JPH01500718A - ブラッシカの種における形質転換及び外来遺伝子の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２、前記ＤＮＡがオープンリーディングフレームである、請求の範囲第１項に記 載の細胞。

３、　前記オープンリーディングフレームが前記細胞に表現型性質を特徴する請 求の範囲第１項に記載の細胞。

４、前記造成物が少なくとも１個のＴ　−ＤＮＡボーダーを含んで成る、請求の 範囲第１項に記載の細胞。

５、前記ブラフシカがナプス（止り旦Ω−又はカンペストリス（９シｅ　ｓ　ｔ 　ｒ　ｉ　ｓ　）である、請求の範囲第１項に記載の細胞。

６、前記転写開始領域がカリフラワーモザイクウィルスの３５３領域である、請 求の範囲第１項に記載の細胞。

７、　ブラフシカの細胞を形質転換してブラフシカ植物を製造する方法であって 、 ブラフシカの細胞を、転写カセットと少なくとも右Ｔ−ＤＮＡボーダー、及びマ ーカーを含有する細胞の選択を提供するマーカーとをインビトロ連結することに より得られる挿入配列を含んで成るプラスミドを含んで成るＡ、ツメファシェン スと共に同時培養し、これによって前記ブラフシカ細胞が前記挿入配列によって 形質転換され、この配列が植物細胞ゲノムに導入され； 前記形質転換されたブラフシカの細胞を、少なくとも１種類のオーキシンを含有 しそして前記マーカーを含んで成る細胞に対して選択的なカルス誘導培地に移し て、前記形質転換された細胞からカルスを生成せしめ；前記カルスを、約２％未 満のシュークロース又はカロリ。

−が同等の有機物を含有する再生培地に移して芽（ｓｈｏｏｔ）を生成せしめ； そして 前記芽を生育培地に移して植物を生成せしめる；ことを含んで成る方法。

８、前記ブラフシカの細胞が胚軸の細胞である、請求の範囲第７項に記載の方法 。

９、前記胚軸の細胞が茎のセグメントの形である、請求の範囲第８項に記載の方 法。

１０、前記カルス誘導培地がサイトカイニンを含有しない、請求の範囲第７項に 記載の方法。

１１．前記再生培地が約１％のシュークロースを含有する請求の範囲第７項に記 載の方法。

１２、前記Ａ、ツメファシェンスが非武装株である請求の範囲第７項に記載の方 法。

１３、前記カルス誘導培地が約１■／ｌのオーキシン、及び約Ｏ〜１■／１のサ イトカイニンを有し、そして前記再生培地が約１％のシュークロースを特徴する 請求の範囲第７項に記載の方法。

１４、前記ブラフシカがカンペストリス又はナプス種である、請求の範囲第７項 に記載の方法。

１５、請求の範囲第１項に記載の細胞を含んで成るブラフシカ植物。

１６、前記ブラフシカがカンペストリス又はナプス種である、請求の範囲第１５ 項に記載のブラフシカ植物。

１７、請求の範囲第１項に記載の細胞の細胞培養物。

１８、前記培養物が選択剤を特徴する請求の範囲第１７項に記載の細胞の細胞培 養物。

１９、請求の範囲第７項に記載の方法により製造される植物。

２０、前記転写カセットがカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターを 含んで成る、請求の範囲第１９項に記載の植物。

明　細　書 ブラフシカの種における形質転換 及び外来遺伝子の発現 矢′　への宙　な舌 本出願は１９８６年３月２９日に出願された出願番号Ｎ１８６Ｂ、６４０の部分 ｍ続出側であり、そして引用によりこの明細書に組み入れる。

主」ＬΔｊＬ景 主更夏公国 この発明はアグロバクテリウム（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を基礎とする遺 伝的形質転換によるブラフシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）における遺伝子型及び関連 する表現型の改良方法に関する。

宜−量 ブラッシカエ（Ｂｒａｓｓ　１ｃｅａｅ）類の十字架植物の種は蛋白質、油、調 味料及び化学飼料の資源として広く使用されている。

常用の植物育種により栽培ブランシカの種の品質を改良するためにかなりの努力 が行われ、そして多数の大きな成功が報告されている。しかしながら常用の植物 育種法はブラフシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）層の構成員から同じ属の他の構成員へ の遺伝子及び形質の移行、及び少数の顕著な例における他の害接に関連する属か らの“広域交配（ｗｉｄｅ　ｃｒｏｓｓｅｓ）”に限定される。

ブラフシカの種に外来遺伝子を導入するための方法の開発はブラフシカの油種及 び野菜に付与し得る形質の範囲を一般に拡大するであろう。

有用な遺伝子をブラフシカの種に導入するための確実な系を得るために多くの障 害が克服されなければならない。これらには標的組織の全体植物への再生の最適 化、ブラフシカの細胞とアグロバクテリウム−値１１脂四士■カシ）細胞との同 時培養のための条件（例えば、時間、細菌濃度、及び培地）の特定、遺伝子移行 のためのブラフシカについて適当な毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）のアグロバクテ リウムの株の発見、形質転換された組織での外来遺伝子の発現を確実にするため の適当な制御配列（プロモーター）の同定、及び形質転換体の同定を可能にする 選択マーカーの発現を包含する。

翫゛車　の　′　な蕾己　− ブラフシカの種は組織外植体（ｔｉｓｓｕｅ　ｅｘｐｌａｎｔ）からの再生のた めに広範に研究されている。ブラフシカ・ナブス（紅と胚山１旦…蛙及びブラフ シカ・オリラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｍ１１１−ｃｅａ）の両者は、胚軸（Ｍ 、Ｆ、Ｄｉｅｔｅｒｔ等、Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔ−ｔｅｒｓ（１ ９８２）２６：２３３　２４０）　、葉カルス（Ｇ、Ｒ，Ｓｔｒｉｎｇｈａｍ、 　Ｚ。

並び記載及び茎プロトプラスト（１，、Ｃ，Ｌｉ及び）１．Ｗ、Ｋｏｈｌｅｎｂ ａｃｈ。

Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ　ｏｒｔｓ（１９８２）上：　２０９−２１１　； 　Ｋ、Ｇｌｉｍｅｌｉｕｓ、ハＬｓｉｏ１．　Ｐｌａｎｔ、　（１９８４）６１ 　：　３８　４４）を包含する種々の組織からの芽の再生を示す。さらに、Ｒａ ｄｋｅ等、Ｃｒｕｃｉｆｅｒ　ＧｅｎｅｔｉｃｓＷｏｒｋｓｈｏｐ、Ｇｕｅｌｐ ｈ＋１９８６年６月２９日によるポスターを参照のこと。

ブラフシカの形質転換のためのベクターとしてのアグロバクテリウムの適切さは 、ブラフシカの幾つかの種〔ナプス７）　、オレラセア（ｏｌｅｒａｃｅａ）　 、ニグラ（ｉ及びカンヘストリス（組肛且江ｎ）を包含する〕がアグロバクテリ ウムに対して感受性であることを示すＤｅＣｌｅｅｎｅ及びＤｅＬｅｙ（Ｂｏｔ ａｎｉｃａｌ　Ｒｅｖ、　（１９７６）４２　：　３８６−４６６）による宿主 域の研究により示唆されている。

組織外植体を用いる植物の形質転換のためのアグロバクテリウム・ツメファシェ ンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の（１９８３） ３０３　：　２０９２１３）　、Ｆｒａｌｅｙ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　（ｔ９８３）８０　：　４８０３−４８０７）　、及びＢｅｖａｎ等［ Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０４　：　１８４−１８７）を参照のこと。植物に おけるキメラ遺伝子の発現を指令するためのカリフラワーモザイクウィルスから の３５３プロモーターの使用が報告されている（Ｃ，に、Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ等 、■組圏■（１９８５）　１４０　：　２８１−２８８　、及びＲ，Ｃ３Ｇａｒ ｄｎｅｒ等、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　（１９８６）　６ 　：　２２１　２２８を参照のこと〕。

光里二目！ 安定な発現が可能な新規なヌクレオチド構成を含有する形質転換されたブラフシ カ植物及び組織が提供される。形質転換技法は、形質転換の頻度、標的組織の回 復、及び形質転換された組織からの植物の再生を最適化するように計画される。

望ましい形質転換されたブラフシカ植物を得るためのこの発明の好ましい技法は アグロバクテリウム・ツメファシェンスの株（ブラフシカに対する毒性を有する ）の使用、通常より低い炭素Ｂ、（２％以下のシュークロース又は同等のカロリ ー値）を含有する選択過程の培地の使用、効果的なプロモーターの使用、及び標 的組織としての胚軸の使用を含む。この技法は、形質転換頻度及び標的Ｍｉ織の 回収を助けるためにタバコ懸濁細胞のフィーダー細胞を使用する。

凹皿■呈見鼠に班 第１図は細胞蛋白質のポリアクリルアミドゲル電気泳動により形成されたオート ラジオグラフィーマツプであって、γ−３２Ｐ−ラベル化＾ＴＰを用いるカナマ イシンのＡＴＰ介在リン酸化の存在を示すことにより、選択培地上で増殖する形 質転換された細胞におけるネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の存 在を示すものである： レーン１．２．３及び４　：　Ａ２８１Ｘ２００アグロバクテリウム・ツメファ シェンスにより形質転換されたブラフシカ・ナプスｃｖ　Ｗｅｓｔｅｒ紺織； レーン５及び６　：　Ｋ１２Ｘ１００アグロバクテリウム・ツメファシェンスに より形質転換されたブランシカ・ナプスｃｖ　Ｗｅｓｔｅｒ組織； レーン７：形質転換されていないブラフシカ組織の陰性対照； レーン８：細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性（陽性対照）。

第２図は、形質転換されたブラフシカ組織及び非形質転換ブラッシカ組織のカナ マイシンに対する感受性を示すグラフ第３図は、ｐＴｉＡ６　Ｔ−ＤＮＡのマツ プ、及びｐＴｉＫ６１への経路である。

特淀！」■１因匠虹 典型的には葉及び胚軸外植体（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ　ｅｘｐｌａｎｔ）を用いる 、ブラフシカ・ナプスの細胞への新規なヌクレオチド造成物の導入を含む新規な 方法及び生成物が提供され、この場合、植物の形質転換された細胞は前記造成物 中に存在するｌ又は複数の遺伝子を発現せしめ、植物のための少なくとも１つの 新規な性質、特に表現型性質を提供する。

効率的な頻度の形質転換、標的組織の回収、及び形質転換された組織からの植物 の再生のために多くの工程段階が用いられる。最初の段階はブラフシカの効率的 な形質転換をもたラスアグロバクテリウム・ツメファシェンスの選択である。

次の段階において、少量のみの炭素源材料（２％未満のシュークロース又はこれ に相当するカロリー値）を含有する選択培地及び再生培地が用いられる。使用さ れる造成物はブラフシカにおいて効率よく機能する転写開示領域を含有すべきで ある。形質転換のための植物細胞源は好ましくは胚軸に由来する。

