SU994554A1

SU994554A1 - Способ получени метиониназы

Info

Publication number: SU994554A1
Application number: SU813307247A
Authority: SU
Inventors: Темирболат Темболатович Березов; Кении Сода; Нобуйоши Есаки; Кунио Шугие
Original assignee: Университет дружбы народов им.П.Лумумбы
Priority date: 1981-06-23
Filing date: 1981-06-23
Publication date: 1983-02-07

Description

С) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕТИОНИНАЗЫ

л/: . . 1 Изобретение относитс к биохимии, а именно к методам выделени и очист ки ферментов из микроорганизмов, и может быть использовано в экзимологии . Известен способ выделени метиониназы Z-метионин-у-лиазы из культуры , Clostrldium sporogenes, включающий шесть стадий очистки фермента l . Недостаток данного способа - небольшой выход фермента и незначительна степень очистки. Известен также способ получени метиониназы из культуры Pseudomonas oval is, включающий получение грубого экстракта, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией 0,05 М фосфатнымбуфером , содержащим пиридоксальфосфат и меркаптоэтанол, осаждение 20-50 сульфатом аммони , вторичную хроматографию на .ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буферным раствором, осаждение 50 сульфатом аммони , тепловую обработку , хроматографию на гидроксилаппатите , хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе с элюцией 0,02 М калий,фосфатным буфером, с добавлением 0,1.М хлористого кали и хроматографию на сефадексе G-200. Конечный выход метиониназы 1% 2 }. Однако известный способ не приводит к получению фермента с высркой удельной активностью. Кроме того, способ сложен, так как включает большое число операций. Целью изобретени вл етс повышение степени очистки и активности фермента, а также ускорение способа получени метиониназы. , Поставленна цель достигаетс тем, что, при осуществлении способа получени фермента путем экстракции культуры Pseudomonas putida с последующим выделением целевого продукта хроматографией экстракта на ДЭфЭ-целлюлозе , хроматографией на-ДЭАЗ-сефа-. дексе и гельфильтрацией элюцию при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе осуществл ют пиридоксальфосфатным буфером с градиентом хлористого кали от 0,12 до 0,18 М, а элюцию при рОматографии на ДЭАЭ сефадексе провод т пиридоксальфосфатным буфером с градиентрм хлористого кали от 0,2 до О, М, а очистку целевого продукта дополнительно провод т хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

Способ осуществл ют следующим образом .

Полученный бесклеточный экстракт после разрушени микроорганизмов под вергают хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и после элюзии из колонки линейным градиентом хлористого кали от 0,12 до 0,18 М активные фракции, после диализа в течение 16 ч, вновь подвергают хроматографии на колонке с ДЭАЭ-сефадексом (А-50). фермент элюируют градиентом хлористого кали от 0,2 до 0,4 М.

При концентрации хлористого кали менее 0,2 М не происходит элюирование фермента, но элюируютс другие . балластные белки. В собранных фракци х определ ют активность метиониназы . Активность была сосредоточена в пробах от № (5 до № 8б. Эти пробы объедин ют и диализируют против пиридоксельфосфатного буфера.

Активные фракции подвергают вторичной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюзию провод т линейным градиентом хлористого, кали от 0,12 до 0,18 М. На заключительном этапе обессоливают целевой.продукт методом гель-хроматографии:, использу гель Тойоперл HW-50 или Сефадекс типа G-25, G-50, G-75.

Пример. Культуру Pseudomonasputida IF03738 выращивают на среде следующего состава, %: Z-метионин 0,25; мочевина 0,1; глицерин 0,1; КН2Р04 0,1; К2НР04 0,1 ; .MgSO.yHgO О,01; дрожжевой экстракт 0,025. Куль туру выращивают при 28° 18 ч с аэрацией . Клетки отмывают дважды рдствором 0,85 -ного NaCe, а затем 0,01 М фосфатным буфером (ph 7,2), содержащим 10 М и пиридоксаль-S-фосфат и 0,01% 2-меркаптоэтанол. Клетки (150 г) разрушают и суспендируют в , том же буферном растворе.

