NL8100719A - Microbiologisch bereid polypeptide met de aminozuur-orde van menselijk interferon, dna en plasmiden, die voor deze volgorde coderen, microoerganismen, die deze genetische informatie bevatten en werkwijze voor het maken daarvan. - Google Patents

Description

70 13^5

Betr.Y Microbiologisch, bereid polypeptide met de aminozuurvolgorde van menselijk interferon, DM en piasmi den, die voor deze volgorde coderen, microorganismen, die deze genetische informatie bevatten en werkwijze voor het maken daarvan.

Sedert meer dan 20 jaren is het bekend, dat interferon de virus-produktie verhindert. Onderzoekingen van de laatste jaren hebben voorts uitgewezen, dat interferon ook de celdeling remt en vele reacties van het immunosysteem reguleert. Al deze resultaten onderstrepen de grotè-.. therapeutische betekenis van interferon.

De hoeveelheden interferon, die tot dusver voor wetenschappelijke en therapeutische onderzoekingen konden worden gebruikt, werden uit fibroblast- en lymfocytencdlturen gewonnen. Men is er met beide methoden evenwel niet in geslaagd, grote of ook slechts voor afzonderlijke problemen toereikende hoeveelheden aan interferon te bereiden. Dit is te- ; gelijkertijd de oorzaak ervoor, dat de kennis op het interferongebied slechts zeer langzaam voortschrijdt en dat slechts zeer weinige van de dringend gewenste onderzoekingen op het kankergebied konden worden uitgevoerd. Het is dus noodzakelijk, nieuwe wegen bij de produktie van interferon in te slaan.

Een dergelijke weg wordt nu door de onderhavige uitvinding gewezen. Deze betreft de isolatie van nucleotidevolgorden, die de genetische code voor interferon bevatten, de synthese van DM met deze specifieke nucleotidevolgorde en de transfer van dit DM in een micro-organisme als gastheer, waarin de replicatie en expressie van dit DM plaatsvindt.

De uitvinding betreft in het bijzonder de vorming van genen voor fibroblast-interferon, de transfer van deze genen in een microbe-gastheer, replicatie van gastheer en genten expressie van het gen door de gastheer. Daarbij ontstaat interferon-proteine met de voor dit proteïne karakteristieke biologische en immunologische eigenschappen.

Yoor het bereiken van de onderhavige doeleinden kan men op de volgende wijze tewerk gaan, waarbij de weergegeven weg· als voorbeèld voor verscheidene bruikbare staat.

Menselijke fibroblasten worden bij aanwezigheid van een proteïne-synthese-remmer met behulp van polyinosinezuur/polycytidylzuur tot een maximale produktie van interferon-mEM aangezet. De cellen worden gedenatureerd en het RM als neerslag met een cesiumchloridecentrifu- 81 00 7 1 9 -2- gering gewonnen. Ka opnieuw neerslaan wordt uit dit RNA het ffiRNA via een oligo-dT-cellulosekolom afgescheiden. Het gewonnen mRNA wordt met "behulp van het enzym reverse-transcriptase tot een RNA-DNA-dubbelstreng gecompleteerd. Na afbraak van de RNA-streng wordt de DNA-streng (het com-5 plementaire DNA = cDNA) met reverse transcriptase of het enzym polymerase I tot een DNA-DNA-dubbelstreng (dsDNA) gecompleteerd.

' Dit dubbels trengi ge DNA moet nu in een piasmi de worden ingebouwd. Daartoe is de verlenging van het 31 -uiteinde van het DNA, b.v. met dCMP-resten nodig. Het plasmide (b.v. pBR 322) wordt met het restrictie-10 nuclease PstI opengesneden en b.v. met dGMP-resten verlengd. Bij samenvoeging van het aldus verlengde DNA met een passend verlengd plasmide vindt base-paring tussen DNA en plasmide plaats. Dit circulair gemaakte molecuul wordt dan in microörganismen (vooral bacteriën, liefst E.coli v zoals E_. coli K 12 of X 1776) getransformeerd; de nog niet gesloten 15 bindingen worden door de enzymen van het mier oor ganisme covalent verknoopt. De getransformeerde microörganismen worden op agarplaten uitgestreken en op antibioticaresistenties, die door het gekozen plasmide en het toegepaste restrictienuclease gegeven zijn, geselecteerd.

