EP0805865A1 - Für glutathion-s-transferase kodierende desoxyribonukleinsäure und ihre verwendung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Desoxyribonukleinsäure (DNA) und ihre Verwendung zur Transformation von Vektoren, Wirtsorganismen und Pflanzen sowie zur Erzeugung von Pflanzen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Herbiziden aufweisen.

Description

FÜR GLUTATHION-S-TRANSFERASE KODIERENDE DESOXYRIBONUKLEINSÄURE UND IHRE VERWENDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Desoxyribonukleinsäure (DNA) und ihre Nerwendung zur Transformation von Vektoren, Wirtsorganismen und Pflanzen sowie zur Erzeugung von Pflanzen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Her- biziden aufweisen.

Es ist bereits bekannt, Pflanzen genetisch so zu verändern, daß sie gegenüber be¬ stimmten Herbiziden eine erhöhte Resistenz aufweisen. Dies ermöglicht es, Her¬ bizide, die bei einer geringen Selektivität ansonsten vorteilhafte Eigenschaften auf¬ weisen, in den Kulturen von solchen Pflanzen, die in der ursprünglichen nicht transgenen Form durch diese Herbizide geschädigt würden, einzusetzen. Durch die Bereitstellung von herbizidresistenten Pflanzen wird somit die Auswahl an ein¬ setzbaren Herbiziden vergrößert, und es ist auch in vielen Fällen möglich, mit relativ geringen Herbizidaufwandmengen auszukommen, z.B. wenn die Be¬ kämpfung der unerwünschten Pflanzen erst nach deren Auflaufen bei Erreichung der jeweiligen Schadschwelle, vorgenommen werden kann. Es besteht somit ein erhebliches Bedürfnis neue Kulturpflanzen zu erzeugen, welche gegenüber wei¬ teren Herbiziden eine erhöhte Resistenz aufweisen.

Glutathion-S-Transferasen sind multifunktionelle Proteine, die eine wesentliche Rolle bei der Entgiftung cytotoxischer Substanzen spielen. Die Enzyme kataly- sieren die Konjugation von reduziertem Glutathion an elektrophile, hydrophobe

Substrate, die natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein können.

Die physiologischen Substrate pflanzlicher Glutathion-S-Transferasen und ihre Rolle im Stoffwechsel der Pflanzen sind im einzelnen nicht bekannt. Nachgewie¬ sen ist jedoch die Beteiligung dieser Enzyme an der Entgiftung und damit am Selektivitätsmechanismus für eine Reihe wichtiger Herbizide aus der Gruppe der

Thiocarbamate, Chloroacetanilide und S-Triacine: Mozer TJ., Tiemeier D.C., Jaworski E.G., Biochemistry 22: 1068-1072 (1983); Moore R.E., Davies M S., O'Connell K.M., Harding EJ, Wiegand R.C., Tiemeier D.C., Nucleic Acids Res. 14 7227-7235 (1983), Grove G , Zarlengo R P , Timmermann K P , Li N , Tarn M F , Tue C P D , Nucleic Acids Res 16 425-438 (1988)

Es wurde nun die neue Desoxyribonukleinsäure gefunden, welche für das neue Pro¬ tein Glutathion-S-Transferase IIIc (im folgenden "GSTIIIc") kodiert, das die in SEQ ID NO 2 aufgeführte Aminosauresequenz aufweist (wobei die neue erfin¬ dungsgemäße DNA im folgenden als "GSTIIIc-DNA" bezeichnet wird )

Weiterhin wurde gefunden, daß Pflanzen, in deren Genom die neue GSTIIIc-DNA eingebaut wurde, im Vergleich zu den entsprechenden "Ausgangspflanzen", eine erhöhte Resistenz gegenüber Herbiziden, vorzugsweise Heteroaryloxyacetamid- Herbiziden, besitzen

Die neue GSTIIIc-DNA wurde aus Mais (Zea mais) der Sorte Mutin isoliert. Diese DNA kodiert für das Protein GSΗIIc der Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO 2. In Pflanzenzellen bilden 2 Moleküle des Proteins GSΗIIc spontan das dimere aktive Enzym (im folgenden als "GSTIIIc-Enzym" bezeichnet), welches für die Entgiftung des eingesetzten Herbizides sorgt und damit die Pflanzen gegen das

Herbizid resistent werden läßt

Die erfindungsgemäß bevorzugte GSTIIIc-DNA weist die in SEQ ID NO: 1 auf¬ geführte Sequenz auf

Erfindungsgemaß ebenfalls bevorzugt ist die GSTIIIc-DNA, wie sie auf den weiter unten beschriebenen Vektor Plasmiden pET3a-GSTIIIc und pSS-GSTIIIc enthalten

Die neue GSTIIIc-DNA kann in Form eines Einzel Stranges oder in Form des Dop¬ pelstranges vorliegen, der zusätzlich einen zum jeweiligen Einzelstrang komple¬ mentären Strang enthalt

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung wird der

GSTIIIc-DNA am 5'-Ende ein in Pflanzen wirksamer Promotor vorgeschaltet Hierfür können die üblichen, in Pflanzen wirksamen Promotoren verwendet wer¬ den Beispielhaft sei der Promotor des Gens der kleinen Untereinheit der Ribulose- 1,5-bψhosphat-carboxylase (rbsc) (vgl EMBO Journal, vol 5 Nr 9, 2063-2071 (1986)) genannt Bevorzugt werden Promotoren von Pflanzenviren eingesetzt, wo- bei der CaMN 35S RΝA Promotor als Beispiel genannt werden soll. Besonders bevorzugt wird das bekannte Konstrukt aus dem CaMN 35S Enhancer und dem sich in 5'-3'-Reihenfolge anschließenden CaMN 35S Promotor ("CaMV 35S-Doρ- pelpromotor") verwendet. Ein entsprechendes bevorzugtes Konstrukt aus der GSTIIIc-DΝA und dem CaMN-Doppelpromotor ist auf dem weiter unten er¬ läuterten Vektor Plasmid pSS-GSTMc enthalten. Es ist jedoch auch möglich, den natürlichen Promotor, der die Expression der GSTIIIc-DΝA in Mais, Sorte Mutin reguliert, zu verwenden.

Die Art der sich an die GSTTIIc-DΝA in 5'-3'-Reihenfolge anschließenden 3'-Ter- minationssequenz ist weitestgehend variabel und für die vorliegende Erfindung nicht von entscheidender Bedeutung. Bevorzugt werden pflanzliche 3'-Termina- tionssequenzen eingesetzt. Beispielhaft kann auch die natürliche Terminations- sequenz des GSTÜIc-Gens aus Mais, Sorte Mutin verwendet werden.

Ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung ist das neue Protein GSΗIIc mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID ΝO: 2 sowie dessen ebenfalls neues Dimeres

(GSTIIIc-Enzy ), welches, wie bereits oben ausgeführt wurde, aus 2 Molekülen des Proteins GSTIIIc nach deren Bildung in Pflanzenzellen spontan entsteht.

Zur erfindungsgemäßen DNA bzw. zum erfindungsgemäßen Protein (gegebenfalls in der dimeren Form) gehören jeweils auch die von dieser DNA bzw. von diesem Protein abgeleiteten DNA-Sequenzen bzw. Proteinsequenzen. Unter DNA bzw.

Proteinen mit abgeleiteten Sequenzen soll DNA bzw. Protein verstanden werden, welche noch die wesentlichen Merkmale der GSTIIIc-DNA bzw. des Proteins GSTIIIc (gegebenfalls als GSTIIIc-Enzym in der dimeren Form) aufweisen, die also im wesentlichen gleichwirkend sind, d.h. in Pflanzen die erfindungsgemäße Herbizidresistenz in einem ausreichenden Maße erzeugen. In solchen abgeleiteten

Sequenzen können einzelne DNA's, Kodons, und/oder DNA-Teilsequenzen bzw. einzelne Aminosäuren oder Aminosäuren-Teilsquenzen fehlen (im Falle der DNA z.B. durch die Verwendung von Restriktionsenzymen) und/oder durch andere, im wesentlichen gleichwirkende, DNA's, Kodons und DNA-Teil Sequenzen bzw. Aminosäuren oder Aminosäuren-Teilsequenzen ersetzt sein. Solche Modifikationen können aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes vorliegen oder sich bei der Manipulation der GSTIIIc-DNA bzw. des Proteins GSTIIIc oder des GSTIIIc- Enzyms ergeben. Die erfindungsgemäße DNA kann auch DNA's, Kodons oder DNA-Sequenzen enthalten, welche ihre Handhabung erleichtern, z.B. sogenannte Linker oder welche von solchen Linkern nach Manipulationen (z.B. nach Schnitten mit Restriktionsenzymen) übrig bleiben. Die GSTIIIc-DNA bzw. das Protein GSTIIIc oder das GSTIIIc-Enzym kann natürlichen Ursprungs sein oder teilweise oder vollständig in synthetisierter Form vorliegen.

Teil der vorliegenden Erfindung ist auch eine rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA, welche die neue GSTIIIc-DNA oder eine davon abgeleitete DNA als "fremde" oder "zusätzliche" DNA enthält. Beispielhaft seien virale DNA, mikrobielle DNA (insbesondere bakterielle DNA, wie DNA von Escherichia coli oder Agrobakterium tumefaciens) und pflanzliche DNA genannt.

