EP0787196A1 - Dna-sequenzen und ihre verwendung - Google Patents

Dna-sequenzen und ihre verwendung

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Publication number
EP0787196A1
EP0787196A1 EP95938377A EP95938377A EP0787196A1 EP 0787196 A1 EP0787196 A1 EP 0787196A1 EP 95938377 A EP95938377 A EP 95938377A EP 95938377 A EP95938377 A EP 95938377A EP 0787196 A1 EP0787196 A1 EP 0787196A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna sequence
dna
plants
sequence
component
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP95938377A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rüdiger Hain
Regina Fischer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer CropScience AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Publication of EP0787196A1 publication Critical patent/EP0787196A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility

Definitions

  • the present invention relates to a new DNA sequence and its use for the transformation of vectors, host organisms and plants and for the production of new plants which are male-sterile and have a changed flower color.
  • male sterile plants play an important role in plant breeding, especially in hybrid breeding.
  • Various methods for the production of male-sterile plants have already become known, according to which, for example, targeted cell damage z. B. caused in the anthers, interventions in mitochondrial functions take place, with the help of antisense DNA sterilizing possibilities of action of chemicals are created or the chalcone synthesis is inhibited (cf. WO 90/08830, WO 90/08831, WO 89/10396, EP -A-0 329 308 and EP-A-0 335 451).
  • the methods available hitherto for the production of male-sterile plants do not lead to fully satisfactory results in many cases.
  • plants with a significantly increased sensitivity to fungal pests are often obtained, which makes their practical handling to a great extent difficult. There is therefore a strong need for further processes for the production of male-sterile plants which do not have these disadvantages.
  • DNA sequence I The new DNA sequence, which is called DNA sequence I below, has now been found, which consists of the following constituents, which is shown in FIG.
  • 3'-sequence are: a) a promoter which is heterologous to component b) and which is highly active in plants and / or which is anther- or tapetum-specific and is optionally preceded by a reinforcing element ("enhancer");
  • DNA sequence I also including the derived DNA sequences which still have the features which are essential for carrying out the invention.
  • plants which contain DNA sequence I in their genome are surprisingly male-sterile and moreover have a flower color which is different from the corresponding plants which do not contain DNA sequence I.
  • the present invention thus also relates to new plants (including parts of these plants and their propagation material, such as protoplasts, plant cells, calli, seeds, tubers or cuttings, etc.) which contain the DNA sequence I in their genome and which are male-sterile and / or a flower color which has changed compared to the corresponding plants which do not contain the DNA sequence I.
  • Promoters which can be used according to the invention as constituent a) of DNA sequence I and which are highly active in plants are known.
  • the promoter of the gene of the small subunit of ribulose-1, 5-bisphosphate-carboxylase (rbcS) can be mentioned as an example (see, for example, EMBO Journal, Vol. 5 No. 9, 2063-2071 (1986)).
  • highly effective plant virus promoters can also be used in plants.
  • Such promoters are known, the CaMV 35S promoter (cf. for example Science 250: 959-960 (1990) being mentioned as an example.
  • Anther-specific and or wallpaper-specific promoters can also be used as component a) of the DNA sequence I.
  • Promoters of this type which are particularly effective in the anthers or in the anther site called tapetum are known.
  • the TA29 promoter should be mentioned as an example (cf., for example, Nature 347, 737-741 (1990)).
  • the known anther-specific promoters of the TA26 and TA13 genes isolated from tobacco are also suitable for use according to the invention.
  • the CaMV 35S promoter is preferably used as component a) of the DNA sequence I.
  • enhancer-promoter constructs are known.
  • the known CaMV 35S enhancer can be used particularly advantageously as an enhancer.
  • the CaMV 35S promoter is particularly preferably used as component a) of the DNA sequence I.
  • a construct is very particularly preferably used which consists of the CaMV 35S enhancer and the CaMV 35S promoter which follows in 5'-3 'sequence.
  • the promoter to be used according to the invention is heterologous to component b), i.e. different from promoters which occur in natural stilbene synthase genes.
  • Stilbene synthase should be understood to mean any enzyme which (in a suitable environment, especially in plant cells) can produce stilbene.
  • the term stilbene describes a group of chemical substances that occur in plants and contain the stilbene framework (trans-1,2-diphenylethylene) as a common basic structure. This basic structure can also be supplemented by adding further groups.
  • Two important and preferred stilbenes are the 3,5-dihydroxy-stilbene (Pinosylvin) and the 3,4 ', 5-trihydroxy-stilbene (resveratrol).
  • DNA sequences encoding stilbene synthase are known, for example, from European patent applications EP-A-0 309 862, EP-A-0 464 461 and EP-A-0 533 010. These patent applications describe the isolation of stilbene synthase genes and their use for the production of transgenic plants which have increased pest resistance.
  • the DNA sequences coding for stilbene synthase which are described in these patent applications, are preferably used according to the invention, the sequences coding for resveratrol synthase being particularly preferred.
  • the DNA sequences from peanut plants which are described in the European patent applications and which code for stilbene synthase are preferably used.
  • the DNA sequences coding for stilbene synthase can be in the form as they are contained in the corresponding natural plant genes ("genomic form"), including any non-coding regions (such as introns), or in a form which the corresponds to cDNA ("copy DNA”), which is obtainable via mRNA with the help of reverse transcriptase / polymerase and no longer contains introns. They can also be in partially or completely synthesized form or be composed of parts from different origins.
  • Particularly preferred according to the invention are the DNA sequences coding for stilbene synthase, which are contained in the plasmid pGS828.1 (EP-A-0 309 862), the plasmid pin5-49 (EP-A-0 533 010) and very particularly preferably the plasmids pVstl , pVst2 and pVstl2t3 (EP-A-0 464 461) are contained and the further DNA sequences coding for stilbene synthase which can be isolated from plants with the aid of these DNA sequences (use as probes) are used.
  • the sequence coding for stilbene synthase, which is contained in the plasmid pVstl (EP-A-0 464 461) is particularly emphasized.
  • the isolation of the DNA sequences which can be used as component b) of the DNA sequence I is known and / or can be carried out by the known methods and methods familiar to the person skilled in the art.
  • the coding region for stilbene synthase can e.g. B. with the help of the polymerase chain reaction technique (PCR technology) from the plasmids pVstl, pVst2 pVstl2t3 or pGS828.1 isolated.
  • the amplification can be done by means of PCR, e.g. B. via the following programs:
  • Primer 1 Vstl see SEQ ID NO: 1 primer IVst2: see SEQ ID NO: 2 primer 1 A. hyp .: see SEQ ID NO: 3
  • Primer 2 Vstl see SEQ ID NO: 4
  • Primer 2 Vst2 see SEQ ID NO: 5
  • Primer 2 A. hyp . see SEQ ID NO: 6
  • the coding and the terminating sequence can also be isolated from pSSVstl (see below) by the enzymes EcoRI and PstI and EcoRI and SphI.
  • the 3'-polyadenylation sequence contained as component c) in the DNA sequence I can be varied to a large extent, so that all corresponding sequences can be used which do not adversely affect the expression of stilbene synthase in plants. It can also be expedient to use several (for example two) polyadenylation sequences, optionally of different origins, to be used one after the other, especially if this results from the techniques used (see part c) in SEQ ID NO: 7).
  • the 3'-polyadenylation sequence contained in the natural stigen synthase genes is preferably used, this sequence advantageously being isolated from the stilbene synthase genes together with the sequence coding for stilbene synthase.
  • stilbene synthase genes can therefore also be used as constituents b) and c) in which only the natural promoter has been removed.
  • component a) of DNA sequence I that is to say the heterologous promoter and, if appropriate, the enhancer.
  • Suitable 3'-polyadenylation sequences can be isolated by generally customary methods and methods which are familiar to the person skilled in the art.
  • nucleotides 1 to 720 represent the double 35S CaMV RNA promoter, which consists of the CaMV 35S enhancer and the CaMV 35S promoter (component a)).
  • Nucleotides 721 to 730 are a synthetic linker sequence.
  • Nucleotides 731 to 2265 of SEQ ID NO: 7 represent the coding part for stilbene synthase (component b)) and nucleotides 2266 to 2485 represent the polyA part (component c)) of the stilbene synthase gene.
  • the nucleotides from 2486 to 2728 represent the portion of component c) from CaMV 359 RNA, with polylinker sequences at the end.
  • DNA sequence I also includes all derived DNA sequences which still have the features which are essential for the implementation of the invention, which therefore cause male sterility in plants and, if appropriate, a change in the color of the flowers.
  • individual DNAs, codons and / or partial sequences may be missing (eg through the use of restriction enzymes) and / or replaced by other DNAs, codons and / or partial sequences.
  • modifications can be due to the degeneracy of the genetic code or can result from the manipulation of the DNA sequences.
  • the DNA sequences according to the invention and / or their components a) to c) can also contain DNAs and / or DNA sequences which facilitate their handling, for example so-called. Left or which of such links core remains after manipulations (eg after cuts with restriction enzymes).
  • the components a) to c) of the DNA sequence I can be of natural origin or can be partially or completely in synthesized form.
  • the DNA sequence I consists of (a) the so-called CaMV 35S double promoter, which is composed of the CaMV 35S promoter and the associated CaMV 35S enhancer, and (b) the sequence coding for stilbene synthase (resveratrol synthase) with the subsequent 3'-polyadenylation sequence, as is present in the plasmid pVstl (cf. EP-A-0 464 461).
  • This DNA sequence is contained in the new plasmid pSSVstl, the construction of which can be seen from FIG. 1.
  • the coding region of the stilbene synthase gene Vstl can accordingly be isolated as a 2.1 kB Munl fragment from the plasmid pVstl, which contains the complete stilbene synthase gene (Vstl gene) as a 4.9 kB EcoRI fragment.
  • this Muni fragment lacks the first 4 codons at the 5 'end of the coding area.
  • the purified Muni fragment is expediently digested with the restriction enzyme Nrul and the resulting 1.7 kB large Nrul Munl fragment is fused with an oligonucleotide linker which codes for the first four amino acids.
  • the oligonucleotide linker is designed in such a way that the EcoRI site is only created by a subsequent restriction digest.
  • the resulting NruI / EcoRI fragment is ligated between the Smal and EcoRI sites of the binary vector pSS, so that the complete coding region of the stilbene synthase gene Vstl is under the control of the double 35S promoter.
  • Corresponding other constructions can be produced and used by the person skilled in the art on the basis of his specialist knowledge and the information contained in the present text using the usual methods.
  • the Escherichia coli strain RH pSSVstl contains the plasmid pSSVstl.
  • This E. coli strain RH pSSVstl was obtained from the German Collection of Microorganisms (DSM), Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany, in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the International Filing of Microorganisms for the purposes of patent proceedings on October 18, 1994 and received the deposit number DSM 9501.
  • the plasmid pSSVstl and the E. coli strain RH pSSVstl and its mutants, which still have the essential features of the stored strain for the implementation of the invention, are also part of the present invention.
  • the E. coli strain RH pSSVstl can be multiplied by the generally customary methods.
