MXPA97003431A - Secuencia de dna que codifica para una sintetasa de estilbeno y sus usos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una nueva secuencia de DNA y a su empleo para la transformación de vectores, organismos huésped y plantas asícomo para la generación de nuevas plantas, que presentan esterilidad masculina y que presentan una coloración de la floración modificada.

Description

SECUENCIAS DE DNA Y SU EMPLEO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una nueva secuencia de DNA y a su empleo para la transformación de vec-tores, organismos huésped y plantas así como para la generación de nuevas plantas, que tienen esterilidad masculina y que presentan un color modificado de la floración. Las plantas con esterilidad masculina juegan un papel significativo en el cultivo de las plantas, especial- mente en el cultivo híbrido. Se han dado ya a conocer diversos procedimientos para la generación de plantas con esterilidad masculina, según los cuales se producen, por ejemplo, deterioros específicos celulares, por ejemplo en las anteras, se realizan intervenciones en la función mito- condrial, se consiguen posibilidades de acción esterilizante por medio de productos químicos, con ayuda de DNA an- tisentido o se inhibe la síntesis de la calcona (véanse las O/90/08830, O 90/08831, WO 89710396, EP-A-0329308 y EP- A-0 335 451) . Los procedimientos disponibles hasta el pre- senté para la generación de plantas con esterilidad masculina conducen, sin embargo, en muchos casos a resultados que no son completamente satisfactorios. Además se obtienen frecuentemente plantas con una sensibilidad considerablemente acrecentada frente a las pestes fúngicas, lo que di- ficulta en gran medida su manipulación práctica. Existe, por lo tanto, una gran necesidad de otros procedimientos para la generación de plantas con esterilidad masculina, REF: 24661 que no presenten estos inconvenientes. La generación de plantas con un color modificado de la floración es interesante, ante todo, para el cultivo de plantas ornamentales, de modo que existe en este caso un gran interés en nuevos procedimientos. Se ha encontrado ahora la nueva secuencia de DNA, que se denominará a continuación como secuencia de DNA I, que está constituida por los componentes siguientes, que están dispuestos entre si en orden 5' -3': a) un promotor he erólogo con respecto al componente b) , que es fuertemente activo en las plantas y/o que es antero- o tapeto-específico y que va precedido, en caso dado, por un elemento reforzador ("Enhancer") ; b) una secuencia de DNA codificadora de stilben- sintasa; y c) una secuencia de 3 ' -poliadenilación; incluyendo el concepto de secuencia de DNA I también las secuencias de DNA derivadas, que presenten todavía caracte- rísticas esenciales para la realización de la invención. Se ha encontrado, además, de manera sorprendente, que las plantas que contienen la secuencia de DNA I en su genoma, tienen esterilidad masculina y que, además, presentan un color modificado de la floración con respecto a las plantas correspondientes, que no contienen la secuencia de DNA I. Estas nuevas plantas tienen, además, una resis-tencia acrecentada frente a las pestes microbianas de las plantas, especialmente contra los hongos fitopatógenos . La coloración modificada de la floración facilita en muchos casos reconocer fácilmente las plantas con esterilidad mas-culina en un población mixta, lo que puede ser de una relevancia práctica considerable. La presente invención se refiere, por lo tanto, también a nuevas plantas (con inclusión de partes de estas plantas así como de su material de reproducción, tales como protoplastos, células vegetales, semillas, tubérculos o plantones, etc) , que contengan en su geno a la secuencia de DNA I y que presenten esterilidad masculina y/o que presenten un color modificado de la floración con respecto de las plantas correspondientes, que no contengan la secuencia de DNA I. Se conocen promotores empleables según la invención como componente a) de la secuencia de DNA I, que son altamente activos en las plantas. Como ejemplo puede citarse el promotor del gen de la subunidad pequeña de la ribu- losa-1, 5-bisdifosfato-carboxilasa (rbcS) (véase por ejemplo EMBO Journal, Vol. 5 Nr. 9, 2063-2071 (1986)). Además pueden emplearse también en plantas promotores altamente activos de virus vegetales. Tales promotores son conocidos, pudiéndose citar de manera eje plifica iva el promotor CaMV 35S (véase por ejemplo Science 250: 959-960 (1990). Como componentes a) de la secuencia DNA I pueden emplearse también promotores antero-específicos y/o tapeto-específicos. Se conocen tales promotores, que desarrollan su actividad de forma especialmente potente en las anteras o bien en el tapete del citado punto de las anteras. Como ejemplo se citará el promotor TA29 (véase, por ejemplo, Nature 347, 737-741 (1990)). También entran en consideración para un empleo según la invención los promotores conocidos, aislados del tabaco, antero-específicos de los genes TA26 y TAI3. Preferentemente se empleará según la invención el promotor CaMV 35S como componente a) de la secuencia DNA I. Puede ser ventajoso disponer delante del promotor un elemento reforzador adecuado (Enhancer) , para reforzar el efecto deseado del promotor. Tales constructos reforzador-promotor son conocidos. Como reforzador puede emplear- se, por ejemplo, de forma especialmente preferente el conocido reforzador CaMV 35S. De forma especialmente preferente se empleará, según la invención, como componente a) de la secuencia DNA I el promotor CaMV 35S. De forma muy especialmente prefe- rente se empleará un constructo formado por el reforzador CaMV 35S y por el promotor CaM 35S situado seguidamente en el orden 5 ' -3 ' . El promotor a ser empleado según la invención es heterólogo del componente b) , es decir diferente de los promotores que se presentan en los genes naturales de la estilbensintasa. El aislamiento de los promotores adecuados y del reforzador es conocido o puede llevarse a cabo según métodos y procedimientos conocidos, familiares para el técnico en la materia. Como componente b) en la secuencia DNA I puede emplearse cualquier DNA que codifique el enzima estilben-sintasa. Se entenderá por estilbensintasa aquel enzima que pueda generar estilbeno (en un medio adecuado, ante todo en células vegetales) . La expresión estilbeno describe un grupo de substancias químicas, que se presentan en las plantas y que contienen, como estructura común de base el esqueleto de estilbeno (trans-1, 2-difeniletileno) . Esta estructura de base puede completarse también mediante la adición de otros grupos. Dos estilbenos importantes y preferentes son el 3, 5-dihidroxi-estilbens (pinosilvina) y el 3 , 4' , 5-trihidro- xi-estilbeno (resveratrol) . Las secuencias de DNA, que codifican la estilbensintasa, son conocidas, por ejemplo, por las solicitudes de patente europeas EP-A-0 309 862, EP-A-0 464 461 y EP-A-0 533 010. En estas solicitudes de patente se describe el aislamiento de genes de la estilbensintasa y su empleo para la generación de plantas transgénicas, que presenta una resistencia acrecentada contra las pestes. Las secuencias de DNA, que codifican la estilbensintasa, que han sido descritas en estas solicitudes de patente, serán empleadas prefe- rentemente según la invención, siendo especialmente preferentes las secuencias que codifican la resveratrolsintasa . Además serán preferentes las secuencias de DNA, que codifi-can la estilbensintasa, descritas en las solicitudes de patente europeas citadas, procedentes de plantes da maní iArachis hypogaea y de la vid (Vitis vinifera) ) . Las secuencias de DNA, que codifican la estilbensintasa, pueden presentarse en la forma en que se encuentran en los genes de las plantas naturales correspondientes ("forma genómi-ca"), con inclusión de las regiones no codificantes, presentes en caso dado (tales como intrones) o en una forma que corresponda a cDNA ("copia DNA"), que puede obtenerse a través de mRNA con ayuda de transcriptasa inversa/polime- rasa y que ya no contienen intrones. También pueden presentarse en forma parcial o completamente sintetizada o presentarse en estado combinado a partir de partes de origen diverso. Según la invención se emplearán de forma especialmente preferentes las secuencias de DNA, que codifican la estilbensintasa, que están contenidas en el plásmido ?GS828.1 (EP-A-0 309 862), en el plásmido pin5-49 (EP-A-0 533 010) y de forma muy especialmente preferente en los plásmidos pVstl, pVst2 y pVstl2t3 (EP-A-0464461; así como las otras secuencias de DNA, que codifican la estilbensin- casa, aislables a partir de plantas con ayuda de estas secuencias de DNA (empleo a modo de sondas) . Se señalará de forma especial la secuencia que codifica la estilbensin- tasa, que está contenida en el plásmido pVstl (EP-A-0 464 461) . El aislamiento de las secuencias de DNA, emplea-bles como componente b) de la secuencia de DNA I es conocido y/o puede llevarse a cabo según los procedimientos y métodos familiares para el técnico en la materia. La región codificante de estilbensintasa puede aislarse de los plás-midos pVstl, pVst2, pVstl2t3 o pGS828.1 con ayuda de la técnica de las reacciones en cadena de polimerasa (técnica PCR) . La amplificación puede llevarse a cabo por medio de PCR, por ejemplo por medio de los programas siguientes: lx 95 ßC 180 segundos 72 °C mantenimiento (adición de polimerasa) 25x 95°C 45 segundos 55°C 45 segundos 72 °C 90 segundos lx 95"C 45 segundos 55ßC 45 segundos 72 "C 300 segundos. La amplificación de los genes de estilbensintasa Vstl y Vst2 procedentes de Vitis vinifera (var. óptima) así como del gen de la estilbensintasa procedente de Arachis hypogaea (A. hyp.) puede llevarse a cabo con los iniciado- res siguientes: Iniciador 1 Vstl: véase SEQ ID NO: 1 Iniciador 1 Vst2 : véase SEQ ID NO: 2 Iniciador 1 A.hyp. : véase SEQ ID NO: 3 Iniciador 2 Vstl: véase SEQ ID NO: 4 Iniciador 2 Vst2 : véase SEQ ID NO: 5 Iniciador 2 A, hyp.: véase SEQ ID NO: 6.

