KR20090023489A

KR20090023489A - 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법 및 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물

Info

Publication number: KR20090023489A
Application number: KR1020097000867A
Authority: KR
Inventors: 에미 이시마루; 히로카즈 사나다; 히로노리 오무라; 히데키 요시오카; 슈헤이 츠카모토; 미노루 마스다
Original assignee: 이케다 쇼쿠겐 가부시키가이샤; 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 2006-06-22
Filing date: 2007-06-22
Publication date: 2009-03-04
Also published as: EP2039765A4; CA2655890A1; US8945864B2; EP2039765B1; WO2007148797A1; ES2372879T3; CN101522895A; AU2007261942A1; JP5222139B2; US20100173343A1; EP2039765A1; JPWO2007148797A1

Abstract

본 발명의 목적은, (a) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질; (b) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 혹은 수 개의 아미노산이 결실(缺失), 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질; 또는 (c) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에 대해 적어도 60%의 배열 상동성을 가지는 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질을 이용하는 것을 특징으로 하는 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법을 제공하는 것이다.

Description

1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법 및 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물 {METHOD FOR DETERMINATION OF 1,5-ANHYDROGLUCITOL, AND REAGENT COMPOSITION FOR DETERMINATION OF 1,5-ANHYDROGLUCITOL}

본 발명은, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법 및 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물에 관한 것이다.

본원은, 2006년 6월 22일에, 일본에 출원된 특허 출원2006-172619호에 의거하여 우선권을 주장하며, 그 내용을 여기에 원용한다.

1,5-안하이드로글루시톨(이하, 1,5-AG로 기재함.)은, 포도당의 1위(位)에서의 환원체로서, 생체 내에 미량 존재하고 있다. 이 1,5-AG는, 당뇨병의 컨트롤 마커로서 유용한 것이 발견되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 1, 2 참조.).

비특허문헌 1에 기재되어 있듯이, 1,5-AG는, 혈당값과 헤모글로빈 A1c(HbA1c)의 중간에 위치하는 마커로서, 경증(輕症) 당뇨병 환자의 자기 관리에 적당하다고 생각된다.

[표 1]

비특허문헌 2에 개시되어 있듯이, 정상인의 1,5-AG값은, 혈중에서는 글루코오스에 이어 많은 단당(單糖) 성분이고, 일본인에서 실시된 임상 시험에 의하면, 1,5-AG값의 평균값은 24.6±7.2(mean±SD)㎍/mL이다. 개인의 생리적 변동폭은 작고, 일내(日內) 및 일간(日間) 변동에 의한 영향을 거의 받지 않는다. 일반적으로, 남성이 여성보다 약간 높은 값을 나타내는 경향이 있다. 정상인의 95%가 정상이라고 판정되는 cut off 값은, 약 14.0㎍/mL로 되어 있다.

종래, 1,5-AG의 측정 방법으로서는, 비특허문헌 1에 기재되어 있듯이, 가스크로마토그래피법과 효소법이 알려져 있다. 효소법은, 혈장(혈청) 검체(檢體) 0.2mL을 제단백(除蛋白) 후, 또한 미니 컬럼을 통해 협잡물을 제거한다. 그 다음으로 피라노스 옥시다아제(pyranose oxidase; 이하, PROD로 기재함.)를 작용시켜 1,5-AG의 2위의 수산기의 산화 반응에 의해 발생한 과산화수소를 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP)를 이용하여 발색시켜, 420㎚에서 흡광도를 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 이 효소법에 근거하는 혈액 전용의 측정 키트가, 개발되고 있다.

[비특허문헌 1: 가와이 아츠오, 아카누마 야스오, "1,5-안하이드로글루시톨", 임상 검사 vol. 33 no.8 1989년 8월 901~907]

[비특허문헌 2: 「Medical Technology」임시증간호 2002 Vol.30 No.13(임시증간호) 당뇨병 검사의 모든 것 스크리닝으로부터 합병증의 검사까지 pp. 1498-1499(의치약 출판 주식회사)]

[발명이 해결하고자 하는 과제]

그러나, 종래의 효소법에 의한 1,5-AG 측정에서 이용되고 있던 PROD는, 글루코오스에의 작용성이 높으므로, 고정밀한 1,5-AG측정을 행하기 위해서는, 혈중에 다량으로 존재하는 글루코오스(혈당)를 소거해야 하는 문제가 있다.

이 PROD에 대신하여, 글루코오스에의 작용성이 낮은 1,5-AG 산화효소(탈수소효소)를 이용함으로써, 1,5-AG의 측정이 보다 간편해지고, 측정 정밀도의 향상, 측정 시간의 단축을 도모하는 것이 가능하기 때문에, 이러한 효소를 이용한 1,5-AG의 측정 방법의 제공이 갈망되고 있었다.

본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어지고, 검체 중의 1,5-AG 값을 측정할 때에, 방해 물질의 영향이 적고, 종래법보다 고정밀하게 1,5-AG값을 측정할 수 있는 1,5-AG 측정 방법 및 1,5-AG 측정 시약 조성물의 제공을 목적으로 한다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은, 이하의 양태를 제공한다.

[1] (a) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질;

(b) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 혹은 수 개의 아미노산이 결실(缺失), 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질; 또는

(c) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에 대해 적어도 60%의 배열 상동성(相同性)을 가지는 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질:

을 이용하는 것을 특징으로 하는 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.

[2] 상기 단백질이, 시노라이조비움(Sinorhizobium)속(屬)에 속하는 균 유래인, [1]에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.

[3] 상기 단백질이, 시노라이조비움 에스피. 97507(Sinorhizobium sp. 97507)(수탁 번호: FERM P-19428) 유래인, [1] 또는 [2]에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.

[4] 상기 단백질의 소르보스에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 상기 단백질의 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성이 10% 이상인, [1]~[3] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.

[5] 상기 단백질의 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 상기 단백질의 D-글루코오스에 대한 반응성이 10% 이하인, [1]~[4] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.

[6] 상기 단백질을, 발색 기질의 존재하에서, 시료 중의 1,5-안하이드로글루시톨에 작용시킴으로써 반응한 발색 기질의 양을 측정하는, [1]~[5] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.

[7] 상기 단백질을 시료 중의 1,5-안하이드로글루시톨에 작용시키기 전에, 시료 중의 D-글루코오스를 미리 제거하는, [1]~[6] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.

[8] 상기 단백질을, 발색 기질 및 전자 캐리어의 존재하에서, 시료 중의 1,5-안하이드로글루시톨에 작용시키는, [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.

[9] 1,5-안하이드로글루시톨을 기질로 하여 측정했을 경우의 상기 단백질의 효소 활성을 기본 단위로 하여, 시료 1mL당, 1~500 단위가 되도록 상기 단백질을 첨가하는, [1]~[8]에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.

[10] 시료 중의 1,5-안하이드로글루시톨에 작용시키기 전에, 상기 단백질을, 전자 캐리어를 이용해 활성화하는, [1]~[9] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.

[11] (a) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질;

(b) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 혹은 수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질; 또는

(c) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에 대해 적어도 60%의 배열 상동성을 가지는 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질:

을 함유하는 것을 특징으로 하는 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.

[12] 상기 단백질이, 시노라이조비움(Sinorhizobium)속에 속하는 균 유래인, [11]에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.

[13] 상기 단백질이, 시노라이조비움 에스피. 97507(Sinorhizobium sp. 97507)(수탁 번호: FERM P-19428) 유래인, [11] 또는 [12]에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.

[14] 상기 단백질의 소르보스에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 상기 단백질의 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성이 10% 이상인, [11]~[13] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.

[15] 상기 단백질의 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 상기 단백질의 D-글루코오스에 대한 반응성이 10% 이하인, [11]~[14] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.

[16] 상기 단백질이, 전자 캐리어를 이용하여 활성화된 것인, [11]~[15] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.

[17] 상기 전자 캐리어가, 페나진 메토설페이트 및 1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸설페이트 중 적어도 일종인, [16]에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.

[18] 상기 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물이, 또한, 발색 기질을 함유하는, [11]~[17] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.

[19] 또한, 전자 캐리어를 함유하는 상기 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약조성물로서, 상기 발색 기질이 환원성 발색 기질인, [18]에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.

[20] (a) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질;

(b) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 혹은 수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성이 10% 이상인 단백질; 또는

(c) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에 대해 적어도 85%의 배열 상동성을 가지는 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성이 10% 이상인 단백질.

[21] [11]~[19] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물을 이용하여 당뇨병을 진단하는 방법.

[22] [10]~[19] 중 어느 하나에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물의 1,5-안하이드로글루시톨의 측정에의 사용.

[23] (a) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질;

의 1,5-안하이드로글루시톨의 측정에의 사용.

[발명의 효과]

본 발명에 의하면, 검체 중의 1,5-AG값을 측정할 때에, 방해 물질의 영향이 적고, 종래법보다 고정밀하게 1,5-AG값을 측정할 수 있는 1,5-AG 측정 방법 및 1,5-AG 측정 시약 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 1,5-AG 측정 방법 및 1,5-AG 측정 시약 조성물에 의하면, 혈장, 혈청, 수액(髓液), 소변 등의 임상 검체에 적용하는 것이 가능하고, 신속, 또한, 간편하게 검체 중의 1,5-AG의 정량, 검출을 가능하게 할 수 있다. 또, 작은 스케일에 의한 측정도 가능하며, 임상 검사에서 범용되고 있는 전자동 생화학 검사 분석 장치 등에서도, 고정밀하고 고감도인 1,5-AG의 검출, 정량을 실현할 수 있다.

도 1은 실시예 1에서, 소르보스 디하이드로게나아제의 제조에 이용한 플라스미드 pUCNNT2의 구축 순서의 전반의 공정을 나타내는 개략도이다.

도 2는 도 1의 구축 순서의 후반의 공정을 나타내는 개략도이다.

도 3은 실시예 1에서, 제조한 소르보스 디하이드로게나아제의 최적 pH의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 실시예 1에서, 제조한 소르보스 디하이드로게나아제의 pH 안정성의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 실시예 1에서, 제조한 소르보스 디하이드로게나아제의 최적 온도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 실시예 1에서, 제조한 소르보스 디하이드로게나아제의 온도 안정성의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 실시예 1에서 작성한 검량선을 나타내는 그래프이다.

도 8은 실시예 2에서, 소르보스 디하이드로게나아제의 제조에 이용한 플라스미드 pUCpTrcAGD1의 구축 순서의 공정을 나타낸 개략도이다.

도 9는 실시예 2에서 작성한 검량선을 나타내는 그래프이다.

도 10은 실시예 3에서, 실시예 2에서 제조한 소르보스 디하이드로게나아제를 이용한 임상 검체의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명의 1,5-AG의 측정 방법은, (a) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질; (b) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 혹은 수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질; 또는 (c) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에 대해 적어도 60%의 배열 상동성을 가지는 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질을 이용하는 것을 특징으로 한다.

이하, 상기 단백질을 소르보스 디하이드로게나아제로 표기한다.

본 발명의 측정 방법에서 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제는, 이하의 이화학적 성질을 가지는 것이 바람직하다.

(1) 최적 pH: 약 8.0. 다만 6.3~9.1의 범위에서 50% 이상의 활성을 나타낸다.

(2) pH 안정성: 40℃, 15분 처리 후, pH 5.9~8.6 사이에서 안정하다.

(3) 최적 온도: pH 7.0 완충액 중, 최적 온도가 60℃ 부근이다.

(4) 온도 안정성: pH 7.0 완충액 중, 45℃, 10분간 처리 후에도 77% 이상의 잔존 활성을 가지고, 약 45℃ 이하에서 안정하다.

(5) 기질 특이성 및 Km값: 기질로서 1,5-AG 및 L-소르보스에 강하게 작용하고, D-갈락토오스, D-글루코오스 등의 당에 대해 거의 작용하지 않거나, 또는 약하게 작용한다. Km값은, 1,5-AG에 대해 82.5mM 정도, L-소르보스에 대해 65.6mM 정도이다.

(6) 분자량 및 서브유닛 분자량: 총 분자량은 약 150kDa 및 약 672kDa 정도, 서브유닛 분자량 약 59.6 kDa 정도.

(7) 저해제 특이성: 중금속 이온(Mn²⁺, Hg²⁺, Cu²⁺)으로 강하게 저해된다.

(8) L-소르보스에 작용하여, L-소르보손을 생성한다.

(9) 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)를 보효소(補酵素)로 한다.

본 발명의 측정 방법에서 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제는, 본 명세서에 기재된 특징을 가지는 한, 그 기원, 제법 등은 특별히 한정되지 않고, 천연 단백질, 유전자 공학적인 수법에 의해 재조합 DNA로부터 발현시킨 단백질, 혹은 화학 합성 단백질 중 어느 것이어도 된다. 특히, 본 발명의 측정 방법에서 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제는, 시노라이조비움(Sinorhizobium)속에 속하는 균 유래인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 시노라이조비움 에스피. 97507(Sinorhizobium sp. 97507) (수탁 번호: FERM P-19428) 또는 시노라이조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti(바람직하게는 스트레인 1021; Strain 1021)) 유래, 가장 바람직하게는, 시노라이조비움 에스피. 97507(Sinorhizobium sp. 97507)(수탁 번호: FERM P-19428) 유래이다.

여기에서, 「유래이다」란, 상기의 균이 가지는 소르보스 디하이드로게나아제 유전자에 코드되는 단백질을 의미하고, 그 균체로부터 직접 추출한 것, 유전자 공학적 수법에 의해 발현시킨 것, 화학적으로 합성한 것 등, 그 제조 방법은 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 측정 방법에서 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제의 유전자 공학적 수법을 이용한 제조 방법의 일례를, 이하에 설명한다.

(DNA의 추출)

시노라이조비움 에스피. 97507(Sinorhizobium sp. 97507)(FERM P-19428)의 균체를, 초음파 처리나 용균 효소 처리로 세포벽의 파괴를 실시한 후, 페놀 등으로 DNA를 추출하고, 염석(鹽析) 및 에탄올 침전 등으로 DNA의 회수를 행한다.