  • the plasmid pSSVstl can also be obtained from this E. coli strain using the generally customary methods. It is also easily possible for the person skilled in the art to isolate the DNA sequence I contained in the plasmid pSSVstl. For example, the DNA sequence I contained in the plasmid pSSVstl is isolated from this plasmid with the aid of the restriction enzymes SphI and PstI in the form of an approximately 2700 bp (base pairs) large DNA fragment.
  • DNA sequence I one or more times (for example a tandem arrangement), preferably simply, into any prokaryotic (preferably bacterial) or eukaryotic (preferably vegetable) DNA as “foreign” DNA to install.
  • prokaryotic preferably bacterial
  • eukaryotic preferably vegetable
  • the "modified" recombinant DNA which e.g. can be used for the transformation of plants or plant cells and is contained in plants or plant cells after the transformation, is part of the present invention.
  • the DNA sequence I and the recombinant DNA can be used as "foreign" DNA in
  • Vectors in particular plasmids, cosmids or phages
  • transformed microorganisms preferably bacteria, in particular Gram-negative bacteria, such as E. coli
  • transformed plant cells and plants or in their DNA are constituents of the present invention.
  • the DNA sequence I is built into the natural plant genome one or more times (at the same or different locations in the genome).
  • the present invention thus also relates to a process for the production of transgenic plant cells (including protoplasts) and plants (including plant parts and seeds), these plants being male-sterile and possibly having a changed flower color, which is characterized in that
  • the DNA sequence I and / or recombinant DNA according to the invention is inserted one or more times into the genome of plant cells (including protoplasts) and, if appropriate
  • the desired plant parts are obtained from the transgenic plants of the parent generation or further generations obtained therefrom.
  • Process steps (a), (b) and (c) can be carried out in a conventional manner by known processes and methods.
  • Transgenic plant cells including protoplasts
  • plants including plant parts and seeds
  • Parts of the present invention are also:
  • transgenic plant cells according to the invention including protoplasts
  • plants including plant parts and seeds
  • transgenic plants which are male-sterile and / or have a different flower color compared to corresponding plants which do not contain this DNA in their genome.
  • a number of different methods are available for inserting the DNA sequence I as "foreign" DNA into the genetic material of plants or plant cells.
  • the gene transfer can take place in accordance with the generally known methods, the person skilled in the art being able to determine the most suitable method in each case without difficulty.
  • the Ti plasmid from Agrobacterium tumefaciens is available as a particularly inexpensive and widely usable vector for the transfer of foreign DNA into genomes of dicotyledonous and monocotyledonous plants.
  • the DNA sequence I is suitably inserted into the T-DNA of suitable Ti plasmids (for example Zambryski et al., 1983) and by infection of the plant, infection of parts of plants or plant tissues, such as, for example, leaf disks, stems , Hypocotyls, cotyledons, meristems and tissues derived therefrom, such as secondary embryos and calli or by co-culture of protoplasts with Agrobacterium tumefaciens.
  • suitable Ti plasmids for example Zambryski et al., 1983
  • DNA uptake can also be promoted by an electric field (electroporation) (e.g. Fromm et al., 1986).
  • electroporation e.g. Fromm et al., 1986.
  • the DNA can also be introduced via plant pollen in a known manner, e.g. by "bombarding" pollen or plant tissue with physically accelerated particles which carry the DNA (cf. EP-A 0 270 356).
  • the plants are regenerated in a known manner using suitable nutrient media (e.g. Nagy and Maliga 1976).
  • suitable nutrient media e.g. Nagy and Maliga 1976.
  • Plasmid pSSVstl is contained in a suitable intermediate E. coli vector e.g. pGV700 or pGV710, (see EP-A-116 718) or preferably derivatives thereof, which additionally contain a reporter gene such as e.g. nptll (Herrera-Estrella et al. 1983) or hpt (Van den Elzen et al 1986).
  • a reporter gene such as e.g. nptll (Herrera-Estrella et al. 1983) or hpt (Van den Elzen et al 1986).
  • the plasmid constructed in this way is transferred to Agrobacterium tumefaciens, which contains, for example, pGV 3850 or derivatives thereof (Zambryski et al. 1983), using customary methods (for example Van Haute et al. 1983).
  • the DNA sequence I can be cloned in a binary vector, for example PCV001 or PCV002 (for example Koncz and Schell 1986) and transferred to a suitable Agrobacterium strain (Koncz and Schell 1986) as described above.
  • the resulting Agrobacterium strain which contains the DNA sequence I in a form that can be transferred to plants, is subsequently used for plant transformation.
  • the plasmid pSSVstl can also be introduced directly into a suitable A.
  • the plasmid pSSVstl which contains a reporter gene for plant cells for kanamycin resistance (for example Herrera-Estrella et al. 1983), is transferred to plant protoplasts in a conventional manner (for example Hain et al 1985).
  • the plasmid pSSVstl can be present in a circular, but preferably in a linear form.
  • Transformed (transgenic) plants or plant cells are produced according to the known methods, e.g. by leaf disc transformation (e.g. Horsch et al. 1985) by coculturing regenerating plant protoplasts or cell cultures
  • Agrobacterium tumefaciens e.g. Marton et al. 1979, Hain et al. 1985
  • Resulting transformed plants are either selected by selection for the expression of the reporter gene, e.g. by the phosphorylation of kanamycin sulfate in vitro (Reiss et al. 1984; Schreier et al. 1985) or by the expression of nopaline synthase (according to Aerts et al. 1983) or
  • Stilbene synthase detected by Northern blot analysis and Western blot analysis.
  • the stilbene synthase and the stilbene can also be detected in a known manner with the aid of specific antibodies in transformed plants.
  • Stilbene synthase can also be detected by enzyme activity test (Rolfs et al., Plant Cell Reports J, 83-85, 1981).
  • the cultivation of the transformed plant cells and the regeneration to complete plants is carried out according to the generally customary methods with the aid of the appropriate nutrient media.
  • Both the transformed plant cells and the transformed plants which contain the DNA sequence I according to the invention and which are components of the present invention show a considerably higher resistance to pests, in particular phytopathogenic fungi.
  • plants means both complete plants and parts of plants, such as leaves, stems or roots, and propagation material, such as seeds, tubers, cuttings, etc.
  • Plant cells include protoplasts, cell lines, plant calli, etc.
  • the flower color is of considerable commercial importance.
  • the targeted influencing of the flower colors and the achievement of stable flower colors is often difficult and complex.
  • the present invention makes it possible to change the flower color of all brightly flowering plants which have flower colors, in particular anthocyanins, in a relatively simple manner.
  • the incorporation of DNA sequence I makes the flowers lighter and often completely white. In plants without colored flowers, a change is generally not or only with difficulty.
  • the male sterility of plants plays a very important role in plant breeding in the production of hybrid lines and hybrid seeds.
  • many hybrid lines are very sensitive to phytopathogenic fungi, so that their use is very limited.
  • With the help of the present invention it is possible to produce male-sterile plants in a relatively simple manner. These plants also have an increased resistance to microbial plant pests, such as phytopathogenic fungi, bacteria and / or viruses, in particular to phytopathogenic fungi, and are therefore superior to male-sterile plants obtained by other processes.
  • the plants which can be given male sterility by incorporating (transforming) the DNA sequence I according to the invention include practically all plants.
  • crops such as plants that supply food and raw materials, e.g. cereals (in particular wheat, rye, barley, oats, millet, rice and corn), potatoes, legumes (such as legumes and in particular alfalfa, soybeans), vegetables (especially types of cabbage and tomatoes), fruit (especially apples, pears, cherries, grapes, citrus, pineapples and bananas), oil palms, tea, cocoa and coffee bushes, tobacco, sisal and cotton, as well as medicinal plants such as rauwolfia and digitalis.
  • Rice, wheat, barley, rye, corn, sugar beet, rapeseed and soy are particularly preferred. The present invention will be explained in more detail using the following exemplary embodiments:
  • the plasmid pSSVstl is a derivative of pSS.
  • pSS is a derivative of PCV001 (Koncz and Schell, 1986), which contains an expression cassette based on the plasmid pRTlOl (Töpfer et al., 1987), in which a doubling of the CaMV 35S RNA enhancer by cloning the Ddel / EcoRV- Fragment in the Hincll interface was carried out.
  • pSSVstl contains the coding sequence and the polyA sequence of stilbene synthase from pVstl (cf. FIG. 1).
  • pSSVstl contains a kanamycin resistance for plants and a bacterial ampicillin resistance.
  • pSSVstl contains border sequences from the Ti plasmid from Agrobacterium tumefaciens and a start of replication for A. tumefaciens and E. coli
  • the plasmid pSSVstl can be mobilized using the E. coli RH pSSVstl strain directly into a suitable Agrobacterium tumefaciens strain (e.g. Koncz and Schell, 1986).
  • Nicotiana tabacum (Petit Havana SRI) is propagated as a sterile shoot culture on hormone-free LS medium (Linsmai er and Skoog 1965). At intervals of about 6-8 weeks, shoot sections are transferred to fresh LS medium. The shoot cultures are kept in a culture room at 24-26 ° C. under 12 h light (1000-3000 lux).
  • the leaf material is in 20 ml enzyme solution, consisting of K3 medium (Nagy and Maliga 1976), 0.4 m sucrose, pH 5.6, 2% cellulase RIO (Serva), 0.5% Macerozym RIO (Serva) incubated for 14-16 h at room temperature.
  • K3 medium Nagy and Maliga 1976
  • Serva cellulase RIO
  • Macerozym RIO Serva
  • the protoplasts are then separated from cell residues by filtration through 0.30 mm and 0.1 mm steel sieves.
  • the filtrate is centrifuged at 100 xg for 10 minutes. During this centrifugation, intact protoplasts float and collect in a band at the top of the enzyme solution.
  • the pellet from cell residues and the enzyme solution are aspirated with a glass capillary.
  • the pre-cleaned protoplasts are made up to 10 ml with fresh K3 medium (0.4 M 10 sucrose as an osmotic agent) and
  • the washing medium is suctioned off and the protoplasts are diluted to 1-2 ⁇ 10 5 / ml for culture or subsequent infection with agrobacteria (coculture).
  • the protoplast concentration is determined in a counting chamber.
  • Sequence I contained in their T-DNA or which contain the plasmid pSSVstl, added to 3 ml of regenerating protoplasts in minimally A (Am) medium (density approx. 10 9 agrobacteria / ml).
  • Am minimally A
  • the coculture lasts 3-4 days at 20 ° C in the dark.
  • the tobacco cells are filled into 12 ml centrifuge tubes with sea water
  • the cell suspension is at a density of 5 ⁇ 10 4 / ml in K3 medium (0.3 m saccharose) with 1 mg / 1 NAA (naphthyl-1-acetic acid), 0.2 mg / 1 kinetin
  • Approx. 10 6 protoplasts in 180 ⁇ l K3 medium with 20 ⁇ l aqueous DNA solution containing 0.5 ⁇ g / ⁇ l plasmid pSSVstl or the isolated DNA sequence I from pSSVstl as a DNA fragment and 0.5 ⁇ l / ⁇ l pLGVneo2103 are placed in a Petri dish (Hain et al. 1985), mixed carefully. Then 200 ⁇ l of fusion solution (0.1 m calcium nitrate, 0.45 M mannitol, 25% polyethylene glycol (PEG 6000), pH 9) are carefully added.
