CN109679890A

CN109679890A - 一种油松愈伤组织瞬时表达基因功能鉴定方法

Info

Publication number: CN109679890A
Application number: CN201910023159.8A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 钮世辉; 刘双委; 马晶晶
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2019-04-26

Abstract

本发明公开了一种油松愈伤组织瞬时表达基因功能鉴定方法。本发明提供了一种制备油松愈伤组织的方法，包括如下步骤：以油松下胚轴为外植体，将所述外植体在诱导培养基中诱导培养，得到油松愈伤组织；所述诱导培养基含有1‑2mg/L2,4‑D和1‑1.5mg/L 6‑BA。本发明以油松实生幼苗的下胚轴为外植体，通过调节培养条件，建立油松愈伤组织诱导条件。该研究优化的油松愈伤组织瞬时转化体系有助于外源基因在油松愈伤组织内的表达，为后期通过转基因技术研究目标基因功能奠定了技术基础。

Description

一种油松愈伤组织瞬时表达基因功能鉴定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种油松愈伤组织瞬时表达基因功能鉴定方法。

背景技术

随着高通量测序技术的快速发展，植物基因组测序得以开展，越来越多的植物新基因被发现。植物遗传转化是开展基因工程育种和鉴定基因功能的重要途径。其中，稳定的遗传转化具有重现性好的优势。但是，对于大多数种子植物来说，因受限于遗传转化技术，稳定的遗传转化植物的获得仍十分困难。相对于稳定遗传转化来说，瞬时表达技术将外源基因在植物组织或细胞中进行瞬时表达，可以获得关于该基因功能或表达模式的很多信息，近年来已被广泛应用于多种植物基因功能的研究。

瞬间表达是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位及基因间互作的一种重要技术，这种方式与获得完整转基因植株相比，在数小时至数天之内即可完成对目的基因的表达分析，具有简便、快捷和高效的优点，是目前进行功能基因组学研究的常用手段。常用的瞬时表达方法主要有基因枪轰击法、原生质体转化法、农杆菌介导法。基因枪轰击法具有简便、精准等优势被应用于多种物种中，但其设备高昂及转化效率低等因素，其应用性受到限制；原生质转化法已在拟南芥、水稻、烟草等植物中开发与应用，然而对于一些多年生的木本植物来说，原生质体的获得较为困难，且酶的价格昂贵。相较于前两种方法，农杆菌介导的瞬时表达利用农杆菌的天然能力将外源DNA导入完整的细胞壁的植物细胞中，其操作简单、转化效率高及低成本而受到广泛应用于植物功能基因的研究中。

基于农杆菌介导的瞬时表达方法，从农作物的小麦(Triticum monococcum)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)，到园艺观赏植物的矮牵牛(Petunia hybrida)、长春花(Catharanthus roseus)、香蒲(Typha orientalis)等以及藻类植物绿藻等都已建立了相应的瞬时表达体系。

油松(Pinus tabuliformis)是中国的特有乡土树种，主要分布于我国华北、西北及东北的14个省市自治区，生态适生区达300Km²。油松具有抗干旱、耐瘠薄、适生范围广、生长速度稳定等特点，是重要用材、生态和景观树种，具有重要的经济、生态和社会价值。作为针叶树的一种，油松是研究裸子植物进化的重要的材料。但由于其复杂的、巨大的基因组、营养生长周期长及受限制的遗传转化体系等因素，油松的相关基因功能研究进展缓慢。目前，主要是以模式植物拟南芥为材料，通过异源基因表达的方式研究油松的基因功能。但是作为裸子植物的油松与被子植物拟南芥，两者的遗传背景存在较大差异，使得油松的关键基因功能研究进展缓慢。因此，开发高效遗传转化及功能鉴定体系对于油松功能基因的研究是十分必要的。

发明内容

为了开发油松自身基因的高效遗传转化及功能鉴定的体系，本发明发现了一种非胚性愈伤组织以及找到了愈伤组织培育的效果好的培养基及转染外源基因效果好的培养基。

本发明一个目的是提供了一种制备油松愈伤组织的方法，包括如下步骤：以油松下胚轴为外植体，将所述外植体在诱导培养基中诱导培养，得到油松愈伤组织；

所述诱导培养基含有1-2mg/L2,4-D和1-1.5mg/L 6-BA。

上述方法还包括如下步骤：将所述油松愈伤组织在继代培养基中继代培养，扩繁愈伤组织；

所述继代培养基含有1.13-2.13mg/L 6-BA和2.21-2.5mg/L2,4-D。

上述方法中，所述诱导培养基由1-2mg/L 2,4-D、1-3mg/L 6-BA、3-4g/L植物凝胶、20-30g/L蔗糖、4-5g/L MS固体培养基和水组成；