(PCR)

상기와 같이 추출한 시노라이조비움 에스피. 97507(Sinorhizobium sp. 97507)(FERM P-19428) 유래 DNA를 주형(template)으로 하고, 또 소르보스 디하이드로게나아제 유전자의 염기 배열을 바탕으로 작성한 복수의 프라이머를 이용하여, PCR를 실시하여, 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 증폭시킨다. 얻어진 PCR 산물은, 아가로스 겔 전기 영동 등에 의해 정제하고, 아가로스 겔로부터 소르보스 디하이드로게나아제 유전자 DNA를 추출한다.

(재조합 벡터의 제작)

재조합 벡터 제작용 발현 벡터는, 발현시키는 단백질이 그대로의 형태로 생산되는 것, 혹은 그 N말단 또는 C말단에 히스티딘 태그가 부가된 형태로 생산되는 것, 혹은 N말단 또는 C말단에 말토오스 결합 단백질이나 GST펩티드가 융합된 형태로 생산되는 것 등으로부터, 적절히 선택된다. 재조합 벡터는, 발현 벡터와 상기 PCR로 얻어진 소르보스 디하이드로게나아제 유전자 DNA를, 예를 들면 NcoI, HindIII 등의 동일한 제한 효소를 이용하고 절단한 후, 효소 유전자 DNA를 벡터에 라이게이션(ligation)함으로써 제작할 수 있다.

또한, 발현 벡터는, 시판품을 이용할 수 있지만, 해당 시판의 플라스미드 벡터의 특정 부위를 치환하여 안정화한 것을 이용하는 것이 보다 바람직하다.

또, 상술한 바와 같이, 본 발명의 측정 방법에서 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제는, (a) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질; (b) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 혹은 수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질; 또는 (c) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에 대해 적어도 60%(60%~100%)의 배열 상동성을 가지는 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질을 이용하는 것을 특징 으로 하지만, 그 상동성에 대해서는, 바람직하게는 65% 이상(65%~100%), 보다 바람직하게는 75% 이상(75%~100%), 더욱 바람직하게는 85% 이상(85%~100%)이다.

이들 아미노산 배열의 상동성을 고려하면서, 또한, 제조되는 재조합형 소르보스 디하이드로게나아제가 본 발명의 목적을 달성하는 한에서, 상기 발현 벡터에 삽입된 소르보스 디하이드로게나아제 유전자 코드 영역에, Kunkel법 등의 공지의 염기 치환 기술을 이용하는 부위 특이적 돌연 변이에 의해 아미노산의 치환, 부가, 결실 등의 조작을 실시해도 되고, 또 에러-프론(error-prone) PCR법 등 공지의 염기 치환 기술을 이용하는 랜덤 변이에 의해 아미노산의 치환, 부가, 결실 등의 조작을 실시해도 된다. 또한, 복수종의 박테리아 등으로부터 단리(單離)한 소르보스 디하이드로게나아제 유전자에 대해, DNA 셔플링 등의 공지 기술에 의해, 보다 우위한 성상(性狀)을 가지는 소르보스 디하이드로게나아제를 제조하는 것도 상정(想定)된다.

또한, 본 발명에서 「상동성」이라는 말은, 2 이상의 유전자 배열의 서로에 대한 동일성의 정도를 가리킨다. 따라서, 어떤 2개의 유전자의 상동성이 높을수록, 그들의 배열의 동일성 또는 유사성은 높다. 2종류의 유전자가 상동성을 가지는지 여부는, 배열의 직접적인 비교에 의해, 또는 핵산의 경우에는 스트린젠트(stringent)한 조건하에서의 하이브리디제이션(hybridization)법에 따라 조사할 수 있다.

(형질전환체의 제작)

상기 소르보스 디하이드로게나아제 유전자가 삽입된 재조합 벡터의 숙주 세 포로의 도입(형질전환(형질이입))은 종래 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 세균(E. coli, Bacillus subtilis 등)의 경우에는, 예를 들면 Cohen 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 제69권, 제2110페이지, 1972년), 프로토플라스트(protoplast)법(Mol. Gen. Genet., 제168권, 제111페이지, 1979년)이나 컴피턴트(competent)법(저널·오브·몰레큘라·바이올로지(J. Mol. Biol.), 제56권, 제209페이지, 1971년)에 의해, 효모(Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris 등)의 경우는, 예를 들면 하이넨(Hinnen) 등의 방법(Proc. Natl. Acad. USA., 제75권, 제1927페이지, 1978년)이나 리튬법(J. Bacteriol., 제153권, 제163페이지, 1983년)에 의해, 동물세포의 경우에는, 예를 들면, 그라함(Graham)의 방법(바이롤로지(Virology), 제52권, 제456페이지, 1973년)에 의해, 곤충 세포의 경우는, 예를 들면, 서머즈(Summers) 등의 방법(Mol. Cell. Biol, 제3권, 제2156~제2165페이지, 1983년)에 의해 각각 형질전환할 수 있다. 또한, 형질전환은, 상기 재조합 벡터에 의해 발현시킬 필요는 없고, 예를 들면, 본 발명에 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 숙주 세포의 염색체 DNA에 직접 삽입하여, 발현시키는 수단을 이용해도 된다. 본 발명에서는, 취급이 용이하고, 비교적 단시간에 대량의 재조합 단백질을 제조하는 것이 가능한 점에서, 세균 및 효모를 숙주로 하는 것이 바람직하고, 에쉐리치아(Escherichia)속에 속하는 미생물을 숙주로 하는 것이 보다 바람직하다.

(소르보스 디하이드로게나아제의 발현, 채취)

본 발명의 측정 방법에서 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제는, 상기와 같이 조제된 발현 벡터를 포함하는 형질전환 세포를 영양 배지에서 배양하고, 발현된 소르보스 디하이드로게나아제를 채취함으로써 얻을 수 있다. 영양 배지는, 숙주 세포(형질전환체)의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원 혹은 유기 질소원을 포함하는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예를 들면 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당, 메탄올 등이 예시된다. 무기 질소원 혹은 유기 질소원으로서는, 예를 들면, 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘 스팁·리커(corn steep liquor), 펩톤, 카제인, 고기 엑스(meat extract), 콩깻묵, 감자 추출액 등이 예시된다. 또, 소망에 의해 다른 영양소(예를 들면, 무기염(예를 들면, 염화나트륨, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류, 항생 물질(예를 들면 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등) 등)을 포함해도 된다. 배양은, 당업계에서 알려져 있는 방법에 의해 행해진다. 배양 조건, 예를 들면 온도, 배지의 pH 및 배양 시간은, 상기 소르보스 디하이드로게나아제가 대량으로 생산되도록 적절히 선택된다.

상기와 같이, 상기 소르보스 디하이드로게나아제를 발현시킨 미생물 등의 숙주 세포(형질 전환체)는, 원심분리 등의 조작에 의해 배양액으로부터 회수할 수 있다. 회수된 숙주 세포를 각종 적절한 완충액에 현탁(懸濁)한 후, 소니케이션 등의 기계적 처리, 라이소자임 처리 등의 효소 처리를 실시하고, 또한, 각종 어피니티크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 공지의 정제 기술을 목적에 따라 조합, 상기 소르보스 디하이드로게나아제를 정제할 수 있다.

또, 상술한 대로, 본 발명에 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제는, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)를 보효소로 하지만, 상술한 바와 같은 통상의 조건에 의거하는 소르보스 디하이드로게나아제의 제조에서는, 외인적인 FAD의 첨가를 하지 않아도, 그 보효소가 결합된 상태의 소르보스 디하이드로게나아제를 조제하는 것이 가능하다.

따라서, 상술한 제조 공정에서, 또, 본 발명의 1,5-AG 측정 방법 및 1,5-AG 시약 조성물에, 인위적으로 FAD를 첨가하는 것이 필수는 아니다.

(소르보스 디하이드로게나아제의 활성화법)

본 발명의 소르보스 디하이드로게나아제는, 전자 캐리어의 존재하에 인큐베이트하면 활성화된다. 이 때문에, 본 발명의 측정 방법 및 1,5-AG 측정 시약 조성물의 제조에 앞서, 미리, 그 활성화 처리를 실시해도 된다. 특히, 적용하는 시료가, 혈액 등의 임상 검체인 경우에는, 고감도의 1,5-AG의 검출을 가능하게 하는 점에서, 상기 소르보스 디하이드로게나아제를 미리 활성화 처리하는 것이 바람직하다.

활성화에 이용되는 전자 캐리어로서는, 페나진 메토설페이트(PMS)나 1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸설페이트(1m-PMS) 등이 있다. 1m-PMS를 이용한 경우, 상기 조제된 소르보스 디하이드로게나아제에, 최종 농도 0.01~50mM, 보다 바람직하게는, 0.01~10mM의 1m-PMS를 첨가하고, pH 5~9, 온도 4~45℃에서, 30분 ~1일간 인큐베이트한다. 활성화 처리 후, 측정 시약을 조제하는데 1m-PMS가 과잉된 경우에는, 투석이나 한외여과 등에 의해 과잉의 1m-PMS를 제거하고, 본 발명의 측정 방법 및 1,5-AG 측정 시약 조성물의 제조에 사용할 수 있다.

상기의 처리에 의해, 본 발명에 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제를 활성화할 수 있지만, 하기와 같이, 1,5-AG를 기질로 하여 측정한 경우의 효소 활성이, 활성화 처리 전과 처리 후에서, 바람직하게는, 2배 이상(2~20배), 또한, 4배 이상(4~10배) 활성화되어 있는 것이 보다 바람직하다.

(측정 방법)

본 발명의 1,5-AG의 측정 방법은, 혈액이나 수액 등의 검체 중의 1,5-AG 양을 정확하게 측정할 수 있다. 상술한 바와 같이, 혈액 중의 1,5-AG 값은, 당뇨병의 컨트롤 마커로서 유용하므로, 본 발명의 측정 방법은, 당뇨병의 진단에서 유용하다.

본 발명의 1,5-AG의 측정 방법은, 예를 들면 다음과 같은 방법으로 실시할 수 있다. 1,5-AG의 함유가 예상되는 체액 시료(검체)에, 본 발명의 소르보스 디하이드로게나아제를 시료 1mL당, 1,5-AG를 기질로 하여 측정했을 경우의 효소 활성을 기본 단위로 하여, 1~500단위가 되도록 첨가하고, 또한, 본 발명의 소르보스 디하이드로게나아제에 의해 직접 반응하는 발색 기질의 경우에는 이 발색 기질만을, 본 발명의 소르보스 디하이드로게나아제로는 직접 반응하지 않는 발색 기질이지만 전자 캐리어의 존재하에서 환원 발색하는 발색 기질, 또는, 본 발명의 소르보스 디하이드로게나아제로는 조금밖에 발색하지 않는 발색 기질이지만, 전자 캐리어가 존재하면 강하게 환원 발색하는 발색 기질인 경우에는, 이 발색 기질 외에 전자 캐리어도 첨가하고, 바람직하게는 4~50℃, 특히 바람직하게는 25~40℃에서, 바람직하게 는, 1분~3시간, 보다 바람직하게는 1~30분간, 특히 바람직하게는 1~10분간, 인큐베이트하면서 흡광도의 변화를 계측하고, 미리 작성한 검량선으로부터 검체 중의 1,5-AG 농도를 측정한다.

또한, 본 발명에서, 「발색 기질」이란, 상술한, 디하이드로게나아제에 의해 직접 반응하는 발색 기질; 전자 캐리어의 존재하에서 환원 발색하는 발색 기질; 및, 전자 캐리어가 존재하면 강하게 환원 발색하는 발색 기질을 포함하는 것으로 하고, 또한, 「환원성 발색 기질」이란, 전자 캐리어의 존재하에서 환원 발색하는 발색 기질; 및, 전자 캐리어가 존재하면 강하게 환원 발색하는 발색 기질을 포함하는 것으로 한다.

본 발명의 1,5-AG 측정 방법에 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제는, 적어도, 실용적인 범위 내에서 1,5-AG와 반응하는 것을 이용할 필요가 있다. 소르보스는 생체 중에는 존재하지 않는 당이고, 소르보스에 대한 반응성은 특별히 문제가 되지 않는다. 그러나 1,5-AG에 대한 반응성은, 공시(供試)되는 검체 시료에도 따르지만, 소르보스에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 바람직하게는 10% 이상(10~200%), 보다 바람직하게는 50% 이상(50~200%)의 반응성을 가지는 소르보스 디하이드로게나아제를 이용한다. 또한, 본 발명의 1,5-AG 측정 방법에 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제는, D-글루코오스에 대해서는 거의 작용하지 않거나, 또는 약하게 작용하는 것을 이용한다. D-글루코오스는 검체 중에 다량으로 존재하므로, 1,5-AG에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, D-글루코오스에 대한 반응성이 10% 이하(0.001~10%), 더욱 바람직하게는, 5% 이하(0.001~5%)인 소르보스 디하이드 로게나아제를 선택함으로써, 검체의 전처리, 특히 D-글루코오스 등의 당류 제거 처리의 필요성 및 엄밀성을 대폭 저감할 수 있고, 측정의 간이화, 측정 시간의 단축, 측정 정밀도의 향상 및 비용의 삭감 등을 도모할 수 있다.

또한, 상기의 「반응성」은, 반응에 사용하는 효소량에 대해, 대과잉의 기질, 이 경우는 소르보스, 1,5-AG, D-글루코오스를 작용시켜, 기질과의 반응을 촉매하는 효소의 최대 반응속도에서 반응성을 평가한 것이다. 소르보스의 경우로 구체예를 나타내면, 후술하는 소르보스의 [효소 활성 측정 방법]에 나타내는 대로이다.