Todas las regiones codificantes, amplificadas de este modo, de los genes individuales pueden ligarse en los puntos de corte de restricción correspondientes de los vec- tores usuales. Además las secuencias codificante y terminadora pueden aislarse también conjuntamente por medio de los enzimas EcoRI y Ps I así como EcoRI y Sphl procedentes de pSSVstl (véase mas adelante) . La secuencia de 3 ' -poliadenilación, contenida en la secuencia de DNA I como componente c) , puede variarse ampliamente, de modo que pueden emplearse todas las secuencias correspondientes, que no influyan negativamente la expresión de la estilbensintasa en plantas. También puede ser conveniente emplear varias secuencias de poliadenilación (por ejemplo dos) , en caso dado de origen diferente, ensambladas de manera sucesiva, especialmente cuando esto se produzca por medio de la técnica empleada en cada caso (véase parte c) en SEQ ID NO: 7) . Con objeto de simplificar se empleará preferentemente la secuencia de 3 ' -poliadenila- ción contenida en los genes naturales de la estilbensintasa, aislándose convenientemente esta secuencia, junto con la secuencia codificante de la estilbensintasa, de los genes de la estilbensintasa. Según la invención pueden emplearse , por lo tanto, como componentes b) y e) también genes de la estilbensintasa, de los cuales se haya retirada simplemente el promotor natural. En este caso se requiere, únicamente, disponer delante el componente a) de la secuencia de DNA I, es decir el promotor heterólogo y, en caso dado, el reforzador. El aislamiento de las secuencias adecuadas de 3'- políadenilación puede llevarse a cabo según los procedimientos y métodos usuales en general, familiares para el técnico en la materia. De forma muy especialmente preferente se emplearán como componentes a) hasta c) de la secuencia de DNA I, las secuencias de DNA individuales o en la presente combinación según SEQ ID NO: 7. En la SEQ ID NO: 7, los nucleó- tidos 1 a 20 representan el doble del promotor 35S CaMV RNA, que está constituido por el reforzador CaMV 35S y por el promotor CaMV 35S (componente a) ) . Los nucleótidos 721 hasta 730 son una secuencia de conexión (linkage) sintética. Los nucleótidos 731 hasta 2265 de la SEQ ID NO: 7 representan la, parte codificante de la estilbensintasa (componente b) ) y los nucleótidos 2266 hasta 2485 representan la parte poliA (componente c) ) del gen de la estilbensin- tasa. Los nucleótidos desde 2486 hasta 2728 representan la parte del componente c) procedente de CaMV 359 RNA, presentándose al final secuencias de policonexión (polilinkage) .

El concepto de secuencia de DNA I abarca también todas las secuencias de DNA derivadas, que presenten todavía características esenciales para la realización de la invención, que provoquen pues en las plantas esterilidad masculina y, en caso dado, una modificación del color de la floración. En tales secuencias derivadas pueden faltar DNAs individuales, codones y/o secuencias parciales (por ejemplo mediante el empleo de enzimas de restricción) y/o pueden estar reemplazas por otras DNAs, codones y/o secuencias parciales. Tales modificaciones pueden presentarse debido a la degeneración del código genético, o producirse durante la manipulación de las secuencias de DNA. Las secuencia de DNA según la invención y/o sus componentes a) hasta c) pueden contener también DNAs y/o secuencias de DNA, que faci- liten su manipulación, por ejemplo las denominadas conexiones (linkages) o las que queden restantes de tales conexiones tras las manipulaciones (por ejemplo tras corte con enzimas de restricción) . Los componentes a) hasta c) de la secuencia de DNA I pueden ser de origen natural o pueden presentarse parcial o completamente en forma sintética. Los componentes a) hasta c) pueden combinarse según los procedimientos y métodos usuales en general y familiares para el técnico en la materia, para dar la secuencia de DNA I, que puede considerarse también como un "gen qui- mérico" . En una forma de realización especial de la invención la secuencia de DNA I está constituida por (a) el de-nominado promotor doble CaMV 35S, que está compuesto por el promotor CaMV 35S y por el reforzador correspondiente CaMV 355, u ib) por la secuencia que codifica la estilbensintasa (resveratrolsintasa) con la secuencia, situada a continua-ción, de 3 ' -poliadenilación, como se presente en el plásmido pVstl (véase la EP-A-0 464 461) . Esta secuencia está contenida en el nuevo plásmido pSSVstl, cuya construcción puede verse en la figura 1. La región codificante del gen de la estilbensintasa Vstl puede aislarse por lo tanto, como fragmente Muñí de 2,1 kB, del plásmido pVstl, que contiene el gen completo de la estilbensintasa (gen Vstl) en forma de fragmento EcoRI de 4,9 kB. Desde luego en este fragmento Muñí faltan los 4 primeros codones en el extremo 5' de la zona codificante. El fragmento Muñí purificado se digiera ulteriormente, de manera conveniente, con el enzima de restricción NruI y el fragmento de Nrul/Munl grande formado, de 1,7 kB, se fusiona con una conexión oligonucleótida, que codifica los primeros cuatro aminoácidos. Dado que son idénticos los extre- mos sobresalientes de los puntos de corte por restricción ScoRI y Muñí y que debe impedirse una fusión Munl/EcoRI, se ha concebido la conexión oligonucleótida de tal manera que el punto d corte de EcoRI se genera solamente por medio de una digestión de restricción ulterior. El fragmento NruI/ EcoRI formado se liga entre los puntos de corte de Smal y de ?ciRI del vector binario pSS, de manera que la región codificante completa del gen de la estilbensintasa Vstl se encuentre bajo el control del promotor doble 35S. Otras construcciones correspondientes pueden ser preparadas y empleadas por el técnico en la materia en base a sus conocimientos especializados y de las informaciones contenidas en el presente texto, con ayuda de los métodos usuales. La cepa Escherichia coli RH pSSVstl contiene el plásmido pSSVstl. Esta cepa de E. coli RH pSSVstl ha sido depositada en la Colección Alemana de Microorganismos (DSM) , Mascheroder Weg IB, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania, de acuerdo con los requisitos del Tratado de Budapest sobre el depósito internacional de microorganismos para la finalidad de procedimientos de patente, el 18 de octubre de 1994 y recibió el número de depósito DSM 9501. El plásmido pSSVstl así como la cepa E. coli RH pSSvstl y sus mutantes, que presenten todavía características esenciales para la realización de la invención de la cepa depositada, constituyen igualmente parte de la presente invención. La cepa E. coli RH pSSVstl puede multiplicarse según los métodos usuales en general. El plásmido pSSVstl puede obtenerse a parte de esta cepa de E. coli, igualmente, según los métodos usuales en general. Del mismo modo es posible para el técnico en la materia aislar fácilmente la secuencia de DNA contenida en el plásmido pSSVstl. De este modo