FR2482132A1 - Polypeptide prepare par voie microbiologique avec la sequence d'acides amines de l'interferon humain, adn et plasmide codant pour cette sequence, microorganismes contenant ces informations genetiques et leurs procedes de preparation - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE NOTAMMENT UN POLYPEPTIDE QUI CONTIENT LA SEQUENCE DES ACIDES AMINES DE L'INTERFERON DE FIBROBLASTES HUMAINS, PREPARE PAR ISOLEMENT DE SEQUENCES DE NUCLEOTIDES QUI CONTIENNENT LE CODE GENETIQUE POUR UNE PROTEINE SPECIFIQUE, UNE SYNTHESE D'ADN AVEC CES SEQUENCES DE NUCLEOTIDES ET LE TRANSFERT DE CET ADN DANS UN MICROORGANISME DANS LEQUEL ONT LIEU LA REPLIQUE ET L'EXPRESSION DE CET ADN.

Description

Depuis plus de 20 ans, on sait que l'interféron empê-

che la production des virus. Des recherches récentes ont mon-

tré en outre que l'interféron inhibe également la division des

cellules et règle de nombreuses-réactions du système immun.

Tous ces résultats mettent-en relief la grande importance médi-

cale de l'interféron.

Les quantités d'interféron qui ont pu jusqu'à présent

ôtre utilisées pour-des recherches scientifiques et thérapeu-

tiques, ont été obtenues à partir de cultures de fibroblastes et de lymphocytes. Mais aucun de ces deux procédés n'a permis

de préparer des quantités d'interféron plus importantes ou mê-

me suffisantes pour des problèmes isolés. C'est également la raison pour laquelle l'état des connaissances dans le domaine

de l'interféron ne progresse que très lentement et seules quel-

ques recherches très souhaitées dans le domaine du cancer ont

pu être entreprises. Il s'avère donc indispensable de s'enga-

ger dans de nouvelles voies pour la production d'interféron.

La présente invention propose donc une telle voie. Elle

concerne l'isolement de séquences de nucléotides qui contien-

nent le code génétique pour l'interféron, la synthèse de l'ADN avec ces séquences de nucléotides spécifiques et le transfert

de cet ADN dans un microorganisme choisi comme hôte, dans le-

quel ont lieu la réplique et l'expression de cet ADN.

La présente invention concerne en particulier la pré-

paration de gènes pour l'interféron de fibroblastes, le trans-

fert de ces gènes dans un hôte microbien, la réplique de l'hôte et du gène et l'expression du gène par l'hôte. On obtient alors une protéine d'interféron ayant les propriétés biologiques et

immunologiques caractéristiques pour cette protéine.

- Pour atteindre le but de l'invention, on peut procéder de la manière suivante, la voie décrite étant donnée à titre

d'exemple parmi plusieurs autres possibles.

En présence d'un inhibiteur de synthèse protéinique,

on stimule des fibroblastes humains à l'aide d'acide polyinosi-

nique/acide polycytidylique pour une production maximale de mARN d'interféron. On dénature les cellules et on obtient l'ARN

sous forme d'un précipité après une centrifugation dans le chlo-

rure de césium. Après une autre précipitation, on sépare le mARn de cet ARN sur une colonne d'oligo-dT-cellulose. Le mARN obtenu est complété en une double chaîne ARN-ADN au moyen de l'enzyme reverse transcriptase. Après digestion de la chaîne

d'ARN, la cha ne d'ADN (ADN complémentaire = cADN) est complé-

tée en une double chaîne ADN-ADN (dsADN) au moyen de la reverse transcriptase ou de l'enzyme polymérase I. Cet ADN à double chaîne doit alors être incorporé dans un plasmide. Dans ce but, on doit prolonger l'extrémité 3' de 1'ADN avec des restes dCMP (désoxycytosine monophosphate) par exemple. Le plasmide (par exemple pBR 322) est scindé avec la nucléase de restriction PstI et prolongé par exemple avec des restes dGMP (désoxyguanidine monophosphate). Il résulte de la réunion de l'ADN ainsi prolongé avec le plasmide prolongé de façon correspondante un appariement de base entre l'ADN et le

plasmide. Cette molécule rendue circulaire est alors transfor-

mée dans des microorganismes (avant tout des bactéries, de pré-

férence:E. coli, tel que E. coli K 12 ou X 1776); les liaisons

non encore fermées sont liées de façon covalente par les enzy-

mes du microorganisme. Les microorganismes transformés sont éta-

lés sur des plaques de gélose et sélectionnés quant aux résis-

tances aux antibiotiques, conférées par le piasmide choisi et

la nucléase de restriction utilisée.