상술한 대로, 본 발명의 1,5-AG 측정 방법에 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제는 1,5-AG에 대한 특이성은 높지만, 약간, D-글루코오스의 영향을 받는 경우도 있다. 예를 들면, D-글루코오스의 농도가 1,5-AG의 수천배도 되는 당뇨병 환자의 검체 측정에 적용할 경우에는, D-글루코오스의 영향을 무시할 수 없는 경우도 있다. 이와 같은 검체에서는, D-글루코오스의 영향을 완전히 회피하기 위해, 검체에 D-글루코오스 제거제 혹은 소거제(消去劑)를 추가하여, 미리 D-글루코오스의 영향을 소거하고 나서 1,5-AG를 측정할 필요가 있다.

D-글루코오스 등의 당류를 제거하는 방법으로서는, 예를 들면, 일본국 특허 공고 평5-41235호 공보와 같은 이온교환 수지를 이용하는 방법이 있다. 또, D-글루코오스를 소거하는 방법으로서는, 예를 들면, 일본국 특허 공개 평1-320998호 공보, 일본국 특허 공고 평7-71514호 공보, 일본국 특허 공개 평6-237795호 공보, 일본국 특허 공개 평3-27299호 공보, 일본국 특허 공개 평6-245796호 공보, 일본국 특허 공고 평7-102154호 공보 등에 나타내어져 있는 바와 같이, 글루코오스 6위 인 산화효소(헥소키나아제 또는 글루코키나아제)를 이용하여, D-글루코오스를 글루코오스-6-인산으로 변환시키는 방법을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 생화학 검사용의 범용 자동 측정기에 세트할 수 있는 후자의 D-글루코오스 소거법을 이용한다. 여기에서 이용하는 글루코오스 6위 인산화 효소로서는, D-글루코오스에 특이성이 높은 글루코키나아제를 이용하는 것이 바람직하다. 글루코키나아제의 사용량은, 검체 중의 글루코오스의 양에 따라 다르지만, 1~20U/mL이다. 또, 글루코오스의 인산화에 필요한 아데노신삼인산(ATP)의 양은, 검체 중의 글루코오스의 양에 따라 다르지만, 0.5~20mM이다. 또한, D-글루코오스의 인산화를 촉진하기 위해, 염화마그네슘을 2~50mM 추가한다.

또한, 고도의 D-글루코오스의 소거가 필요할 경우, 예를 들면, 상기의 글루코키나아제를 이용하는 D-글루코오스의 6위 인산화계를 이용할 경우에는, 또한 효소 사이클링계, 예를 들면, 피루브산 키나아제를 이용하는 ATP 사이클링계 등을 편입시켜, 완전한 D-글루코오스의 소거를 달성할 수 있다.

본 발명의 소르보스 디하이드로게나아제에 의해 직접 반응하는 발색 기질로서는, 예를 들면, 2,6-디클로로페놀인도페놀(DCIP)과 같은 전자 수용체가 있다.

또, 페리시안화칼륨과 같은 페리시안화합물을 전자 수용체로 하여, 소르보스 디하이드로게나아제에 의한 산화 환원 반응 후에, 전자 수용체 자체의 정색(呈色)의 변화를 검출하거나, 또는, 황산제이철-듀파놀·리젠트(ferric sulfate-dupanol reagent)를 첨가하고, 프러시안블루로서 발색시키는 방법도 적용이 가능하지만, 간편성 및 검출 감도를 고려하면, DCIP 등의 직접 반응하여 높은 감도로 측정할 수 있는 발색 기질을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 전자 캐리어의 존재하에서 환원 발색하는 발색 기질, 또는, 전자 캐리어가 존재하면 강하게 환원 발색하는 발색 기질로서는, 테트라졸륨 또는 그 염류가 있다. 구체예로서, 니트로테트라졸륨블루(NTB), 2-(4-요오드페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸륨클로라이드, 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨브로마이드, 2-(4-요오드페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨·1나트륨염(WST-1), 2-(4-요오드페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨·1나트륨염(WST-3), 2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨·1나트륨염(WST-8) 등을 들 수 있다. 그 사용 농도는 0.05~4mM이고, 특히 0.1~2mM의 범위가 바람직하다.

또, 본 발명의 테트라졸륨 또는 그 염의 발색을 위해 사용되는 전자 캐리어로서는, 페나진 메토설페이트(PMS), 1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸설페이트(1m-PMS) 등이 있다. 1m-PMS를 이용한 경우, 그 사용 농도는 0.01~50mM, 특히 0.01~10mM의 범위가 바람직하다.

상기 측정 방법에 사용할 수 있는 완충액으로서는, pH 6~10의 인산 완충액, 트리스염산완충액, 굿 완충액, 붕산 완충액 등, 통상 사용되는 것이면, 모두 사용할 수 있다.

(측정 시약 조성물)

본 발명의 1,5-AG 측정 시약 조성물은, 상기 소르보스 디하이드로게나아제를 필수 성분으로서 포함하는 것으로서, 당뇨병의 진단에서 유용하지만, 목적으로 하 는 검체시료, 사용하는 발색제, 측정 형태 등에 따라, 그 시약 형태를 적절히 바꿀 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 1,5-AG 측정 시약 조성물은, 상술한 대로, D-글루코오스의 농도가 높은 당뇨병 환자의 검체 측정에 사용할 경우에는, D-글루코오스 등의 당류를 제거하는 시약(당류 제거제)과 조합해도 된다. 당류 제거제로서는, 상기 공지 기술을 적용하는 것이 가능하고, 붕산 결합 수지, 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지를 조합한 것이나, 강염기성의 음이온 교환 수지와 양이온 교환 수지를 조합한 것이 바람직하다. 강염기성 음이온 교환 수지 또는 붕산으로 검체를 처리하면, 1,5-AG는 제거되지 않고 당류가 선택적으로 제거되어 1,5-AG를 포함하는 시료가 얻어진다. 또, 1,5-AG에는 작용하지 않고, 다른 당류에는 작용하는 효소를 이용함으로써, 1,5-AG 이외의 당류를 제거하는 것이 가능하다. 이러한 효소로서 예를 들면, 상술한 대로, 헥소키나아제 또는 글루코키나아제를 들 수 있고, 이러한 효소를 이용해 글루코오스를 인산화함으로써, 글루코오스를 제거할 수 있다. 그 이외에도, 글루코오스 옥시다아제를 이용하여, 검체 중의 D-글루코오스를 제거하는 방법 등도 있다. 또한, 글루코오스 옥시다아제에 의한 D-글루코오스로부터의 반응 생성물은, D-글루코노-1,5-락톤이다.

본 발명의 1,5-AG 측정 시약 조성물은, 모두를 혼합하여 단일 시약으로 해도 되고, 서로 간섭하는 성분이 존재할 경우에는, 각 성분을 적당, 적절한 조합이 되는 상태로 분할해도 된다. 또, 이들은, 용액 형상, 혹은 분말 형상 시약으로서 조제해도 되고, 또한 이들을 거름종이 혹은 필름 등의 적당한 지지체에 함유시켜 시 험지 혹은 분석용 필름으로서 조제해도 된다. 또한, 과염소산 등의 제단백제나 1,5-AG 일정량을 함유하는 표준 시약을 첨부해도 된다. 본 조성물 중의 효소, 소르보스 디하이드로게나아제의 양은, 1,5-AG를 기질로 하여 측정한 경우의 효소 활성을 기본 단위로 하여, 1시료당 반응액 중에서의 최종 농도로서는, 0.1~50단위/mL 정도가 되도록 조제하는 것이 바람직하다. 1,5-AG를 정량하기 위한 검체는, 예를 들면, 혈장, 혈청, 수액, 소변 등을 들 수 있다.

본 발명의 1,5-AG 측정 시약 조성물의 용도로서, 가장 일반적인 것으로서, 생화학 검사용의 대형 범용 자동 측정기가 상정되지만, 그 외에도, 이를 소형화한 전용기나, 개업의(開業醫)용으로 포터블화한 것이 생각된다.

이들 자동 측정기용의 1,5-AG측정 시약 조성물을 조제할 경우, 예를 들면, D-글루코오스 소거제, 환원성 발색제, 환원성 발색제가 테트라졸륨인 경우에는 테트라졸륨과 전자 캐리어, 소르보스 디하이드로게나아제의 검체에의 첨가는, D-글루코오스 소거제를 먼저 하면, 그 이외는, 모두 동시에 행해도 되고, 즉, 이들 성분을 하나의 시약으로 합쳐 조제할 수도 있다. 또, 예를 들면, D-글루코오스 소거제, 테트라졸륨, 전자 캐리어, 소르보스 디하이드로게나아제 중, 서로 간섭하는 것이 존재하는 경우, 이들을 분리하여 각각의 시약으로서 조제하면, 간섭을 피할 수 있다.

다음에 실시예를 나타내어 본 발명을 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것이 아니다.

[실시예]

(실시예 1)

[사용 균주의 동정(同定)]

실험에 이용한 균주는, 알팔파(alfalfa)의 근립(根粒)으로부터 분리한 균주이며, 이 균주의 균학적 성질은, 하기와 같다.

1. 형태학적 성질

효모 엑기스-만니톨 배지에서 생육한 본 균주의 형태적 성질을 이하에 기술한다. 세포의 형태는 간균(桿菌)이고, 크기는 0.5~0.9×1.2~3.0㎛이다. 포자를 형성하지 않고, 그람염색성은 음성이다.

2. 각 배지에서의 생육 상태

효모 엑기스-만니톨 배지에서 생육한 본 균주의 생육 상태를 이하에 기술한다. 콜로니는, 크림색을 나타내고, 형상은 원형, 볼록 형상으로 융기하고, 점성(粘性)이 있다. 30℃에서 3일간 배양 후의 콜로니는, 직경 2~4mm가 된다. 또, 편모(鞭毛)가 있어, 운동성을 가진다.

3. 생리학적 성질

본 균주는, 호기성이고, 생육의 최적 온도는 25~30℃이며, 생육의 최적 pH는 6~8이었다. 또, 각종 당류의 이용성은 표 2에 기재한 대로이고, 옥시다아제 및 카탈라아제를 생산한다.

[표 2]

상기의 분리원·성질에 의거하여, 본 균주가 속하는 속을, 「Bergey＇s Manual of DETERMINATIVE BACTERIOLOGY(제9판)」에 따라 검색하여, 그 균주가, 시노라이조비움(sinorhizobium)속에 속하는 미생물인 것을 판명하고, 본 균주를 시노라이조비움 에스피. 97507(Sinorhizobium sp. 97507)주(株)로 명명했다. 이 시노라이조비움 에스피. 97507(Sinorhizobium sp. 97507)주는, 본 출원인에 의해, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 2003년 7월 10일부로 기탁되고, 특허생물기탁센터로부터 2003년 7월 11일부로 통지된 수탁증에서, FERM P-19428의 수탁 번호를 얻었다. 이하, 이 시노라이조비움 에스피. 97507(Sinorhizobium sp. 97507)(FERM P-19428)를 기탁 균주로 기재한다.

또한, 본 출원인은, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(국제 기탁 당국)에 2007년 6월 22일부로, 상기 시노라이조비움 에스피. 97507(Sinorhizobium sp. 97507)(수탁 번호: FERM P-19428)에 대해 국제 기탁으로의 이관 신청을 실시하고, 동일부로 동당국(同當局)에 의해 본 신청이 수령되었다. 당해 수령서에서, 수령 번호 FERM ABP-10843이 발행되었다.

[소르보스 디하이드로게나아제의 클로닝]

상술한 기탁 균주로부터 염색체 DNA를 추출하고, 이하의 순서에 의해 소르보스 디하이드로게나아제의 클로닝을 실시했다.

1. 염색체 DNA의 추출

상기 기탁 균주의 균체를, 용균효소 처리하여 세균의 세포벽을 파괴한 후, 페놀로 DNA를 추출하고, 염석하여 염색체 DNA를 추출, 회수했다.

2. PCR

하기 조건으로 PCR를 실시하고, 약 1.6kbp의 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 PCR산물을 취득했다.

주형: 1.에서 추출한 기탁 균주 유래의 DNA

프라이머: 배열 번호 3 및 배열 번호 4로 나타내어지는 DNA

(Sinorhizobium meliloti strain 1021 Genome Project(웹 사이트 http://sequence.toulouse. inra.fr/meliloti.html)에서 공개되어 있는 염기 배열 SMa1414(L-소르보스 디하이드로게나아제로 추정)를 바탕으로, 프라이머 1, 2를 합성했다.)

폴리머라아제: TaKaRa LA Taq(다카라바이오사제)

반응 조건:

a. 변성 94℃, 1분 (1 사이클)

b. 변성 94℃, 30초

c. 어닐링 57℃, 1분

d. 신장 반응 72℃, 2분

e. 신장 반응 72℃, 5분 (1 사이클)

또한, b~d의 반응은, 30 사이클을 실행했다.

3. 겔로부터 잘라내어 정제

2.에서 취득한 PCR 산물을 아가로스 겔 전기 영동함으로써 정제하고, QIAEXII Gel Extraction Kit(키아겐사제)를 이용하여, 아가로스 겔로부터 소르보스 디하이드로게나아제 유전자 DNA를 추출했다.

4. 제한 효소 처리

3.에서 아가로스 겔로부터 추출 정제한 소르보스 디하이드로게나아제 유전자 DNA 및 플라스미드 pUCNNT2를, 제한 효소 NcoI, HindIII로 제한 효소 처리했다. 제한 효소 처리한 소르보스 디하이드로게나아제 유전자 DNA 및 플라스미드 pUCNNT2를 아가로스 겔 전기 영동함으로써 정제하고, QIAEXII Gel Extraction Kit(키아겐사제)를 이용하여, 아가로스 겔로부터 소르보스 디하이드로게나아제 유전자 DNA 및 플라스미드 pUCNNT2를 추출했다.