Met behulp van immunologische en biologische proeven worden de . 20 clonen, die interferonhoudende proteïnen vormen, uitgezócht. Deze clonen worden gekweekt, de microörganismemassa afgecentrifugeerd, geëxtraheerd en op interferongehalte onderzocht. De door ontsluiting van de interferon producerende clonen gewonnen oplossing bevat interferon-proteïne.

25 De onderhavige stappen kunnen op de volgende wijze worden uitge voerd:

1. Werkwijze voor het isoleren van RNA

a) De winning van interferon producerende fibroblastcellen.

Menselijke, neonatale voorhuidfibroblasten werden bij 37 °C onder 30 toepassing van een geschikt cultuurmedium (b.v. Eagle’s medium MEM) (minimaal essentieel medium) plus foetaal kalverserum) in rolkolven (0 10 cm, lengte Uo cm) in een aantal passages vermeerderd. Na bereiken van uitgewassen celculturen van de 25e tot de 35e celverdubbeling wordt het vermeerderingsmedium door het 35 interferon-inductiemedium vervangen. Dit bestaat uit Eagle’s MEM, 8100719 -3- waaraan geschikte hoeveelheden van de fibroblast-interferon-inductor poly-inosinezuur : polycytidylzuur (10-100 ^g/cm; in het actuele

O

geval 50 ^ug/emJ) en de proteïnesyntheseremmer cycloheximide (10-100 3 3 ^Ug/cm , in dit geval 50 jig/cm. ) werden toegevoegd. Ha incubatie van 5 de celculturen bij 37°C gedurende k-6 uren (in het onderhavige geval 5 uren) werd de bovenstaande vloeistof af gegoten,

b) Winning van 5M

De verkregen cellen werden in een denaturerend medium M guani-diniumthiocyanaat, 1 M mercaptoëthanol, 0,15 M natriumacetaat met 10 pH 5,5) opgenomen en 1 minuut bij 0°C met een ultra-turrax gehomogeniseerd. Het hcmogenisaat werd 15 minuten bij !+°C met 20000 tpm gecentrifugeerd.

De bovenstaande vloeistof werd daarna op een oplossing (kussen) van

O

5 cnr 5,7 M CsCl, 10 mM tris-hydroxyaminamethaan (tris), 10 mM 15 ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) met pH 7,6 als laag opge bracht en in een Beckman-SW 27 rotor 36 uren bij 20°C en 22.000 tpm ge centrifugeer!.

Er' werd gevonden, dat in tegenstelling tot de opgave in de literatuur, een toevoeging van CsCl aan het lysaat moet worden vermeden, 20 om een zo volledig mogelijke afscheiding van mRWA in de volgende reactietrap te bereiken. Ha afloop van het centrifugeren werden de polyallcmeer-buisjes in vloeibare stikstof ingevroren en de bodem van de buisjes, waarop zich het RWA-neerslag bevond, afgesneden.

Het neerslag werd in een oplossing van 10 mM tris, 10 mM EDTA en 25 10$ "sarcosyl" (W-lauryl-sarcosine-natriumzout) met pH 7,6 opgencmen en de suspensie bij 20.000 tpm 20 minuten gecentrifugeerd. Het verkregen neerslag werd nogmaals in dezelfde buffer opgenomen, 5 minuten op 6>5°C verwarmd en opnieuw gecentrifugeerd. De verenigde bovenstaande -vloeistoffen werden 0,3 M aan natriumacetaat gemaakt, 30 met het 2,5-voudig volume ethanol gemengd en bij -20°C bewaard.

