DE69636392T2

DE69636392T2 - Polypeptide und polynukleotide bezüglich alpha-und-beta-glutamat-dehydrogenase-untereinheiten und deren verwendung

Info

Publication number: DE69636392T2
Application number: DE69636392T
Authority: DE
Inventors: R. Robert Gainesville SCHMIDT; Philip Ballwin MILLER
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-03
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2016-10-04
Also published as: AU715640B2; NZ319920A; EA199800273A1; EP0859849B1; ES2268711T3; WO1997012983A1; JPH11512618A; CN1198777A; CA2232542A1; EP0859849A1; AU7255696A; US5879941A; DE69636392D1; CA2232542C; BR9610861A; US5985634A; ATE334205T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Anorganischer Stickstoff, der von Pflanzen aufgenommen wird, wird letztendlich in Ammoniak umgewandelt, bevor er im organischen Stickstoff-Stoffwechsel assimiliert wird. Ein Enzym, von dem angenommen wird, dass es am Assimilationsvorgang beteiligt ist, ist die Glutamat-dehydrogenase (GDH), eine Gruppe von weitverbreiteten Enzymen, die in fast sämtlichen Organismen, angefangen von Mikroorganismen bis zu höheren Pflanzen und Tieren, vorhanden sind (H. S. Srivastava, R. P. Singh, Phytochem., Bd. 26 (1987), S. 597-610). GDH katalysiert die reversible Umwandlung von α-Ketoglutarat zu Glutamat über eine reduktive Aminierung, bei der reduziertes β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) oder reduziertes β-Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (NADPH) als Cofaktor dient. Die Rolle von Pflanzen-GDHs bei der Assimilation von Ammoniak zu Aminosäuren wurde seit der Entdeckung des Glutamin-synthetase/Glutamatsynthase (GS/GOGAT)-Stoffwechselwegs, von dem angenommen wird, dass es sich um den bevorzugten Weg der Ammoniak-Assimilation in höheren Pflanzen handelt, in Frage gestellt (B. J. Miflin, P. J. Lea, Phytochem., Bd. 15 (1976), S. 873-885).
Der Haupteinwand gegen die Annahme einer Schlüsselrolle von GDH im Pflanzen-Stickstoff-Stoffwechsel besteht in ihrer geringen Affinität zu Ammoniak, die hohe intrazelluläre Ammoniak-Konzentrationen erforderlich machen würde, um eine anabolische Funktion zu gewährleisten. Es gab frühe Anzeichen, dass GDH ein katabolisches Enzym darstellt, das die Desaminierung von Glutamat katalysiert und nur eine partielle anabolische Funktion bei der Synthese von Glutamat aufweist (J. C. Wallgrove, N. P. Hall, A. C. Kendall, Plant Physiol., Bd. 83 (1987), S. 155-158). Die physiologische Rolle von großen Mengen an GDH, die in verschiedenen Pflanzengeweben und -organellen vorhanden ist, ist noch unklar. Mögliche Bedingungen, unter denen GDH eine wichtige Rolle im Kohlenstoff- und Stickstoff-Stoffwechsel spielt, sind noch nicht geklärt.
Der Großteil von Pflanzen-GDHs, die bisher charakterisiert worden sind, findet sich in den Mitochondrien; jedoch wurde eine GDH-Spezies, die sich in mehreren Eigenschaften unterscheidet (z. B. Cofaktor, Spezifität, K_m-Werte, Organellenlokalisierung, thermische Stabilität und dergl.), aus den Chloroplasten der einzelligen Grünalge Chlorella sorokiniana charakterisiert. Von C. sorokiniana-Zellen wurde gezeigt, dass sie eine konstitutive, mitochondrielle, tetramere NAD-spezifische GDH (nachstehend als "NAD-GDH" bezeichnet) (M. J. Meredith, R. M. Gronostajski, R. R. Schmidt, Plants Physiol., Bd. 61 (1978), S. 967-974) und sieben Ammoniuminduzierbare, Chloroplasten-lokalisierte, homo- und heterohexamere NADP- spezifische GDH-Isoenzyme (nachstehend als "NADP-GDH" bezeichnet) (D. E. Prunkard, N. F. Bascomb, R. W. Robinson, R. R. Schmidt, Plant Physiol., Bd. 81 (1986), S. 349-355; N. F. Bascomb, R. R. Schmidt, Plant Physiol., Bd. 83 (1987), S. 75-84) aufweisen. Von den sieben Chloroplasten-NADP-GDH-Isoenzymen wurde gezeigt, dass sie während nativer PAGE eine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit besitzen, die zur Bildung von Homo- und Heterohexameren führen kann, die aus variierenden Verhältnissen von α- und β-Untereinheiten (53,5 und 52,3 Kilodalton) zusammengesetzt sind.
Chlorella-Zellen, die in 1 bis 2 mM Ammoniummedium gezüchtet werden, reichern nur das α-Homohexamere an (Bascomb und Schmidt, a.a.O.). Die Zugabe höherer Ammoniumkonzentrationen (3,4 bis 29 mM) zu Nitrat-gezüchteten Zellen führt zur Anreicherung sowohl der α- als auch β-Untereinheiten in NADP-GDH-Holoenzymen (Prunkard et al., a.a.O.; Bascomb und Schmidt, a.a.O.; N. F. Bascomb, D. E. Prunkard, R. R. Schmidt, Plant Physiol., Bd. 83 (1987), S. 85-91). Prunkard et al. (D. E. Prunkard, N. F. Bascomb, W. T. Molin, R. R. Schmidt, Plant Physiol., Bd. 81 (1987), S. 413-422) wiesen nach, dass das NADP-GDH-Untereinheitenverhältnis und das Isoenzymmuster sowohl durch die Kohlenstoff- als auch durch die Stickstoffquelle sowie durch die Lichtbedingungen, unter denen die Zellen gezüchtet werden, beeinflusst wird.
Die α- und β-NADP-GDH-Homohexameren, die aus Chlorella-Zellen gereinigt worden sind, weisen auffallend unterschiedliche Ammonium-K_m-Werte auf; jedoch sind die K_m-Werte für ihre übrigen Substrate sehr ähnlich. Das α-Homohexamere (aus sechs identischen α-Untereinheiten zusammengesetzt), das die Biosynthese von Glutamat katalysiert, wird allosterisch durch NADPH reguliert und besitzt einen ungewöhnlich niedrigen K_m-Wert für Ammonium, der im Bereich von 0,02 bis 3,5 mM liegt, und zwar je nach der NADPH-Konzentration (Bascomb und Schmidt, a.a.O.). Der K_m-Wert für Ammonium des α-Homohexameren ist der niedrigste Ammonium-K_m-Wert für sämtliche bisher charakterisierten Pflanzen-GDHs. Im Gegensatz dazu handelt es sich beim β-Homohexameren (katabolische Form) um ein nicht-allosterisches Enzym mit einem Ammonium-K_m-Wert von etwa 75 mM. Aufgrund dieser Untersuchungen unter Beteiligung von gereinigten Enzymen wurde bisher die Auffassung vertreten, dass die Heterohexameren variierende Affinitätsgrade für Ammonium aufweisen, die im Bereich zwischen den K_m-Werten für die α- und β-Homohexameren liegen. Überraschenderweise haben wir jedoch festgestellt, dass bestimmte Heterohexamere ein Aktivitätsverhältnis von Aminierung zu Desaminierung aufweisen können, das größer als das für die α- und β-Homohexameren ist.
Obgleich die α- und β-Untereinheiten unterschiedliche in vivo-Turnover-Geschwindigkeiten aufweisen (Bascomb et al., a.a.O.) und die entsprechenden Homohexameren deutlich unterschiedliche Ammonium-K_m-Werte aufweisen, leiten sich die α- und β-Untereinheiten von Vorläuferproteinen mit nahezu identischer Größe ab (etwa 58000 Dalton), und es wurde gezeigt, dass sie sehr ähnliche Peptidkarten aufweisen (Prunkard et al., a.a.O.; Bascomb und Schmidt, a.a.O.). Außerdem sind polyklonale Antikörper, die gegen das β-Homohexamere hergestellt worden sind, zur Immunopräzipitation sämtlicher NADP-GHD-Isoenzyme befähigt (Yeung et al., Anal. Biochem., Bd. 10 (1981), S. 216-228; Bascomb et al., a.a.O.), gehen jedoch keine Kreuzreaktion mit der mitochondriellen NAD-GDH ein.
Cock et al., Plant Mol. Biol, Bd. 17 (1991), S. 17-27 beschreiben eine Nucleotidsequenz, die für die gesamte reife β-Untereinheit von Glutamatdehydrogenase (GDH) von Chlorella sorokiniana und für mindestens 98 % der reifen α-Untereinheit kodiert. Dieser Artikel liefert auch genomische Klonierungs- und Southern-Blot-Beweise, die zeigen, dass das C. sorokiniana-Genom ein einziges NADP-GDH-Strukturgen besitzt.
Die nuklear-kodierten, C. sorokiniana-Chloroplasten-NADP-GDH-Isoenzyme stellen die einzigen, in den Chloroplasten lokalisierten GDH-Sequenzen dar, die aus Pflanzen isoliert und charakterisiert worden sind.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Es wurde nunmehr festgestellt, dass die beiden reifen Untereinheiten von Chlorella-GDH-Isoenzymen über eine spezifische Prozessierung von zwei ähnlichen Vorläuferproteinen entstehen, die durch zwei mRNAs kodiert werden, die durch alternatives Spleißen einer prä-mRNA, die sich von einem einzigen nuklearen Gen ableitet, gebildet werden. Ferner wurden die Spaltungsstelle und die aminoterminale Peptidsequenz der reifen, funktionellen GDH-Untereinheiten identifiziert.
