SU958502A1 - Способ выделени никотинамидадениндинуклеотид-глутаматдегидрогеназы из хлореллы - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ХЛОРЕЛЛЫ

1

Изобретение относитс  к биохимии, а именно к способам ферментов из-растительного сырь , и может быть использовано дл  научных целей и в ферментной промышленности .

Известен способ выделени  йикотишмидаденкндинуклеотидглутаматдегндрогеназы (НАД(Ф)-ГДГ) из термофильного штамма хлореллы - Cftlorella 0yrenoidosa 82Т путем разрушени  клеток в фосфатном буфере на Q дезинтеграторе, ультрацентрифугировани  с отбрасьтанием . осадка, удалени  балластных веществ обработкой надосадочной жидкости стрептомицинсульфатом с поспедующим концентрированием ферментсодержащего раствора высаливанием сульфатом аммони  до 52-60% степени насыщени  и обессоливанием на Сефадексе, ионообменной хроматографии на дизтиламиноэтилцеллюлоэе с злюцией фосфатным буфером рН 7,0-7,4 с последующей гель-фильтрацией го полученного элюата на Сефадексе G--200, сорбцией на геле фосфата кальци  и высаливани  сульфатом аммони . Через 1,5-2 недели с момента разрутиени  клеток в результате высаливани  выпадает мелкодисперсный осадок, где сосредоточена вс  активность НАД (Ф) - ГДГ t и J 2}.

Однако известный способ  вл етс  длительным и при его осуществлении получают небольшой выход фермента (29%), обладающего недостаточной активностью (230-250 Ед) и чистотой (степень очистки 740).

Цель изобретени  - ускорение процесса, цовышение выхода и качества целевого продукта.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу выделени  НАД(Ф)-ГДГ из хлореллы путем разрушени  клеток в фосфатном буфере, выделени  бесклеточного экстракта , осаждени  из него балластных веществ и удалени  осадка центрифугированием с последующим концентрированием супернатзнта осаждением сернокислым аммонием до 5б-52% степени насыщени  и обессоливанием на Сефадексе , хроматографии ферментсодержащей фракщш на полисахаридном сорбенте с. злюцией фосфатным буфером рН 7,0-7,4, содержащим NaCI, и фракционировани  ее на геле фосфата кальци , осаждение балластных веществ провоп т нагреванием бесклеточного экстракта в 3958 течение 5-10 мин при 60-65°С, в полученный супернатант добавл ют MnClj до конечной концентрации его в супернатанте 0,015-0,030 М с последующим элюированием фермента с образовавшегос  осадка буфером, причем фракционирование на геле фосфата кальци  провод т после обработки, сульфатом аммони  и обессоливани  с последующей двукратной хроматографией элюата с использованием в качестве полисахаридного сорбента аминогексил-Сефарозь и злюцией фермента линейным градиентом NaCl в пределах 0-0,10 М. В предлагаемом способе по сравнению с прототипом сокращаетс  врем  выделени  фермента с 20 до дней, увеличиваетс  выход целевого продукта, а также повышаетс  активность выделенного фермента в 2 раза. Пример. 250 г влажной клетовдой пасты термофильного хлореллы суспен днруют в равном объеме 0,07 М фосфатного буфера рН 7,4, .содержащего мМ меркаптоэтанол . Разрушение суспензии клеток осуществл ют в гомогенизаторе Л-17 типа планетарна  мельница 12. После разрущени  клеток гомогенат разбавп ют исходным буфером и центрифугируют сначала при 6000 хд, а затем при 30000 хд в течение 30 мин. В результате полутают 770 мл бесклеточного экстракта, который прогревают 5 мин при 60-65° С и осадок денатурированных белков удал ют центрифугированием. К охлажденной до 15° С надесадрЧйой жигасост при интенсивном перемещивании добазл ют по капл м 1 М МпСЬ (из расчета 3 мл 1 М МпСЬ на 100 мл бесклеточного экстракта). В этих услови х в течение 30 мин образуетс 

