FR2653781A1 - Procede de synthese de derives d'adenosine phosphate et derives obtenus. - Google Patents
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Abstract
Le procédé de synthèse de dérivés substitués d'adénosine phosphate est caractérisé en ce qu'il est réalisé par voie enzymatique en soumettant des dérivés de cAMP substitués à l'action d'une protéine à activité adényl cyclase, puis les dérivés d'ATP obtenus à l'action d'une protéine à activité NDP kinase, couplée à un système consommateur de groupes phosphate et qu'on récupère les dérivés d'ATP formés. Ces dérivés sont utilisables notamment comme réactifs de laboratoire.
Description
L'invention concerne un procédé de synthèse de dérivés d'adénosine phosphate substitués et les dérivés d'adénosine diphosphate (ADP) et d'adénosine triphosphate (ATP) substitués obtenus.
La synthèse de dérivés substitués de 1'ADP ou de l'ATP est réalisée à ce jour par voie chimique. Ce mode d'obtention présente l'inconvénient d'une spécificité insuffisante. Ainsi la synthèse de dérivés substitués en position 2' ou 3' conduit à l'obtention de mélanges d'isomères substitués en 2' et en 3' dont la séparation, difficile, nécessite la mise en oeuvre de techniques coûteuses.
Les Inventeurs ont constaté qu'il est possible de remédier au moins en partie aux inconvénients évoqués ci-dessus en réalisant la synthèse de ces dérivés par voie enzymatique.
L'invention a donc pour but de fournir un procédé de synthèse par voie enzymatique, de faible coût, de dérivés d'adénosine phosphate, permettant de disposer de dérivés d'ATP ou d'ADP substitués et en particulier de dérivés d'ATP dans lesquels le groupe phosphate comporte un groupe marqueur.
Elle vise également à fournir les enzymes mises en jeu dans ce procédé, sous forme pure telle qu'obtenue en mettant en oeuvre les techniques du génie génétique, et les séquences nucléotidiques codant pour ces enzymes.
Un autre objet de l'invention concerne les applications, plus spécialement dans le domaine de la biologie, des dérivés d'adénosine, des enzymes et des séquences nucléotidiques codant pour ces enzymes.
Le procédé de synthèse de dérivés d'adénosine phosphate selon l'invention est caractérisé en ce qu'on soumet un dérivé d'AMP cyclique, ou cAMP, substitué par le ou les groupes souhaités pour le dérivé d'adénosine recherché, la position 3' étant bloquée par la cyclisation, à l'action d'une protéine à activité adényl cyclase, et qu'on soumet les dérivés d'ATP substitués obtenus, à l'action d'une protéine à activité nucléoside diphosphate kinase (ou NDP kinase) couplée à un système consommateur de groupe phosphate, tel qu'une hexokinase, et qu'on récupère les dérivés d'ADP substitués formés.
L'utilisation dans ce procédé de dérivés du cAMP permet de disposer de produits de départ ayant une grande stabilité chimique par rapport à 1'ATP ou à 1'ADP classiquement utilisés. Le blocage de la position 3' confère en outre une spécificité élevée à la synthèse.
Le dérivé de cAMP substitué comporte notamment une substitution en position 2' et/ou, le cas échéant, d'autres substitutions en position 2 et/ou 6 et/ou 8.
Le groupe phosphate comporte le cas échéant un groupe marqueur en position a. Ce groupe est choisi parmi les groupes habituels.
Des dérivés de cAMP avantageux pour la mise en oeuvre de l'invention comprennent par exemple en position 2' un groupe alcoyle, alcoxy, acyle, aryle, amino ou azido, ester d'alcoyle et/ou en position 6 un groupe amino et/ou en position 8 et/ou 6 un atome d'halogène, un groupe alcoyle, acyle, alcoxy, aryle ou une fonction azotée telle qu'un groupe azido, amino ou amino alcoyle.
D'une manière générale les groupes alcoyle auxquels il est fait référence dans la description et les revendications comprennent plus particulièrement 1 à 12 atomes de carbone, avantageusement de 1 à 4. Les groupes amino sont des amines primaires, secondaires ou tertiaires et dans ces deux derniers cas sont plus spécialement substitués par des radicaux alcoyle tels que définis plus haut.
Les dérivés de cAMP substitués mis en oeuvre dans le procédé de l'invention, plus spécialement les dérivés comportant en position 2' un groupe azido, sont des produits nouveaux et en tant que tels entrent également dans le cadre de cette dernière.
Selon une disposition avantageuse de l'invention, ces dérivés de cAMP sont obtenus par synthèse chimique à partir de cAMP lui-même. Les différents groupes sont introduits selon les techniques classiques qui seront aisément choisies et mises en oeuvre par l'homme de l'art.
Quant au cAMP, il est obtenu selon le procédé le plus habituel, à partir d'ATP en utilisant de l'adényî cyclase comme catalyseur et en opérant à pH 8 pour obtenir un déplacement à pratiquement 100% dans le sens de la formation de cAMP.
La catalyse par la protéine à activité adényl cyclase est réalisée avantageusement à un pH entre environ 6 et 8, plus particulièrement de l'ordre de 6.
De préférence, cette protéine est fixée à un support, par exemple à des billes d'agarose.
La protéine à activité adényl cyclase mise en oeuvre pour la catalyse enzymatique est avantageusement constituée par une préparation d'adényl cyclase de pureté élevée.
Une préparation purifiée particulièrement satisfaisante est décrite dans la demande FR n" 8615963 du 17/11/86 au nom de l'institut Pasteur.
De manière préférée, on a recours à une protéine à activité adényl cyclase telle qu'exprimée par le gène cya cloné à partir de Bordetella, notamment de
B.pertussis, ou à partir de Bacillus anthracis.
B.pertussis, ou à partir de Bacillus anthracis.
Le gène cya de B.pertussis et la protéine codée exprimant une activité adényl cyclase sont décrits dans la demande FR n" 8710614 du 24/07/87 au nom de l'Institut Pasteur.
Dans la demande FR n" 8813952 du 29/10/88 au nom de l'institut Pasteur, on a également décrit une protéine exprimant une activité adényl cyclase codée par un gène cya de B.anthracis. Cette séquence est également rapportée par Escuyer et-al. dans Gene 71 (1988), 293-298.
La séquence nucléotidique du gène cya et la séquence d'acides aminés correspondantes codées sont rapportées sur la figure 1.
Les lettres indiquées dans l'enchaînement d'acides aminés présentent les significations conventionnelles suivantes:
D Acide aspartique
E Acide glutamique
A Alanine
R Arginine
N Asparagine
C Cystéine
Q Glutamine
G Glycine
H Histidine
I Isoleucine
L Leucine
K Lysine
M Méthionine
F Phenylalanine
P Proline
S Sérine
T Thréonine
W Tryptophane
Y Tyrosine
V Valine
Selon une disposition particulièrement avantageuse de l'invention, la protéine à activité adényl cyclase mise en oeuvre est une forme tronquée d'adényl cyclase.
D Acide aspartique
E Acide glutamique
A Alanine
R Arginine
N Asparagine
C Cystéine
Q Glutamine
G Glycine
H Histidine
I Isoleucine
L Leucine
K Lysine
M Méthionine
F Phenylalanine
P Proline
S Sérine
T Thréonine
W Tryptophane
Y Tyrosine
V Valine
Selon une disposition particulièrement avantageuse de l'invention, la protéine à activité adényl cyclase mise en oeuvre est une forme tronquée d'adényl cyclase.
Cette adényl cyclase tronquée, qui constitue en tant que produit nouveau un objet de l'invention, est un dérivé de délétion par rapport à la séquence d'acides aminés de la figure 1. I1 s'agit en particulier d'un dérivé dépourvu d'une séquence d'acides aminés dans la partie N-terminale, qui n'intervient pas de manière fondamentale dans l'activité adényl cyclase, plus spécialement d'une séquence de 261 acides aminés à l'extrémité Nterminale.
Le dérivé d'adényl cyclase de l'invention est caractérisé par une masse moléculaire de 62200 daltons + 10%.
Cette protéine possède des propriétés catalytiques et de liaison à la calmoduline semblables à celles de l'adényl cyclase de type sauvage provenant de surnageants de culture de B.anthracis, à savoir kcat de 1100 s là 30"C pH 8, Km apparent pour ATP de 0,25 mM et Kd pour la calmoduline de cerveau de boeuf de 23 nM.
Elle partage également des caractéristiques communes avec 1'adényl cyclase de B.pertussis.
Cette protéine est avantageusement obtenue par expression, par exemple dans une souche déficiente en protéase (lon de E.coli, du gène cya de B.anthracis dépourvu à l'extrémité N-terminale d'au moins une partie des codons n'intervenant pas de manière fondamentale pour la synthèse de la protéine à activité adényl cyclase ci-dessus. Ce gène cya est en particulier caractérisé en ce qu'il est dépourvu des 261 codons à l'extrémité N-terminale de la séquence de la figure 1.
Ce gène tronqué est compris dans l'invention.