アグロバクテリウムの ブランシカの種に遺伝物質を移行せしめることができるアグロバクテリウムの多 くの株のいずれもこの発明の他の変法と組合わせて使用することができるが、特 に改良された形質転換、回収、及び再生は、アグロバクテリウム・ツメファシェ ンスＡ２８１　、　ＥＨＡＩＯＩ、及びに６１株、並びにこれらの株と共通の特 徴を共有する他の株を用いることにより達成され得る。

好ましいプラスミド（後で詳細に記載する）を含有するこれらの細菌株は、アメ リカン・タイプ・カルチュア・コレクション、ロックビル、マリ−ランドに寄託 されており、そしてＡＴＣＣ寄託番号、Ａ、ツメファシェンスＡ２８１　（ｐｃ ＧＮ２００）　ＡＴＣＣ隘６７１２１　、　Ａ、ツメファシェンス（Ｋ６１）Ａ ＴＣＣ寛　が認められた。

異るＴｉ−プラスミドを有するアグロバクテリウム・ツメファシェンスの多くの 株、例えばアグロピン（■ユ旦匹）又はツバリン（７）特異的なもの、が開発さ れている。

武装された（ａｒｍｅｄ）プラスミド及び非武装（ｄｉｓａｒｍｅｄ）プラスミ ドの両者が用いられ、すなわち、武装されたプラスミドは植物細胞に移送され得 る腫瘍原性（ｏｎｃｏｇｅｎ　ｉｅ）　Ｔ　−ＤＮＡを含有し、そして非武装プ ラスミドは植物細胞に移送され得る腫瘍原性Ｔ　−ＤＮＡを含有しない。菌株は 、アグロバクテリウム・ツメファシェンスＡ２８１株、ＥＨＡＩＯＩ株及びに６ １株を包含する。

Ｂｏ３４２株からのＴｉ−プラスミドを含有するアグロバクテリウムＡ２８１は 次の特性：バイオタイプ（ｂｉｏｔｙｐｅ）　１、アグロピン・シンサーゼ及び アグロピン分解陽性、並びに３−ケトラクトース陽性、を有する。この武装され た株は、野性型Ｂｏ３４２とＡｌ３６株、すなわちそのＴｉ−プラスミドが除去 されそしてリファンピシン及びナリジキシン酸に対して耐性にされたＣ５８ツバ リン株誘導体とのイン・ブランク（順１セユ垣）接合により造成された（Ｅ、） ｆｏｏｄ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　（１９８４）２　：　７０２−７０８　 ；　Ｄ、５ｃｉａｋｙ等、Ｐｌａｓｍｉｄ　（１９７８）上：２３８−２５３） 　、無傷のｖｉｒ刊域及びＴ　−ＤＮＡ領域を含有する毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃ ｅ）プラスミドｐＴｉＢｏ５４２は２４９ＫＤである。

ＥＨＡＩＯＩ株は）ｆｏｏｄ等、ム奸」肛旦亘虱並■（１９８６）　１６８　： 　１２６１−１３０１中に記載されている。

ＫＳＩ株は、広宿主域複製系ｐＶＫ１０２　（Ｋｎａｕｆ’及びＮｅ５ｔｅｒ。

Ｐｌａｌｓｍｉｄ（１９８２）８　：４５　５４）並びにｐＴｉ８６の左及び右 Ｔ−ＤＮＡボーダーを含有するｐＣＧＮ５６７とのトリパルタイト交配（ｔｒｉ ｐａｒｔｉｔｅ　ｍａｔｉｎｇ）によりアグロバクテリウムに１２株から誘導さ れる。

ｐＴｉＡ　５を含有するアグロバクテリウムＡ３４８　（Ｇａｒｆｆｎｋｅｌ等 、（旦（１９８１）釘：　１４３−１５３）がＡ１１４又はＮ７１株に形質転換 され、そしてＢＴＢ培地（）１ｏｏｙｋａａｓ等、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ、　（１９７９）　１１０：９９−１０９）上でオクトピン分解について選 択された得られた株かに１２と命名された。

形質転換系として使用されるべきアグロバクテリウムは、Ｅ、コリ　（Ｅ、　ｃ ｏｌｉ）からアグロバクテリウムにＤＮＡを移送することができる広宿主域プラ スミドにより便利に形質転換される。これは、Ｐ−１不和合性（ｉｎｃｏ＋ｎｐ ａｔｉｂｉｌｉｔｙ）プラスミドレブリコン、例えばＲＫ２、及びＥ、コリにお いて多数コピー、通常Ｅ、コリにおいて少なくとも５コピー、好ましくは少なく とも１０コピー、そして２００コピーまでをもたらすことができるプラスミドレ プリコンを手にすることにより達成される。

広宿主域プラスミドは、少なくとも１個のＴ　−ＤＮＡボーダー配列、特に右ボ ーダー配列を有することにより、又は植物種ゲノムに組み込まれることが意図さ れる種々の造成物によって１方向に分離されている両ボーダー配列を有すること により特徴付けられる。上に示したように、アグロバクテリウムの株は非武装Ｔ ｉ−プラスミド又はＲｉ−プラスミドのいずれかを有することができる。プラス ミド９ＣＧＮ２００はＡ、ツメファシェンスに形質転換しそしてカナマイシン耐 性により検出することができる。次に、植物細胞がＡ、ツメファシェンス形質転 換体と共に同時形質転換され、増殖し、そして殺生物剤に対する耐性及び目的遺 伝子の発現について選択され、そしてサザンプロット及びウェスタンプロット、 イムノアッセイ等によりモニターされ得る。マーカーとして特に興味のあるのは 、形質転換された植物種が効率的に選択され得るように、植物細胞及び植物に殺 生物剤耐性を付与するマーカーである。

艮ｌ五換灰 形質転換される植物細胞は培養物中の細胞、カルス中の非組織化塊として存在す る細胞、葉外植体として組織化された細胞、芽培養物、種子、果実、葉、根、又 は全体植物として組織化された細胞であることができる。胚軸片の使用により増 強された形質転換及び回収率が得られるので、形質転換された植物細胞を形成す るための標的細胞として胚軸片が特に好ましい。胚軸は植物の胚子の子葉下の軸 又は茎の部分である。

アグロバクテリウムの株はプラスミド（Ｔｉ−プラスミド又は広宿主域プラスミ ドのいずれか）上に、植物細胞に形質転換されることが予定されている外来造成 物を含むであろう。

この様な移行の結果として、外来造成物は通常、形質転換及び再生の後植物組織 のすべての又は実質上すべての細胞中に存在するであろうが、しかしながら発現 は特定の細胞又は植物の発達の特定の段階に限定されるであろう、外来造成物は 転写及び翻訳開始及び終止シグナルを含有し、開始シグナルは注目の遺伝子の５ ′側にそして終止シグナルは注目の遺伝子の３′側に、転写の方向に存在するで あろう。

ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（プロモーター）を含む転写開始領域は植物宿主に とって本来的なものでもよく、又は該領域がブラッシカ宿主において機能的であ れば他の源に由来することもできる。広範囲の種類の転写開始領域を使用するこ とができ、これにはブラッシカにとって又は特定のブラッシカの種、例えばナプ スｍ旦）にとって同種性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）、あるいはプラッシカにとっ て異種性の（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）　、すなわちブラッシカの種の細胞以外の細 胞源からのそれが包含される。この様な転写開始領域源は他の植物種、植物ウィ ルス、細菌プラスミド、例えばＴｉ−又はＲｉ−プラスミド、特に植物細胞中で 機能的なＴ　−ＤＮＡ遺伝子を包含する。転写開始シグナルは構成的（ｃｏｎｓ ｔｉｔｕｔｉｖｅ）でも制御可能（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）でもよい。制御可 能な遺伝子は、光及び熱のごとき物理的シグナル、代謝産物のごとき化学的シグ ナル、又は細胞分化シグナル、例えば根特異的シグナル、種子特異的シグナル等 、あるいはストレス−関連シグナル等を包含する外的シグナルにより制御可能な ものであることができる。好ましいプロモーター領域はカリフラワーモザイクウ ィルスからの３５３プロモーターである。このプロモーターはよく知られている が、しかしブラッシカと共に今まで使用されていない。

３′終止領域は、転写開始領域と同一の又は異る遺伝子に由来することができる 。例えば、注目の遺伝子がブラッシカの種子で機能する転写終止領域を有する場 合、この領域を前記遺伝子と共に残すことができる。

転写開始領域、該転写開始領域の転写制御のちとにある注目の遺伝子、開始コド ン、遺伝子（イントロンを伴うか又は伴わない）コード配列、及び翻訳終止コド ンを含有し、そしてこれに続いて転写終止領域（これはターミネータ−を含有す るであろうし、そしてポリアゾニレ−ジョンシグナル配列及び転写終止に関連す る他の配列を含有することができる）を含有するであろう発現カセットを造成す ることができる。

方向は転写の方向において５’−３’である。このカセットは通常約１０ＫＤ未 満であり、しばしば約６ＫＤ未満であり、通常約ＩＫＤ以上、より普通には２Ｋ Ｄ以上である。

注目の遺伝子は染色体遺伝子、ｃＤＮＡ、合成遺伝子、又はこれらの組合わせに 由来することができる。この遺伝子の発現生成物が細胞質以外に位置すべき場合 、遺伝子は通常、オルガネラ（例えば葉緑体、ミトコンドリア又は核）又は細胞 質膜であることができる特定の部位への生成物のトランスロケーションをもたら す特定のアミノ酸配列を含有するように、あるいは生成物が細胞のペリプラズム 空間に外部環境に分泌され得るように構成される。種々の分泌リーダー、膜結合 配列、及びペプチド発現生成物を特定の部位に向けるためのトランスロケーショ ン配列（トランシフトペプチド）が文献に記載されている。例えば、Ｃａｓｈｍ ｏｒｅ等、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　（１９８５）３　：　８０３−８０８、 Ｗｉｃｋｎｅｒ及びＬｏｂｉｓｈ、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）２３０　：４ ００−４０７を参照のこと。

ブラッシカの種において使用するための注目の遺伝子は広範囲の種類の表現型特 性及び非表現型特性を含有する。表現型特性は特に、ストレス、例えば熱及び塩 分から生ずる脱水に対する抵抗性、昆虫、除草剤、毒性金属又は徽良金属に対す る抵抗性、並びにこれらに類似する性質を提供する酵素である。抵抗性は、標的 部位の変化、宿主細胞中の標的蛋白質の量の増強、宿主をストレスに対して保護 する生成物への生合成経路に関与する１又は複数の酵素の増加、等の結果として であることができる。遺伝子は、細胞、真菌（例えば酵母）、ウィルス、植物又 は哺乳類を包含するがこれらに限定されない原核生物又は真核生物から得ること ができ、あるいは全体的に又は部分的に合成することができる。遺伝子の例には グリホセート耐性３−エノールピルビルオスホシキメートシンサーゼ遺伝子、ニ トリラーゼ遺伝子、プロリン及びグルタミン生合成経路中の遺伝子、及びメタロ チオネインが含まれる。