Исходный экстракт

Нагревание 5 мин при 60 - 65°С

Обработка MnCIi

Фракционирование на геле фосфата кальци 

« Хроматографи  на

АГ-Сефарозе 4 В

Рехроматографи  на АГ-Сефарозе 4 В

100

0,46

86

2,8

1.32 126

73

58,7

44 39

820

382

956 440

1097

Claims (2)

1. 37 510 осадок фосфата марганца и происходит адсорбци  на нем НАД(Ф)-ГДГ. Образовавшийс  осадок собирают центрифугированием при 8000 хд в течение мин. Элюцию фермента с осадка осуществл ют 0,20 М фосфатным буфером рН 7,4 два раза порци ми по 160 мл. Объединенный элюат концентрируют высаливанием сернокислым аммонием до 52% насыщени  с последующим обессоливанием на колонке с Сефадексом G-25. К 60 мл сконцентрированной и обессоленной фракции добавл ют гель фосфата кальци  (из расчета 2 мг гел  на 1 мг белка). Осадок отдел ют центрифугированием, а фермент элюируют с гел  0,20 М фосфатным буфером рН 7,4. Активную фракцию концентрируют высаливанием сернокислым аммонием до 52% насьццени  с последующим обессоливанием на. колонке с Сефадексом G-25. Обессоленную фракцию помещают на колонку с АГ-Сефарозой 4 В,уравновешенную старто-; вым 0,005 М фосфатным буфером рН 7,0. Элюцию фермента с колонки осуществл ют линейнъпи градиентом NaCI 0-0,10 М в стартовом буфере. Активный элюат концентрируют путем ультрафильтрации , через мембрану Амикон ХМ-50 и подвергают рёхроматографии на колонке с АГ-Сефарозой 4 В. В результате получают гомогенный препарат с удельной активностью 510 Е/мг белка. Результаты очистки (НАД(Ф)-глутаматдегидрогеназы Chlorella pyrenoidosa 82 Т представлены в таблице. Технико-экономическа  эффективность предлагаемого изобретени  состоит в ускорении процесса , улучшейЛи качества и повышении выхода получаемого продукта. 595850 Формула изобретени  Способ выделени  никотинамидадениндинуклеотид- глутаматдегвдрогеназы из хлореллы путем разрушени  клеток в фосфатном буфере, 5 выделени  бесклеточного зкстра|ста, осаждени  нз него балластных веществ и удалени  осадка центрифугированием с последующим концентрированием супериатанта осаждением сернокиспкол аммонием до 50-52% степени насыщени  ю и обессоливанием на Сефадексе, хроматотрафии ферментсодержащей фракции на полисахаридном сорбенте с элюцией фосфатным буфером рН.7,0-7,4, содержащим NaCl, и фрмсционировани  ее на геле фосфата кальци , о т- is личающийс  тем, что, с целью ускорени  процесса, повыщени  выхода и качества целевого продукта, осаждение балластных веществ провод т нагреванием бесклеточного экстракта в течение 5-10 мин при 60-65 С, jO в полученный супернатант добавл ют MnClj 26 до конечной концентрации его в супернатанте 0,015-0,030 М, злюироваш1ем фермента с образовавшегос  осадка буфером, причем фракционирование на геле фосфата кальци  провоД т после обработки сульфатом аммони  и обессоливанн  с последующей двукратной хроматографией элюага с использованием в качестве сорбента аминогексил-Сефарозы и элюцией ф ермента линейным градиентом Nad в пределах 0-0,1 М в буфере, Источники информации, прин тые во внимание при зкспертизе 1. Лосева Л. П., Шатилов В. Р., СофьинА.В., Кретович В. Л. Молекулщ ный вес и субъедидачна  природа конститутивной НАД(Ф)-глутаматдегищ )огеназы хлореллы. ДАН СССР. Т. 232, 1977, И 3, с. 703-705.
2. 2. Рашба Е. Я. и др. Дезинтеграци  микроорганизмов . Материалы Всесоюзной конференции . Пущино-на-Оке, 1972, с. 159.