podrá aislarse, por ejemplo, la secuencia de DNA I, contenida en el plásmido pSSVstl, a partir de este plásmido con ayuda de los enzimas de restricción Sphl y PstI en forma de un fragmento de DNA con un tamaño aproximado de 2700 bp (pares de bases) . Es posible, con ayuda de los métodos familiares para el técnico en la materia, incorporar la secuencia de DNA I una o varias veces (por ejemplo en disposición tándem) , preferentemente una sola vez, en cualquier DNA pro-cariótico (preferentemente bacteriano) o eucariótico (preferentemente vegetal) a modo de DNA "foráneo". El DNA re- combinante "modificado" de este modo, que puede emplearse, por ejemplo, para la transformación de plantas o bien de células vegetales y que está contenido en las plantas o bien en la células vegetales después de la transformación, constituye parte integrante de la presente invención. La secuencia de DNA I, así como el DNA recombi- nante, pueden estar contenidos a modo de DNA "foráneo" en vectores (especialmente plásmidos, cosmidos o fagos) , en microorganismos transformados (preferentemente bacterias, especialmente bacterias gram-negativas, tal como E. coli) así como en células vegetales transformadas y en plantas o bien en su DNA. Tales vectores, microorganismos transformados (que pueden contener también estos vectores) así como las células vegetales transformadas y las plantas y su DNA constituyen parte integrante de la presente invención. Tal como ya se ha indicado, se incorporará la secuencia de DNA I según la invención una o varias veces (en puntos idénticos o diferentes del ge oma) en el genoma ve-getal natural . La presente invención se refiere por lo tanto a un procedimiento para la obtención de células vegetales transgénicas (con inclusión de protoplastos) y de plantas (con inclusión de partes de plantas y semillas) , presentando estas plantas esterilidad masculina y presentando, en caso dado, un color modificado de la floración, que se caracteriza porque (a) se inserta una o varias veces la secuencia de DNA I y/o el DNA recombinante según la invención, en el genoma de las células vegetales (con inclusión de protoplastos) y, en caso dado (b) se regeneran de las células vegetales transformadas (con inclusión de protoplastos) plantas com- pletamente transformadas y, e caso dado se multiplican y, en caso dado (c) se recogen de las plantas transgénicas así obtenidas, de la generación inicial o de otras generaciones, obtenidas a partir de la misma, las partes deseadas de las plantas (con inclusión de semillas) . Las etapas del procedimiento (a) , (b) y (c) pueden llevarse a cabo según procedimientos y métodos conocidos y de manera usual . Las células vegetales transgénicas (con inclusión de protoplastos) y las plantas (con inclusión de partes de las plantas y de las semillas) , que contienen una o varias veces la secuencia de DNA I a modo de DNA "foráneo" y sus descendientes así como las células vegetales transformadas y las plantas, que pueden obtenerse según el procedimiento anteriormente citado y sus descendientes, pertenecen tam-bien a la presente invención. También so parte de la presente invención: (a) el empleo de la secuencia de DNA I y/o del DNA recombinante según la invención y/o del vector recombinante según la invención y/o de los micro- organismos transformados según la invención para la transformación de células vegetales (con inclusión de protoplastos) y de plantas (con inclusión de partes de las plantas y semillas) , (b) el empleo de las células vegetales transgénicas según la invención (con inclusión de protoplastos) y de plantas (con inclusión de partes de las plantas y semillas) para la generación de material de reproducción así como para la generación de nuevas plantas y su material de reproducción, (c) el empleo de la secuencia de DNA I según la invención y/o del DNA recombinante según la invención para la generación de esterilidad masculina y, en caso dado, de un color modificado de la floración en plantas, (d) el empleo la secuencia de DNA I, contenida en el plásmido pSSVstl, para detectar la presencia de la secuencia de DNA I en plantas así como (en general) en la generación de células vegetales transgénicas (con inclusión de protoplastos) y de plantas (con inclusión de partes de las plantas y semillas) , así como (e) el empleo de la secuencia de DNA que codifica la estilbensintasa para la generación de plantas transgénicas, que tienen esterilidad masculina y/o que presentan una coloración modificada de la flsracicn frente a .las plantas correspondientes, que no contienen es-te DNA en su genoma. Se dispone de una pluralidad de métodos diferentes para insertar la secuencia de DNA I, a modo de DNA "foráneo" en el material genético de las plantas o bien en las células vegetales. La transferencia genética puede llevarse a cabo según los métodos usuales, conocidos en general, pu- diendo determinar el técnico en la materia, sin dificultad, ios métodos adecuados en cada caso. El plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens está disponible a modo de vector especialmente conveniente y am- pliamente empleable para la transferencia de DNA foráneo en el gensma de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas. En este caso se introducirá la secuencia de DNA I de manera adecuada en la T-DNA de plásmidos Ti adecuados (por ejemplo Zambryski et al., 1983) y transfefirse por infección de la planta, infección de partes de la planta o de tejidos vegetales, tales como, por ejemplo, discos de hojas, tallos, hipocotiios, cotiledones, meriste as y tejidos derivados de los mismo, tales como, por ejemplo, embriones secundarios y callos o mediante cultivo de protoplastos con Agrobac-ter um tumefaciens. Una alternativa consiste en la incubación de la secuencia de DNA I o del DNA recombinante con protoplastos vegetales (por ejemplo Hain et al, 1985; rens et al., 1982; Paszkowski et al., 1984) en presencia de policationes o sales de calcio y de polietilenglicol. La absorción del DNA puede favorecerse también adicionalmente por medio de un campo eléctrico (electropo- ración) (por ejemplo Fromm et al., 1986). El DNA puede insertarse de manera conocida tam- .én a través de polen vegetal, por ejemplo "bombardeando" el polen o tejidos vegetales con partículas físicamente aceleradas, que porten el DNA (véase la EP-A 0 270 356) . La regeneración de las plantas se lleva a cabo de manera conocida con ayuda de medios nutrientes adecuados (por ejemplo Nagy y Maliga 1976) . En una forma de realización preferente del proce- dimiento según la invención (según el método de la EP-A 116 718) se clona la secuencia de DNA I, como la que está contenida en el plásmido pSSVstl, en un vector de E. coli intermediario adecuado, por ejemplo pGV700 o pGV7l0 (véase la EP-A-116 718) o bien preferentemente derivados del mismo, que contengan, además, un gen indicador tal como, por ejempio, nptll (Herrera-Estrella et al., 1983) o hpt (Van den ?lzen et al . , 1986) .