Speziell wird erfindungsgemäß die Isolierung und Charakterisierung von zwei cDNAs von voller Länge aus mRNAs, die aus der einzelligen Grünalge Chlorella sorokiniana isoliert worden sind, bereitgestellt. Die beiden cDNAs kodieren für die Vorläuferproteine (α-Vorläufer: 56,35 kD; β-Vorläufer: 57,85 kD), die unter Bildung der reifen α- und β-Untereinheiten (53,5 kD; bzw. 52,3 kD), die die hexameren NADP-GDH-Isoenzyme bilden, prozessiert werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ein einzelnes NADP-GDH-Gen, das alternativ unter Bildung von zwei mRNAs gespleißt wird, die für zwei verschiedene Chloroplasten-Vorläuferproteine kodieren. Diese Vorläuferproteine können anschließend zu den reifen α- und β-Untereinheiten der NADP-GDH-Isoenzyme prozessiert werden. Ferner werden geeignete Fragmente oder Mutanten der Nucleotid- und Aminosäuresequenzen beschrieben, bei denen die angegebene Aktivität oder Verwendungsmöglichkeit erhalten bleibt. Beispielsweise können bestimmte Fragmente der hier bereitgestellten Aminosäuresequenzen als Transitpeptide geeignet sein, die dem Protein die Fähigkeit verleihen, in bestimmte Zellkompartimente zu gelangen und dort zu verbleiben. Die hier beschriebenen Nucleotidsequenzen und die Fragmente dieser Nucleotidsequenzen eignen sich beispielsweise als Primer bei Amplifikationsverfahren oder als Sonden zur Hybridisierung mit komplementären Sequenzen von Interesse. Die hier beschriebenen Nucleotid- und Aminosäuresequenzen und Fragmente davon können sich auch als Molekulargewichtsmarker oder bei der Feststellung oder Bestätigung der Verwandtschaft anderer Nucleotidsequenzen, Polypeptide oder Isoenzyme, die zur NADP-GDH-Gruppe gehören, eignen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren bereit, mit denen die Assimilation von anorganischem Stickstoff in den organischen Stickstoff-Stoffwechsel von höheren Pflanzen verändert werden kann, indem man GDH aus C. sorokiniana oder GDHs, die aus anderen Organismen isoliert worden sind, exprimiert. Die Veränderung der Stickstoff-Assimilation kann die Wirkung aufweisen, dass die Stickstoffassimilation erhöht wird, was gemäß den Erkenntnissen aus dem Stand der Technik die Zusammensetzung der Pflanze über einen inversen Einfluss auf den Kohlenstoff-Stoffwechsel, z. B. Anreicherung von Kohlenhydraten, beeinflussen kann. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner DNA-Konstrukte zur Verwendung in den beschriebenen Verfahren. Die vorliegende Erfindung umfasst die Identifizierung der aminoterminalen Sequenzen der α- und β-Untereinheiten, die zur Bildung der NADP-GDH-Isoenzyme zusammengesetzt werden können, z. B. zum nativen, hexameren NADP-GDH, die in C. sorokiniana-Chloroplasten auftritt. Die präzise molekulare Information kann dazu eingesetzt werden, NADP-GDH mit den besonderen kinetischen Eigenschaften der C. sorokiniana-Chloroplasten-NADP-α- und β-GDH-Homohexameren zu exprimieren. Die vorliegende Erfindung stellt ferner rekombinante Zellen oder Organismen bereit, z. B. transgene Pflanzen, die durch Expression der Gene der beschriebenen Polynucleotidsequenzen zur Bildung der entsprechenden Polypeptide erhöhte Erträge, verbesserte Ammoniak-Assimilationseigenschaften, die in vorteilhafter Weise die Toleranz der Feldfrüchte oder Pflanzen gegenüber der Toxizität von Ammoniak erhöhen können, eine verbesserte osmotische Stresstoleranz und verbesserte Zusammensetzungen der Früchte oder Pflanzen aufweisen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Muster der NADP-GDH-Aktivitäten in Homogenisaten von synchronen C. sorokiniana-Zellen, die 240 min in 29 mM Ammoniummedium unter kontinuierlicher Belichtung gezüchtet worden sind. Aliquotanteile von geklärten Homogenisaten aus Zellen, die in verschiedenen Zeitabständen gewonnen wurden, wurden spektrophotometrisch sowohl auf aminierende (•) als auch auf desaminierende (o) NADP-GDH-Aktivitäten analysiert.
2 zeigt Muster der Anreicherung von NADP-GDH-Antigenen in belichteten Zellen, die 240 min in 29 mM Ammoniummedium gezüchtet worden sind. Zum Zeitpunkt 0 wurde Ammonium zu synchronen C. sorokiniana-Tochterzellen gegeben und die Kultur wurde belichtet. Autoradiographien von Western-Blots wurden durch Laser-Densitometrie analysiert, um die relativen Konzentrationen der NADP-GDH-α-Untereinheit (•) und β-Untereinheit (o) während der 240-minütigen Induktionsperiode zu bestimmen.
Kurze Beschreibung der Sequenzen
SEQ ID NO. 1 ist die cDNA für das Vorläuferprotein der α-Untereinheit einer NADP-spezifischen Glutamat-dehydrogenase.
SEQ ID NO. 2 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz des Polynucleotids von of SEQ ID NO. 1.
SEQ ID NO. 3 ist die cDNA für das Vorläuferprotein der β-Untereinheit einer NADP-spezifischen Glutamat-dehydrogenase.
SEQ ID NO. 4 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz des Polynucleotids von SEQ ID NO. 3.
SEQ ID NO. 5 ist die N-terminale Sequenz für die NADP-GDH-α-Untereinheit.
SEQ ID NO. 6 ist die N-terminale Sequenz für die NADP-GDH-β-Untereinheit.
SEQ ID NO. 7 ist die cDNA-Sequenz im Klon mit der Bezeichnung pBGDc53.
SEQ ID NO. 8 ist ein Primer, der mit der konservierten Region von NADP-GDH-mRNAs hybridisiert.
SEQ ID NO. 9 ist ein poly(dT)-Polynucleotid, das erfindungsgemäß als Adapterprimer verwendet wird.
SEQ ID NO. 10 ist ein Polynucleotid, das erfindungsgemäß als Primer verwendet wird.
SEQ ID NO. 11 ist ein Polynucleotid, das erfindungsgemäß als Primer verwendet wird.
SEQ ID NO. 12 ist ein Polynucleotid, das erfindungsgemäß als Adapterprimer verwendet wird.
SEQ ID NO. 13 ist das Polynucleotid-Insert im Klon mit der Bezeichnung pRGDc 60.
SEQ ID NO. 14 ist das Polynucleotid-Insert im Klon mit der Bezeichnung pRGDc 61.
SEQ ID NO. 15 ist das Polynucleotid, das erfindungsgemäß als ein Primer verwendet wird.
SEQ ID NO. 16 ist das Polynucleotid-Insert in einem Klon mit der Bezeichnung pGDc 63.
SEQ ID NO. 17 ist das Polynucleotid-Insert eines Klons mit der Bezeichnung pGDc 64.
SEQ ID NO. 18 ist das Polynucleotid, das sich aus der Ligation von gereinigten Fragmenten der Inserts in den Klonen mit den Bezeichnungen pBGDc 53 und pGDc 63, erfindungsgemäß ergibt.
SEQ ID NO. 19 ist das Polynucleotid, das sich aus der Ligation der gereinigten Inserts der Klone mit den Bezeichnungen pGDc 64 und pBGDc 53 ergibt.
SEQ ID NO. 20 ist ein Polynucleotid, das erfindungsgemäß als ein Primer verwendet wird.
SEQ ID NO. 21 ist ein Polynucleotid, das erfindungsgemäß als ein Primer verwendet wird, der mit dem 3'-Terminus der Matrizen-DNA hybridisiert.
SEQ ID NO. 22 ist ein Polynucleotid, das erfindungsgemäß als ein Primer verwendet wird.
SEQ ID NO. 23 ist eine Polynucleotidsequenz (cDNA) der prozessierten, reifen NADP-GDH-α-Untereinheit.
SEQ ID NO. 24 ist die Aminosäuresequenz der prozessierten, reifen NADP-GDH-α-Untereinheit.
SEQ ID NO. 25 ist die Polynucleotidsequenz (cDNA) der prozessierten, reifen NADP-GDH-β-Untereinheit.
SEQ ID NO. 26 ist die Aminosäuresequenz der prozessierten, reifen NADP-GDH-β-Untereinheit.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt bisher nicht beschriebene Polynucleotidsequenzen bereit, beispielsweise cDNAs für Vorläuferproteine von α- und β-Untereinheiten einer Ammonium-induzierbaren, in den Chloroplasten lokalisierten, NADP-spezifischen Glutamat-dehydrogenase (nachstehend als NADP-GDH bezeichnet) aus Chlorella sorokiniana bereit. Die Nucleotidsequenz für die Vorläuferproteine der α- und β-Untereinheiten, die NADP-GDH bilden, sind in SEQ ID NO. 1 bzw. 3 dargestellt. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für die Vorläuferproteine der α- und β-Untereinheiten des NADP-GDH-Enzyms von Chlorella sorokiniana sind in SEQ ID NO. 2 bzw. 4 dargestellt.
E. coli-Wirte, die die vorliegenden cDNA-Inserts umfassen, wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt. Die Kulturen erhielten von der Hinterlegungsstelle die nachstehend angegebenen Hinterlegungsnummern:
Durch eine automatisierte Aminosäure-Sequenzanalyse werden die 20 bzw. 10 aminoterminalen Aminosäurereste der α- und β-Untereinheiten identifiziert. Eine Ausrichtung der Peptidsequenzen der α- und β-Untereinheiten ergibt, dass die beiden Untereinheiten identisch sind, mit der Ausnahme einer in der größeren α-Untereinheit vorhandenen Erweiterung mit 11 Aminosäuren. Von monoklonalen Antikörpern, die gegen die α-Untereinheit erzeugt wurden, wurde gezeigt, dass sie die β-Untereinheit erkennen, was einen weiteren Beweis dafür darstellt, dass die beiden Untereinheiten nahezu identisch sind. Die Identifizierung der besonderen α- und β-Untereinheit-Prozessierungsstellen innerhalb der Vorläuferproteine führt zum molekularen Mechanismus, um die unterschiedlichen kinetischen Eigenschaften der α- und β-NADP-GDH-Homohexamer-Isoenzyme zu erklären.
Die vorerwähnten Daten liefern Informationen, die auf die genetische Manipulation von Pflanzen anwendbar sind, die eine spezifische GDH mit günstigen kinetischen Eigenschaften aufweisen, die sowohl den Kohlenstoff- als auch den Stickstoff-Stoffwechsel beeinflussen können. Auf der Grundlage des hohen Gehalts an Guanin/Cytosin sind die cDNAs in hohem Maße einer heterologen Expression in höheren Pflanzen zugänglich. Die Einführung von einer der beiden Untereinheiten mit ihren auf Chloroplasten abzielenden Sequenzen oder mit anderen, auf Organellen abzielenden Sequenzen in heterologe Pflanzensysteme kann die Stickstoff-Assimilation verbessern und das Kohlenstoff/Stickstoff-Gleichgewicht beeinflussen.
Es wurde festgestellt, dass die Chloroplasten-Lokalisierung mit dem N-Terminus des α- oder β-Vorläuferproteins in Zusammenhang steht und davon abhängig sein kann. Die Abspaltung des N-Terminus der Vorläufer führt zu den reifen Proteinen. Demgemäß umfasst das Chloroplasten-Transitpeptid ein Peptid, das den vom Vorläuferprotein abgespaltenen N-Terminus bildet oder ein aktives Fragment davon ist. Peptide mit ähnlichen oder gleichwertigen Aminosäuresequenzen oder Peptide, die eine tertiäre Struktur oder Konformation, die ähnlich mit denen der abgespaltenen Peptide sind, aufweisen, können ebenfalls als Transitpeptide fungieren. Das Chloroplasten-Transitpeptid umfasst das aktive Fragment des N-terminalen Peptids, das vom α-Vorläufer (ein 40-meres) oder vom β-Vorläufer (ein 37-meres) abgespalten wird. Die Polynucleotidsequenzen, die für die Chloroplasten-Transitpeptide kodieren, können vom Fachmann zur Herstellung von Chloroplasten-Transitpeptiden eingesetzt werden, die zusammen mit den hier beschriebenen Peptiden oder anderen bekannten Produkten verwendet werden.
Eine Addition, eine Entfernung oder ein Ersatz des Chloroplasten-Transitpeptids, das mit einem Protein, z. B. einem GDH-Enzym, assoziiert ist, kann je nach den Bedürfnissen zur Lokalisierung des Proteins mittels bekannter Maßnahmen verwendet werden. Beispielsweise kann die Lokalisierung des Enzyms in einem Chloroplast einer Zelle erreicht werden, indem man ein Chloroplasten-Transitpeptid in die Aminosäuresequenz, der ein derartiges Transitpeptid fehlt, einführt. Speziestypische Chloroplasten-Transitpeptide können an vorhandene Peptide addiert werden oder diese ersetzen, um die Insertion in den Chloroplast einer erwünschten Spezies zu optimieren. Ferner kann eine Lokalisierung eines Proteins, das in Chloroplasten exprimiert wird, im Innern des Chloroplasten durch direkte Transformation des Plastids mit den Polynucleotidsequenzen, die für ein exprimiertes Protein kodieren, erreicht werden. Gleichermaßen kann eine Entfernung eines Chloroplasten-Transitpeptids oder eine Erzeugung eines rekombinanten Proteins, dem das Peptid fehlt, dazu herangezogen werden, das Protein in einem zellulären Kompartiment, das vom Chloroplasten abweicht, zu sequestrieren.