A l'aidede tests ismunologiques et biologiques, on cherche les clo-

nes qui expriment des protéines contenant de l'interféron. On cul-

tive ces clones, on sépare la masse de microorganismes par cen-

trifugation, on extrait et on détermine la teneur en interfé-

ron. La solution obtenue par extraction du clone produisant de

l'interféron contient la protéine d'interféron.

Les procédés selon l'invention peuvent être mis en oeuvre de la manière suivante: 1. Procédé d'isolement de l'ARN

a) L'obtention de cellules de fibrobastes productrices d'inter-

féron.

Dans des flacons sous agitation (diamètre 10 cm, lon-

gueur 40 cm), on fait proliférer en plusieurs passages des fibroblastes de prépuce néonatal humain à 37 C, en utilisant des milieux de culture appropriés (par e- xemple milieu HEM de Eagle (milieu essentiel minimal)

plus sérum foetal de veau). Après avoir obtenu des cul-

tures de cellules ayant poussé, du 25ème au 35ème dou-

blement des cellules, on remplace le milieu de prolifúé-

ration par le milieu d'induction d'interféron. Celui-ci

consiste en MEM de Eagle auquel on ajoute des quanti-

tés appropriées d'inducteur d'interféron de fibroblas-

tes, l'acide polyinosinique:acide polycytidylique (10

à 100 g/ml, dans le cas présent 50 pg/ml), et d'inhibi-

teur de synthèse des protéines, le cycloheximide (10 à pg/ml, dans le cas présent 50.g/ml). Après avoir incubé les cultures de cellules à 37 C pendant 4 à 6

heures (dans le cas présent 5 heures), on jette le pro-

duit de culture surnageant.

b) Obtention de lARN

On fixe les cellules obtenues dans un "milieu dénatu-

rant" (thiocyanate de guanidinium 4 M, mercaptoéthanol

1 M, acétate de sodium 0,15 M - pH 5,5) et on homogé-

néise pendant 1 minute à O C avec une Ultra-Turrax. On centrifuge l'homogénéisat pendant 15 minutes à 4 C et

000 tours/minute.

On verse ensuite le produit surnageant sur une solution

("coussin") de 5 ml de CsCl 5,7 M, tris-hydroxyamino-

méthane (Tris) 10 mM, acide éthylène diamine tétraacéti-

que (EDTA) 10 mM, de pH 7,6 et on centrifuge dans un ro-

tor Beckman-SW 27 pendant 36 heures à 20 C et 22 000 tours/minute. On a trouvé que, contrairement aux indications de la

littérature, il faut éviter d'ajouter du CsCl au ly-

sat pour obtenir une séparation la plus totale possible

du mARN au stade réactionnel suivant. Lorsque la cen-

trifugation est terminée, on réfrigère les petits tu-

bes de polyallomère dans de l'azote liquide et on dé-

coupe le fond du tube dans lequel se trouve le précipi-

té d'ARN. On reprend le précipité dans une solution de mM de tris, lO mM d'EDTA et 1 % de "Sarcosyl" (sel de sodium de la N-lauryl sarcosine) de pH 7,6 et on sépare la suspension par centrifugation à 20 000 tours/ minute pendant 20 minutes. On reprend encore une fois le précipité dans le même tampon, on chauffe pendant 5 minutes à 65 C et on centrifuge de nouveau. On ajoute de l'acétate de sodium aux produits surnageants réunis de façon à avoir une concentration 0,3 M en acétate de sodium, on ajoute 2,5 fois le volume d'éthanol et

on conserve à -20 C.