Die erfindungsgemäße GSTHIc-DNA sowie die davon abgeleiteten DNA-Sequen¬ zen sowie die rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA sowie die davon abgeleiteten DNA-Sequenzen können als "fremde" oder "zusätzliche" DNA in Vektoren (insbesondere Plasmiden, Cosmiden oder Phagen), in transformierten bzw. transgenen Mikroorganismen (vorzugsweise Bakterien, wie Escherichia coli oder Agrobakterium tumefaciens) sowie in transformierten bzw. transgenen Pflan¬ zenzellen und Pflanzen bzw. in deren DNA enthalten sein. Diese Vektoren, Mikroorganismen, Pflanzenzellen und Pflanzen sowie deren DNA sind Teil der vorliegenden Erfindung. Sie können, ebenso wie die rekombinante prokaryontische und eukaryontische DNA durch den Fachmann bei Kenntnis der vorliegenden Beschreibung, insbesondere der SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2, gemäß den allgemein bekannten und/oder üblichen Verfahren und Methoden erhalten werden.

Als besonders bevorzugte Vektoren seien die Vektor Plasmide pET3a-GSTIIIc und pSS-GSTIIIc genannt. Beide Vektoren enthalten die erfindungsgemäße GSTIIIc- DNA gemäß SEQ ID NO: 1.

Das Plasmid pET3a-GSTIIIc enthält die GSTIIIc-DNA auf einem Ndel/BamHI-

Fragment. Zur Konstruktion dieses Plasmides wurde die GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO: 1 in die Ndel und BamHI Schnittstellen des Vektors pET-3a (Novagen/Madison) kloniert (Studier F.W., Moffatt B.A., J. Mol. Biol. 189: 1 13- 130; Studier F.W., J. Mol. Biol. 219:37-44 (1991)). Dieses Plasmid (5306 bps) wird in Fig. 1 dargestellt. Die Pfeilrichtung zeigt die Richtung des Promotors und des Gens bzw. der GSTIIIc-DNA mit dem Startkodon ATG. "Amp" steht für das Ampicillin-Resistenzgen. Zur Konstruktion des Plasmids pSS-GSTIIIc wurde die GSTIIIc-DNA als Xbal/BamHI-Fragment aus dem Vektor pET3a-GSTIIIc gereinigt und in das Plasmid Bluescript-SKII (Xbal/BamHI-linearisiert; Stratagene) kloniert. Anschlie¬ ßend wurde die GSTIIIc-DNA über eine Sstl/Smal-Restriktionsspaltung aus dem so erhaltenen Plasmid Bluescript-SKII-GSTIIIc isoliert und und in den Vektor pRTlOl (Sstl/Smal-linerisiert; Töpfer et al. 1987) ligiert. Danach wurde die GSTIIIc-DNA als EcoRI/Smal-Fragment aus dem so erhaltenen Vektor pRTlOl- GSTTIIc gereinigt und in den binären Vektor pSS (EcoRI/Smal-linearisiert; Voß et al. 1994) kloniert. In dem entstandenen Vektor pSS-GSTIIIc steht die kodierende GSTIIIc-DNA unter der Kontrolle eines duplizierten 35S RNA Promotors aus CaMV. Das Plasmid pSS-GSTIIIc ( 10000 bps ) ist als Fig. 2 dargestellt.

Die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA kann bei Bedarf durch den Fachmann aus den genannten Plasmiden nach den allgemein üblichen Verfahren und Methoden isoliert werden.

Als besonders bevorzugte erfindungsgemäße transformierte bzw. transgene Mikro¬ organismen seien die Escherichia coli-Stämme DS pET3a-GSTfflc und DS pSS- GSΗIIc sowie deren Mutanten genannt. Der Stamm DS pET3a-GSTIIIc enthält das Plasmid pET3a-GSΗÜc und der Stamm DS pSS-GSTIIIc enthält das Plasmid pSS-GSTIIIc. Erfindungsgemäße Mutanten sind solche Mikroorganismen, die noch die für die Ausfuhrung der Erfindung wesentlichen Merkmale enthalten, also insbesondere noch die Plasmide pET3a-GSTIIIc und/oder pSS-GSTIIIc oder davon abgeleitete DNA-Sequenzen enthalten. Diese Stämme können nach den allgemein üblichen Methoden vermehrt werden. Die Plamide pET3a-GSTIIIc und pSS- GSTIIIc können aus diesen Mikroorganismen ebenfalls nach den allgemein üblichen Methoden isoliert werden.

Der Escherichia coli-Stamm pET3a-GSTIIIc wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Bu¬ dapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt (Hinterlegungs¬ datum: 17.01.1995). Der Stamm erhielt die Hinterlegungsnummer DSM 9677.

Wie bereits oben dargelegt wurde, gehören zur vorliegenden Erfindung auch transgene Pflanzen sowie Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflan- zenteile (wie Kallus, Blatter, Stengel, Bluten, Blutenteile, Wurzel, Knollen, Samen und sonstiges Vermehrungsmaterial) solcher transgenen Pflanzen, welche in ihrem Genom die GSTIIIc-DNA oder davon abgeleitete DNA-Sequenzen und/oder eine erfindungsgemaße rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA als "fremde" oder "zusatzliche" DNA enthalten

Zu den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen gehören auch die Nachkommen der erfindungsgemaß erhältlichen transgenen Pflanzen sowie die Kreuzungsergeb¬ nisse mit anderen Pflanzen und deren Nachkommen, solange diese transgenen Pflanzen die GSTIIIc-DNA oder davon abgeleitete DNA-Sequenzen als "fremde" oder " zusatzliche" DNA enthalten

Bevorzugte transgene Pflanzen sind solche Pflanzen, die in ihrem Genom die GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO 1 als "fremde" oder "zusatzliche" DNA ent¬ halten

Besonders bevorzugte transgene Pflanzen sind solche Pflanzen, die in ihrem Genom das Konstrukt aus dem CaMV 35S Doppelpromotor und der GSTIIIc-

DNA gemäß SEQ ID NO 1 als "fremde" oder "zusatzliche" DNA enthalten

Ganz besonders bevorzugte transgene Pflanzen sind solche Pflanzen, die in ihrem Genom die GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder das Konstrukt aus dem CaMV 35S Doppelpromotor und der GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO 1 als "fremde" DNA enthalten. Bisher sind keine Pflanzen, außer der Mais-Sorte Mutin, bekanntgeworden, welche eine der GSTIIIc-DNA entsprechende DNA in ihrem Genom enthalten

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll unter "fremder" DNA eine solche DNA verstanden werden, welche in einem bestimmten prokaryontischen oder eukaryonti sehen (einschließlich pflanzlichen) Genom nicht naturlich enthalten ist, sondern erst durch den Eingriff des Menschen (Transformation) in diesen Genom aufgenommen wird "Zusatzliche" DNA ist eine solche DNA, welche in dem jeweiligen prokaryontischen oder eukaryonti sehen Genom zwar bereits vor¬ handen ist, jedoch in zusatzlicher Menge durch Eingriffe durch den Menschen (Transformation) in diesen Genom aufgenommen wird Die "fremde" oder "zu¬ satzliche" DNA kann je nach Bedarf und Art des vorliegenden Falles in einem oder mehreren Exemplaren eingebaut werden Wie bereits dargelegt wurde, liegt die Hauptzielsetzung der vorliegenden Erfin¬ dung darin, daß neue Pflanzen erzeugt werden, die eine erhöhte Resistenz gegen¬ über Herbiziden, vorzugsweise gegenüber Heteroaryloxyacetamid-Herbiziden auf¬ weisen.

Somit werden solche erfindungsgemäße neue transgene Pflanzen bevorzugt, wel¬ che zusätzlich zu den oben angegebenen Eigenschaften (Gehalt an "fremder" oder "zusätzlicher" GSTIIIc-DNA) im Vergleich zu den entsprechenden nicht-trans- genen Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegen Herbizide, insbesondere gegen Heteroaryloxyacetamid-Herbizide, aufweisen. Kulturen dieser transgenen Pflanzen können somit mit den Herbiziden zur Bekämpfung von unerwünschten Pflanzen behandelt werden, ohne die Kulurpflanzen zu schädigen.

Die erhöhte Herbizidesistenz der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen ist von Bedeutung für Landwirtschaft und Forsten, für den Zier¬ pflanzenanbau, den Heilpflanzenanbau und die Pflanzenzucht.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung trans- gener Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteile und Samen) mit erhöhter Resistenz gegen Herbizide, welches da¬ durch gekennzeichnet ist, daß man

(a) ein oder mehrere Exemplare der GSTIIIc-DNA und/oder erfindungsgemäße rekombinante DNA, welche die GSTIIIc-DNA enthalten, die für das Pro¬ tein GSΗIIc kodieren, in das Genom von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) einsetzt und gegebenenfalls

(b) aus den transformierten Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) voll¬ ständige transformierte Pflanzen regeneriert und gegebenenfalls vermehrt und gegebenenfalls

(c) von den so erhaltenen transgenen Pflanzen der Elterngeneration oder wei¬ terer daraus gewonnener Generationen die gewünschten Pflanzenteile (ein¬ schließlich Samen) gewinnt.

Die Verfahrensschritte (a), (b) und (c) können nach bekannten Verfahren und Methoden in üblicher Weise durchgeführt werden. Transgene Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteile und Samen), welche die GSTIIIc-DNA ein oder mehrfach als "fremde" oder "zusätzliche" DNA enthalten sowie solche transformierte Pflan¬ zenzellen und Pflanzen, welche nach den obigen Verfahren erhältlich sind, gehören ebenfalls zur vorliegenden Erfindung.