또한, 상기 플라스미드 pUCNNT2는, 시판의 플라스미드 pUC19(다카라바이오사제)에, NcoI 링커 및, 플라스미드의 안정화에 기여하는 pKK223-3(Pharmacia Biotech사제) 유래의 rrnB ribosomal terminator를 부가한 플라스미드이고, 본 발명에 이용하는 소르보스 디하이드로게나아제를 발현시키는데 특히 적합하다. 도 1 및 도 2는, 본 실시예에서 이용한 플라스미드 pUCNNT2를 구축하는 흐름도이다. 도 1, 도 2에 나타낸 바와 같이, 이 플라스미드 pUCNNT2는, 이하의 공정 1~5를 거쳐 구축했다.

공정 1: 시판의 플라스미드 pUC19(다카라바이오사제)에, NdeI 링커를 부가한 pUCNde를 제작.

공정 2: pKK223-3(Pharmacia Biotech사제)의 EcoRI-SspI 영역을 PCR에서 증폭. 그 때, NdeI 링커를 부가(PCR product NdeI-SspI 단편).

또한, 도 1 중에 나타내어지는 PCR product NdeI-SspI 단편에서의 rrnBT₁T₂는, 플라스미드의 안정화에 기여하는 것이다.

공정 3: pUCNde의 NdeI-SspI 영역을, 상기 PCR product NdeI-SspI 단편과 치환한 플라스미드 pUCNNT를 제작한다.

공정 4: 상기 pUCNNT의 Cfr10I-BamHI 영역을 PCR로 증폭. 그 때, NdeI 링커를 NcoI 링커로 변환.

공정 5: 상기 증폭 단편을, pUCNNT의 Cfr10I-BamHI과 치환하여 플라스미드 pUCNNT2를 제작한다.

5. 라이게이션

4.에서 제한 효소 처리한 소르보스 디하이드로게나아제 유전자 DNA 및 플라스미드 pUCNNT2를, DNA Ligation Kit Ver2.1(다카라바이오사제)을 이용해 라이게이션시켜, 플라스미드 pUCNNT2_AGD1을 구축했다.

6. 트랜스포메이션

5.에서 구축한 플라스미드 pUCNNT2_AGD1을 이용하여, E. coli JM1O9 Competent Cell(다카라바이오사제)을 형질전환하고, 암피실린나트륨 함유한 LB 플레이트에 파종(播種)하고, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 다이렉트 PCR로, 암피실린나트륨 함유한 LB 플레이트에 생육한 콜로니 20개에, 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함한 플라스미드가 도입되어 있는지 확인했다. 소르보스 디하이드로게나아제 유전자의 증폭을 확인할 수 있던 7주(株)를, 암피실린나트륨 함유의 LB 플레이트에 파종하여, 순화(純化)했다.

7. 활성 확인

(1) 순화한 유전자 재조합체 대장균 7주를, 하기의 조건으로 액체 배양했다.

배지:

LB배지 10mL

Bacto Tryptone(Bectone, Dickinson and Co.제) 1.00%(w/v)

Bacto Yeast Extract(Bectone, Dickinson and Co.제) 0.50%(w/v)

염화나트륨(나카라이테스크사제) 1.00%(w/v)

암피실린나트륨(와코우순약사제) 0.005%(w/v)

배양 용기: 시험관(직경 2.5×길이 20㎝)

배양 조건: 37℃, 15시간, 121rpm

(2) 배양액 10mL분(分)의 균체를 집균(集菌)(1000×g, 10분, 실온).

(3) 상청(上淸)을 제거하고, 파쇄 버퍼(50mM KPB(pH 7.5), 0.25%(w/v) BL-9EX(닛코케미컬즈사제), 0.Ol%(w/v) 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)) 1mL로, 균체를 현탁.

(4) 팁(tip)식 초음파 파쇄장치로, 균체를 파쇄(얼음조(氷浴), 5분).

(5) 균체 파쇄액을 원심분리(13000×g 4℃ 5분)하고, 상청(무세포 추출액)을 회수하고, 이것을 활성 측정용 샘플로 했다.

(6) 활성 발현의 확인은, 후술하는 [효소 활성 측정 방법]에 의거하여 실시하고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성이 가장 강한 주를, E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1으로 했다. 또한, 배지당 소르보스 디하이드로게나아제 활성은, 0.080U/mL배지였다.

또, E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1의 배양균체로부터 추출한 플라스미드 pUCNNT2_AGD1에 대해 염기 배열의 결정을 실시한 바, 소르보스 디하이드로게나아제를 코드하는 DNA 단편이 삽입되어 있는 것이 확인되었다. 그 염기 배열을 배열 번호 1로, 아미노산 배열을 배열 번호 2로 나타낸다.

또한, 본 실시예에서 결정한 염기 배열을, 상기 Sinorhizobium meliloti strain 1021의 게놈·프로젝트에 공개되어 있는, 소르보스 디하이드로게나아제 추정 코드 영역(Locus tag: SMa1414)과 비교했다. 그 결과, 제160번째의 염기가 SMa1414에서는 아데닌(A)인 것에 대해, 본 실시예의 것에서는 시토신(C)이었다. 이 염기의 치환에 의해, 제54번째의 아미노산에 대해, SMa1414(ACCESSION No.: NP_436019)에서는 메티오닌(Met)인 것에 대해, 본 실시예의 것에서는 류신(Leu)으로 되어 있다.

[소르보스 디하이드로게나아제 제조]

상술한 대로 제작한, 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 가지는 유전자 재조합체(E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1)를 배양하고, 얻어진 균체로부터 소르보스 디하이드로게나아제를 분리·정제했다.

또한, 이 유전자 재조합체 E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1은, 본 출원인에 의해, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 2006년 3월 28일부로 기탁하고, 특허생물기탁센터로부터 2006년 3월 28일부로 통지된 수탁증에서, FERM P-20854의 수탁 번호를 얻었다.

1. 배양

균주: 유전자 재조합체 E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1

1. 1 종(種)배양

2.OL 용량의 사카구치 플라스크에, LB배지 1.OL를 첨가하여 오토클레이브 멸균(121℃, 20분)하고, 또한 필터 멸균한 암피실린나트륨을 최종 농도 0.005%(w/v)가 되도록 사용 직전에 첨가했다. 이 LB배지에 유전자 재조합체 E. coli JM109/pUCNNT2_AGD1을 백금이(白金耳)로 접종하고, 37℃에서 진탕 배양(120rpm)했다. 배양 개시 13시간 후의 배양액을, 본 배양시의 종균으로 했다.

LB배지 조성:

Bacto Tryptone(Bectone, Dickinson and Co.제) 1.00%(w/v)

Bacto Yeast Extract(Bectone, Dickinson and Co.제) 0.50%(w/v)

염화나트륨(나카라이테스크사제) 1.00%(w/v)

암피실린나트륨(와코우순약사제) 0.005%(w/v)

1. 2 본(本) 배양

30L 용량 배양 장치에, GYC 배지 21L를 첨가하여 오토클레이브 멸균(121℃, 20분)하고, 또한 필터 멸균한 암피실린나트륨(와코우순약사제) 및 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(시그마알드리치재팬사제)를, 각각 최종 농도 0.005, 0.024%(w/v)가 되도록 사용 직전에 첨가했다.

GYC 배지 조성: (15N의 NaOH로 pH 7.0으로 조정)

글리세롤(사카모토약품공업사제) 4.0%(w/v)

효모엑기스(아지노모토사제) 2.0%(w/v)

콘 스팁 리커(산에이당화사제) 4.5%(w/v)

상기 배지에, 상기 1. 1에서 준비한 종균 1L을 접종하고, 하기 조건으로 15시간 배양했다. 또한, 배양 중은, 15N의 NaOH로 pH를 7.0으로 제어했다.

배양 온도: 37℃

통기량: 1v/v/m

회전수: 350rpm

배양 개시 15시간 후에, 원심분리기를 이용하여, 균체 955.06g을 회수했다.

2. 정제

상기 배양에 의해 얻어진 균체로부터, 이하의 각 정제 공정을 거쳐, 소르보스 디하이드로게나아제를 분리·정제했다. 주된 정제 공정에서의 소르보스 디하이드로게나아제의 전(全)활성, 비(比)활성, 회수율, 비활성 배수(fold)를 측정했다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.

또한, 소르보스 디하이드로게나아제 활성은, 후술하는 [효소 활성 측정 방 법]에 의거하여 측정했다.

[표 3]

2. 1 무세포 추출액(CFE)의 조제

상기 1. 2의 본 배양으로 취득한 균체 955.06g 중 200g을 이용해 정제를 실시했다. 균체 200g에 대해, 1L의 파쇄 버퍼(50mM KPB(pH 7.5), 0.25%(w/v) BL-9EX(닛코케미컬즈사제), 0.001mM FAD)를 더해 균체 현탁액을 제작했다. 이 균체 현탁액에, 세린 프로테아제의 저해제인 불화페닐메틸술포닐(PMSF)을 최종 농도 1mM가 되도록 첨가하고, 팁식 초음파 파쇄 장치로 파쇄했다. 이 균체 파쇄액을, 원심분리(13000×g, 4℃, 15분)하고 상청을 회수했다. 이 상청을 CFE로 했다.

2. 2 암모늄 설페이트 분획

상기 2. 1에서 회수한 CFE 1095mL에 대해, 최종 농도 40%(w/v)가 되도록 암모늄 설페이트를 얼음조 하에서 첨가하였다. 이때, pH가 7.5가 되도록 암모니아로 조정했다. 암모늄 설페이트가 용해된 후, 4℃에서 하룻밤 정치(靜置)했다.

2. 3 투석

원심분리(13,000×g, 4℃, 15분)에 의해, 암모늄 설페이트 침전을 회수했다. 회수한 암모늄 설페이트 침전은, 투석 튜브(심레스(seamless) 셀룰로오스 튜브 작은 사이즈 18 와코우순약사제)에 넣고, 투석 버퍼(5mM KPB(pH 8.0), 0.25%(w/v) BL-9EX(닛코케미컬즈사제), 0.001mM FAD)를 이용해 투석을 행하였다.

2. 4 원심분리

투석 튜브 내에 불용물(不溶物)이 생겼기 때문에, 원심분리(13000×g, 4℃, 15분)에 의해, 이를 제거하고, 상청을 회수했다.

2. 5 강 음이온 교환 크로마토그래피(TOYOPEARL SuperQ650M)

평형화 버퍼(5mM KPB(pH 8.0), 0.25%(w/v) BL-9EX(닛코케미컬즈사제), 0.001mM FAD)로 평형화한 강 음이온 교환 수지 TOYOPEARL SuperQ650M(토오소사제) 350mL(컬럼사이즈: φ6.2㎝×높이 27㎝)에, 상기 2. 3에서 회수한 상청을 차지(charge)했다. 차지 종료후, 수지의 bed volume의 5배량의 세정 버퍼(5mM KPB(pH 8.0), 0.25%(w/v) BL-9EX(닛코케미컬즈사제), 0.001mM FAD)로 세정 후, 수지의 bed volume의 2.5배량의 2종(種)의 용출(溶出) 버퍼(1: 5mM KPB(pH 8.0), 0.25%(w/v) BL-9EX(닛코케미컬즈사제), 0.001mM FAD, 2: 5mM KPB(pH 8.0), 0.25%(w/v) BL-9EX(닛코케미컬즈사제), 0.001mM FAD, 1M NaCl)를 이용하여 목적 단백을 구배(gradient) 용출시켜 활성 분획을 회수했다.

2. 6 탈염농축

한외여과장치 비바셀 250(비바사이언스사제, 분획 분자량 1만)을 이용하여, 상기 2. 5의 강 음이온 교환 크로마토그래피(TOYOPEARL SuperQ650M)로 회수한 활성 분획의 탈염농축을 실시하고, 최종적으로 효소가 용해되어 있는 버퍼를 50mM KPB(pH 7.5), 0.25%(w/v) BL-9EX(닛코케미컬즈사제), 0.01mM FAD로 치환하고, 소르보스 디하이드로게나아제를 얻었다.

[효소 활성 측정 방법]

0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 1mL, 1.OM L-소르보스 1.OmL, 3mM 2,6-디클로로페놀인도페놀(DCIP) 0.14mL, 3mM 1-메톡시-5-메틸페나지늄메틸설페이트 0.2mL, 물 0.61mL를 3mL 석영 셀에 첨가하고, 항온 셀 홀더 부착된 분광광도계에 세트하고 37℃에서 10분간 인큐베이트한 후, 효소 용액 0.05mL를 첨가 후, DCIP의 600nm에서의 흡광도 변화(ΔABS600/min)를 37℃에서 측정한다. DCIP의 pH 7.0에서의 몰 흡광계수를 16.3mM-1로 하고, 1분간에 1μ㏖의 DCIP가 환원되는 효소량을 1단위(unit)로 하여, 효소활성 농도를 다음 식에 따라 구했다.

효소 활성 농도(units/mL)=

(-ΔABS600/min×3.0×희석 배율)/(16.3×1.0×0.05)

광로 길이: 1.O㎝

[소르보스 디하이드로게나아제의 성질 시험]

상기 [효소 활성 측정 방법]에서의 측정 조건을 적절히 변경하고, 상기 2. 6에서 얻어진 소르보스 디하이드로게나아제의 최적 pH, pH 안정성, 최적 온도, 온도 안정성, 기질특이성, Km값, 총 분자량, 서브유닛 분자량, 저해제, 효소 반응 생성물의 동정에 대해, 이하와 같이 시험하고, 본 효소의 성질을 조사했다.

(1) 최적 pH:

상기 [효소 활성 측정 방법]에서의 완충액을, 아세트산·아세트산나트륨 완 충액(pH 3.71~5.36), 구연산·인산나트륨 완충액(pH 5.55~5.95), 인산칼륨 완충액(pH 6.25~7.35), 트리스·염산 완충액(pH 7.52~8.34), 글리신·수산화나트륨 완충액(pH 8.68~9.ll)(각 완충액 모두 최종 농도로 33.3mM)로 바꾸어, 정제 효소의 효소 활성 농도를 측정했다. 또한, 효소 활성 농도 산출시에는, 미리 구해둔 각 pH에서의 DCIP의 몰 흡광 계수를 이용했다. 그 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 이 소르보스 디하이드로게나아제의 최적 pH는, 8.0이었다.