Toute séquence de nucléotides hybridable avec celle de l'enchaînement de la figure 1, telle qu'obtenue par transcription enzymatique inverse de 1'ARN correspondant, ou encore par synthèse chimique, fait partie de l'invention.
I1 va de soi que les bases de la séquence de nucléotides considérée peuvent être dans un ordre différent de celui trouvé dans les gènes et/ou que ces bases peuvent être, le cas échéant, substituées, des lors qu'une sonde élaborée à partir d'une telle séquence donne une réponse caractéristique et .non équivoque quant à la capacité de reconnaître la présence de gènes codant pour une telle adényl cyclase tronquée. Cette remarque s'applique également à la séquence donnée dans la figure 2.
D'une manière générale, l'invention concerne une séquence de nucléotides caractérisée en ce qu'elle porte l'information pour la synthèse d'une adényl cyclase tronquée, ou de fragments de cette derniere, capables de former un complexe immunologique avec des anticorps dirigés respectivement contre une adényl cyclase de B.anthracis, de B.pertussis ou de cerveau de rat ou contre des fragments d'une telle adényl cyclase.
L'invention concerne également une séquence recombinante comprenant l'une des séquences définies ci-dessus, le cas échéant associée à un promoteur capable de contrôler la transcription de la séquence d'ADN codant pour des séquences de terminaison de la transcription et des signaux de traduction et de sécrétion.
Elle vise encore une séquence de nucléotides recombinante, associée à un promoteur et à un opérateur permettant de contrôler la transcription, et à une séquence signal permettant la sécrétion de la protéine dans l'espace pêriplasmique (gram -) ou dans le milieu extérieur.
Selon encore un autre aspect, la séquence de nucléotides de l'invention est capable de s'hybrider avec une sonde formée à partir de la séquence présentant l'enchaînement de nucléotides de la figure 1 correspondant au gène cya tronqué de B.anthracis.
L'invention vise aussi bien les séquences d'ADN que d'ARN.
Dans le procédé de l'invention, les dérivés d'ATP substitués obtenus par action de l'adényl cyclase comme décrit ci-dessus sont utilisés comme substrats par un système, comportant une protéine à activité NDP kinase couplée à un système consommateur de groupe phosphate, par exemple à une hexokinase.
La protéine à activité NDP kinase catalyse le transfert du groupement r-phosphate d'un triphosphonucléotide sur un nucléotide diphosphate accepteur selon un mécanisme communément appelé "ping-pong", comportant un intermédiaire phosphorylé stable.
Lorsqu'on souhaite disposer de dérivés d'adénosine phosphate comportant une substitution en position 3', on introduit par voie chimique le substituant souhaité avant de soumettre le dérivé d'ATP à l'action du système ci-dessus.
Les substitutions introduites en position 3' correspondent avantageusement à celles indiquées pour la position 2' des dérivés de cAMP.
Conformément à une disposition préférée de l'invention, la protéine à activité NDP kinase mise en oeuvre est une protéine telle qu'obtenue par clonage du gène codant pour la NDP kinase de Dictyostelium discoideum et purification de la protéine.
Cette protéine constitue l'un des objets de l'invention en tant que produit nouveau.
Elle est caractérisée par l'enchaînement de 155 acides aminés représenté sur la figure 2. Son poids moléculaire théorique Mr est de 16700 + 10 t.
La protéine à activité NDP kinase de l'invention est encore caractérisée en ce qu'elle est fortement basique avec un pI calculé de 9,15 et qu'elle contient un fragment hydrophobe (résidus 64 à 84). Ses propriétés basiques permettent de la purifier aisément. Cette protéine constitue donc une source industrielle de NDP kinase présentant un grand intérêt par rapport aux NDP kinases obtenues actuellement à partir d'extraits de tissus ou d'organes et dont la purification nécessite la mise en oeuvre de techniques coûteuses. On connaît la composition en acides aminés des NDP kinases purifiées obtenues à partir de - levure (16), - cerveau de boeuf (17), - foie de rat (14).
L'invention vise également une séquence de nucléotides constituée par au moins une partie d'une séquence codant pour une protéine à activité NDP kinase telle qu'exprimée par D.discoideum.
Cette séquence est capable de s'hybrider avec des gènes codant pour une protéine à activité NDP kinase.
Le pourcentage d'homologie en ce qui concerne les séquences qui s'hybrident est de 70 à 90 %.
Les conditions pour les hybridations évoquées en rapport avec les nouvelles séquences de nucléotides sont des conditions de stringence relativement faibles. On utilise ainsi par exemple 30 % de formamide, 6xSSC (citrate de sodium, NaCl), 0,12 M de pyrophosphate de sodium, 0,5 % de SDS et 250 pg d'ADN de sperme de hareng à 30"C. Les lavages sont effectués dans le même milieu à 37"C et suivant l'importance du bruit de fond, en diminuant progressivement la concentration de SSC et en augmentant la température de lavage de 5"C en 5"C.
L'invention concerne également une séquence recombinante comprenant l'une des séquences définies ci-dessus, le cas échéant associée à un promoteur capable de contrôler la transcription de la séquence d'ADN codant pour des séquences de terminaison de la transcription et des signaux de traduction et de sécrétion.
Selon encore un autre aspect, la séquence de nucléotides de l'invention est capable de s'hybrider avec une sonde formée à partir de la séquence présentant l'enchaînement de nucléotides representé sur la figure 2 ou l'enchaînement des nucléotides complémentaires de cette séquence.
Les séquences de 11 invention sont des séquences d'ADN ou d'ARN.
Toute séquence de nucléotides hybridable avec celle de l'enchaînement de la figure 2, telle qu'obtenue par transcription enzymatique inverse de 1'ARN correspondant, ou encore par synthèse chimique, fait partie de l'invention.
Conformément à l'invention, le clonage de la séquence de nucléotides codant pour une protéine à activité NDP kinase comprend l'isolement des clones d'une banque d'expression construite dans un vecteur, du type de ceux exprimant une protéine interagissant spécifiquement avec un composé tel que [35S) GTPzS, donneur de triphosphate.
Pour l'expression de la protéine dans un hôte, on construit un vecteur en insérant un fragment nucléotidique renfermant la séquence codante.
Selon un mode de réalisation avantageux, on construit par exemple le plasmide pNDK pour exprimer la protéine à activité NDP kinase dans une bactérie telle que E.coli. A cet effet, on insère le fragment de restriction HaeIII - EcoRI du clone isolé, ce fragment ayant été avantageusement traité au préalable pour obtenir des extrémités franches. L'insertion est réalisée dans le site HincII du plasmide pTZ18R. Le plasmide recombinant résultant est introduit dans la bactérie aux fins d'expression, selon les techniques habituelles, de l'enzyme sous le contrôle du promoteur lac Z.
Un agent inducteur tel que 1'IPTG est avantageusement ajouté pour augmenter le taux d'expression. Plusieurs mg par litre de culture peuvent être ainsi obtenus.
L'enzyme récupérée est soumise à au moins une étape de purification sur une colonne de chromatographie.
Une préparation homogène d'enzyme est obtenue en mettant en contact un surnageant de centrifugation d'une suspension de bactéries préalablement cassées par sonication, obtenue à l'issue du procédé cidessus, avec un dérivé de dextrane tel que le DEAE Sephacele, puis en chromatographiant l'élut recueilli sur une colonne de résine telle que Af figel-Blue0.
A pH 8,5, la protéine à activité NDP kinase n'est pas retenue dans la résine et est éluée dans le volume mort.
Selon un autre aspect du procédé de synthèse de dérivés d'adénosine de l'invention, on fait réagir un dérivé d'ADP substitué, tel que défini ci-dessus, avec une protéine à activité NDP kinase capable de phosphoryler le dérivé d'ADP en conduisant à un dérivé d'ATP dans lequel le groupe phosphate apporté par la protéine à activité NDP kinase est éventuellement marqué.
Ainsi, la NDP kinase fixe de façon covalente le groupement phosphate marqué des Cr'32p7 triphosphonucléotides.
L'utilisation de l'enzyme fixée à un support, par exemple couplée à des billes d'agarose permet d'éliminer après la réaction de marquage, les nucléotides donneurs par rinçages successifs des billes. Le phosphate marqué fixé à la protéine est ensuite transféré aux nucléosides diphosphates accepteurs.
La mise en oeuvre des dispositions qui précèdent permet notamment d'effectuer une substitution sélective en une position donnée du dérivé recherché, par exemple en position 2' sans avoir à recourir à la séparation des isomeres en positions 2' et 3' qui sont obtenus habituellement en opérant par voie chimique.
I1 est également possible d'obtenir des dérivés substitués de façon sélective en 2' et en 3', alors que les procédés chimiques classiques conduisent à 6 isomères ce qui rend les opérations de séparation difficiles.
En outre, selon un aspect de grand intérêt, le coût de la synthèse est réduit de manière sensible par rapport aux procédés chimiques utilisés jusqu'à présent, étant donné que la séparation d'isomères n'est plus nécessaire, les réactions de substitution sont réalisées en une seule étape, si l'on excepte l'introduction d'un groupe en position 3', lorsqu'on souhaite une substitution à cette position, avec des rendements allant jusqu'à 100 t.