  • fusion solution 0.1 m calcium nitrate, 0.45 M mannitol, 25% polyethylene glycol (PEG 6000), pH 9
  • the transformation with the DNA sequence I from pSSVstl can also be carried out without the addition of the 0.5 ⁇ g / ⁇ l pLGV neo 2103. Since no reporter gene is used in this case, the resulting calli are checked for the presence of the DNA sequence I gene unit using a dot blot hybridization.
  • Hybridization sample the coding sequence from pSSVstl can be used.
  • detection methods such as a test with antibodies or an enzyme test for stilbene synthase, can also be used.
  • a modified "bead type culture” technique (Shillito et al. 1983) is used for the culture and selection of kanamycin-resistant colonies described below.
  • K3 medium 0.3 M sucrose + hormones; 1.2% (Seaplaque) LMT agarose (low melting agarose, Marine Colloids) mixed in 5 cm petri dishes for this purpose
  • the exchange medium (K3 + Km) is reduced by 0.05 m of sucrose (approx. 60 mOsm) per week.
  • kanamycin-resistant colonies have reached a diameter of approx. 0.5 cm
  • half is placed on regeneration medium (LS medium, 2% sucrose, 0.5 mg / 1 benzylaminopurine BAP) and exposed to 12 h light (3000-5000 lux ) and 24 ° C in the culture room.
  • the other half is propagated as callus culture on LS medium with 1 mg / 1 NAA, 0.2 mg / 1 kinetin, 0.1 mg / 1 BAP and 100 mg / 1 kanamycin sulfate.
  • the regenerated shoots are approx. 1 cm in size, they are cut off and placed on 1/2 LS medium (1% sucrose, 0.8% agar) without growth regulators for rooting.
  • the shoots are rooted on 1/2 MS medium with 100 mg / 1 kanamycin sulfate and later converted into soil.
  • Leaf pieces are then washed in MS medium (0.5 mg / ml BAP, 0.1 mg / ml NAA) and on the same medium (0.8% agar) with 500 g / ml cefotaxime and 100 g / ml kanamycin sulfate ( Sigma). The medium should be replaced after two weeks. Transformed shoots become visible after another 2-3 weeks.
  • MS medium 0.5 mg / ml BAP, 0.1 mg / ml NAA
  • Neomycin phosphotransferase (NPT II) enzyme test :
  • NPT II activity in plant tissue is determined by in situ phosphorylation of kanamycin, as described by Reiss et al. (1984) and by Schreier et al. (1985) modified as follows. 50 mg of plant tissue are homogenized in 50 ⁇ l extraction buffer (10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0.1% SDS, 0.025% bromophenol blue, 62.5 mM Tris pH 6.8) with the addition of glass powder on ice and for 10 minutes centrifuged in an Eppendorf centrifuge at 4 ° C.
  • the gel is placed on a glass plate of the same size and covered with 40 ml of 1% agarose in reaction buffer which contains the substrates kanamycin sulfate (20 g / ml) and 20-200 Ci 32 P ATP (Amersham).
  • the sandwich gel is incubated for 30 min at room temperature and then a sheet of phosphocellulose paper P81 (Whatinan) is placed on the agarose.
  • P81 phosphocellulose paper
  • 3MM Whatinan
  • transgenic tobacco plants obtained according to the above examples are grown in tissue culture and then in the greenhouse at 23 ° C. and 70-
  • T L -DNA gene 5 controls the tissue- specific expression of chimaeric genes carried by a noval type of Agrobacterium linary vector. Mol. Gen. Genet. (1986) 204: 338-396
  • EP-A-174 166 WO 83/01176
  • EP-A-122 791 EP-A-0 309
  • EP-A-0 464 461
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • CTCTCTACAA ATCTATCTCTCT CTCTATTTTT CTCCAGAATA ATGTGTGAGT AGTTCCCAGA 258

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue DNA-Sequenz und ihre Verwendung zur Transformation von Vektoren, Wirtsorganismen und Pflanzen sowie zur Erzeugung von neuen Pflanzen, die männlich steril sind und eine veränderte Blütenfarbe aufweisen.

Description

DNA-Seαuenzen und ihre Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue DNA-Sequenz und ihre Verwendung zur Transformation von Vektoren, Wirtsorganismen und Pflanzen sowie zur Erzeu¬ gung von neuen Pflanzen, die männlich steril sind und eine veränderte Blütenfarbe aufweisen.
Männlich sterile Pflanzen spielen in der Pflanzenzüchtung, insbesondere in der Hybridzüchtung, eine bedeutende Rolle. Verschiedene Verfahren zur Erzeugung von männlich sterilen Pflanzen sind bereits bekanntgeworden, gemäß welchen beispielsweise gezielt Zellschäden z. B. in den Antheren hervorgerufen werden, Eingriffe in mitochondriale Funktionen erfolgen, mit Hilfe von Antisense-DNA sterilisierende Einwirkungsmöglichkeiten von Chemikalien geschaffen werden oder die Chalkonsynthese inhibiert wird (vgl. WO 90/08830, WO 90/08831, WO 89/10396, EP-A-0 329 308 und EP-A-0 335 451). Die bisher zur Erzeugung von männlich sterilen Pflanzen zur Verfügung stehenden Verfahren führen jedoch in vielen Fällen nicht zu voll befriedigenden Ergebnissen. Darüberhinaus werden häufig Pflanzen mit einer erheblich gesteigerten Empfindlichkeit gegenüber pilz¬ lichen Schädlingen erhalten, was ihre praktische Handhabung in einem hohen Maße erschwert. Es besteht somit ein starkes Bedürfnis nach weiteren Verfahren zur Erzeugung von männlich sterilen Pflanzen, welche diese Nachteile nicht aufweisen.
Die Erzeugung von Pflanzen mit einer geänderten Blütenfarbe ist vor allem für die Zierpflanzenzüchtung von Interesse, sodaß auch hier ein erhebliches Interesse an neuen Verfahren besteht.
Es wurde nun die neue DNA-Sequenz, welche im folgenden DNA-Sequenz I genannt wird, gefunden, die aus den folgenden Bestandteilen besteht, die in der 5'-
3'-Reihenfolge aneinandergereiht sind: a) ein zum Bestandteil b) heterologer Promotor, der in Pflanzen stark wirksam ist und/oder der antheren- oder tapetum-spezifisch ist und dem gegebenen¬ falls ein verstärkendes Element ("Enhancer") vorgesetzt ist;
b) eine für Stilbensynthase kodierende DNA-Sequenz; und
c) eine 3'-Polyadenylierungssequenz;
wobei der Begriff DNA-Sequenz I auch die abgeleiteten DNA-Sequenzen ein¬ schließt, welche noch die für die Ausführung der Erfindung wesentlichen Merk¬ male aufweisen.
Weiterhin wurde gefunden, daß Pflanzen, die die DNA-Sequenz I in ihrem Genom enthalten, in überraschender Weise männlich steril sind und darüberhinaus eine, gegenüber den entsprechenden Pflanzen, die die DNA-Sequenz I nicht enthalten, veränderte Blütenfarbe aufweisen.
Diese neuen Pflanzen besitzen zusätzlich eine erhöhte Resistenz gegenüber mikro- biellen Pflanzenschädlingen, insbesondere gegenüber phytopathogenen Pilzen. Die geänderte Blütenfarbe erleichtert es in vielen Fällen, die männlich sterilen Pflanzen in einer gemischten Population leicht zu erkennen, was von einer erheblichen praktischen Relevanz sein kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch neue Pflanzen (einschließlich Teile dieser Pflanzen sowie deren Vermehrungsmaterial, wie Protoplasten, Pflanzen- zellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklingen usw.), die in ihrem Genom die DNA-Sequenz I enthalten und die männlich steril sind und/oder eine gegenüber den entsprechenden Pflanzen, welche die DNA-Sequenz I nicht enthalten, geänderte Blütenfarbe aufweisen.
Erfindungsgemäß als Bestandteil a) der DNA-Sequenz I verwendbare Promotoren, die in Pflanzen stark wirksam sind, sind bekannt. Als Beispiel kann der Promotor des Gens der kleinen Untereinheit der Ribulose-l,5-bisphosphat-carboxylase (rbcS) genannt werden (vgl. z.B EMBO Journal, Vol. 5 Nr. 9, 2063-2071 (1986)). Wei¬ terhin können auch in Pflanzen stark wirksame Promotoren von Pflanzenviren eingesetzt werden. Solche Promotoren sind bekannt, wobei der CaMV 35S Promo- tor ( vgl. z.B. Science 250: 959-960 (1990 ) beispielhaft genannt sei. Als Bestandteil a) der DNA-Sequenz I können auch antherenspezifische und oder tapetumspezifische Promotoren verwendet werden. Solche Promotoren, die ihre Wirksamkeit besonders stark in den Antheren bzw. im Tapetum genannten Antherenort entfalten, sind bekannt. Als Beispiel soll der TA29-Promotor genannt werden (vgl. z.B. Nature 347, 737-741 (1990)). Auch die bekannten, aus Tabak isolierten, antherenspezifischen Promotoren der TA26 und TA13 Gene kommen für eine erfindungsgemäße Verwendung in Frage.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird der CaMV 35S Promotor als Bestandteil a) der DNA-Sequenz I eingesetzt.
Es kann vorteilhaft sein, dem Promotor ein geeignetes Verstärkungselement (Enhancer) voranzustellen, um die erwünschte Wirkung des Promotors zu ver¬ stärken. Solche Enhancer-Promotor-Konstrukte sind bekannt. Als Enhancer kann beispielweise der bekannte CaMV 35S Enhancer besonders vorteilhaft eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß als Bestandteil a) der DNA-Sequenz I der CaMV 35S Promotor verwendet. Ganz besonders bevorzugt wird ein Konstrukt eingesetzt, welches aus dem CaMV 35S Enhancer und dem sich in 5'-3'-Reihen- folge anschließenden CaMV 35S Promotor besteht.
Der erfindungsgemäß zu verwendende Promotor ist zum Bestandteil b) heterolog, d.h. von Promotoren, die in natürlichen Stilb ensynthase-Genen vorkommen, ver¬ schieden.
Die Isolierung geeigneter Promotoren und Enhancer ist bekannt oder kann nach bekannten Verfahren und Methoden, die dem Fachmann geläufig sind, erfolgen.
Als Bestandteil b) in der DNA-Sequenz I kann jede DNA verwendet werden, die für das Enzym Stilbensynthase kodiert. Unter Stilbensynthase soll jedes Enzym verstanden werden, welches (in einer geeigneten Umgebung, vor allem in Pflan¬ zenzellen) Stilbene erzeugen kann. Der Begriff Stilbene beschreibt eine Gruppe von chemischen Substanzen, welche in Pflanzen vorkommen und als gemeinsame Grundstruktur das Stilbengerüst (trans-l,2-Diphenylethylen) enthalten. Dieses Grundgerüst kann auch durch die Addition weiterer Gruppen ergänzt werden. Zwei wichtige und bevorzugte Stilbene sind das 3,5-Dihydroxy-stilben (Pinosylvin) und das 3,4',5-Trihydroxy-stilben (Resveratrol).