2. Winning van mRITA

Het RÏTA werd door afcentrifugeren uit de ethanoloplossing (20.000 tpm, 30 minuten, -5°C) afgescheiden en in 0,5 M NaCl, 10 mM tris met pH 7,5 opgelost. Deze oplossing werd op een oligo-dT-cellulosekolcm 35 (Collaborative Research, type 3), die met een zelfde buffer was ge- 81 00 7 1 9 -k- equilibreerd, aangebracht en met 1 mM tris, pH 7 ,6 of gedestilleerd water geëlueerd. De elutie van het poly-A-houdende RITA (mRNA) kan door een extinctiemeting bij 260 nm worden gevolgd.. Het aldus verkregen mRNA werd met natriumacetaat tot een eindeoncentratie van 0,3 5 M begiftigd, het 2,5-voudig volume ethanol toegevoegd en de oplossing bij ^20°C bewaard.

3. Winning van het cDKA

a} Winning van enkelstreng-cDNA

De omzetting 'van het mRNA in hét overeenkomstige DM (cDM) 10 vindt plaats met behulp van het enzym reverse-transcriptase.

Het incubatiemengsel bevatte: 50 mM tris, pH 8,3, 10 mM MgClg, 30 mM 2-mercaptoëthanol, 0,5 mM aan alle ^ gewoonlijk voorkomende desoxyribonucleosidetrifosfaten (de trifosfaten van adenine, 3 guaninè·;. cytosine en thymidine), 100/ug/cm oligo-dT12_1g (van 15 Boehringer Mannheim) ca. 100 jag/cm? gepoOyadenyleerd RNA en 800

O

eenheden/cm"1 reverse-transcriptase (van Life Science Ine.,

St. Petersburg, USA). Voor het volgen van de reactie kan een op de c(-plaats met 32 P gemerkt desoxyribonucleosidetrifosfaat (specifieke activiteit 50 Ci/mmol) aan het mengsel worden toege-20 voegd. Het mengsel wordt 60 minuten bij k2°C geïncubeerd, waarna door een toevoeging van 20 mM EDTA de reactie wordt afgebroken.

De oplossing wordt met een zelfde volume met water verzadigde fenol geëxtraheerd, de fenol door uitschudden met ether verwijderd en resten ether met stikstof afgedestilleerd. Wiet ingebouwde 25 desoxyribonucleosidetrifosfatèn werden door kolomchromatografie over Sephadex G50 in 10 mM tris, pH 9,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA afgescheiden. Het geëlueerde cDM werd door een toevoeging van 0,3 M natriumacetaat en het 2,5-voudig volume ethanol neergeslagen. Na centrifugeren werd het neerslag in 0,1 M NaOH opgenomen en 30 20 minuten bij 70°C gêincubeerd of in 0,3 M NaOH een nacht bij kamertemperatuur geïncubeerd. Het mengsel werd met 1 M HC1 en 1 M tris op pH 7,6 gebracht, b) Vorming van dubbelstreng-cDNA (ds DNA)

Voor een vorming van de tweede DNA-streng kan wederom het enzym 35 reverse transcriptase of het enzym polymerase I worden gebruikt.

81 00 7 1 9 -5-

Vorming van dsDKA met reverse transcriptase:

Het incubatiemengsel (pH 8,3) "bevatte 50 mM tris, 10 mM MgClp, 30 mM 2-mercaptoëthanol, 0,5 mM van de "bovengenoemde 4 desoxy-ribonucleoèidetrifosfaten, 50yUg/cm cDHA en 800 eenheden/cm reverse transcriptase. De reactie werd 120 minuten "bij if-2°C uitgevoerd en door een toevoeging van EDTA tot een eindconcentratie van 20 mM afgebroken. Vervolgens vond de fenolextractie en een gelpermeatiechromatografie over Sephadex G50 als "bovenbeschreven plaats.

Vorming van dsDNA met polymerase I:

Het incubatiemengsel (pH 6,9) "bevatte 200 mM hepes, 0,5 mM van de "bovengenoemde U desoxyribonucleosidetrifosfaten, 10 mM MgCl^, 30 mM 2-mercaptoëthanol en TO mM KC1. Door een toevoeging van met 32 P gemerkte desoxyribonucleotiden (qp de &L-plaatsen) aan het incubatiemengsel kan de reactie worden gevolgd. De reactie werd met 800 eenheden/cm^ polymerase I gestart en 2 uren bij 15°C uitgevoerd. Door een toevoeging van 0,1$ natriumdodecylsulfaat en 100 ,ug/ 3 cm RHA werd de reactie beëindigd. De oplossing werd als bovenbeschreven geëxtraheerd. De na de extractie verkregen oplossing werd op een Sephadex G50-kolom aangebracht en gechrcmatografeerd met 10 mM tris pH 9,0, 100 mM jtfaCl en 1 mM EDTA. Het geëlueerde DHA kan door zijn radioactiviteit worden bepaald en werd door een toevoeging van 0,3 M natriumacetaat en 2,5-voudige volume ethanol neergeslagen. Het ethanol-neerslag werd in een oplossing (pH ^,5) uit 300 mM EaCl, 30 mM natriumacetaat en 3 mM ZnClp opgenomen en met 1500 eenheden/cnr S1 nuclease (Boehringer Mannheim) gemengd.

De reactie werd na 1 uur bij 3T°C door een toevoeging van EDTA tot een eindconcentratie van 20 mM afgebroken. Vervolgens werd met fenol geëxtraheerd en met ethanol neergeslagen béide als bovenbeschreven.

c) Winning van cDM met een eenreactorproces.

Alternatief kan het dsDNA uit het mBWA ook met een eenre act or procédé worden gewonnen. Daarbij wordt de reactie van het reverse transcriptase als beschreven uitgevoerd, maar aan het incubatiemengsel nog lUO mM SCI toegevoegd. Ha afloop van de reactie werd het 8100719 5 -6- monster U minuten op 100°C verhit en het gevormde neerslag afgecentrifugeerd. Aan de bovenstaande vloeistof werd een gelijk volume 0,U M hepes buffer (pH 6,9) toegevoegd, waarbij de bovengenoemde k desoxyribonucleotiden in de buffer 0,5 mM aanwezig waren.

Door een toevoeging van 800 eenheden/cm polymerase I werd de reactie als beschreven bij 15°C uitgevoerd en door een toevoeging van natriumdodecylsulfaat en RNA gestopt. Vervolgens werd als onder 3b) 'Vorming van dsDNA met polymerase I" verder gewerkt. b. Verlenging van dd 3'-uiteinden van cDNA met dCTP (desoxycytosine- 10 15 20 25 30 trif osfaat)._

Voor een inbouw in het plasmide is een verlenging van het 3-uiteinde van het DNA met een van de bovengenoemde k desoxynucleotiden nodig. Voorts werden de 3'-uiteinden van het opengesneden plasmide met complementair desoxynucleotide verlengd. Bij samenvoeging van DNA met plasmide vindt dan een baseparing tussen DNA en plasmide plaats.

Dit weer cirkelvormig gemaakte molecuul kan voor een transformatie van bacteriën worden gebruikt; de nog niet gesloten bindingen worden door een enzymsysteem in bacteriën covalent verknoopt.

B.v. kunnen de 3'-uiteinden van cDNA met dCMP-resten (desoxycyto-sinemonofosfaatresten) en het plasmide met dGMP-resten (desöxyguani-dinemonofosfaat-resten) worden verlengd. Bij toepassing van deze desoxynucleotiden op de beschreven wijze en bij opening vaihet plasmide door het restrictie-enzym Pst I wordt na inbouw van het vreemde DNA een Pst I-splitsingsplaats aan elke insertieplaats nieuw gevormd, zodat na vermeerdering van het plasmide het geïnsereerde DNA voor verder onderzoek gemakkelijk weer met het restrictie-enzym Pst I kan worden uitgeknipt.

Het neerslag na de alcoholtoevoeging na afbraak met $1 nuclease werd in een waterige oplossing met pH 6,7 van 30 mM tris, 1 mM CoClg, 1^0 mM kaliumcacodylaat, 150 mM dCTP, 100 ;ug geautoclaveerd gelatine-hydrolysaat en 0,1 M dithioërythritol opgelost. Voor het volgen van de reactie kan met 32 P-gemerkte dCTP worden gebruikt. De reactie werd door een toevoeging van terminaal désoxynucleotidyl-transferase op gang gebracht en 10 minuten bij 37°C uitgevoerd. Na afloop van de reactietijd werd het monster in ijs geplaatst en door een radioactivi- 35 8100719 -7- teitsmeting in met trichloorazijnzuur verkrijgtaar neerslag het aantal van de ingehouwde dCMP-resten bepaald. Bij de reactie moeten hij voorkeur ca. 10# van de oorspronkelijk aanwezige nucleotiden zijn geaddeerd; indien dit niet het geval is kan door een toevoeging van verder enzym de reactie worden voortgezet. Indien een te groot aantal dCMP-resten werd geaddeerd, kan de gevormde keten met behulp van het enzym S1 nuclease worden ingekort.