Les dérivés d'adénosine phosphate substitués de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule:
dans laquelle
R1 et R2 , identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, un radical alcoyle, alcoxy, acyle, aryle, amino, azido, ester d'alcoyle,
R3 et R5 , identiques ou différents l'un de l'autre, sont choisis dans le groupe comprenant un atome d'halogène, un groupe alcoyle, alcoxy, acyle, une fonction azotée telle qu'azido, amino ou aminoaîcoyle,
R4 est un groupe amino,
R6 est un groupe di- ou triphosphate et comporte éventuellement un groupe marqueur.
dans laquelle
R1 et R2 , identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, un radical alcoyle, alcoxy, acyle, aryle, amino, azido, ester d'alcoyle,
R3 et R5 , identiques ou différents l'un de l'autre, sont choisis dans le groupe comprenant un atome d'halogène, un groupe alcoyle, alcoxy, acyle, une fonction azotée telle qu'azido, amino ou aminoaîcoyle,
R4 est un groupe amino,
R6 est un groupe di- ou triphosphate et comporte éventuellement un groupe marqueur.
L'invention vise également les applications biologiques des produits nouveaux de l'invention.
Ces applications comprennent l'utilisation des dérivés d'adénosine phosphates comme réactifs de laboratoire.
De tels réactifs présentent un intérêt tout particulier comme marqueurs de fluorescence, ou encore comme marqueurs d'affinité ou de photoaffinité, en permettant de réaliser des études de structure et de sites actifs. Ces réactifs sont marqués par exemple au 32P.
Les dérivés d'adénosine phosphate ainsi obtenus sont également utilisables comme ligands en chromatographie d'affinité. Dans cette application, ils sont fixés à un support, par exemple à de l'agarose. Ils permettent de purifier notamment les protéines qui se fixent à 1'ATP.
Une ou plusieurs substitutions spécifiques permettent d'augmenter l'affinité et la spécificité d'interaction pour une enzyme donnée, par exemple une cyclase de mammifères.
En ce qui concerne les moyens nouveaux mis en oeuvre pour l'obtention de ces dérivés d'adénosine phosphates, leur utilisation couvre plusieurs aspects de la chimie préparative ou analytique des nucléotides de l'adénine.
Ainsi 1'adényl cyclase tronquée, sous forme soluble ou immobilisée est utilisable notamment pour la synthèse de cAMP ou des analogues de cAMP en partant de 1'ATP ou des analogues correspondants de 1'ATP. Le coût du cAMP (environ 7 à 10 fois supérieur à celui de 1'ATP) justifie d'accorder la préférence au procédé enzymatique par rapport au procédé chimique utilisé actuellement.
L'adényl cyclase tronquée de l'invention permet également de séparer des dérivés d'adénosine phosphate substitués en 3' obtenus par synthèse chimique et souvent difficilement séparables de dérivés substitués en d'autres positions, notamment en 2'. Comme les dérivés substitués en 3' sont insensibles à l'action de l'adényl cyclase, il suffit de soumettre le mélange de dérivés substitués, notamment substitués en 2', d'une part et ceux substitués en 3' d'autre part à l'action de l'enzyme pour ensuite séparer le nucléoside triphosphate d'un nucléotide monophosphate cyclique.
Dans les applications qui précedent, ainsi que pour la synthèse des dérivés d'adénosine phosphate de l'invention, on utilise l'enzyme immobilisée, par exemple selon une technique classique sur Sepharose activé par CNBr, en opérant selon les procédés décrits dans la littérature. Le milieu de réaction tamponné à pH 8 (formation de cAMP) ou à pH 6 (synthese de 1'ATP et de ses dérivés) contient MgC12 (5-20mM), nucléotides (5-100mM), pyrophosphate (5-20mM) et glucose (10-100mM), ainsi que des concentrations catalytiques de 1'ADP, hexokinase et nucléotide diphosphate kinase (également immobilisés sur billes de Sepharose). Les nucléotides obtenus sont ensuite purifiés selon des procédés décrits dans la littérature.
I1 est en outre possible d'effectuer le dosage de cAMP, du pyrophosphate (PP) ou de la calmoduline ou dans des produits de synthèse ou milieux biologiques à l'aide de la réaction réverse. La sensibilité de cette méthode peut être augmentée par exemple soit par couplage avec d'autres enzymes comme les hexokinases et la pyruvate kinase, soit en utilisant les tests de bioluminescence.
Dans cette application, l'adényl cyclase est utilisée avantageusement sous forme soluble. La concentration du produit à doser varie entre 0,1 et 50 pM pour cAMP, entre 0,1 et 50pM pour PP et entre 0,1 et 20 nM pour la calmoduline.
On effectue plus spécialement le dosage à un pH voisin de la neutralité notamment supérieur à 7, en particulier de 7,4. La formation de NADPH est suivie par spechophotométrie ou fluorométrie.
Des concentrations standards sont par exemple: Tris-HC1 (pH 7,4) 50mM; KC1 20mM; MgC12 5mM; glucose lmM; NADP+ 0,7mM; cAMP 20mM; PP 5mM; calmoduline luM; adényl cyclase 0,îtLM; hexokinase et glucose 6phosphate déhydrogénique, chaque 2 unités.
Les applications des produits selon l'invention comprennent également l'élaboration, à partir de fragments de l'enchaînement de nucléotides de la figure 2, de sondes d'ARN, d'ARN-m ou d'ADN, pour la détection de séquences similaires dans d'autres organismes ou tissus.
Cette élaboration comprend, notamment, la dénaturation des séquences double brin pour obtenir une séquence monobrin utilisable en tant que sonde.
L'invention vise donc des sondes de détection caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'une séquence de nucléotides définie cidessus, d'ARN ou d'ADN, plus spécialement un fragment d'une séquence codant pour une protéine à activité NDP kinase.
Le fragment utilisé comme sonde comporte un nombre de nucléotides suffisant pour obtenir la spécificité requise et la formation d'un hybride stable.
Des sondes appropriées sont avantageusement marquées par un élément radio-actif (sondes chaudes) ou tout autre groupe non radio-actif (sondes froides) permettant la reconnaissance de la sonde à l'état hybridé avec la préparation renfermant 1'ADN à étudier.
Des dérivés d'adénosine phosphate dans lesquels le groupe phosphate est marqué en a sont particulièrement avantageux pour l'élaboration de sondes froides. Pour cette élaboration, on opte avantageusement comme décrit dans les brevets FR ne8413095 et ne8413096 du 22 août 1984, au nom de l'Institut Pasteur.
Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique renfermant des bactéries, ou directement avec ces bactéries ou leurs acides nucléiques, dans des conditions autorisant l'hybridation éventuelle de la séquence de nucléotides de la sonde avec une séquence complémentaire, éventuellement contenue dans le produit testé.
Ces sondes permettent de rechercher la présence de gènes homologues chez d'autres espèces par hybridation après transfert de Southern. Pour parvenir à détecter des séquences même relativement divergentes, on fait varier, de manière en soi connue, les conditions de force ionique des milieux d'hybridation et de rinçage. Ces conditions d'hybridation ont été énoncées plus haut.
On peut mettre en oeuvre la méthode d'hybridation sur taches (dot blot). Cette méthode comporte après dénaturation de l'ADN préalablement obtenu à partir de cellules exprimant une protéine à activité adényl cyclase ou NDP kinase selon l'invention, le dépôt d'une quantité aliquote de cet ADN sur des membranes de nitrocellulose, l'hybridation de chaque membrane dans les conditions usuelles avec la sonde et la détection, de manière classique, de l'hybride formé.
Dès lors que des séquences apparentées sont détectées, des clones sont isolés par hybridation hétérologue des banques d'ADNc construites dans des phages ou des plasmides.
L'invention fournit ainsi des outils permettant de détecter rapidement, avec une grande spécificité, des séquences similaires dans les gènes codant pour des protéines à activité NDP kinase, ce qui permet d'étudier l'origine et le mode d'action de ces NDP kinases.
Pour la mise en oeuvre des méthodes de détection considérées ci-dessus, basées sur l'utilisation de sondes nucléotidiques, on a recours avantageusement à des nécessaires ou kits comprenant: - une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon l'invention, - avantageusement, un milieu approprié respectivement à la formation d'une réaction d'hybridation entre la séquence à détecter et la sonde, - avantageusement des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre la séquence de nucléotides et la sonde lors de la réaction d'hybridation.
L'invention z invention vise également les applications immunologiques de l'adényl cyclase tronquée, plus spécialement pour l'élaboration d'immunsérums spécifiques polyclonaux et d'anticorps monoclonaux.
Les anticorps polyclonaux sont formés selon les techniques classiques par injection de la protéine à des animaux, récupération des antisérums, puis des anticorps à partir des antisérums par exemple par chromatographie d'affinité.
Les anticorps monoclonaux sont produits de manière habituelle en fusionnant des cellules de myélomes avec des cellules de rate d'animaux préalablement immunisés à l'aide des protéines de l'invention.
Les essais de toxicologie réalisés avec cette adényl cyclase en l'absence d'antigène protecteur ont démontré son absence de toxicité.