Für Stilbensynthase kodierende DNA-Sequenzen sind beispielsweise aus den Europäischen Patentanmeldungen EP-A-0 309 862, EP-A-0 464 461 und EP-A- 0 533 010 bekannt. In diesen Patentanmeldungen wird die Isolierung von Stil- bensynthase-Genen und ihre Verwendung zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, die eine erhöhte Schädlingsresistenz aufweisen, beschrieben. Die für Stilben¬ synthase kodierenden DNA- Sequenzen, die in diesen Patentanmeldungen be¬ schrieben werden, werden bevorzugt erfindungsgemäß eingesetzt, wobei die für Resveratrolsynthase kodierenden Sequenzen besonders bevorzugt werden. Weiter¬ hin werden bevorzugt die in den genannten Europäischen Patentanmeldungen be¬ schriebenen, für Stilbensynthase kodierenden DNA-Sequenzen aus Erdnußpflanzen (Arachis hypogaea und aus Wein (Vitis vinifera)) eingesetzt. Die DNA-Sequenzen, die für Stilbensynthase kodieren, können in der Form vorliegen, wie sie in den entsprechenden natürlichen Pflanzengenen enthalten sind ("genomische Form"), einschließlich der gegebenfalls vorhandenen nicht kodierenden Regionen (wie Introns) oder in einer Form, welche der cDNA ("copy DNA") entspricht, die über mRNA mit Hilfe von Reverse-Transkriptase/Polymerase erhältlich ist und keine Introns mehr enthält. Sie können auch in teilweise oder vollständig synthetisierter Form vorliegen oder aus Teilen verschiedener Herkunft zusammengesetzt vor¬ liegen.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt werden die für Stilbensynthase kodierenden DNA-Sequenzen, welche in dem Plasmid pGS828.1 (EP-A-0 309 862), dem Plasmid pin5-49 (EP-A-0 533 010) und ganz besonders bevorzugt den Plasmiden pVstl, pVst2 und pVstl2t3 (EP-A- 0 464 461) enthalten sind sowie die mit Hilfe dieser DNA-Sequenzen (Verwendung als Sonden) aus Pflanzen isolierbaren wei¬ teren für Stilbensynthase kodierende DNA-Sequenzen eingesetzt. Besonders her¬ vorgehoben wird die für Stilbensynthase kodierende Sequenz, welche in dem Plasmid pVstl ( EP-A-0 464 461 ) enthalten ist.
Die Isolierung der als Bestandteil b) der DNA-Sequenz I verwendbaren DNA- Sequenzen ist bekannt und/oder kann nach den bekannten und dem Fachmann geläufigen Verfahren und Methoden erfolgen. Die kodierende Region für Stilben¬ synthase kann z. B. mit Hilfe der Polymerasekettenreaktions-Technik (PCR-Tech- nik) aus den Plasmiden pVstl, pVst2 pVstl2t3 oder pGS828.1 isoliert werden. Die Amplifizierung kann mittels PCR, z. B. über folgende Programme erfolgen:
lx 95°C 180 sec.
72°C hold ( Zugabe der Polymerase )
25x 95°C 45 sec. 55°C 45 sec.
72°C 90 sec.
lx 95°C 45 sec. 55°C 45 sec. 72°C 300 sec.
Die Amplifizierung der Stilb ensynthase-Gene Vstl und Vst2 aus Vitis vinifera (var. optima) sowie des Stilbensynthase-Gens aus Arachis hypogea (A. hyp.) kann mit den folgenden Primern durchgeführt werden:
Primer 1 Vstl: siehe SEQ ID NO: 1 Primer lVst2: siehe SEQ ID NO: 2 Primer 1 A. hyp.: siehe SEQ ID NO: 3
Primer 2 Vstl: siehe SEQ ID NO: 4 Primer 2 Vst2: siehe SEQ ID NO: 5 Primer 2 A. hyp.: siehe SEQ ID NO: 6
Alle so amplifizierten codierenden Regionen der einzelnen Gene können in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen üblicher Vektoren einligiert werden.
Weiterhin können die kodierende und die terminierende Sequenz auch gemeinsam durch die Enzyme EcoRI und PstI sowie EcoRI und SphI aus pSSVstl (vgl. unten) isoliert werden.
Die als Bestandteil c) in der DNA-Sequenz I enthaltene 3'-Polyadenylierungs- sequenz kann weitgehend variiert werden, sodaß alle entsprechenden Sequenzen verwendet werden können, welche die Exprimierung der Stilbensynthase in Pflan¬ zen nicht nachteilig beeinflussen. Es kann auch zweckmäßig sein, mehrere (z.B. zwei) Polyadenylierungssequenzen, gegebenenfalls verschiedenen Ursprungs, hintereinander gefügt einzusetzen, insbesondere, wenn sich dies durch die jeweils verwendeten Techniken ergibt (vgl. Teil c) in SEQ ID NO: 7). Der Einfachheit halber wird vorzugsweise die in den natürlichen Stibensynthase-Genen enthaltene 3'-Polyadenylierungssequenz verwendet, wobei zweckmäßigerweise diese Sequenz zusammen mit der für Stilbensynthase kodierenden Sequenz aus den Stilben- synthase-Genen isoliert wird. Erfindungsgemäß können also als Bestandteile b) und c) auch Stilbensynthase-Gene eingesetzt werden, bei denen lediglich der natürliche Promotor entfernt wurde. In diesem Fall ist es nur erforderlich, den Bestandteil a) der DNA-Sequenz I, also den heterologen Promotor und gegebe- nenfalls den Enhancer, vorzuschalten.
Die Isolierung geeigneter 3'-Polyadenylierunssequenzen kann nach allgemein üb¬ lichen Verfahren und Methoden erfolgen, die dem Fachmann geläufig sind.
Ganz besonders bevorzugt werden als Komponenten a) bis c) der DNA-Sequenz I einzeln oder in der vorliegender Kombination die DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 7 verwendet. In Seq ID NO: 7 stellen die Nukleotide 1 bis 720 den Doppel 35S CaMV RNA-Promotor dar, der aus dem CaMV 35S Enhancer und dem CaMV 35S Promotor besteht (Komponenete a)). Die Nukleotide 721 bis 730 sind eine synthetische Linkersequenz. Die Nukleotide 731 bis 2265 der SEQ ID NO: 7 repräsentieren den kodierenden Teil für Stilbensynthase (Komponente b)) und die Nukleotide 2266 bis 2485 stellen den polyA-Teil (Komponente c)) des Stilb ensynthase-Gens dar. Die Nukleotide von 2486 bis 2728 stellen den Anteil der Komponente c) aus CaMV 359 RNA dar, wobei am Ende Polylinkersequenzen vorliegen.
Der Begriff DNA-Sequenz I schließt auch alle abgeleiteten DNA-Sequenzen ein, welche noch die für die Ausführung der Erfindung wesentlichen Merkmale auf¬ weisen, welche also in Pflanzen männliche Sterilität und gegebenfalls eine Ände¬ rung der Blütenfarbe hervorrufen. In solchen abgeleiteten Sequenzen können einzelne DNAs, Kodons und/oder Teilsequenzen fehlen (z. B. durch die Verwen¬ dung von Restriktionsenzymen) und/oder durch andere DNAs, Kodons und/oder Teilsequenzen ersetzt sein. Solche Modifikationen können auf Grund der Degene¬ ration des genetischen Kodes vorliegen, oder sich bei der Manipulation der DNA- Sequenzen ergeben. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und/oder ihre Be¬ standteile a) bis c) können auch DNAs und/oder DNA- Sequenzen enthalten, wel¬ che ihre Handhabung erleichtern, z.B. sogen. Linker oder welche von solchen Lin- kern nach Manipulationen (z.B. nach Schnitten mit Restriktionsenzymen) übrig bleiben. Die Bestandteile a) bis c) der DNA-Sequenz I können natürlichen Ur¬ sprungs sein oder teilweise oder vollständig in synthetisierter Form vorliegen.
Die Bestandteile a) bis c) können nach den allgemein üblichen und dem Fachmann geläufigen Verfahren und Methoden zu der DNA-Sequenz I , welche auch als ein "chimäres Gen " betrachtet werden kann, zusammengefügt werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung besteht die DNA-Sequenz I aus (a) dem sogenannten CaMV 35S-Doppelpromotor , der aus dem CaMV 35S Promotor und dem zugehörigen CaMV 35S Enhancer zusammengesetzt ist, und (b) der für Stilbensynthase (Resveratrolsynthase) kodierenden Sequenz mit der sich anschließenden 3'-Polyadenylierungssequenz, wie sie im Plasmid pVstl (vgl. EP- A-0 464 461) vorliegt.
Diese DNA-Sequenz ist in dem neuen Plasmid pSSVstl enthalten, dessen Kon¬ struktion aus Fig. 1 ersichtlich ist. Die kodierende Region des Stilbensynthase- Gens Vstl kann demgemäß als 2,1 kB-Munl-Fragment aus dem Plasmid pVstl isoliert werden, das das vollständige Stilbensynthase-Gen (Vstl -Gen ) als 4,9 kB- EcoRI-Fragment enthält. Allerdings fehlen diesem Muni-Fragment die ersten 4 Kodons am 5'-Ende des codierenden Bereichs. Das gereinigte Muni-Fragment wird zweckmäßigerweise mit dem Restriktionsenzym Nrul nachverdaut und das ent- standene 1,7 kB große Nrul Munl-Fragment mit einem Oligonukleotidlinker fusio¬ niert, welcher für die ersten vier Aminosäuren kodiert. Da die überstehenden Enden der EcoRI- und Munl-Restriktionsschnittstellen identisch sind und eine Munl EcoRI-Fusion verhindert werden soll, ist der Oligonukleotidlinker so konzi¬ piert, daß die EcoRI-Schnittstelle erst durch einen nachträglichen Restriktions- verdau entsteht. Das entstandene NruI/EcoRI-Fragment wird zwischen die Smal- und EcoRI-Schnittstellen des binären Vektors pSS ligiert, sodaß die vollständige codierende Region des Stilbensynthase-Gens Vstl unter der Kontrolle des doppelten 35S Promotors steht. Entsprechende andere Konstruktionen können durch den Fachmann anhand seines Fachwissens und der im vorliegenden Text enthaltenen Informatonen mit Hilfe der üblichen Methoden hergestellt und ver¬ wendet werden.
Der Escherichia coli Stamm RH pSSVstl enthält das Plasmid pSSVstl. Dieser E. coli Stamm RH pSSVstl wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren am 18. Oktober 1994 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer DSM 9501.