(2) pH 안정성:

소르보스 디하이드로게나아제를, 50mM 농도의 완충액, 즉 아세트산·아세트산나트륨 완충액(pH 4.14~5.91), 구연산·인산나트륨 완충액(pH 5.91~6.30), 인산칼륨 완충액(pH 6.59~7.47), 트리스·염산 완충액(pH 7.53~8.39), 글리신·수산화나트륨 완충액(pH 8.61~10.30)의 각각에 용해시키고, 40℃에서 15분간 유지한 후의 효소 활성을 상기 [효소 활성 측정 방법]에 의해 측정했다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 이 소르보스 디하이드로게나아제는 pH 5.9~8.6의 영역에서 안정했다.

(3) 최적 온도:

소르보스 디하이드로게나아제를 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 용해시키고, 상기 [효소 활성 측정 방법]에서의 온도를 35℃~70℃까지의 범위에서 변화시켜, 효소활성을 측정했다. 그 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 이 소르보스 디하이드로게나아제의 최적 온도는 60℃부근이었다.

(4) 온도 안정성:

소르보스 디하이드로게나아제를 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0), 0.25% BL-9EX(닛코케미컬즈사제), 0.01mM FAD에 용해하고, 30℃~70℃까지의 각 온도에서 10분간 유지한 후, 상기 [효소 활성 측정 방법]에 의해 측정하고, 효소 활성의 잔존율을 구했다. 그 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 이 소르보스 디하이드로게나아제는, 45℃에서도 77%의 효소 활성이 유지되고, 약 45℃ 이하에서 안정했다.

(5) 기질 특이성 및 Km값:

상기 [효소 활성 측정 방법]에서의 활성 측정용 반응액의 기질로서, 1,5-AG, L-소르보스 및 표 4 중에 나타낸 다른 각 기질(모두 최종 농도 333mM, 락토오스는 167mM)을 사용한 경우의 활성을, [효소 활성 측정 방법]에 따라 측정하고, 상대 반응성을 구했다. 결과는, L-소르보스의 활성값을 기준으로 하고, 각각의 기질에서의 상대값으로서 표시했다.

[표 4]

표 4의 결과로부터 알 수 있듯이, 이 소르보스 디하이드로게나아제는, 1,5-AG 및 L-소르보스에 강하게 작용하고, 알릴알코올, D-소르보스, 2-메틸-1-프로판올, D-갈락토오스, 1-부탄올, D-글루코오스에는 약하게 작용했다. 또, 자일리톨, 1-프로판올, 락토오스, 2-프로판올, 2,3-부탄디올, D-만노오스, 에탄올, 글리세롤, 말토오스, D-프룩토오스, L-람노오스, D-만니톨, D-소르비톨, D-리보오스, D-크실로오스, L-아라비노오스, D-셀로비오스, 수크로오스, D-트레할로오스, D-라피노오스, 이노시톨, meso-에리스리톨, 2-부탄올, 2-펜탄올, 프로필렌글리콜, 메탄올에는 거의 작용하지 않았다.

또, 이 소르보스 디하이드로게나아제의 Km값은, 1,5-AG에 대해 82.5mM, L-소르보스에 대해 65.6mM이었다.

(6) 총 분자량 및 서브유닛 분자량:

이 소르보스 디하이드로게나아제의 총 분자량을, 이동상으로 0.2M NaCl을 포함하는 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5)을 이용하고, TSKgel BioAssist G4SWXL 컬럼(직경 0.78㎝×길이 30㎝, 토오소사제)에서 유속 0.5mL/분의 조건으로 분석했다. 분자량 마커(오리엔탈효모사제), 분자량 마커(아머샴바이오사이언스사제) 및 IgM(시그마사제)과의 비교에 의해, 이 소르보스 디하이드로게나아제는 총 분자량 약 150kDa와 약 672kDa의 형태로 존재한다고 추정되었다.

10% 폴리아크릴아미드 겔을 이용하고, Laemmli 등의 방법에 따라, 이 소르보스 디하이드로게나아제를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 걸었다. 영동 후에 쿠마시·브릴리언트·블루 염색하고, 이동도를 분자량 마커(아머샴바이 오사이언스사제)의 그것과 비교한 결과, 본 발명의 소르보스 디하이드로게나아제의 서브유닛 분자량은 약 59.6 kDa로 추정되었다.

(7) 저해제:

상기 [효소 활성 측정 방법]에서의 활성 측정용 반응액에, 최종 농도가 1 mM이 되도록 표 5 중에 나타낸 각종 첨가물을 각각 첨가하고, 소르보스 디하이드로게나아제의 활성을 측정했다. 컨트롤은, 첨가물을 더하지 않은 이외는 [효소 활성 측정 방법]에 따랐다. 컨트롤의 활성값을 100(%)로 하고, 1)~39)의 각종 저해제를 첨가한 경우에 얻어진 활성값을 상대 활성(%)으로 구하여, 결과를 표 5에 기재했다.

[표 5]

표 5의 결과로부터, 이 소르보스 디하이드로게나아제는, 중금속 이온(Mn^2＋, Hg^2＋, Cu^2＋)으로 강하게 저해되었다. 또, 아크리플라빈에서는 상대 활성이 66%가 되었다.

(8) 효소 반응 생성물의 동정:

상기 2. 6에서 얻어진 소르보스 디하이드로게나아제 3.87U를 첨가하고, 300mM L-소르보스, 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5), 60mM 1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸설페이트, 498U/mL 카탈라아제(와코우순약사제)가 되도록 조정한 효소 반응 용액 1.5mL를, 교반하면서 2시간 실온에서 반응시켰다. 원심한외여과기 마이크로콘 YM-10(아미콘사제, 분획 분자량 1만)에서 효소를 제거한 효소 반응 용액을, 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분석했다. 그 결과, 리텐션 타임의 표품과의 비교로부터, 효소 반응 생성물은 L-소르보손이라고 동정되었다. 여기에서, 표품으로서 사용한 L-소르보손은 미리 화학 합성한 것이다.

또한, 고속 액체 크로마토그래피의 분석 조건은, 이하와 같다.

컬럼: High Performance Carbohydrate Column(워터즈사제)

검출: RI

용리액: 아세토니트릴: 증류수=6:4(50mM 인산칼륨 완충액(pH 6.0)을 포함함)

유속: 1.OmL/min

컬럼 온도: 35℃

인젝션 볼륨: 10μL

[검량선 작성]

상기 [효소 활성 측정 방법]에서의 기질을, L-소르보스에서 1,5-AG로 바꾸고, 그 최종 농도를, 1.5~40.6mM의 범위에서 변화시켜, 흡광도 변화를 측정하고, 1,5-AG농도와 흡광도 변화(ΔABS600/min)의 관계를 플롯하고, 도 7에 나타내는 검량선을 작성했다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 이 소르보스 디하이드로게나아제는, 최종 농도 1.5~40.6mM의 1,5-AG를 정량할 수 있는 것을 알았다.

[보효소]

소르보스 디하이드로게나아제에 산 처리를 실시하고, 산 처리에 의해 소르보스 디하이드로게나아제의 단백으로부터 유리(遊離)시킨 플라빈 화합물을, 고속 액체 크로마토그래피로 분석했다. 소르보스 디하이드로게나아제로부터 유리한 플라빈 화합물은, FAD의 표준품과 리텐션 타임이 일치한 것으로부터, 이 소르보스 디하이드로게나아제의 보효소는 FAD인 것을 알았다.

(실시예 2)

다음으로, 치환형 고발현 플라스미드(이하, pUCpTrcAGD1으로 한다.)를 이용한 재조합 소르보스 디하이드로게나아제의 제조, 및, 그 소르보스 디하이드로게나아제를 활성화함으로써, 고감도로 1,5-AG를 검출하는 예를 나타낸다.

또한, pUCpTrcAGD1에서는, 하기와 같이, 그 소르보스 디하이드로게나아제 유전자의 개시 코돈의 직후에, 글루타민산(Glu), 페닐알라닌(Phe)을 코드하는 코돈이 부가되어 있는 점에서, 상기 pUCNNT2_AGD1과는 다르다.

이하, 도 8에 개략 나타내어진 순서에 따라, 플라스미드 pTrcAGD1의 구축 방법에 대해 상세히 설명한다.

[1] 플라스미드 pTrcAGD1의 구축

1. PCR(도 8 중, 공정 1)

하기 조건으로 PCR를 실시하고, 약 1.6kbp의 치환형 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 PCR 산물을 취득했다.

주형: pUCNNT2_AGD1

프라이머: 배열 번호 7 및 8로 나타내어지는 DNA

폴리머라아제: Takara LA Taq(다카라바이오사제)

또한, 배열 번호 7로 나타내어지는 프라이머는 제한 효소 NcoI 사이트, 및, 상기 글루타민산(gaa), 페닐알라닌(ttc)의 부가 배열을 포함하고, 배열 번호 8로 나타내어지는 프라이머는 제한 효소 BamHI 사이트를 포함한다. 각 프라이머의 위치 관계는, 도 8의 공정 1에 나타낸다.

반응 조건:

a, 변성 94℃, 2분 (1 사이클)

b, 변성 94℃, 40초

c, 어닐링 58℃, 30초

d, 신장 반응 72℃, 2분

c, 신장 반응 72℃, 5분 (1 사이클)

또한, b~d의 반응은, 35 사이클 실시했다.

2. PCR 산물의 정제(도 8 중, 공정 1)

1.에서 취득한 PCR 산물을 아가로스 겔 전기 영동함으로써 증폭을 확인하고, QIAquick PCR Purification Kit(키아겐사제)를 이용하여, 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 약 1.6kbp의 DNA를 정제했다.

3. 제한 효소 처리(도 8 중, 공정 1)

2.에서 정제한 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 약 1.6kbp의 DNA를, 제한 효소 NcoI, BamHI으로 제한 효소 처리했다. 제한 효소 처리한 소르보 스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 약 1.6kbp의 DNA를 아가로스 겔 전기 영동함으로써 정제하고, QIAquick Gel Extraction Kit(키아겐사제)를 이용하여, 아가로스 겔로부터 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 약 1.6kbp의 DNA를 추출했다.

플라스미드 pTrc99A(아머샴바이오사이언스사제)는, 제한 효소 NcoI, BamHI로 제한 효소 처리한 후, QIAquick PCR Purification Kit(키아겐사제)를 이용해 정제했다.

4. 라이게이션(도 8 중, 공정 2)

3.에서 제한 효소 처리한 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 약 1.6kbp의 DNA, 및 pTrc99A를, Ligation high(토요보우사제)를 이용해 라이게이션시켜, 플라스미드 pTrcAGD1을 구축했다. pTrcAGD1의 플라스미드 모식도에 대해는 도 8의 공정 2에 나타낸다.

5. 트랜스포메이션

4.에서 구축한 플라스미드 pTrcAGD1을 이용하여, E. coli JM109 Competent Cell(다카라바이오사제)을 형질전환하고, 암피실린나트륨이 함유된 LB 플레이트에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 생육한 콜로니를 하기의 조건으로 배양했다.

배지: LB배지 10mL

배양 용기: 시험관(직경 2.5×길이 20㎝)

배양 조건: 30℃, 20시간, 210rpm

배양액으로부터 QIAprep Spin Miniprep Kit(키아겐사제)를 이용해 플라스미드를 추출하고, 그 플라스미드를 제한 효소 NcoI 혹은 BamHI으로 처리하고, 이 처리된 플라스미드를 아가로스 겔 전기 영동함으로써, 소르보스 디하이드로게나아제 유전자가 도입되어 있는지 확인했다.

또한, 치환형 소르보스 디하이드로게나아제 유전자는 배열 번호 5에, 그 아미노산 배열은 배열 번호 6에 나타낸 대로이다.

[2] 플라스미드 pUCpTrcAGD1의 구축

1. PCR(도 8 중, 공정 3)

하기 조건으로 PCR을 실시하고, 약 2.2kbp의 trc 프로모터 및 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 PCR산물을 취득했다.

주형: pTrcAGD1

프라이머: 배열 번호 9 및 10으로 나타내어지는 DNA

폴리머라아제: Takara Ex Taq(다카라바이오사제)

또한, 배열 번호 9 및 배열 번호 10으로 나타낸 프라이머는, 각각, BglII 사이트를 어댑터 배열로서 포함한다.

반응 조건:

a, 변성 96℃, 5분 (1 사이클)

b, 변성 96℃, 40초

c, 어닐링 58℃, 40초

d, 신장 반응 72℃, 2분

e, 신장 반응 72℃, 5분 (1 사이클)

또한, b~d의 반응은, 25사이클 실시했다.

2. 겔로부터 잘라내어 정제(도 8 중, 공정 3)

1.에서 취득한 PCR 산물을 아가로스 겔 전기 영동함으로써 정제하고, QIA quick Gel Extraction Kit(키아겐사제)를 이용하여, 아가로스 겔로부터 trc 프로모터 및 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 약 2.2kbp의 DNA를 추출했다.

3. 제한 효소 처리(도 8 중, 공정 3, 4)

2.에서 아가로스 겔로부터 추출 정제한 trc 프로모터 및 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 약 2.2kbp의 DNA를, 제한 효소 BglII로 제한 효소 처리했다. 제한 효소 처리된 trc 프로모터 및 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 약 2.2kbp의 DNA를 아가로스 겔 전기 영동함으로써 정제하고, QIAquick Gel Extraction Kit(키아겐사제)를 이용하여, 아가로스 겔로부터 trc 프로모터 및 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 약 2.2kbp의 DNA를 추출했다.

플라스미드 pUC19는, 제한 효소 BamHI으로 제한 효소 처리한 후, 탈인산화처리했다.