Des souris ont été immunisées avec différentes doses d'antigène (3 injections sous-cutanées à une semaine d'intervalle, de 250 1 d'antigène dans du tampon tris 10 mM pH 7 contenant 1 mg/ml d'Am---).
Les résultats obtenus montrent l'obtention d'une synthèse d'anticorps antiAC, après immunisation avec la protéine.
L'invention vise donc des compositions immunogènes à base des protéines définies ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutique. Ces compositions sont potentiellement capables de prévenir les infections provoquées notamment par B.anthracis,
B.pertussis, B.parapertussis et B.bronchiseptica et leurs effets toxiques chez l'homme et l'animal.
B.pertussis, B.parapertussis et B.bronchiseptica et leurs effets toxiques chez l'homme et l'animal.
L'invention vise également les applications immunologiques de la NDP kinase telle qu'obtenue selon l'invention.
Ces applications comprennent comme indiqué cidessus en rapport avec 1'adényl cyclase tronquée, l'élaboration d'immunsérums spécifiques polyclonaux et d'anticorps monoclonaux.Elles comprennent également l'élaboration de compositions immunogènes.
Les essais d'immunisation rapportés ci-dessus pour la protéine à activité adényl cyclase ont été également effectués avec la NDP kinase de l'invention et ont conduit à la formation d'anticorps.
Les compositions immunogènes définies ci-dessus sont utilisées aux doses et sous les formes d'administration habituelles, en particulier sous les formes classiques administrables par voie intranasale, orale ou parentérale.
Le cas échéant, les compositions renfermant la protéine à activité adényl cyclase sont associées à de la FHA et/ou de la PTx dans le même inoculum ou non.
Les préparations de FHA sont avantageusement obtenues, par exemple, selon la méthode de Sato et al. (15).
On indique ci-après, à titre d'exemples non limitatifs,
A) les matériels et les méthodes utilisés pour obtenir la protéine tronquée à activité adênyl cyclase,
B) les matériels et méthodes utilisés pour cloner et séquencer le gène d'une protéine à activité NDP kinase et pour exprimer cette protéine dans un hôte,
C) la synthèse de dérives d'ADP substitués.
A) les matériels et les méthodes utilisés pour obtenir la protéine tronquée à activité adênyl cyclase,
B) les matériels et méthodes utilisés pour cloner et séquencer le gène d'une protéine à activité NDP kinase et pour exprimer cette protéine dans un hôte,
C) la synthèse de dérives d'ADP substitués.
Les figures 1 et 2 auxquelles il est fait référence représentent: - la figure 1, la séquence de nucléotides codant pour 1'adényl cyclase de B.anthracis et, en correspondance, la séquence d'acides aminés de cette enzyme, - la figure 2, la séquence de l'ADNc codant pour une protéine a activité NDP kinase et, en correspondance, la séquence d'acides aminés de cette protéine.
Les références numériques données dans les exemples correspondent aux références bibliographiques mentionnées en fin de description.
EXEMPLE A: OBTENTION D'UNE PROTEINE TRONQUEE A
ACTIVITE ADENYL CYCLASE:
I- MATERNELS ET METHODES
L'origine des produits chimiques utilisés dans les exemples est indiquée ci-après:
Nucléotides d'adénine, enzymes de restriction,
ADN T4 ligase : BOEHRINGER SANNHEIM.
ACTIVITE ADENYL CYCLASE:
I- MATERNELS ET METHODES
L'origine des produits chimiques utilisés dans les exemples est indiquée ci-après:
Nucléotides d'adénine, enzymes de restriction,
ADN T4 ligase : BOEHRINGER SANNHEIM.
ADN polymérase (Sequenase) : USBC
Oîigodéoxyribonucléotides utilisés comme amorces dans le séquençage d'ADN : PHARMACIA
Enzymes de couplage et CaM (calmoduline) de cerveau de boeuf: Sigma 3'dATP, 8-BrATP, (8-bromo adénosine 5' triphosphate) 8-N3ATP (8-azidoadénosine 5' -triphosphate), EATP, (1
Né-éthénoadénosine-5'-triphosphate)GTP
Bleu-Sépharose, Ultrogel AcA 44, échangeur polytampon 94 et polytampon 96 : PHARMACIA LKB
Biotechnologies
[a32P]ATP (3000 Ci/mmol), [ H] cAMP (40 Ci/mmol) et (a35S) 2'dATP (1000 Ci/nlmol): Centre Amersham (GB)
[α P]3'dATP (5000 Ci/mmol) : NEN Research
Product.
Oîigodéoxyribonucléotides utilisés comme amorces dans le séquençage d'ADN : PHARMACIA
Enzymes de couplage et CaM (calmoduline) de cerveau de boeuf: Sigma 3'dATP, 8-BrATP, (8-bromo adénosine 5' triphosphate) 8-N3ATP (8-azidoadénosine 5' -triphosphate), EATP, (1
Né-éthénoadénosine-5'-triphosphate)GTP
Bleu-Sépharose, Ultrogel AcA 44, échangeur polytampon 94 et polytampon 96 : PHARMACIA LKB
Biotechnologies
[a32P]ATP (3000 Ci/mmol), [ H] cAMP (40 Ci/mmol) et (a35S) 2'dATP (1000 Ci/nlmol): Centre Amersham (GB)
[α P]3'dATP (5000 Ci/mmol) : NEN Research
Product.
.SOUCHES BACTERIENNES ET MILIEUX DE CROISSANCE
Deux souches de E.coli sont utilisées : JM105(1) et une souche déficiente en protéase (lon~)CAG 1139(2). Les bactéries sont cultivées sur milieu riche
LB de Miller (3). On atteint une DO600nm de 24 lorsque la culture est effectuée dans des conditions de fermenteur de 20 1. On ajoute de l'ampicilline à raison de 100 g/ml, si nécessaire.
Deux souches de E.coli sont utilisées : JM105(1) et une souche déficiente en protéase (lon~)CAG 1139(2). Les bactéries sont cultivées sur milieu riche
LB de Miller (3). On atteint une DO600nm de 24 lorsque la culture est effectuée dans des conditions de fermenteur de 20 1. On ajoute de l'ampicilline à raison de 100 g/ml, si nécessaire.
PROCEDES D'ANALYSE D'ADN
On génère des délétions unidirectionnelles dans le gène cya cloné dans M13mpl9 en utilisant le système "Cyclone" (IBI) en suivant les instructions du fabricant. La séquence nucléotidique est déterminée par une méthode de terminaison de chaîne au didéoxynucléotide modifiée en utilisant la Séquénase comme ADN polymérase (4).
On génère des délétions unidirectionnelles dans le gène cya cloné dans M13mpl9 en utilisant le système "Cyclone" (IBI) en suivant les instructions du fabricant. La séquence nucléotidique est déterminée par une méthode de terminaison de chaîne au didéoxynucléotide modifiée en utilisant la Séquénase comme ADN polymérase (4).
PURIFICATION D'ADENYL CYCLASE
70g de pâte congelée humide de bactéries sont mis en suspension dans 500ml de 50mM Tris-HCl (pH 8) et soumis à sonication à 20 KHZ et 100 watts (3 x 4 min). Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 12000 g pendant 20 min à 4 C.
70g de pâte congelée humide de bactéries sont mis en suspension dans 500ml de 50mM Tris-HCl (pH 8) et soumis à sonication à 20 KHZ et 100 watts (3 x 4 min). Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 12000 g pendant 20 min à 4 C.
. CHROMATOGRAPHIE SUR BLEU-SEPHAROSE
L'extrait bactérien est déposé sur une colonne de
Bleu-Sépharose (5 x 20 cm) équilibrée avec 50mM de
Tris-HCl (pH 8) à un débit de 400 ml/h. La colonne est lavée avec 5 volumes du même tampon pendant 5 h, puis les protéines sont éluées avec 0,5M de NaCl dans 50 mM de Tris-HCl (pH 8) et sont précipitées avec du sulfate d'ammonium solide (80% saturation).
L'extrait bactérien est déposé sur une colonne de
Bleu-Sépharose (5 x 20 cm) équilibrée avec 50mM de
Tris-HCl (pH 8) à un débit de 400 ml/h. La colonne est lavée avec 5 volumes du même tampon pendant 5 h, puis les protéines sont éluées avec 0,5M de NaCl dans 50 mM de Tris-HCl (pH 8) et sont précipitées avec du sulfate d'ammonium solide (80% saturation).
.CHRONIVTOFOCUSING
Après centrifugation à 10000 g pendant 10 min, les protéines précipitées sont redissoutes dans 25 mM de Tris-HCl (pH 9), puis on élimine les sels par gel filtration sur une colonne de Séphadex G25 équilibrée avec le même tampon. L'échantillon désalé est déposé sur une colonne échangeur polytampon 94 (1 x 50 cm) à raison de 20 mg de protéine/ml de gel gonflé et à un débit de 100 ml/h. Après lavage avec 250 ml de Tris HC1 25mM (pH 9) pendant une heure, on élue les protéines avec 450 ml de polytampon 96 dilué 10 fois, ajusté à pH 7 avec HC1 1N On recueille des échantillons de 5 ml à un débit de 30 ml/h. L'adényl cyclase est éluée entre pH 8,3 et 8,1. On rassemble les échantillons contenant l'adényl cyclase et on effectue une précipitation avec du sulfate d'ammonium solide (80%).