Das Plasmid pSSVstl sowie der E. coli Stamm RH pSSVstl und seine Mutanten, die noch die für die Ausführung der Erfindung wesentlichen Merkmale des hin¬ terlegten Stammes aufweisen, sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Der E. coli Stamm RH pSSVstl kann nach den allgemein üblichen Methoden ver¬ mehrt werden. Das Plasmid pSSVstl kann ebenfalls nach den allgemein üblichen Methoden aus diesem E. coli Stamm gewonnen werden. Ebenso ist es dem Fachmann leicht möglich, die in dem Plasmid pSSVstl enthaltene DNA-Sequenz I zu isolieren. So kann z.B. die im Plasmid pSSVstl enthaltene DNA-Sequenz I, aus diesem Plasmid mit Hilfe der Restriktionsenzyme SphI und PstI in Form eines etwa 2700 bp ( Basenpaare ) großen DNA-Fragments isoliert werden.
Mit Hilfe der üblichen und dem Fachmann geläufigen Methoden ist es möglich, die DNA-Sequenz I ein oder mehrfach (z.B. Tandemanordnung), vorzugsweise einfach, in beliebige prokaryontische (vorzugsweise bakterielle) oder eukaryon- tische (vorzugsweise pflanzliche) DNA als "fremde" DNA einzubauen. Die so "modifizierte" rekombinante DNA, welche z.B. zur Transformation von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen verwendet werden kann und nach der Transformation in Pflanzen bzw. Pflanzenzellen enthalten ist, ist Bestandteil der vorliegenden Erfin¬ dung.
Die DNA-Sequenz I sowie die rekombinante DNA können als "fremde" DNA in
Vektoren (insbesondere Plasmiden, Cosmiden oder Phagen), in transformierten Mikroorganismen (vorzugsweise Bakterien, insbesondere Gram-negativen Bakte¬ rien, wie E. coli) sowie in transformierten Pflanzenzellen und Pflanzen bzw. in deren DNA enthalten sein. Solche Vektoren, transformierte Mikroorganismen (die auch diese Vektoren enthalten können) sowie die transformierten Pflanzenzellen und Pflanzen und deren DNA stellen Bestandteile der vorliegenden Erfindung dar. Wie bereits angedeutet, werden erfindungsgemäß die DNA-Sequenz I ein- oder mehrfach (an gleichen oder verschiedenen Stellen des Genoms) in das natürliche pflanzliche Genom eingebaut.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteile und Samen), wobei diese Pflanzen männlich steril sind und gege¬ benenfalls eine geänderte Blütenfarbe aufweisen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) ein oder mehrfach die DNA-Sequenz I und/oder erfindungsgemäße rekom- binante DNA in das Genom von Pflanzenzellen (einschließlich Proto¬ plasten) einsetzt und gegebenenfalls
(b) aus den transformierten Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) voll¬ ständige transformierte Pflanzen regeneriert und gegebenenfalls vermehrt und gegebenenfalls
(c) von den so erhaltenen transgenen Pflanzen der Elterngeneration oder weiterer daraus gewonnener Generationen die gewünschten Pflanzenteile (einschließlich Samen) gewinnt.
Die Verfahrensschritte (a), (b) und (c) können nach bekannten Verfahren und Methoden in üblicher Weise durchgeführt werden.
Transgene Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteile und Samen), welche ein oder mehrfach die DNA-Sequenz I als "fremde" DNA enthalten und deren Nachkommen sowie solche transformierte Pflanzenzellen und Pflanzen, welche nach den obigen Verfahren erhältlich sind und deren Nachkommen, gehören ebenfalls zur vorliegenden Erfindung.
Teile der vorliegenden Erfindung sind auch die:
(a) Verwendung der DNA-Sequenz I und/oder der erfindungsgemäßen rekom- binanten DNA und/oder der erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren und/oder der erfindungsgemäßen transformierten Mikroorganismen zur Transformation von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflan¬ zen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen), die
(b) Verwendung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen (einschlie߬ lich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen) zur Erzeugung von Vermehrungsmaterial sowie zur Erzeugung neuer Pflan¬ zen und deren Vermehrungsmaterial, die
(c) Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz I und/oder der erfin¬ dungsgemäßen rekombinanten DNA zur Erzeugung von männlicher Steri¬ lität und gegebenenfalls einer geänderten Blütenfarbe in Pflanzen, die
d) Verwendung der auf dem Plasmid pSSVstl enthaltenen DNA-Sequenz I zum Nachweis der Anwesenheit der DNA-Sequenz I in Pflanzen sowie (allgemein) bei der Erzeugung von transgenen Pflanzenzellen (einschlie߬ lich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen) sowie die
e) Verwendung der für Stilbensynthase kodierenden DNA-Sequenz zur
Erzeugung von transgenen Pflanzen, welche männlich steril sind und/oder gegenüber entsprechenden Pflanzen, die diese DNA in ihrem Genom nicht enthalten, eine geänderte Blütenfarbe aufweisen.
Eine Anzahl verschiedener Methoden steht zur Verfügung, die DNA-Sequenz I als "fremde" DNA in das genetische Material von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einzu¬ setzen. Der Gentransfer kann nach den allgemein üblichen bekannten Met oden erfolgen, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierig¬ keiten ermitteln kann.
Das Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens steht als besonders günstiger und breit einsetzbarer Vektor zur Übertragung von fremder DNA in Genome dikotyler und monokotyler Pflanzen zur Verfügung. Hierzu wird die DNA-Sequenz I in geeigneter Weise in die T-DNA von geeigneten Ti-Plasmiden eingesetzt (z.B. Zambryski et al.,1983) und durch Infektion der Pflanze, Infektion von Pflan¬ zenteilen oder Pflanzengeweben, wie z.B. von Blattscheiben, Stengeln, Hypo- kotylen, Kotyledonen, Meristemen und davon ableitenden Geweben, wie z.B. sekundären Embryonen und Kalli oder durch Kokultur von Protoplasten mit Agrobacterium tumefaciens übertragen.
Eine Alternative ist die Inkubation der DNA-Sequenz I oder von rekombinanter DNA mit Pflanzenprotoplasten (z.B. Hain et al., 1985; Krens et al., 1982; Paszkowski et al., 1984) in Gegenwart von Polykationen oder Calziumsalzen und Polyethylenglykol .
Die DNA-Aufnahme kann auch zusätzlich durch ein elektrisches Feld (Elektro- poration) begünstigt werden (z.B. Fromm et al., 1986).
Die DNA kann in bekannter Weise auch über Pflanzenpollen eingeführt werden, z.B. indem Pollen oder Pflanzengewebe mit physikalisch beschleunigten Partikeln "beschossen" werden, welche die DNA tragen (vgl. EP-A 0 270 356).
Die Regeneration der Pflanzen erfolgt in bekannter Weise mit Hilfe geeigneter Nährmedien (z.B. Nagy und Maliga 1976).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens (gemäß der Methode aus EP-A 116 718) wird die DNA-Sequenz I, wie sie auf dem
Plasmid pSSVstl enthalten ist, in einen geeigneten intermediaeren E.coli Vektor z.B. pGV700 oder pGV710, (vergl. EP-A-116 718) bzw. vorzugsweise Derivaten davon, die zusätzlich ein Reportergen wie z.B. nptll (Herrera-Estrella et al. 1983) oder hpt (Van den Elzen et al 1986) enthalten, kloniert.
Das so konstruierte Plasmid wird auf Agrobacterium tumefaciens, das z.B. pGV 3850 bzw. Derivate davon enthält (Zambryski et al. 1983), mit üblichen Methoden (z.B. Van Haute et al. 1983) übertragen. Alternativ dazu kann die DNA- Sequenz I in einem binären Vektor, z.B. PCV001 oder PCV002 (z.B. Koncz und Schell 1986) kloniert und wie oben beschrieben in einen geeigneten Agrobakterium Stamm (Koncz und Schell 1986) transferiert werden. Der resultierende Agrobakterium Stamm, der die DNA-Sequenz I in einer auf Pflanzen transferierbaren Form enthält, wird im weiteren zur Pflanzentransformation verwendet. Das Plasmid pSSVstl kann auch direkt in einen geeigneten A. tumefaciens Stamm (vgl. z.B. Koncz und Schell (1986)) eingebracht werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Plasmid pSSVstl, das ein Reportergen für Pflanzenzellen für Kanamycin-Resistenz (z.B. Herrera-Estrella et al. 1983) enthält, in üblicher Weise durch direkten Gentransfer auf Pflanzen- protoplasten übertragen (z.B. Hain et al 1985). Dabei kann das Plasmid pSSVstl in zirkulärer, vorzugsweise jedoch in linearer Form, vorliegen. Bei der Verwen¬ dung von pSSVstl mit Reportergen werden kanamycinresistente Protoplasten dann auf Expression von Stilb ensynthasen überprüft.
Transformierte (transgene) Pflanzen bzw. Pflanzenzellen werden nach den bekannten Methoden, z.B. durch Blattscheiben Transformation (z.B. Horsch et al. 1985) durch Cokultur regenerierender Pflanzenprotoplasten oder Zellkulturen mit
Agrobacterium tumefaciens (z.B. Marton et al. 1979, Hain et al. 1985) oder durch direkte DNA Transfektion erzeugt. Resultierende transformierte Pflanzen werden entweder durch Selektion auf die Expression des Reportergens, z.B. durch die Phosphorylierung von Kanamycin-Sulfat in vitro (Reiss et al. 1984; Schreier et al. 1985) oder durch die Expression der Nopalinsynthase (nach Aerts et al. 1983) oder
Stilbensynthase durch Northern-Blot-Analyse und Western Blot-Analyse nachgewiesen. Die Stilbensynthase und die Stilbene können auch in bekannter Weise mit Hilfe spezifischer Antikörper in transformierten Pflanzen nachgewiesen werden. Stilbensynthase kann auch durch Enzymaktivitätstest nachgewiesen werden (Rolfs et al., Plant Cell Reports J, 83-85, 1981).
Die Kultivierung der transformierten Pflanzenzellen sowie die Regeneration zu vollständigen Pflanzen erfolgt nach den allgemein üblichen Methoden mit Hilfe der jeweils geeigneten Nährmedien.
Sowohl die transformierten Pflanzenzellen als auch die transformierten Pflanzen, welche die erfindungsgemäße DNA-Sequenz I enthalten und welche Bestandteile der vorliegenden Erfindung sind, zeigen eine erheblich höhere Resistenz gegen Schädlinge, insbesondere pflanzenpathogene Pilze.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Pflanzen" sowohl vollständige Pflanzen als auch Pflanzenteile, wie Blätter, Stengel oder Wurzeln sowie Vermehrungsmaterial, wie Samen, Knollen, Steck¬ linge u.s.w. "Pflanzenzellen" schließen Protoplasten, Zelllinien, Pflanzenkalli usw. ein. Wie bereits dargelegt wurde, weisen Pflanzen, welche die erfindungsgemäße DNA-Sequenz I in ihrem Genom enthalten, eine männliche Sterilität und gegebenfalls eine, im Vergleich zu den entsprechenden Pflanzen, welche die DNA- Sequenz I nicht enthalten, geänderte Blütenfarbe auf.