4. 라이게이션(도 8 중, 공정 4)

3.에서 제한 효소 처리한 trc 프로모터 및 소르보스 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 약 2.2kbp의 DNA, 및 pUC19를, Ligation high(토요보우사제)를 이 용해 라이게이션시켜, 플라스미드 pUCpTrcAGD1을 구축했다. pUCpTrcAGD1의 플라스미드 모식도에 대해는 도 8의 공정 4에 나타낸다.

5. 트랜스포메이션

4.에서 구축한 플라스미드 pUCpTrcAGD1을 이용하여, E. coli JM109 Competent Cell(다카라바이오사제)을 형질전환하고, 암피실린나트륨 함유된 LB 플레이트에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 생육한 콜로니를 하기의 조건으로 배양했다.

배지: LB배지 10mL

배양 용기: 시험관(직경 2.5×길이 20㎝)

배양 조건: 30℃, 20시간, 200rpm

배양액으로부터 QIAprep Spin Miniprep Kit(키아겐사제)를 이용해 플라스미드를 추출하고, 이 플라스미드를 제한 효소 EcoRI 혹은 PstI로 처리하고, 이 처리된 플라스미드를 아가로스 겔 전기 영동함으로써, trc 프로모터 및 소르보스 디하이드로게나아제 유전자가 도입되어 있는지 확인했다.

trc 프로모터 및 소르보스 디하이드로게나아제 유전자의 도입이 확인된 상기E. coli 클론의 하나(이하, E. coli JM109/pUCpTrcAGD1으로 한다.)를 이하에 나타내는 「치환형 소르보스 디하이드로게나아제의 제조」에 공시하였다.

또한, 이 E. coli JM109/pUCpTrcAGD1으로부터 추출한 플라스미드에 대해, 소르보스 디하이드로게나아제 유전자 부위의 염기 배열을 결정했다. 그 염기 배열은 배열 번호 5에, 아미노산 배열은 배열 번호 6에 나타낸 대로이다.

염기 배열을 확인한 결과, pUCpTrcAGD1에서는, 삽입되어 있는 소르보스 디하이드로게나아제 유전자의 개시 코돈의 직후에, gaa(글루타민산), ttc(페닐알라닌)가 순서대로 인·프레임으로 부가되어 있는 것이 확인되었다.

또, 상기 플라스미드 pUCNNT2_AGD1의 소르보스 디하이드로게나아제의 코드 영역에서의 제51번째의 염기 시토신(C), 제108번째의 염기 구아닌(G), 및 제168번째의 염기 구아닌(G)에 대해, pUCpTrcAGD1에서는, 이들에 상당하는 염기가, 각각 순서대로, 티민(T), 아데닌(A), 및 아데닌(A)으로 치환되어있는 것이 확인되었다. 그러나, 상기 2개의 아미노산이 부가되어 있는 것 이외에는, 상기의 염기 치환에 의해, 이에 코드되는 소르보스 디하이드로게나아제의 아미노산 배열에 치환 등의 변이는 생기지 않았다.

[3] 치환형 소르보스 디하이드로게나아제의 제조

1. 배양

균주: 유전자 재조합체 E. coli JM109/pUCpTrcAGD1

1. 1 종 배양

500mL 용량의 삼각 플라스크에, LB배지 100mL를 첨가하여 오토클레이브 멸균하고, 또한 필터 멸균한 암피실린나트륨을 최종 농도 0.01%(w/v)가 되도록 사용직전에 첨가했다. 이 LB배지에 유전자 재조합체 E. coli JM109/pUCpTrcAGD1을 백금이로 접종하고, 25℃에서 진탕 배양(120rpm)했다. 배양 개시 21시간 후의 배양액을, 본 배양시의 종균으로 했다.

1. 2 본 배양

500mL 용량의 삼각 플라스크에, LB배지 100mL을 첨가하여 오토클레이브 멸균하고, 또한 필터 멸균한 암피실린나트륨을 최종 농도 0.01%(w/v)가 되도록 사용 직전에 첨가한 플라스크 배지 40개를 조제했다. 각각의 배지에, 상기 1. 1에서 준비한 종균 2mL씩을 접종하고, 25℃에서 3시간, 진탕 배양(120rpm)한 배양액에 필터 멸균한 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드를 0.0024%(w/v)가 되도록 첨가하고, 또한, 25℃에서 21시간, 진탕 배양했다. 배양 종료 후에, 원심분리기를 이용해 균체를 회수했다.

2. 정제

상기 배양에 의해 얻어진 균체로부터, 이하의 각 정제 공정을 거쳐, 치환형 소르보스 디하이드로게나아제를 분리·정제했다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.

또한, 소르보스 디하이드로게나아제 활성은, 실시예 1에 기재된 [효소 활성 측정 방법]을 의거하여 측정했다.

[표 6]

2. 1 무세포 추출액(CFE)의 조제

상기 1. 2의 본 배양에서 회수한 균체에 360mL의 50mM 인산나트륨 버퍼 pH 7.5를 더하여 균체 현탁액을 제작했다. 이 균체 현탁액을 4분할하고, 각각에 초음파 파쇄 장치(KUBOTA사제 INSONATOR 201M)를 이용해 출력 180W, 30분간 파쇄했다. 이들 균체 파쇄액을 합쳐, 원심분리(11,000×g, 4℃, 30분)하고, CFE 355mL를 회수했다.

2. 2 암모늄 설페이트 분획

상기 2. 1에서 회수된 CFE에, 얼음조 하, 최종 농도 0.25%(v/v)가 되도록 BL-9EX를 더하고 30분간 교반 용해했다. 또한, 포화 농도 25%가 되도록 암모늄 설페이트 51.12g을 조금씩 용해시키면서 첨가하였다. 암모늄 설페이트가 용해된 후, 30분간 더 교반했다. 이 용해액을 원심분리(11,000×g, 4℃, 30분)하고, 상청 370mL을 회수했다. 다음으로, 이 상청에, 얼음조 하, 포화 농도 40%가 되도록 암모늄 설페이트 34.41g를 조금씩 용해시키면서 첨가하였다. 암모늄 설페이트가 용해된 후, 30분간 더 교반한 후, 4℃에서 하룻밤 정치했다.

2. 3 투석

원심분리(11,000×g, 4℃, 30분)에 의해, 암모늄 설페이트 침전을 회수했다. 회수한 암모늄 설페이트 침전은, 10mL의 50mM 인산나트륨 버퍼 pH 7.5에 용해하고, 투석 튜브에 넣고, 투석 버퍼(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 20%글리세린)를 이용해 투석을 실시했다.

2. 4 원심분리

투석 튜브 내에 불용물이 생겼기 때문에, 원심분리(27,000×g, 4℃, 15분)에 의해, 이를 제거하고, 상청 21mL를 회수했다.

2. 5 약 음이온 교환 크로마토그래피(DEAE Sepharose Fast Flow)

평형화 버퍼(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 20% 글리세린)로 평형화한 약 음이온 교환 수지 DEAE Sepharose Fast Flow(GE헬스케어바이오사이언스사제) 320mL(컬럼 사이즈: f2.6㎝×높이 60㎝)에, 상기 2. 4에서 회수한 상청을 차지했다. 차지 종료후, 수지의 bed volume의 3배량의 세정 버퍼(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 20% 글리세린)로 세정 후, 수지의 bed volume의 5배량의 용출 버퍼(1: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 20% 글리세린, 2: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 20% 글리세린, 1M NaCl)를 이용하여, 목적 단백을 구배 용출시켜, 활성 분획 262mL를 회수했다.

2. 6 탈염농축

한외여과장치 모델 8200(아미콘사제, 한외여과 멤브레인 분획 분자량 10만)을 이용하여, 상기 2. 5의 활성 분획을 21.5mL로 농축했다. 이 농축액을 투석 튜브에 넣고, 투석 버퍼(50mM HEPES, pH 7.5)를 이용해 투석을 실시하고, 버퍼의 치환을 실시했다. 또한, 원심농축기 비바스핀20(비바사이언스사제, 분획 분자양 10만)을 이용해 원심분리(2,700×g, 4℃, 3시간)에 의해 2.7mL로 농축하고, 치환형 소르보스 디하이드로게나아제 322U를 얻었다.

[4] 치환형 소르보스 디하이드로게나아제의 활성화

상기 [3](「치환형 소르보스 디하이드로게나아제의 제조」)에서 제조한 소르보스 디하이드로게나아제(이하, 치환형 효소로 줄임)를, 이하와 같은 방법으로 1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸설페이트(1m-PMS)로 처리하고, 치환형 효소를 활성화했다.

상기 [3]에서 제조된 119U/mL 농도의 치환형 효소의 용액 0.115mL에, 50mM의 HEPES 버퍼(pH 7.5) 1.765mL와 20mM의 1m-PMS 수용액 0.12mL을 첨가하여 교반 후, 냉장고 내에서 하룻밤 보존하여 활성화를 실시했다. 활성화 종료후, 원심농축기 비바스핀20(비바사이언스사제, 분획 분자량 5만)에, 이 활성화 효소액 전체량을 첨가하고, 50mM의 HEPES 버퍼(pH 7.5) 10mL로 희석하고 원심분리기에 세트해 4,500rpm에서 45분간 원심분리하고, 약 0.3mL까지 농축했다. 또한, 이 농축액에 50mM의 HEPES 버퍼(pH 7.5) 10mL를 첨가하여 희석한 후, 재차 원심분리하여 농축하고, 1m-PMS를 제거했다. 또한 같은 조작을 2회 반복하고, 거의 완전히 1m-PMS를 제거했다. 마지막으로, 이 농축액에 50mM의 HEPES 버퍼(pH 7.5)를 첨가하여 총액량을 4mL로 하고, 활성화된 치환형 효소의 농도를 3.4U/mL로 조정했다.

[5] 활성화 효과의 확인

1m-PMS로 활성화된 효소와 미처리의 효소를 이용하고, 각각, 실시예 3(임상적인 1,5-AG의 측정법)의 R2시약을 조제했다. 이러한 R시약을 이용하여, 0과 50㎍/mL의 1,5-AG 표준액을 측정하고, 각각의 발색 강도를 비교했다. 50㎍/mL의 1,5-AG 표준액에 의한 흡광도의 증가는, 활성화 전의 효소에서는 0.064였던 데에 대해, 활성화 처리 후의 효소에서는 약 4배인 0.248이 되고, 효소가 약 4배로 활성화되어 있는 것을 알았다.

(실시예 3)

[1] 임상적인 1,5-AG의 측정법

임상 검사에서 범용되고 있는 전자동 생화학 검사 분석 장치에의 대응을 생 각하여, 최소 스케일의 측정법을 구성했다.

미리, 이하와 같은 조성의 측정 시약, R1-1 시약(글루코오스 소거제), R1-2 시약(1m-PMS 수용액), R2시약(1,5-AG 검출제)을 조제했다.

시험관에, 샘플로서 1,5-AG 표준액 또는 임상 검체를 9μL, R1-1 시약을 200μL 첨가하여, 교반하고, 37℃의 항온 수조에서 5분간 반응시켰다. 반응 후, 또한, R1-2 시약 10μL와, R2시약 100μL를 첨가하여 교반하고, 즉시, 이 반응액을 분광 광도계용의 셀에 옮기고, 37℃로 가온된 셀 홀더에 세트하고, 450nm에서의 흡광도의 변화를 5분간 측정했다.

또한, 본 실시예에 사용한 임상 검체는, 정상인과 당뇨병 환자로부터 채취한 혈청이다.

·시약 조성

R1-1 시약(글루코오스 소거제)

염화칼륨 49.6mM

염화나트륨 100mM

EDTA·2나트륨 0.1mM

포스포에놀피루브산 8.01mM

ATP O.99mM

염화마그네슘 7.38mM

피루브산 키나아제(토요보우제) 5U/mL

글루코키나아제(유니티카제) 4U/mL

WST-1 0.95mM

HEPES버퍼 50mM(pH 7.5)

R1-2 시약(1m-PMS 수용액)

1m-PMS O.4mM

R2 시약(1,5-AG 검출제)

치환형 효소 3.4U/mL

HEPES버퍼 50mM(pH 7.5)

[2] 검량선의 작성

혈청 베이스의 매트릭스를 이용하여, 1,5-AG의 표준액, 0.5, 12.5, 25, 50㎍/mL를 조제했다. 이 표준액을 상기의 임상적인 1,5-AG 측정법으로 측정하고, 도 9의 검량선을 작성했다. 또한, 각 표준액에 대해 흡광도 증가의 값을 표 7에 나타낸다.

[표 7]

[3] 임상 검체의 측정

정상인과 당뇨병 환자로 이루어지는 20개의 혈청 검체를, 상기의 임상적인 1,5-AG의 측정법(본법(本法))에 따라 측정하고, 이미, 확립되어 있는 1,5-AG 측정키트, 「라나 1,5AG 오토 리퀴드」로 측정한 결과와 비교했다. 그 결과를, 표 8, 도 10에 나타낸다.

[표 8]

도 10의 그래프에 나타낸 바와 같이, 양자의 측정값 사이에는, 상관식: y(본법)=1.0124×(라나 1,5AG 오토 리퀴드)＋3.3199, 상관계수(r): 0.964이며, 양호한 상관관계가 확인되었다.

본 발명에 의한 1,5-AG의 측정 방법, 및, 1,5-AG 측정 시약 조성물에 의하면, 당뇨병의 컨트롤 마커인 1,5-AG를 고정밀하게 정량하는 것이 가능하고, 혈장, 혈청, 수액, 소변 등의 임상 검체에 적용함으로써, 신속, 또한, 간편하게 당뇨병의 진단을 할 수 있다.

따라서, 본 발명은, 지극히 높은 산업상 이용 가능성을 가진다.