Transformierte Pflanzen, die ein α-Homohexameres exprimieren, können gegenüber der Ammoniak-Toxizität toleranter sein, Ammonium wirksamer assimilieren und rascher auf eine osmotische Belastung, die in vorübergehend salzhaltigen Böden auftritt, reagieren, indem sie Glutamat, den Vorläufer für das osmotische Schutzmittel Prolin, bereitstellen. Beispielsweise kann die Expression des β-Homohexameren oder der GDH-Heterohexameren dazu eingesetzt werden, die Geschwindigkeit der Stickstoff-Assimilation zu verändern, um die Anreicherung von Kohlenhydraten in Früchten und anderen Speicherorganen zu begünstigen.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass ein Hexameres, das mindestens eine α-Untereinheit und mindestens eine β-Untereinheit enthält, d. h. ein Heterohexameres, eine vorteilhafte Aktivität aufweisen kann. Speziell lässt sich das Aktivierungsverhältnis von Aminierung zu Desaminierung (d. h. die biosynthetische Kapazität zur Synthese von Glutamat) eines Chloroplasten-NADP-GDH-Isoenzyms erhöhen, indem man sowohl die α- als auch die β-Untereinheiten in das hexamere Protein einbaut, anstelle der Verwendung eines Homohexameren, das nur die α- oder nur die β-Untereinheiten umfasst. In einer Ausführungsform der Erfindung kann es vorteilhaft sein, cDNAs, die für beide Typen der Untereinheiten kodieren, in der gleichen Pflanze in unterschiedlichen Geschwindigkeiten/Konzentrationen zu koexprimieren, so dass ein bestimmtes Verhältnis von α- und β-Untereinheiten im Heterohexameren erzielt wird. Beispielsweise haben wir festgestellt, dass ein NADP-GDH-Heterohexameres mit mindestens einer der Untereinheiten in der β-Form für die Erhöhung des Aktivierungsverhältnisses von Aminierung zu Desaminierung bevorzugt ist. Ein besonders bevorzugtes Heterohexameres weist 2-5 β-Untereinheiten auf. Die unterschiedliche Expressionsgeschwindigkeit der beiden cDNAs kann erreicht werden, indem man sie unter die Kontrolle von Pflanzenpromotoren mit unterschiedlichen Stärken oder unter den gleichen Promotor, der so modifiziert worden ist, dass er unterschiedliche Expressionsgrade erzeugt, stellt. Die Verwendung dieses Algen-NADP-GDH-Isoenzymsystems in der Pflanzenbiotechnik weist Vorteile gegenüber NADP-GDHs aus Organismen, wie Bakterien, auf, die nur eine einzige Form des Enzyms (d. h. keine Isoenzyme) enthalten.
Es ist bekannt, dass die Expressionsgrade bestimmter rekombinanter Proteine in transgenen Pflanzen über eine erhöhte Expression von stabilisierten mRNA-Transkripten verbessert werden kann, und dass umgekehrt der Nachweis dieser stabilisierten RNA-Transkripte zur Messung der Expression eines translationalen Produkts (Protein) verwendet werden kann. Eine geringe Expression von Protein-RNA in Pflanzen und daher eine geringe Proteinexpression kann zur Verwendung eines verbesserten, synthetischen Gens, das das erwünschte Protein aus dem Gen-Quellenorganismus spezifiziert, behoben werden.
Somit werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Bakterien und Pflanzen gentechnisch so bearbeitet, dass die angestrebten Expressionsgrade neuer Proteine, die landwirtschaftlich oder anderweitig gewerblich wertvoll sind, erreicht werden. Zur Bereitstellung von Genen mit erhöhter Expression in Pflanzen kann die DNA-Sequenz des Gens so modifiziert werden, dass sie Codons, die von hochgradig exprimierten Pflanzengenen bevorzugt werden, umfasst, so dass ein A+T-Gehalt in einer Nucleotidbasenzusammensetzung erreicht wird, wie er im wesentlichen in Pflanzen auftritt, und vorzugsweise eine Pflanzeninitiationssequenz gebildet wird und Sequenzen, die eine Destabilisierung, eine ungeeignete Polyadenylierung, einen Abbau und eine Termination von RNA verursachen, beseitigt werden und Sequenzen, die sekundäre Struktur-Haarnadeln und RNA-Spleißstellen darstellen, vermieden werden. Beispielsweise können in synthetischen Genen, die zur Spezifizierung einer gegebenen Aminosäure verwendeten Codons im Hinblick auf die Verteilungsfrequenz des Codons, das in hochgradig exprimierten Pflanzengenen verwendet wird, ausgewählt werden, um diese Aminosäure zu spezifizieren. Der Fachmann erkennt, dass die Verteilungsfrequenz der Codonanwendung, die im synthetischen Gen verwendet wird, eine Determinante des Expressionsgrads darstellt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "Frequenz der bevorzugten Codonverwendung" auf die Bevorzugung einer bestimmten Wirtszelle bei der Verwendung von NucleotidCodons, um eine gegebene Aminosäure zu spezifizieren. Zur Bestimmung der Frequenz der Verwendung eines bestimmten Codons in einem Gen wird die Anzahl des Auftretens dieses Codons im Gen durch die Gesamtzahl des Auftretens sämtlicher Codons, die die gleiche Aminosäure im Gen spezifizieren, dividiert. Gleichermaßen lässt sich die Frequenz einer bevorzugten Codonverwendung durch eine Wirtszelle berechnen, indem man die Frequenz der bevorzugten Codonverwendung in einer großen Anzahl von Genen, die durch die Wirtszelle exprimiert werden, mittelt. Es ist bevorzugt, dass diese Analyse auf Gene beschränkt wird, die von der Wirtszelle hochgradig exprimiert werden.
Bei der Synthese eines Gens zur verbesserten Expression in einer Wirtszelle ist es erstrebenswert, das Gen so zu konstruieren, dass seine Häufigkeit der Codonverwendung sich der Häufigkeit der bevorzugten Codonverwendung der Wirtszelle nähert.
Die prozentuale Abweichung der Frequenz der bevorzugten Codonverwendung für ein synthetisches Gen von der Frequenz, die von der Wirtszelle verwendet wird, wird berechnet, indem man zunächst die prozentuale Abweichung der Frequenz der Verwendung eines einzelnen Codons von der Frequenz der Wirtszelle bestimmt und anschließend die durchschnittliche Abweichung über sämtliche Codons hinweg ermittelt. Gemäß der hier gegebenen Definition umfasst diese Berechnung einmal vorkommende Codons (d. h. ATG und TGG). Allgemein ausgedrückt, wird die gesamte durchschnittliche Abweichung der Codonverwendung eines synthetischen Gens von der Verwendung einer Wirtszelle gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
wobei X_n die Frequenz der Verwendung für das Codon n in der Wirtszelle bedeutet und Y_n die Frequenz der Verwendung für das Codon n im synthetischen Gen bedeutet. Während n ein individuelles Codon, das eine Aminosäure spezifiziert, wiedergibt, beträgt die Gesamtzahl der Codons Z. Die gesamte Abweichung der Frequenz der Codonverwendung A für sämtliche Aminosäuren soll vorzugsweise weniger als etwa 25 % und insbesondere weniger als 10 % bedeuten. Somit lässt sich ein Gen so konstruieren, dass seine Verteilungsfrequenz der Codonverwendung vorzugsweise nicht mehr als 25 % vom Wert von hochgradig exprimierten Pflanzengenen und insbesondere um nicht mehr als 10 % abweicht. Ferner wird der prozentuale G+C-Gehalt der degenerierten dritten Base beachtet (Monocotyledone scheinen in dieser Position G+C zu bevorzugen, während dies bei Dicotyledonen nicht der Fall ist). Ferner ist ersichtlich, dass das XCG-Nucleotid (wobei X A, T, C oder G bedeutet) das am wenigsten bevorzugte Codon in Dicotyledonen darstellt, während das XTA-Codon sowohl in Monocotyledonen als auch in Dicotyledonen vermieden wird. Erfindungsgemäße synthetische Gene weisen vorzugsweise CG- und TA-Dublett-Vermeidungsindices auf, die nahe bei den Werten der gewählten Wirtspflanze liegen. Insbesondere weichen diese Indices von denen des Wirts um nicht mehr als etwa 10-15 % ab.
Das Zusammensetzen des erfindungsgemäßen NADP-GDH-Gens lässt sich unter Anwendung der üblichen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren durchführen. Ein Strukturgen, das für eine verstärkte Expression in Pflanzen der speziellen Ausführungsform konzipiert ist, lässt sich enzymatisch innerhalb eines DNA-Vektors aus chemisch synthetisierten Oligonucleotid-Duplexsegmenten zusammensetzen. Das Gen kann sodann durch aus dem Stand der Technik bekannte Maßnahmen in eine Pflanzenwirtszelle eingeführt und exprimiert werden. Vorzugsweise ist das bei Expression des synthetischen Gens in Pflanzen erzeugte Protein funktionell mit einem nativen Protein insofern gleichwertig, als es eine vergleichbare oder verbesserte Aktivität der Aminierung/Desaminierung aufweist. Erfindungsgemäß bezieht sich der Ausdruck "funktionell gleichwertig" auf eine identische oder nahezu identische Funktion. Ein synthetisches Genprodukt, das mindestens eine Eigenschaft bezüglich seiner Aktivität oder Funktion, die gleich oder ähnlich wie bei einem natürlichen Protein ist, aufweist, wird als funktionell gleichwertig damit angesehen. Modifikationen in der Nucleotidsequenz der Kodierungsregion können vorgenommen werden, um den A+T-Gehalt in der DNA-Basenzusammensetzung eines synthetischen Gens zu verändern, um die Zusammensetzung widerzuspiegeln, die normalerweise in Genen für hochgradig exprimierte Proteine, die für die Wirtszelle nativ sind, auftreten. Vorzugsweise ist der A+T-Gehalt des synthetischen Gens im wesentlichen gleich mit dem Gehalt dieser Gene für hochgradig exprimierte Proteine. In Genen, die für hochgradig exprimierte Pflanzenproteine kodieren, beträgt der A+T-Gehalt etwa 55 %. Vorzugsweise weist das synthetische Gen einen A+T-Gehalt auf, der nahe bei diesem Wert liegt und nicht so hoch ist, dass eine Destabilisierung von RNA hervorgerufen wird und dadurch die Proteinexpressionsgrade gesenkt werden. Insbesondere beträgt der A+T-Gehalt nicht mehr als etwa 60 % und ganz besonders etwa 55 %. Ferner kann für die letztendliche Expression in Pflanzen die synthetische Gen-Nucleotidsequenz vorzugsweise so modifiziert werden, dass eine Pflanzeninitiationssequenz am 5'-Ende der Kodierungsregion gebildet wird. Außerdem wird vorzugsweise besonders darauf geachtet, dass gewährleistet ist, dass sich besondere Restriktionsstellen an strategischen Positionen befinden, um ein wirksames Zusammensetzen von Oligonucleotidsegmenten während der Konstruktion des synthetischen Gens zu ermöglichen und die anschließende Nucleotidmodifikation zu erleichtern. Als Ergebnis dieser Modifikationen in der Kodierungsregion des nativen Gens wird das bevorzugte synthetische Gen in Pflanzen in einem erhöhten Maß exprimiert, verglichen mit dem Wert, der bei natürlichen Strukturgenen beobachtet wird.