注目の他の遺伝子は、生育の制御、例えば水源／下水（ｓｏｕｒｃｅ／５ｉｎｋ ）　（炭素分配）関係の操作、ホルモン制御；除草荊、例えばフエンメディファ ム（ｐｈｅｎｍｅｄ　ｉｐｈａｍ）に対する耐性；雄性不稔の生成；光合成効率 の制御、例えばＲｕＢＰカルボキシラーゼの効率の変化；植物の味及び栄養価の 品質の管理；油又は蛋白質の状態、収量又は品質の変化；あるいは特定の不所望 の代謝産物、例えばゲルコシル−ト類又は非常に長い鎖の脂肪酸、例えばＣ２２ 脂肪酸の減少、に関与するものであることができる。

発現力セントに代えて転写カセットを手にすることができ、この場合生産される ＲＮＡ配列は内因性転写生成物に対して相補的である。相補的又はアンチ−セン ス配列はオーブンリーディングフレーム、あるいは非コード領域、例えばイント ロン又は５′−非コードリーダー配列に対するものであることができる。この場 合、種々の同種性生成物の発現が調節され得る。

１個又は複数個のカセットが関与することができ、この場合、カセットは、相互 に独立に生成物を発現せしめることができるか又は連係して制御される得る独立 した遺伝子の発現のためにタンデム配置で使用されることができ、生成物は独立 して、又は関連して作用し得る。

発現カセットがアグロバクテリウムにより植物細胞中に形質転換されるべきであ る場合、このカセットは右Ｔ　−ＤＮＡボーダー及び場合によっては左Ｔ　−Ｄ ＮＡボーダーに接しているであろう。これらのボーダーは任意のＴｉ−又はＲｉ −プラスミ〆　ドから得ることができ、そして常用手段により発現カセットに連 結され得る。発現カセットはＴｉ−又はＲｉ−プラスミド以外のプラスミドから 直接移行される様に、あるいは相同性組換を介してＴｉ−又はＲｉ−プラスミド のＴ　−ＤＮＡ領域に組込まれるように構成することができる。すなわち、発現 カセットは該発現カセットの一方の又は両方のボーダーにＴｉ−又はＲｉ−プラ スミドのＴ　−ＤＮＡ中に存在する配列と相同なりＮＡ配列を有することができ る。

発現カセットは少なくとも１個の複製系を有するベクター上に担持されるであろ う。便宜上、Ｅ、コリにおいて機能する複製系、例えば凪Ｅｌ　、　ｐｓｃｌｏ ｌ　、　ｐＡｃＹｃ１８４等を有するのが一般的である。この様にして、各操作 の後の各段階において、得られた生成物をクローン化し、そして配列決定し、そ して操作の正しさを決定することができる。Ｅ、コリ複製系に加えて又はこれに 代えて、広宿主域複製系、例えばＰ−１不和合性プラスミド、例えばｐＲＫ２９ ０を使用することができる。これらのプラスミドは特に、植物種宿主にＴ　−Ｄ ＮＡを移送するために武装された又は非武装Ｔｉ−プラスミドと共に用いて効果 的である。

複製系に加えて、１又は複数の宿主中で有用な少な（とも１個のマーカー、又は 個々の宿主のための異るマーカーがしばしば存在するであろう、すなわち、１つ のマーカーが原核性宿主中での選択のために使用され、他方他のマーカーが真核 性宿主、特に植物種宿主での選択のために使用されるであろう。マーカーは殺生 物剤、例えば抗生物質、毒素、重金属等に対する保護であることができ、あるい は栄養要求性宿主に原栄養性を付与する補完により機能することができる。使用 され得る種々の遺伝子にはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ 　ｉ　ＡＰＨｎとしても知られる）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラー ゼ（）ＩＰＴ）　、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ ）　、ニトリラーゼ、及びケンタマイシン耐性の遺伝子であることができる。植 物宿主の選択のためには、特に興味あるマーカーにはカナマイシン耐性又はＧ４ １８耐性を提供するＮＰＴｎｉハイグロマイシン耐性を提供するＨＰＴ　、クロ ラムフェニコール耐性を提供するＣＡＴ　；グリホセート耐性を提供する変異し たＡｒｏＡ遺伝子；等が包含される。

種々の造成物、発現力セント、マーカー等を含んで成る種々の断片を、適切な複 製系の制限酵素開裂及び利用可能な部位への特定の造成物又は断片の導入により 引き続き導入することができる。連結及びクローニングの後、ベクターを単離し てさらに操作することができる。これらの技法のすべては文献に詳細に例示され ており、そして具体的な例示がＭａｎｉａ〜ｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　コールドスプリングハーバ−１ ＮＹ、１９Ｂ２に例示されている。

一旦ベクターが完成すれば、今や造成物は植物細胞中に導入され得る。植物細胞 を形質転換する技法にはマイクロインジェクション、ポリエチレングリコールを 用いる直接ＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション、ウィルス感染、及びアグ ロバクテリウムによる形質転換が含まれる。この発明に従えば、アグロバクテリ ウムを用いてブラフシカ細胞を形質転換するための機能的方法が開発された。こ の発明は効率的な方法で外来遺伝子により植物種を形質転換する方法を提供し、 こうして効率的で再現性ある態様で植物細胞を形質転換しそして再生するための 迅速な技法を提供する。

儂煎則崖− 従来技術はブランシカが多くの植物組織から再生され得ることを教示しているが 、胚軸が最大効率の形質転換をもたらすことが見出された。他の植物部分、例え ば葉外植体をこの発明の選択及び再生培地と組み合わせて使用することができる 。しかしながら、胚軸組織の使用がこの発明の好ましい態様を代表する。

ブラフシカの胚軸の分離源として好ましくは無菌種子が使用される。３週間経過 した植物からの表面殺菌された葉片又はブラフシカ・ナプスｃｖ　Ｗｅｓｔｅｒ の無菌生育した胚軸の両者が容易に再生する。これらの外植体の切断された表面 は理想的なアグロバクテリウムの標的を提供する。

本発明の実施において任意のブラフシカの種、例えばＢ、ナプス（菜種及びカブ ハボタン）、Ｂ、オレラセア（Ｂ、　ｏｌｅｒａｃｅａｅ）（キャベツ、ブロッ コリ、芽キャベツ及び他のオレラセアの２種）　、Ｂ、シュンセア（Ｂ、　垣赳 並）（インドヵラシ）、Ｂ、カンヘストリス（Ｂ　、　組並組扛亘）　（カブラ ナ）、等を用いることができる。

形　転　のフィーダー細胞の　用 形質転換過程においてフィーダー細胞を使用することができる。フィーダープレ ートの細胞はブラフシカ外植体のための保護培養物（ｎｕｒｓｅ　ｃｕｌｔｕｒ ｅ）として、及び形質転換率の効率の増強のために機能する。一般に、操作が容 易であるためにタバコフィーダー細胞が使用される。他のフィーダー細胞、特に 微細懸濁液の形態のブラフシカのフィーダー細胞を使用（Ｇａｍｂｏｒｇ）　、 ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）及びオジマ塩（Ｂ５塩）　（Ｇａｍｂｏｒｇ等、Ｅｘｐ 、Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、　（１９６８）５０　：　１５１−１５８を参照のこと） 、炭素源、例えばシュークロース（３％）、及び適当量の増殖物質、すなわちオ ーキシン、例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）　、カイネチ ン及びビタミン類（例えばチアミン）を含有し、そして５〜６、好ましくは約５ ．５に適当に緩衝化されている軟寒天培地上に、植物懸濁培養物〔例えば、０． ２■／ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及び０．１■／！のカイネチンが補 充されたムラシゲ最少有機培地（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ、）中で増殖したニコチアナ （Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）の細胞を用いることにより調製される。２．４−Ｄ及び カイネチンの濃度は１■／βである。ビタミン類及び補充物の最終濃度は次の通 りである：イノシトール（１００■／２）、ニコチン酸（１■／ｌ）、ピリドキ シンＨＣＣ（１■／り、チアミンＨＣｌ（１０■／ｌ＞。好ましくは、フィーダ ープレートは使用に先立って、通用、使用される２４〜４８時間前に調製される 。

フィーダープレートに多孔性カバーをかけることによりフィーダー細胞がブラフ シカの葉又は芽外植体と接触するのを防止する。この多孔性カバーは外植体が条 件化培地に浸たるのを許容する。これは無菌濾紙ディスクを用いることにより容 易に達成され得る。次に、外植片を前インキュベートし、そして組み込み（ｉｎ ｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のための造成物を含有しそして造成物を植物細胞に移行せ しめる遺伝的能力を有するアグロバクテリウムの株の液体培養物に移す。一般に 、細菌数は約１０’〜１０’／ｍｌ（最終濃度）である。細菌液体培養物、例え ばＭＧ／Ｌ　（ＬＢＭＧと同じ；　Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ、　（１９８０）１４４　；　７３２−７４３）中での細菌との接触時間は 好ましくは約３０分間〜１時間であり、但しより長いか又は短い時間を用いるこ とができる。次に、外植片を細胞溶液から移し、過剰の表面液を除去し、そして 切片をフィーダープレートにもどす。フィーダープレート上での細菌同時培養は １２時間以上３日間以下であり、平均１〜２日間である。

這択及グ再生迭 ブラフシカの細胞と形質転換用細菌との同時培養に続く再生処理の間の低炭素源 培地の使用が増強された回収及び再生をもたらすことが見出された。低炭素源培 地は、２重量％未満のシュークロースを含有するか又はカロリー値において２重 量％未満のシュークロース溶液と同等の培地である。他の炭素源（例えば、モノ −又はジ−サツカライド）が同じカロリー値をもたらすのであれば、それらは同 様の効果をもたらすことができる。再生培地のため、サイトカイニンと組合わせ て典型的な塩及びビタミン混合物が使用される。

前記の細菌との１〜２日間の同時培養の後、外植体は典型的にはブラフシカのカ ルス培地（これは、好ましくはＢ５塩及びビタミン、１ｒｄ／ｌの２．４−Ｄ及 びカイネチン、３％のシュークロースを含有する）に移される。サイトカイニン が排除され、そしてそれらの不存在が再生頻度を増強する。カルス形成培地は殺 菌前、例えばカルベニシリン（５００■／ｉ）を含有し、そして選択剤が適用さ れる。例えば、カナマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラー ゼＮＰＴ■）を選択マーカーとして使用する場合、約１０〜２００■／ｌの濃度 のカナマイシンが培地に含められよう。選択のための典型的な濃度は１０〜５０ ■／ｌであり、但し幾らかの形質転換体は２００■／２のカナマイシンに耐性で あろう。組織はこの培地上で１〜３週間、好ましくは約７日間生育する。

この時間の後、カルス化外植体はブラフシカ再生培地に移される。この培地は、 ガンボーグ、ミラー及びオジマＢ５塩、及び下記のビタミン、１％シュークロー ス、３−ベンジルアデニン（３ｍｇ／ｆ）、ゼアチン（ｚｅａｔｉｎ）　（１ｍ ｇ／／！　）　、０．６％精製寒天（Ｐｈｙｔａｇｂｒ）ビブコ、及び５００■ ／！のカルベニシリンを含有する。この段階で選択剤を適用することができる。