SEQUENCE LISTING <110> Ikeda Food Research Co.,Ltd. NIPPON KAYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> A measurement method of 1,5-anhydroglucitol, a 1,5-anhydroglucitol measurement reagent constituent <150> JP 2006-172619 <151> 2006-06-22 <160> 10 <210> 1 <211> 1596 <212> DNA <213> Sinorhizobium sp. 97507 <220> <221> CDS <222> (1)..(1596) <400> 1 atg atg gaa ggt ttt gat tac gtc atc gtc ggc ggc gga tcg tcg ggc 48 Met Met Glu Gly Phe Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Ser Ser Gly 1 5 10 15 tgc gtt ctg gcc gcc cgc ctt tcc gag aac cct tcg gtg cgc gtc tgc 96 Cys Val Leu Ala Ala Arg Leu Ser Glu Asn Pro Ser Val Arg Val Cys 20 25 30 ctg atc gag gcg ggc ggg cgc gac cgt cac ccg ttg atc cac atg ccg 144 Leu Ile Glu Ala Gly Gly Arg Asp Arg His Pro Leu Ile His Met Pro 35 40 45 gtc ggc ttc gca aag ctg acc gcg ggg ccg atg acc tgg ggc ctg acg 192 Val Gly Phe Ala Lys Leu Thr Ala Gly Pro Met Thr Trp Gly Leu Thr 50 55 60 acc gcc ccg cag aaa cat gca aac aac cgc gag att ccc tat gcc cag 240 Thr Ala Pro Gln Lys His Ala Asn Asn Arg Glu Ile Pro Tyr Ala Gln 65 70 75 80 gcg aga 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cgt tgc tcg gcc gct gtc gga tat ttg cgg ccg gcg ctc gcg cgc aag 624 Arg Cys Ser Ala Ala Val Gly Tyr Leu Arg Pro Ala Leu Ala Arg Lys 195 200 205 aac ctc atg ctc atc acg ggt gcg ctt gtg ctg cgc atc gta ttc cag 672 Asn Leu Met Leu Ile Thr Gly Ala Leu Val Leu Arg Ile Val Phe Gln 210 215 220 ggc cgc cgc gcc gtc ggc gtc gaa tac tcg acc ggg ggc gcc gcg aag 720 Gly Arg Arg Ala Val Gly Val Glu Tyr Ser Thr Gly Gly Ala Ala Lys 225 230 235 240 atc gcc cgg gcg gaa agc gag gtt ctc gtc acc tcg ggt gcg atc gga 768 Ile Ala Arg Ala Glu Ser Glu Val Leu Val Thr Ser Gly Ala Ile Gly 245 250 255 acg cct aag ctc atg atg ctt tca ggc gtc ggc ccg gcc gcc tct ctg 816 Thr Pro Lys Leu Met Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Ala Ala Ser Leu 260 265 270 cgg agc cac ggt atc gac gtc gtg cag gat atg gcg ggg gtc ggc cag 864 Arg Ser His Gly Ile Asp Val Val Gln Asp Met Ala Gly Val Gly Gln 275 280 285 aac ctc cac gat cac ttc ggc gtg gac atc gtt gcc gaa ctg aag ggg 912 Asn Leu His Asp His Phe Gly Val Asp Ile Val Ala Glu Leu Lys Gly 290 295 300 cat gac agc ctc gac aag tac aac aag ttc cac tgg atg ctc ttg gcg 960 His Asp Ser Leu Asp Lys Tyr Asn Lys Phe His Trp Met Leu Leu Ala 305 310 315 320 gga atc gaa tac gcg ctt ttc aaa tcc ggg ccg gtc gcc tcg aat gtt 1008 Gly Ile Glu Tyr Ala Leu Phe Lys Ser Gly Pro Val Ala Ser Asn Val 325 330 335 gtg gag ggt gga gcc ttc tgg tac ggc gat agg gca agc ccc tat ccc 1056 Val Glu Gly Gly Ala Phe Trp Tyr Gly Asp Arg Ala Ser Pro Tyr Pro 340 345 350 gac ctg caa ttc cac ttt ctt gcg ggg gcg gga gcc gag gcc ggg gtg 1104 Asp Leu Gln Phe His Phe Leu Ala Gly Ala Gly Ala Glu Ala Gly Val 355 360 365 ccg agc gtc cca aag ggt tcc tcc ggc gtg acc ttg aat tcc tac acg 1152 Pro Ser Val Pro Lys Gly Ser Ser Gly Val Thr Leu Asn Ser Tyr Thr 370 375 380 gtc cgg ccg aag tca cgg ggt tcc gtc acc ctt cgt tct gcc gac ccc 1200 Val Arg Pro Lys Ser Arg Gly Ser Val Thr Leu Arg Ser Ala Asp Pro 385 390 395 400 cgt gcc ctg ccg atc gtc gac ccg aac ttc ctc gat gat ccg gat gat 1248 Arg Ala Leu Pro Ile Val Asp Pro Asn Phe Leu Asp Asp Pro Asp Asp 405 410 415 ctc agg atc tcg gtc gaa ggc atc agg atc agc agg gaa att ttc ggg 1296 Leu Arg Ile Ser Val Glu Gly Ile Arg Ile Ser Arg Glu Ile Phe Gly 420 425 430 cag ccg tcg ctg cag aag tac atc aag acg atc cgc ttc ccc gac gag 1344 Gln Pro Ser Leu Gln Lys Tyr Ile Lys Thr Ile Arg Phe Pro Asp Glu 435 440 445 agc gtc agg aca cag gcc gac ttc gag gcc tat gcg cgg caa tac ggg 1392 Ser Val Arg Thr Gln Ala Asp Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Gln Tyr Gly 450 455 460 cgg acg tcc tat cac ccg aca tgc acc tgc aag atg ggt cgc gac gat 1440 Arg Thr Ser Tyr His Pro Thr Cys Thr Cys Lys Met Gly Arg Asp Asp 465 470 475 480 atg tcg gtg gtc gat ccg cag ctc cgc gtc cac ggc ctt gac ggc atc 1488 Met Ser Val Val Asp Pro Gln Leu Arg Val His Gly Leu Asp Gly Ile 485 490 495 cgc atc tgc gac agt tcg gtg atg ccc agt ctc gtg ggc tcc aat acc 1536 Arg Ile Cys Asp Ser Ser Val Met Pro Ser Leu Val Gly Ser Asn Thr 500 505 510 aat gcg gct acc atc atg atc ggc gag aag gcg gcc gat ctg ata cgg 1584 Asn Ala Ala Thr Ile Met Ile Gly Glu Lys Ala Ala Asp Leu Ile Arg 515 520 525 ggc aac att tga 1596 Gly Asn Ile 530 <210> 2 <211> 531 <212> PRT <213> Sinorhizobium sp. 97507 <400> 2 Met Met Glu Gly Phe Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Ser Ser Gly 1 @5 @10 @15 Cys Val Leu Ala Ala Arg Leu Ser Glu Asn Pro Ser Val Arg Val Cys @@20 25 @ 30 Leu Ile Glu Ala Gly Gly Arg Asp Arg His Pro Leu Ile His Met Pro 35 @40 @@45 Val Gly Phe Ala Lys Leu Thr Ala Gly Pro Met Thr Trp Gly Leu Thr 50 @55 @60 Thr Ala Pro Gln Lys His Ala Asn Asn Arg Glu Ile Pro Tyr Ala Gln 65 @70 75 @@80 Ala Arg Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Ile Asn Ala Glu Val Tyr Thr @85 @90 @95 Arg Gly His Pro Arg Asp Tyr Asp Arg Trp Val Glu Glu Gly Ala Asp 100 @105 @110 Gly Trp Ser Phe Gln Glu Val Lys Pro Tyr Phe Leu Arg Ser Glu Gly 115 @120 125 Asn Thr Ile Leu Ser Gly Glu Trp His Gly Thr Asp Gly Pro Leu Gly 130 135 140 Val Ser Asn Leu Pro Asp Pro Gln Pro Met Thr Arg Ala Phe Val Gln 145 150 155 160 Ser Cys Gln Glu Leu Gly Ile Pro Tyr Asn Pro Asp Phe Asn Gly Pro 165 170 175 Val Gln Glu Gly Ala Gly Val Tyr Gln Thr Thr Ile Arg Asn Ser Arg 180 185 190 Arg Cys Ser Ala Ala Val Gly Tyr Leu Arg Pro Ala Leu Ala Arg Lys 195 200 205 Asn Leu Met Leu Ile Thr Gly Ala Leu Val Leu Arg Ile Val Phe Gln 210 215 220 Gly Arg Arg Ala Val Gly Val Glu Tyr Ser Thr Gly Gly Ala Ala Lys 225 230 235 240 Ile Ala Arg Ala Glu Ser Glu Val Leu Val Thr Ser Gly Ala Ile Gly @ 245 250 255 Thr Pro Lys Leu Met Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Ala Ala Ser Leu 260 265 270 Arg Ser His Gly Ile Asp Val Val Gln Asp Met Ala Gly Val Gly Gln 275 280 285 Asn Leu His Asp His Phe Gly Val Asp Ile Val Ala Glu Leu Lys Gly 290 295 300 His Asp Ser Leu Asp Lys Tyr Asn Lys Phe His Trp Met Leu Leu Ala 305 310 315 320 Gly Ile Glu Tyr Ala Leu Phe Lys Ser Gly Pro Val Ala Ser Asn Val 325 330 335 Val Glu Gly Gly Ala Phe Trp Tyr Gly Asp Arg Ala Ser Pro Tyr Pro 340 345 350 Asp Leu Gln Phe His Phe Leu Ala Gly Ala Gly Ala Glu Ala Gly Val 355 360 365 Pro Ser Val Pro Lys Gly Ser Ser Gly Val Thr Leu Asn Ser Tyr Thr 370 375 380 Val Arg Pro Lys Ser Arg Gly Ser Val Thr Leu Arg Ser Ala Asp Pro 385 390 395 400 Arg Ala Leu Pro Ile Val Asp Pro Asn Phe Leu Asp Asp Pro Asp Asp 405 410 415 Leu Arg Ile Ser Val Glu Gly Ile Arg Ile Ser Arg Glu Ile Phe Gly 420 425 430 Gln Pro Ser Leu Gln Lys Tyr Ile Lys Thr Ile Arg Phe Pro Asp Glu 435 440 445 Ser Val Arg Thr Gln Ala Asp Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Gln Tyr Gly 450 455 460 Arg Thr Ser Tyr His Pro Thr Cys Thr Cys Lys Met Gly Arg Asp Asp 465 470 475 480 Met Ser Val Val Asp Pro Gln Leu Arg Val His Gly Leu Asp Gly Ile 485 490 495 Arg Ile Cys Asp Ser Ser Val Met Pro Ser Leu Val Gly Ser Asn Thr 500 505 510 Asn Ala Ala Thr Ile Met Ile Gly Glu Lys Ala Ala Asp Leu Ile Arg 515 520 525 Gly Asn Ile 530 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>Inventor: Ishimaru, Emi; Sanada, Hirokazu; Omura, Hironori. <400> 3 ccccccatgg atgatggaag gttttgatta 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>Inventor: Ishimaru, Emi; Sanada, Hirokazu; Omura, Hironori. <400> 4 gggaagcttt caaatgttgc cccgtatcag 30 <210> 5 <211> 1602 <212> DNA <213> Sinorhizobium sp. 97507 <220> <221> CDS <222> (1)..(1602) <400> 5 atg gaa ttc atg gaa ggt ttt gat tac gtc atc gtc ggc ggc gga tcg 48 Met Glu Phe Met Glu Gly Phe Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 tcg ggc tgt gtt ctg gcc gcc cgc ctt tcc gag aac cct tcg gtg cgc 96 Ser Gly Cys Val Leu Ala Ala Arg Leu Ser Glu Asn Pro Ser Val Arg 20 25 30 gtc tgc ctg atc gag gca ggc ggg cgc gac cgt cac ccg ttg atc cac 144 Val Cys Leu Ile Glu Ala Gly Gly Arg Asp Arg His Pro Leu Ile His 35 40 45 atg ccg gtc ggc ttc gca aag ctg acc gca ggg ccg atg acc tgg ggc 192 Met Pro Val Gly Phe Ala Lys Leu Thr Ala Gly Pro Met Thr Trp Gly 50 55 60 ctg acg acc gcc ccg cag aaa cat gca aac aac cgc gag att ccc tat 240 Leu Thr Thr Ala Pro Gln Lys His Ala Asn Asn Arg Glu Ile Pro Tyr 65 70 75 80 gcc cag gcg aga gtg ctc ggc gga ggg tcc tcg atc aat gcc gag gtc 288 Ala Gln Ala Arg Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Ile Asn Ala Glu Val 85 90 95 tat acg cgc ggc cac ccg cgg gac tat gac cgc tgg gtg gaa gag ggg 336 Tyr Thr Arg Gly His Pro Arg Asp Tyr Asp Arg Trp Val Glu Glu Gly 100 105 110 gcc gac gga tgg agc ttt cag gag gtg aag cct tac ttc ctg cga tcc 384 Ala Asp Gly Trp Ser Phe Gln Glu Val Lys Pro Tyr Phe Leu Arg Ser 115 120 125 gag ggc aat acg atc ctc tcc ggc gag tgg cac ggg acg gac ggt cct 432 Glu Gly Asn Thr Ile Leu Ser Gly Glu Trp His Gly Thr Asp Gly Pro 130 135 140 ctc gga gtc tcc aac ctt ccc gat ccg cag ccg atg aca cgg gct ttc 480 Leu Gly Val Ser Asn Leu Pro Asp Pro Gln Pro Met Thr Arg Ala Phe 145 150 155 160 gtc cag agc tgc cag gaa ctc ggc atc ccc tat aat ccc gac ttc aac 528 Val Gln Ser Cys Gln Glu Leu Gly Ile Pro Tyr Asn Pro Asp Phe Asn 165 170 175 ggg ccg gtc cag gaa ggt gcg ggg gtc tac cag acg acg atc cgc aac 576 Gly Pro Val Gln Glu Gly Ala Gly Val Tyr Gln Thr Thr Ile Arg Asn 180 185 190 agc cgc cgt tgc tcg gcc gct gtc gga tat ttg cgg ccg gcg ctc gcg 624 Ser Arg Arg Cys Ser Ala Ala Val Gly Tyr Leu Arg Pro Ala Leu Ala 195 200 205 cgc aag aac ctc atg ctc atc acg ggt gcg ctt gtg ctg cgc atc gta 672 Arg Lys Asn Leu Met Leu Ile Thr Gly Ala Leu Val Leu Arg Ile Val 210 215 220 ttc cag ggc cgc cgc gcc gtc ggc gtc gaa tac tcg acc ggg ggc gcc 720 Phe Gln Gly Arg Arg Ala Val Gly Val Glu Tyr Ser Thr Gly Gly Ala 225 230 235 240 gcg aag atc gcc cgg gcg gaa agc gag gtt ctc gtc acc tcg ggt gcg 768 Ala Lys Ile Ala Arg Ala Glu Ser Glu Val Leu Val Thr Ser Gly Ala 245 250 255 atc gga acg cct aag ctc atg atg ctt tca ggc gtc ggc ccg gcc gcc 816 Ile Gly Thr Pro Lys Leu Met Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Ala Ala 260 265 270 tct ctg cgg agc cac ggt atc gac gtc gtg cag gat atg gcg ggg gtc 864 Ser Leu Arg Ser His Gly Ile Asp Val Val Gln Asp Met Ala Gly Val 275 280 285 ggc cag aac ctc cac gat cac ttc ggc gtg gac atc gtt gcc gaa ctg 912 Gly Gln Asn Leu His Asp His Phe Gly Val Asp Ile Val Ala Glu Leu 290 295 300 aag ggg cat gac agc ctc gac aag tac aac aag ttc cac tgg atg ctc 960 Lys Gly His Asp Ser Leu Asp Lys Tyr Asn Lys Phe His Trp Met Leu 305 310 315 320 ttg gcg gga atc gaa tac gcg ctt ttc aaa tcc ggg ccg gtc gcc tcg 1008 Leu Ala Gly Ile Glu Tyr Ala Leu Phe Lys Ser Gly Pro Val Ala Ser 325 330 335 aat gtt gtg gag ggt gga gcc ttc tgg tac ggc gat agg gca agc ccc 1056 Asn Val Val Glu Gly Gly Ala Phe Trp Tyr Gly Asp Arg Ala Ser Pro 340 345 350 tat ccc gac ctg caa ttc cac ttt ctt gcg ggg gcg gga gcc gag gcc 1104 Tyr Pro Asp Leu Gln Phe His Phe Leu Ala Gly Ala Gly Ala Glu Ala 355 360 365 ggg gtg ccg agc gtc cca aag ggt tcc tcc ggc gtg acc ttg aat tcc 1152 Gly Val Pro Ser Val Pro Lys Gly Ser Ser Gly Val Thr Leu Asn Ser 370 375 380 tac acg gtc cgg ccg aag tca cgg ggt tcc gtc acc ctt cgt tct gcc 1200 Tyr Thr Val Arg Pro Lys Ser Arg Gly Ser Val Thr Leu Arg Ser Ala 385 390 395 400 gac ccc cgt gcc ctg ccg atc gtc gac ccg aac ttc ctc gat gat ccg 1248 Asp Pro Arg Ala Leu Pro Ile Val Asp Pro Asn Phe Leu Asp Asp Pro 405 410 415 gat gat ctc agg atc tcg gtc gaa ggc atc agg atc agc agg gaa att 1296 Asp Asp Leu Arg Ile Ser Val Glu Gly Ile Arg Ile Ser Arg Glu Ile 420 425 430 ttc ggg cag ccg tcg ctg cag aag tac atc aag acg atc cgc ttc ccc 1344 Phe Gly Gln Pro Ser Leu Gln Lys Tyr Ile Lys Thr Ile Arg Phe Pro 435 440 445 gac gag agc gtc agg aca cag gcc gac ttc gag gcc tat gcg cgg caa 1392 Asp Glu Ser Val Arg Thr Gln Ala Asp Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Gln 450 455 460 tac ggg cgg acg tcc tat cac ccg aca tgc acc tgc aag atg ggt cgc 1440 Tyr Gly Arg Thr Ser Tyr His Pro Thr Cys Thr Cys Lys Met Gly Arg 465 470 475 480 gac gat atg tcg gtg gtc gat ccg cag ctc cgc gtc cac ggc ctt gac 1488 Asp Asp Met Ser Val Val Asp Pro Gln Leu Arg Val His Gly Leu Asp 485 490 495 ggc atc cgc atc tgc gac agt tcg gtg atg ccc agt ctc gtg ggc tcc 1536 Gly Ile Arg Ile Cys Asp Ser Ser Val Met Pro Ser Leu Val Gly Ser 500 505 510 aat acc aat gcg gct acc atc atg atc ggc gag aag gcg gcc gat ctg 1584 Asn Thr Asn Ala Ala Thr Ile Met Ile Gly Glu Lys Ala Ala Asp Leu 515 520 525 ata cgg ggc aac att tga 1602 Ile Arg Gly Asn Ile 530 <210> 6 <211> 533 <212> PRT <213> Sinorhizobium sp. 97507 <400> 6 Met Glu Phe Met Glu Gly Phe Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Ser Gly Cys Val Leu Ala Ala Arg Leu Ser Glu Asn Pro Ser Val Arg 20 25 30 Val Cys Leu Ile Glu Ala Gly Gly Arg Asp Arg His Pro Leu Ile His 35 40 45 Met Pro Val Gly Phe Ala Lys Leu Thr Ala Gly Pro Met Thr Trp Gly 50 55 60 Leu Thr Thr Ala Pro Gln Lys His Ala Asn Asn Arg Glu Ile Pro Tyr 65 70 75 80 Ala Gln Ala Arg Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Ile Asn Ala Glu Val 85 90 95 Tyr Thr Arg Gly His Pro Arg Asp Tyr Asp Arg Trp Val Glu Glu Gly 100 105 110 Ala Asp Gly Trp Ser Phe Gln Glu Val Lys Pro Tyr Phe Leu Arg Ser 115 120 125 Glu Gly Asn Thr Ile Leu Ser Gly Glu Trp His Gly Thr Asp Gly Pro 130 135 140 Leu Gly Val Ser Asn Leu Pro Asp Pro Gln Pro Met Thr Arg Ala Phe 145 150 155 160 Val Gln Ser Cys Gln Glu Leu Gly Ile Pro Tyr Asn Pro Asp Phe Asn 165 170 175 Gly Pro Val Gln Glu Gly Ala Gly Val Tyr Gln Thr Thr Ile Arg Asn 180 185 190 Ser Arg Arg Cys Ser Ala Ala Val Gly Tyr Leu Arg Pro Ala Leu Ala 195 200 205 Arg Lys Asn Leu Met Leu Ile Thr Gly Ala Leu Val Leu Arg Ile Val 210 215 220 Phe Gln Gly Arg Arg Ala Val Gly Val Glu Tyr Ser Thr Gly Gly Ala 225 230 235 240 Ala Lys Ile Ala Arg Ala Glu Ser Glu Val Leu Val Thr Ser Gly Ala 245 250 255 Ile Gly Thr Pro Lys Leu Met Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Ala Ala 260 265 270 Ser Leu Arg Ser His Gly Ile Asp Val Val Gln Asp Met Ala Gly Val 275 280 285 Gly Gln Asn Leu His Asp His Phe Gly Val Asp Ile Val Ala Glu Leu 290 295 300 Lys Gly His Asp Ser Leu Asp Lys Tyr Asn Lys Phe His Trp Met Leu 305 310 315 320 Leu Ala Gly Ile Glu Tyr Ala Leu Phe Lys Ser Gly Pro Val Ala Ser 325 330 335 Asn Val Val Glu Gly Gly Ala Phe Trp Tyr Gly Asp Arg Ala Ser Pro 340 345 350 Tyr Pro Asp Leu Gln Phe His Phe Leu Ala Gly Ala Gly Ala Glu Ala 355 360 365 Gly Val Pro Ser Val Pro Lys Gly Ser Ser Gly Val Thr Leu Asn Ser 370 375 380 Tyr Thr Val Arg Pro Lys Ser Arg Gly Ser Val Thr Leu Arg Ser Ala 385 390 395 400 Asp Pro Arg Ala Leu Pro Ile Val Asp Pro Asn Phe Leu Asp Asp Pro 405 410 415 Asp Asp Leu Arg Ile Ser Val Glu Gly Ile Arg Ile Ser Arg Glu Ile 420 425 430 Phe Gly Gln Pro Ser Leu Gln Lys Tyr Ile Lys Thr Ile Arg Phe Pro 435 440 445 Asp Glu Ser Val Arg Thr Gln Ala Asp Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Gln 450 455 460 Tyr Gly Arg Thr Ser Tyr His Pro Thr Cys Thr Cys Lys Met Gly Arg 465 470 475 480 Asp Asp Met Ser Val Val Asp Pro Gln Leu Arg Val His Gly Leu Asp 485 490 495 Gly Ile Arg Ile Cys Asp Ser Ser Val Met Pro Ser Leu Val Gly Ser 500 505 510 Asn Thr Asn Ala Ala Thr Ile Met Ile Gly Glu Lys Ala Ala Asp Leu 515 520 525 Ile Arg Gly Asn Ile 530 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>Inventor: Yoshioka, Hideki; Tsukamoto, Shuhei; Masuda, Minoru. <400> 7 atataccatg gaattcatgg aaggttttga ttacg <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>Inventor: Yoshioka, Hideki; Tsukamoto, Shuhei; Masuda, Minoru. <400> 8 atctagagga tcctcatcaa atgttgcccc gtatc <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>Inventor: Yoshioka, Hideki; Tsukamoto, Shuhei; Masuda, Minoru. <400> 9 atatagatct tgacagctta tcatcgactg c <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>Inventor: Yoshioka, Hideki; Tsukamoto, Shuhei; Masuda, Minoru. <400> 10 attaagatct cagataaaac gaaaggccca