Es ist bekannt, dass die relative Verwendung von synonymen Codons zwischen Monocotylidonen und Dicotylidonen unterschiedlich ist. Im allgemeinen besteht der wichtigste Faktor bei der Unterscheidung zwischen Monocotylidonen- und Dicotylidonen-Mustern der Codonverwendung im prozentualen G+C-Gehalt der degenerierten dritten Base. Bei Monocotylidonen begünstigen 16 von 18 Aminosäuren G+C in dieser Position, während Dicotylidone G+C nur bei 7 von 18 Aminosäuren begünstigen.
Bei Sojabohne und Mais besitzt das Codon-Verwendungsmuster von Mais eine Ähnlichkeit mit dem von Monocotylidonen im allgemeinen, während das Codon-Verwendungsmuster der Sojabohne mit dem Muster von üblichen Dicotylidonen fast identisch ist.
Bei der Konstruktion eines synthetischen Gens zur Expression in Pflanzen ist es bevorzugt, Sequenzen zu beseitigen, die die Wirksamkeit der Genexpression beeinträchtigen.
Ein synthetisches Gen kann neben dem Ziel, einen erhöhten Expressionsgrad zu erreichen, auch für andere Zwecke synthetisiert werden. Beispielsweise kann erfindungsgemäß eine der Nucleotidsequenzen, die für die α-Untereinheit oder die β-Untereinheit von NADP-GDH kodieren, so modifiziert werden, dass die Produkte unterschiedlich exprimiert werden, wobei eine Expression von einer der Untereinheiten begünstigt wird. Als Ergebnis einer derartigen unterschiedlichen Expression entsteht ein Heterohexameres, das von einer Untereinheit einen größeren Anteil als von der anderen Untereinheit umfasst. Die Modifikation kann eine Substitution von einem oder mehreren, wenn nicht allen Oligonucleotidsequenzen, die zur Konstruktion des synthetischen Gens durch eine entsprechende Region einer natürlichen Sequenz verwendet werden, umfassen. Vorzugsweise kann man sich einer unterschiedlichen Expression der Nucleotidsequenzen, die für die α- und β-Untereinheiten der NADP-GDH-Polypeptide kodieren, bedienen, um ein Heterohexameres zu erzeugen, das mindestens eine β-Untereinheit, vorzugsweise 2-5 β-Untereinheiten und ganz besonders 3 β-Untereinheiten aufweist.
Das rekombinante DNA-Molekül, das eine erfindungsgemäße Nucleotidsequenz umfasst, kann im Pflanzengewebe durch beliebige, dem Fachmann geläufige Maßnahmen eingeführt werden. Die Technik, die für eine gegebene Pflanzenspezies oder einen bestimmten Typ von Pflanzengewebe herangezogen wird, hängt von den bekannten erfolgreichen Techniken ab. Mit der Entwicklung von neuartigen Maßnahmen zur stabilen Insertion von fremden Genen und Pflanzenzellen und zur Manipulation der modifizierten Zellen sind die Fachleute in der Lage, eine Auswahl unter bekannten Maßnahmen zu treffen, um ein angestrebtes Ergebnis zu erreichen. Zu Maßnahmen zur Einführung von rekombinanter DNA in Pflanzengewebe gehören (ohne Beschränkung hierauf) eine direkte DNA-Aufnahme (J. Paszkowski et al., EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 2717), die Elektroporation (M. Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 82 (1985), S. 5824), die Mikroinjektion (A. Crossway et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 202 (1986), S. 179) oder der T-DNA-vermittelte Transfer von Agrobacterium tumefaciens in das Pflanzengewebe. Es scheint keine grundlegende Beschränkung der T-DNA-Transformation auf den natürlichen Wirtsbereich von Agrobacterium zu geben. Es wurde über eine erfolgreiche T-DNA-vermittelte Transformation von Monocotylidonen (G. Hooykaas-Van Slogteren et al., Nature, Bd. 311 (1984), S. 763), Gymnospermen (A. Dandekar et al., Biotechnology, Bd. 5 (1987), S. 587) und Algen (R. Ausich, EP-A-108580) berichtet. Repräsentative T-DNA-Vektorsysteme werden in folgenden Druckschriften beschrieben: G. An et al., EMBO J., Bd. 4 (1985), S. 277; L. Herrera-Estrella et al., Nature, Bd. 303 (1983), S. 209; L. Herrera-Estrella et al., EMBO J., Bd. 2 (1983), S. 987; L. Herrera-Estrella et al., Plant Genetic Engineering, New York, Cambridge University Press (1985), S. 63. Nach der Einführung in das Pflanzengewebe kann die Expression des Strukturgens durch beliebige, aus dem Stand der Technik bekannte Maßnahmen bestimmt werden und die Expression kann als transkribierte mRNA oder als synthetisiertes Protein gemessen werden. Es sind Techniken für die in vitro-Züchtung von Pflanzengeweben und in zahlreichen Fällen für die Regeneration zu vollständigen Pflanzen bekannt. Verfahren zur Übertragung des eingeführten Expressionskomplexes auf gewerblich verwendbare Kulturvarietäten sind dem Fachmann geläufig.
In einer der bevorzugten Ausführungsformen umfasst die hier beschriebene Erfindung die Expression eines NADP-GDH-Gens unter der Kontrolle eines in Pflanzen exprimierbaren Promotors in Pflanzenzellen, d. h. durch Insertion des Gens in T-DNA unter der Kontrolle eines in Pflanzen exprimierbaren Promotors und durch Einführen der T-DNA, die das Insert enthält, in eine Pflanzenzelle unter Heranziehung bekannter Maßnahmen. Nachdem Pflanzenzellen, die das Gen unter der Kontrolle eines in Pflanzen exprimierbaren Promotors exprimieren, erhalten worden sind, lassen sich Pflanzengewebe und vollständige Pflanzen daraus regenerieren, wobei man aus dem Stand der Technik bekannte Methoden und Techniken heranzieht. Die regenerierten Pflanzen werden sodann durch herkömmliche Maßnahmen reproduziert und die eingeführten Gene können auf andere Stämme und Kulturvarietäten durch herkömmliche Pflanzenzuchttechniken übertragen werden.
Die Einführung und Expression des NADP-GDH-Gens kann dazu verwendet werden, beispielsweise die Feldfruchtausbeute zu verbessern. Weitere Anwendungsmöglichkeiten für die Erfindung, bei denen die Eigenschaften der in Pflanzenspezies eingeführten Gene ausgenützt werden, sind für den Fachmann leicht ersichtlich.
Es können auch Unterschiede zwischen der Codonwahl in Pflanzenkerngenen und in Chloroplasten bestehen. Chloroplasten unterscheiden sich von höheren Pflanzen insofern, als sie nur 30 tRNA-Spezies kodieren. Da Chloroplasten ihre tRNA-Gene beschränkt haben, erscheint die Verwendung von bevorzugten Codons durch Chloroplasten-kodierte Proteine extremer. Jedoch wurde über eine positive Korrelation zwischen dem Grad der Isoakzeptanz von tRNA für eine gegebene Aminosäure und der Frequenz, mit der dieses Codon im Chloroplastengenom verwendet wird, berichtet (Pfitzinger et al., Nucl. Acids Res., Bd. 15 (1987), S. 1377-1386). Im allgemeinen besitzt das Chloroplasten-Codonprofil eine stärkere Ähnlichkeit mit dem von einzelligen Organismen, wobei eine starke Tendenz hin zur Verwendung von A+T in der degenerierten dritten Base besteht.
Nachstehend finden sich Beispiele, die Verfahren zur Durchführung der Erfindung unter Einschluss der besten Ausführungsform erläutern. Diese Beispiele sind nicht als Beschränkung anzusehen. Sämtliche Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht und sämtliche Lösungsmittelverhältnisse beziehen sich auf das Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist.
Beispiele
Beispiel 1 – Kinetik der C. sorokiniana-Chloroplasten-Glutamatdehydrogenasen
Die Chloroplasten-Glutamat-dehydrogenase-α- und β-Isoenzyme, die in den folgenden Experimenten verwendet werden, werden in natürlicher Weise durch einen Organismus, der als Chlorella sorokiniana charakterisiert wird, erzeugt.
C. sorokiniana-Züchtungsbedingungen:
Zur kinetischen Charakterisierung in Richtung sowohl der Aminierung als auch der Desaminierug wurden die α- und β-Holoenzyme aus Zellen gereinigt, die nur eine Form von homohexamerem GDH-Isoenzym anreicherten.
Die C. sorokiniana-Zellen (UTEX-1230, Kultursammlung der University of Texas, 3B2NA, Robert R. Schmidt, University of Florida, Microbiology Cell Science Department) wurden in autotropher Weise gemäß den Angaben von Prunkard et al. (a.a.O.) in einem modifizierten Basalsalzmedium gezüchtet. Das modifizierte Medium wies folgende Konzentrationen in mM auf: CaCl₂, 0,34; K₂SO₄, 6,0; KH₂PO₄, 18,4; MgCl₂, 1,5; in μM-Konzentrationen: CoCl₂, 0,189; CuCl₂, 0,352; EDTA, 72; FeCl₃, 71,6; H₃BO₃, 38,8; MnCl₂, 10,1; NH₄VO₄, 0,20; (NH₄)₆MO₇O₂₄, 4,19; NiCl₂, 0,19; SnCl₂, 0,19; ZnCl₂, 0,734. Das Medium wurde mit 1 mM NH₄Cl, 29 mM NH₄Cl oder 29 mM KNO₃ als Stickstoffquelle, je nach den experimentellen Bedingungen, ergänzt. Das Medium mit einem Gehalt an NH₄Cl wurde auf den pH-Wert 7,4 eingestellt und das Medium mit einem Gehalt an KNO₃ wurde nach dem Autoklavisieren mit KOH auf den pH-Wert 6,8 eingestellt. Die Zellen wurden mit einem 2 % (Vol./Vol.)-CO₂-Luftgemisch und einer Lichtintensität, die zur Zellteilung bis zur vierten Nachkommengeneration ausreichte, versorgt.
Reinigung der NADP-GDH-Isoenzyme.
Zur Reinigung des Glutamatdehydrogenase-α-Isoenzyms wurden C. sorokiniana-Zellen unter anhaltender Belichtung in 29 mM-Ammoniummedium in einer 30 Liter fassenden Kammer aus Plexiglas gemäß Literaturangaben gezüchtet (A. L. Baker, R. R. Schmidt, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 74 (1963), S. 75-83). Zellen wurden bei 4,0 OD₆₄₀ durch Zentrifugation mit 30 000 U/min mit einer Sharples-Zentrifuge geerntet und zweimal in 10 mM Tris (pH-Wert 8,5, bei 4 °C) gewaschen. Pelletisierte Zellen (130 g) wurden bei –20 °C in 250 ml fassenden Zentrifugenflaschen bis zur Verwendung aufbewahrt. Die Reinigung von NADP-GDH wurde unter Anwendung eines modifizierten Verfahrens gemäß Yeung et al., a.a.O., erreicht. Die Verfahrensmodifikationen umfassten die Verwendung von Sephadex G-200-Gel (Pharmacia) anstelle des G-150-Gels in der Gelfiltrationssäule und die Zugabe von NADP⁺ als Stabilisator in einer Endkonzentration von 0,1 mM zum Gelfiltrationspuffer und zu allen folgenden Aufbewahrungspuffern. Als letzte Modifikation wurde die NADP⁺-Affinitätsharzstufe weggelassen und stattdessen wurde eine nicht-denaturierende präparative PAGE-Stufe durchgeführt (P. W. Miller, W. D. Dunn, R. R. Schmidt, BioRad US/EG Bulletin (1994), S. 1897).