2. Obtention du mARN

On sépare l'ARN par centrifugation à partir de la so-

lution éthanolique (20 000 tours/minute, 30 minutes, -5 C) et

on dissout dans NaCl 0,5 M et O10 mM de tris à pH 7,5. On ver-

se cette solution sur une colonne d'oligo-dT-cellulose (fabri-

cant: Collaborative Research, type 3), équilibrée avec le me-

me tampon et on élue avec 1 mM de tris à pH 7,6 ou de l'eau

distillée. On peut suivre l'élution de l'ARN contenant des po-

ly-A (mARN) par une mesure de l'extinction à 260 nm. A 'ARN

ainsi obtenu, on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une con-

centration finale de 0,3 M, on ajoute 2,5 fois le volume d'é-

thanol et on conserve la solution à -20 C.

3. Obtention du cADN a) Obtention du cADN à simDle chaSne

On effectue la conversion du mARN en l'ADN correspon-

dans (cADN) à l'aide de l'enzyme reverse transcripta-

se. La préparation d'incubation contient:

mM de tris à pH 8,3, 10 mM de MgC12, 30 mM de 2-mer-

captoéthanol, 0,5 mM au total des 4 désoxyribonucléo-

side triphosphates usuellement présents (soit les tri-

phosphates correspondants dfadénine, de guanine, de cy-

tosine et de thymidine), 100 Fg/ml d'oligo-dT12_18 (fa-

bricant: Boehringer Mannheim), environ 100 Pg/ml d' ARN polyadénylé et 800 unités/ml de réverse transcrip- tase (fabricant: Life Science Inc., St-Petersburg,

USA). Pour suivre la réaction, on peut ajouter à la pré-

paration un désoxyribonncléoside triphosphate marqué au P en position A (activité spécifique: 50 Ci/ mMole). On incube le mélange pendant 60 minutes à 42 C, après quoi on arrête la réaction par addition de 20 mM d'EDTA. On extrait la solution avec un même volume de phénol saturé d'eau, on sépare le phénol par agitation

avec de l'éther et on chasse le reste d'éther par éva-

poration a l'azote-. Les désoxyribonucléoside triphos-

phates non-incorporés sont séparés par chromatographie sur colonne de Sephadex G50 dans 10 mM de tris, pH 9,0, mM de NaCl, 1 mM dtEDTAo On précipite le cADN par addition d'acétate de sodium jusqutk une concentration

de 0,3 M et de 2,5 fois le volume d'éthanol.

- Après avoir centrifugé, on reprend le précipité dans NaOH 0,1 M et on incube pendant 20 minutes à 70 C ou dans NaOH 0,3 M pendant une nuit a la température ambiante. On ajuste le pH du mélange à une valeur de 7,6 avec HC 1 M et du tris 1 M. b) Formation du cADN double chaîne (ds ADN)

Pour synthétiser la seconde chaîne d'ADN, on peut uti-

liser de nouveau l'enzyme réverse transcriptase ou l'en-

zyme polymérase I. Formation du dsADN avec la réverse transcriptase: La préparation d'incubation (pH 8,3) contient 50 mM de tris, 10 mM de MgC12, 30 mM de 2-mercaptoéthanol,

0,5 mM des 4 désoxyribonucléoside triphosphates men-

tionnés ci-dessus, 50 pg/ml de cADN et 800 unités/ml

de réverse transcriptase. On effectue la réaction pen-

dant 120 minutes à 42 C et on l'arrête par une addi-

tion d'EDTA jusqu'tà une concentration finale de 20 mM.

On extrait ensuite au phénol et on effectue une chro-

matographie par perméation de ael sur Sephadex G50 tel que décrit cidessus. Formation du dsADN avec la polymérase I: La préparation d'incubation (pH 6,9) contient 200 mM

d'Hepes, 0,5 mMNI des 4 désoxyribonucléoside triphos-

phates mentionnés ci-dessus, 10 mM de MgC12, 30 mM de 2-mercapto-éthanol et 70 mM de KC1. On peut suivre la réaction en ajoutant des désoxyribonucléotides marqués

au 3 P (en les positions y) à la préparation d'incu-

bation. La réaction est déclenchée avec 800 unités/ml

de polymérase I et effectuée pendant 2 heures à 15 C.