或，所述继代培养基由1.13-2mg/L 6-BA、2.21-3mg/L2,4-D、4-5g/L MS固体培养基和水组成。

上述方法中，所述诱导培养的条件为24±1℃、暗培养、30-50天；

和/或，所述继代培养为1次或多次继代培养，所述继代培养为每15-20天转接一次。

由上述的方法制备的油松愈伤组织在转染目的基因中的应用也是本发明保护的范围；

或，由上述的方法法制备的油松愈伤组织在瞬时表达目的基因中的应用；

或，由上述的方法制备的油松愈伤组织在鉴定瞬时表达目的基因功能中的应用。

本发明另一个目的是提供一种向油松愈伤组织中瞬时转染目的基因的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)按照上述的方法制备的油松愈伤组织；

2)将目的基因转入所述油松愈伤组织中，实现向油松愈伤组织中瞬时转染目的基因。

上述方法中，所述将目的基因转入所述油松愈伤组织中的方法包括如下步骤：

a)制备表达目的基因的重组农杆菌；

所述重组农杆菌为将表达目的基因的重组载体导入农杆菌中，得到重组农杆菌；

b)将所述油松愈伤组织浸泡在所述重组农杆菌菌液中10-15分钟，得到侵染后愈伤组织；

c)将所述侵染后愈伤组织在共培养培养基中培养1-3天，得到共培养愈伤组织；

d)将所述共培养愈伤组织在含筛选抗生素的培养基中培养2-5天，得到转染后的愈伤组织。

上述方法中，所述表达目的基因的重组载体为将目的基因替换双元表达载体的酶切位点间的DNA片段，得到的载体；

和/或，所述双元表达载体具体为pBI121或pBI121-A；

和/或，所述pBI121-A为在pBI121载体上的GUS报告基因后插入4个双拷贝酶切识别位点(顺序为SacI、XhoI、SalI、SpeI、SpeI、SalI、XhoI和SacI，序列为序列3)的载体；

和/或，所述共培养培养基由4.19g/L SH培养基、1.13-2mg/L 6-BA、2.21-3mg/L2,4-D、20-30g/L蔗糖、3-4g/L植物凝胶和水组成；

所述含筛选抗生素的培养基由4.19g/L SH培养基、1.13-2mg/L 6-BA、2.21-3mg/L2,4-D、20-30g/L蔗糖、3-4g/L植物凝胶、300-500mg/L特美汀、30-50mg/L卡那霉素和水组成。

本发明第3个目的是提供一种油松愈伤组织瞬时表达目的基因功能鉴定体系。

本发明提供的油松愈伤组织瞬时表达目的基因功能鉴定体系，包括上述诱导培养基、继代培养基和油松下胚轴；以及，上述中的共培养培养基和含筛选抗生素的培养基。

上述中，所述目的基因为油松自身基因或模式基因。

本发明利用组织培养技术，以油松实生幼苗的下胚轴为外植体，通过调节培养条件，建立油松愈伤组织诱导条件。放置在不同的诱导培养基中，在20-30天观察愈伤组织诱导状况。通过观察结果表明MS+1mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA+3g/L植物凝胶+30g/L蔗糖的愈伤诱导效果较好。在此基础上，通过前期试验确定合适的诱导条件，获得了油松愈伤组织，利用农杆菌介导的载体pBI121∷GUS和两个油松基因LEAFY和NEEDLY，瞬时表达产物经过GUS蛋白活性检测和转录组测序，结果表明该研究优化的油松愈伤组织瞬时转化体系有助于外源基因在油松愈伤组织内的表达，为后期通过转基因技术研究目标基因功能奠定了技术基础。