5. Werkwijze voor het integreren van DNA in een piasmide.

Een geschikt circulair plasmide, b.v. pBR 322, werd met een restrictieëndonuclease opengeknipt, dat slechts een volgorde op het plasmide erkent. Gunstig is het, wanneer deze splitsingsplaats achter een sterke of induceerbare promotor ligt en/of zo is gelocaliseerd, dat een antibioticaresistentie wordt beïnvloed.

Het aldus lineair gemaakte plasmide wordt daarna aan de 3-uit-einden met een van de vier desoxynucleotiden verlengd.

Dit wordt b.v. als volgt gedaan: 30 jag plasmide wordt met 50 eenheden Pst I restrictieëndonuclease bij aanwezigheid van 50 mM ÏTaCl, o 6 mM tris , 6 mM MgClg, 6vmM 2-mercaptoëthanol en 0,1 mg/cm gelatine gedurende ko minuten bij 37°C en een pH van 7 »5 geïncubeerd. Vervolgens wordt met fenol en ether als beschreven geëxtraheerd en het opengeknipte plasmide met ethanol bij aanwezigheid van 0,3 M natriumacetaat neergeslagen. De verlenging van de 3 ’-uiteinden van het plasmide met dGTP (desoxyguanidinetrifosfaat) vindt plaats analoog de bovenbeschreven verlenging van cDHA met dCTP.

Het verlengde piasmide-DKA wordt dan in een oplossing (pH 8,0) van 0,1 M HaCl, 10 mM tris en 1 mM EDTA met het verlengde ds cDHA gemengd, 2 minuten op 5ö°C verwarmd, 2 uren bij k2°C geïncubeerd en daarna langzaam op kamertemperatuur afgekoeld. Het aldus verkregen hybride DMA wordt daarna voor een transformatie van E. coli gebruikt.

6. Clonering van hybrideplasmide in E. coli.

De bacteriën, b.v. E. coli X 1776 5 werden bij 37°C in 50 cn^ van een gebruikelijke voedingsbodem tot een optische dichtheid van Agoo = 0,5 - 0,6 gekweekt, gesedimenteerd, eenmaal met 10 mM tris pH 7>5 gewassen en daarna in ^0 cm^ van een oplossing van 75 mM CaClp, 5 mM MgCl^ en 5 mM tris met pH 8,0 hersuspendeerd en 20 minuten 81 00 7 1 9 -8- in ijs geïncubeerd. Daarna werden de cellen gesedimenteerd en in

O

2 cm 75 mM CaClg, 5 mM MgCl2, 5 mM tris pH 8,0 hersuspendeerd.

0,2 cm^ van deze bacterie suspensie werden vervolgens met 0,1

O

cm hybride-DM-oplossing gemengd en U5 minuten op ijs geïncubeerd.

Daarna werd 90 seconden op b2 C verwarmd en vervolgens met 0,2 cm-3 . 3 voedingsbodem gemengd. 50 - 75 mm van deze suspensie werden daarna op tetracycline en ampicillinehoudende agarplaten uitgestreken en op antibioticaresistentie geselecteerd.

7· Isolatie van stammen, die interferonhoudende proteïnen produceren.

a) Immunologische aantoning.