Bei Zierpflanzen und Schnittblumen, z.B. Rosen, Nelken, Freesien, Gerbera usw., ist die Blütenfarbe von einer erheblichen kommerziellen Bedeutung. Häufig ist die gezielte Beeinflussung der Blütenfarben und die Erzielung stabiler Blütenfarben schwierig und aufwendig. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es auf relativ einfache Weise die Blütenfarbe aller bunt blühenden Pflanzen, die Blütenfarben, insbesondere Anthocyane, aufweisen, zu ändern. In der Regel werden durch den Einbau der DNA-Sequenz I die Blüten heller und häufig ganz weiß. Bei Pflanzen ohne bunte Blüten, ist im allgemeinen eine Veränderung nicht oder nur schwer zu erkennen.
Die männliche Sterilität von Pflanzen spielt in der Pflanzenzucht bei der Erzeu- gung von Hybridlinien und Hybridsamen eine sehr große Rolle. Leider sind viele Hybridlinien sehr empfindlich gegenüber pflanzenpathogenen Pilzen, sodaß hier¬ durch ihre Verwendbarkeit sehr stark eingeschränkt ist. Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ist es auf relativ einfache Weise möglich, männlich sterile Pflanzen zu erzeugen. Diese Pflanzen weisen zudem eine erhöhte Resistenz gegenüber mikrobiellen Pflanzenschädlingen, wie phytopathogenen Pilzen, Bakterien und/oder Viren, insbesondere gegenüber phytopathogenen Pilzen auf und sind somit nach anderen Verfahren gewonnenen männlich sterilen Pflanzen überlegen.
Zu den Pflanzen, welchen durch den Einbau (Transformation) der erfindungs¬ gemäßen DNA-Sequenz I eine männliche Sterilität verliehen werden kann, gehören praktisch alle Pflanzen. Ein besonderes diesbezüglichen Bedürfnis besteht naturgemäß bei den Kulturpflanzen, wie Nahrungsmittel und Rohstoffe liefernden Pflanzen, z.B. Getreide (insbesondere Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Hirse, Reis und Mais), Kartoffel, Leguminosen (wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohnen), Gemüse (insbesondere Kohlarten und Tomaten), Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal und Baumwolle sowie bei Heil¬ pflanzen wie Rauwolfia und Digitalis. Besonders bevorzugt seien Reis, Weizen, Gerste, Roggen, Mais, Zuckerrübe, Raps und Soja genannt. Die vorliegende Erfindung soll anhand der folgenden beispielhaften Ausführungen näher erläutert werden:
I) Transformation von Pflanzen
1. Konstruktion und Beschreibung des Vektors pSSVstl
Die Konstruktion des Plasmids pSSVstl wurde bereits oben näher erläutert und ist in Fig. 1 dargestellt, so daß sie ohne weiteres durch den Fachmann nachvollzogen werden kann.
Das Plasmid pSSVstl ist ein Derivat von pSS. pSS stellt ein Derivat von PCV001 (Koncz und Schell, 1986) dar, welches eine Expressionskassette, basierend auf dem Plasmid pRTlOl (Töpfer et al., 1987) enthält, in der eine Verdoppelung des CaMV 35S RNA Enhancers durch Einklonierung des Ddel/EcoRV-Fragmentes in die Hincll Schnittstelle durchgeführt wurde. pSSVstl enthält die kodierende Sequenz sowie die polyA-Sequenz von Stilbensynthase aus pVstl (vgl. Fig. 1). pSSVstl enthält eine Kanamy- cinresistenz für Pflanzen und eine bakterielle Ampicillinresistenz. Weiterhin enthält pSSVstl Bordersequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobakterium tumefaciens sowie einen Replikationsstart für A. tumefaciens und E. coli
(Koncz und Schell, 1986). Das Plasmid pSSVstl kann mit Hilfe des Stammes E. coli RH pSSVstl direkt in einen geeigneten Agrobakterium tumefaciens Stamm (z.B. Koncz und Schell, 1986) mobilisiert werden.
2. Transformation von Tabak
a) Kultur von Tabaksprossen und Isolierung von Tabakprotoplasten:
Nicotiana tabacum (Petit Havana SRI) wird als sterile Sproßkultur auf hormonfreiem LS Medium (Linsmai er und Skoog 1965) ver¬ mehrt. In Abständen von ca. 6-8 Wochen werden Sproßabschnitte auf frisches LS-Medium umgesetzt. Die Sproßkulturen werden bei 12 h Licht (1000-3000 Lux) in einem Kulturraum bei 24-26°C ge¬ halten.
Für die Isolierung von Blattprotoplasten werden ca. 2 g Blätter (ca.
3-5 cm lang) mit einer frischen Rasierklinge in kleine Stücke
(0,5 cm x 1 cm) geschnitten. Das Blattmaterial wird in 20 ml En- zymlösung, bestehend aus K3 Medium (Nagy und Maliga 1976), 0,4 m Saccharose, pH 5,6, 2 % Zellulase RIO (Serva), 0,5 % Macerozym RIO (Serva) für 14-16 h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Protoplasten durch Filtration über 0,30 mm und 0,1 mm Stahlsiebe von Zellresten getrennt. Das Filtrat wird 10 Mi- 5 nuten lang bei 100 x g zentrifugiert. Während dieser Zentrifugati on flotieren intakte Protoplasten und sammeln sich in einer Bande am oberen Rand der Enzymlösung. Das Pellet aus Zellresten und die Enzymlösung werden mit einer Glaskapillare abgesaugt. Die vor¬ gereinigten Protoplasten werden mit frischem K3 Medium (0,4 M 10 Saccharose als Osmotikum) auf 10 ml aufgefüllt und erneut flotiert.
Das Waschmedium wird abgesaugt und die Protoplasten werden für Kultur oder folgende Infektion mit Agrobakterien (Kokultur) auf 1- 2 x 105/ml verdünnt. Die Protoplastenkonzentration wird in einer Zählkammer bestimmt.
15 b) Transformation von regenerierenden Tabakprotoplasten durch Ko¬ kultur mit Agrobacterium tumefaciens:
Es wird im folgenden die Methode von Marton et al. 1979 mit kleinen Veränderungen benutzt. Die Protoplasten werden wie be¬ schrieben isoliert und in einer Dichte von 1-2 x 105/ml in K3
20 Medium (0,4 m Saccharose, 0,1 mg/1 NAA, 0,2 ml in K3 Medium
(0,4 m Saccharose, 0,1 mg/1 NAA, 0,2 mg Kinetin) 2 Tage im Dunkeln und ein bis zwei Tage lang unter Schwachlicht (500 lux) bei 26°C inhibiert. Sobald die ersten Teilungen der Protoplasten auftreten, werden 30 μl einer Agrobakteriumsuspension, die die
25 Sequenz I in ihrer T-DNA enthalten oder die das Plasmid pSSVstl enthalten, in minimal A (Am) Medium (Dichte ca. 109 Agrobakte- rien/ml) zu 3 ml regenerierenden Protoplasten gegeben. Die Kokul- turdauer beträgt 3-4 Tage bei 20°C im Dunkeln. Danach werden die Tabakzellen in 12 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt, mit Seewasser
30 (600 mOsm/kg) auf 10 ml verdünnt und bei 60 x g 10 Minuten lang pelletiert. Dieser Waschvorgang wird noch 1-2 x wiederholt um den größten Teil der Agrobakterien zu entfernen. Die Zellsuspension wird in einer Dichte von 5 x 104/ml in K3 Medium (0,3 m Saccha¬ rose) mit 1 mg/1 NAA (Naphthyl-1 -essigsaure), 0,2 mg/1 Kinetin
35 und 500 mg 1 des Cephalosporin- Antibiotikums Cefotaxim kulti- viert. Die Zellsuspension wird jede Woche mit frischem K3 Medium verdünnt und der osmotische Wert des Mediums graduell um 0,05 m Saccharose (ca. 60 mOsm/kg) pro Woche reduziert. Die Selektion mit Kanamycin (100 mg/1 Kanamycinsulfat (Sigma), 660 mg/g aktives Km) wird 2-3 Wochen nach der Kokultur in
Agarose "bead type culture" (Shillito et al. 1983) gestartet. Kanamycinresistente Kolonien können 3-4 Wochen nach Beginn der Selektion vom Hintergrund zurückgebliebener Kolonien unterschie¬ den werden.
Direkte Transformation von Tabakprotoplasten mit DNA. Calcium- nitrat-PEG Transformation.
In einer Petrischale werden ca. 106 Protoplasten in 180 μl K3 Medium mit 20 μl wäßriger DNA Lösung welche 0,5 μg/μl Plasmid pSSVstl oder die isolierte DNA-Sequenz I aus pSSVstl als DNA- Fragment und 0,5 μl/μl pLGVneo2103 (Hain et al. 1985) enthält, vorsichtig gemischt. Anschließend werden 200 μl Fusionslösung (0, 1 m Calciumnitrat, 0,45 M Mannit, 25 % Polyethylenglykol (PEG 6000), pH 9) vorsichtig zugegeben. Nach 15 Minuten werden 5 ml Waschlösung (0,275 M Calciumnitrat pH 6) addiert und nach weiteren 5 Minuten werden die Protoplasten in ein Zentrifugen- röhrchen transferiert und bei 60 x g pelliert. Das Pellet wird in einer kleinen Menge K3 Medium aufgenommen und wie im nächsten Abschnitt beschrieben kultiviert. Alternativ können die Protoplasten nach Hain et al. 1985 tranformiert werden.
Die Transformation mit der DNA-Sequenz I aus pSSVstl kann auch ohne den Zusatz der 0,5 μg/μl pLGV neo 2103 durchgeführt werden. Da in diesem Fall kein Reportergen eingesetzt wird, werden die resultierenden Kalli auf das Vorhandensein der DNA-Sequenz I- Gen-Einheit mit Hilfe einer Dot-Blot-Hybridisierung überprüft. Als
Hybridisierung-Probe ist die kodierende Sequenz aus pSSVstl verwendbar. Selbstverständlich können auch andere Nachweis¬ methoden, wie Test mit Antikörpern oder ein Enzymtest für Stilbensynthase eingesetzt werden. d) Kultur der mit DNA inkubierten Protoplasten und Selektion Kana¬ mycin resistenter Kalli:
Für die im folgenden beschriebene Kultur und Selektion Kanamycin resistenter Kolonien wird eine modifizierte "Bead Type culture"- 5 Technik (Shillito et al. 1983) verwendet. Eine Woche nach Behand¬ lung der Protoplasten mit DNA (vgl. c) werden 3 ml der Zell¬ suspension mit 3 ml K3 Medium (0,3 M Saccharose + Hormone; 1,2 % (Seaplaque) LMT Agarose (low melting agarose, Marine Colloids) in 5 cm Petrischalen gemischt. Für diesen Zweck wird
10 Agarose trocken autoklaviert und nach Zugabe von K3 Medium im
Mikrowellenherd kurz aufgekocht. Nach Erstarren der Agarose werden die Agarosescheiben ("beads") mit den eingebetteten Tabak- mikrokalli für weitere Kultur und Selektion in 10 cm Petrischalen transferiert und je 10 ml K3 Medium (0,3 M Saccharose, 1 mg/1
15 NAA, 0,2 mg/1 Kinetin) und 100 mg/1 Kanamycinsulfat (Sigma) addiert. Das Flüssigmedium wird jede Woche gewechselt. Dabei wird der osmotische Wert des Mediums stufenweise herabgesetzt.