Après centrifugation à 10000 g pendant 10 min, les protéines précipitées sont redissoutes dans 25 mM de Tris-HCl (pH 9), puis on élimine les sels par gel filtration sur une colonne de Séphadex G25 équilibrée avec le même tampon. L'échantillon désalé est déposé sur une colonne échangeur polytampon 94 (1 x 50 cm) à raison de 20 mg de protéine/ml de gel gonflé et à un débit de 100 ml/h. Après lavage avec 250 ml de Tris HC1 25mM (pH 9) pendant une heure, on élue les protéines avec 450 ml de polytampon 96 dilué 10 fois, ajusté à pH 7 avec HC1 1N On recueille des échantillons de 5 ml à un débit de 30 ml/h. L'adényl cyclase est éluée entre pH 8,3 et 8,1. On rassemble les échantillons contenant l'adényl cyclase et on effectue une précipitation avec du sulfate d'ammonium solide (80%).
.CHROMTOGRAPHIE SUR ULTROGEL AcA 44
L'enzyme précipitée est redissoute dans 50 mM de
Tris-HCl (pH 7,4) et déposée sur une colonne de 1,5 x 120 cm d'Ultrogel AcA 44 équilibrée avec le même tampon. L'enzyme est éluée à un débit de 15 ml/h. On récupère des fractions de 3 ml. Les échantillons contenant de 1'adényl cyclase pure sont rassemblés et stockés à -20 C ou sont lyophilisés après une dialyse extensive contre 50 mM de bicarbonate d'ammonium.
L'enzyme précipitée est redissoute dans 50 mM de
Tris-HCl (pH 7,4) et déposée sur une colonne de 1,5 x 120 cm d'Ultrogel AcA 44 équilibrée avec le même tampon. L'enzyme est éluée à un débit de 15 ml/h. On récupère des fractions de 3 ml. Les échantillons contenant de 1'adényl cyclase pure sont rassemblés et stockés à -20 C ou sont lyophilisés après une dialyse extensive contre 50 mM de bicarbonate d'ammonium.
.PROCEDURE8 ANALYTIQUES
A moins d'indications contraires, l'activité de l'adényl cyclase est mesurée comme décrit dans (5) dans 100 p1 de milieu contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 8), 6 mM de MgC12, 0,1 mM de CaC12, 0,2 AM de CaM de cerveau de boeuf, 0,5 mg/ml d'albumine de sérum bovin, 0,1 mM de cAMP (104 cpm/essai) et 2 mM d'ATP (5 x cpm/essai). Une unité (1 U) d'activité adényl cyclase correspond à 1 pmol de cAMP formé dans 1 min à 30 C et pH 8.
A moins d'indications contraires, l'activité de l'adényl cyclase est mesurée comme décrit dans (5) dans 100 p1 de milieu contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 8), 6 mM de MgC12, 0,1 mM de CaC12, 0,2 AM de CaM de cerveau de boeuf, 0,5 mg/ml d'albumine de sérum bovin, 0,1 mM de cAMP (104 cpm/essai) et 2 mM d'ATP (5 x cpm/essai). Une unité (1 U) d'activité adényl cyclase correspond à 1 pmol de cAMP formé dans 1 min à 30 C et pH 8.
La séquence d'acides aminés de la partie Nterminale de la protéine purifiée est déterminée en utilisant le séquenceur de protéine automatisé de
APPLIED BIOSYSTEMS. L'électrophorèse sur gel de SDSpolyacrylamide est effectuée selon Laemmli(6).
APPLIED BIOSYSTEMS. L'électrophorèse sur gel de SDSpolyacrylamide est effectuée selon Laemmli(6).
II- RESULTATS .EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA PROTEINE CODEE PAR
LE GENE CYA TRONQUE DE B.ANTKRACIS dans E.coli
Un fragment EcoRI-BamHI de 3 kb provenant de pMMA86, codant pour le site cya est cloné dans
M13mpl9. On génère des délétions unidirectionnelles à partir du site EcoRI pour éliminer les séquences d'ADN en aval de l'extrémité 5' du gène cya. Les fragments d'ADN portant les différentes délétions sont récupérés par digestion par EcoRI-PstI de la forme réplicative du phage. Ces fragments sont sous-clonés dans pUC8 apportant ainsi l'expression du gène cya sous le contrôle du promoteur lac. Les clones portant les plasmides recombinants sont analysés pour étudier l'expression de l'adényl cyclase.
LE GENE CYA TRONQUE DE B.ANTKRACIS dans E.coli
Un fragment EcoRI-BamHI de 3 kb provenant de pMMA86, codant pour le site cya est cloné dans
M13mpl9. On génère des délétions unidirectionnelles à partir du site EcoRI pour éliminer les séquences d'ADN en aval de l'extrémité 5' du gène cya. Les fragments d'ADN portant les différentes délétions sont récupérés par digestion par EcoRI-PstI de la forme réplicative du phage. Ces fragments sont sous-clonés dans pUC8 apportant ainsi l'expression du gène cya sous le contrôle du promoteur lac. Les clones portant les plasmides recombinants sont analysés pour étudier l'expression de l'adényl cyclase.
L'un de ces clones, pMMA86, AcYa 19, exprime de manière significative de fortes quantités d'adényl cyclase (1 U/mg de protéine). Le séquençage d'ADN au site EcoRI de M13mpl9 Acya 19 indique que les 261 premiers codons du gène de l'adényl cyclase ont été éliminés, conduisant à un produit tronqué avec Pro 262 comme acide aminé N-terminal. La séquence N-terminale de l'enzyme purifiée est Asn-Ser-Pro-Asp-Met-Phe-Glu Tyr-Met-Asn-Lys -Leu-Glu-Lys -Gly-Gly-Phe-Glu. Les deux premiers résidus n'ont pas d'équivalent dans la protéine de type sauvage de B.anthracis. Ils résultent de la fusion de la séquence codant pour l'adényl cyclase à la séquence de nucléotide du polylinker
M13mpl9.La transformation de pMMA86 Acya 19 en une souche déficiente en protéase, CAG 1139, et la culture des bactéries dans un fermenteur de 20 1 augmente fortement la production d'adényl cyclase qui peut atteindre 20 U/mg de protéine.
M13mpl9.La transformation de pMMA86 Acya 19 en une souche déficiente en protéase, CAG 1139, et la culture des bactéries dans un fermenteur de 20 1 augmente fortement la production d'adényl cyclase qui peut atteindre 20 U/mg de protéine.
L'adényl cyclase tronquée de B.anthracis exprimée dans E.coli représente approximativement 2% des protéines totales bactériennes.
L'élution de l'enzyme liée au Bleu-Sépharose avec 0,5 M de NaCl conduit à une purification de 1'adényl cyclase de 8 fois avec un taux de récupération de 70%.
On obtient une protéine pratiquement pure par chromatofocusing entre pH 9 et pH 7, le pic de l'enzyme éluant à pH 8,2. La chromatographie par gel perméation dans 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4) a été utilisée pour éliminer le sulfate d'ammonium, l'ampholine et quelques contaminants de faible poids moléculaire. Dans le tableau qui suit, on a résumé les étapes de purification.
PURIFICATION D'ADENYL CYCLASE RECOMBINANTE DE B.ANTHRACIS
EXPRIMEE DANS E.COLIa
E T A P E PROTEINE ACTIVITE TOTALE ACTIVITE SPECIFIQUE RENDEMENT
( mol/min) ( mol/min,mg (%)
de protéine)
Extrait cellulaire 9800 206000 21 100 soluble
Chromatographie sur
Bleu-Sépharose 749 142000 190 69
Chromatofocusing 76 72200 950 35
Ultrogel AcA 44 44 45300 1020 22 a A partir de 70 g de cellules humides
L'adényl cyclase pure est stable à une concentration supérieure à 1 mg/ml pendant plusieurs semaines à -20 C. La lyophilisation de l'adényl cyclase n'altère pas ses propriétés catalytiques ce qui permet d'utiliser ce procédé pour un stockage à long terme ou pour d'autres études spectroscopiques.
EXPRIMEE DANS E.COLIa
E T A P E PROTEINE ACTIVITE TOTALE ACTIVITE SPECIFIQUE RENDEMENT
( mol/min) ( mol/min,mg (%)
de protéine)
Extrait cellulaire 9800 206000 21 100 soluble
Chromatographie sur
Bleu-Sépharose 749 142000 190 69
Chromatofocusing 76 72200 950 35
Ultrogel AcA 44 44 45300 1020 22 a A partir de 70 g de cellules humides
L'adényl cyclase pure est stable à une concentration supérieure à 1 mg/ml pendant plusieurs semaines à -20 C. La lyophilisation de l'adényl cyclase n'altère pas ses propriétés catalytiques ce qui permet d'utiliser ce procédé pour un stockage à long terme ou pour d'autres études spectroscopiques.