El plásmido construido de este modo se transfiere sobre Agrobacterium tumefaciens que contiene, por ejemplo, el pGV 3350 o bien derivados del mismo (Zambryski et al., 1983), con métodos usuales (por ejemplo Van Haute et al., 1983) . Alternativamente puede clonarse la secuencia de DNA I en un vector binario, por ejemplo PCV001 o PCV002 (por ejemplo Koncz y Schell, 1986) y transferirse, como se ha descrito anteriormente, a una cepa de Agrobacterium adecuada (Koncz y Schell, 1986) . La cepa de Agrobacterium re- sultante, que contiene la secuencia de DNA I en una forma transferible a las plantas, se empleará después para la transformación de plantas. El plásmido pSSVstl puede insertarse también directamente en una cepa de A. tumefaciens adecuada (véase, por ejemplo, Koncz y Schell (1986)). En otra forma de realización preferente se transferirá el plásmido pSSVstl, que contiene un gen indicador para células vegetales para la resistencia a la canamicina (por ejemplo Herrera-Estrella et al., 1983), de manera usual mediante transferencia génica directa sobre los pro- toplastos vegetales (por ejemplo Hain et al., 1985) . En este caso puede presentarse el plásmido pSSVstl en forma circular, preferentemente sin embargo en forma lineal. Cuando se emplea el pSSVstl con gen indicador se verificaran entonces los protoplastos resistentes a la canamicina con respecto a la expresión de la las estilbensintasas. Las plantas o bien las células vegetales transformadas (transgénicas) se generan según losa métodos cono-c dos, por ejemplo mediante transformación de discos de ho-jas (por ejemplo Horsch et al., 1985) mediante co-cultivo de protoplastos vegetales regenerantes o cultivos celulares con Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo Marton et al., 1979, Hain et al., 1985) o mediante transfección directa del DNA. Las plantas transformadas, resultantes, se detectaran bien por selección por la expresión del gen indicador, por ejemplo mediante el fosforilado de sulfato de canamicina in vitro (Reiss et al., 1984; Schreier et al., 1985) o mediante la expresión de nopalinsintasa (según Aerts et al., 1983) o de la estilbensintasa mediante análisis de Northern-Blot y Western-Blo . La estilbensintasa y los estilbenos pueden detectarse también en las plantas transformadas de manera conocida con ayuda de anticuerpos específicos. Las estilbensintasa puede detectarse también mediante ensayos de actividad enzimática (Rolfs et al., Plant Cell Reports 1, 83-85, 1981) . El cultivo de las plantas transformadas así como la regeneración para dar plantas completas se lleva a cabo según los métodos usuales en general con ayuda de medios nutrientes adecuados en cada caso. Tanto las células vegetales transformadas, como las plantas transformadas, que contienen la secuencia de DNA I según la invención y que son parte integrante de la presente invención, muestran una resistencia sensiblemente acrecentada contra las pestes, especialmente contra los hongos fitopatógenos .

En relación con la presente invención, el concepto "plantas" significa tanto las plantas completas como también partes de las plantas, tales como hojas, tallos o raíces así como material de reproducción, tales como semi-lias, bulbos, plantones etc. La expresión "células vegetales" abarca protoplastos, líneas celulares, callos vegetales etc. Tal como ya se ha indicado, las plantas, que contienen en su genoma la secuencia de DNA I según la inven- ción, presentan una esterilidad masculina y, en caso dado, una coloración de la floración diferente, en comparación con la de las plantas correspondientes, que no contienen la secuencia de DNA I. En las plantas ornamentales y las flores para cortar, por ejemplo rosas, claveles etc. Tiene un significado comercial considerable la coloración de la floración. Frecuentemente es difícil y costoso el influjo específico sobre la coloración de la floración y la consecución de colores estable de la floración. La presente invención posibilita de manera relativamente sencilla, la modificación del color de la floración de todas las plantas de florezcan con color, que presenten coloración de la floración, especialmente antocianos. Por regla general las floraciones se volverán mas claras y, frecuentemente co - pletamente blancas, mediante la incorporación de la secuencia de DNA I. En el caso de las plantas sin color en la floración, no puede reconocerse en general una modificación o únicamente puede hacer con dificultad. La esterilidad masculina de las plantas juega un gran papel en el cultivo de las plantas en la generación de líneas híbridas y de semillas híbridas. Infelizmente muchas líneas híbridas son muy sensibles frente a los hongos fito-patógenos, de manera que, de este modo, quedan muy limitadas sus posibilidad de aplicación. Con ayuda de la presente invención es posible, de forma relativamente sencilla, generar plantas con esterilidad masculina. Estas plantas pre- sentan, además, una resistencia acrecentada contra las pestes microbianas de las plantas, tales como hongos, bacterias y/o virus fitopatógenos, especialmente contra hongos fítopatógenos y, por lo tanto, son superiores con respecto a otras plantas con esterilidad masculina obtenidas por otros procedimientos. A las plantas, a las que se les puede proporcionar una esterilidad masculina mediante la incorporación (transformación) de la secuencia de DNA I según la invención, pertenecen prácticamente todas las plantas. Una ne- cesidad especial a este respecto se presenta, naturalmente, en el caso de plantas de cultivo, tales como plantas suministradoras de artículos comestibles y de materia primas, por ejemplo cereales (especialmente trigo, centeno, cebada, avena, mi]o, arroz y maíz) , patatas, leguminosas (tales co- mo legumbres y, especialmente, alfalfa, judías) , verduras (especialmente variedades de col y tomates) , frutales (especialmente manzanos, perales, guindos, vides, cítricos, palmeras de ananas y bananeros) , palmeras de aceite, arbustos de te, de cacao y de café, tabaco, sisal y algodón así como en plantas medicinales tales como rauwolfia y digitales. Pueden citarse de forma especialmente preferente arroz, trigo, cebada, centeno, maíz, caña de azúcar, colza y soja. La presente invención se explicará con mayor detalle por medio de las realizaciones ejemplificativas siguientes . I) Transformación de plantas 1. Construcción v descripción del vector pSSVstl La construcción del plásmido pSSVstl se ha explicado ya en detalle anteriormente y se ha representado en la figura 1, de modo que puede llevarse a cabo por el técnico en la materia sin mas. El plásmido pSSVstl es un derivado de pSS. El pSS representa un derivado de PCV001 (Koncz y Schell, 1986), que contiene un cassette de expresión, basado en el plásmido pRTIOl (Tópfer et al., 1987), en el que se ha llevado a cabo una duplicación del reforzador CaMV 35S RNA mediante clonación del fragmento Ddel/EcoRV en el punto de corte Hincll. El pSSVstl contiene la secuencia codificante así como la secuencia poliA de la estilbensintasa procedente de pVstl (véase la figura 1) . El pSSVstl contiene una resis- tencia a la canamicina para plantas y una resistencia bacteriana a la ampicilina. Además el pSSVstl contiene secuencias de delimitación procedentes del plásmido Ti de Agro-bacterium tumefaciens así como un iniciador de replicación para A. tumefaciens y E. coli (Koncz y Schell, 1986). El piásmido pSSVstl puede movilizarse, con ayuda de la cepa E. colí RH pSSVstl, directamente en un Agrobacterium tumefa-ciens adecuado (por ejemplo Koncz y Schell, 1986) . 