SU737443A1 - Способ получени фермента днк-цитозин-метилазы 1 из клеток - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ДНК-иИТОЗИНМЕТИЛАЗЫ 1 ИЗ КЛЕТОК ESeHERICHI COUI )00

Изобретение относитс  к способамполучени  ферментов из микроорганизмов а именно к способам получени  гомогенных ДНК-метилаз. Наиболее близким по технической сунь ности к за вленному  вл етс  способ получени  фермента ДНК-цитозин-метилазы 1 из клеток Esc er-ichia Coti предусматривающий дезинтеграцию биомас сы, центрифугирование при 165000, осаждение из полученного бесклеточного экстракта нуклеиновых кислот, фракционирование белкового раствора сульфатом аммони , обессоливание фракций, содержащих фермент, дл  чего их соб1фают центрифугированием, раствор ют в минимальном объеме буфера, диализуют и хро матографируют на колонках с ДЕАЕ-сефа дексом А -50 и фосфоиеллюлозой f. . К полученному раствору добавл ют равный объем глицерина и хран т при температуре - 20 С. Описанный метод не позвол ет получить ферментный препарат ДНК-метилазы с достаточной степенью чистоты; конечный продукт содержит 85% примесей. Кроме того, при очистке в 190 раз выход не более 8% (от общей активности). Целью изобретени   вл етс  получение гомогенного препарата и увеличени  выхода фермента. Цель достигаетс  тем, что перед стабилизацией белковый раствор хроматографируют и рехроматографируют на ДНК-агарозе, затем хроматографируют на КМ-целлюлозе и полученный раствор пропускают через последовательно соединенные колонки с ДЕАЕделлюлозой и фосфоцеллюлозой рП, при этом центрифугирование гомогената, осуществл ют при 10000-3000 , осаждение нуклеиновых кислот провод т протаминсульфатом , обессоливание фракций ведут гельфильтраиией на сефадексеО-25, а стабилизацию ферментного препарата осуществл ют диализом против раствора глицерина. Осаждение нуклеиновых кислот осу373

шествл ют 0,5-0,6%-ным раствором прота м инсул 1эфата.

Хроматографию иа ДНК-агарозе ведут в линейном градиенте хлористого натри  от 0,1 до 0,6 М.

Рехроматографию на ДНК-агарозе веnvT в линейном градиенте хлористого наГри  от 0,1 до 0,3 М.

Хроматографию на КМ - целлюлозе ведут в линейном градиенте хлористого натри  от О до 0,1 М.

Диализ ведут в течение суток против 2-х кратного объема 60% раствора глицерина в ФЕМ-буфере,

Сущность способа состоит в том, что клетки Е. COliMIxE 600, выращенные до конца логарифмической стадии роста дезинтегрируют в буфере. Полученный гомогенат центрифугируют при 1000030000 После центрифугировани  в бесклеточный Экстракт добавл ют протаминсульфат дл  осаждени  нуклеиновых кислот и сопутствуюодах метилаз. Полученный супернатант фракционируют сульфатом aMMOffflH, Осадок, растворенный в буфере, обессоливают на колонках с сефадексом С-25. В обессоленный раствор добавл ют хлористый натрий и Фоакционируют на колонке с ДЕАЕ-сефадексо фракишо с ДНК- метилазной активностью концентрируют высаливанием сульфатом аммони . Осадок раствор ют в буфере и помешают на колонку с ДНК - агарозой . Фракции с ДНК - цитрзин - метилазой 1 объедин ют, Концентрируют ульграфильтрацией , развод т буфером, рехроматографируют на ДНК - агарозе.

В отличие Р -11 фофоиеллюлозы , котора  примен лась ранее на этом этапе, ДНК-агароза  вл етс  более м гким ионообменником I и обладает высокой удельной емкостью с повышенным сродством к ферменту. Процесс приготовлени  ДНК-агарозы не трудоемки и. При хроматографии фермента на ДНК-агарозе результаты хорошо воспроизводимы, фермент меньше инакттнвируетс . Таким образом, применение ДНК-агарозы на этом этапе позвол ет получить фермент с высокой степенью очистки и большим выходом. Выход фермента на этой стади  составл ет 57%.

Собранную активную фракцию далее крнцентрируют Ha NMliat.nian Р-11 фосфоцеллюлозе , хроматографируют на КМиеплЮлозе . Фракции, обладающие активностью , объедан ют и нанос т на последоват ьно соединенные кш:онк:и с ДЕАЕ434

целлюлозой и фосфоцеллюлозой. ДНК-ш тозин-метилазу 1 -элюируют в фрсфоаеллюлозной колонке с буфером. Затем раст- . .вор диализуют против глицерина,

,Пример. 5 кг биомассы Escbericli-ia Gobi MRE 600 разрушают при тем . пературе +4°С на прессе A,anton Goutih ,

Разрущенные клетаи суспендируют в 15 л

0,02 М трнс-НС t буфера рН 7,4, содер0 жащего 5%-ныйглицерини 7 мм меркаптоэтанол (ТМ-буфер). Все последующие стадии провод т при температуре . Неразрушенные клетки и дебрис удал ют центрифугированием при ЮОООа в те5 чение ЗР мин. Надосадочную жидкость используют дл  выделени  фермента.