Teile der vorliegenden Erfindung sind auch die:

(a) Verwendung der GSTIIIc-DNA und/oder der erfindungsgemäßen rekombi- nanten DNA und/oder der erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren und/oder der erfindungsgemäßen transformierten Mikroorganismen zur Transformation von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflan¬ zen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen), die

(b) Verwendung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen (einschlie߬ lich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen) zur Erzeugung von Vermehrungsmaterial sowie zur Erzeugung neuer Pflan- zen und deren Vermehrungsmaterial, die

c) Verwendung der auf dem Plasmid pET3a-GSTIIIc enthaltenen cDNA oder ihrer Teile sowie der den Sequenzinformationen gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NOJ entsprechenden DNA-Sequenzen zur Bestimmung von DNA, die für GSTIIIc-Protein bzw. GSTIIIc-Enzym kodieren in Pflanzen sowie (allgemein) bei der Erzeugung von transgenen Pflanzenzellen (einschlie߬ lich Protoplasten) und Pflanzen^einschließlich Pflanzenteilen und Samen) sowie die Verwendung der durch die GSTIIIc-DNA von pET3a-GSTIIIc- codierten Proteinsequenz sowie des Proteins gemäß SEQ ID NO:2 bei der Isolierung und dem Nachweis der GSTIIIc-DNA (z.B. durch die übliche Antikörper-Technik).

Eine Anzahl verschiedener Methoden steht zur Verfügung, die GSTIIIc-DNA, gegebenenfalls als Konstrukt mit dem CaMV35S Doppelpromotor, als "fremde" oder "zusatzliche" DNA in das genetische Material von Pflanzen bzw. Pflanzen¬ zellen einzusetzen Der Gentransfer kann nach den allgemein üblichen bekannten Methoden erfolgen, wobei der Fachmann die leweils geeignete Methode ohne

Schwierigkeiten ermitteln kann Das Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens steht als besonders günstiger und breit einsetzbarer Vektor zur Übertragung von "fremder" oder "zusätzlicher" DNA in Genome dikotyler und monokotyler Pflanzen zur Verfügung. Das- genetische Material, welches für das Protein GSTIIIc kodiert, wird gegebenenfalls zusammen mit regulatorischen DNA-Sequenzen in die T-DNA von geeigneten Ti-Plasmiden eingesetzt (z.B. Zambryski et al.,1983) und durch Infektion der Pflanze, Infektion von Pflanzenteilen oder Pflanzengeweben, wie z.B. von Blattscheiben, Stengeln, Hypokotylen, Kotyledonen, Meristemen und davon ableitenden Geweben, wie z.B. sekundären Embryonen und Kalli oder durch Kokultur von Protoplasten mit Agrobacterium tumefaciens übertragen.

Eine Alternative ist die Inkubation von gereinigter DNA, die das gewünschte Gen bzw. die gewünschte DNA enthält, in Pflanzenprotoplasten (z.B. Hain et al., 1985; Krens et al., 1982; Paszkowski et al., 1984) in Gegenwart von Polykationen oder Calziumsalzen und Polyethylenglykol.

Die DNA-Aufnahme kann auch zusätzlich durch ein elektrisches Feld (Elektro- pöration) begünstigt werden (z.B. Fromm et al., 1986).

Die DNA kann in bekannter Weise auch über Pflanzenpollen eingeführt werden, indem Pollen oder andere Pflanzenteile mit physikalisch beschleunigten Partikeln "beschossen" werden, welche die DNA tragen (vgl. EP-A 0 270 356).

Die Regeneration der Pflanzen erfolgt in bekannter Weise mit Hilfe geeigneter

Nährmedien (z.B. Nagy und Maliga 1976).

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die GSTIIIc-DNA aus dem Plasmid pET3a-GSTIIIc in einen binären Expressions¬ vektor kloniert (z.B. Voß et al. (1994)). Das chimäre Genkonstrukt wird dann auf Agrobakterium tumefaciens (Koncz und Schell 1986) übertragen.

Alternativ wird das chimäre Genkonstrukt auf dem Vektor pSS-GSTIIIc in üb¬ licher Weise durch direkten Gentransfer auf Pflanzenprotoplasten übertragen (z.B. Hain et.al. 1985). Dabei kann das Plasmid in zirkulärer, vorzugsweise jedoch in linearer Form, vorliegen. Bei der Verwendung dieses Plasmids mit Reportergen werden Kanamycin-resi- stente Protoplasten dann auf Expression von GSTIIIc überprüft

Transformierte (transgene) Pflanzen bzw. Pflanzenzellen werden nach den bekann¬ ten Methoden, z.B. durch Blattscheiben-Transformation (z.B. Horsch et al. 1985), durch Cokultur regenerierender Pflanzenprotoplasten oder Zellkulturen mit Agro¬ bacterium tumefaciens (z.B. Marton et al. 1979, Hain et al. 1985) oder durch direkte DNA Transfektion erzeugt. Resultierende transformierte Pflanzen werden entweder durch Selektion auf die Expression des Reportergens, z.B. durch die Phosphorylierung von Kanamycinsulfat in vitro (Reiss et al. 1984; Schreier et al. 1985) oder durch die Expression der Nopalinsynthase (nach Aerts et al. 1983) oder von GSΗIIc durch Northern-Blot-Analyse und Western Blot-Analyse nachge¬ wiesen. Das Protein GSTIIIc kann auch in bekannter Weise in Western-Blot- Analysen mit Hilfe spezifischer Antikörper in transformierten Pflanzen nachge¬ wiesen werden.

Die Kultivierung der transformierten Pflanzenzellen sowie die Regeneration zu vollständigen Pflanzen erfolgt nach den allgemein üblichen Methoden mit Hilfe der jeweils geeigneten Nährmedien.

Sowohl die transformierten Pflanzenzellen als auch die transformierten Pflanzen, welche die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA enthalten und welche Bestandteile der vorliegenden Erfindung sind, zeigen eine erheblich höhere Resistenz gegen

Herbizide, insbesondere gegen Heteroaryloxyacetamid-Herbizide.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Pflan¬ zen" sowohl vollständige Pflanzen als auch Pflanzenteile, wie Blätter, Samen, Knollen, Stecklinge u.s.w.. "Pflanzenzellen" schließen Protoplasten, Zelllinien, Pflanzenkalli usw. ein. "Vermehrungsmaterial" bedeutet Pflanzen und Pflanzen¬ zellen, welche zur Vermehrung der transformierten Pflanzen und Pflanzenzellen verwendet werden können und ist somit ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung

Zu den Pflanzen, welchen durch den Einbau (Transformation) der erfindungs¬ gemäßen GSTIIIc-DNA eine erhöhte Resistenz gegenüber Herbiziden verliehen werden kann, gehören praktisch alle Pflanzen Ein besonderes Bedürfnis zur

Resistenzerzeugung besteht naturgemäß bei den Kulturpflanzen, wie Forstpflanzen, z.B Fichten, Tannen, Douglasien, Kiefern, Lärchen, Buchen und Eichen sowie Nahrungsmittel und Rohstoffe liefernden Pflanzen, z.B. Getreide (insbesondere Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Hirse, Reis und Mais), Kartoffel, Leguminosen (wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohnen), Gemüse (insbesondere Kohlarten und Tomaten), Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Wein- trauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffee- sträucher, Tabak, Sisal und Baumwolle sowie bei Heilpflanzen, wie Rauwolfia und Digitalis. Besonders bevorzugt seien Kartoffel, Zuckerrüben, Zuckerrohr, Getreide, wie Weizen und Gerste und Sorghum, und Reis genannt. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA als "fremde" DNA in den Genom von Pflanzen eingebaut.

Bevorzugte Herbizide, gegen die erfindungsgemäß eine erhöhte Herbizidresistenz erzeugt werden kann, gehören zur Gruppe der Heteroaryloxyacetamide. Besonders bevorzugt sind hierbei die Heteroaryloxyacetamide der allgemeinen Formel ( I )

Het-O-CH₂-CO-NR¹R² ( I )

in welcher

Het für einen gegebenfalls substituierten heteroaromatischen Rest mit vorzugs¬ weise 5 Ringliedern steht, der vorzugsweise wenigstens ein Stickstoffatom und ein Schwefel- oder Sauerstoffatom enthält, wobei als besonders bevorzugter Rest der 5-Trifluormethyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl-Rest genannt sei;

R¹ für gegebenfalls substituiertes Alkyl oder Alkoxy (mit jeweils vorzugsweise

1-4 Kohlenstoffatomen) steht; und

R für einen gegebenfalls substituierten Arylrest (vorzugsweise Phenylrest, welcher vorzugsweise durch Halogen substituiert ist) steht.