与现有技术方法相比，本发明具有如下有益效果：

1)细胞悬浮系或愈伤组织遗传背景一致、来源稳定，取材不受时间限制，愈伤组织可长期继代保存；

2)作为转化的外植体，操作简单，转化率高，可获得大量转化细胞系，构建转基因群体；

3)实现通过筛选快速生长油松愈伤组织，建立油松愈伤组织瞬时表达基因功能鉴定体系，为油松特异的基因功能和基因间相互作用的研究，提供技术支持和新的研究途径。

4)相比于油松胚性愈伤，本发明下胚轴诱导的非胚性愈伤组织的获得率高，培养基成分简单易于操作，并且获得体细胞愈伤组织所需时间较短。

附图说明

图1为改造后植物双元表达载体pBI121质粒图谱。

图2为油松下胚轴诱导的愈伤组织在继代培养基生长状态。

图3为油松下胚轴愈伤组织GUS组织染色状况；左侧为对照(没有转基因的愈伤)，右侧为GUS染色。

图4为转基因油松愈伤组织中基因的表达量分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

GUS组织染色试剂购买于北京拜尔迪生物技术有限公司，货号为DE0175-50mL将前期利用卡那霉素筛选的转基因愈伤组织放入2mL的EP管，加入适量配制GUS染色工作液(X-gluc溶液与GUS缓冲液按1：50的比例混合)至完全覆盖材料；锡箔纸包好后放置37℃恒温箱中10-16h组织显现蓝色，将染色的愈伤组织转入无水乙醇褪色2-3次，直至阴性对照材料为白色。最后，将蓝色的组织放在显微镜观察并拍照。

实施例1、油松下胚轴愈伤组织的制备

1、以油松实生幼苗的下胚轴为外植体诱导愈伤

选取油松种子50粒，放入清水浸泡的水苔中，放置于光照16/8h黑暗的气候箱中进行萌发。2周后，选取生长状态的一致的油松幼苗用锋利的手术刀片去除根部，保留下胚轴作为外植体；

对上述的下胚轴分别用75％的酒精表面消毒1min，再用17％的次氯酸钠(84)消毒10min；最后用无菌蒸馏水冲洗4～6次，得到消毒后的油松下胚轴。

2、诱导培养

将1得到的消毒后的50个油松下胚轴接种到装有诱导培养基的组培瓶中，接种方式为下胚轴采用切口处垂直插入培养基中，黑暗诱导培养50天，得到45个带有愈伤组织的下胚轴。

上述诱导培养的温度为(24±1)℃。

上述诱导培养基由1mg/L 2,4-D、1mg/L 6-BA、3g/L植物凝胶、30g/L蔗糖和4.33g/L MS固体培养基(产品货号MSP09-50LT，生产商为美国Caisson Laboratories)和水组成。

表1为MS固体培养基组分及浓度

组成成分	mg/L
		Ammonium Nitrate(NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>)	1650.0000
Boric Acid(H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>)	6.2000
		Calcium Chloride,Anhydrous(CaCl<sub>2</sub>)	332.2000
Cobalt Chloride,Hexahydrate(CoCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O)	0.0250
		Cupric Sulfate,Pentahydrate(CuSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>O)	0.0250
EDTA,Disodium Salt,Dihydrate(C<sub>10</sub>H<sub>14</sub>N<sub>2</sub>Na<sub>2</sub>O<sub>8</sub>.2H<sub>2</sub>O)	37.2600
		Ferrous Sulfate,Heptahydrate(FeSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O)	27.8000
Magnesium Sulfate,Anhydrous(MgSO<sub>4</sub>)	180.7000
		Manganese Sulfate,Monohydrate(MnSO<sub>4</sub>.H<sub>2</sub>O)	16.9000
Molybdic Acid Sodium Salt,Dihydrate(Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O)	0.2500
		Potassium Iodide(KI)	0.8300
Potassium Nitrate(KNO<sub>3</sub>)	1900.0000
		Potassium Phosphate,Monobasic,Anhydrous(KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>)	170.0000
Zinc Sulfate,Heptahydrate(ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O)	8.6000
		Glycine(C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>NO<sub>2</sub>)	2.0000
Myo-inositol(C<sub>6</sub>H<sub>12</sub>O<sub>6</sub>)	100.0000
		Nicotinic Acid(C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>NO<sub>2</sub>)	0.5000
Pyridoxine,Hydrochloride(C<sub>8</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>3</sub>.HCl)	0.5000
		Thiamine,Hydrochloride(C<sub>12</sub>H<sub>17</sub>ClN<sub>4</sub>OS.HCl)	0.1000

