切段受试。
(3)所用的双元载体质粒pCAMBIA2301(市售质粒)的T-DNA上构建了nptⅡ基因，因此卡那霉素(Kan)成为该实验的筛选剂将下胚轴切段接种于分别添加0-500mg/l头孢霉素(Cef，Cefotaxime)、0-30mg/l卡那霉素(Kan，Kanamycin)且附含2mg/l BA、0.2mg/l NAA和0.008mg/l TDZ的DCR培养基上，进行抗生素敏感性实验。将经农杆菌感染后共培养5d的下胚轴切段接种于分别添加0-500mg/l头孢霉素(Cef，Cefotaxime)且附含2mg/l BA、0.2mg/lNAA和0.008mg/l TDZ的DCR培养基上，光照(80μmol.m-2.s-1)16h/d，培养温度25±2℃，1周后考察农杆菌生长状况。确定出适合本实验的头孢霉素(Cef)浓度为300mg/l，卡那霉素(Kan)浓度为30mg/l。
(4)为了探讨乙酰丁香酮(AS)对杉木转化的影响，本研究在杉木转化过程中以三种方式添加AS：只在感染液中添加AS；只在共培养基中添加AS；在感染液和共培养基中都添加AS。添加的浓度依次为：0、100、200、300μmol/1乙酰丁香酮。通过实验对照，并综合考虑AS对杉木遗传转化的促进作用及其对外植体的毒害作用，AS的适宜添加浓度应为200μmol/1。
(5)将杉木下胚轴切段(2mm)浸入制备好的感染液，在28℃摇床(100rpm)放置5-40min。取出切段，用灭菌纸吸干表面菌液，放到共培养培养基上，在22℃黑暗条件下共培养1-6d(图1，图A)。
(6)在共培养培养基上共培养4d，即可完成T-DNA向杉木受体细胞的转移(图1，图B)。
(7)将转化外植体在筛选培养基上，用15mg/1Kan筛选2周、20mg/1Kan筛选2周、25mg/1Kan筛选4周，获得了一定数量的Kan抗性愈伤组织(图1，图C-E)。
(8)将Kan抗性愈伤组织转接在分化培养基上，用25mg/1Kan筛选2周(图1，图F)、30mg/1Kan筛选4-6周后(图1，图G)，可见一定数量的不定芽从抗性愈伤组织上分化出来(图1，图H)。
(9)抗性不定芽在附含30mg/1Kan的伸长培养基上能有效伸长(图1，图I)，并于筛选4周后获得可直接用于生根培养的抗性芽。
(10)将抗性芽转接到附含30mg/1Kan的生根培养基上筛选4-6周后根系形成(图1，图J)，炼苗1周后将抗性小植株到温室的花盆中生长，最终获得假定的转基因植株(图1，图L)。
(11)提取所有抗性植株的DNA，进行gus基因和nptⅡ基因的PCR分析，结果得到32株gus基因和nptⅡ基因均为阳性的杉木转化植株。PCR阳性检出率约为70％。PCR初步检测结果证明外源基因已经整合到杉木基因组中。
(12)取32株PCR阳性植株的幼嫩针叶进行GUS染色实验。经95％乙醇脱色后，所有针叶叶面上均可见到蓝色的斑点或条带(图1，图K)。
(13)随机选取5株经经PCR检测gus基因和nptⅡ基因均呈阳性的转化植株，用CTAB法提取其基因组DNA，用HindⅢ酶切，以PCR扩增的gus基因和nptⅡ基因片段为探针，对转化植株基因组DNA进行Southern blot分析。其中有3株显示单一条带，1株显示两个条带，另一株显示3个条带，表明外源基因在基因组大多数呈单位点整合。
重复三次试验，累计从120个胚轴获得针叶树(如杉木)植株系25个，PCR和Southern blot检测阳性株系15个，转化效率为12.5％，生根频率100％。
实施例2
本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处采用马尾松。
实验步骤重复三次，累计从100个胚轴获得针叶树(如马尾松)植株系12个，PCR和Southern blot检测阳性株系9个，转化效率为7.5％，生根频率为100％。
实施例3
本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处采用落叶松。
实验步骤重复三次，累计从110个胚轴获得针叶树(如落叶松)植株系8个，PCR和Southern blot检测阳性株系8个，转化效率为7.4％，生根频率为100％。
对比例1
种子出苗3天后，去根消毒，重复三次实验，累计从120个胚轴获得针叶树(如杉木)植株系3个，PCR和Southern blot检测阳性株系0个，转化效率为0％，生根频率为0。
对比例2
种子刚发芽，取下胚轴进行转基因植株的培育，重复三次实验，累计从120个胚轴获得针叶树(如落叶松)植株系0个，PCR和Southern blot检测阳性株系0个，转化效率为0％，生根频率为0。
对比例3
下胚轴切段长度为10mm，重复三次实验，累计从120个胚轴获得针叶树(如)植株系5个，PCR和Southern blot检测阳性株系3个，转化效率为2.5％，生根频率为50％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种针叶树植物的转基因方法，其特征在于，包括步骤：
(a)对针叶树植物的种子进行萌发处理，从而获得幼苗；
(b)对所述幼苗进行去根处理，从而获得经去根的幼苗；
(c)将所述经去根的幼苗进行培养，获得经培养的幼苗；
(d)对所述经培养的幼苗的下胚轴进行切取，获得下胚轴切段；
(e)将所述的下胚轴切段作为转基因受体材料，进行转基因处理，从而获得转入外源基因的下胚轴切段；和
(f)任选地，对所述转入外源基因的下胚轴切段进行再生，从而获得转基因的针叶树植物植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(f)中，包括以下一个或多个独立的子步骤：
(f1)对所述转入外源基因的下胚轴切段，在递增的筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织；
(f2)对愈伤组织进行出芽处理，从而获得抗性不定芽；
(f3)对抗性不定芽进行生根处理，从而获得转基因的针叶树植物植株。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(f1)中，所述的递增的筛选压力包括2、3、4、5、6级的递增筛选压力。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(f1)中，在针对所述述抗性筛选基因的第一筛选压力条件、第二筛选压力条件、第三筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(f2)中，在单级或递增的筛选压力下进行出芽处理。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(f2)中，在针对所述抗性筛选基因的第一筛选压力条件、第二筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(f3)中，在单级或递增的筛选压力进行生根处理。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述下胚轴切段的长度为1-5mm，较佳地，2-4mm。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转入外源基因的方法选自下组：农杆菌法、电穿孔法、基因枪法、或其组合。
10.一种转基因材料，其特征在于，所述转基因材料由权利要求1中(a)-(e)的步骤制得。
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