Die GDH-Desaminierungs-Enzym-Testlösung bestand aus 44 mM Tris, 20,4 mM Glutamat und 1,02 mM NADP⁺, pH-Wert 8,8. Die Aminierungstestlösung bestand aus 50 mM Tris, 25 mM α-Ketoglutarat, 0,357 mM NADPH und 0,356 M (NH₄)₂SO₄, pH-Wert 7,4. 1 Einheit Enzymaktivität war die Menge an NADP-GDH, die zur Reduktion oder zur Oxidation von 1,0 μMol NADP⁺ oder NADPH pro Minute bei 38,5 °C erforderlich war.
Sephadex G-200-Säulenfraktionen mit NADP-GDH-Aktivität wurden vereinigt und durch Diaflow-Filtration eingeengt. Das lösliche Enzym (68 mg) wurde durch Zugabe von DTT in einer Endkonzentration von 10 mM gegen Oxidation geschützt und 30 Minuten gegen 28,8 mM Tris, 192 mM Glycin, 2 mM DTT (pH-Wert 8,4) dialysiert. Das Dialysat wurde durch 10-minütige Zentrifugation mit 20 000 g bei 4 °C geklärt und mit 3 ml 40 %-iger (Gew./Gew.) Saccharoselösung und 1 ml 0,02 % Bromphenolblau vereinigt.
Für die präparative, nicht-denaturierende PAGE wurden ein 3 cm hohes 7 % Acrylamid-Trenngel (Gew./Vol., 28 Acrylamid: 0,735 Bis-Acrylamid, pH-Wert 8,8) und ein 2 cm hohes 2 % Acrylamid-Stapelgel (Gew./Vol., 1,6 Acrylamid: 0,4 Bis-Acrylamid, pH-Wert 6,6) in das Gelrohr mit 28 mm Innendurchmesser der Modell 491-Prep Cell gegossen. Sämtliche Acrylamid-Materialien wurden mit AG501-X8 Mischbettharz vorbehandelt, um etwaige verunreinigende Acrylsäurereste zu entfernen und dadurch die in vitro-N-Acylierung von Proteinen während der Elektrophorese zu verhindern. Die Proteinprobe wurde 20 Minuten bei einem konstanten Strom von 15 mA und sodann 3,5 Stunden bei einem konstanten Strom von 30 mA der Elektrophorese unterzogen. 6 ml-Fraktionen wurden gesammelt und auf NADP-GDH-Desaminierungsaktivität getestet. GDH enthaltende Fraktionen wurden vereinigt. Das Enzym in den vereinigten Fraktionen in 10 mM KPO₄ (pH-Wert 6,2), 0,1 mM NADP⁺, wurde durch Diaflow-Ultrafiltration auf 1 mg/ml (bestimmt durch das Verfahren von Bradford unter Verwendung von BSA als Standard) eingeengt. Das eingeengte Enzympräparat wurde bei –20 °C aufbewahrt. Die Reinheit des Präparats wurde durch Silberfärbung zur Sichtbarmachung von Proteinen, die durch 10 % (Gew./Vol.) Tris-Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt worden waren, bestimmt (H. Schagger, G. von Jagow, Anal. Biochem., Bd 166 (1987), S. 368-379).
Das NADP-GDH-β-Isoenzym wurde aus einem Gemisch von Zellen gereinigt, die 240 Minuten in 1 mM Ammoniummedium (14 g), 90 Minuten in 1 mM Ammoniummedium (6 g) und 20, 40, 60 und 80 Minuten in 29 mM Ammoniummedium (1 g/Zeitpunkt) gemäß Bascomb und Schmidt, a.a.O., gezüchtet worden waren. Das NADP-GDH-β-Isoenzym wurde partiell unter Anwendung des im Maßstab verkleinerten, modifizierten Verfahrens von Yeung et al., a.a.O., gereinigt. Die DEAE-Sephacel-Ionenaustauschsäulen (pH-Wert 7,4 und pH-Wert 6) wurden auf ein Bettvolumen von 40 ml verkleinert und ein linearer KCl-Gradient von 400 ml (0 bis 0,4 M) wurde zur Elution der Proteine in Fraktionen von 3 ml verwendet. Die pH-Wert 6-DEAE-Ionenaustauschersäulen-Fraktionen mit einem Gehalt an NADP-GDH wurden zu zwei Pools vereinigt: entsprechend der vorderen und der hinteren Hälfte des NADP-GDH-Aktivitätspeaks. Die getrennt vereinigten Fraktionen wurden gegen 10 mM KPO₄ (pH-Wert 6,2), 2 mM DTT 16 Stunden dialysiert und der Affinitätsreinigung unter Verwendung von Typ 3-NADP⁺-Affinitätsgel (Pharmacia) gemäß Literaturangaben (Bascomb und Schmidt, a.a.O.) unterzogen. Die NADP-GDH in den vereinigten Fraktionen wurde durch Diaflow-Ultrafiltration auf 2 mg/ml Protein gemäß dem Verfahren von Bradford (M. M. Bradford, Anal. Biochem., Bd. 72 (1976), S. 248-254) eingeengt und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C aufbewahrt. Nach Auftrennung der Proteine durch 8 % (Gew./Vol.) Tris-Tricin-SDS-PAGE wurde die Reinheit des Präparats durch Silberfärbung bestimmt.
In Tabelle 1 sind die K_m-Werte, die für die α- und β-Homohexamer-Isoenzym-Aminierungsreaktion bestimmt wurden, zusammengestellt. Tabelle 1

* gemäß V. R. Shatilov, W. L. Kretovich, Mol. Cell Biochem., Bd. 15 (1977), S. 201-212.

In Tabelle 2 sind die K_m-Werte, die für die α- und β-Homohexamer-Isoenzym-Desaminierungsreaktion bestimmt wurden, zusammengestellt.
Tabelle 2
Aktivität des α-,β-Heterohexameren.
Die Aminierungs- und Desaminierungsaktivitäten des Gemisches von nativen NADP-GDH-Isoenzymen (Heterohexamere, zusammengesetzt aus verschiedenen Verhältnissen der α- und β-Untereinheiten) wurden ferner bei Sättigungskonzentrationen von Substraten während der gesamten 240-minütigen Induktionsperiode gemessen (1). Die Aminierungs- und Desaminierungsaktivitäten zeigten anfängliche Induktionsverzögerungen von 20 bzw. 40 Minuten. Die Aminierungsaktivität nahm während der ersten 100 Minuten rasch zu, fiel zwischen 100 und 140 Minuten scharf ab und stieg erneut zwischen 140 und 240 Minuten scharf an. Im Gegensatz dazu nahm die Desaminierungsaktivität während der gesamten Induktion nach der anfänglichen Induktionsverzögerung in fast linearer Weise zu.
Während der 240-minütigen Induktionsperiode in 29 mM Ammoniummedium wurden ferner die Muster der Anreicherung der Chlorella sorokiniana NADP-GDH- α- und β-Untereinheiten in Isoenzymen geprüft, wobei man sich eines Western-Blot-Immunonachweisverfahrens und einer anschließenden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bediente (vergl. 2). Die NADP-GDH-β-Untereinheit wurde bei T₀ nachgewiesen und nahm während der ersten 40 Minuten zu, wonach ein allmählicher Abfall während der restlichen Induktionsperiode folgte. Die α-Untereinheit wurde erstmals nach 20 Minuten nachgewiesen. Diese Untereinheit reicherte sich während der ersten 80 Minuten langsam an, zeigte eine ausgeprägte Zunahme zwischen 80 und 100 Minuten und reicherte sich anschließend für die restliche Induktionsperiode in linearer Weise mit einer langsameren Geschwindigkeit an. Der Übergang von der β-Untereinheit als überwiegende Spezies zur α-Untereinheit als überwiegender Spezies erfolgte zwischen 60 und 80 Minuten.
Das Aktivitätsverhältnis von Aminierung zu Desaminierung und das Verhältnis von α- und β-Untereinheit wurde berechnet, um festzustellen, ob Veränderungen im Untereinheitsverhältnis im Gemisch von NADP-GDH-Isoenzymen mit dem vorhergesagten Aktivitätsverhältnis der Aminierung zur Desaminierung im zeitlichen Verlauf der Induktionsperiode korrelierten (Tabelle 3). Überraschenderweise wurde das höchste Verhältnis von Aminierung zu Desaminierung nach 60 Minuten festgestellt, als das Untereinheitsverhältnis zeigte, dass die β-Untereinheit das überwiegende NADP-GDH-Antigen darstellte, während die α-Untereinheit die überwiegende Form darstellte, wenn das Aktivitätsverhältnis von Aminierung zu Desaminierung am niedrigsten war. Dieses letztgenannte Ergebnis war nicht vorhersehbar.
Vor dieser Entdeckung wurde aufgrund von Substrat-Kinetik-Untersuchungen an gereinigten α- und β-Homohexameren angenommen, dass das α-Homohexamere mit seiner sehr hohen Affinität für Ammonium (relativ zum β-Homohexameren) die Isoenzymform mit der höchsten Aminierungsaktivität (d. h. biosynthetische Kapazität für die Glutamat-Synthese) darstellt. Die Ergebnisse ließen darauf schließen, dass die einzelnen Untereinheiten in unabhängiger Weise in bezug auf ihre kinetischen Eigenschaften in Homo- und Heterohexameren wirken.
Ein Vergleich des Aktivierungsverhältnisses von Aminierung zu Desaminierung mit dem α:β-Untereinheitsverhältnis während der gesamten 240-minütigen Induktion in 29 mM Ammoniummedium ergab eine unerwartete Korrelation zwischen den Maxima in diesen Verhältnissen (Tabelle 3).
Tabelle 3 NADP-GDH-Aktivitätsverhältnis von Aminierung zu Desaminierung und Verhältnisse von α-Untereinheit zu β-Untereinheit während der Ammonium-Induktionsperiode in C. sorokiniana-Zellen
Der Peak im Verhältnis von Aminierung zu Desaminierung trat nach 60 Minuten auf, wobei zu diesem Zeitpunkt die β-Untereinheit das vorherrschende, jedoch nicht das ausschließliche Antigen darstellte, während die α-Untereinheit dann überwog, wenn das Verhältnis von Aminierung zu Desaminierung am niedrigsten war. Interessanterweise war die Aminierungsaktivität am höchsten, wenn beide Untereinheiten vorhanden waren, was darauf schließen lässt, dass das oder die durch Kombination der α- und β-Untereinheiten gebildeten Heterohexameren eine höhere Aminierungsaktivität als ein Homohexameres aufweisen können. Auf der Grundlage des wesentlich niedrigeren K_m-Werts des gereinigten α-Homohexameren im Vergleich zum β-Homohexameren in bezug auf Ammonium wurde früher vorausgesagt, dass das α-Homohexamere eine höhere Aminierungsaktivität als beliebige, aus zwei Untereinheiten zusammengesetzte Heterohexamere aufweisen sollten (Bascomb und Schmidt, 1987).
Beispiel 2 – Sequenzierung von Polypeptiden und Polynucleotiden Aminoterminale Sequenzierung der reifen Untereinheiten.