On arrête la réaction en ajoutant 0,1 % de dodécylsul-

fate de sodium et 100 ig/ml d'ARN. On extrait la solu-

tion tel que décrit ci-dessus. On transfère la solution obtenue après l'extraction sur une colonne de Sephadex G50 et on effectue la chromatographie avec 10 mM de tris à pH 9,0, 100 mM de NaCl et 1 mM d'EDTA. On peut déterminer l'ADN élué par mesure de la radioactivité

et on précipite par addition de 0,3 M d'acétate de so-

dium et 2,5 fois le volume d'éthanol. On reprend le pré-

cipité dans l'éthanol dans une solution (pH 4,5) de 300 mM de NaCl, 30 mM d'acétate de sodium et 3 mM de ZnC12 et on ajoute 1 500 unités/ml de nucléase S1 (Boehringer Mannheim). On arrête la réaction après

1 heure à 37 C en ajoutant de 1,EDTA jusqu'à une con-

centration finale de 20 mM. On extrait au phénol et on

précipite à l'éthanol tel que décrit ci-dessus.

c) Obtention du cADN dans un "procédé en un seul stade" D'une façon différente des réactions décrites, on peut également obtenir le dsADN à partir du mARN dans un

"procédé en un seul stade". On effectue alors la réac-

tion avec la reverse transcriptase tel que décrit, mais on ajoute encore à la préparation d'incubation 140 mM de KC1. Lorsque la réaction est terminée, on chauffe le mélange pendant 4 minutes à 100 C et on sépare le

précipité formé par centrifugation. Au produit surna-

geant, on ajoute le même volume de tampon d'Hepes 0,4 M (pH 6,9), les 4 désoxyribonucléotides ci-dessus étant alors présents dans le tampon à une concentration de O,5 mMo En ajoutant 800 unités/ml de polymérase I, on

effectue la réaction à 15 C tel que décrit et on ar-

rête la réaction par addition de dodécyl sulfate de so-

dium et d'ARN. Puis on procède tel qu'indiqué en 3.b)

"formation du dsADN avec la polymérase Io-

4. Prolongement des extrémités 3' du cADN avec le dCTP (désoxy-

cytosine triphosphate) Pour l'introduction dans le plasmide, il faut prolonger

l'extrémité 3' de l'ADN avec l'un des 4 désoxynucléotides men-

tionnés ci-dessus. On prolonge en outre les extrémités 3' du plasmide scindé avec le désoxynucléotide complémentaire. En réunissant l'ADN et le plasmide, il se forme un appariement de

base entre l'ADN et le plasmide. Cette molécule rendue de nou-

veau circulaire peut être utilisée pour la transformation des bactéries; les liaisons non encore fermées sont liées de façon

covalente par un système d'enzymes dans la bactérie.

On peut par exemple prolonger les extrémités 3' du cADN avec des restes de dCMP (restes de désoxycytosine monophosphate)

et le plasmide avec des restes de dGMP (restes de désoxyguani-

dine monophosphate). En utilisant ces désoxynucléotides selon le procédé décrit et en ouvrant le plasmide par l'enzyme de restriction Pst I, après l'incorporation d'ADN étranger, il se forme de nouveau un site de scission de Pst I sur chaque site d'insertion, de sorte qu'après la multiplication du plasmide, 1'ADN inséré peut être de nouveau "découpé" facilement avec

l'enzyme de restriction Pst I pour une autre étude.

On dissout le précipité résultant de la précipitation

par un alcool après dégradation par la nucléase S1 dans une so-

lution aqueuse (pH 6,7) contenant 30 mM de tris, 1 mM de CoCl2,

mM de cacodylate de potassium, 150 pM de dCTP, 100l pg d'hy-

drolysat de gélatine autoclavé et O,1 M de dithioérythrite.