INTERACTION D'ADENYL CYCLASE TRONQUEE DE B.ANTHRACIS
AVEC CaM
L'adényl cyclase tronquée de B.anthracis est activée par CaM en présence et en l'absence de Ca2+.
AVEC CaM
L'adényl cyclase tronquée de B.anthracis est activée par CaM en présence et en l'absence de Ca2+.
L'affinité de la CaM de cerveau de boeuf pour l'adényl cyclase recombinante (Kd = 23 nM) est très proche de celle observée pour la protéine complète excrétée par B.anthracis dans les surnageants de culture (Kd = 26 nM). L'activité maximale de l'adényl cyclase recombinante à des concentrations saturantes d'ATP et de CaM, pH 8 et 30 C est de 1100 AmoVmin.mg de protéine, ce qui correspond à un kcatd'environ 1100s-1 Cette valeur est proche de celle calculée pour l'adényl cyclase purifiée de surnageants de culture de B.anthracis si l'on fait une correction de température (23 C contre 30 C).Dans des conditions expérimentales identiques, 1'adényl cyclase de
B.pertussis présente des valeurs de kcat entre 1700 et 2300
EXEMPLE B: CLONAGE DU GENE CODANT POUR UNE PROTEINE A
ACTIVITE NDP KINASE ET PROTEINE EXPRIMEE: I- MATERIEL8 ET METRODES
a- Matériels, phages et souches bactériennes:
On indique ci-après la provenance des matériaux et des produits utilisés, - filtres de nitrocellulose BA85: Schleicher et
Schuell (pour le criblage de la banque d'ADN de D.
B.pertussis présente des valeurs de kcat entre 1700 et 2300
EXEMPLE B: CLONAGE DU GENE CODANT POUR UNE PROTEINE A
ACTIVITE NDP KINASE ET PROTEINE EXPRIMEE: I- MATERIEL8 ET METRODES
a- Matériels, phages et souches bactériennes:
On indique ci-après la provenance des matériaux et des produits utilisés, - filtres de nitrocellulose BA85: Schleicher et
Schuell (pour le criblage de la banque d'ADN de D.
discoideum avec (35S)GTP, - disques colonie/plaque Screen pour le criblage avec les sondes d'ADNc, - membranes- de transfert par capillarité pour l'hybridation : Gene Screen Plus (Dupont-New England
Nuclear; E.U.), - disques en fibre de verre (GF/C) et papier de chromatographie d'échange d'ions DE81 : - GTP, GTPrS 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-D-galactopy- ranoside(X-Gal), isopropyl-8-D-thiogalactopyranoside (IPTG), lactate déhydrogénase et pyruvate kinase
BOEHRINGER MANNHEIM, - albumine de sérum bovin, benzamidine, PMSF, phosphoénolpyruvate, NADH, ATP et dTDP: Sigma; - Tween 20 : Merck, - enzymes de restriction et enzymes modifiant 1'ADN
BOEHRINGER MANNHEIM, AMERSHAM (UK) ou PROMEGA BIOTEC, - Mung bean nucléase :: PHARMACIA.
Nuclear; E.U.), - disques en fibre de verre (GF/C) et papier de chromatographie d'échange d'ions DE81 : - GTP, GTPrS 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-D-galactopy- ranoside(X-Gal), isopropyl-8-D-thiogalactopyranoside (IPTG), lactate déhydrogénase et pyruvate kinase
BOEHRINGER MANNHEIM, - albumine de sérum bovin, benzamidine, PMSF, phosphoénolpyruvate, NADH, ATP et dTDP: Sigma; - Tween 20 : Merck, - enzymes de restriction et enzymes modifiant 1'ADN
BOEHRINGER MANNHEIM, AMERSHAM (UK) ou PROMEGA BIOTEC, - Mung bean nucléase :: PHARMACIA.
Toutes les enzymes sont utilisées selon les recommandations du fabricant.
- ARNs de 0,16 à 1,77 kb utilisés comme marqueurs dans les empreintes Northern : BETHSEDA RESEARCH
Laboratories, - kit "Cyclone" utilisé pour les délétions unidirectionnelles des inserts à séquencer : IBI (New
Haven Connecticut, EUA), - t35S] GTPrS (1300 Ci/mmoles) :DUPONT-NEW ENGLAND
NUCLEAR (E.U.), - (r-32P)GTP(1O Ci/mmoles), [# ss]ATP(3000 Ci/mmoles), [α- P]ATP(3000 Ci/moles), [α- P]dcTP(3000 35
Ci/mmoles), la C S)dATPaS (supérieur à 400
Ci/mmoles): AMERSHAM, - système de marquage d'ADN à amorces multiples utilisés pour la synthèse des sondes selon (7) et kit de séquençage M13: AMERSHAM (GB).
Laboratories, - kit "Cyclone" utilisé pour les délétions unidirectionnelles des inserts à séquencer : IBI (New
Haven Connecticut, EUA), - t35S] GTPrS (1300 Ci/mmoles) :DUPONT-NEW ENGLAND
NUCLEAR (E.U.), - (r-32P)GTP(1O Ci/mmoles), [# ss]ATP(3000 Ci/mmoles), [α- P]ATP(3000 Ci/moles), [α- P]dcTP(3000 35
Ci/mmoles), la C S)dATPaS (supérieur à 400
Ci/mmoles): AMERSHAM, - système de marquage d'ADN à amorces multiples utilisés pour la synthèse des sondes selon (7) et kit de séquençage M13: AMERSHAM (GB).
#gt11 et les souches de E.coli, Y1088 et Y1090 sont décrites dans (8). La banque d'ADNc #gt11 a été construite à partir d'ARN poly(A+) isolé de cellules de Dictyostelium discoideum de la souche axénique AX3 qui a été carencée pendant 3 heures en présence de 1 mM de cAMP (9). La souche de E.coli XLl-Blue provient de Stratagène et les vecteurs M13mpl9 RF et pTZ18R proviennent de Pharmacia. L'oligonucléotide amorce utilisé pour le séquençage d'ARN et l'analyse de l'extrémité 5' présente la séquence : (5'
GCGATGATTTCACCAAC-3').
GCGATGATTTCACCAAC-3').
b- CRIBLAGE DE LA BANQUE DE XGTll PAR MARQUAGE
IN SITU AVEC r35S1GTP S
La banque d'ADNc (2,5 x 105pfu)) a été étalée en utilisant la souche de E.coli Y1090 et 2,3x104pfu, par boîtes de Pétri de 90 mm avec de l'agarose remplaçant l'agar dans le milieu L utilisé pour la couche supérieure. Après avoir effectué le test d'empreinte comme décrit dans (13), les botes sont transférées à 4 C pendant 30 min. Les filtres de nitrocellulose sont retirés et rincés 2 fois brièvement avec 50 mM de tampon Tris-HCl, pH 8 utilisé à 4 C et contenant 150 mM de NaCl et 0,5t de Tween 20.Ils sont ensuite incubés sous agitation ménagée soit 30 min. a température ambiante soit 14 heures à 4 C dans des botes de Pétri contenant 1,5 ml par filtre de tampon
A (50 mN HEPES, pH 8,1 mM, d'EDTA, 20 mM de MgC12, 100 mM de NaCl) avec 1 mM de DTT et 1 à 5 nM [35S]GTPγS 3 à 15 x 106 Cpm/ml de milieu d'essai). Les filtres sont ensuite transférés sur un support en verre frité de taille correspondante et lavés 4 fois avec 50 ml de tampon utilisé à 4 C (20 mM de tampon Tris-HCl, pH 8, contenant 100 mM de NaCl et 25 mM de MgC12).
IN SITU AVEC r35S1GTP S
La banque d'ADNc (2,5 x 105pfu)) a été étalée en utilisant la souche de E.coli Y1090 et 2,3x104pfu, par boîtes de Pétri de 90 mm avec de l'agarose remplaçant l'agar dans le milieu L utilisé pour la couche supérieure. Après avoir effectué le test d'empreinte comme décrit dans (13), les botes sont transférées à 4 C pendant 30 min. Les filtres de nitrocellulose sont retirés et rincés 2 fois brièvement avec 50 mM de tampon Tris-HCl, pH 8 utilisé à 4 C et contenant 150 mM de NaCl et 0,5t de Tween 20.Ils sont ensuite incubés sous agitation ménagée soit 30 min. a température ambiante soit 14 heures à 4 C dans des botes de Pétri contenant 1,5 ml par filtre de tampon
A (50 mN HEPES, pH 8,1 mM, d'EDTA, 20 mM de MgC12, 100 mM de NaCl) avec 1 mM de DTT et 1 à 5 nM [35S]GTPγS 3 à 15 x 106 Cpm/ml de milieu d'essai). Les filtres sont ensuite transférés sur un support en verre frité de taille correspondante et lavés 4 fois avec 50 ml de tampon utilisé à 4 C (20 mM de tampon Tris-HCl, pH 8, contenant 100 mM de NaCl et 25 mM de MgC12).