Pro Woche wird das Austauschmedium (K3 + Km) um 0,05 m an Saccharose (ca. 60 mOsm) reduziert.
20 Schema der Selektion kanamycinresistenter Tabakkolonien nach
DNA Transformation:
0,3 M" 0,25 M 0,20 M 0,15 M 0,10 M Saccharose im
Flüssigmedium
ES K
6 Wochen nach DNA Aufnahme
(K3 Medium 1 mg NAA, 0,2 mg Kinetin)
A = DNA Aufnahme E = Einbettung in Agarose
S = Selektion mit Kanamycin (100 mg/1 Kanamycinsulfat) K = Kanamycinresistente Kolonien können vom Hintergrund eindeutig unterschieden werden
e) Regeneration kanamycinrestistenter Pflanzen:
Sobald die kanamycinrestistenten Kolonien einen Durchmesser von ca. 0,5 cm erreicht haben, wird die Hälfte auf Regenerationsmedium (LS-Medium, 2 % Saccharose, 0,5 mg/1 Benzylaminopurin BAP) gesetzt und bei 12 h Licht (3000-5000 lux) und 24°C im Kultur¬ raum gehalten. Die andere Hälfte wird als Kalluskultur auf LS Medium mit 1 mg/1 NAA, 0,2 mg/1 Kinetin, 0,1 mg/1 BAP und 100 mg/1 Kanamycinsulfat propagiert. Wenn die regenerierten Sproße ca. 1 cm groß sind, werden sie abgeschnitten und auf 1/2 LS Medium (1 % Saccharose, 0,8 % Agar) ohne Wachstumsregulatoren zur Bewurzelung gesetzt. Die Sproße werden auf 1/2 MS-Medium mit 100 mg/1 Kanamycinsulfat bewurzelt und später in Erde umgesetzt.
Transformation von Blattscheiben durch Agrobacterium tumefaciens
Für die Transformation von Blattscheiben (Horsch et al. 1985) werden ca. 2-3 cm lange Blätter von sterilen Sproßkulturen in Scheiben von 1 cm Durchmesser gestanzt und mit einer Suspension entsprechender Agrobacterien, die das Plasmid pSSVstl oder die DNA-Sequenz I aus diesem Plasmid in ihrer T-DNA enthalten, (ca. 109/ml) (vgl. b), in Am-Medium, (siehe unten) für ca. 5 Minuten in¬ kubiert. Die infizierten Blattstücke werden auf MS-Medium (siehe unten) ohne Hormone für 3-4 Tage bei ca. 24°C gehalten. Während dieser Zeit überwächst Agrobakterium die Blattstücke. Die
Blattstücke werden anschließend in MS-Medium (0,5 mg/ml BAP, 0,1 mg/ml NAA) gewaschen und auf das gleiche Medium (0,8 % Agar) mit 500 g/ml Cefotaxim und 100 g/ml Kanamycinsulfat (Sigma) gelegt. Nach zwei Wochen sollte das Medium erneuert werden. Transformierte Sproße werden nach weiteren 2-3 Wochen sichtbar.
Biochemische Nachweismethode der Transformation
Neomycin-Phosphotransferase (NPT II) Enzymtest:
NPT II Aktivität in Pflanzengewebe wird durch in situ Phosphorylierung von Kanamycin, wie bei Reiß et al. (1984) beschrieben und von Schreier et al. (1985) modifiziert, wie folgt, nachgeweisen. 50 mg Pflanzengewebe werden in 50 μl Extraktionspuffer (10 % Glycerin, 5 % 2-Mercaptoethanol, 0,1 % SDS, 0,025 % Bromphenolblau, 62,5 mM Tris pH 6,8) unter Zusatz von Glaspulver auf Eis homogenisiert und 10 Minuten lang in einer Eppendorfzentrifuge bei 4°C zentrifugiert. 50 μl des Überstandes werden auf ein natives Polyacrylamidgel (145 x HO x 1,2 mm; Trenngel: 10 % Acrylamid, 0,33 % Bisacrylamid, 0,375 M Tris pH 8,8, Sammelgel: 5 % Acrylamid, 0,165 % Bisacrylamid, 0,125 M Tris pH 6,8) aufgetragen und über Nacht bei 4°C und 60 V elektrophoretisiert. Sobald der Brom- phenolblau-Marker aus dem Gel herausläuft, wird das Gel zweimal mit destilliertem Wasser 10 Min. lang und einmal 30 Min. mit Reaktionspuffer gewaschen (67 mM Tris-Maleat, pH 7,1 , 42 mM MgCl2, 400 mM Ammoniumchlorid). Das Gel wird auf eine gleichgroße Glasplatte gelegt und mit 40 ml 1 %iger Agarose in Reaktionspuffer, der die Substrate Kanamycinsulfat (20 g/ml) und 20-200 Ci 32P ATP (Amersham) enthält, überschichtet. Das Sandwichgel wird 30 Min. bei Zimmertempreratur inkubiert und dann wird ein Blatt Phosphozellulosepapier P81 (Whatinan) auf die Agarose gelegt. Darüber werden vier Filtrierpapierlagen 3 MM, (Whatinan) und einige Papierhandtücher gestapelt. Der Transfer von in situ phosphoryliertem radioaktiven Kanamycinphosphat auf das P81 Papier wird nach 3-4 h gestoppt. Das P81 Papier wird für 30 min. in einer Lösung von Proteinase K und 1 % Natriumdodecyl sulfat (SDS) bei 60°C inkubiert und dann 3-4 mal in 250 ml 10 mM Phosphatpuffer pH 7,5 bei 80°C gewaschen, getrocknet und für 1-12 h lang bei -70°C autoradiografiert
(XAR5 Film Kodak).
In den gemäß den obigen Beispielen erhaltenen Pflanzenzellen und Pflanzen (Tabak) wurde die Anwesenheit der für Stilbensynthase kodierenden DNA-Sequenz durch Southern Blot Analyse bestätigt. Die Expression der für Stilbensynthase kodierenden Sequenz wurde durch
Northern Blot Analyse, Stilbensynthase und Resveratrol mit Hilfe von spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Transformierte und nicht- transformierte Pflanzen (zum Vergleich) wurden im Gewächshaus bis zur Blüte kultiviert. Die transformierten Pflanzen zeigten (gegenüber den nicht transformierten Vergleichspflanzen) eine veränderte Blütenfarbe und waren männlich steril.
Die bei der Transformation von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eingesetzte Medien werden u.a. in der EP-A 0 309 862 beschrieben:
Alle Prozentangaben in den obigen sowie in den nachfolgenden Beispielen beziehen sich auf Gewichtsprozente, wo nichts anderes angegeben wird.
II) Prüfung der transgenen Pflanzen auf eine veränderte Blütenfarbe sowie die - männliche Sterilität.
Beispiel A
Die gemäß den obigen Beispielen erhaltenen transgenen Tabakpflanzen werden in Gewebekultur vorgezogen und anschließend im Gewächshaus bei 23°C und 70-
80% relat. Luftfeuchte bis zur Blüte herangezogen. Die Versorgung mit Dünger und Wasser erfolgt nach Bedarf.
Alle gemäß Beispiel I) transformierten Pflanzen zeigten eine weiße oder weiß-rosa Blütenfarbe die auch nach Rückkreuzung mit dem Wildtyp in der Fl -Generation erhalten blieb, während die nicht transformierten entsprechenden Kontrollpflanzen eine kräftig rote, dunkelrosa oder purpurfarbene Blütenfarbe aufwiesen.
Ebenso waren alle transformierten Pflanzen männlich steril, wobei diese Sterilität auch in der Fl -Generation erhalten blieb.
Zur Transformation von Pflanzen können die folgenden Veröffentlichungen herangezogen werden:
Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Adams S.P., Bittner M.L., Brand L.A., Fink C.L., Fry J.S., Fallupi GR., Goldberg S.B., Hoffmann N.L., Woo S.C. (1983). Expression of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-4807.