処理及び同時培養条件に依存して約３〜６週間以内に芽の形成が始まる。やはり 潜在的に再生可能であるカナマイシン耐性カルスが同様の時間内に生育する。再 生体及び形質転換されたカルスが取り出され、そして規則的に（−週間ごとに） 、すぐ上に記載した他の成分を含有する新鮮なり５培地に移される。規則的な移 行を行わない場合、形質転換体のロス及び見かけ形質転換率の低下が生ずる。

前記のブラフシカの形質転換及び再生系は迅速でありそして効率的であることが 見出された。十分な比率の同時培養外植体が形質転換され、ブラフシカを形質転 換するための経済的な系が提供される。

次の例は限定的ではなく例示的に与えられる。

ｐＲＫ２９０タイプのレプリコンを含有する二元ベクターのための宿主として、 Ｅ、コリｌ’１Ｍ２９４株（Ｈａｎａｈａｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　（１９ ８３）遷玉：　５５７−５８０）を使用した。Ｋ１２株は、ｐＴｉ八６へＡ１１ ４（ＮＴＩ）株（Ｎｅｓｔｅｒ及びにｏｓｕｇｅ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　（１９８１）３５　：　５３１　；Ｈｏｅｋｅｍａ等、Ｎａｔｕ ｒｅ（１９８３）３０３　：　１７９）に形質転換することにより生成した。ア グロバクテリウムＡ２８１株は野性型Ｂｏ３４２をＡ１３６株（Ｄ、５ｃｉａｋ ｙ等、Ｐｒａｓｍｉｄ　（１９７８）土：２３８−２５３）と接合せしめること により生成した。アグロバクテリウムＥＨＡＩＯＩ株はＨｏｏｄ等、Ｊ、ｏｆ　 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ　（１９８６）１６８　：　１２９１−１３０　、により 記載されている。

Ｅ、コリと共に使用される抗生物質のレベルはカナマイシンでは３０■／Ｉ！、 クロラムフェニコールでは５０ｏｖ／β、ペニシリンでは３００■／７！、テト ラサイクリンでは１０■／１、そしてゲンタマイシンでは２０■／ｌである。特 にことわらない限り、アグロバクテリウムと共に使用される抗生物質のレベルは カナマイシン又はゲンタマイシンでは１００■／β、そしてカルベニシリン又は クロラムフェニコールについては５０■／！である。

天ＭＸｔ眠順 制限酵素及びＴ４リガーゼは商業的提供者から得、そして製造者の推奨に従って 使用した。クローニング及び分子分析の標準的方法はＭａｎｉａｔｉｓ等、前掲 、に記載されているようにして行った。

これらの方法において使用される培地の名称は次の通りである。

Ｂ５培地はＧａｍｂｏｒｇ、　Ｍｉ　１ｌｅｒ及びＯｊｉｍａ、Ｅｘ　、Ｃｅ１ ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ硫酸アンモニウム　１３４．０ 硼酸　３．０ 塩化カルシウム　１５０．０ 塩化第一コバルト　０．０２５ 硫酸第二＆ＰｌＯ，０２５ 硫酸第一鉄　２７．８ 硫酸マグネシウム　２５０．０ 硫酸マンガン　１０．０ ヨウ化カリウム　０．７５ 硝酸カリウム　２５００．０ エチレンジアミン四酢酸ナトリウム　３７．３モリブデン酸ナトリウム　０．２ ５ リン酸二水素ナトリウム　１５０．０ 硫酸亜鉛　２．０ 特にことわらない限り、Ｂ５培地は３％（重量／容量）シュークロースを含有す る。

Ｂ５ビタミン　び　工ｌＬ ミオ−イノシトール　１００．０ ニコチン酸　１．０ ピリドキシンＨ（Ｊ　１．０ チアミンＨＣｊｌ！　１０．０ 名称Ｂ５０／１／１はＢ５培地、３％のシュークロース、１■／２の２．４−Ｄ 、１■／ｌのカイネチンを意味し、そして名称Ｂ５０／Ｉ１０は前記と同じであ るがカイネチンが含まれないことを意味する。生育物質濃度は／（スラッシュ） 表示により表わし、３種類の生育物質の濃度が■／ｌで示される。

これらの順序はインドール−３−酢酸／２．４−Ｄ／カイネチンである。

名称Ｂ５ＢＺ　１％は、Ｂ５塩、ビタミン及び補充物＋１％（−／ν）シューク ロース、３■／ｌペンジルアデミン及び１■／ｉゼインを意味する。８５Ｂ２１ ％はここではブラッシカの組織のカナマイシン耐性のための再生及び選択培地と して使用される。

ＡＰＨＩＩ　（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等、Ｎｏ１．Ｇｅｎ、　（１９７９）１７ユ ：６５〕のための完全な構造遺伝子を含有するＴｎ５の旦ＬＬＩ［−３ｍａｌ断 片をｐＵｃ８　（Ｖｉｅｉｒａ及びＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ（１９８２）旦： 　２５９）にクローン化し、ＳｍａＩ部位にすぐ隣接して旦ｃｏＲ１部位が存在 するため、前記断片が旦１ｎｄｎｌ一旦ｃｏＲＩ断片に転換した。次に、ＡＰＨ ｎ遺伝子の３′部分を含有するＰｓｔｌ一旦ｃｏＲＩ断片を、イシン耐性を付与 しないため、ＡＰＨＩｆ遺伝子の旦しＩＩ　−Ｐ　ｓ　ｔＩ断片を旦ａｍＨＩ　 −Ｐｓｔ　Ｉ部位に挿入することによりカナマイシン耐性を得た（ｐＣＧＮ５４ ６Ｘ）。この方法はＡＰＨＩＩ遺伝子を再構成し、旦ｃｏＲＩ部位が該遺伝子を 挟む。１個のＡＴＧコドンが、ＡＰ）ｌ　ＩｆのＡＴＧ開始コドンを伴うリーデ ィングフレームの外側でその上流に存在した。この不所望のＡＴＧは、余分なＡ ＴＧを欠＜　ＡＰ）ＩＩＩの５′−末端からの５ａｕＩ［Ｉ　Ａ　−Ｐｓｔ　Ｉ 断片をｐＣＧＮ５４６ＷのＢａｍＨＩ　−Ｐｓｔ　１部位に挿入してプラスミド ｐｃＧＮ５５０を得ることにより除去された。

次に、ＡＰＩ（ｎ遺伝子（Ｉ　ＡＴＧ）を含有する旦ｃｏＲＩ断片を、発現用オ クトビンシンサーゼカセットを含有するｐｃＧＮ４５１のユニーク足並Ｒ１部位 にクローン化してｐＣＧＮ５５２　（ＩＡＴＰ）を得た。

プラスミドｐｃＧＮ４５１　は、オクトビンカセットを含み、このカセットはｐ ＴｉＡ　６のオクトビンシンサーゼ遺伝子の３′非コード領域に旦ｃｏＲＩリン カ−を介して融合した５′非コード領域の約１５５６ｂｐを含有する。Ｂａｒｋ ｅｒ等、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

（１９８３）　２　：　３２５により定義されたように、ｐＴｉの座標は、３′ 領域については１１，２０７〜１２，８２３であり、そして５′領域については １３，６４３〜１５，２０８である。

５′断片を次のようにして得た。コード領域の５′末端を含有する小さなサブク ローニングされた断片をＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩ断片としてｐＢＲ３２２にク ローン化しプラスミドｐＣＧＮ４０７とした。旦ａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩ断片は コード領域中に１個のＸｍｎ１部位を有し、他方ｐＢＲ３２２は２個のＸｍｎＩ を有する。

ｐｃＧＮ４０７をＸμＵで消化し、Ｂａ１３１ヌクレアーゼで削り取り、そして 断片に旦ｃｏＲＩリンカ−を付加した。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化の後、断 片をサイズ分画し、両分をクローン化しそして配列決定した。１つの場合、完全 なコード領域及び１０ｂｐの５′非翻訳配列が除去され、５′非転写領域、ｍＲ ＮＡキャップ部位、及び１６ｂｐの５′非翻訳領域（ＢａｍＨＩ部位まで）が無 傷のまま残った。この小断片は、７％アクリルアミドゲル上でのサイズ画分及び 約１３０ｂｐの長さの断片の溶出により得られた。このサイズ分画されたＤＮＡ をＭ１３ｍｐ９に連結し、そして幾つかのクローンを配列決定し、そしてその配 列をオクトピンシンサーゼ遺伝子の既知の配列と比較した。Ｍ１３造成物をｐＩ ４と命名し、このプラスミドをＢａｍＨＩ及び旦ｃｏＲ■により消化して小断片 を得、これをｐＴｉＡ　６　（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ及びＮｅ５ｔｅｒ、　Ｊ、Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９８０）１４４　：　７３２）からの上流５′配列を含 有するＸｈｏｌ一旦ａｍＨＩ断片に、及び３′配列を含有する旦ｃｏＲＩ　−Ｘ ｈｏ　Ｉ断片に連結した。生ずる又ｈｏｌ断片をＸｈｏｌ断片をｐＣＧＮ４２６ と称するｐＵＣ８誘導体のＸｈｏＩ部位にクローン化した。このプラスミドは、 ＤＮＡポリメラーゼＩによりフィルインされた唯一のＥｃｏＲＩ部位を有するこ と、及びｐｔｌｃ８のユニークＨｉｎｃ［部位にＸｈｏｌリンカ−が挿入された 場合Ｈ４ｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼの汚染によりＰｓｔｌ及びＨｉｎｄＩ ［１部位を失っていることによりｐＵＣ８と異る。生ずるプラスミドｐｃＧＮ４ ５１は、５′非コード領域（これは、Ｔ　−ＤＮＡの右ボーダーを含む１　、５ ５０ｂｐの５′非転写領域、ｍＲＮＡキャップ部位、及び１６ｂｐの５′非翻訳 配列を含有する）と３′領域（これは、２７６ｂｐのコード領域、終止コドン、 １９６ｂｐの３′非翻訳ＤＮＡ　、ポリＡ部位、及び１，１５３ｂｐの３′非転 写部位を含有する）と間に蛋白質コード配列の挿入のための単一の１匹Ｒ１部位 を有する。

適切な方向にｏｃｓ５　’及びｏｃｓ３　’を有する得られるプラスミドｐｃＧ Ｎ４５１を旦ｃｏＲＩにより消化し、そして無傷のカナマイシン耐性遺伝子を含 有するｐｃＧＮ４５１からのＥｃｏＲＩ断片を旦ｃｏＲ１部位に挿入して、適切 な方向にカナマイシン耐性遺伝子を有するｐＣＧＮ５５２を得た。