Супернатант диализируют в течение 21 ч против вышеуказанного буфера . Образующийс осадок удал ют центрирфугированием. Полученный грубый экстракт объемом 2500 мл с удельной активностью 0,07 нмоль нанос т на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой.

Элюирование фермента Провод т КС (0,12 М) в течение суток, затем постепенно замен ют на боле концентрированный раствор КС (0,18 М). Элюируют калийфосфатным буфером 0,1 (jjh 7,2), содержащего 200 М пиридоксальфосфата , 0,01 меркаптоэтанола и 0,ОЦ% этилендиаминтетраацетата (ЭДТА).

Первый раствор элюирует балластные белки, а второй - фермент метиониназу . Диализ провод т против пирофосфатного буфера.

После диализа раствор фермента перенос т на колонку с ДЭАЗ-сефадексом (А-50). Сначала элюируют балластные белки пирофосфатным буфером в присутствии 0,1 М КСе (1 л). Затем увеличивают концентрацию КСЕ до 0,2 М и подключают коллектор фракции . Активность фермента определ ют в пробах, а затем подключают градиентную элюцию раствором пирофосфатногр буфера с возрастающими концентраци ми КСР (от 0,20 до 0,40 М). В собранных фракци х (по 13 мл) определ ют активность метиониназы. Ферментна активность была сосредоточена Е5 пробах от № 45 до № 8й.

Объединенные пробы с № 45 до № 80 (общий объем 550 мл). После диализа перенос т на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой . Колонку промывают 500 мл калийфосфатного буфера, содержащего пиридоксальфосфат и меркаптоэтанол, но не содержащего ЭДТА. Затем колонку промывают последовательно 0,07 М (500 мл) КСЕ и 0,12 М (500 мл) КСЕ. Элюирование провод т градиентной элюцией с 0,12 М по 0,18 М КС9 (600 мл), собира пробы по 6 мл в каждой пробирке. Во всех пробах определ ют активность метиониназы. Наибольша активность фермента была сосредоточена в пробах с № 50 по №104.

В зависимости от активности фермента пробы объедин ют в 3 объема, в каждом из которых определ ют общую активность фермента. Из каждого объема берут пробы дл диск-электрофореза .

Все три объема подвергают гельфильтрации через колонку с Тойоперл (HW-50). Элюирование провод т калийфосфатным буфером (ph 7,2), и активные фракции, содержащие целевой продукт , объедин ют.

Claims

Предложенный способ позвол ет получать фермент с высокой удельной активностью ( мкмоль/кг белка Формула изобретени Способ получени метиониназы путем экстракции культуры Pseudomonas put Ida с последующим выделением целе вого продукта хроматографией экстрак та на ДЭАЭ-целлюлозе, хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе и гельфильтра .цией, отличающийс тем, что, с целью ускорени способа, повышени активности и степени очистки фермента, элюцию при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе осуществл ют пиридоксальфосфатным буфером с градиентом хлористого кали от 0,12 .до 0,18 М, а элюцию при хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе. провод т пиридокв минуту), высокой степенью очистки и за меньшее число операций.

В таблице приведены сравнительные данные сопоставительного анализа предложенного и известного способов. сальфосфатным буфером с градиентом хлористого кали от 0,2 до О, М, а очистку целевого продукта дополнительно провод т хроматографией на колонке с ДЗАЭ-целлюлозой. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1.Kreis W.,Hessio С. Biological Effects of enzymatic deprivation on L-methionine in ceil culture on experimental tunrar. Cancer Res., 33 1866-1869, 1979.
2.Tanaka H, Esakf N;, YamamOto T., SodaK. Purif ication and properties of Methioninase from Pseudomonas ovalls. FEBS Letters, 66, 307311 , 1976..