2 • Tranaformación de tabaco a) Cultivo de tallos de tabaco y aislamiento de protoplastos de tabaco: Se multiplica nicotina tabacum (Petit Havana SR1) como cultivo en tallo estéril sobre medio LS exento de hormonas (Linsmaier y Skoog 1965) . A intervalos de aproximadamente 6 a 8 semanas se trasplantan segmentos de tallo a medio LS fresco. Los cultivos en talle se mantienen en un recinto de cultivo a 24-26°C con 12 horas de luz (1000-3000 lux) . Para el aislamiento de los protoplastos de las hojas se cortan en pequeños trozos (0,5 cm x 1 cm) aproximadamente 2 g de hojas (longitud aproximada 3-5 cm) con una cuchilla de afeitar nueva. El material de las hojas se incuba en 20 mi de solución enzimática, constituida por medio K3 (Nagy y Maliga, 1976) , sacarosa 0,4 m, pH 5,6, 2% de celulasa RIO (Serva), 0,5 % de macerozima RIO (Serva) durante 14-16 horas a temperaturas ambiente. Seguidamente se separan los protoplastos, mediante filtración a través de tamices de acero de 0,30 mm y de 0,1 mm, de los restos celulares. El filtrado se centrifuga durante 10 minutos a 100 x g. Durante esta centrifugación flotan protoplastos intac-tos y se acumulan en una banda en el borde superior de la solución enzimática. El pellet constituido por los restos celulares y la solución enzimática se separa, mediante filtración por succión, en un capilar de vidrio. Los proto-plastos pre-purificados se completan con medio K3 fresco (sacarosa 0,4 M como osmótico) hasta 10 mi y se flotan de nuevo. El medio de crecimiento se separa mediante filtración por succión y los protoplastos se diluyen a 1-2 x 105 /mi para el cultivo o para la infección subsiguiente con Agrobacterium (co-cultivo) . La concentración de protoplastos se determina en una cámara de conteo. b) Transformación de protoplastos de tabaco regeneradores por co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens: A continuación se empleará el método de Marton et al., 1979 con pequeñas modificaciones. Los protoplastos se aislan como se ha descrito y se incuban, con una densidad de 1-2 x 105/ml en medio K3 (sacarosa 0,4 m, 0,1 mg/1 NAA, 0,2 mi en medio K3 (sacarosa 0,4 m, 0,1 mg/1 NAA, 0,2 mg quinetina) durante 2 días en la obscuridad y durante uno a dos días bajo luz débil (500 lux) a 26"C. Tan pronto como se produzca la primera división de los protoplastos, se agregaran 30 µl de una suspensión de Agrobacterium, que contienen la secuencia I en un T-DNA o que contienen el plásmido pSSVstl, en medio minimal A (Am) (densidad aproxi- ada 109 Agrobacterios/ml) a 3 mi de protoplastos regeneradores. La duración del cultivo es de 3-4 días a 20°C en la obscuridad. Seguidamente se cargan las células de tabaco en tubitos de centrifugado de 12 mi, se diluyen con agua de mar (600 mOsm/kg) hasta 10 mi y se pelletizan a 60 x g durante 10 minutos. Este proceso de lavado se repite 1-2 veces mas para eliminar la mayor parte de los Agrobacterios. La suspensión celular se cultiva con una densidad de 5 x 104/mi en medio K3 ) sacarosa 0,3 m) con 1 mg/1 de NAA (ácido naftil-l-acético) , 0,2 mg/1 de quinetina y 500 mg/1 del antibiótico de cefalosporina Cefotaxim. La suspensión celular se diluye todas las semanas con medio K3 fresco y se reduce, semanalmente, el valor osmótico del medio gradualmente en una proporción 0,05 m de sacarosa (aproximadamente 60 mOsm/kg) . La selección con canamicina (100 mg/1 de sulfato de canamicina (sigma) , 660 mg/g de canamicina activa) se inicia al cabo de 2-3 semanas desde el co-cultivo en agarosa "bead type culture" (cultivo tipo perla) (Shillito et al., 1983). Las colonias resistentes a la canamicina pueden diferenciarse, al cabo de 3-4 semanas desde el inicio de la selección, del fondo de las colonias remanentes, c) Transformación directa de protoplastos de ta- baco con DNA. Transformación con nitrato de calcio-PEG. Se mezclan cuidadosamente en una cápsula de Petri aproximadamente 10° protoplastos en 180 µl de medio K3 con 20 µl de solución acuosa de DNA que contiene 0,5 µg/µl de plásmido pSSVstl o la secuencia de DNA I aislada del pSSVstl como fragmento de DNA y 0,5 µl/µl de pLGVneo2103 (Hain et al . , 1985) . Seguidamente se agregan cuidadosamente 200 µl de solución de fusión (nitrato de calcio 0,1 m, ma-nita 0,4 M, 25 % de polietilenglicol (PEG 6000), pH 9). Al cabo de 15 minutos se agregan 5 mi de solución de lavado (nitrato de calcio 0,275 M, pH 6) y, al cabo de otros 5 minutos, se transfirieron los protoplastos a un tubito de centrifugado y se pelletizan a 60 x g. El pellet se recoge en una pequeña cantidad de medio K3 y se cultivan como se ha descrito en el párrafo siguiente. Alternativamente pueden transformarse los protoplastos según Hain et al., 1985. La transformación con la secuencia DNA I proce- dente de pSSVstl puede llevarse a cabo incluso sin adición de los 0,5 µg/µl de pLGVneo2103. Puesto que, en este caso, no se emplean genes indicadores, los callos resultantes se ensayarán con respecto a la existencia de la unidad génica- secuencia de DNA I con ayuda de una hibridación Dot-Blot. Como muestra de hibridación puede emplearse la secuencia codificante de pSSVstl. Evidentemente pueden emplearse también otros métodos de detección, tal como el ensayo con anticuerpos o el ensayo enzimático para estilbensintasa. d) Cultivo de los protoplastos incubados con DNA y selección de callos resistentes a la canamicina: Para el cultivo descrito a continuación y la selección de las colonias resistentes a la canamicina se empleará una técnica de "bead type culture" modificada (Shillito et al., 1983) . Una semana después del tratamiento de los protoplastos con DNA (véase c) ) se mezclan, en cápsulas de Petri de 5 cm, 3 mi de la suspensión celular con 3 mi de medio K3 (sacarosa 0,3 M + hormonas; 1,2 % (placa marina) LMT Agarosa (agarosa de bajo punto de fusión, coloide marino) . Para esta finalidad se seca en autoclave agarosa y, tras adición de medio K3 , se seca brevemente en un horno de micro-ondas. Tras solidificación de la agarosa se transfieren los discos de agarosa ("perlas") con los mi-crocallos de tabaco incrustados a cápsulas de Petri de 10 cm, para su cultivo ulterior y selección y se agregan, respectivamente, 10 mi de medio K3 (sacarosa 0,2 M, l mg/1 NAA, 0,2 mg/1 quinetina) y 100 mg/1 de sulfato de canamici- na (sigma) . El medio líquido se cambia semanalmente. En este caso se reduce escalonadamente el valor osmométrico del medio . Se reduce semanalmente el medio de intercambio (K3 + Km) en una proporción de 0,05 m de sacarosa (aproxi- adamente 60 mOsm) . Esquema de selección de colonias de tabaco r s- tentes a la canamicina después de la transformación del DNA: 0,4 M 0,3 M 0,25 M 0,20 M 0,15 M 0,10 M Sacarosa en el mediolíquido A ES K 1 2 3 4 5 6 semanas tras absorción del DNA (medio K3 1 mg NAA, 0 , 2 mg quinetina) A = absorción de DNA ? = incrustación en agarosa S = selección con canamicina (100 mg/1 de sulfato de canamicina) K = las colonias resistentes a la canamicina pueden diferenciarse claramente del fondo e) Regeneración de plantas resistentes a la canami- • ciña: Tan pronto como las colonias resistentes a la canamicina hayan alcanzado un diámetro de aproximadamente 0,5 cm, se aplicará la mitad del medio de regeneración (medio LS, 2% de sacarosa, 0,5 mg/1 de bencilamínopurina BAP) y se mantienen en el recinto de cultivo con 12 horas de lµz (3000-5000 lux) y a 24°C. La otra mitad se propaga como cultivo de callo sobre medio LS con 1 mg/1 de NAA, 0,2 mg/1 de quinetina, 0,1 mg/1 de BAP y 100 mg/1 de sulfato de canamicina. Cuando los tallos regenerados tenga un tamaño aproximado de 1 cm se cortaran y se dispondrán sobre medio 1/2 LS (1 % de sacarosa, 0,8 % de agar) sin reguladores del crecimiento, para el enraizado. Los tallos se enraizan sobre medio 1/2 LS con 100 mg/1 de sulfato de canamicina y después de trasplantan a tierra. f) Transformación de discos de hojas por medio de Agrobacterium tumefaciens Para la transformación de discos de hojas (Horsch et al., 1985) se troquelan hojas, con una longitud de 2-3 cm de cultivos