3、继代培养

将上述2得到的愈伤组织用灭菌的镊子捣碎，接种到继代培养基中多次继代培养，平均每15-20天转接一次，共继代培养3-4次，共继代培养90-120天；得到扩繁的愈伤组织(图2)。

上述继代培养基由1.13mg/L 6-BA、2.21mg/L2,4-D、4.33g/L MS固体培养基和水组成。

根据如下公式计算诱导愈伤组织效率，结果诱导愈伤组织效率能达到90％以上。

实施例2、油松下胚轴愈伤组织在瞬时转染目标基因中的应用

一、油松下胚轴愈伤组织在瞬时转染GUS基因

1、表达GUS的载体

植物双元表达载体pBI121记载在如下文献中：Chen P,Wang C,Soong S,etal.Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application incloning T-DNA insertion from transgenic plants[J].Molecular Breeding.2003,11(4):287-293；GenBank:AF485783.1，该载体含有CaMV 35S启动子(835bp)，GUS报告基因(1812bp)，NPTII筛选基因和NOS终止子(253bp)等元件。

2、表达GUS重组菌

将质粒pBI121转入采用冻融法转入农杆菌GV3101，在含有卡那霉素(50mg/L)、利福平(50mg/L)的固体培养基28℃培养2天后，得到重组菌GV3101/pBI121菌液。

3、渗透缓冲溶液的制备

将GV3101/pBI121菌液加入到含50mg/L卡那霉素与50mg/L利福平抗生素的YEB溶液中，200rpm 28℃过夜培养，然后把菌液进行5000g离心10min，收集沉淀的菌体；

将菌体用缓冲液(10mM MES pH 5.6，100μM acetosyringone，10mM MgCl₂，0.005％Tween 20)洗脱2次。5000g离心10min收集菌体，再用缓冲液重悬浮OD₆₀₀＝0.3-0.5，23℃避光静置3小时，待用，得到待侵染GV3101/pBI121菌液。

4、农杆菌介导侵染

取继代培养10-15天长势良好乳白色的油松下胚轴愈伤组织，(侵染时取得是如图2的愈伤，侵染后分成体积相似的块状组织。)分别将其浸泡在上述3得到的待侵染GV3101/pBI121菌液中10-15min，得到侵染后愈伤组织；

再用无菌滤纸去除侵染后愈伤组织表面多余菌液，将侵染后愈伤组织按照每90mm的培养皿中放置9块愈伤的量置于表面覆盖无菌滤纸的共培养基上，黑暗条件下共培养2天，得到共培养后愈伤组织；

上述共培养基的配方：4.19g/L SH培养基(Schenk&Hildebrandt培养基，购买于Coolaber公司，产品编号PM1541-50L)、1.13mg/L 6-BA、2.21mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶和水组成，该培养基的pH值为5.8；

再将共培养后愈伤组织置于含筛选抗生素的培养基中，黑暗条件下继续培养3天，得到pBI121转染后的愈伤组织，实现瞬时转化和表达。

含筛选抗生素的培养基配方：4.19g/L SH培养基、1.13mg/L 6-BA、2.21mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶、300mg/L特美汀(Timentin)、30mg/L卡那霉素(Kanamycin)和水组成，该培养基的pH值为5.8。

5、GUS组织化学染色

取上述4得到的pBI121转染后的愈伤组织和未转染的油松下胚轴愈伤组织分别放于1.5mL/2mL EP管中，加入适量配制好的GUS染色工作液至完全覆盖愈伤组织；锡箔纸包好，黑暗条件下37℃孵育3h或过夜。

倒掉染色液，用70％乙醇漂洗染色的愈伤组织至GUS染色的阳性的蓝色斑点稳定，在乙醇中不褪色。将染色的愈伤保存于乙醇中，用普通光学显微镜下观察，白色背景上的蓝色即为GUS表达位点(图3；左侧为未转染的油松下胚轴愈伤组织；右侧转染后的愈伤组织)。

根据染色的愈伤块数，来确定侵染效率。

侵染效率＝染上蓝色的愈伤组织块数/总的接种愈伤组织块数X 100％

结果侵染效率为44.1％。

二、油松下胚轴愈伤组织在瞬时转染本体目的基因

1、表达目的基因的重组载体

重组载体p35S::NEEDLY为将油松的PtNEEDLY基因(序列2)替换植物双元表达载体pBI121-A的SmaI和SpeI酶切位点间得到的质粒。

植物双元表达载体pBI121-A(改造后植物双元表达载体pBI121)为将4个双拷贝重叠酶切位点(顺序为SacI、XhoI、SalI、SpeI、SpeI、SalI、XhoI和SacI)的DNA片段(序列3)添加到植物双元表达载体pBI121的GUS后面如图1所示。