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Weiterhin können die folgenden veröffentlichten Patentanmeldungen aufgeführt werden: EP-A 116 718 EP-A- 126 546
EP-A 159 418 EP-A-164 597
EP-A 120 515 EP-A-175 966
EP-A-120 516 WO 84/02913 EP-A-172 112 WO 84/02919
EP-A- 140 556 WO 84/02920
EP-A- 174 166 WO 83/01176 EP-A-122 791 EP-A-0 309 862 EP-A-0 464 461 EP-A-0 533 010
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Bayer AG (B) STRASSE : Bayerwerk
(C) ORT: Leverkusen
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-51368
(G) TELEPHON: 0214/30 66400 (H) TELEFAX: 0214/30 3482
(I) TELEX: 85 101-265 by d
(ii) ANMELDETITEL: DNA-Sequenzen und ihre Verwendung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 7
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 33 Baεenpaare
(B) ART: Nukleinεäure
(C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
TCCCCCGGGA TCCATGGCTT CAATTGAGGA AAT 33
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2
TCCCCCGGGA TCCATGGCGT CTGTGGAGGA AAT 33
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3
TCCCCCGGGA TCCATGGTGT CTGTGAGTGG AAT 3
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
TGAATTCCCG GGTCAATTTG TAACCATAGG AA 32
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomiβch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5;
CGGATCCCGG GTCAATTGGA ATCCCTAGGA A 31
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
CGGATCCCGG GTCTTCGCAT AACGAATTAA CT 32
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 2728 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
AAGCTTGCAT GCCTGCAGGT CTCAGAAGAC CAGAGGGCTA TTGAGACTTT TCAACAAAGG
GTAATATCGG GAAACCTCCT CGGATTCCAT TGCCCAGCTA TCTGTCACTT CATCGAAAGG 1
ACAGTAGAAA AGGAAGATGG CTTCTACAAA TGCCATCATT GCGATAAAGG AAAGGCTATC 1
GTTCAAGAAT GCCTCTACCG ACAGTGGTCC CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAACAT 2
CGTGGAAAAA GAAGACGTTC CAACCACGTC TTCAAAGCAA GTGGATTGAT GTGATAACAT 3
GGTGGAGCAC GACACTCTCG TCTACTCCAA GAATATCAAA GATACAGTCT CAGAAGACCA 3
GAGGGCTATT GAGACTTTTC AACAAAGGGT AATATCGGGA AACCTCCTCG GATTCCATTG 4
CCCAGCTATC TGTCACTTCA TCGAAAGGAC AGTAGAAAAG GAAGATGGCT TCTACAAATG 4
CCATCATTGC GATAAAGGAA AGGCTATCGT TCAAGAATGC CTCTACCGAC AGTGGTCCCA 5
AAGATGGACC CCCACCCACG AGGAACATCG TGGAAAAAGA AGACGTTCCA ACCACGTCTT 6
CAAAGCAAGT GGATTGATGT GATATCTCCA CTGACGTAAG GGATGACGCA CAATCCCACT 66
ATCCTTCGCA AGACCCGTCC TCTATATAAG GAAGTTCATT TCATTTGGAG AGGACCTCGA 72
GAATTCCACC ATGGCTTCAA TTGAGGAAAT TAGAAACGCT CAACGTGCCA AGGGTCCGGC 7
CACCATCCTA GCCATTGGCA CAGCTACTCC CGACCACTGT GTCTACCAGT CTGATTATGC 8 TGATTACTAT TTCAGAGTCA CTAAGAGCGA GCACATGACT GAGTTGAAGA AGAAGTTCAA 900
TCGCATATGT AAGTATATAT ATTCATGCAT TAATTCTTAC ATTCACAACA TTTCTATACA 960
TATACGÄGTG TGCTATTAAG TGAGGGTCAC CTCCAAGTGA ATGAATGTTT CAAGCTTAGA 1020
GAATAGCTTT TAGCTAAATT ACTTTAGGAA ACTTGAAAAT CATTTTACAT CÄGTAACCGA 1080
TATTCCTTTC ATTTGATTGT AAGGGCTTGA AGAGCTGTTC TTTGAATCAT GTAGCATTGC 1140
TAGCTATAAT TAAGAATAAC CTTTTATAAT TTCTTCAATG TTAAATGCAT GTTGATCATC 1200
TTCAAGAATA TACTATATGA CTAGTCGTTG GAAAACTAAT GTGTTCATCT TATTTCTTTT 1260
ACAGGTGACA AATCAATGAT CAAGAAGCGT TACATTCATT TGACCGAAGA AATGCTTGAG 1320
GAGCACCCAA ACATTGGTGC TTATATGGCT CCATCTCTCA ACATACGCCA AGAGATTATC 1380
ACTGCTGAGG TACCTAAACT TGGTAAAGAA GCAGCATTGA AGGCTCTTAA AGAATGGGGT 1440
CAACCAAAGT CCAAGATCAC CCATCTTGTA TTTTGTACAA CCTCCGGTGT AGAAATGCCC 1500
GGTGCAGATT ACAAACTCGC TAATCTCTTA GGCCTTGAAA CATCGGTTAG AAGGGTGATC 1560
TTGTACCATC AAGGTTGCTA TGCAGGTGGA ACTGTCCTTC GAACTGCTAA GGATCTTGCA 1620
GAAAATAACG CAGGAGCACG AGTTCTTGTG GTGTGCTCTG AGATCACTGT TGTTACATTT 1680
CGTGGGCCTT CCGAAGATGC TTTGGACTCT TTAGTAGGTC AAGCCCTTTT TGGTGATGGG 1740
TCAGCAGCTG TGATTGTTGG ATCAGATCCA GATGTCTCCA TTGAACGACC CCTCTTCCAA 1800
CTTGTTTCAG CAGCACAAAC GTTTATTCCT AATTCAGCAG GTGCTATTGC GGGTAACTTA 1860
CGTGAGGTGG GACTCACCTT TCACTTGTGG CCTAATGTGC CTACTTTGAT TTCCGAGAAC 1920 ATAGAGAAAT GCTTGAATCA GGCTTTTGAC CCACTTGGTA TTAGCGATTG GAACTCGTTA 198
TTTTGGATTG CTCACCCTGG TGGCCCTGCA ATTCTTGATG CAGTTGAAGC AAAACTCAAT 204
TTAGAGAAAA AGAAACTTGA AGCAACAAGG CATGTGTTAA GTGAGTATGG TAACATGTCT 210
AGTGCATGTG TCTTGTTTAT TTTGGATGAG ATGAGAAAGA AATCCCTAAA GGGGGAAAAA 216
GCTACCACAG GTGACGGATT GGATTGGGGN GTACTATTCG GTTTTGGGCC AGGCTTGACC 222
ATTGAGACCG TTGTGCTGCA TAGCGTTCCT ATGGTTACAA ATTGAGTGGA AAACGGTAAG 228
AGAAATGATA TAGGGGACAT GTCTTATTGT ATTACAGAGG AGGTGCTACG AAAGATATGT 234
ACATGTATCT TCAAAGTTAA TAATAGTACT CCTAAATCTT TTATTCCTAT CCTAACATTG 240
AGGGATTGTA ATTTAGTGAT TGTTGGAGGG TGCAGTCACG TCAGGCAAGT GGATGAAACT 246
GCAAGTGCTT GTCATTCTGT TATCGGGGGA TCCTCTAGAG TCCGCAAAAA TCACCAGTCT 252
CTCTCTACAA ATCTATCTCT CTCTATTTTT CTCCAGAATA ATGTGTGAGT AGTTCCCAGA 258
TAAGGGAATT AGGGTTCTTA TAGGGTTTCG CTCATGTGTT GAGCATATAA GAAACCCTTA 264
GTATGTATTT GTATTTGTAA AATACTTCTA TCAATAAAAT TTCTAATTCC TAAAACCAAA 270
ATCCAGTGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTT 272

Claims

Patentansprüche:
1. DNA-Sequenz I , die aus den folgenden Bestandteilen besteht, die in der 5'-3'-Reihenfolge aneinandergereiht sind:
a) ein zum Bestandteil b) heterologer Promotor, der in Pflanzen stark wirksam ist und/oder der antheren- oder tapetum-spezifisch ist und dem gegebenenfalls ein verstärkendes Element ("Enhancer") vorge¬ setzt ist;
b) eine für Stilbensynthase kodierende DNA-Sequenz; und
c) eine 3'-Polyadenylierungssequenz;
sowie die davon abgeleiteten DNA-Sequenzen.
2. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) ein Pflanzen¬ virus-Promotor und gegebenfalls ein Enhancer verwendet wird.
3. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) ein antheren- oder tapetumspezifischer Promotor verwendet wird.
4. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) der CaMV
35S Promotor verwendet wird.
5. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) der CaMV 35S Promotor verwendet wird, dem der CaMV 35S Enhancer vorgeschaltet ist.
• 6. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) das Konstrukt aus dem CaMV 35S Promotor und dem CaMV 35S Enhancer verwendet wird, welches auf dem Plasmid pSSVstl enthalten ist.
7. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) das Konstrukt aus dem CaMV 35S Promotor und dem CaMV 35S Enhancer verwendet wird, welches aus den Nukleotiden 1 bis 720 gemäß SEQ ID NO: 7 oder einer davon abgeleiteten Sequenz besteht. - 34 -
8. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil b) eine für Resveratrolsynthase kodierende DNA-Sequenz verwendet wird.
9. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil b) eine für Resveratrolsynthase kodierende DNA-Sequenz aus Arachis hypogea oder aus vitis vinifera oder deren cDNA verwendet wird.
10. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil b) eine für Resveratrolsynthase kodierende DNA-Sequenz aus vitis vinifera oder deren cDNA verwendet wird.
11. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil b) die für Resveratrolsynthase kodierende DNA-Sequenz, die auf dem Plasmid pSSVstl enthalten ist oder eine davon abgeleitete Sequenz, verwendet wird.
12. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil b) die für Resveratrolsynthase kodierende DNA-Sequenz verwendet wird, welche aus den Nukleotiden 731 bis 2265 gemäß SEQ ID NO:7 oder einer daraus abgeleiteten Sequenz besteht.
13. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil c) die 3'- Polyadenylierunssequenz, welche in den jeweiligen natürlichen Stilben- synthase-Genen enthalten ist, verwendet wird.
14. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil c) die 3'-
Polyadenylierunssequenz, welche im Plasmid pSSVstl enthalten ist, ver¬ wendet wird.
15. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil c) die 3'- Polyadenylierunssequenz, verwendet wird, welche aus den Nukleotiden 2266 bis 2485 oder 2266 bis 2728 gemäß SEQ NO: 7 oder einer davon abgeleiteten Sequenz besteht.
16. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, welche aus einer Kombination der Bestandteile a) bis c), welche auf dem Plasmid pSSVstl enthalten ist oder eine davon abgeleitete Sequenz besteht.
17. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, welche aus den Nukleotiden 1 bis 2728 gemäß SEQ NO: 7 oder einer davon abgeleiteten Sequenz besteht.
18. Rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA, welche die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 enthält.
19. Rekombinante DNA, die in Pflanzen oder Pflanzenzellen enthalten ist und die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 enthält.
20. Vektoren, welche die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder die rekombinante DNA gemäß Anspruch 18 enthalten.
21. Vektor-Plasmid pSSVstl .
22. Transformierte Mikroorganismen, welche die DNA-Sequenz I oder die rekombinante DNA gemäß Anspruch 18 enthalten.
23. Escherichia coli Stamm RH pSSVstl (gemäß DSM 9501) sowie seine Mutanten, welche noch die für die Ausführung der Erfindung wesentlichen Merkmale aufweisen.
24. Transgene Pflanzen (einschließlich Teile dieser Pflanzen sowie deren Vermehrungsmaterial, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklingen usw.), die in ihrem Genom die DNA-Sequenz I enthalten und die männlich steril sind und/oder eine gegenüber den entsprechenden Pflanzen, welche die DNA-Sequenz I nicht enthalten, geänderte Blütenfarbe aufweisen sowie die Nachkommen dieser Pflanzen.
25. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 24, welche als DNA-Sequenz I die DNA-Sequenz I enthalten, welche sich auf dem Plasmid pSSVstl befindet oder welche davon abgeleitet ist.
26. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 24, welche als DNA-Sequenz I die DNA-Sequenz I enthalten, welche aus den Nukleotiden 1 bis 2728 gemäß
SEQ ID NO: 1 besteht oder welche davon abgeleitet ist.
27. Verwendung der DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1 und/oder der rekombinanten DNA gemäß Anspruch 18 und/oder der Vektoren gemäß Anspruch 20 und/oder der transformierten Mikroorganismen gemäß An¬ spruch 22 zur Transformation von Pflanzenzellen (einschließlich Proto- plasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen).
28. Verfahren zur Herstellung der transgenen Pflanzen gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) die DNA- Sequenz I gemäß Anspruch 1 und/oder die rekombinante DNA gemäß den Anspruch 4 in den Genom von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) einsetzt und gegebenenfalls
(b) aus den transgenen Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) vollständige transformierte Pflanzen regeneriert und gegebenenfalls vermehrt und gegebenenfalls
(c) von den so erhaltenen transgenen Pflanzen der Elterngeneration oder weiterer daraus gewonnener Generationen die gewünschten Pflan¬ zenteile (einschließlich Vermehrungsmaterial) gewinnt.
29. Verwendung der transgenen Pflanzen gemäß Anspruch 24 zur Erzeugung von Vermehrungsmaterial sowie zur Erzeugung neuer Pflanzen, die die DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1 oder die rekombinante DNA gemäß Anspruch 18 enthalten und deren Vermehrungsmaterial.
30. Verwendung von DNA-Sequenzen, welche ganz oder teilweise der DNA entsprechen, die als DNA-Sequenz I auf dem Plasmid pSSVstl enthalten ist, als Sonde zum Nachweis des Gehaltes der DNA-Sequenz I oder ihrer Bestandteile in DNA, welche auf diesen Gehalt untersucht werden soll.
31. Verwendung der für Stilbensynthase kodierenden DNA-Sequenz zur
Erzeugung von transgenen Pflanzen, welche männlich steril sind und/oder gegenüber entsprechenden Pflanzen, die diese DNA nicht in ihrem Genom enthalten, eine geänderte Blütenfarbe aufweisen.
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