en tallo estériles, en discos con un diámetro de 1 cm y se incuban con una suspensión de los Agrobac-cerios correspondientes, que contiene el plásmido pSSVstl o la secuencia de DNA I de este plásmido en su T-DNA (apro-ximadamente 109/ml) (véase b) ) , en medio Am (véase mas abajo) durante aproximadamente 5 minutos. Los trozos de hoja infectados se mantienen sobre medio MS (véase mas adelante) sin hormona durante 3-4 días aproximadamente a 24 °C. Durante este tiempo el Agrobacterium cubre los trozos de hoja. Los trozos de hoja se lavan seguidamente en medio MS (0,5 mg/ml BAP, 0,1 mg/ml NAA) y se disponen sobre el mismo medio (0,8 % de agar) con 500 g/ml de cefoxatim y 100 g/ml de sulfato de canamicina (sigma) . Al cabo de dos semanas debe renovarse el medio. Pueden verse tallos transformados al cabo de otras 2-3 semanas. Métodos biosuímicos de detección de la transformación Ensayo enzi ático con neomicina-foßfotranßferasa (NPT II) : Se detecta la actividad NPT II en tejido vegetal mediante la fosforilación in situ de canamicina, como se ha descrito por Reiss et al., (1984) y como se ha modificado por Schreier et al., (1985) , de la manera siguiente. Se ho- ogeneizan 50 mg de tejido vegetal en 50 µl de tampón de extracción (10 % de glicerina, 5 % de 2-mercaptoetanol, 0,1 % de SDS, 0,025 % de azul de bromofenol, 62,5 mM de Tris pH 6,8) con adición de polvo de vidrio sobre hielo y se centrifugan durante 10 minutos en una centrifugadora Eppen- dorf a 4°C. Se transfieren 50 µl del sobrenadante sobre un gel nativo de poliacrilamida (145 x 110 x 1,32 mm; gel de separación: 10% de acrilamida, 0,33 % de bisacrilamida, 0,375 M de Tris pH 8,8, gel recolector: 5 % de acrilamida, 0,165 % de bisacrilamida, 0,125 M de Tris pH 6,8) y se so-meten a electrofóresis durante la noche a 4ßC y 60 V. Tan pronto como se desprende del gel el marcador de azul de bromofenol, se lavará el gel dos veces con agua destilada durante 10 minutos y una vez durante 30 minutos con tampón de reacción (67 M de Tris-maleato, pH 7,1, 42 mM de MgCl2, 400 mM de cloruro amónico) . El gel se dispone sobre una placa de vidrio del mismo tamaño y se cubre con 40 mi de agarosa al 1 % en tampón de reacción, que contiene el substrato de sulfato de canamicina (20 g/ml) y 20-200 Ci 32P ATP (Amersham) . El sandwich de gel se incuba durante 30 mi- utos a temperatura ambiente y, seguidamente, se dispone una hoja de papel de fosfocelulosa P81 (Whatman) sobre la agarosa. Por encima se apilan cuatro capas de papel de filtro 3 MM, (Whatman) y algunos pañuelos de papel. La transferencia del fosfato de canamicina radioactivo fosforilado in situ al papel P81 se detiene al cabo de 3-4 horas. El papel P81 se incuba durante 30 minutos en una solución de prsteinasa K y 1 % de dodecil sulfato sódico (SDS) a 60°C y, seguidamente, se lava en 250 mi de tampón de fosfato 10 M, pH 7,5, a 80 °C, se seca y se auto-radiografía durante 1-12 horas a -70°C (película XAR5 Kodak) . En las células vegetales y plantas (tabaco) , obtenidas según los ejemplos anteriores se confirmó la pre-sencia de la secuencia de DNA que codifica la estilbensintasa por medio del análisis de Southern Blot . La expresión de la secuencia que codifica la estilbensintasa se demostró análisis de Northern Blot, la de la estilbensintasa y del resveratrol con ayuda de anticuerpos específicos. Las plantas transformados y no transformadas (con fines comparativos) se cultivaron en el invernadero hasta la floración. Las plantas transformadas mostraron (con respecto a las plantas comparativas no transformadas) una coloración modi- ficada de la floración y tenían esterilidad masculina. Los medios empleados en la transformación de plantas o bien ce células vegetales se describen, entre otras publicaciones, en la EP-A 0 309 862. Todas las indicaciones en porcentaje en los ejem- píos anteriores, así como en los que siguen, se refieren a porcentajes en peso, cuando no se diga otra cosa. II) Ensayo de plantas tranßgénicas con respecto a una coloración modificada de la floración así como a la esterilidad masculina. Ejemplo A Las plantas de tabaco transgénicas obtenidas según los ejemplos anteriores se cultivan en cultivo de tejido y, seguidamente, se dejan crecer en el invernadero a 23 °C y con una humedad relativa del aire del 70-80 % hasta la floración. El tratamiento de abono y agua se verificó según las necesidades. Todas las plantas transformadas según el ejemplo I) mostraron una coloración de la floración blanco o blanco -rosa y se mantuvo incluso tras el recruzamiento con el tipo nativo en la generación Fl, mientras que las plantas de control correspondientes, no transformadas, mostraron una coloración de la floración vivo rojo, rosa obscuro y púrpura. Del mismo modo todas las plantas transformadas tenían esterilidad masculina, manteniéndose esta esterilidad incluso en la generación Fl. Para la transformación de las plantas pueden tomarse en consideración las publicaciones siguientes: Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Adams S.P., Bittner M.L., Brand L.A., Fink C.L., Fry J.S., Fallupi G.R., Golderg S.B., Hoffmann N.L., Woo S.C, (1983), Expression of bacterial genes in plant cells. Proc.Natl.Acd. Sci. USA 80:4803-4807. Fromm ME, Taylor LP, Walbot V (1986) Estable transformation of maize after gene tranfer by electropora- tion. Nature 319: 791-793. Hain, R. Stabel, P., Czernilofsky, A.P., Stein- biß, H.H., Herrera-Estrella, L. Schell, J. (1985) Uptake, integration, expression and genetic transmission of a se- lectable chimeric gene by plant protoplasts. Molec Gen Genet 199: 161-168. Hain R., Bieseler B., Kindl H., Schróder G., Stócker R. (1990) Expression of a stilbene synthase gene un Nicotiana tabacum results in synthesis of the phytoalexin resveratrol. Plant Mol, Biol. 15: 325-336. 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Rolf, C.H., Fritzemeier K.H. and Kindl H. (1981) Cultured cells of Arachis hypogaea susceptible to induction of stilbene synthase (resveratrol forming) Plant Cell, Rep. 1: 83-85. Schróder, G., Brown J.W.S. and Schrdder, J. (1988) Molecular analysis of resveratrol synthase: cDNA, genomic clones and relationship with chalconsynthase. Eur. J.Sicchem. 172, 161-169. Shillito RD, Paszkowski J. Potrykus I (1983) Aga- rose plating and Bead type culture technique enable and stimulate development of protoplast-derived colonies in an number of plants species. Pl Cell Rep 2: 244-247 Van den Elzen PJM, Townsend J, Lee KY, 3edbrook JR (1985) A chimaeric resistance gen as a selectable marker in plant cells. Plant Mol,Biol. 5, 299-302. Van den Elzen PJM, Townsend J, Lee KY, Bedbrook JR (1985) A chimaeric resistance gen as a selectable marker in plant cells. Plant Mol. Biol, 5, 299-302. Velten J, Velten L, Hain R, Schell J (1984) Iso- lation of a dual plant promotor fragment from the Ti Plas- mid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J 12: 2723-2730. Van haute E, Jóos H, Maes M, Warren G, Van Monta- gu M, Schell J (1983) Intergenic transfer and excharge re- combination of restriction fragments clones in pBR 322: a novel strategy for the reversed genetics of Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J 2: 411-418. Zambryski P, Jóos H, Genetello C, van Montagu M, Schell J (1983) Ti-plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without altering their normal regeneration capcity, EMBO J 12: 2143-2150. Reiss, B., Sprengel, Will H., and Schaller H (1984) A new sensitive method for qualitative and quantita- tive assay of neomycin phosphotransferase in crude cell tracts, GENE 1081: 211-217. Schreier P.H., Seftor E.A., Schell J. and Bohnert H.J. (1985) The use of nuclear-encoded sequences to direct the light-regulated synthesis and transport of a foreingn protein into plant chloroplats, EMBO J Vol. 4, 1: 25-32.