2、表达目的基因的重组菌

将上述重组载体p35S::LEAFY和重组载体p35S::NEEDLY分别采用冻融法转入农杆菌GV3101，在含有卡那霉素(50mg/L)、利福平(50mg/L)的固体培养基28℃培养2天后，挑选单克隆菌株，分别进行PCR检验。

检测含有重组载体p35S::LEAFY的重组菌的引物如下：

检测PtLEAFY基因的引物：

PtLEAFY-F ATGGATCCTGAAAGCTTTTCTGCAG

PtLEAFY-R TTATAGATGGGACTGCTTACTTTTC；

扩增的PCR产物片段大小1236bp的重组菌，命名为GV3101/p35S::LEAFY。

检测含有重组载体p35S::NEEDLY的重组菌的引物如下：

检测PtNEEDLY基因的引物：

PtNEEDLY-F ATGGATGCAGAGCACTTTCCTGTAG

PtNEEDLY-R CTATTGACACTCTTTGCTTCTCTCC；

扩增的PCR产物片段大小1215bp的重组菌，命名为GV3101/p35S::NEEDLY。

3、渗透缓冲溶液的制备

将GV3101/p35S::LEAFY和GV3101/p35S::NEEDLY菌液分别加入到含50mg/L卡那霉素与50mg/L利福平抗生素的YEB溶液中，200rpm 28℃过夜培养，然后把菌液进行5000g离心10min，收集沉淀的菌体；

将菌体用缓冲液(10mM MES pH 5.6，100μM Acetosyringone，10mM MgCl₂，0.005％Tween 20)洗脱2次。5000g离心10min收集菌体，再用缓冲液重悬浮OD₆₀₀＝0.3，23℃避光静置3小时，待用，得到待侵染GV3101/p35S::LEAFY菌液和待侵染GV3101/p35S::NEEDLY菌液。

4、农杆菌介导侵染

取继代培养10-15天长势良好乳白色的油松下胚轴愈伤组织，分别将其浸泡在上述2得到的待侵染GV3101/p35S::LEAFY菌液和待侵染GV3101/p35S::NEEDLY菌液中10-15min，得到侵染后愈伤组织；

再将共培养后愈伤组织置于含筛选抗生素的培养基中，黑暗条件下继续培养3天，得到p35S::LEAFY转染后的愈伤组织和p35S::NEEDLY转染后的愈伤组织，实现瞬时转化和表达。

将空载体pBI121-A采用同样的方法转入下胚轴愈伤组织，得到pBI121-A转染后的愈伤组织作为对照。

5、转基因愈伤组织RNA-seq测序

将p35S::LEAFY转染后的愈伤组织和p35S::NEEDLY转染后的愈伤组织，分别收集到无菌的离心管中，置于液氮中快速冷却，提取总RNA,，反转录得到cDNA进行建库，然后RNA-seq测序。

以pBI121-A转染后的愈伤组织作对照。

结果如图4所示，RPKM代表每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数，CK1和CK2均为是pBI121-A转染后的愈伤组织，PtLEAFY为p35S::LEAFY转染后的愈伤组织，PtNEEDLY为p35S::NEEDLY转染后的愈伤组织；可以看出，p35S::NEEDLY转染后的愈伤组织的PtNEEDLY基因表达量是pBI121-A转染后的愈伤组织的149.5倍；p35S::LEAFY转染后的愈伤组织中PtLEAFY基因表达量比pBI121-A转染后的愈伤组织的PtLEAFY基因表达量上升了47.2倍，可以得出转基因后目的基因的表达量有很大的提高，为在油松基因在愈伤组织中本体表达及油松重要基因的功能分析提供了可行的方法。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京林业大学

<120> 一种油松愈伤组织瞬时表达基因功能鉴定方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1236