Solche Herbizide sind bereits bekannt (vgl. z.B. EP-A-18 497 und die entsprechen- de US-Patentschrift Nr. 4 645 525, die EP-A-94 541 und die entsprechende

US-Patentschrift Nr. 4 585 471 sowie die EP-A- 348 737 und die entsprechende US-Patentschrift Nr. 4 968 342). Die in diesen Patentanmeldungen bzw. Patent¬ schriften genannten Herbizide sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt wird erfindungsgemaß eine Resistenz gegen das in der EP-A-348 737 und in der entsprechenden US-Patentschrift Nr 4 968 342 genannte Herbizid mit der chemischen Bezeichnung (5-Tπfluormethyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl- oxy)-essigsaure-N-isopropyl-N-(4-fluorphenyl)-amιd (vorgeschlagener common name Thiafluamide) Diese Resistenz erlaubt den Einsatz des genannten Herbizi¬ des auch in solchen Kulturen, die in der nicht-resistenten Form in einer nicht akzeptablen Weise durch das Herbizid geschadigt wurden

Die vorliegende Erfindung soll anhand der folgenden beispielhaften Ausführungen naher erläutert werden

I. Isolierung der GSTIIIc-DNA aus Mais

Bei der Isolierung der GSTIIIc-DNA werden die bekannten Verfahren und Methoden der Molekularbiologie verwendet, wie sie beispielsweise in folgendem Handbuch beschrieben werden Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Second Edition 1989

Zur Isolierung der GSTIIIc-DNA wird zunächst das Protein aus etiolierten Maiskeimlingen (Zea mais), Sorte Mutin, gereinigt (1) und die Amino¬ sauresequenz vollständig durch Proteinsequenzanalyse bestimmt (2) Eben¬ falls aus Maiskeimlingen wird mRNA isoliert (3) und durch Reverse Transkriptase enzymatisch in cDNA umgeschrieben (4) Die so gewonnene cDNA wird als Matrize in der Polymerase-Kettenreatkon (Mullis K.B , Faloona F A, (1987) Methods Enzymol 155 335-350) zur Isolierung der GSTIIIc-DNA eingesetzt

1. Isolierung des GSTIHc-Proteins aus Mais, Sorte, Mutin

Zur Reinigung des GSTIIIc-Proteins werden Maiskeimlinge aufgeschlossen und mit 0,2 M Tπs/HCl pH 7,8, 1 M EDTA (2 ml/g Fπschgewicht) versetzt Die Suspension wird zentπfugiert und die Proteinfraktion im Überstand durch fraktionierte Ammoniumsulfatfallung mit einer Sättigung von 30 % und 70 % gewonnen Die Isolierung des GSTIIIc-Proteins erfolgt durch Chromatographie auf folgenden Säulen mit den aufgeführten Puffer¬ bedingungen A) Sephadex G-100 (Trennmedium auf Dextranbasis), v = 500 ml (Pharmacia)

Puffer A: 50 mM Kaliumphosphat pH 7,3

B) DEAE-Sepharose (vernetzte Agarosematrize mit kovalent gebun- dener Diethylamino-ethyl-Gruppe), v = 50 ml (Pharmacia)

Puffer AJ0 mM Kaliumphosphat pH 7,3 Puffer B: 1,0 M Kaliumphosphat pH 7,3 Gradient: 0-100 % B in 500 ml

C) Glutathion-Sulfobromophthalein-Agarose, v = 20 ml (Sigma) Puffer A: 50 mM Kaliumphosphat pH 7,3

Puffer B: 50 mM Kaliumphosphat pH 8,0, 5 mM Glutathion

D) Mono Q HR 5/5 (Anionenaustauscher-Material auf Basis quervernetzter Agarose mit geladenen -CH₂N(CH₃)₃ + -Gruppen, Partikelgröße von 10+5 μm), v = 1 ml (Pharmacia) Puffer A: 20 mM Tris/HCl pH 7,5

Puffer B: 20 mM Tris HCl pH 8,0, 1,0 M NaCl Gradient: 0-25 % B in 20 ml

2. Proteinsequenzanalyse des GSTIIIc-Proteins

Das aus Mais (Sorte Mutin) isolierte GSTIIIc-Protein wird reduziert, car- boxymethyliert und gegen 0.2 M Ammoniumhydrogencarbonat dialysiert

(Glazer A.N., Delange RJ., Sigman D.S., (1975) Chemical Modification of Proteins, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam). Die anschließende Spal¬ tung des Proteins mit den Endoproteasen Asp-N (sequencing grade, Boehringer Mannheim) oder Trypsin (TPCK-treated, Worthington) erfolgt bei 23°C für 16 Stunden mit einem Protein-Protease- Verhältais von 1 :100.

Die Spaltungsreaktionen werden durch Zugabe von 0J % Trifluoressigsäu- re beendet. Unlösliche Peptide werden abzentrifugiert, die löslichen Peptide werden durch Reversed-Phase-HPLC unter folgenden Bedingungen von¬ einander getrennt:

Säule: Vydac C 18 (Trenngel auf Silicabasis mit aliphatischen Ket¬ ten (C₁₈)), 0,46 cm x 25 cm Eluent A OJ % Trifluoressigsaure

Eluent B OJ % Trifluoressigsaure, 90 % Acetonitril

Gradient 0 - 60 % B in 40 min

Flußrate 0,25 ml/min

Die Aminosauresequenz der isolierten Peptide wird mit Hilfe der Applied

Biosystems Proteinsequenatoren 470A und 473A bestimmt Die vollstän¬ dige Proteinsequenz des GSTIIIc-Proteins ist in SEQ ID No 2 dargestellt

3. Isolierung von poly(A) + mRNA aus Mais (Sorte Mutin)

Die GSTIIIc-DNA, die mRNA und die entsprechende cDNA enthalten Nukleotidsequenzen, die voneinander abgeleitet werden können. Zur Iso¬ lierung der GSTIIIc-DNA wird zunächst polyadenyherte mRNA aus etio- lierten Maiskeimlingen präpariert Die Isolierung erfolgt mit Hilfe von Dynabeads Oligo (dT)₂₅ entsprechend dem Protokoll des Herstellters (Dynal, Oslo/Norwegen; Jakobsen K.S., Breivold E , (1990) Nucleic Acids Res 18.3669) Diese Methode zur Reinigung von poly(A) + RNA basiert auf der Basenpaarbindung zwischen den poly(A) + -Reste am 3'-Ende von mRNA und oligo(dT)-Resten, die kovalent auf der Oberfläche von mag¬ netischen Metallkugeln (Dynabeads) gebunden sind Pro Milligramm Dynabeads werden 0,2 g Pflanzenmaterial eingesetzt Die mit dieser Me- thode isolierte mRNA wird ohne weitere Reinigungsschritte für die enzy- matische Synthese von cDNA eingesetzt

4. Enzy atische Synthese von cDNA

Die Herstellung von cDNA wird mit Hilfe des "First Strand cDNA Synthesis Kits" (Pharmacia P-L Biochemicals Ine ) durchgeführt Diese Methode basiert auf der enzymatischen Aktivität von viralen DNA-Poly- merasen (Reverse Transkriptasen), welche DNA nach einer RNA-Matπze synthetisieren (Maniatis T , Fπtsch E F , Sambrook j , (1982) Molecular Cloning A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory)

Entsprechend den Angaben des Herstellern wird die Reaktion folgender- maßen durchgeführt 5 μm poly(A) + mRNA aus Mais, Sorte Mutin wurden versetzt mit:

1 μm 0,5 M Dithioeritrit

I μm d(T)₁₆_₁₈-Primer

I I μm Reaktionsmischung (Bulk Reaction Mix) bestehend aus:

Murine Reverse Transkriptase, 135 mM Tris/HCl, pH 8,3, 204 mM KCl,

27 mM MgCl₂, 0,24 mg/ml BSA, 5,4 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde bei 37°C wird die mRNA durch alkalische Hydrolyse entfernt. Die synthetisierte cDNA wird gefällt und als Matrize für die Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt.

Amplifizierung, Klonierung und Sequenzierung der GSTIIIc-DNA

Zur Isolierung der GSTIIIc-DNA wird die für GSTIIIc codierende Nukleotidsequenz zunächst mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ampli- fiziert (Mullis K.B., Faloona F.A., (1987) Methods Enzymol. 155:335-350). Als Matrize für die Reaktion dient die aus Mais-mRNA hergestellte cDNA. Zur spezifischen Anreicherung der GSTHIc-DNA werden die Primer 1

(forward) gemäß SEQ ID NO: 3 und Primer 2 (reverse) gemäß SEQ ID No: 4 eingesetzt.

Reaktionsansätze mit folgender Zusammensetzung werden hergestellt:

5 μm cDNA (200 ng/μl) 1 μm 50 μM Primer 1

1 μm 50 μM Primer 2

4 μl 250 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP

5 μl 200 mM Tris HCl, pH 8,8, 100 mM KCl, 60 mM (NH₄)₂SO₄, 15 mM Mg Cl₂, 1 % Triton X-100 34 μl H,O

Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgt in einem GeneAmp PCR System 9600-Thermocycler (Perkin Eimer). Als hitzestabile Polymerase wird 1 μl Pfu-Dna-Polymerase (Stratagene, 2500 U/ml) zugesetzt. Insgesamt werden 35 Reaktionszyklen mit folgenden Temperaturen und Reaktionszeiten durchgeführt 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 58°C, 45 sec bei 72°C Das am- plifizierte DNA-Fragment, welches die für GSTIIIc kodierende- Nukleotid- sequenz enthalt, wird durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und, wie bereits beschrieben, in den Vektor pET 3a kloniert Die vollständige DNA-

Sequenz der GSTIIIc-DNA (SEQ ID NO- 1) wird unter Verwendung des Sequenase DNA Sequencing Kits (United States Biochemical/Cleveland) bestimmt (Sanger F., Coulson R , (1975) J Mol Biol 94 441-448).