Además pueden indicarse las solicitudes de patente publicadas siguientes: EP-A 116 718 EP-A-12 546 EP-A 159 418 EP-A-164 597 EP-A 120 515 EP-A-175 966 EP-A-120 516 WO 84/02913 EP-A-172 112 WO 84/02919 EP-A-140 556 WO 84/02920 EP-A-174 166 WO 83/01176 EP-A-122 791 EP-A-0 464 461 EP-A-0 309 862 EP-A-0 533 010 PROTOCOLO DE LA SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Bayer AG (B) CALLE: Bayerwerk (C) LOCALIDAD: Leverkusen (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL: D-51368 (G) TELEFONO: 0214/30 66400 (H) TELEFAX: 0214/30 3482 (I) TELEX: 85 101-265 by d (ii) TITULO DE LA SOLICITUD: Secuencias de DNA y su empleo (iii) NUMERO DE LAS SECUENCIAS: 7 (iv) FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR: (A) SOPORTE DE DATOS: disco Floppy (B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA DE TRABAJO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25 (EPA) (2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEQ ID NO: 1 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (O FORMA DE LA HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómica) {iii) HIPOTETCIA: NO (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: TCCCCCGGGA TCCATGGCTT CAATTGAGGA AAT 33 (2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEQ ID NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómica) (iii) HIPOTETCIA: NO (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2: TCCCCCGGGA TCCATGGCGT CTGTGGAGGA AAT 33 (2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEQ ID NO: 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómica) (iii) HIPOTETCIA: NO (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: TCCCCCGGGA TCCATGGTGT CTGTGAGTGG AAT 33 (2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEQ ID NO: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómica) (iii) HIPOTETCIA: NO (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: TGAATTCCCG GGTCAATTTG TAACCATAGG AA 32 (2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEQ ID NO: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómica) (iii) HIPOTETCIA: NO (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 5: CGGATCCCGG GTCAATTGGA ATCCCTAGGA A 31 (2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEQ ID NO: 6 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómica) (iii) HIPOTETCIA: NO (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: CGGATCCCGG GTCTTCGCAT AACGAATTAA CT 32 (2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEQ ID NO : 7 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 2728 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE LA MOLÉCULA : DNA (genómica ) ( iii ) HIPOTETCIA : NO ( XI ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 7 : AAGCTTGCAT GCCTGCAGGT CTCAGAAGAC C?GAGGGCTA tTGAGACTTt TCAACAAAGG 60 GTAATATCGG GAAACCTCCT CGGATTCCAT TGCCCAGCTA TCtGTCACTT CATCGAAAGG 120 ACAGTAGAAA AGGAAGATGG CTTCTACAAA TGCCATCATT GCGATAAAGG AAAGGCTATC 180 GTTCAAGAAX GCCTCTACCG ACAGTGGTCC CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAACAT 240 CGTGGAAAAA GAAGACGTTC CAACCACGTC TTCAAAGCAA GTGGATTGAT GTGATAACAT 300 GGTGGAGCAC GACACTCTCG TCTACTCCAA GAATATCAAA GATACAGTCT CAGAAGACCA 360 GAGGGCTATT GAGACTTTTC AACAAAGGGT AATATCGGGA AACCTCCTCG GATTCCATTG 420 CCCAGCTATC TGTCACttCA tCGAAAGGAC AGTAGAAAAG GAAGATGGCT TCTACAAATs 480 CCATCATTCC GATAAAGGAA AGGCTATCGT TCAAGAATGC CTCTACCGAC AGTGGTCCCA S40 AAGATGGACC CCCACCCACG AGGAACATCG TGGAAAAAGA AGACGTTCCA ACCACGTCTT 600 CAAAGCAAGT sGATTGATGT GATATCTCCA CTGACGTAAG GGATGACGCA CAATCCCACT 660 ATccttcscA AGACCCGTCC TCTATATAAG GAAGTTCATT TCAGTTCGAG AGGACCTCGA 720 GAATTCCACC ATGGCTTCAA TtGAGGAAAT TAGAAACGCT CAACGTGCCA AGGGTCCGGC 780 CACCATCCTA GCCATTGGCA CAGCTACTCC CGACCACTGT GTOTACCAGT CTCATTATGC 940 TGATTACTAT TTCAGAGTCA CTAAGAGCGA GCACATGACT GAGTTGAAGA AGAAGTTCAA 900 TCGCATATGT AAGTATATAT ATTCATGCAT TAATTCTTAC ATTCACAACA TTTCTATACA 960 TATACGAGTG TGCTATTAAG TGAGGGTCAC CTCCAAGTGA ATGAATGTTT CAAGCTTAGA 1020 GAATAGCTrr TAGCTAAATT ACTtTAGGAA ACTTGAAAAT CATTTTACAT CAGTAACCGA 1080 TATTCCTTTC ATTTGAtTGT AAGGGCTTGA AGAGCTGTTC TTTGAATCAT GTAGCATTGC 1140 TAGCTATAAT TAAGAATAAC CTTTTATAAT TTCTTCAATG TTAAATGCAT GTTGATCATC 120 TTCAAGAATA TACTATATGA CTAGTCGTGG GAAAACTAAT GTGtTCATCT TATTTCTTTT 12 S ACAGGTGACA AATCAATGAT CAAGAAGCGT TACATTCATT TGACCGAAGA AATGCTTGAG 1320 GAGCACCCAA ACATTssTGC TTATATGGCT CCATCTCTCA ACATACGCCA AGAGATTATC 1380 ACTGCTGAGG TACCTAAACT TGGTAAAGAA GCAGCATTGA AGGCTCTTAA AGAATGGGGT 1440 CAACCAAAGT CCAAGATCAC CCATCTTGTA TTTTGTACAA CCTCCGGTGT AGAAATGCCC .1500 GGTGCAGATT ACAAACTCGC TAATCTCTTA GGCCTTGAAA CATCGGTTAG AAGGGTGATC 1560 TTGTACCATC AAGGTTGCTA TGCAGGTGGA ACTGTCCTTC GAACTGCTAA GGATCTTGCA 1620 GAAAATAACG CAGGAGCACG AGTTCTTGTG GTGTsCTCTG AGATCACTGT TGTTACATTT 1680 CGTGGGCCTT CCGAAGATGC TTTGGACTCT TTAGTAGGTC AAGCCCtTTT TGGTGATGGs 1740 rcAGCAGcts TGATTGttsG ATCAGATCCA GATGTCTCCA TGCAACGACC CCTCTTCCAA IS O O CTTGTTTCAG CAGCACAAAC GTTTATTCCt AATTCAGCAG sTGCTAtTGC GGGTAACTTA 1860 CGtGAGGTGG GACTCACCTT TCACTTGTGs CCTAATsTsC CTACTTTGAT TTCCGAGAAC 1920 ATAGAGAAAT GCTTGAATCA GGCTTTTGAC CCACTTGGTA TTAGCGATTG GAACTCGTTA 1980 TTTtssATTG CTCACCCTGG TGGCCCTGCA ATTCTTsATG CAGTTGAAGC. AAAACTCAAT 2040 TTAGAGAAAA AGAAACTTGA AGCAACAAGG CATGTGTTAA GTGAGTATGß TAACATGTCT 2100 AGTGCATGTG TCTTGTTTAT TTTGGATGAG ATGAGAAAGA AATCCCTAAA GGGGGAAAAA 216 GCTACCACAG GTGACssATT GGATTGGGGM GTACTATTCG GTTTTGGGCC AGGCTTGACC 222 ATTGAGACCG TTGTGCTGCA TAGCGTTCCT ATGGTTACAA ATTGAGTGGA AAACGGTAAG 228 AGAAATGATA TAGGGGACAT GTCTTATTGT ATTACAGAGG AGGTGCTACG AAAGATATGT 234 ACATGTATCT TCAAAGTTAA TAATAGTACT CCTAAATCTT TTATTCCTAT CCTAACATTG 240 AsGGATTGTA AttTAGTGAT TsTTsGAGGG TGCAGTCACG TCAGGCAAGT GGATGAAACT 246 GCAAGTGCTT GTCATTCTGT TATCGGGGGA TCCTCTAGAG TCCGCAAAAA TCACCAGTCT 2S20 CTCTCTACAA ATCTATCTCT CTCTATTTTT CTCCAGAATA ATGTGTGAGt AGTTCCCAGA 2S80 7AAGGGAATT AGGGTTCTTA TAGGGTTTCG CTCATGTGTT GAGCATATAA GAAACCCTTA 2640 GTATGTATTT sTATTTGTAA AATACTTCTA TCAATAAAAT TTCTAATTCC TAAAACCAAA 2700 ATCCAGTGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTT 2728 Se hace constar que, con relación a este fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES 1.- Secuencia de DNA I, caracterizado porque está constituida por los co conentes siguientes, que están dispuestos entre si en orden 5' -3': a) un promotor heterólogo con respecto al componente b) , que es fuertemente activo en las plantas y/o que es antero- o tapeto-específico y que va precedido, en caso dado, por un elemento reforzador ("Enhancer") ; b) una secuencia de DNA codificadora de estilbensintasa; y c) una secuencia de 3 ' -poliadenilación; así como las secuencias de DNA derivadas de la misma.