En variante, on lave les filtres 2 fois dans des bains par incubation 10 min. à 4 C dans 50 ml du même tampon.
c- CRIBLAGE DE LA BANQUE DE GT11 AVEC UNE
SONDE D'ADNc
La matrice utilisée pour la synthèse de la sonde d'ADNc de NDP kinase par la technique des amorces multiples (10) est constituée par le fragment de restriction XmnI-EcoRI de 399 paires de base du phage recombinant G821, sous-cloné dans le vecteur pTZ18R.
SONDE D'ADNc
La matrice utilisée pour la synthèse de la sonde d'ADNc de NDP kinase par la technique des amorces multiples (10) est constituée par le fragment de restriction XmnI-EcoRI de 399 paires de base du phage recombinant G821, sous-cloné dans le vecteur pTZ18R.
Ce fragment correspond à 72% de la séquence codante pour la protéine à activité NDP kinase.
d- SEQUENCAGE D'ADN
Les inserts d'ADNc provenant des clones de Agtll sont excisés par digestion avec EcoRI et insérés par ligation dans le vecteur pTZ18R ou dans la forme réplicative du phage M13mpl9.
Les inserts d'ADNc provenant des clones de Agtll sont excisés par digestion avec EcoRI et insérés par ligation dans le vecteur pTZ18R ou dans la forme réplicative du phage M13mpl9.
L'analyse de la séquence d'ADN a été réalisée selon la méthode au didéoxy de SANGER et al (11) modifiée pour l'utilisation avec [35S] d'ATPaS (12) et l'analyse de la séquence d'ARN a été effectuée selon la technique décrite par GELIEBTER et al dans (13), en utilisant comme amorce 1'oligonucléotide (51 GCGATGATTTCACCAAC-3') élaboré pour s'hybrider avec les nucléotides 91 à 107 de la séquence de l'ADNc codant pour la NDP kinase.
e- CONSTRUCTION DU PLASMIDE pNDPK UTILISE POUR
EXPRIMER LA NDPK DANS E.COLI
Un plasmide pNDK a été construit pour exprimer la protéine recombinante dans E.coli en utilisant le fragment HaeIII-EcoRI (540 pb) du clone obtenu par criblage de la banque d'expression avec le t35S]GTPl,S.
EXPRIMER LA NDPK DANS E.COLI
Un plasmide pNDK a été construit pour exprimer la protéine recombinante dans E.coli en utilisant le fragment HaeIII-EcoRI (540 pb) du clone obtenu par criblage de la banque d'expression avec le t35S]GTPl,S.
f - INCORPORATION DE r35Sl DANS Dp17 ET MESURE
DE L'ACTIVITE NDP KINASE
L'activité NDP kinase a été mesurée dans les extraits de bactéries transformées par pNDK en dosant 1'ADP formé au cours de la réaction par un test enzymatique couplé aux activités pyruvate kinaselactate déhydrogénase.
DE L'ACTIVITE NDP KINASE
L'activité NDP kinase a été mesurée dans les extraits de bactéries transformées par pNDK en dosant 1'ADP formé au cours de la réaction par un test enzymatique couplé aux activités pyruvate kinaselactate déhydrogénase.
II- RESULTATS
La détection des clones a été effectuée par marquage direct in situ avec t35S]GTPrS. En opérant comme décrit dans l-b, deux clones ont été isolés
G821 et G951.
La détection des clones a été effectuée par marquage direct in situ avec t35S]GTPrS. En opérant comme décrit dans l-b, deux clones ont été isolés
G821 et G951.
Les deux clones sélectionnés par le criblage fonctionnel contiennent un fragment identique de EcoRI de 680 nucléotides qui a été séquencé sur les deux brins après sous-clonage dans le site EcoRI du plasmide pTZ18R. Un cadre ouvert de lecture de 504 nucléotides a été trouvé précédé par une extrémité 5' de 136 nucléotides contenant de multiples codons d'arrêt et suivi par une extrémité 3' tronquée dépourvue de la queue poly (A). Le cadre ouvert de lecture démarre au codon ATG en position 137 suivi par un second ATG 12 codons en aval (voir figure 2 partie
B).
B).
Etant donné que la banque utilisée a été amplifiée une fois, les deux clones peuvent provenir du même ADNc primaire. La séquence a été confirmée sur des phages isolés indépendemment par criblage de la banque avec un large fragment de restriction
XmnI-EcoRI du clone G821 qui contient la majorité de la séquence codante. Plusieurs clones ont été choisis et purifiés (G7, G9 et G10). Ils contiennent tous la séquence complète 3' non traduite suivie par une extrémité poly (A) de longueur variable (25 à 70 nucléotides).
XmnI-EcoRI du clone G821 qui contient la majorité de la séquence codante. Plusieurs clones ont été choisis et purifiés (G7, G9 et G10). Ils contiennent tous la séquence complète 3' non traduite suivie par une extrémité poly (A) de longueur variable (25 à 70 nucléotides).
La détermination de la séquence de l'extrémité 5' de ces clones a montré que même les inserts les plus longs (clones G7 et G10) ne vont pas au-delà du second
ATG dans la séquence G821.
ATG dans la séquence G821.
La séquence de l'extrémité 5' a été déterminée par le séquençage de llARN-m.
Cette extrémité 5', longue de seulement 18 nucléotides, diverge de la séquence du clone G821 par un nucléotide en amont du second ATG du cadre ouvert de lecture.
Un seul produit majeur a été obtenu par extension de l'amorce correspondant à la taille du fragment d'ARN le plus long de la réaction de séquençage.
SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DE L'ADNc DE LA NDPK ET
SEQUENCE CORRESPONDANTE D'ACIDES AMINES
La séquence de 1'ADNc complet est représentée sur la figure 2, partie A.
SEQUENCE CORRESPONDANTE D'ACIDES AMINES
La séquence de 1'ADNc complet est représentée sur la figure 2, partie A.
La séquence correspondant à l'oligonucléotide utilisé pour le séquençage de 1'ARN et l'extension avec une amorce est soulignée. Les sites de phosphorylation potentiels par la protéine kinase C et les tyrosine kinases sont indiqués par des étoiles et un pointillé.
Dans la partie B, est représentée la séquence de l'extrémité 5' du clone primaire G821 résultant de la fusion artéfactuelle de deux ADNc et qui est utilisée pour construire le plasmide pNDK.
Le fragment qui diverge de 1'ADNc consensuel (partie A) est mentionné en italique un nucléotide en amont du codon d'initiation.
Le fragment HaeIII-EcoRI de l'insert du clone
G821 est utilisé pour construire le vecteur d'expression pNDK. Le site HaeIII est souligné.
G821 est utilisé pour construire le vecteur d'expression pNDK. Le site HaeIII est souligné.
La séquence nucléotidique entourant cet ATG est en accord avec la séquence consensus (ANNATGR) des codons d'initiation des eucaryotes avec un A en position-l, comme trouvé généralement pour les gènes de Dictyostelium.
Les deux autres ATG du cadre ouvert de lecture en position 256 et 298 sont en désaccord avec le consensus. Le codon venant apres le codon d'initiation code pour la sérine comme observé chez les levures pour au moins 50% des gènes fortement exprimés.
Le cadre ouvert de lecture code pour une protéine de 155 amino acides avec une Mr calculée de 16700 + 10%. Cette protéine (NPDK) est complètement dépourvue de résidus cystéine.
Sa taille et sa composition en acides aminés sont analogues à celles rapportées pour les monomères de
NDP kinase de levures ou de foie de rat obtenus par extraction (14).
NDP kinase de levures ou de foie de rat obtenus par extraction (14).
La protéine de Dictyostelium exprimée chez E.coli est très basique (pI calculé : 9,15) et contient un fragment hydrophobe (résidus 64 à 84).
IDENTIFICATION DE L'ACTIVITE NUCLEOSIDE DIPHOSPHATE
KINASE DANS DES EXTRAITS BACTERIENS
Afin de caractériser les propriétés biochimiques de la protéine NDPK, on a construit le plasmide pNDK exprimant la protéine dans E.coli.
KINASE DANS DES EXTRAITS BACTERIENS
Afin de caractériser les propriétés biochimiques de la protéine NDPK, on a construit le plasmide pNDK exprimant la protéine dans E.coli.
Après incubation des extraits bactériens avec 1OnM de C35S] GTPaS comme décrit dans la partie expérimentale, on observe un transfert covalent de [35S] aux protéines qui est dépendant de l'induction du promoteur lac par IPTG.
Les extraits de bactéries recombinantes montrent une incorporation thiophosphate proportionnelle au temps d'incubation jusqu'à 5 min à 15 C tandis que les extraits témoins (bactéries transformées avec le plasmide ne contenant pas d'insert) incorporent seulement des traces de [S35].
La formation d'ADP résultant du transfert de phosphates de 1'ATP à la dTDP démontre la présence d'une activité NDP kinase. Cette activité est fortement augmentée dans les extraits des bactéries exprimant la NDP kinase comparés aux extraits témoins.