К 16 литрам бесклеточного экстракта в течение полутора часов при перемешивании добавл ют порци ми 5 литров

0 2,0% протаминсульфата. Осадок удал ют центрифугированием при 10000(J- в течение 30 мин.,

К 19 пиарам надосадочной жидкости добавл ют сухой(NH4)2SO4 до 40% оа

5 полного насыщени . Осадок удал ют центрифугированием . К полученному супернатанту добавл ют сухой ( ЫНд), 60% от полного насыщени . Осадок собирают центрифугированием и раствор ют в

0 1000 мл ТМ буфера; Раствор дел т на две разных части и нанос т на колонки (5x70 см) с сефа ексом Q-25, уравновешенном ТМ буфером. Объем обессоленного раствора довод т до 4 л и добавл 5 ют сухой NaCl до 0,15 М (ЦН4 5О-ФракЦИЯ .

Эту фракцию нанос т на колонку (10х 100 см) с ДЕАБ-сефадексом А-50 со скоростью 400 мл/ч. После того, когда выйдет {)аствор свободного объема коло№ки (около 3 литров), собирают еше 1,5 литра опалесцирующего раствора и от брасывают. ДНК-метилазную активность

5 собирают в следующих 5 литрах элюирующего раствора.

Элюат концентрируют высаливанием белков сульфатом аммони  до 70% от полного насыщени . Осадок собирают центриjj фугированием, раствор ют в 600 мл ФЕМ-буфера (20 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,0; 1мМ ЭДТА; 7 мМ 2-меркаптоэтанол;-5% гл-ицерин), диализируют против 5 литров фЕМ-буфера с четырех5 кратной сменой в течение суток (Фракгш  2).

Хроматографи  на ДНК-агарозе. Раствор белка после диализа нанос т на колонку (5x30 см ) с ДНК-агарозой, урав5 повешенной ФЕМ-буфером со скростью 60 мл/ч и промывают ФЕМ-буфером, содержащим 0,1 ММаСедо тех пор, пока опт1гческа  плотность элюата не упадет до нул . Хроматографию ведут 6 л ФЕМбуфера с линейно повышающейс ,концентрацией Nace от 0,1 до 0,6 М со скоро стью 60 мл/ч. Фракции собирают по 20 фермент элюируют со средней концентрацией NaC&0,25 М в объеме 600 мл. фр ции с активностью ДНК-цитозин-метилаз 1 объедин ют и концентрируют ультрафил рацией в системе Амикон через мембран РМ-1О до 80 мл и развод т буфером в 2,5 раза до 200 мл (Фракци  3). 200 мл фракции 3 нанос т на колонку (5x5 см) с ДНК-агарозой, уравновешенной ФЕМ-буфером, содержащим 0,1 MNa промывают 120 мл этого же буфера и ведут хроматографию 3 л ФЕМ-буфера с линейно повышающейс  концентрацией МаСе/ от 0,1 до 0,36 М со скоростью 6.0 мл/ч. Фракции собирают по 15 мл. ДНК-цитозин-метилазу 1 элюируют со средней концентрацией NaCt 0,22 М в объеме 45О мл (фракци  4). Фракцию 4 концентрируют на колонке (5x1 см) с /1iOitman Р-11 фосфоцеллюлозой; уравновешенной ФЕМ-буфером . Дл  этого фракцию дел т на 4-5 равных частей и каждую часть перед нанесением на колонку развод т в 2,2 раза ФЕМ-буфером, нанесение со скоростью 200 мл/час, ДНК-метилазу 1 элюируют с колонки ФЕМ-буфером, содержащим 0,35 NaCl со скоростью 40 мл/ч. Весь белко вый пик с ДНК-цитозин-металазой 1 выходит в объеме 60 мл. Этот белок диализуют против 5 литров 0,01 М калий фосфатного буфера рН 7,0 в течение 16ч с двукратной сменой, далее раствор белк нанос т на колонку (2,6x10 см) с КМце люлозой , уравновешенную диализным буфером, со скоростью 20 мл/ч. Колонку промывают 120 мл этого же буфера со скоростью 30 мл/ч. Хроматографию веду 750 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера с линейно повьшающейс  концентрациейNaCl от О до 0,1 М со скоростью 30 мл/ч. Фракции собирают по 15 мл Активностью ДНК-цитозин-метилазы 1 обладают фракции со средней концентрацией NaClj-равной 0,05 М в объеме 25О мл (фракци  5). Фракцию 5 нанос т на две последовательно соединенные колонки (5x1 см) с ДЕАЕ-целлюлозой и фосфоцеллюпозой со скоростью 120 мл/ч. Колонки про- 43 мывают ,ФЕМ-буфером, содержащим 0,05 М NaCljH колонки разъедин ют. ДНК-метилазу I элюируют с фосфоцеллюлозы ФЕМ-буфером, содержащим 0,35 М NaCl со скоростью 30 мл/ч в объеме 60 мл дополнительно концентрируют диализом против двух объемов 70% глицерина в ФЕМ-буфере в течение суток, фермент хран т при -20°С, Применение предлагаемого метода позвол ет получить гомогенный фермент и повысить выход в 3,5 раза по сравнению с ранее предложенным способом. формула изобретени  1. Способ получени  фермента ДИКгштозин-метилазы 1 из клеток Escher-ic .io Co2.iMRE 600, предусматривающий дезинтеграцию биомассы, центрифугирование гомогената, осаждение из полученного бесклеточного экстракта нуклеиновых кислот, фракционирование белкового раствора сульфатом аммони , обессоливание фракций, содержащих фермент, с последующей хроматографией на ДЕАБсефадексе и стабилизацией готового продукта , отличающийс  тем, что, с целью получени  гомогенного препарата и увеличени  вьохода фермента, перед стабилизацией белковый раствор хроматографируют и рехроматографируют на ДНК-агарозе, затем хроматографируют на КМ-целлюлозе иполученный раствор пропускают через последовательно соединенные , колонки с ДЕА Е-целлюлозой и фосфоцеллюлозой Р при этом центрифугирование гомогеНата осуществл ют при 10000-30000 осаждение нуклеиновых кислот провод т протаминсульфатом , обессоливание фракцией ведут гельфильтрацией на сефадексе(5-25 а стабилизацию ферментного препарата осуществл ют диализом против раствора глицерина. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и йс   тем, что осаждение нуклеиновых кислот осуществл етс  0,5-0,6%-ным раствором протаминсульфата. 3.Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и и с   тем, что хроматографию на ДНК-агарозе ведут в линейном градиенте хлористого натри  от 0,1 до 0,6 М. 4.Способ по п. 1, о т л и. ч а ю щ и-й с   -тем, что рехроматографию на ДНК-агарозе ведут в линейном гра7 7374438