Claims

(a) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질;

(b) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 혹은 수 개의 아미노산이 결실(缺失), 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질; 또는,

(c) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에 대해 적어도 60%의 배열 상동성(相同性)을 가지는 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질:

을 이용하는 것을 특징으로 하는 1,5-안하이드로글루시톨(1,5-anhydroglucitol)의 측정 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 단백질이, 시노라이조비움(Sinorhizobium)속(屬)에 속하는 균 유래인, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 단백질이, 시노라이조비움 에스피. 97507(Sinorhizobium sp. 97507) FERM P-19428 유래인, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 단백질의 소르보스에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 상기 단백질의 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성이 10% 이상인, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
청구항 4에 있어서,

상기 단백질의 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 상기 단백질의 D-글루코오스에 대한 반응성이 10% 이하인, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 단백질을, 발색 기질의 존재하에서, 시료 중의 1,5-안하이드로글루시톨에 작용시킴으로써 반응한 발색 기질의 양을 측정하는, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
청구항 6에 있어서,

상기 단백질을 시료 중의 1,5-안하이드로글루시톨에 작용시키기 전에, 시료 중의 D-글루코오스를 미리 제거하는, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
청구항 7에 있어서,

상기 단백질을, 발색 기질 및 전자 캐리어의 존재하에서, 시료 중의 1,5-안하이드로글루시톨에 작용시키는, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
청구항 8에 있어서,

1,5-안하이드로글루시톨을 기질로 하여 측정했을 경우의 상기 단백질의 효소 활성을 기본 단위로 하여, 상기 시료 1mL당, 1~500 단위가 되도록 상기 단백질을 첨가하는, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
청구항 8에 있어서,

시료 중의 1,5-안하이드로글루시톨에 작용시키기 전에, 상기 단백질을, 전자 캐리어를 이용하여 활성화하는, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정 방법.
(a) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질;

(b) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 혹은 수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질; 또는,

(c) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에 대해 적어도 60%의 배열 상동성을 가지는 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질:

을 함유하는 것을 특징으로 하는 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.
청구항 11에 있어서,

상기 단백질이, 시노라이조비움속에 속하는 균 유래인, 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.
청구항 11에 있어서,

상기 단백질이, 시노라이조비움 에스피. 97507 FERM P-19428 유래인, 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.
청구항 11에 있어서,

상기 단백질의 소르보스에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 상기 단백질의 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성이 10% 이상인, 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.
청구항 14에 있어서,

상기 단백질의 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 상기 단백질의 D-글루코오스에 대한 반응성이 10% 이하인, 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.
청구항 11에 있어서,

상기 단백질이, 전자 캐리어를 이용하여 활성화된 것인, 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.
청구항 16에 있어서,

상기 전자 캐리어가, 페나진 메토설페이트 및 1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸설페이트 중 적어도 한개인, 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.
청구항 11에 있어서,

상기 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물이, 또한, 발색 기질을 함유하는, 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.
청구항 18에 있어서,

또한, 전자 캐리어를 함유하는 상기 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물로서, 상기 발색 기질이 환원성 발색 기질인, 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물.
(a) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질;

(b) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 혹은 수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성이 10% 이상인 단 백질; 또는

(c) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에 대해 적어도 85%의 배열 상동성을 가지는 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스에 대한 반응성을 100%로 했을 경우, 1,5-안하이드로글루시톨에 대한 반응성이 10% 이상인 단백질.
청구항 11에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물을 이용하여 당뇨병을 진단하는 방법.
청구항 11에 기재된 1,5-안하이드로글루시톨 측정 시약 조성물의, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정에의 사용.
(a) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질;

(b) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 혹은 수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질; 또는

(c) 배열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 배열에 대해 적어도 60%의 배열 상동성을 가지는 아미노산 배열로 이루어지고, 소르보스 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질:

의, 1,5-안하이드로글루시톨의 측정에의 사용.