Ein Aliquotanteil eines Präparats einer gereinigten NADP-GDH-α-Untereinheit (120 pMol) und ein partiell gereinigtes Präparat einer NADP-GDH-α-Untereinheit (80 pMol) und einer β-Untereinheit (50 pmol) wurden mit 8 % (Gew./Vol.) Tris-Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt und einem Elektroblotting an einer PVDF-Membran (Immobilon-P^SQ, Millipore) gemäß den Angaben von Plaugh et al. (M. Plough, A. L. Jensen, V. Barkholt, Anal. Biochem. Bd. 181 (1989), S. 33-39) unterzogen. Um eine in vitro-Acylierung der aminoterminalen Reste des Proteins zu verhindern, wurden sämtliche bei der PAGE verwendeten Polyacrylamid-Lösungen mit AG501-X8-Mischbettharz behandelt, um verunreinigende Acrylsäure zu entfernen. Das Gasphasen-Sequenzierbett der Firma Applied Biosystems Inc., Modell 470 A wurde für die automatisierte Edman-Abbau-Aminosequenzanalyse herangezogen. Die PTH-Aminosäurederivate wurden durch RP-HPLC identifiziert. Die Proteinsequenzanalyse der dem Elektroblotting unterzogenen Proteine wurde vom Interdisciplinary Center for Biotechnology Research Protein Chemistry Core, der University of Florida, durchgeführt.
Die folgende N-terminale Sequenz wurde für die α-Untereinheit bestimmt: AVSLEEQISAMDATTGDFTA (SEQ ID NO. 5). Die folgende N-terminale Sequenz wurde für die β-Untereinheit bestimmt: DATTGDFTAL (SEQ ID NO. 6). Diese Sequenzen sind mit dem ORF, der in den beiden NADP-GDH-cDNAs identifiziert worden ist, identisch und geben die Positionen der internen Spaltungsstellen an, die zur Entfernung der Chloroplasten-Zielpeptidsequenzen verwendet wurden. Die Chloroplasten-Zielpeptidsequenzen (oder Chloroplasten-Transitpeptide) können für die Zellkompartiment-Lokalisierung mit diesen und anderen Aminosäuresequenzen geeignet sein. Die Polynucleotide, die für die Chloroplasten-Transitpeptide kodieren, können zusammen mit anderen Polynucleotidsequenzen zur Kodierung von Chloroplasten-Transitpeptiden verwendet werden.
cDNA-Isolierung und -Sequenzierung.
Ein Pellet von C. sorokiniana-Zellen, das bei –70 °C gelagert worden war, wurde in 1 bis 10 (Gew./Vol.) in RNA-Aufbrechpuffer resuspendiert: 0,1 M Tris (pH-Wert 8,5), 0,4 M LiCl, 10 mM EGTA, 5 mM EDTA, 100 Einheiten/ml Natriumheparin (Sigma, 100 Einheiten/mg) und 1 mM Aurintricarbonsäure (Sigma). Die Zellsuspension wurde 5 Minuten bei 4 °C mit 7000 g zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das Zellpellet wurde 1:10 (Gew./Vol.) in RNA-Aufbrechpuffer resuspendiert und durch Passage durch eine French-Druckzelle bei 20 000 psi aufgebrochen. Das Zellhomogenisat wurde in einem 50 ml fassenden konischen Einwegröhrchen mit einem Gehalt an dem 0,05-fachen Volumen 20 % (Gew./Vol.) SDS, dem 0,05-fachen Volumen 0,5 M EDTA (pH-Wert 8), 200 μg/ml Proteinase K gesammelt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ein halbes Volumen von mit TE-Puffer (Tris 10 mM: EDTA 1 mM, pH-Wert 8,0) äquilibriertem Phenol wurde zum Homogenisat gegeben und nach 3-minütiger Inkubation wurde ein halbes Volumen Chloroform:Isoamylalkohol (24:1, Vol./Vol.) zugegeben und 10 Minuten mit einem Schüttler mit "wrist"-Wirkung vermischt. Das extrahierte Homogenisat wurde in ein 30 ml fassendes, siliconisiertes Corex-Röhrchen übertragen und 10 Minuten bei 4 °C mit 1000 g zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde entfernt und wiederholt mit einem gleichen Volumen an Chloroform:Isoamylalkohol (24:1, Vol./Vol.), wie vorstehend beschrieben, extrahiert, bis die wässrige Grenzfläche klar war. Nach der letzten Extraktion wurde die wässrige Phase mit einem gleichen Volumen an 2 × LiCl-Harnstoffpuffer (4 M LiCl, 4 M Harnstoff, 2 mM EDTA, 1 mM Aurintricarbonsäure; Sigma) vereinigt und die RNA wurde auf Eis 16 Stunden bei 4 °C ausgefällt. Der RNA-Niederschlag wurde 20 Minuten bei 4 °C mit 4000 g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde einmal mit 1 × LiCl-Harnstoffpuffer gespült und erneut zur Pelletisierung der RNA zentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde in TE (pH-Wert 7,5) in Lösung gebracht und ein Aliquotanteil wurde spektrophotometrisch bei 260 nm quantitativ bestimmt. Nach der quantitativen Bestimmung wurde die mRNA-Fraktion aus der gesamten zellulären RNA unter Verwendung eines oligo(dT)-Schleudersäulen-Kits isoliert. Poly(A)⁺-RNA (50 μg) aus jedem Präparat wurde vereinigt und für die gewerbliche Herstellung einer maßgeschneiderten λUni-ZAP XR-C. sorokiniana-cDNA-Bibliothek (Stratagene Cloning Systems, Palo Alto, CA) verwendet.
Die amplifizierte λ-ZAP-Bibliothek mit einem Gehalt an 2 × 10¹⁰ pfu/ml wurde auf 20 150 mm-Petri-Schalen mit 50000 pfu pro Platte für insgesamt 1 × 10⁶ abgesuchte pfu ausgestrichen. Die Phagen-Plaques wurden an doppelte Hybond-N-132 mm-Kreismembranen absorbiert und gemäß dem Plaque-Blotting-Verfahren von Amersham behandelt (Amersham International plc, Arlington Heights, IL, 1985). Die Membranen wurden in einem üblichen Behälter in 200 ml 2 × PIPES (0,8 M NaCl, 20 mM PIPES, pH-Wert 6,5), 50 % (Gew./Vol.) Formamid, 0,5 % (Gew./Vol.) SDS, 100 μg/ml denaturierte, einer Scherbehandlulng unterworfene Lachssperma-DNA bei 40 °C vorhybridisiert. Blockierte Membranen wurden bei 42 °C in 10 heißsiegelbaren Beuteln (vier Membranen/Beutel) in Vorhybridisierungspuffer mit einem Gehalt an 1 × 10⁶ cpm/Membran in einer ³²P-markierten NADP-GDH-242 bp-HCR-cDNA-Sonde auf einem Laboratoriumsschwenkgerät hybridisiert. Die Membranen wurden dreimal in 200 ml 0,1 × SSC, 0,1 % (Gew./Vol.) SDS 20 Minuten pro Waschvorgang bei 50 °C gewaschen. Doppelte Membranen wurden in Kunststoff eingewickelt und 28 Stunden bei –70 °C auf einen Kodak X-Omat-AR-Film gelegt. Mutmaßliche NADP-GDH-cDNA-Plaques, die auf doppelten Membranen nachgewiesen worden waren, wurden auf der Platte ausgebohrt und einer Plaquereinigung durch sekundäre und tertiäre Screeningvorgänge mit der 242 bp-Konservierungsregion-Sonde unterzogen. Mutmaßliche NADP-GDH-cDNA-Phagenklone, die beim primären Screening selektiert worden waren, wurden vereinigt und ein zweites Mal einem Screening mit einem ³²P-markierten 130 bp-Eco RI/Bgl II-cDNA-Fragment, das vom 5'-Terminus des vollständigsten 5'-NADP-GDH-cDNA-Klon isoliert worden war, unterzogen. 10 plaquegereinigte NADP-GDH-Klone wurden in pBluescript KS⁺ (Stratagene) subkloniert und über ein in vivo-Exzisionsverfahren der Firma Stratagene in E. coli DH5α F' (Bethesda Research Laboratories, BRL) transformiert. Sämtliche Plasmidisolierungen wurden gemäß den Angaben von Kraft et al. durchgeführt (R. Kraft, J. Tardiff, K. S. Krauter, L. A. Leinwand, Biotechniques, Bd. 6 (1988), S. 544-547). Eine Sequenzanalyse ergab, dass sämtliche 10 Klone an ihren 3'-Termini identisch waren und sich durch verschiedene Grade der Verkürzung an ihren 5'-Termini unterschieden. Der längste cDNA-Klon mit einem vollständigen 3'-Terminus mit der Bezeichnung pBGDc53 (SEQ ID NO. 7) wies keine ausreichende Länge auf, um für eine der Untereinheiten zu kodieren; daher wurden die 5'-terminalen Sequenzen durch RACE-PCR bestimmt.
Die 5'-terminalen NADP-GDH-cDNA-Sequenzen wurden unter Anwendung eines modifizierten Anker-PCR-Verfahrens für die rasche Amplifikation von cDNA-Enden kloniert (M. A. Frohman, in D. H. Gelford, J. J. Snincky, T. J. White, Herausg., PCR Protocols, Academic Press, San Diego, CA, (1990) S. 28-38; R. Jain, R. N. Gorner, J. J. Murtagh, Biotechniques, Bd. 12 (1992), S. 58-59). Ein Gemisch von Poly(A)⁺-RNA, das bei der Synthese der λ-ZAP-Bibliothek verwendet wurde, wurde zur Klonierung des 5'-Endes der NADP-GDH-mRNA eingesetzt. 100 ng des mRNA-Gemisches wurden mit 10 ng eines genspezifischen Primers (5'-CTCAAAGGCAAGGAACTTCATG-3', SEQ ID NO. 8), der zur Hybridisierung der konservierten Region von NADP-GDH-mRNAs konstruiert worden war, vereinigt, 5 Minuten erwärmt und sodann auf Eis gekühlt. Eine Erststrang-DNA-Synthese wurde unter Verwendung von Superskript^®-reverser Transkriptase (BRL) gemäß dem vom Lieferanten angegebenen Verfahren durchgeführt. Das Reaktionsgemisch nach Beendigung der reversen Transkription wurde mit 1 Einheit Ribonuclease H 20 Minuten bei 37 °C und 5 Minuten bei 95 °C behandelt und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1, Vol./Vol.) extrahiert. Überschüssige Primer und dNTPs wurden durch Zentrifugation mit 2000 U/min unter Verwendung eines Ultrafree-MC-Filterzentrifugen-Röhrchens (Trenngrenze 30000 MG Millipore) entfernt und das Retentat wurde mit einem Savant-Speedvac-Gerät auf 10 μl eingeengt. Die Produkte der Erststrangsynthese wurden mit 10 μl Tailing-Gemisch (1X Tailing-Puffer (Promega Corp.), 0,4 mM dATP, 10 Einheiten terminale Desoxytransferase) vereinigt und 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Sodann wurde das Reaktionsgemisch 5 Minuten auf 95 °C erwärmt, mit TE (pH-Wert 8) auf 0,5 ml verdünnt und als cDNA-Pool verwendet. Ein Gemisch aus 5 μl des cDNA-Pools, 5 μl Vent^®-Polymerase-10X-Puffer (New England Biolabs), 200 μM der einzelnen dNTPs, 25 pMol eines genspezifischen Primers (SEQ ID NO. 8), 5 pMol poly(dT)-Adapterprimer (5'-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)₁₈-3'; SEQ ID NO. 9), 0,2 Einheiten Perfectmatch^®-DNA-Polymerase-Verstärker (Stratagene) und 1 Einheit Vent^®-Polymerase (NEB) in 50 μl wurden gemäß den Angaben von Jain et al., a.a.O., amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden durch Zentrifugation durch eine Ultrafree-MC-Anlage mit 2000 U/min gereinigt. Das Retentat wurde gewonnen und 2 weiteren Amplifikationsrunden unter Verwendung eines neuen genspezifischen "nested"-Primerpakets bei jeder Stufe (5'-GGACGAGTACTGCACGC-3', SEQ ID NO. 10; bzw. 5'-GATCTCGGTCAGCAGCTG-3', SEQ ID NO. 11) und eines Adapterprimers (5'-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3'; SEQ ID NO. 12) unterworfen. PCR-Amplifikationen wurden in einem Thermocyclermodell 480 (Perkin- Elmer Cetus) durchgeführt und sämtliche maßgeschneiderten Oligonucleotide wurden von der ICBR-DNA-Syntheseeinrichtung, University of Florida, synthetisiert. Das standardmäßige PCR-Reaktionsgemisch bestand aus 10 μl 10 × Vent^®-Polymerase-Puffer, 100 μM der einzelnen dNTPs, 0,4 Einheiten Perfektmatch^®, 50 pMol der einzelnen Primer, 1 Einheit Vent^®-DNA-Polymerase in einem Reaktionsvolumen von 100 μl. Die 5'-RACE-PCR-Produkte wurden der Gelreinigung unterzogen, in die SmaI-Stelle von pUC18 subkloniert und zur weiteren Charakterisierung in E. coli-DH5α transformiert. Durch RACE-PCR wurden zwei 5'-cDNA-Klone identifiziert, die sich mit dem früher identifizierten pBGDc-53-Klon überlappten, der sich durch ein 42 nt-Insert, das in einem Klon mit der Bezeichnung pRGDc 60 (SEQ ID NO. 13) identifiziert worden war und das in der zweiten cDNA mit der Bezeichnung pRGDc 61 (SEQ ID NO. 14) fehlte, unterschied.