このｏｃｓ／ＫＡＮ遺伝子を用いて、タランスー型二元ベクター　ｐＣＧＮ５８ ７のための選択マーカーを得た。

操作されたオクトピンシンサーゼプロモーターカセットの５′部位は、１５２０ Ｂ−１３６４４（Ｂａｒｋｅｒ等、前掲、におけるＢａｒｋｅｒの番号付与）に おけるＸαす断片からのＴｉＡＤ　ＤＮＡから成り、これはまたＴ　−ＤＮＡ移 行に関与するＴ　−ＤＮＡ境界配列（ボーダー）を含有する。プラスミドｐＣＧ Ｎ５８７において、ｐＣＧＮ５５２からのｏｃｓ／ＫＡＮ遺伝子が選択マーカー 及び右ボーダーを提供する。左ボーダー領域を且１ｎｄｎ［一旦ｃｏＲＩ断片か らに凱■一旦飴ＲＩ断片としてｐＣＧＮ５６５中に再クローン化してｐＣＧＮ５ ８０を得る。ｐＣＧＮ５６５はｐＵｃ８−　Ｃｍに基礎を置くがしかしｐＵｃ１ ８リンカ−を含有するクローニングベクターである。ｐｃＧＮ５８０を１吐ＨＩ により線状化し、これを用いてｐＶｃＫ１０２　（Ｋｎａｕｆ及びＮｅ５ｔｅｒ 、Ｐｌａｓｍｉｄ　（１９８２）　８　：　４５）の小さい方の且旺Ｉ［断片を 置換してｐＣＧＮ５８５を生じせしめた。ｐＣＧＮ５８５の小さい方の５刀ｊ断 片をｏｃｓ／ＫＡＮ遺伝子を含有するｐＣＧＮ５５２からのＸｈｏＩ断片で置き 換えることにより、ｐｃｃＮ５８７が得られた。

−〆μり甜Ｗｊ１衣 ＣａＭＶ　（３５Ｓ）からの成長プロモーター及び選択マーカーとしてのカナマ イシン遺伝子を含有するプラスミドｐｃＧＮ２００を造成するため、ｐｃＧＮ１ ６７を二元ベクターｐＣＧＮ５７８に再連結した。

ｐｃＧＮ１６７を造成するため、Ｃａｌ’ｌＶの人１ｕＩ断片（７１４４−７７ ３５ｂｐ）　（Ｒ，Ｇａｒｄｎｅｒ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　（１９ ８１）　９　：　２８７１−２８８８）をＡｌｕｌにより消化により得、そして Ｍ１３ｍｐ７　（Ｖｉｅｉｒａ等、銃匣（１９８２）耳し２５９〕の且１ｎｃＩ Ｉ部位にクローン化してＣ６１４を生成せしめた。Ｃ６１４のＥｃｏＲＩ消化に より３５Ｓプロモーターを含有するＣ６１４からのＥｃｏＲＩ断片を生じさせ、 これをｐＵｃ８　（Ｖｉｅｉｒａ等、Ｇｅｎｅ（１９８２）１９　：　２５９） の旦ｃｏＲ１部位にクローン化してｐｃＧＮ１４６を生成せしめた。

プロモーター領域を切り整えるため、旦れ■部位（ｂｐ７６７０）をＩｎ及び１ 虹３１により処理し、そして次に１社３１で処理されたＤＮＡに旦ｄｎリンカ− を付加してｐｃＧＮ１４７を得た。

ｐＣＧＮ５２８　（下記参照のこと）を扛■で消化しそしてｐｃＧ１４７からの Ｂ　ａｍ　ＨＩ　−旦しＩ［プロモーター断片を挿入することにより、プロモー ター領域、選択マーカー（２個のＡＴＧを有するＫＡＮ）及び３′領域を含有す るｐｃＧＮ１４８ａを調製した。この断片をｐＣＧＮ５２８のＨａ部位にクロー ン化してｆｉ［Ｉ［部位がｐｃｃＮ５２８のカナマイシン遺伝子に近くなるよう にした。

この造成のために使用したシャトルベクターｐＣＧ５２８は次の様にして作った 。カナマイシン遺伝子を担持するＩｎ５を含有するプラスミド（Ｊｏｒｇｅｎｓ ｏｎ等、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　（１９７９）１７７　：　６５）を且１ｎｄｌ［［ 一旦ａｍＨＩで消化し、そしてカナマイシン遺伝子を含有する且ｆｎｄＩ［［− ＢａｍＨＩ断片をｐＡｃＹｃ１８４　（Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ、Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、（１９７８）１３４：１１４１　１１５６）のテトラサイタリフ 遺伝子中のＨｉｎｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩ部位に挿入することによりｐＣＧＮ５２ ５を調製した。ｐＴｉＡ　６　（Ｔｈｏｍａｓｈａ−等、む土１　（１９８０） 月１７２９−７３９）の旦憇Ｈ１断片をｐＣＧＮ５２５の旦憇ＨＩ部位に挿入す ることによりｐＣＧＮ５２６を調製した。ＸｈｏＩにより消化しそして再連結す ることによりｐＣＧＮ５２６から小ＸｈｏＩ断片を除去することによりｐＣＧＮ ５２Ｂを得た。

ｐＭＢ９ＫａｎＸＸＩからのＢａｍＨＩ−カナマイシン遺伝子断片をｐｃＧＮ１ ４８ａのＢａｍＨ１部位にクローン化することによりｐＣＧＮ１４９ａを調製し た。

ｐＭＢ９ＫａｎＸＸＩはｐＵＣ４にの変形体（Ｖｉｅｉｒａ及びＭｅｓｓｉｎｇ 、Ｇｅｎｅ（１９８２）　１９　：　２５９−２６８）であって、このものは止 ｌを欠いているがＴｎ９０３からの機能的カナマイシン遺伝子を含有し、アグロ バクテリウムでの効率的な選択を可能にする。

ｐｃＧＮ１４９ａをｑｎ及びＩＩで消化した。ｐｃＧＮ１４９ａのこの小ｌ１１ −盈ｐｉｔ断片を、１憇Ｈ１及びＩＩによる消化によって単離された旧（下記参 照のこと）からの旦ａｍＨＩ−３ｐｈｌ断片で置き換えた。こうして、全長Ｃａ ＭＶプロモーター、１個のＡＴＧを有するカナマイシン遺伝子、３′末端、及び 細菌Ｔｎ９０３−型カナマイシン遺伝子を含有する造成物ｐｃＧＮ１６７を得た 。ＭｌはｐＣＧＮ５４６Ｘ　（ｐＣＧＮ５８７の造成を参照のこと）からのＥｃ ｏＲＩ断片であり、これをＭ１３Ｊ）９のＥｃｏＲＩクローニング部位にクロー ン化して、１個のＡＴＧを有するカナマイシン遺伝子中のＰｓｔＩ部位がＭ１３ ｍｐ９のポリリンカー領域に近くなるようにした。

二元ベクターｐＣＧＮ５８７を含有するＥ、コリＣ２１１０（史」Ａ１）株をｐ ｃＧＮ１６５で形質転換することによりｐｃＧＮ２００を調製した。

ｐｃＧＮ１６７をインビドで組み換えてｐｃＧＮ２００を作った。直接ＤＮＡ相 同の２個の領域が存在し、これによって組換が起こり得たのであろう。この場合 、ｐｃＧＮ１６７及びｐＣＧＮ５８７により担持されたｐＵＣ複製開始点で組換 が起った。カナマイシン耐性により組換体を選択した（ｄｅＦｒｏｍａｒｄ等、 Ｂｉｏｔａｃｈｎｏｌｏｇｙ＋１９８３年５月、２６２−２６７頁〕。

ｐｃＧＮ２００を交配（ｍａｔｉｎｇ）によりアグロバクテリウム・ツメファシ ェンスＡ２８１及びに１２に導入した。細菌交配は２種類のＥ、コリ株及び１種 類のアグロバクテリウム株を用いて行った。

一方のＥ、コリ株（ＭＭ２９４）はｐＲＫ２０７３を担持し、動員機能を提供し 、そして他方の株（Ｃ２１１０）はアグロバクテリウムに移送されるべきカナマ イシン耐性を伴うプラスミドを担持する。

２種類のＥ、コリ株をＬＢ液体培地中で振とうしながら３７℃にて一夜増殖せし めた。アグロバクテリウム株はＭＧ／Ｌ培地中２８℃にて一夜増殖せしめた。５ ０ｍずつの３つの株をニトロセルロースフィルター上で混合し、そしてＭＧ／Ｌ プレート上に置いた。プレートを２８℃にて３日間インキュベートした。次に、 混合物を、１００ｇ／−のカナマイシン及び１００ｉ／’−のストレプトマイシ ンが補充されたＡＢ最少培地（Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏ−ｖｅｒ、ＤＮＡＣＩｏｎｉｎ　 ＶｏｌｕｍｅｌＮ（１９８５）、７８頁〕上にストリークし２、そして２８°Ｃ にて２日間インキュベートした。２つのＥ、コリ株を殺すためにストレプトマイ シンを含めた。単コロニーを拾い上げ、上記培地上でのさらに２回のストリーキ ングにより精製した。

上−１ｕ（０遺戒 ＴｉプラスミドｐＴｉＡ　６をアグロバクテリウムＡ３４８株（Ｇａｒｆｉ−ｎ ｋｅｌ等、と旦（１９８１）２７　：　１４３−１５３）から単離し、そし７て これを用いてアグロバクテリウムＡ１１４株（ＮＴ　ｌとも称される）（Ｃｕｒ ｒｉｅｒ及びＮｅ５ｔｅｒ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９７６）　１２ ６　：　１５７−１６５）を形質転換した。ＢＴＢ培地（Ｈｏｏｙｋａａｓ等、 Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

（１９７９）　１１１　：　９９−１０９１上でオクトビン異化作用について選 択した。この株をに１２と命名した。

ｐＴｉＡ６の右Ｔ　−ＤＮＡボーダー領域（Ｂａｒｋｅｒ等、前掲、の番号付与 系によるｂｐ　６０２　２２１２）を士、ｎｄＵＴ−３，！ＡＩ断片とし７てフ ァージベクターＭ１３ｍｐ９　（ｐｃＧＮ５０１）中にクローン化した。

Ｍ１３ｍｐ９リンカ−構造が旦１ｎｄｎｌ−Ｅ匹Ｒ１断片としてこの断片を提供 する。ｐＴｉＡ６の右Ｔ　−ＤＮＡポ・−ダー領域＜ｂｐ１３３６２−１５２０ ８、８ａｒｋｅｒ等、前掲）を旦ｃｏＲＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片として、酵素足並 ＲＩ及び５ａｌＩにより切断したＭ１３ｍｐυ中にサブクローン化した（ｐｃＧ Ｎ５０２）。次Ｇコ、この断片をＥｃｏＲＩ　−、Ｈｉｎ　ｄ　ｍ断片として切 り出すことかできた。プラスミドｐｃＧＮ５０１及びｐｃＧＮ５０２をＨｉｎｄ ｎｌ及び旦ｃｏＲＩで消化し、そしてあらかじめＨｉｎｄＩＩＩのみで切断され たｐＵＣ８に連結した。白色のペニシリン耐性コロニーの選択が、天然の方向に ｐＴｔＡ　６の左及び右Ｔ　−ＤＮＡボーダーを含有する３、５ｋｂｐ旦１ｎｄ ＤＩ断片を存するｐＵＣ８（ｐｃＧＮ５０３）を含有する単離体をもたらした。