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggatcctg aaagcttttc tgcagctttc ttcaagtggg accagagacc gcctgctctt 60

gcgcccccac aaatgcagag gagtgcagga ttggaagctc agcgtatttt ccatgacttc 120

ggtgttccaa atgcagctgc catggcagct tccaataaca gcagcagttg caggaaggaa 180

ttgaactgcc tggaggagct cttcaggaat tacggcgtga gatacataac gctgaccaaa 240

atggtggaca tggggttcac tgtgaacaca ttggttaata tgactgaaca agagctggat 300

gatctagtca ggacccttgt tgagatatac cgtgttgagc tcctggttgg ggagaaatat 360

ggaattaaat ctgcaatcag agcagaaaag agaaggttgg aagaagcaga aaggaaaagg 420

atggaacaac tctttgttga tgttgatgga aaacgcaaga ttgatgagaa tgcacttgac 480

acactatctc aggaaggctt gtcagtagaa gagcctcaag gagataatgc tataattctt 540

tcacaaaata atacatcagc aaactttcct ctaaacctaa atgcaggcat ggatccagtg 600

cttattctcc aaaacagtgg ccacctaggg actactgtca gtgggcttat tggaatgcct 660

gacactaact atggaagcga acagacaaag gcttgcaaaa aacagaaaag aagacgttcc 720

aaggattcag gagaagatgg tgaagaaaga cagagagaac atcctttcat tgttactgag 780

cccggtgaac ttgcaagagg gaaaaagaat gggttagact atctctttga tctttatgaa 840

cagtgcggga aatttctgct ggatgtgcaa catattgcga aggagagggg agaaaaatgt 900

cctacgaagg taacaaatca agtatttcga catgcgaagc attcaggcgc aggttatatc 960

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gtgtttaaca agcatgaaaa actgcgaatt tggtatgttc ccacaaaatt acgtcagctc 1200

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gaagtcattc ttcccatgaa tgggagaaag gatttgaagt cccttgaaga tctgtttaaa 180

gagtatggag ttcgatacgt aactcttgcc aagatgaccg agatgggctt cactgccaac 240

acccttgtca atatgacaga ggaagagatt gaagatttga tgaagaccct ggtagaactc 300

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Claims

1.一种制备油松愈伤组织的方法，包括如下步骤：以油松下胚轴为外植体，将所述外植体在诱导培养基中诱导培养，得到油松愈伤组织；

所述诱导培养基含有1-2mg/L2,4-D和1-1.5mg/L 6-BA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将所述油松愈伤组织在继代培养基中继代培养，扩繁愈伤组织；

所述继代培养基含有1.13-2.13mg/L 6-BA和2.21-2.5mg/L2,4-D。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述诱导培养基由1-2mg/L 2,4-D、1-3mg/L 6-BA、3-4g/L植物凝胶、20-30g/L蔗糖、4-5g/L MS固体培养基和水组成；

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述诱导培养的条件为24±1℃、暗培养、30-50天；

5.由权利要求1-4中任一所述的方法制备的油松愈伤组织在转染目的基因中的应用；

或，由权利要求1-4中任一所述的方法制备的油松愈伤组织在瞬时表达目的基因中的应用；

或，由权利要求1-4中任一所述的方法制备的油松愈伤组织在鉴定瞬时表达目的基因功能中的应用。

6.一种向油松愈伤组织中瞬时转染目的基因的方法，包括如下步骤：

1)按照权利要求1-4中任一所述的方法制备的油松愈伤组织；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述将目的基因转入所述油松愈伤组织中的方法包括如下步骤：

a)制备表达目的基因的重组农杆菌；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述表达目的基因的重组载体为将目的基因替换双元表达载体的酶切位点间的DNA片段，得到的载体；

和/或，所述双元表达载体具体为pBI121或pBI121-A；

和/或，所述pBI121-A为在pBI121载体上的GUS报告基因后插入4个双拷贝酶切识别位点的载体；

所述含筛选抗生素的培养基由4.19g/L SH培养基、1.13-2mg/L 6-BA、2.21-3mg/L 2,4-D、20-30g/L蔗糖、3-4g/L植物凝胶、300-500mg/L特美汀、30-50mg/L卡那霉素和水组成。

9.一种油松愈伤组织瞬时表达目的基因功能鉴定体系，包括权利要求1-4中任一所述的方法中的诱导培养基、继代培养基和油松下胚轴；以及，权利要求6-8中任一所述的方法中的共培养培养基和含筛选抗生素的培养基。

10.根据权利要求5所述应用或权利要求6-8任一所述方法或权利要求9所述的体系，其特征在于：所述目的基因为油松自身基因或模式基因。