Transformation von Reis

Die Transformation von Reis (Oryza sativa) kann entsprechend der Me¬ thoden, die in folgenden Literaturstellen beschrieben werden, durchgeführt werden

Zhang H M., Yang H., Rech E.L , Golds T J , Davis A.S , Mulligan BJ., (1988) Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plas- mid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep 7 379-384

Zhang W., Wu R., (1988) Efficient regeneration of transgenic plants from rice protoplasats and correctly regulated expression of the foreign gene in the plant. Theor. Appl. Gen 76 835-840

Shimamoto K, Terada R , Izawa T., Fujimoto H , (1989) Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts Nature 338.274-276

Datta S K , Peterhans A , Datta K, Potrykus I , (1990) Genetically engineered fertile indica-πce recovered from protoplasts Biotechnol 6 736- 740

Hayashimoto A., Li Z , Murai N , (1990) A polyethylene glycolmediated transformation System for production of fertile transgenic rice plants Plant

Physiol 93 857-863

Für die Übertragung des Vektors pSS-GSTIIIc in Reis wurde die Methode von Hayashimoto et al (1990) ohne Veränderungen verwendet Kanamycinrestistente Transformanden wurden in Northern Blot-Experi- menten auf die Expression von GSTIIIc überprüft. Die Bildung des GSTIIIc-Proteins wurde durch spezifische Antiköφer nachgewiesen. Die enzymatische Aktivität des Proteins konnte im Rohextrakt von trans¬ formierten Reispflanzen gezeigt werden durch den Nachweis der enzym¬ katalysierten Modifikation des Herbizides (5-Trifluormethyl-l,3,4-thiadia- zol-2-yl-oxy)-essigsäure-N-isoproypl-N-(4-fluoφhenyl)-amid.

Transgene Reispflanzen weisen im Vergleich zu nicht transformierten Kon¬ trollen" eine Resistenz gegenüber dem genannten Herbizid auf.

ID. Transformation von Tabak

a) Kultur von Tabaksprossen und Isolierung von Tabakprotopasten

Nicotiana tabacum (Petit Havanna SRI) wird als sterile Sproßkultur auf hormonfreiem LS Medium (Linsmaier und Skoog 1965) vermehrt. In Ab- ständen von ca. 6-8 Wochen werden Sproßabschnitte auf frisches LS-

Medium umgesetzt. Die Sproßkulturen werden bei 12 h Licht (1000- 3000 Lux) in einem Kulturraum bei 24-26°C gehalten.

Für die Isolierung von Blattprotoplasten werden ca. 2 g Blätter (ca. 3-5 cm lang) mit einer frischen Rasierklinge in kleine Stücke (0,5 cm x 1 cm) ge- schnitten. Das Blattmaterial wird in 20 ml Enzymlösung, bestehend aus K3

Medium (Nagy und Maliga 1976), 0,4 M Saccharose, pH 5,6, 2 % Zellu- lase RIO (Serva), 0,5 % Macerozym RIO (Serva) für 14-16 h bei Raum¬ temperatur inkubiert. Danach werden die Protoplasten durch Filtration über 0,30 mm und 0J mm Stahlsiebe von Zellresten getrennt. Das Filtrat wird 10 Minuten lang bei 100 x g zentrifugiert Während dieser Zentrifugati on flotieren intakte Protoplasten und sammeln sich in einer Bande am oberen Rand der Enzymlösung. Das Pellet aus Zellresten und die Enzymlösung werden mit einer Glaskapillare abgesaugt. Die vorgereinigten Protoplasten werden mit frischem K3 Medium (0,4 M Saccharose als Osmotikum) auf 10 ml aufgefüllt und erneut flotiert. Das Waschmedium wird abgesaugt und die Protoplasten werden für Kultur oder folgende Infektion mit Agrobak- terien (Kokultur) auf 1-2 x 10⁵/ml verdünnt Die Protoplastenkonzentration wird in einer Zählkammer bestimmt.

b) Konstruktion des Vektors pSS-GSTIIIc und Übertragung in Agro- bacterium tumefaciens

Die GSTIIIc-DNA und die Shine-Delgarno-Sequenz wurde als Xbal BamHI-Fragment aus dem Vektor pET3a-GSTIIIc herausgeschnitten, gereinigt und in das Plasmid Bluescript II Sk +/- (Stratagene, La Jolla, Californien), im folgenden bezeichnet als pBS-SKII, kloniert Verwendet wurden die Schnittstellen Xbal und BamHl Anschließend wurde die

GSTIIIc-DNA über die Schnittstellen Sstl und Smal aus dem Vektor pBS- SKII-GSTIIIc herausgeschnitten, isoliert und in den Vektor pRTl O l (Sstl/Smal linearisiert) ligiert (Töpfer R, Matzeit V., Gronenborn B., Schell J., Steinbiß H.H., (1987) Nucleic Acids Res. 14:5890).

Danach wurde die GSTIIIc-DNA als EcoRl/Smal-Fragment aus dem Vektor pRTl 01 -GSTIIIc gereinigt und in den Expressionsvektor pSS (EcoRl/Smal linearisiert, (Voß A et al, Molec. Breeding 1:15-26 (1995)) kloniert.

Statt der genannten Vektoren können beliebige andere Expressionsvektoren und intermediäre Vektoren, die entsprechende Schnittstellen aufweisen, ein¬ gesetzt werden, wobei der Fachmann anhand der obigen Angaben eine ge¬ eignete Auswahl leicht treffen kann. Der resultierende intermediäre Vektor pSS-GSTIIIc, der die GSTIIIc-DNA enthält, wird nach Agrobacterium tumefaciens, das eine funktioneile vir-Region enthält, übertragen (Koncz und Schell 1986, van Haute et al. 1983).

c) Transformation von regenerierenden Tabakprotoplasten durch Ko- kultur mit Agrobacterium tumefaciens

Es wird im folgenden die Methode von Marton et al. 1979 mit kleinen

Veränderungen benutzt. Die Protoplasten werden wie beschrieben isoliert und in einer Dichte von l-2xl0⁵/ml in K3 Medium (0,4 M Saccharose, 0,1 mg/ml NAA, 0,2 mg Kinetin) zwei Tage im Dunkeln und ein bis zwei Tage unter Schwachlicht (500 lux) bei 26°C inkubiert.

Sobald die ersten Teilungen der Protoplasten auftreten, werden 30 μl einer Agrobakteriumsuspension gemäß b) in minimal A (Am) Medium (Dichte ca. 10⁹ Agrobakterien/ml) zu 3 ml regenerierenden Protoplasten gegeben. Die Kokulturdauer beträgt 3-4 Tage bei 20°C im Dunkeln. Danach werden die Tabakzellen in 12 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt, mit Seewasser (600 mOsm/kg) auf 10 ml verdünnt und bei 60 x g 10 Minuten lang pelletiert. Dieser Waschvorgang wird noch 1-2 x wiederholt um den größten Teil der Agrobakterien zu entfernen. Die Zeil Suspension wird in einer Dichte von 5 x 10⁴/ml in K3 Medium (0,3 m Saccharose) mit 1 mg/1 NAA (Naphthyl-1 -essigsaure), 0,2 mg/1 Kinetin und 500 mg/1 des Cephalosporin-Antibiotikums Cefotaxim kultiviert. Die Zellsuspension wird jede Woche mit frischem K3 Medium verdünnt und der osmotische Wert des Mediums graduell um 0,05 M Saccharose (ca. 60 mOsm/kg) pro Woche reduziert. Die Selektion mit Kanamycin (100 mg/1 Kanamycinsulfat (Sigma), 660 mg/g aktives Km) wird 2-3 Wochen nach der Kokultur in Agarose "bead type culture" (Shillito et al 1983) gestartet. Kanamycin- resistente Kolonien können 3-4 Wochen nach Beginn der Selektion vom Hintergrund zurückgebliebender Kolonien unterschieden werden.

d) Direkte Transformation von Tabakprotoplasten mit DNA. Calcium- nitrat-PEG Transformation.

In einer Petrischale werden ca. 10⁶ Protoplasten in 180 μl K3 Medium mit 20 μl wäßriger DNA Lösung, welche 20 μg Plasmid pSS-GSTIIIc enthält, vorsichtig gemischt. Das Plasmid pSS-GSTIIIc ist nach bekannten Me¬ thoden aus den Plasmiden pET3a-GSTIIIc, pRTlOl, pBS-SKII und pSS er¬ hältlich. Anschließend werden 200 μl Fusionslösung (0J M Calciumnitrat, 0,45 M Mannit, 25 % Polyethylenglykol (PEG 6000), pH 9) vorsichtig zugegeben. Nach 15 Minuten werden 5 ml Waschlösung (0,275 M

Calciumnitrat pH 6) addiert und nach weiteren 5 Minuten werden die Protoplasten in ein Zentrifugenröhrchen transferiert und bei 60 x g pelliert. Das Pellet wird in einer kleinen Menge K3 Medium aufgenommen und wie im nächsten Abschnitt beschrieben kultiviert Alternativ können die Proto- plasten nach Hain et al. 1985 transformiert werden.

e) Kultur der mit DNA inkubierten Protoplasten und Selektion Kanamycin resistenter Kalli:

Für die im folgenden beschriebene Kultur und Selektion Kanamycin resistenter Kolonien wird eine modifizierte "Bead Type culture"-Technik (Shillito et al. 1983) verwendet. Eine Woche nach Behandlung der Proto¬ plasten mit DNA (vgl. d) werden 3 ml der Zeil Suspension mit 3 ml K3 Medium (0,3 M Saccharose + Hormone; 1 ,2 % (Seaplaque) LMT Agarose (low melting agarose, Marine Colloids) in 5 cm Petrischalen gemischt. Für diesen Zweck wird Agarose trocken autoklaviert und nach Zugabe von K3 Medium im Mikrowellenherd kurz aufgekocht Nach Erstarren der Agarose werden die Agarosescheiben ("beads") mit den eingebetteten Tabak- mikrokalli für weitere Kultur und Selektion in 10 cm Petrischalen trans¬ feriert und je 10 ml K3 Medium (OJ M Saccharose, 1 mg/1 NAA, 0,2 mg/1 Kinetin) und 100 mg/1 Kanamycinsulfat (Sigma) addiert. Das Flüssigme¬ dium wird jede Woche gewechselt. Dabei wird der osmotische Wert des Mediums stufenweise herabgesetzt.