次に、Ｔ−ＤＮＡボーダーを含有するこの３．５ｋｂｐ且ハ、ｄＩ［［断片をｐ ＶＫ１０２のＨ４ｎｄｎ［部位に移行せしめた。この広宿主域クローニングベク ターｐＶＫ１０２（ｐＶＣＫ１０２とも称される）は記載されている（Ｋｎａｕ ｆ及びＮｅ５ｔｅｒ、Ｐｌａｓｍｉｄ（１９８２）　８　：　４５　５４）　、 　ｐＶＫ１０２ベクターに対するｐｃＧＮ５０６中のボーダー断片の方向は、左 Ｔ−ＤＮＡボーダー領域がテトラサイクリン耐性座に近い。ｐＣＧＮ５０６は左 及び右ボーダー領域の間にユニーク旦ｃｏＲ１部位及びユニークＢａｍＨＩ部位 を有し、すなわち、すべての挿入部は天然方向に方向付けられているであろう。

カナマイシン耐性決定基を担持するｐＵＣ４にの１憇ＨＩ断片をｐＣＧＮ５０６ の１憇ＨＩ部位に連結することによりプラスミドｐＣＧＮ５６７を造成した。従 って、ｐＣＧＮ５６７はテトラサイクリン及びカナマイシンの両耐性をコードす る。

最少培地上でのトランスコンシュガント（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）アグ ロバクテリウムについてカナマイシン選択を用いてトリパルタイト（ｔｒｉｐａ ｒｔｉ　ｔｅ）法［Ｄｉｔｔａ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＬＩＳＡ（１９８１）　７７　：　７３４７−７３５１３によりプラスミドｐＣ ＧＮ５６７をアグロバクテリウムに１２株に交配した。次に、プラスミドｐＰＨ ＩＪＩ〔Ｇａｒｆ　１ｎｋｅ１等、Ｃｅ１ｌ　（１９８１）２７　：　１４３− １５３）を有するＥ６コリをに１２（ｐＣＧＮ５６７）株と交配し、そしてトラ ンスコンシュガント。

アグロ・ダクテリウムをカナマイシン及びゲン′アマイ）：、、ｐ　：、／の両 者を含有する最少培地上で選択した。ｐｐ旧Ｊｌ及びｐＣＧＮ５６７は不和合性 プラスミドであるため、、Ｔ％−プラスミドとの相同の２つの直接領域間の二重 組換事象は、ボーダー領域間のすべての腫瘍原性遺伝子座とカナマイ・リン耐性 遺伝子座との交換をもたらすと予想された〔方法の説明についてはＧａｒｆｉｎ ｋｅｌ等、Ｃｅ１ｌ（１９８１）２７　：　１４３−１５３を参照のこと）。し かしながら、これは起こらなかった。ｐＰＨＩＪｌをＫ１２（ｐＣＧＮ５６７’ ）ζこ導入することにより生じたカナマイシン及びゲンタマイシン耐性アグロバ クテリウムは非常にｉ／″Ｄっくり増殖し、ｐＣＧＮ５６’？及びｐＰ）ＩＩＪ Ｉの両者は不安定な状態で存在し、不和合性問題のために個々の細菌が２つのプ ラスミドの１方を排除する傾向を有するためにコロ−＝−の見かげ上非常！、： Ｊい増殖が起こる。−夜培養において力ナマ・イシン鳴汀培地及びゲンタマイシ ン含有液体培地上での交互の増殖ｊ７こより、予想通りの増殖速度を有する単離 体を同定した。、て、の株からブラ”スミドＤＮＡを単離し、そしてこれを用い てＡ１１４株を形質転換し７、カナマイシン耐性について選択し、そし２てゲン タマイシン感受性について、１）マようじで拾い上げた。従って、アグロバクテ リウムの得られる株に６１はｐＰ＋１１．１１を久いブ、−０（（６１中の、− のプラスミド（ｐＴｉＫ６１）の、Ｓｍａ　Ｉ　、　ＭＰａ　Ｉ　、ＥｃｏＲＩ 及びΣ鮭■を用いる制限酵素分析は、ｐＴｉＡ６のｋｂｐ　１７３．３０−１８ １及び０．０　５３．３５　（Ｋｎａｕｆ及びＮｅ５ｔｅｒ、　Ｐｌａｓｍｉｄ −（１９８２）　８　：　４７３５４、の番号付与系を用いる〕に対応する配列 を欠＜Ｔｉ−プラスミドを示した。これは、ｐＴｉＡ６により通常コードされて いる形質である、オクトビンの利用を６１に１株が行うことができないことを説 明する。

すなわち、ｐＴｉＫ６１はｐＴｉＡ　６の自律的欠失を示し、この場合、左ボー ダーはなお存在するが、腫瘍遺伝子、右Ｔ　−ＤＮＡボーダー、Ｔｉ　ＤＮＡ？ ＋Ｊｉ域、及びオクトビン異化を含む他の座が欠けている。ｐＴｉＡ　６の囚工 領域をコードする領域、すなわち座標１１１−１６８（Ｋｎａｕｆ及びＮｅ５ｔ ｒ、前掲、の番号付与を用いる）は、ｐＴｉＫ６１中において無傷であり、これ は、腫瘍原性遺伝子又は機能的Ｔ　−ＤＮＡを欠くがしかし二元Ｔ　−ＤＮＡベ クターからのＴ　−ＤＮＡの移行を達成するのに必要な虫遺伝子を含有する非武 装Ｔｉ−プラスミドを示す。

−ＥＭＢＩ、４　（Ｆｉｓｅｈａｕｆ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　（１９８３ ）１７０　：　８２７−８４２）中にゲノムライブラリーを造成した。４Ｘ１０ ’個の組換体ファージをニックトランスレーションｐＮ１ナビンｃＤＮＡプロー ブ（Ｃｒｏｕｃｈ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　１．Ｇｅｎ、　（１９８３）　２　：　 ２７３−２８３）とのプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングし た際、λＢｎＮａ及びλＢｎＮｂと称する２個のユニークなナビンゲノムクロー ンが単離された。

ナピンゲノムクローンを制限ヌクレアーゼマツピング及びザザンブロットハイプ リダイゼーションにより分析した。各ファージはちょうど１個のナビン遺伝子を 含有し、そしてナビン遺伝子領域のみが胚ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡにハイ ブリダイズする。λＢｎＮａナピン遺伝子を含有する３、３ｋｂ　ＥｃｏＲ１断 片をｐＬｌｃ８（Ｖｅｉｅｒａ及びＭｅｓｓｉｎｇ、　１９８２）中でサブクロ ーニングし、そしてｐｇＮａと命名した。

約３２０ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ断片をｐｇＮａのＸｈｏＩ部位にクローン化し、ｐｇ Ｎａ中のナピンコード領域の終止コドンの後に“タッグとして細菌ＤＮＡ配列を 置＜　ｐｃＧＮ７１４を生成せしめた。この場合、細菌ＤＮＡ配列は、ジヒドロ フオレート・レダクターゼ（ＤＨＰＲ）遺伝子のコード領域を含有する５ａｌＩ 制限断片から成る。

３ｏｏｂｐのプロモーター及びナビンコード領域に続く約２１００ｂｐを伴うナ ミン遺伝子を含有するｐｇＮａ中のＥｃｏＲＩ断片はｐＣＧＮ７１４中で約３． ６ｋｂである。

ｐＵｃ１８　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅｎｅ（１９８５）３３　 ：　１０３）中の旦１ｎｄＩ［［一旦ｃｏＲＩセットのリンカ−をｐＵｃ１２ｃ ｍ　（Ｋｅｉｔｈ　Ｊ。

Ｂｕｃｋｌｅｙ、　Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ、　ＵＳＣＤ、　１９８５］中に移 行せしめることによりｐＣＧＮ５６５を生じさせた。これは基本的に、ｐＵｃ１ ２の青−白クローニング系及びクロラムフェニコール耐性に連結されたｐＵｃレ プリコンであるタッグされたナピン遺伝子を含有するｐｃＧＮ７１４の１赳Ｒ１ 断片をｐＣＧＮ５６５の足並ＲＩ部位に移行せしめてｐＣＧＮ７２３を得た。こ れはｐｃＧＮ７１４のペニシリン耐性ではなく、クロラムフェニコール耐性をコ ードする。ｐＵｃ８ｃｍ（Ｋｅｉｔｈ　Ｊ、Ｂｕｃｋｌｅｙ、Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅ ｓｉｓ、ＵＣ５Ｄ、１９８５）　のＨｉｎｄＩＩ［−１印Ｒ１リンカ−を１旦ｄ Ｉ［Ｉ−ＥｃｏＲＩで切断されたｐＥＭＢＬ１９　（Ｄｅｎｔｅ等、Ｎｕｃｌ、 　Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅ５（１９８３）１１　：　１６４５に移行せ軒めてｐｃＧＮ ７３０ａを作った。親ｐＥＭＢＬ１９と異り、ｐｃＧＮ７３０ａはすべての基１ ０部位を欠く。タッグを付されたナビン遺伝子を含有するｐＣＧＮ２３の旦ｃｏ ＲＩ断片をｐｃＧＮ７３０ａの旦ｃｏＲ１部位に移行せしめた。従って、ナビン 遺伝子中の５ｓｔＩ部位は得られるプラスミドｐＣＧＮ７３５中でユニークであ った。

２つの２７ｍａｒオリゴヌクレオチドを、アプライド・バイオシステムスＤＮＡ 合成機上で合成した。＃Ａは次の配列：Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−八−Ｔ− Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ，Ｔか ら成り、５’−３’の順序である。＃１３は次の配列：Ｇ−Ｃ−＾−Ｇ−Ｃ−＾ −Ｔ−Ｃ−八−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−ＣへＡ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ −Ｇ−Ｃ−Ｔ−から成る。これら２個のオリゴヌクレオチドは部分的に相補的で あり、アニーリングによりこれらは５ｓｔＩ部位にクローニングするのに適合性 の３′接種末端を残す。好ましい方向において、１個の挿入部は追加の９アミノ 酸のコードを加え、その内の５個はメチオニン残基である。オリゴヌクレオチド ＃Ａ及び＃Ｂのアニーリングにより生成した合成ｄｓＤＮＡをｐＣＧＮ７３５の ５ｓｔ１部位にクローン化した。オリゴヌクレオチドはリン酸化されていないた め、挿入部がｐＣＧＮ７３５の５ｓｔｌ末端に対して過剰であっても、唯一個の 要素が挿入されるであろう。このプラスミドｐＣＧＮ７５７の制限酵素分析は挿 入部が存在することを示した（このこと及び方向は後でＤＮＡ配列決定により確 認された）。ｐＣＧＮ７５７の１赳Ｒ１断片をｐＣＧＮ５６５に移行せしめ、プ ラスミドｐＣＧＮ７５７ｃが、）ＣＧＮ７５７のペニシリン耐性ではなくむしろ クロラムフェニコール耐性をコードするようにした。