Ёйенте хлористого натрий от ОД дочение суток против 2-х кратного объема

М.60% раствора глицерина в ФЕМ-буфере.

5.Способ по п. 1, о т д   ч а ю -Источники информации,

щ и и с   тем, что хроматографию наприн тые во внимание при экспертизе

КМ-целлюпозе ведут в линейном градиен-.. Бурь нов Я. И. Нестеренко В. Ф.,

те хлористого натри  от О до 0,1 М.Вагабова Л. М. Докладц Академии Наук

6.Способ по п. 1, о т л и ч а ю -СССР. т. 227, № 6, 1976, с. 1972-ц и И с   тем, что диализ ведут в те-1975.

Claims (4)

1. Формула изобретения

   1. Способ получения фермента ДИКпитозин-металазы 1 из клеток EscheHchia C0C1MRE 600, предусматривающий дезинтеграцию биомассы, центрифугирование гомогената, осаждение из полученного бесклеточного экстракта нуклеиновых кислот, фракционирование белкового раствора сульфатом аммония, обессоливание фракций, содержащих фермент? с последующей хроматографией на ДЕАЕсефадексе и стабилизацией готового продукта, отличающийся тем, что, с целью получения гомогенного препарата и увеличения выхода фермента, перед стабилизацией белковый раствор хроматографируют и рехроматографируют на ДНК-агарозе, затем хроматографируют на КМ-целлюлозе и'полученный раствор пропускают через последовательно соедине иные, колонки с ДЕАЕ-целлюлозой и фосфоцеллюлозой Р Ц при этом центрифугирование гомогената осуществляют при 10000-30000осаждение нуклеиновых кислот проводят протаминсульфатом, обессоливание фракцией ведут гельфильтрацией на сефадексе Q-25? а стабилизацию ферментного препарата осуществляют диализом против раствора глицерина.
2. 2. Способ по π. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что осаждение нуклеиновых кислот осуществляется 0,5-0,6%-ным раствором протаминсульфата.
3. 3. Способ по π. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что хроматографию на ДНК-агарозе ведут в линейном градиенте хлористого натрия от 0,1 до 0,6 М.
4. 4. Способ по π. 1, о т л и. ч а ющ и-й с я тем, что рехроматографию на ДНК-агарозе ведут в линейном гра8 чение суток против 2-х кратного объема

   60% раствора глицерина в ФЕМ-буфере.