Pro Woche wird das Austauschmedium (K3 + Km) um 0,05 M an Saccha¬ rose (ca. 60 mOsm) reduziert.

Schema der Selektion kanamycinresistenter Tabakkolonien nach DNA Transformation:

0,4 M 0J M 0,25 M 0,20 M 0,15 M 0,10 Saccharose im Flüssigmedium

E S K

Wochen nach DNA Aufnahme

(K3 Medium 1 mg/1 NAA, 0,2 mg/1 Kinetin)

A = DNA Aufnahme E = Einbettung in Agarose

S = Selektion mit Kanamycin (100 mg/1 Kanamycinsulfat) K = Kanamycinresistente Kolonien können vom Hintergrund eindeutig unterschieden werden

e) Regeneration kanamycinresistenter Pflanzen:

Sobald die kanamycinresistenten Kolonien einen Durchmesser von ca. 0,5 cm erreicht haben, wird die Hälfte auf Regenerationsmedium (LS-Me- dium, 2 % Saccharose, 0,5 mg/1 Benzylaminopurin BAP) gesetzt und bei 12 h Licht (3000-5000 lux) und 24°C im Kulturraum gehalten. Die andere Hälfte wird als Kalluskultur auf LS Medium mit 1 mg/1 NAA, 0,2 mg/1 Kinetin, 0,1 mg/1 BAP und 100 mg/1 Kanamycinsulfat propagiert. Wenn die regenerierten Sproße ca. 1 cm groß sind, werden sie abgeschnitten und auf 1/2 LS Medium (1 % Saccharose, 0,8 % Agar) ohne Wachstums¬ regulatoren zur Bewurzelung gesetzt. Die Sproße werden auf 1/2 MS- Medium mit 100 mg/1 Kanamycinsulfat bewurzelt und später in Erde umgesetzt. g) Transformation von Blattscheiben durch Agrobacterium tumefaciens

Für die Transformation von Blattscheiben (Horsch et al. 1985)- werden ca. 2-3 cm lange Blätter von sterilen Sproßkulturen in Scheiben von 1 cm Durchmesser gestanzt und mit einer Suspension entsprechender Agro- bacterien (ca. 10⁹/ml) (vgl. c) in Am-Medium, siehen unten) für ca.

5 Minuten inkubiert. Die infizierten Blattstücke werden auf MS-Medium (siehe unten) ohne Hormone für 3-4 Tage bei ca. 24°C gehalten. Während dieser Zeit überwächst Agrobakterium die Blattstücke. Die Blattstücke wer¬ den anschließend in MS-Medium (0,5 mg/ml BAP, OJ mg/ml NAA) ge- waschen und auf das gleiche Medium (0,8 % Agar) mit 500 μg/ml Cefo- taxim und 100 μg/ml Kanamycinsulfat gelegt. Nach zwei Wochen sollte das Medium erneuert werden. Transformierte Kanamycin-resistente Sproße werden nach weiteren 2-3 Wochen sichtbar.

Biochemische Nachweismethode der Transformation

Neomycin-Phosphotransferase (NPT II) Enzymtest:

NPT II Aktivität in Pflanzengewebe wird durch in situ Phosphorylierung von Kanamycin, wie bei Reiß et al. (1984) beschrieben und von Schreier et al. (1985) modifiziert, wie folgt, nachgeweisen. 50 mg Pflanzengewebe werden in 50 μl Extraktionspuffer (10 % Glycerin, 5 % 2-Mercaptoethanol, 0,1 % SDS, 0,025 % Bromphenolblau, 62,5 mM Tris pH 6,8) unter Zusatz von Glaspulver auf Eis homogenisiert und 10 Minuten lang in einer Eppendorfzentrifuge bei 4°C zentrifugiert. 50 μl des Überstandes werden auf ein natives Polyacrylamidgel (145 x 110 x 1,2 mm; Trenngel: 10 % Acrylamid, 0,33 % Bisacrylamid, 0,375 M Tris pH 8,8, Sammelgel: 5 % Acrylamid, 0J65 % Bisacrylamid, 0J25 M Tris pH 6,8) aufgetragen und über Nacht bei 4°C und 60 V elektrophoretisiert. Sobald der Bromphenolblau-Marker aus dem Gel herausläuft, wird das Gel zweimal mit destilliertem Wasser 10 Min. lang und einmal 30 Min. mit Reaktionspuffer ge¬ waschen (67 mM Tris-Maleat, pH 7J, 42 mM MgC , 400 mM Ammonium¬ chlorid). Das Gel wird auf eine gleichgroße Glasplatte gelegt und mit 40 ml 1 %iger Agarose in Reaktionspuffer, der die Substrate Kanamycinsulfat (20 μg/ml) und 20-200 μCi ³²P ATP (Amersha ) enthält, überschichtet. Das Sandwichgel wird 30 min. bei Zimmertempreratur inkubiert und dann wird ein Blatt Phospho- zellulosepapier P81 (Whatman) auf die Agarose gelegt. Darüber werden vier Filtrieφapierlagen 3 MM, (Whatman) und einige Papierhandtücher gestapelt. Der Transfer von in situ phosphoryliertem radioaktiven Kanamycinphosphat auf das P81 Papier wird nach 3-4 h gestoppt. Das P81 Papier wird für 30 min. in einer Lösung von Proteinase K und 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 60°C inkubiert und dann 3-4 mal in 250 ml 10 mM Phosphatpuffer pH 7,5 bei 80°C gewaschen, getrocknet und für 1-12 h lang bei -70°C autoradiografiert (XAR5 Film Kodak).

Alle Prozentangaben in den obigen sowie den weiter unten folgenden Beispielen beziehen sich auf Gewichtsprozente, wo nichts anderes angegeben wird.

In den gemäß den obigen sowie Beispielen erhaltenen Pflanzenzellen und Pflanzen wurde die Anwesenheit der GSTIIIc-DNA durch Southern Blot Analyse bestätigt. Die Expression der GSTIIIc-DNA wurde durch Northern Blot Analyse und We¬ stern Blots mit Hilfe von spezifischen Antiköφern nachgewiesen.

Im folgenden werden einige der bei der Transformation von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eingesetzte Medien beschrieben:

Am-Medium

3,5 g K₂HPO₄

1,5 g KH₂PO₄

0,5 g Na₃ Citrat

0J g MgSO₄ x 7H₂O 1 g (NH₄ ⁾2^S04

2 g Glukose ad 1 1

Medium für sterile Sproßkultur von Tabak

Macro-elemente 1/2 der Konzentration der MS Salze Macro-elemente 1/2 der Konzentration der MS Salze

Fe-EDTA Murashige und Skoog (MS)

Myo-Inosit 100 mg/1

Sucrose 10 mg/1

Agar 8 mg/1

Vitamine Ca-panthotenat 1 mg/1

Biotin 10 mg/1

Nicotinsäure 1 mg/1

Pyridoxin 1 mg/1

Thiamin 1 mg/1 pH 5,7 vor dem Autoklavieren

K3 -Medium

Zur Kultur von Nicotiana tabacum petit Havana SRI, Nicotiana tabacum Wiscon¬ sin 38, und Nicotiana plumaginifolia Protoplasten (Nagy und Maliga, 1976)

Macro-elemente NH₄N0₃ 250 mg/1

KNO₃ 2500 mg/1

CaCl₂-2H₂O 900 mg/1

MgS0₄-7H₂O 250 mg/1

NaH₂PO₄JH₂O 150 mg/1

(NH₄)₂SO₄ 134 mg/1

CaHPO₄JH₂0 50 mg/1

Micro-elemente H₃BO₃ 3 mg/1

MnSO₄JH₂O 10 mg/1

ZnS0₄-4H₂0 2 mg/1

KI 0,75 mg/1

Na₂MoO₄-2H₂O 0,25 mg/1

CuSO₄-5H₂O 0,025 mg/1

CoCl₂-6H₂O 0,025 mg/1

Fe-EDTA Na₂EDTA 37,2 mg/1

FeS0₄-7H₂0 27,8 mg/1

Inosit 100 mg/1

Sucrose 137 g/i

(= 0,4 M)

Xylose 250 mg/1

Vitamine Nicotinsäure 1 mg/1

Pyridoxin 1 mg/1

Thiamin 10 mg/1

Hormone NAA 1,0 mg/1

Kinetin 0,2 mg/1 pH 5,6

Filter sterilisieren Linsmaier und Skoog Medium (Linsmaier und Skoog 1965)

Zur Kultur von regenerierenden Protoplasten und für Gewebekultur von Tabak¬ tumoren und Kallus Linsmaier und Skoog (LS) Medium ist Murashige und Skoog Medium (Murashige und Skoog, 1962) mit den folgenden Modifikationen

Thiamin wird in höherer Konzentration eingewogen 0,4 mg/1 anstatt OJ mg/1,

Glycin, Pyridoxin und Nicotinsäure fehlen.