ｐＰＨＩＪＩ　（Ｈｉｒｓｃｈ及びＢｅｒｉｎｇｅｒ、　Ｐｌａｓｍｉｄ　（１ ９８４）１２　：　１３９）の旦ｃｏＲＩ（ゲンタマイシン耐性をコードする） をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにより切断したｐＵＣ９にクローン化することにより ｐＣＧＮ５４９を作った。ｐＣＧＮ５８７を１旦ｄＩ［ｒ及び１旺■により切断 し、そして且１ｎｄｌＩ［及び旦ａｍＨＩにより切断されたｐＣＧＮ５４９と結 合せしめることによりｐＣＧＮ５９４を作った。これはｐＵＣレプリコン及びｐ ＣＧＮ５８７のクロラムフェニコールマーカーを細菌ゲンタマイシンマーカーに より置き換えた。ｐＣＧＮ５９４の且１ｎｄＩ［［一旦ａｍＨＩ断片をｐＵｃ１ ８の且１ｎｄｌＩ［一旦ａｍＨＩリンカ−と置き換えることによりｐＣＧＮ７３ ９を作った。これは、ｐＣＧＮ５９４の真核性選択マーカーを、他のタイプの選 択マーカーの挿入のための一連のユニーククローニング部位で効果的に置き換え た。ｐＣＧＮ９７６　（ｐｃＧＮ１６５からのＨｉｎｄ　Ｉ［［−ＢａｍＨＩ断 片を且１ｎｄＩ［Ｉ一旦ａｍＨＩ消化されたｐＵｃ１９に挿入して３５Ｓプロモ ーター、カナマイシン耐性及びｔｍ１３　’　領域を導入することによって得ら れた）の１旦ｄＩ［ｌ一旦憇Ｈ１断片を且ｉｎｄ■一旦ａｍＨＩにより切断され たｐＣＧＮ７３９に移行せしめることによりｐＣＧＮ７６９を作った。ｐＣＧＮ ７５７ｃを１旦ｄＩＩｒにより線状化し、そしてｐＣＧＮ７６３の且１ｎｄＩ［ １部位にクローン化して二元ベクターｐＣＧＮ７６７を生成せしめた。このベク ターは細菌ゲンタマイシン耐性マーカー、キメラ真核性カナマイシン耐性遺伝子 （ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター及びｐＴｉＡ６　Ｔ−ＤＮＡ　ｔｍ１転写終止 シグナルを伴う）、並びにｐＴｉＡ　６　Ｔ　−ＤＮＡボーダー間のタッグされ た操作されたナピン遺伝子を含有する。

■−ｌ ブラフシカの琺′− ブラフシカ・ナブスｃｖ　Ｗｅｓｔｅｒ（アグリカルチュアー・カナダ、サスカ トーン、カナダ〕の土壌生育した実生からの外植体を一次標的材料として使用し た。植物を、１８−８の光−暗サイクル、μＥ＋＋＋−”Ｓ−’で、２４℃にて ３〜４週間生育せしめた。部分的に拡大した二次葉を切り取り、１％次亜塩素酸 ナトリウム中で１５分間表面殺菌し、そして無菌水で４回洗浄した。

直径４ｎの葉ディスクを無菌葉からコルクポーラ−を用いて切り出した。これら のディスクを２４時間、２４℃にて暗中で、１■／ｌの２．４−Ｄ及び１■／ｌ のカイネチンを含存し０．６％の精製寒天（Ｐｈｙｔａｇａｒ）を用いて固化し たＢ５培地（ＫＣＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）　（Ｂ５０／　１　／　１）上で前 インキュベートした。

アグロバクテリウム・ツメファシェンスの単コロニーをインキュベートすること により、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ２８１１　Ｘ　２００株） を！’ＩＧ／Ｌ液体培地中液体及地中した。細菌を１６〜３８時間で収得した。

１０６〜１０７細菌／ｄの濃度への細菌の稀釈物を８５０／１／１液体培地中で 調製した。

葉外植体をアグロバクテリウム懸濁液中に浸漬することにより細菌を接種し、そ して次にこれらを無菌ペーパータオル上にかるくプロットした。次に、接種され た葉ディスクを０．１％ディフコＰｈｙｔａｇａｒを含むＢ５０／１／１培地の ベトリブレートにプレート当り２０デイスクの密度で移した。

細菌及び葉ディスクの同時インキュベーションを１２〜４８時間行った。この同 時培養段階の後、ディスクを液体Ｂ５０／１／ｌ培地中で洗浄し、そしてＢ５０ ／１／１及び５００■／ｌのカルベニシリン、０．６％ディフコＰｈｙｔａｇａ ｒを含むベトリブレートに移した。これらの外植体をこの培地上光（５０μＥｍ −”ｓ−’）中で７〜１０時間、カルス形成が明瞭になるまで培養した。

この時点で外植体を、ブラフシカ・ナプスＣνＷｅｓ　ｔｅｒの再生について最 適化された第二培地に移した。これはＢ５塩及びビタミン、３■／ｌのベンジル アデニン、１■／ｌのゼアチン、及び１％のシュークロースを含有した。これは ５００■／ｌのカルベニシリン及び５０■／ｌの硫酸カナマイシンが補充された 。この培地を０．７％のＰｈｙｔａｇａｒを用いて固化した。光照射条件（１６ −８の光−暗サイクル、２４℃、１００Ａ！Ｅｍ−”ｓ−’）下で、組織は緑色 カルスを発達させ始めた。非選択条件（硫酸カナマイシンを伴わない）で、この 培地上で多くの芽が形成され、増加しそして発根することができる。選択条件下 では緑のカルス及び芽の形成は明瞭であるが、しかし非常に少ない。

これらの選択条件下でカナマイシン耐性材料を温く好結果の形質転換事象が育ち そして頻度について評価され得る。−次選択圧がカナマイシン耐性についてであ って、栄養の消耗又は死組織から放出される阻害物質への不感受性についてでは ないことを確認するため、外植体を７〜１０日ごとに同じ培地に再プレートした 。

カナマイシン含有培地上で生育する芽及びカルスを、Ｒｅ１ｓｓ等、砂皿（１９ ８４）３０　：　２１１−２１８により記載されているアンセイ法を用いてネオ マイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現について試験することができる 。これは、バックグラウンド蛋白質から酵素を分離するためにポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を用いる。酵素活性を、その場で、γ−３２ｐ−ラベル化ＡＴＰ を用いるカナマイシンのＡＴＰ介在リン酸化により検出する０反応の生成物をＰ ８１イオン交換紙上にプロットし、次にこのイオン交換紙を１％ドデシル硫酸ナ トリウム中プロティナーゼＫ（１■／ｌｌ、シグマ・ケミカルス）により処理す る（６５℃にて４５分間）。この処理は、３２Ｐ−ラベル化量白質に関連する紙 上のバックグラウンド放射能の多くを除去する。この処理中、リン酸化カナマイ シンは損傷されないで残る。次に、この生成物をオートラジオグラフィーによっ て検出し、そしてシンチレーション計数によって定量することができる。形質転 換されたカナマイシン耐性ブラフシカ・ナブスの組織について行われたこの様な アッセイの例を第１図に示す。形質転換体の表現型はカナマイシン耐性である。

ブラフシカＡ２８１　Ｘ　２００形質転換体における耐性のレベルを第２図に示 す。

■一旦 フィーダー細胞層の存在下でアグロバクテリウム・ツメファシェンスを用いて形 質転換を行うことができる。これは、アグロバクテリウムで処理されたｍｉの回 収のため、及び形質転換活性を刺激するために有利である。この態様においては 、組織を例■に記載したようにして調製するが、しかし次に、アグロバクテリウ ムに浸漬しそしてプロットした後、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ 　ｔａｂａｃｕｍ）　（タバコ）の懸濁細胞のフィーダー細胞を含有するベトリ ブレートに移す。このフィーダープレートは、１．０−の定常状態タバコ懸濁培 養物を、１■／７！の２，４−Ｄ及びカイネチンを上記のビタミン類と共に含有 するＢ５培地にピペットで加えることにより調製する。培地を０．６％寒天を用 いて固化する。フィーダープレートは使用の２４〜４８時間前に作り、そして切 り取ったブラフシカの組織をフィーダープレート上でプレーインキュベートする ことができる。これは、フィーダープレート上に無菌のワットマン３ｎ濾紙を置 き、そしてアグロバクテリウム処理の２４時間前にその上に切取られたブラフシ カの組織を並べることにより行う。

アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ２８１　Ｘ　２００又は類似の株） に浸漬した後、ブラフシカの外植体をさらに２４〜４８時間フィーダープレート にもどす。この時間の後、これらを、寒天含有培地（０，６％）中に１■／ｌの カイネチン、１■／ｌの２．４−Ｄ及び５００■／ｌのカルベニシリンを含有す るＲ５培地に移す。他のすべての段階は例２記載したのと同この形質転換法はま た、葉外植体ではなく胚軸外植体にも効果的に適用することができる。胚軸外植 体の形質転換のためのすべての方法は葉ディスクについて前記したのと同一であ るが、しかしながら胚軸材料の調製方法は異る。

ブラフシカ・ナブスｃｖ　Ｗｅｓｔｅｒの種子を、５００−の無菌溶液当り２０ ０Ｉの“トウィーン２０″界面活性剤を含有する１％次亜塩素酸ナトリウム溶液 中で表面殺菌した。殺菌剤に２０分間浸漬した後、種子を無菌版留水で洗浄し、 そして生育物質を含有せずそして０．６％寒天により固化された、１／１０ｔｉ 度のＢ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇ、　Ｍｉｌ　Ｉｅｒ及びＯｊｉｍａ、Ｅｘ　ｅｒ ｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅυユ雇（１９６８）観：月江−１５８〕を収容する幅７１ 、長さ７０及び高さ１０ｃｍの無菌プラスチック箱（メガンタ）に植え付けた。

種子を発芽せしめ、そして２３℃〜２５℃にて、１６−８時間の光−暗サイクル で約１００　ｕ　Ｅｍ−”ｓ−’の光強度で生育せしめた。５日間の後、実生を 無菌条件下で取り出し、そして胚軸を切り取り、そして長さ約４鶴の片に切った 。次に、これらの胚軸セグメントを、例■において葉ディスク外植体に適用した のと同じすべての手順により処理した。

■−Ｍ ブラフシカ・ナブスｃｖ　Ｗｅｓｔｅｒの種子を９５％エタノールに４分間浸漬 した。これらを、１００−の無菌溶液当り５０ｉｔ１の“トウイーン２０”界面 活性剤を含む１％次亜塩素酸ナトリウムにより殺菌した。４５分間浸漬した後、 種子を無菌蒸留水により４回洗浄した。これらを、ピリドキシン＜５０ｎ／ｌ） 、ニコチン酸（５０ｐｇ／１２　）及びグリシン（２００ｘ／ｌ）が添加されそ して０．６％寒天により固化されたｌ／１ｏ濃度のＭＳ　（ムラシゲ最少有機培 地、ギブコ）５０−を収容する幅７０、長さ７ｃｍ及び高さＬｏａｎの無菌プラ スチック箱に植え付けた。種子を発芽せしめ、そして２２℃にて、１６−８時間 の光−暗サイクルで光強度約６５μＥｍ−”ｓ−’において生育せしめた。５時 間の後、実生を無菌条件下で取り出しそして胚軸を切り取り、そして長さ約４ｆ ｉの片に切断した。胚軸片を例■に記載したフィーダープレート上に、又はフィ ーダープレート無しで固化Ｂ５０／１／１培地上の濾紙の上に置いた。