Met behulp van een door Broome en Gilbert (PMS 75, 27k6, (1978)) ontwikkeld proefsysteem werden de clonen op de expressie van interferonhoudende proteïnaionderzocht. Clonen, die interferonhoudende proteïnen vormen, werden door de binding van radioactieve anti lichamen aan deze proteïnen met hi er opvolgende autorad! ogr af ie zichtbaar, doordat een röntgenfilm op deze plaatsen werd gezwart. Daartoe werden tot 50 clonen per nitrocellulose-film gedurende 2 dagen bij 37°C gekweekt. Vervolgens werden de filters op een agarblok gelegd, dat 1 mg/cm lysozyme bevatte; op de bacteriekolonie werd een met interferon-antilichaam beklede FVC-folie gebracht, en daarna werd 2-3 uren bij k°C ge-incubeerd. De PVC-folie werd vervolgens 15 uren bij 1j-°C in een oplossing van met 132 jodium gemerkt interferon-antilichaam ge- incubeerd. De specifieke activiteit van de oplossing bedroeg 6 3 ca. lx lCr cpm/cm . ITa kweken en drogen van de folie werd deze geautoradiograf eerd.

b) Biologische aantoning.

De clonen werden m 50 cm van een gebruikelijke voedingsbodem bij 37°C een nacht gekweekt. Daarna werden de bacteriën gesedimenteerd, tweemaal met koude 10 mM tris met pH 8,0, 30 mM ÏTaCl gewassen en in 20% saccharose in 30 mM tris, pïï 8,0,.

1 mM EDTA hersuspendeerd. Er werd vervolgens 10 minuten bij kamertemperatuur geschud, gesedimenteerd, gehersuspendeerd in ijskoud water en in een ijsbad gedurende 10 minuten geïncubeerd. De bacteriën werden daarna gesedimenteerd en de boven- 8f 00 7 1 9 8

• O

-9- staande vloeistof op op zichzelf tekende wijze met een virusremmings-proef op het gehalte aan interferonhoudend eiwit onderzocht.

8. Winning van interferon-proteïne.

De clonen, die in de verschillende proeven een interferonactiviteit 5 vertoonden, werden in de gebruikelijke voedingsbodems gekweekt, de bacteriën afgecentrifugeerd en met waterige buffers geëxtraheerd.

De extractieoplossing bevatte interferonproteïne.

81 00 7 1 9

Claims (7)

1. Microbiologisch verkregen polypeptide, dat de aminozuurvolgorde van menselijk interferon geheel of gedeeltelijk bevat.

2. Microbiologisch verkregen polypeptide volgens conclusie 1, dat de aminozuurvolgorde van menselijk fibroblast-interferon geheel of ge- 5 deeltelijk bevat. 3. cDNA, dat de aminozuurvolgorde van menselijk interferon volgens conclusies 1-2 codeert, verkregen met mRM uit menselijke fibroblastcellen. 1+. Plasmide, dat de aminozuurvolgorde van menselijk interferon volgens conclusies 1-2 codeert, verkregen volgens conclusie 3 en een plas- 10 mide, liefst plasmide pBR 322.

5. Microorganisms, speciaal E. coli, met de genetische informatie voor een biosynthese van het. polypeptide volgens conclusies 1 of 2.

6. Werkwijze voor het vormen van het polypeptide volgens conclusies 1 of 2, met het kenmerk, dat men de genetische informatie voor de bio- 15 synthese van het polypeptide met fibroblast-mRM wint, het verkregen gen op een op zichzelf bekende wijze in microörganismen brengt en die rnicro-organismen op een op zichzelf bekende wijze uitselecteert en cultiveert, die dit polypeptide produceren,

7. Werkwijze voor hetvormen van cDM volgens conclusie 3, Biet het 20 kenmerk, dat men uit fibroblasten RNA wint, daaruit het mENA isoleert en hiermede op een op zichzelf bekende wijze cDM bereidt.

8. Werkwijze voor het bereiden van het plasmide volgens conclusie U, met het kenmerk, dat men een plasmide, liefst plasmide pBR 322, met het cDM volgens conclusie 3 combineert. 25 9« Werkwijze voor het vormen van een microörganisme volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men een microörganisme, liefst E_. coli, met een plasmide volgens conclusie ^ transformeert.

10. Werkwijze voor het winnen van R1A, met het kenmerk, dat men een cesiumchloride-vrij lysaat op een waterige geconcentreerde cesium-30 chlorideoplossing gelaagd aanbrengt, centrifugeert en het RNA wint. 8100719