Macro-elemente NH₄NO₃ 1650 mg/1

KN0₃ 1900 mg/1

CaCl₂-2H₂0 440 mg/1

MgS0₄-7H₂0 370 mg/1

KH₂P0₄ 170 mg/1

Micro-elemente H₃B0₃ 6,2 mg/1

MnS0₄JH₂0 22,3 mg/1

ZnS0₄-4H₂0 8,6 mg/1

KI 0,83 mg/1

Na₂Mo0₄-2H₂0 0,25 mg/1

CuS0₄-5H₂0 0,025 mg/1

CoCl₂-6H₂0 0,025 mg/1

Fe-EDTA Na₂EDTA 37,2 mg/1

FeS0₄-7H₂0 27,8 mg/1

Inosit 100 mg/1

Saccharose 30 g i

Agar 8 mg/1

Vitamine Thiamin 0.4 mg/1

Hormone NAA 1 mg/1

Kinetin 0.2 mg/1 pH 5,7 Zur Transformation von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen kann die folgende Literatur angeführt werden:

Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Adams S.P., Bittner M.L., Brand L.A., Fink C.L., Fry J.S., Fallupi G R., Goldberg S.B., Hoffmann N.L., Woo S.C. (1983). Expression of bacterial genes in plant cells.

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-4807.

Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. (1986) Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nature 319: 791-793

Hain, R., Stabel, P., Czerailofsky, A.P., Steinbiß, H.H., Herrera-Estrella,L., Schell, J. (1985) Uptake, Integration, expression and genetic transmission of a selectable chimeric gene by plant protoplasts. Mol. Gen. Genet. 199: 161-168

Hernalsteens J.P., Thia-Tong L., Schell J., Van Montagu M. (1984) An Agrobac- terium-transformed cell eulture from the monocot Asparagus officinalis. EMBO J. 3:3039-3041

Herrera-Estrella L., De Block M., Messens E., Hernalsteens J.P., van Montagu M., Schell J. (1983) EMBO J. 2: 987-995.

Horsch R.B., Fry J.E. Hoffmann N.L., Eichholtz D., Rogers S.G., Fraley R.T. (1985) A simple and general method for transferring genes into plants. Science 277: 1229-1231

Krens F.H., Molendijk L., Wullems G.J., Schilperoort R.A. (1982) In vitro trans¬ formation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature 296: 72-74

Koncz C, Schell J. (1986) The promotor of T_L-DNA gene 5 controls the tissue- speeifie expression of chimaeric genes carried by a noval type of Agrobacterium linary vector. Mol. Gen. Genet. (1986) 204: 338-396

Linsmaier D.M., Skoog F. (1965) Organic growth factor requirements of tobaeco tissue eultures. Physiol. Plant 18: 100-127 Marton L., Wullems G.J., Molendijk L., Schilperoort P.R (1979) In vitro transfor¬ mation of cultured cells from Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens. Nature 277: 1229-131

Nagy J.I., Maliga P. (1976) Callus induction and plant regeneration from mesophyll protoplasts of Nicotiana sylvestris. Z. Pflanzenphysiol. 78: 453-455

Paszkowski I., Shillito R.D., Saul M, Mandak V., Hohn T., Hohn B., Potrykus I. (1984) Direct gene transfer to plants. EMBO J. 3: 2717-2722

Shillito R.D., Paszkowski J. Potrykus I. (1983) Agarose plating and bead type culture technique enable and stimulate development of protoplast-derived colonies in an number of plant species. Pl. Cell. Rep. 2: 244-247 Van den Elzen P.J.M.,

Townsend J., Lee K.Y., Bedbrook J.R.

Van den Elzen P.J.M., Townsend J., Lee K.Y., Bedbrook J.R. (1985) A chimaeric resistance gene as a selectable marker in plant cells. Plant Mol. Biol. 5: 299-302.

Veiten J., Veiten L., Hain R, Schell J. (1984) Isolation of a dual plant promotor fragment from the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J. 12: 2723-

2730

Van Haute E., Joos H, Maes M., Warren G, Van Montagu M., Schell J. (1983) Intergenic transfer and exchange recombination of restriction fragments clones in pBR 322: a novel strategy for the reversed genetics of Ti plasmids of Agrobac- terium tumefacines. EMBO J. 2: 41 1-418.

Zambryski P., Joos H, Genetello C, van Montagu M., Schell J. (1983) Ti-plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without altering their normal regeneration capacity. EMBO J. 12: 2143-2150.

Reiss, B., Sprengel, Will H., and Schaller H. (1984) A new sensitive method for qualitative and quantitative assay of neomycin phosphotransferase in crude cell tracts, GENE 1081 : 21 1-217 Schreier P.H., Seftor E.A., Schell J. and Bohnert HJ. (1985) The use of nuclear- encoded sequences to direct the light-regulated synthesis and transport of a foreign protein into plant chloroplasts. EMBO J. 1 : 25-32

Weiterhin können die folgenden veröffentlichten Patentanmeldungen aufgeführt werden:

EP- A 116 718 EP- A- 126 546

EP-A 159 418 EP-A- 164 597

EP-A 120 515 EP-A- 175 966

EP-A- 120 516 WO 84/02913 EP-A-172 112 WO 84/02919

EP-A-140 556 WO 84/02920

EP-A- 174 166 WO 83/01176 EP-A- 122 791

Die erhöhte Resistenz der erfindungsgemäßen transformierten Pflanzen sei anhand des folgenden Beispiels erläutert:

Nachweis der erhöhten Resistenz von transformierten Pflanzen:

Zur Prüfung der erhöhten Resistenz gegenüber herbizid wirkenden Herterooxyace- tamiden wird die Schädigung der erfindungsgemäß transformierten Pflanzen im

Vergleich zu Kontrollpflanzen bestimmt. Als Testherbizid wird die Verbindung (5- Trifluormethyl- 1 ,3 ,4-thiadiazol-2-yl-oxy-essigsäure-N-isopropyl-N-(4-fluoφhenyl)- amid eingesetzt.

Samen der Fl -Generation der transformierten Pflanzen werden im Gewächshaus auf Landerde mit 3 % Humusanteil in Töpfe (d = 11 cm) ausgelegt. Die Anzucht der Pflanzen erfolgt bei einer Temperatur von 23°C und einer relativen Luftfeuchte von 70 - 80 %. Die Behandlung mit der oben genannten herbiziden Verbindung, formuliert als 70 WP (wettable powder), erfolgt 24 Stunden nach dem Auslegen der Samen mit Konzentrationen die einer Aufwandmenge von 2 000 - 4 000 g Wirkstoff/ha entsprechen.

Die Auswertung erfolgt 20 Tage nach der Behandlung mit Herbizid. Bonitiert wird der prozentuale Gesamtschaden an transgenen Pflanzen im Vergleich zu ent¬ sprechenden Kontrollpflanzen, die mit der gleichen Wirkstoffkonzentration be¬ handelt wurden.

Die transformierten Tabakpflanzen, in die die erfindungsgemäße GSTIHc-DNA eingesetzt wurde, zeigen eine deutlich erhöhte Resistenz gegenüber hohen Auf¬ wandmengen von des Herbizides (2 000 - 4 000 g ha) im Vergleich zu nicht trans¬ formierten entsprechenden Kontrollpflanzen.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: Bayer AG

(B) STRASSE : Bayerwerk

(C) ORT: Leverkusen

(E) LAND: Deutschland

(F) POSTLEITZAHL: D-51368

(G) TELEFON: 0214/30 66400 (H) TELEFAX: 0214/30 3482 (I) TELEX: 85 101-265 by d

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Desoxyribonukleinsaeure und ihre Verwendung

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4

(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 666 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (iii) HYPOTHETISCH: NEIN

(iv) ANTISENSE: NEIN

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE:1..663

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

ATG GCG CCT CTG AAG CTG TAC GGG ATG CCG CTG TCC CCC AAC GTG GTG 48

Met Ala Pro Leu Lys Leu Tyr Gly Met Pro Leu Ser Pro Asn Val Val 1 5 10 15

CGC GTG GCC ACC GTG CTC AAC GAG AAG GGC CTC GAC TTC GAG ATC GTC 96

Arg Val Ala Thr Val Leu Asn Glu Lys Gly Leu Aεp Phe Glu Ile Val 20 25 30

CCC GTC GAC CTC ACC ACC GGC GCC CAC AAG CAG CCC GAC TTC CTC GCC 144 Pro Val Asp Leu Thr Thr Gly Ala His Lys Gin Pro Asp Phe Leu Ala 35 40 45

CTC AAC CCT TTC GGC CAG ATC CCG GCT CTC GTC GAC GGA GAC GAA GTC 192 Leu Asn Pro Phe Gly Gin Ile Pro Ala Leu Val Asp Gly Asp Glu Val 50 55 60

CTC TTC GAG TCC CGT GCG ATC AAC CGG TAC ATC GCC AGC AAG TAC GCG 240 Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Asn Arg Tyr Ile Ala Ser Lys Tyr Ala 65 70 75 80

TCG GAG GGC ACG GAC CTG CTC CCC GCG ACG GCG TCG GCG GCG AAG CTG 288 Ser Glu Gly Thr Asp Leu Leu Pro Ala Thr Ala Ser Ala Ala Lys Leu 85 90 95 GAG GTG TGG CTG GAG GTG GAG TCG CAC CAC TTC CAC CCG AAC GCG TCG 336 Glu Val Trp Leu Glu Val Glu Ser His His Phe His Pro Asn Ala Ser 100 105 110

CCG CTG GTG TTC CAG CTG CTC GTG AGG CCG CTC CTG GGC GGC GCC CCC 384 Pro Leu Val Phe Gin Leu Leu Val Arg Pro Leu Leu Gly Gly Ala Pro 115 120 125

GAC GCG GCG GTG GTG GAG AAG CAC GCG GAG CAG CTC GCC AAG GTG CTC 432 Asp Ala Ala Val Val Glu Lys His Ala Glu Gin Leu Ala Lys Val Leu 130 135 140

GAC GTG TAC GAG GCG CAC CTG GCC CGC AAC AAG TAC CTC GCC GGG GAC 480 Asp Val Tyr Glu Ala His Leu Ala Arg Asn Lys Tyr Leu Ala Gly Asp 145 150 155 160