Pour suivre la réaction, on peut utiliser un dCTP marqué au P. La réaction est déclenchée par addition de désoxynucléoti- dyle transférase terminale et effectuée pendant 10 minutes

37 C. Lorsque la réaction est terminée,.on place l'échantil-

lon dans la glace et on détermine le nombre de restes de dCIP incorporés, par mesure de la radioactivité dans le précipité obtenu par addition d'acide trichloracétique. Au cours de la

réaction, on devrait ajouter environ 10 % des nucléotides ini-

tialement présents; si tel n'est pas le cas, la réaction est poursuivie en ajoutant une autre quantité d'enzyme. Si un trop grand nombre de restes de dCMP ont été incorporés, la chaîne

formée peut être raccourcie à l'aide de l'enzyme nucléase Sl.

5. Procédé d'intégration d'ADN dans un plasmide On scinde un plasmide circulaire approprié, par exemple

le pBR 322, avec une endonueléase de restriction qui ne recon-

nait qu'une séquence sur le plasmide. Il est avantageux que ce site de'scission se trouve derrière un promoteur puissant ou

inductible et/ou soit localisé de façon à influencer une résis-

tance aux antibiotiques.

Ceplasmide ainsi linéarisé est alors prolongé par un

des 4 désoxynucléotides aux extrémités 3'.

Ceci a lieu par exemple de la manière suivante: on incube 30 g de plasmide avec 50 unités d'endonucléase de restriction Pst I en présence de 50 mM de NaCl, 6 mM de tris,

6 mi de MgCl2, 6 mM de 2-mercapto-éthanol et O,1 mg/ml de géla-

tine pendant 40 minutes à 37 C et à une valeur de pH de 7,5.

On extrait ensuite au phénol et à l'éther tel que décrit ci-

dessus et on précipite le plasmide scindé par l'éthanol en pré-

sence de 0,3 M d'acétate de sodium. Le prolongement des extré-

mités 3' du plasmide avec le dGTP (désoxyguanidine triphospha-

te) se fait selon le procédé de prolongement du cADN avec le

dCTP, décrit ci-dessus.

On mélange 1,ADN plasmique prolongé dans une solution (pH 8,0) contenant 0,1 M de NaCl, 10 mM de tris et 1 mM dtEDTA, avec le ds cADN prolongé, on chauffe pendant 2 minutes à 56 C, on incube pendant 2 heures à 42 C, puis on refroidit lentement à la température ambiante. L'ADN hybride ainsi obtenu est alors

utilisé pour la transformation de E. coli.

6. Clonage du plasmide hybride dans E. coli.

On laisse proliférer les bactéries, par exemple E.coli X 1776, à 37 C dans 50 ml d'un milieu nutritif usuel jusqu'à uedniéotqed une densité optique de A600 = 0,5 - 0,6, on sédimente, on lave

une fois avec du tris 10 mM à pH 7,5, puis on remet en suspen-

sion dans 40 ml d'une solution contenant 75 mM de CaC12, 5 mM

de MgC12 et 5 mM de tris de pH 8,0 et on incube pendant 20 mi-

nutes dans la glace. On sédimente ensuite les cellules et on re-

met en suspension dans 2 ml d'une solution contenant 75 mM de CaCl2, 5 mM de MgC12 et 5 mM de tris à pH 8,0o On mélange 0,2 ml de cette suspension de bactéries avec

0,1 ml de la solution d'ADN hybride et on incube sur de la gla-

ce pendant 45 minutes. On chauffe pendant 90 secondes à 42 C et

on mélange avec 0,2 ml d'un milieu nitritif.

On étale 50 à 75 j1 de cette suspension sur des plaques de gélose contenant de la tétracycline et de l'ampicilline et

on sélectionne quant à la résistance aux antibiotiques.