2. 2.- Secuencia de DNA I según la reivindicación 1, caracterizado porque se emplea como componente a) un promotor de virus de olantas y, en caso dado un reforzador.
3. 3.- Secuencia de DNA I según la reivindicación 1, caracterizado porque se emplea como componente a) un promotor antero- o tapeto-específico.
4. 4.- Secuencia de DNA I según la reivindicación 1, caracterizado porque se emplea como componente a) el promotor CaMV 35S.
5. 5.- Secuencia de DNA I según la reivindicación 1, caracterizado porque se emplea como componente a) el promotor CaMV 35S, delante del cual se ha colocado el reforzador CaMV 35S.
6. 6.- Secuencia de DNA I según la reivindicación 1, caracterizado porque se emplea como componente a) el constructo formado por el promotor CaMV 35S y el reforzador CaMV 35S, que está contenido en el plásmido pSSVstl .
7. 7 . - Secuencia de DNA I según la reivindicación l , caracterizado porque se emplea como componente a) el contructo formado por el Dromotor CaMV 35S y por el reforzador CaMV 35S, que está constituido por los nucleótidos l a 720 según la SEQ ID NO : 7 o de una secuencia derivada de la misma .
8. 8 . - Secuencia de DNA I según la reivindicación 1 , caracterizado porque se emplea como componente b) una secuencia de DNA que codifica la resveratrolsintasa.
9. 9 . - Secuencia de DNA I según la reivindicación 1 , caracterizado porque se emplea como componente o) una secuencia que codif ica la resveratrolsintasa procedente de Arachis hypo- gea o de Vitis vinifera o su cDNA.
10. 10 . - Secuencia de DNA I según la reivindicación 1 , caracterizado porque se emplea como componente b) una secuencia que codifica resveratrolsintasa de Vitis vinifera o su cDNA.
11. 11 . - Secuencia de DNA I según la reivindicación 1 , caracterizado porque se emplea como componente b) la secuencia de DNA que codifica la resveratrolsintasa, que está contenida en el plásmido pSSVstl o una secuencia derivada de la misma .
12. 12 . - Secuencia de DNA I , según la reivindicación 1 , caracterizado porque se emplea como componente b) la secuencia de DNA que codifica la resveratrolsintasa, que está constituida por los nucleótidos 731 a 2265 según la SEQ ID NO : 7 o or una secuencia derivada de los mismos .
13. 13 . - Secuencia de DNA I según la reivindicación 1 ( caracterizado porque se emplea como componente c) la secuencia de 3 ' -poliadenilación, que está contenida en los correspon-dientes genes naturales de estilbensintasa .
14. 14 . - Secuencia de DNA I según la reivindicación 1 1 caracterizado corsue se emplea como componente c) la secuencia de 3 ' -poliadenilación , que está contenida en el Dlásmido pSSVstl .
15. 15 . - Secuencia de DNA I según la reivindicación 1 ' caracterizado poraue se emple como componente c) la secuencia de 3 ' poliadenilación, que está constituida por los nucleótidos 2266 hasta 2485 o 2266 hasta 2728 según la SEQ ID NO : 7 o de una secuencia derivada de los mismos .
16. 16 . - Secuencia de DNA I según la reivindicación 1 , caracterizado porque está constituida por una combinación de los componentes a) hasta c ) , que está contenida en el plásmido pSSVstl o una secuencia derivada de los mismos .
17. 17 . - Secuencia de DNA I según la reivindicación 1 , caracterizado porque esta constituida por los nucleótidos 1 a 2728 seg?un la SEQ ID NO: 7 o de una secuencia derivada de los mismos.
18. 18 . - DNA recombinante procariótico o eucariótico , caracterizado porque contiene la secuencia de DNA según la reivindicación 1
19. 19 . - DNA recombinante , caracterizado porque está contenido en plantas o en células vegetales y que contiene la secuencia de DNA según la reivindicación 1.
20. 20 . - Vectores , caracterizado porque contienen la secuencia de DNA según la reivindicación 1 o el DNA recombinante según la reivindicación 18.
21. 21.- Plásmido-vector pSSVstl.
22. 22.- Microorganismos transformados, caracterizado porgue contienen la secuencia de DNA I o el DNA recombinante según la reivindicación 18.
23. 23.- Cepa de Escherichia coli RH pSSVstl (según DSM 9501) así como sus mutantes, que presentan todavía las características fundamentales para la realización de la invención.
24. 24.- Plantas transgénicas (con inclusión de partes de estas plantas así como de su material de reproducción, tales como protoplastos, células vegetales, callos, semillas, bulbos o plantones, etc.), caracterizado porque contienen en su genoma la secuencia de DNA I y que tienen esterilidad masculina y/o que presentan una coloración de la floración modificada con respecto a la de las plantas correspondientes, que no contienen la secuencia de DNA I, así como los descendientes de estas plantas.
25. 25.- Plantas transgénicas según la reivindicación 24 , caracterizado porque contiene , como secuencia de DNA I , la secuencia de DNA I que se encuentra sobre el plásmido pSSVstl o que se deriva de la misma.
26. 26. - Plantas transgénicas según la reivindicación 24, caracterizado porque contienen, como secuencia de DNA I, la secuencia de DNA I que está constituida por los nucleótidos 1 a 2728 según la SEQ ID NO: l o que la que se deriva de la misma.
27. 27.- Empleo de la secuencia de DNA I según la reivindicación 1 y/o del DNA recombinante según la reivindicación 18 y/o de los vectores según la reivindicación 20 y/o de los microorganismos transformados según la reivin-dicación 22 para la transformación de células vegetales (con inclusión de protoplastos) y plantas (con inclusión de partes de las plantas y semillas) .
28. 28.- Procedimiento para la obtención de plantas transgénicas según la reivindicación 24, caracterizado por- que (a) se inserta la secuencia de DNA I según la reivindicación 1 y/o el DNA recombinante según la reivindicación 4, en el genoma de las células vegetales (con inclusión de protoplastos) y, en caso dado (b) se regeneran a partir de las células vegetales transgénicas (con inclusión de protoplastos) plantas completamente transformadas y, en caso dado se multiplican y, en caso dado (c) se recogen de las plantas transgénicas así obtenidas, de la generación inicial o de otras generaciones, obtenidas a partir de la misma, las partes deseadas de las plantas (con inclusión de material de reproducción) .
29. 29.- Empleo de plantas trangénicas según la reivindicación 24 para la generación de material de reproducción así como la generación de plantas, que contienen la secuencia de DNA I según la reivindicación 1 o el DNA re-combinante según la reivindicación 18 y su material de reproducción.
30. 30.- Empleo de secuencias de DNA, que correspon-den total o parcialmente al DNA, que está contenido como secuencia de DNA I en el plásmido pSSVstl, como sonda para la detección del contenido de la secuencia de DNA I o de sus componente en el DNA, que debe ser ensayado con respecto a este contenido.
31. 31.- Empleo de la secuencia de DNA, que codifica la estilbensintasa, para la generación de plantas transgénicas, que presentan esterilidad masculina y/o que presentan una coloración de la floración modificada con respecto a las plantas correspondientes, que no contienen ente DNA en su genoma.