GAG TTC ACG CTC GCC GAC GCC AAC CAC GCG TCC TAC CTG CTC TAC CTC 528 Glu Phe Thr Leu Ala Asp Ala Asn His Ala Ser Tyr Leu Leu Tyr Leu 165 170 175

AGC AAG ACC CCC AAG GCC GGG CTC GTC GCC GCC CGC CCC CAC GTC AAG 576 Ser Lys Thr Pro Lys Ala Gly Leu Val Ala Ala Arg Pro His Val Lys 180 185 190

GCC TGG TGG GAG GCC ATC GCC GCC CGC CCC GCG TTC CAG AAG ACC GTC 624 Ala Trp Trp Glu Ala Ile Ala Ala Arg Pro Ala Phe Gin Lys Thr Val 195 200 205

GCC GCC ATC CCC TTG CCC CCG CCG CCC TCC TCC TCG GCT TGA 666

Ala Ala Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Ala 210 215 220 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 221 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Met Ala Pro Leu Lys Leu Tyr Gly Met Pro Leu Ser Pro Asn Val Val 1 5 10 15

Arg Val Ala Thr Val Leu Asn Glu Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ile Val 20 25 30

Pro Val Asp Leu Thr Thr Gly Ala His Lys Gin Pro Asp Phe Leu Ala 35 40 45

Leu Asn Pro Phe Gly Gin Ile Pro Ala Leu Val Asp Gly Aεp Glu Val 50 55 60

Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Asn Arg Tyr Ile Ala Ser Lys Tyr Ala 65 70 75 80

Ser Glu Gly Thr Asp Leu Leu Pro Ala Thr Ala Ser Ala Ala Lys Leu 85 90 95

Glu Val Trp Leu Glu Val Glu Ser His His Phe His Pro Asn Ala Ser 100 105 110

Pro Leu Val Phe Gin Leu Leu Val Arg Pro Leu Leu Gly Gly Ala Pro 115 120 125 sp Ala Ala Val Val Glu Lys His Ala Glu Gin Leu Ala Lys Val Leu

130 135 140

Asp Val Tyr Glu Ala His Leu Ala Arg Asn Lys Tyr Leu Ala Gly Asp 145 150 155 160

Glu Phe Thr Leu Ala Asp Ala Asn His Ala Ser Tyr Leu Leu Tyr Leu 165 170 175

Ser Lys Thr Pro Lys Ala Gly Leu Val Ala Ala Arg Pro His Val Lys 180 185 190

Ala Trp Trp Glu Ala Ile Ala Ala Arg Pro Ala Phe Gin Lys Thr Val 195 200 205

Ala Ala Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Ala 210 215 220

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 33 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA

(iii) HYPOTHETISCH: NEIN

(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

AGCGCATATG GCGGCTCTGA AGCTGTACGG GAT ₃3

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 30 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA

(iii) HYPOTHETISCH: NEIN

(iv) ANTISENSE: NEIN

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

GACGGATCCT CAAGCCGAGG AGGAGGGCGG 30

INTERNATIONALES FORMBLATT

Bayer AG

Geschäf sbereich Pflanzenschutz

Forschung/Biotechnologie

Pflanzenschutzzentrum Monhei

EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG,

51368 Leverkusen ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: BB pET3a-GSTIIIc

DSM 9677

II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOM1SCHE BEZEICHNUNG

Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde

(X ) eine wissenschaftliche Beschreibung

(X ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen).

III. EINGANG UND ANNAHME

Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 19 95 - 01 - 17 (Datum der Ersthinterlegung)¹ eingegangen ist.

IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG

Der unter 1 bczςichnctc Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst¬ hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlcgung in eine Hinterlegung gemäß Budapestcr Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung).

V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE

Name: DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON UnterschriΩ(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstell

MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:

Anschrift: Maschcrodcr Weg lb D-38124 üraunschweig U. u?_*r Ό

Daium 1 995 - 01 - 18

¹ us einer internati e un sstelle cnvorbcπ worden ist.

Claims

Patentansprüche

1 DNA (Desoxyribonukleinsäure), welche für das Protein Glutathion-S-Trans¬ ferase IIIc (GSTIIIc) gemäß SEQ ED NO 2 oder eine davon abgeleitete Proteinsequenz kodiert (GSTIIIc-DNA).

2. DNA gemäß Anspruch 1, welche die Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 oder eine davon abgeleitete Sequenz aufweist

3. DNA gemäß Anspruch 1, welche die Sequenz der GSTIIIc-DNA, die auf dem Vektor Plasmid pET3a-GSTIIIc enthalten ist oder eine davon abge¬ leitete Sequenz aufweist.

4. DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, welche in Form eines DNA-Doppel¬ stranges vorliegt, der die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 und einen dazu komplementären DNA- Strang enthält

5 DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, bei welcher am 5'-Ende der kodierenden Sequenz ein in Pflanzen wirksamer Promotor vorgeschaltet ist.

6 DNA gemäß Anspruch 5, wobei als Promotor der CaMN 35S-Promotor oder der aus dem CaMV 35S Enhancer und dem CaMV 35S Promotor zusammengesetzte CaMV 35S Doppelpromotor verwendet wird

7. DNA gemäß Anspruch 5, welche ein Konstrukt aus der GSTIIIc-DNA und dem CaMV 35S Doppelpromotor darstellt, wie es auf dem Vektor Plasmid pSS-GSTIIIc vorliegt

8 Rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA, welche die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 enthalt

9 Rekombinante DNA, die in Pflanzen oder Pflanzenzellen enthalten ist und die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 enthalt

10 Vektoren, welche die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 oder die rekom¬ binante DNA gemäß den Ansprüchen 8 und 9 enthalten

1 1. Vektor-Plasmide pET3a-GSTIIIc und pSS-GSTIIIc.

12. Transformierte Mikroorganismen, welche die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 oder die rekombinante DNA gemäß den Ansprüchen 8 und 9 ent¬ halten.

13. Escherichia coli Stamm DS pET3a-GSTIIIC (gemäß DSM 9677) sowie seine Mutanten, welche noch die für die Ausführung der Erfindung wesent¬ lichen Merkmale aufweisen.

14. Transgene Pflanzen (einschließlich Teile dieser Pflanzen sowie deren Ver¬ mehrungsmaterial, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklingen usw.), die in ihrem Genom die DNA gemäß den An¬ sprüchen 1 bis 7 zusätzlich zur DNA der entsprechenden nicht transgemen Pflanzen enthalten.

15. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 14, welche in ihrem Genom die DNA gemäß Anspruch 6 enthalten.

16. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 14, welche in ihrem Genom die DNA gemäß Anspruch 7 enthalten.

17. Transgene Pflanzen gemäß den Ansprüchen 14 bis 16, welche einen Gehalt an Glutathion-S-Transferase IIIc (GSΗIIc) gegebenenfalls in der dimeren Form aufweisen.

18. Transgene Pflanzen gemäß den Ansprüchen 14 bis 17, welche im Vergleich zu den entsprechenden nicht transgenen Pflanzen, eine erhöhte Resistenz gegen Herbizide, insbesondere gegenüber Heterooxyacetamid-Herbiziden, aufweisen.

19. Verwendung der DNA gemäß Ansprüchen 1 bis 7 und/oder der rekom- binanten DNA gemäß den Ansprüchen 8 und 9 und/oder der Vektoren gemäß den Ansprüchen 10 und 11 und/oder der transformierten Mikro¬ organismen gemäß den Ansprüchen 12 und 13 zur Erzeugung von trans¬ genen Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschlie߬ lich Pflanzenteilen und Samen).

0 Verfahren zur Herstellung der transgenen Pflanzen gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) die DNA gemäß Anspruch 1 und/oder die rekombinante DNA ge¬ mäß Anspruch 8 in den Genom von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) einsetzt und gegebenenfalls

(b) aus den transgenen Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) voll¬ ständige transformierte Pflanzen regeneriert und gegebenenfalls ver¬ mehrt und gegebenenfalls

(c) von den so erhaltenen transgenen Pflanzen der Elterngeneration oder weiterer daraus gewonnener Generationen die gewünschten Pflan¬ zenteile (einschließlich Vermehrungsmaterial) gewinnt.

21. Verwendung der transgenen Pflanzen gemäß Anspruch 14 zur Erzeugung von Vermehrungsmaterial sowie zur Erzeugung neuer Pflanzen, die die DNA gemäß Anspruch 1 oder die rekombinante DNA gemäß Anspruch 8 enthalten und deren Vermehrungsmaterial.

22. Verwendung von DNA, welche ganz oder teilweise der GSTIIIc-DNA ent¬ spricht, die auf dem Plasmid pET3a-GSTIIIc enthalten ist oder welche ganz oder teilweise der SEQ ID NO: 1 entspricht, als Sonde zum Nachweis des Gehaltes an GSTIIIc-DNA oder ihrer Bestandteile in einer DNA, die auf diesen Gehalt untersucht werden soll.

23 Verwendung der für das Protein GSTIIIc gemäß SEQ ID NO: 2 ko¬ dierenden DNA zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, welche im Ver¬ gleich zu den entsprechenden nicht transgenen Pflanzen, eine erhöhte Re¬ sistenz gegenüber Herbiziden, insbesondere Heterooxyacetamid-Herbiziden, aufweisen

24 Protein mit einer Aminosauresequenz gemäß SEQ ED NO 2 oder einer da¬ von abgeleiteten Sequenz

25 Protein gemäß Anspruch 24 in der dimeren Form