7. Isolement de souches qui produisent des protéines contenant de l'interféron a) Détection immunologique A l'aide d'un système d'essai élaboré par Broome et Gil bert (Broome S. et Gilbert E., PNAS 75, 2746, 1978), on étudie les clones quant à l'expression des protéines contenant de l'interféron. Les clones qui expriment des

protéines contenant de l'interféron, sont reconnaissa-

bles par fixation d'anticorps radioactifs sur ces pro-

téines et autoradiographie ultérieure, par le fait que le film R5ntgen est noirci en ces sites. Dans ce but, on laisse se développer jusqu'à 50 clones par filtre de nitrocellulose pendant 2 jours à 37 'C. Puis on place les filtres sur un bloc de gélose qui contient l mg/ml de lysozyme; sur la colonie de bactéries, on applique une feuille de chlorure de polyvinyle (PVC) enduite d' anticorps opposés à l'interféron, puis on incube pendant 2 à 3 heures à 4 C. On incube ensuite la feuille de

PVC pendant 15 heures à 4 C dans une solution d'anti-

corps opposés à l'interféron, marqué à 132 I. L'activi-

té spécifique de la solution est d'environ 1 x 106 cpm/ml.

Après lavage et séchage de la feuille, on procède à 1'autoradiographie. b) Détection biologique On cultive les clones dans 50 ml d'un milieu nutritif

usuel pendant une nuit à 37 C. On sédimente les bacté-

ries, on lave deux fois avec 10 mM de tris (pH 8,0) et mM de NaCl froids et on remet en suspension dans du saccharose à 20 5 dans 30 mM de tris à pH 8,0 et 1 mM d'EDTA. On agite alors à la température ambiante pendant minutes, on sédimente, on remet en suspension dans l20 glacée et:on incube pendant 10 minutes dans un bain de glace. On sédimente les bactéries et d'une manière

connue en soi on détermine la teneur en protéine conte-

nant de l'interféron dans le résidu, dans un test d'inhi-

bition des virus.

8. Obtention de la protéine d'interféron Les clones qui montrent une activité en interféron dans les différents tests, sont cultivés dans des milieux nutritifs

usuels, les bactéries sont séparées par centrifugation et ex-

traites avec des tampons aqueux. La solution d'extraction con-

tient la protéine d'interféron.

Claims (8)

R E V E N D I C A T I O N S

1 - Polypeptide préparé par voie microbiologique, ca-

ractérisé en ce qu'il contient totalement ou partiellement la

séquence d'acides aminés de l'interféron humain.

2 - Polypeptide préparé par voie microbiologique selon

la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient totale-

ment ou partiellement la séquence d'acides aminés de l'inter-

féron de fibroblastes humains.

3 - cADN codant pour la séquence d'acides aminés de l'interféron humain selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est préparé au moyen de mARN à partir de cellules

de fibroblastes humains.

4 - Plasmide, codant pour les séquences d'acides aminés

de l'interféron humain selon la revendication 1 ou 2, caracté-

risé en ce qu'il est préparé à partir du cADN selon la revendi-

caton 3 et d'un plasmide, de préférence le plasmide pBR 322.

Microorganisme, en particulier E.coli, avec l'infor- mation génétique pour la biosynthèse du polypeptide selon la

revendication 1 ou 2.

6 - Procédé de préparation du polypeptide selon la re-

vendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à obtenir l'information génétique pour la biosynthèse du polypeptide au

moyen de mARN de fibroblastes, à introduire le gène obtenu, d'u-

ne manière connue en soi, dans des microorganismes et à sélec-

tionner et à cultiver d'une manière connue en soi les microor-

ganismes qui produisent ce polypeptide.

7 - Procédé de préparation du cADN selon la revendica-

tion 3, caractérisé en ce qu'on obtient l'ARN à partir de fi-

broblastes, on en isole le mARN et au moyen de ce dernier on pré-

pare le cADN d'une manière connue en soi.

8 - Procédé de préparation du plasmide selon la reven-

dication 4, caractérisé en ce qu'on combine un plasmide, de

préférence le plasmide pBR 322, avec le cADN selon la revendi-

cation 3.

9 - Procédé de préparation d'un microorganisme selon

la revendication 5, caractérisé en ce qu'on transforme un mi-

croorganisme, de préférence E.coli, avec un plasmide selon la

revendication 4.