Zwei weitere cDNA-Klone, denen der RACE-PCR-Polylinker fehlte, die aber die vollständigen 5'-Termini, entsprechend pRGDc 60 und 61, aufwiesen, wurden durch RT-PCR-Amplifikation aus mRNA unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Reaktionsbedingungen und des genspezifischen Primerpaars (5'-CTTTCTGCTCGCCCTCTC-3', SEQ ID NO. 15 und SEQ ID NO. 11, wie oben) konstruiert. Die beiden PCR-Produkte wurden in die SmaI-Stelle von pBluescript SK⁺ (Stratagene) kloniert und zur weiteren Charakterisierung in E. coli-DH5α transformiert. Der cDNA-Klon, der das 42 nt-Insert aufwies, erhielt die Bezeichnung pGDc 63 (SEQ ID NO. 16), während die cDNA ohne das Insert die Bezeichnung pGDc 64 (SEQ ID NO. 17) erhielt.
NADP-GDH-cDNAs von voller Länge wurden durch Restriktionsendonuclease-Behandlung von pGDc 63 und 64 mit EcoRI/ApaLI und durch Gelreinigung der erhaltenen Fragmente (264 bzw. 222 bp) konstruiert. Die gelgereinigten Fragmente wurden mit einem gereinigten ApaLI/XhoI-Restriktionsfragment von pBGDc53 verknüpft und die Ligationsprodukte von voller Länge (SEQ ID NO. 18; SEQ ID NO. 19) wurden der Gelreinigung an Agarosegel unterworfen und in den folgenden PCR-Reaktionen eingesetzt.
Expression von α- und β-Homohexameren in E. coli.
Unter Verwendung des gelgereinigten Produkts (SEQ ID NO. 18) wurde eine PCR-Mutagenese durchgeführt, um das Chloroplasten-Zielsignal von der cDNA von voller Länge zu entfernen und cDNAs zu erhalten, die spezifisch für die reifen α- und β-Untereinheiten kodieren. Zwei Sätze von Primerpaaren wurden konstruiert, um α- und β-GDH-Untereinheiten-Gene zu synthetisieren.
Der folgende Primer wurde konstruiert, um Methionin an den Aminoterminus der prozessierten, reifen α-NADP-GDH-Untereinheit (Alanin-41) zu addieren, um eine Translationsinitiation zu ermöglichen und eine 5'-NdeI-Stelle für Subklonierungszwecke zu erzeugen: 5'-CATATGGCCGTCTCGCTGGAGGAG-3' (SEQ ID NO. 20). Der folgende zweite Primer wurde konstruiert, um eine Hybridisierung mit dem 3'-Terminus der Matrizen-DNA in einer Position im Abstand von 20 nt in 3'-Richtung vom endogenen TAA-TerminationsCodon vorzunehmen: 5'-GTTGGATTGCCGGTGAGCC-3' (SEQ ID NO. 21).
Der folgende Primer wurde konstruiert, um ein Methionin an den Aminoterminus der prozessierten, reifen β-Untereinheit (Aspartat-38) zu addieren, um eine Translationsinitiation zu ermöglichen und eine 5'-NdeI-Stelle für Subklonierungszwecke zu erzeugen: 5'-CATATGGACGCCACCACCGGC-3' (SEQ ID NO. 22). Beim zweiten 3'-Primer, der bei der PCR-Amplifikation verwendet wurde, handelte es sich um den 3'-Terminusprimer (SEQ ID NO. 21), der für die Amplifikation der α-Untereinheit beschrieben worden ist.
Folgende PCR-Cyclisierungsbedingungen wurden eingehalten: 95 °C, 50 Sekunden; 64 °C, 1 Minute; 72 °C, 1 Minute und 35 Sekunden (30 Zyklen). Die Konzentrationen von Primer, dNTP, Vent-Polymerase und der übrigen Reaktionskomponenten entsprachen den vorstehenden Angaben. Die PCR-Produkte des 1506 bp-α-NADP-GDH-Untereinheit-Gens (SEQ ID NO. 23) und des 1473 bp-β-GDH-Untereinheit-Gens (SEQ ID NO. 25) wurden der Gelreinigung unterzogen und erhielten einen 3'-Adenin-Nucleotid-Überhang durch 15-minütiges Inkubieren des gereinigten Fragments bei 72 °C mit 100 μM dATP und Taq-Polymerase. Die modifizierten PCR-Produkte wurden in den PCRII-T/A-Klonierungsvektor (Invitrogen) kloniert und in kompetente E. coli-Zellen transformiert. Klone mit den Inserts wurden durch Blau-Weiß-Screening selektiert, einer Plasmidreinigung unterzogen und mit NdeI/BamHI verdaut, um eine Selektion auf die richtige Orientierung im Klonierungsvektor vorzunehmen. Die selektierten Plasmide wurden einer Restriktion mit NdeI und BamHI (vom Vektor bereitgestellte BamHI-Stelle) unterzogen und direktional unter der Kontrolle des IPTG-induzierbaren T7-Polymerase-Promotors der pET 11a- und pET 15b-Bakterien-Expressionsvektoren (Novagen), die mit NdeI/BamHI linearisiert waren, kloniert und in DH5α transformiert. Transformanten wurden durch NdeI/BamHI-Restriktionsanalyse einem Screening unterzogen und Klone, die die in geeigneter Weise orientierten α- und β-Untereinheiten-cDNAs (SEQ ID NO. 23; SEQ ID NO. 25) enthielten, wurden selektiert, einer Plasmidreinigung unterzogen und für Protein-Expressionszwecke in E. coli BL21(DE3) transformiert.
E. coli-BL21(DE3)-Zellen, die mit pET-11a-α-cDNA- und pET-11a-β-cDNA-Konstrukten transformiert worden waren, wurden 1 Stunde mit 100 mM IPTG induziert. Proteinextrakte aus den induzierten Zellen wurden durch Enzymanalyse auf NADP-GDH-Aktivität getestet und die denaturierten Proteine wurden durch SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht. Die Proteine, die durch die reife α-Untereinheit-cDNA (SEQ ID NO. 23) und die β-Untereinheit-cDNA (SEQ ID NO. 25) exprimiert wurden, weisen die in SEQ ID NO. 24 (α-Untereinheit) und SEQ ID NO. 26 (β-Untereinheit) dargestellten Aminosäuresequenzen auf. Die rekombinanten GDH-Untereinheiten wurden durch Kreuzreaktivität mit Kaninchen-anti-Chlorella-NADP-GDH-Antikörpern verifiziert.
Unter Bedingungen, die nicht für eine maximale Induktion optimiert waren, zeigten E. coli-Zellen, die die α- und β-GDH-cDNAs aufwiesen und mit IPTG induziert worden waren, eine 60- bzw. 7000-fache Zunahme der NADP-GDH-Aktivität relativ zu nicht-induzierten Kontrollen. Die rekombinanten α- und β-NADP-GDHs werden derzeit analysiert, um ihre kinetischen und biochemischen Eigenschaften zu verifizieren.
Die Überexpression und der Zusammenbau der C. sorokiniana-Chloroplasten-GDHs zu aktiven Enzymen liefern den Beweis, dass die über PCR bearbeiteten DNA-Konstrukte zu authentischen Proteinen transkribiert und translatiert werden. Die vorerwähnten Konstrukte wurden sodann für die Cytosol-Expression der Algen-GDHs in transgenen Pflanzen verwendet.
Transformation von Pflanzen.
Ein Verfahren zur Erzeugung von genetisch transformierten Pflanzen, die erhöhte Konzentrationen einer spezifischen GDH exprimieren, erfordert die Einführung eines doppelsträngigen, rekombinanten DNA-Moleküls in das nukleare Genom einer Pflanzenzelle. Das DNA-Molekül muss folgende Eigenschaften besitzen: (1) Es muss eine strukturelle DNA für das GDH-Enzym, die in die Pflanzenzelle eingeführt wird, enthalten; (2) es muss einen Promotor aufweisen, der in Pflanzen eine Regulation der Erzeugung einer RNA-Sequenz in konstitutiver oder gewebespezifischer Weise durch RNA-Polymerase-Enzym bewirkt; und (3) es muss eine 3'-untranslatierte Region aufweisen, die bewirkt, dass eine transkriptionelle Termination und die Addition von polyadenylierten Nucleotiden am 3'-Ende der RNA verursacht wird. Das erhaltene primäre RNA-Molekül wird anschließend im Kern prozessiert, ein Verfahren, das die Entfernung von Intron-Sequenzen und die Addition von Polyadenylat-nucleotiden an das 3'-Ende der mRNA beinhaltet.
Bei Promotoren, die erfindungsgemäß geeignet sind, handelt es sich um solche, die die Transkription in konstitutiver Weise oder in gewebespezifischer Weise an der Stelle, wo eine Erzeugung oder ein Katabolismus von Glutamat erwünscht ist, initiieren können. Ein Beispiel für einen geeigneten konstitutiven Promotor ist der CaMV-verstärkte 35S-Promotor, der die Synthese von RNA in gewebeunabhängiger Weise dirigiert. Promotoren, die die Erzeugung von GDH spezifisch in Samen, Stängeln, Wurzeln, Blättern oder spezifischen Zelltypen in diesen Geweben hervorrufen, sind erfindungsgemäß geeignet. Beispielsweise handelt es sich beim samenspezifischen Phaseolin-Promotor um einen derartigen gewebespezifischen Promotor. Somit lassen sich native Promotoren für Mais, Weizen, Gerste und Reis erhalten und erfindungsgemäß verwenden, ebenso heterologe Promotoren aus anderen Organismen, von denen gezeigt worden ist, dass sie in konstitutiver/gewebespezifischer Weise wirken.