これをアグロバクテリウム処理の２４時間前に行った。

アグロバクテリウムの単コロニーをＭＧ／Ｌ液体培地中で３０℃にてインキュベ ートすることによりアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ２８１　Ｘ　７ ６７株、及びＥＨＡＩＯＩ　ｘ　７６７株）を調製した。細菌を１６時間後に収 得し、そして−当り１０！細胞の稀釈物をＭＧ／Ｌ液体培地中に調製した。胚軸 のセグメントをアグロバクテリウム懸濁液に入れることにより細胞を接種し、そ して３０〜６０分間置き、次に取り出しそして前記の８５０／１／１培地を収容 するベトリブレートに移した。プレートを低光度のもとて２２℃にてインキュベ ートした。細胞と胚軸セグメントとの同時インキュベーションを２４〜４８時間 行った。胚軸セグメントを取り出し、そして５００■／ｉのカルベニシリン（こ のとき、１０　、２５又は５０■／！の硫酸カナマイシンを時には加えた）含有 するＢ５０／１／１上に７日間、連続光（約６５μＥｍ−”ｓ−’）のもとで２ ２°Ｃで置いた。これらを、例■に記載したように３■／ｌのＢＡＰ及び１■／ １のゼアチンを含有するＢ５培地に移した。これは５００■／１のカルベニシリ ン、１０　、２５又は５０■／ｌの硫酸カナマイシンを補充し、そして０．５％ のＰｈｙｔａｇａｒ（ギブコ）により固化した。

この後、外植体を２週間ごとに新鮮な培地に植した。

−ケガ後、カナマイシン含有培地上で選択された緑色カルスから芽が出現した。

芽は３ケ月間発達し続けた。芽がＩｃｍ以上の高さになった時カルスから切りと り、そして１％シュークロースを含み、添加された生育物質を含まず、３００■ ／ｌのカルベニシリンを含みそして０．６％Ｐｈｙｔａｇａｒにより固化された Ｂ５培地上に置いた。芽は生育を続け、そして数枚の葉を取ってネオマイシンホ スホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）活性について試験した。ＮＰＴ　Ｉ Ｉ活性陽性の芽を、１％シュークロース、２■／１インドール酪酸及び２００■ ／２カルベニシリンを含有しそして０．６％Ｐｈｙｔａｇａｒで固化されたＢ５ 培地を収容するマゲンタ（Ｍａｇｅｎｔａ）ボックスに入れた。数週間後、芽は 発根し、そしてこれを土壌に移した。植物を生育室中で２２℃にて、１６−８時 間の光−暗サイクルで光強度２２０μＥｍ−２ｓ−’にて育生せしめ、そして数 週間の後温室に移した。

葉を収穫し、液体窒素中で凍結し、そしてＤＮＡを挿出した（Ｄｅｌｌａｐｏｒ ｔａ等、ＰＩ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、Ｒｅ　ｏｒｔｅｒ（１９８３）土：　１ ９−２１３　。

サザン分析（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”ｓ コールド・スプリング・ハーバ−・プレス）は、Ｔ　−ＤＮＡの適切な組み込み （ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を確認した。

上記の方法を用いることにより、２％の胚軸セグメントがＮＴＰ　ＩＩ活性陽性 の芽を生成した。

１　１１５９　２％　１１５９　２％ ２　１１５７　２％ ３　１１５９　２％　１１５４　２％ ！／６２２％　１／６０　２％ １／６４　２％　１１５９　２％ ２１５８　３％　１／６０　２％ １１５８　２％　１１５９２％ ２／６１　３％　１１５９２％ 他の植物遺伝子を有する他の造成物を含有するアグロバクテリウムＥ）ＩＡ−１ ０１株及びに６１株と同時培養されたＢ、ナプス・カルチパルス（Ｂ、促ｌ臣ｃ ｕｌｔｉｖａｒｓ）　Ｗｅｓｔａｒ、Ｖｉｋｉｎｇ及びＢｒｉｄｇｅｒの胚軸セ グメントからもトランスジエニツク（ｔｒａｎｓ−ｇｅｎｉｃ）植物が得られた 。この系は異るアグロバクテリウム株、造成物、及びブラフシカ表現型を用いて 反復可能である。

■一旦 胚軸セグメントからの芽の発生頻度は、同時培養及びカルス形成培地からカイネ チンを除去する（Ｂ５０／１／１からＢ５０／Ｉ１０へ）ことにより少なくとも ２倍上昇した。

小なくとも１　の−を　する・軸　植　の、庁Ｉ　Ｗｅｓｔａｒ　１３／２２　 ５９％　３／２４　１２％２　讐ｅｓｔａｒ　１２／２０　６０％　２／２８　 ７％３　Ｗｅｓｔａｒ　１７／２３　７４％　３／２４　１２％４　Ｔｔ４ｅｓ ｔａｒ　２６／２９　９０％　１２／２８　４３％５　Ｖｉｋｉｎｇ　９５／１ ００９５％　５３／１０２５２％６　Ｂｒｉｄｇｅｒ　５８／１０１５７％　１ ３／７７　１７％この変化は、アグロバクテリウムが接種された胚軸外植体から 回収される形質転換された芽の数の増加をもたらす。

上記の結果が示すところによれば、ブラフシカの種は効率的に形質転換され得、 これによって外来遺伝子が植物ゲノムに組み込まれそして発現され、新しい表現 型性質をもたらすであろう。すなわち、ブラフシカの種は形質転換され得、そし て遺伝子を用いることが可能であることが示され、ここで形質転換された細胞は 植物に再生され、これは新しい表現型の発現をもたらす。高い形質転換効率によ り、合理的な時間内に、そして過度に反復的な手順を用いないで好結果の形質転 換が達成され得る。

前記のすべての特許、他の公表、及び特許出願はこの発明が属する技術分野にお ける技術を有する者の技術の例示である。他特許、他の公表及び特許出願は、各 特許、他の公表し、又は特許出願が引用により導入されることが個々に示されて いたかのごとく、同じ位置及び同じ程度に、引用により個々にこの明細書に導入 される。

前記の発明は理解を明瞭にするために説明及び例により幾分詳細に説明したが、 添付された請求の範囲内においである種の変化及び変法が実施され得ることは自 明である。

ＰＣＴ出願人のガイド　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｉ　−Ａｎｎｅｘ　Ｍ　３ＡＮＮＥＸＭ ３ 国際出願番号　隘：ＰＣＴ／　／ 手続補Ｊｆｉｔｃ方ｊ゛０ 昭和６３年、２月工／日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 工、事件の表示 ＰＣＴ／Ｕｉ　Ｓ　８７１０１２０５ ２、発明の名称 ブラッシ力の種における形質転換及び外来遺伝子の発現 ３　補正をずろ者 事件との関係　特許出願人 名称　カルジーン、インコーホレイティド４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１ｏ号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）委任状 （３）図面の翻訳文 ７、補正の内容 （１）　ｆ２）　別紙の通り （３）　図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５ 第１項の規定による書面　１通 （２）委任状及びその翻訳文　各１通 （３）浄書した図面の翻訳文　１通 国際調査報告 １１１１１ＭＭ１６ｆｉａｌ＾””””ＯＰ”Ｃｃ〒＃＋１Ｊ１７１０ｉ２ＯＳ １″１′””　”””””’　”ＰＣＴ／ＩＪＳ８７１０１２０５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも２個の断片のインビトロ連結により生ずるＤＮＡ造成物を有する 形質転換されたブラッシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種の細胞であって、該断片が ： （１）前記ブラッシカ中で機能する転写開始領域；（２）その５′末端に開始コ ドンを有するオープンリーディングフレームを含んで成るＤＮＡ配列又は同種性 転写生成物に相補的な配列； （３）前記ブラッシカ中で機能する転写終止領域；（４）Ｔ−ＤＮＡの右ボーダ ー； （５）前記ブラッシカ中で発現することができ形質転換されたブラッシカの細胞 の選択を提供する構造遺伝子；を含んで成り； ここで、前記断片が前記ブラッシカ細胞中で発現することができる発現カセット を提供する、 前記細胞。 ２．前記ＤＮＡがオープンリーディングフレームである、請求の範囲第１項に記 載の細胞。 ３．前記オープンリーディングフレームが前記細胞に表現型性質を付与する、請 求の範囲第１項に記載の細胞。 ４．前記造成物が少なくとも１個のＴ−ＤＮＡボーダーを含んで成る、請求の範 囲第１項に記載の細胞。 ５．前記ブラッシカがナプス（ｎａｐｕｓ）又はカンベストリス（ｃａｍｐｅｓ ｔｒｉｓ）である、請求の範囲第１項に記載の細胞。 ６．前記転写開始領域がカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ領域である、請 求の範囲第１項に記載の細胞。 ７．ブラッシカの細胞を形質転換してブラッシカ植物を製造する方法であって、 ブラッシカの細胞を、転写カセットと少なくとも右Ｔ−ＤＮＡボーダー、及びマ ーカーを含有する細胞の選択を提供するマーカーとをインビトロ連結することに より得られる挿入配列を含んで成るプラスミドを含んで成るＡ、ツメファシエン スと共に同時培養し、これによって前記ブラッシカ細胞が前記挿入配列によって 形質転換され、この配列が植物細胞ゲノムに導入され； 前記形質転換されたブラッシカの細胞を、少なくとも１種類のオーキシンを含有 しそして前記マーカーを含んで成る細胞に対して選択的なカルス誘導培地に移し て、前記形質転換された細胞からカルスを生成せしめ；前記カルスを、約２％未 満のシュークロース又はカロリーが同等の有機物を含有する再生培地に移して芽 （ｓｈｏｏｔ）を生成せしめ；そして 前記芽を生育培地に移して植物を生成せしめる；ことを含んで成る方法。 ８．前記ブラッシカの細胞が胚軸の細胞である、請求の範囲第７項に記載の方法 。 ９．前記胚軸の細胞が茎のセグメントの形である、請求の範囲第８項に記載の方 法。 １０．前記カルス誘導培地がサイトカイニンを含有しない、請求の範囲第７項に 記載の方法。 １１．前記再生培地が約１％のシュークロースを含有する請求の範囲第７項に記 載の方法。 １２．前記Ａ、ツメファシエンスが非武装株である請求の範囲第７項に記載の方 法。 １３．前記カルス誘導培地が約１ｍｇ／ｌのオーキシン、及び約０〜１ｍｇ／ｌ のサイトカイニンを有し、そして前記再生培地が約１％のシュークロースを含有 する、請求の範囲第７項に記載の方法。 １４．前記ブラッシカがカンベストリス又はナプス種である、請求の範囲第７項 に記載の方法。 １５．請求の範囲第１項に記載の細胞を含んで成るブラッシカ植物。 １６．前記ブラッシカがカンベストリス又はナプス種である、請求の範囲第１５ 項に記載のブラッシカ植物。 １７．請求の範囲第１項に記載の細胞の細胞培養物。 １８．前記培養物が選択剤を含有する、請求の範囲第１７項に記載の細胞の細胞 培養物。 １９．請求の範囲第７項に記載の方法により製造される植物。 ２０．前記転写カセットがカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを 含んで成る、請求の範囲第１９項に記載の植物。