ANALYSE SDS-PAGE DE L'INCORPORATION DE rS351
Pour caractériser la cible du marquage avec [353) dans les extraits bactériens, on réalise le SDS-PAGE avec des extraits préalablement incubés avec (35S] GTPaSN comme décrit plus haut. Une seule bande marquée de Mr correspondant à la NDP kinase est détectée dans les extraits de bactéries recombinantes. Elle correspond vraisemblablement à la formation de l'intermédiaire phospho-enzyme durant la réaction de la NDP kinase, expliquant pourquoi les clones ont été isolés par marquage avec [35S]GTPγS directement sur les répliques de filtre de la banque d'expression.
Pour caractériser la cible du marquage avec [353) dans les extraits bactériens, on réalise le SDS-PAGE avec des extraits préalablement incubés avec (35S] GTPaSN comme décrit plus haut. Une seule bande marquée de Mr correspondant à la NDP kinase est détectée dans les extraits de bactéries recombinantes. Elle correspond vraisemblablement à la formation de l'intermédiaire phospho-enzyme durant la réaction de la NDP kinase, expliquant pourquoi les clones ont été isolés par marquage avec [35S]GTPγS directement sur les répliques de filtre de la banque d'expression.
L'enzyme est purifiée à homogénéité en deux étapes. La suspension bactérienne est lavée par centrifugation. Le culot est repris dans 1 du volume
25 de la suspension initiale de tampon A : Tris 50 mM pH 8,5 contenant 20 mM de MgC12 et 1 mM de EDTA et les cellules sont cassées par sonication. Les débris bactériens sont éliminés par centrifugation et le surnageant est déposé sur une colonne de DEAE
Sephacel (Pharmacia). L'éluat est recueilli et déposé sur une colonne de résine Affigel-Blue (BioRad) rincée ensuite par 2 volumes de colonne de tampon A. La colonne est éluée par un gradient continu de NaCl, de 0 à 1 M NaCl. Le pic d'activité NDP kinase correspond à une seule bande protéique selon analyse sur gel de polyacrylamide à 12% - SDS coloré au nitrate d'argent.
25 de la suspension initiale de tampon A : Tris 50 mM pH 8,5 contenant 20 mM de MgC12 et 1 mM de EDTA et les cellules sont cassées par sonication. Les débris bactériens sont éliminés par centrifugation et le surnageant est déposé sur une colonne de DEAE
Sephacel (Pharmacia). L'éluat est recueilli et déposé sur une colonne de résine Affigel-Blue (BioRad) rincée ensuite par 2 volumes de colonne de tampon A. La colonne est éluée par un gradient continu de NaCl, de 0 à 1 M NaCl. Le pic d'activité NDP kinase correspond à une seule bande protéique selon analyse sur gel de polyacrylamide à 12% - SDS coloré au nitrate d'argent.
La composition globale en acides aminés correspond exactement à celle de la séquence d'acides aminés représentée sur la figure 2.
EXEMPLE C : PREPARATION DE 2'-ANTHRANILOYL-ADP (ANT ADP), A PARTIR DE 2' -ANTHRANILOYL-cAMP (ANT-cAMP):
Le milieu de réaction contient : Na2pyrophosphate (pH 6,5) 10 mM, Ant-cAMP 8 mM, MgC12, 8 mM, glucose 15 mN, ADP 0.1 mM, hexokinase (5U/ml), nucléoside diphosphate kinase (5U/ml), calmoduline 0,1 SM, adénylate cyclase (5U/ml). La disparition de Ant-cAMP et la formation de nucléoside diphosphate correspondant est suivie par chromatographie en couche mince sur cellulose microcristalline ou PEI-cellulose.
Le milieu de réaction contient : Na2pyrophosphate (pH 6,5) 10 mM, Ant-cAMP 8 mM, MgC12, 8 mM, glucose 15 mN, ADP 0.1 mM, hexokinase (5U/ml), nucléoside diphosphate kinase (5U/ml), calmoduline 0,1 SM, adénylate cyclase (5U/ml). La disparition de Ant-cAMP et la formation de nucléoside diphosphate correspondant est suivie par chromatographie en couche mince sur cellulose microcristalline ou PEI-cellulose.
Le nucléoside diphosphate formé (Ant-ADP) est ensuite purifié par des méthodes conventionnelles telles que la précipitation avec éthanol et sels de Ba2+ ou la chromatographie sur échangeurs d'ions.
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Claims (19)
1. Procédé de synthèse de dérivés d'adénosine phosphate, caractérisé en ce qu'on soumet un .dérivé d'AMP cyclique, ou cAMP, substitué par le ou les groupes souhaités pour le dérivé d'adénosine recherché, la position 3' étant bloquée par la cyclisation, à l'action d'une protéine à activité adényl cyclase, et qu'on soumet les dérivés d'ATP substitués obtenus, à l'action d'une protéine à activité nucléoside diphosphate kinase (ou NDP kinase) couplée à un système consommateur de groupe phosphate, tel qu'une hexokinase, et qu'on récupère les dérivés d'ADP substitués formés.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dérivé de cAMP comprend en position 2' un groupe alcoyle, alcoxy, acyle, aryle, amino ou azido, ester d'alcoyle et/ou en position 6 un groupe amino et/ou en position 8 et/ou 6 un atome d'halogène, un groupe alcoyle, acyle, alcoxy, aryle ou une fonction azotée telle qu'un groupe azido, amino ou amino alcoyle.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dérivés de cAMP mis en oeuvre sont obtenus par synthèse chimique à partir de cAMP.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la catalyse par la proteine à activité adényl cyclase est réalisée avantageusement à un pH entre 6 et 8, plus particulièrement de l'ordre de 6.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la protéine à activité adényl cyclase mise en oeuvre est comprise dans la séquence d'acides aminés donnée dans la figure 1.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la protéine à activité adényl cyclase mise en oeuvre est un dérivé de délétion par rapport à la séquence de la figure 1, et en particulier est dépourvue d'une séquence dans la partie N-terminale qui n'intervient pas de manière fondamentale dans l'activité adényl cyclase, plus spécialement d'une séquence de 261 acides aminés à l'extrémité N-terminale.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que pour disposer de dérivés d'adénosine phosphate substitués en position 3', on introduit le groupe de substitution souhaité sur le dérivé d'ATP obtenu à l'issue de la réaction avec la protéine à activité adényl cyclase.
8. Procédé de synthèse de dérivés d'adénosine phosphate, caractérisé en ce qu'on fait réagir un dérivé d'ADP substitué tel qu'obtenu selon le procédé de la revendication 1, avec une protéine à activité NDP kinase capable de phosphoryler le dérivé d'ADP en conduisant à un dérivé d'ATP dans lequel le groupe phosphate apporté par la protéine à activité NDP kinase est éventuellement marqué.
9. Dérivés d'adénosine phosphate caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule:
dans laquelle
R1 et R2, identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, un radical alcoyle, alcoxy, acyle, aryle, amino, azido, ester d'alcoyle,
R3 et Rg identiques ou différents 1'un de l'autre, sont choisis dans le groupe comprenant un atome d'halogène, un groupe alcoyle, alcoxy, acyle, une fonction azotée telle qu'azido, amino ou aminoalcoyle,
. R4 est un groupe amino,
. R6 est un groupe di- ou triphosphate et comporte éventuellement un groupe marqueur.
10. En tant que produits nouveaux les dérivés de cAMP mis en oeuvre dans le procédé selon 1'une quelconque des revendications 1 à 3, en particulier les dérivés de cAMP substitués en position 2' ou 3' par un groupe azido.
11. Protéine à activité adényl cyclase caractérisée en ce qu'elle répond à l'enchaînement d'acides aminés de la figure 1, mais est dépourvue d'une séquence dans la partie N-terminale n'intervenant pas de manière fondamentale dans l'activité adényl cyclase, en particulier des 261 acides aminés à l'extrémité N-terminale.
12. Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle porte l'information pour la synthèse de la protéine selon la revendication 11.
13. Proteine à activité NDP kinase telle qu'obtenue par clonage du gène codant pour la NDP kinase de Dictyostelium discoideum et purification de la protéine synthétisée.
14. Protéine selon la revendication 13, caractérisée par l'enchaînement de 155 acides aminés représenté sur la figure 2.
15. Séquence de nucléotides constituée par au moins une partie d'une séquence codant pour une protéine à activité NDP kinase telle que synthétisée par D.discoideum.
16. Séquence de nucléotides capable de s'hybrider avec des gènes codant pour une protéine à activité NDP kinase.
17. Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle est capable de s'hybrider avec une sonde formée & partir de la séquence présentant l'enchaînement de nucléotides représenté sur la figure 2 ou l'enchaînement des nucléotides complémentaires de cette séquence.
18. Application des dérivés d'adénosine phosphate selon la revendication 9 comme réactifs de laboratoire.
19. Application de la protéine i activité adényl cyclase selon la revendication 11, pour la synthèse de cAMP ou d'analogues de cAMP en utilisant 1'ATP comme produit de départ, pour la séparation des dérivés de 1'ATP substitués, de dérivés substitués en 3' .
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EP0272174A2 (fr) * | 1986-11-17 | 1988-06-22 | Institut Pasteur | Préparations d'adenyl cyclase purifiées, procédé d'obtention de ces préparations et leurs applications biologiques |
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EP0498838A1 (fr) | 1992-08-19 |
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