Introns.
Im allgemeinen wird eine optimale Expression in einkeimblättrigen Pflanzen erreicht, wenn eine Intronsequenz zwischen die Promotorsequenz und die Strukturgensequenz eingeführt wird. Ein Beispiel für eine derartige Intronsequenz ist das in WO-93/19189 beschriebene HSP 70-Intron.
Polyadenylierungssignal.
Die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte können eine 3'-untranslatierte Region besitzen, die in Pflanzen bewirkt, dass die Addition von Polyadenylat-Nucleotiden zum 3'-Ende der RNA dirigiert wird. Ein Beispiel für eine geeignete 3'-untranslatierte Region ist das Polyadenylierungssignal des Agrobacterium-Tumor-Induktionsplasmids, d. h. das Nopalin-synthetase (NOS)-Gen.
Plastid-Zielsequenz.
Die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte können optional eine Plastid-Zielsequenz enthalten. Die Plastid-Zielsequenz dirigiert den Import des Proteins in das Plastid und wird während des Importvorgangs entfernt. Bei der Plastid-Zielsequenz kann es sich (ohne Beschränkung hierauf) um das native Chloroplasten-Zielspeptid (CTP) handeln, das in C. sorokineana-NADP-GDH-cDNAs von voller Länge, die die Vorläuferproteine kodieren, identifiziert wird. Eine Fusion einer gewählten Plastid-Zielsequenz der reifen α- und β-NADP-GDH-Untereinheitsequenzen kann nach üblichen Verfahren vorgenommen und erfindungsgemäß eingesetzt werden. GDH-Untereinheiten, denen diese Zielsequenzen fehlen, finden sich typischerweise im Zytoplasma der Zelle. Ein derartiges, im Zytosol lokalisiertes Enzym kann sich zum Abfangen von Ammonium oder Glutamat, das im Zytosol der Zelle kompartimentalisiert ist, eignen.
GDH-Genquellen.
Bei dem in den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten verwendeten GDH-Gen kann es sich um ein beliebiges GDH-Gen handeln. Es ist nicht auf die vorstehend beschriebenen C. sorokineana-GDH-Gene beschränkt, obgleich diese bevorzugt sind. Beispielsweise kann ein GDH-Gen aus Bakterien oder Pilzen verwendet werden. Die vorgelegten Beispiele verwenden die α- und β-GDH-Gene von C. sorokineana, was aber in keiner Weise als eine Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung zu interpretieren ist. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass verschiedene andere Gene, sowie Abänderungen an den hier beschriebenen Genen und Verfahren herangezogen werden können, ohne vom Geist und vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können eine Mutagenese und ein routinemäßiges Screening unter Anwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren herangezogen werden, um mutante Varianten zu erzeugen, denen die Regulation durch den Cofaktor NADPH fehlt.
Vorübergehende Expression in Mais-Protoplasten.
Um die Expression der C. sorokiniana-GDH-Untereinheiten und ihren Zusammenbau zu aktiven Enzymen in Zea mais-Zellen zu testen, wurden Vektoren konstruiert, die den CaMV E35S-Promotor, die Kodierungssequenz für die reife α-Untereinheit (pMON21904) oder β-Untereinheit (pMON21905), die NOS-3'-untranslatierte Polyadenylierungsregion und die Kanamycin-Resistenz für die Selektion in E. coli enthalten. Die α- und β-Untereinheit-Gene wurden als XbaI-EcoRI-Fragment aus pET-11a-α-cDNA bzw. pET-11a-β-cDNA isoliert. Die GDH-Gene wurden in die den XbaI-EcoRI-E35S-Promotor, NOS-3' und die Kanamycin-Resistenz tragende Region von pMON22072 unter Bildung von pMON21904 und pMON21905 ligiert. Die DNA-Konstruke wurden der Elektroporation in Mais- und Weizen-Protoplasten gemäß dem Verfahren von Sheen et al. (The Plant Cell, Bd. 3, S. 225-245) unterzogen.
Analyse von transformierten Mais-Protoplasten.
Pelletisierte Protoplastenproben, die mit pMON21904 (α-Untereinheit), pMON21905 (β-Untereinheit), pMON21709 (Kanamycin-negative Kontroll-DNA) und ohne DNA transformiert worden waren, wurden in 0,2 ml GDH-Zellaufbrechpuffer (Yeung et al., a.a.O.) auf Eis aufgetaut. Die Zellen in jeder Suspension wurden zweimal 30 Sekunden homogenisiert, auf Eis gekühlt und 10 Minuten mit 14000 U/min geklärt. Zellextrakte wurden bei 38,5 °C gemäß Yeung et al., a.a.O., in der Desaminierungsrichtung getestet. Der gesamte Proteingehalt der Zellextrakte wurde unter Anwendung des BioRad-Mikroproteintests gemäß den Angaben des Herstellers bestimmt. Die Aktivitäten wurden gegen den gesamten Proteingehalt zum Vergleich unter den verschiedenen Präparaten normiert. 1 Einheit GDH-Aktivität ist als die Enzymmenge definiert, die erforderlich ist, um pro Minute bei 38,5 °C 1 μMol NADP zu reduzieren.
Mit dem Kontrollvektor pMON21709 (n=3) transformierte Protoplasten oder nicht transformierte Protoplasten (n=3) wiesen keine nachweisbare NADP-GDH-Aktivität auf. Mit pMON21904 (n=3) transformierte Protoplasten exprimierten 3,31 Einheiten/mg Protein GDH-Aktivität, während mit pMON21905 transformierte Protoplasten (n=3) 1,96 Einheiten/mg Protein exprimierten.
Der hohe Aktivitätsgrad, der bei den Protoplasten beobachtet wurde, die mit den zytoplasmatisch exprimierten C. sorokineana α- und β-NADP-GDH-Genen transformiert worden sind, liefert den Beweis, dass die GDH-Untereinheiten in heterologen Pflanzensystemen exprimiert werden. Zusätzlich belegen die Expressionsgrade, dass die Untereinheiten zu aktiven Enzymen zusammengesetzt werden. Im allgemeinen ist es für den Fachmann leicht ersichtlich, dass überflüssige Sequenzen, die zu den beschriebenen Sequenzen addiert sind, oder Fragmente der hier beschriebenen Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen, die zu Polynucleotiden oder Aminosäuresequenzen führen, die in ähnlicher oder gleichwertiger Weise wie die hier ausdrücklich beschriebenen Sequenzen wirken, als Teil der Erfindung anzusehen sind. Sie lassen sich leicht und routinemäßig nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren herstellen, z. B. durch zeitgesteuerten Bal31-Exonuclease-Verdau der DNA von voller Länge, gefolgt von einer Expression der erhaltenen Fragmente und einem routinemäßigen Screening der Expressionsprodukte, wie es im vorstehenden Beispiel beschrieben wurde. Ferner ist es für den Fachmann leicht ersichtlich, dass die Funktion, die Eigenschaften oder die Eignung der beschriebenen Sequenzen durch Insertion von Mutationen dieser Sequenzen durch übliche Techniken und Verfahren unwirksam gemacht werden können. Diese Mutationen, die infolgedessen in wirksamer Weise zur Beseitigung der Eigenschaften oder Funktionsweise, die den hier beschriebenen Sequenzen innewohnen, verwendet werden können, werden hierbei ausdrücklich als Teil der Erfindung angesehen. Beispielsweise besteht ein klarer Unterschied zwischen den α- und β-Untereinheiten von C. sorokineana in der Polypeptidsequenz mit 11 Aminosäuren am N-Terminus der α-Untereinheit, die in der β-Untereinheit aber fehlt. Diese Sequenz kann die Affinität, die Spezifität und die Modulation von Ammoniumverbindungen durch das Enzym beeinflussen. Daher ist es ersichtlich, dass eine Insertion (falls abwesend) oder eine Entfernung (falls vorhanden) der geeigneten Sequenz oder eines funktionellen Äquivalents davon mit dem Ziel, einen Unterschied in bestimmten Eigenschaften von anderen GDH-Genen oder deren Produkten herbeizuführen, vom Fachmann leicht vorgenommen werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 26 ausgewählt ist, oder für ein Fragment davon mit Glutamat-dehydrogenase (GDH)-Aktivität kodiert.
Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 25 ausgewählt ist, oder ein Fragment davon, das für ein Peptid mit GDH-Aktivität kodiert.
Polynucleotid nach Anspruch 2, umfassend eine Nucleotidsequenz, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 25 ausgewählt ist, oder ein Fragment davon, das für ein Peptid mit GDH-Aktivität kodiert.
Polynucleotid nach Anspruch 2, das ein chimäres Gen bildet, das zur Expression in Pflanzenzellen befähigt ist, wobei das Polynucleotid funktionell mit einem exprimierbaren Pflanzen-Promotor und einer Pflanzen-Polyadenylierungssequenz verknüpft ist.
Polynucleotid nach Anspruch 2, umfassend mindestens eine Nucleotidsequenz, die für eine NADP-GDH-alpha-Untereinheit kodiert, und mindestens eine Nucleotidsequenz, die für eine NADP-GDH-beta-Untereinheit kodiert.
Polynucleotid nach Anspruch 5, wobei das Polynucleotid ferner einen Promotor für das Polynucleotid, das für eine NADP-GDH-alpha-Untereinheit und eine NADP-GDH-beta-Untereinheit kodiert, umfasst.
Polynucleotid nach Anspruch 6, das verschiedene Promotoren für die alpha-Untereinheit und die beta-Untereinheit umfasst.
Polynucleotid nach Anspruch 6, wobei der Promotor eine unterschiedliche Aktivität für die alpha- und beta-Untereinheiten aufweist.
Polynucleotid nach Anspruch 5, umfassend eine Nucleotidsequenz, die aus SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 23 ausgewählt ist, und eine Nucleotidsequenz, die aus SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 25 ausgewählt ist.
Transformierte Wirtszelle, umfassend ein Polynucleotid nach Anspruch 1.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 10, wobei das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 25 ausgewählt ist, umfasst.
Verfahren zum Modulieren des Stickstoff-Stoffwechsels in einer Pflanzenzelle, umfassend das Transformieren der Pflanzenzelle in der Weise, dass sie ein Polynucleotid nach Anspruch 1 umfasst, und das Halten der Zelle oder von Abkömmlingen davon unter Bedingungen, bei denen das Polypeptid exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die für mindestens eine NADP-GDH-alpha-Untereinheit kodiert, und mindestens eine Nucleotidsequenz, die für eine NADP-GDH-beta-Untereinheit kodiert, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Polynucleotid für ein Polypeptid kodiert, das für eine Aminosäuresequenz, die aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 24 ausgewählt ist, und für eine Aminosäuresequenz, die aus SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 26 ausgewählt ist, kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei das Polynucleotid funktionell mit einem exprimierbaren Pflanzen-Promotor und einer Pflanzen-Polyadenylierungssequenz verknüpft ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die Assimilation von anorganischem Stickstoff zu organischem Stickstoff verstärkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei die Ernteausbeute erhöht wird oder die Ammonium-Assimilation, die osmotische Stresstoleranz oder die Zusammensetzung der Pflanze verändert werden.
Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 26 ausgewählt ist, oder ein Fragment davon mit GDH-Aktivität.
Polypeptid, umfassend mindestens eine NADP-GDH-alpha-Untereinheit, die eine Aminosäuresequenz, die aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 24 ausgewählt ist, oder ein Fragment davon mit GDH-Aktivität und mindestens eine NADP-GDH-beta-Untereinheit umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 19, wobei die beta-Untereinheit eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 26 ausgewählt ist.